KR100862049B1 - 약독화된 재조합 뉴캐슬병 바이러스 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 재조합 뉴캐슬병 바이러스 게놈 전사 벡터, 이를 통해 제작된 병원성 뉴캐슬병 바이러스의 표면 항원을 갖는 약병원성 재조합 뉴캐슬병 바이러스, 상기의 게놈 전사 벡터를 사용하여 뉴캐슬병에 대해 탁월한 예방효능을 가지면서 병원성은 낮은 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 제조하는 방법, 및 상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 함유하는 뉴캐슬병 백신에 관한 것이다.
Description
도 1은 국내 강병원성 뉴캐슬병 바이러스 (Newcastle disease virus, NDV)인 KBNP-4152의 게놈 RNA RT-PCR 결과와 증폭 산물의 이름 및 위치를 나타낸 것이다.
도 2는 도 1의 증폭산물을 TA-클로닝 벡터에 클로닝 한 결과이다.
도 3은 재조합 NDV 게놈의 양쪽 말단을 정확하게 만들어낼 수 있도록 인식부위와 절단부위가 상이한 제한효소인 BsmBI과 BsaI 인식 염기서열을 삽입하는 과정을 보여주는 것이다.
도 4는 NDV 게놈 DNA 클로닝을 위한 모벡터 pTMH 제작을 위한 링커 염기서열과 링커의 제작을 위한 프라이머 염기서열을 나타낸 것이다.
도 5는 pTMH 벡터의 제조 과정을 모식적으로 나타낸 것이다.
도 6은 pTMH의 주요 부위의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 7은 pTMH 벡터의 전체 염기서열을 나타낸 것이다.
도 8은 라소타주의 게놈 RNA RT-PCR 결과 및 증폭산물의 이름과 위치를 나타낸 것이다.
도 9는 도 8의 증폭산물을 TA-클로닝 벡터에 클로닝 한 결과이다.
도 10은 NDV의 게놈 DNA 클로닝 과정을 나타낸 것이다.
도 11은 NDV의 NP, P 및 L 유전자 발현 플라스미드의 제작 과정을 보여주는 것으로, A의 2,3,4 레인은 각각 NP, P, L 유전자의 RT-PCR결과이며, 6,7,8 레인은 각각 NP, P, L 유전자를 pcDNA3.1/topo에 클로닝한 후 NotI으로 처리하여 삽입 유전자를 확인한 사진이고, B는 이에 대한 모식도 이다.
도 12는 PTDS 기법을 이용한 F 및 HN 유전자 반합성 과정을 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 재조합 바이러스의 M 및 F 유전자 연결부 및 F 단백질의 퓨린 인식 부위의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다.
도 14는 PTDS 및 site-directed mutagenesis를 이용한 F 단백질의 furin (퓨린) 인식부위에 돌연변이가 유발된 유전자 합성 과정을 나타낸 것이다.
도 15는 KBNP-4152 HN (1-566) 유전자와 라소타주의 HN말단 (567-577번) 유전자 연결을 위한 PTDS용 프라이머 설계도이다.
도 16은 재조합 바이러스인 KBNP-C4152R2L의 제작 과정을 나타낸 것이다.
도 17은 다양한 퓨린 인식부위를 갖는 재조합 바이러스 클론의 제작과정을 나타낸 것이다.
도 18은 계태아에 접종한 KBNP-C4152R2L의 증식 여부를 평판 혈구응집 반응시험으로 확인한 것이다.
도 19는 KBNP-C4152R2L의 병원성을 알아보기 위한 pathotype-specific RT-PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 KBNP-4152와 KBNP-C4152R2L의 F 단백질의 퓨린 인식 부위의 염기서 열을 비교한 것이다.
도 21은 교차 혈구응집억제법을 이용하여 라소타주, KBNP-4152 및 KBNP-C4152R2L의 항원적 관련성을 나타낸 것이다.
도 22는 KBNP-C4152R2L의 세포변성효과를 나타낸 것이다.
도 23은 pTMH에 클로닝 된 KBNP-C4152R2L의 게놈지도 및 게놈의 염기서열을 나타낸 것이다.
본 발명은 재조합 NDV 게놈 전사 벡터, 이를 통해 제작된 병원성 NDV의 표면 항원을 갖는 약병원성 재조합 NDV, 상기의 게놈 전사벡터를 사용하여 뉴캐슬병에 대해 탁월한 예방효능을 가지면서 병원성은 낮은 재조합 NDV를 제조하는 방법 및 상기 재조합 NDV를 함유하는 ND 백신에 관한 것이다.
뉴캐슬병((Newcastle Disease, ND)은 국제적으로 가장 중요한 가축 질병 15종 중 하나로, 급성 열성 호흡기 질병이며, 면역이 안 된 가금에 감염되는 경우 100% 폐사하는 법정 제1종 전염병이다. 우리나라는 뉴캐슬병바이러스(Newcastle disease virus, NDV) 상재지역으로, 이 질병의 근절에 상당한 어려움이 있을 것으로 예상된다. 또한, 우리나라와 활발한 교역을 하고 있는 동남아시아, 중국, 및 대만에는 다양한 뉴캐슬병 바이러스들이 유행하고 있어서 잠재적인 위해 요인으로 존재하므로, 아시아형 뉴캐슬병 백신의 개발이 절실한 시점이다.
뉴캐슬병 바이러스는 단일 가닥(single stranded) RNA 바이러스로 아부라바이러스 속(genus Avulavirus)에 속한다. 뉴캐슬병 바이러스는 엔벨롭(envelope)을 가지고 있으며 엔벨롭에는 바이러스가 숙주 세포에 결합할 수 있도록 해주는 HN(Haemagglutinin-Neuraminidase) 단백질과 엔벨롭과 숙주 세포의 융합을 일으키는 F(Fusion) 단백질이 있다. F 단백질과 HN 단백질은 글리코단백질(glycoprotein)로서 엔벨롭의 표면에 분포되어 있다.
F 단백질은 Ⅰ형 막 글리코단백질(type Ⅰ membrane glycoprotein)로써 삼합체(trimeric) 구조를 형성한다. F 단백질은 비활성 전구체 형태(F0)로 만들어지고 골지 막(Golgi membranes)을 통해 이동하는 동안 활성 형태인 F1과 F2로 잘리게 된다. 이러한 과정은 F1 소단위체(subunit)의 아미노 말단에서 소수성 도메인(domain)을 노출시키고 이것은 성숙한 단백질의 생물학적 활성에 중요한 역할을 한다. 융합 펩티드(fusion peptide)라 불리는 소수성 도메인은 파라믹소바이러스(paramyxovirus) F 단백질에서 매우 보존되어 있고 막 융합을 매개하는데 직접적으로 관여하고 있을 것이라 여겨지고 있다. 파라믹소바이러스 F 단백질은 7개 반복(heptad repeats)을 포함하고 알파 헬릭스 구조를 형성할 가능성이 있는 두 지역을 포함하는 여러 개의 공통된 구조 형태를 갖고 있다. 두 반복중 가장 긴 7개 반복 A(heptad repeat A)는 F1의 아미노 말단에서 소수성 융합 펩티드와 인접해 있으며, 7개 반복 B는 관통막(transmembrane) 지역의 윗부분에 밀착하여 있다. 7개 반복 B는 매 7개 잔기마다 매우 보존된 류신 또는 이소류신의 연속으로 구성되어 있다.
HN 단백질은 Ⅱ형 막 글리코단백질(type Ⅱ membrane glycoprotein)로 바이러스 엔벨롭의 표면에서 4합체(tetramer)를 형성하여 세포막에 침투한다(Gorman et al., 1988; Ng et al., 1989). HN 단백질은 비리온(virion)이 글리코접합(glycoconjugates)의 시알산(sialic acids)에 결합함으로써 호스트 세포 표면에 위치시키는 기능을 한다. HN 단백질은 관통막(transmembrane) 도메인, 줄기(stalk) 도메인 및 구형(globular) 도메인의 세 지역으로 나뉜다. 항원성인 수용체 결합과 뉴라미니다제(neuraminidase) 활성 위치는 모두 구형 도메인에 위치해 있다. 융합 유도 활성은 줄기 도메인에 위치해 있고 이것은 F 단백질과 상호작용 한다(Sergei et al., 1993). 줄기 도메인은 예상되는 형태로 α-헬릭스와 함께 2개의 7개 반복 지역 A(74-88 위치)와 7개 반복 지역 B(96-110 위치)를 갖고 있다. 또한, 구조를 파괴하는 어떤 돌연변이도 수용체 결합과 뉴라미니다제 활성을 감소시키는 원인이 된다는 보고가 있다.
NDV은 닭에서 질병 정도에 따라 아래와 같은 병원성 타입(phathotype)으로 분류된다: 1) 소화기 병변과 높은 폐사율을 보이는 장 친화 강병원성 (velogenic) NDV; 그리고 호흡기 및 신경학적 증상이 주로 나타나며 높은 폐사율을 보이는 신경 친화 강병원성 NDV; 2) 낮은 치사율, 일부 조류에서 급성 호흡기 질환 및 신경성 증상을 보이는 중병원성 (methogenic) NDV; 3) 경증 또는 무증상의 호흡기 감염을 유발하는 약병원성 (lentogenic) 및 무병원성 (apathogenic) NDV.
NDV이 세포에 감염성을 갖기 위해서는 F1 및 F2로 절단될 전구체 당단백질 Fo이 필요하다. 이 번역-후 절단은 숙주 세포 프로테아제들에 의해 중재된다. 만 약 절단이 일어나는 것이 실패되면, 비-감염성 바이러스 입자들이 생성되고 그리고 바이러스 복제가 진행할 수 없다. 독성 바이러스의 Fo 단백질은 광범위한 프로테아제에 의해 절단될 수 있으나, 낮은 독성의 바이러스들에서 Fo 단백질들은 그들의 감수성에 제약되고 이들 바이러스는 단지 특정 숙주 세포 타입에서만 증식가능하다.
약병원성인 렌토제닉 바이러스는 단지 호흡기 또는 장관과 같은 트립신-같은 효소들을 갖는 영역에서만 복제하는 반면에, 독성 바이러스들은 조직 및 기관의 범위에서 복제할 수 있어 치명적인 전신감염을 초래한다.
Fo 전구체의 아미노산 사열화는 약 병원성 바이러스들은 F2 및 F1 사슬을 연결하는 단일 아르기닌 (R)을 갖는 반면에, 중간독 이상의 균주들은 절단 부위에 K/R-X-K/R-R-F와 같은 두 쌍을 형성하는 추가의 기본 아미노산들을 보유한다는 것을 보여주었다. 게다가, 중병원성이상의 병원성을 갖는 균주들의 F2 사슬은 일반적으로 페닐알라닌 (phenylalanine) 잔기로 개시하는 반면에, 약병원성 이하의 병원성을 보이는 균주들의 F2 사슬은 일반적으로 류신 (leucine)으로 개시한다.
미국에서 뉴캐슬병의 동정은 불활화 백신의 사용을 이끌어 냈다 (Hofstad, 1953). 일부 동물 풍토병 바이러스가 단지 순한 질환을 생산했다는 관찰은 최초로 미소제닉 생 백신 Roakin의 개발의 결과를 가져왔고, 이어서, 더 순한 Hitchner B1 및 LaSota (Goldhaft, 1980)의 개발을 가져왔다.
생백신들의 주요한 이점중 하나는 비용이 싼 대량 적용 기술에 의해 투여될 수 있다는 것이다. 통상적인 적용 방법은 물을 마시는 것을 통하는 것이다.
스프레이 및 에어로졸에 의한 생백신의 대량 적용은 많은 수의 새가 짧은 시간내에 백신 접종될 수 있다는 용이성 때문에 또한 매우 인기가 좋다. 입자들이 발생되는 조들을 조절함에 의해 정확한 입자 크기를 달성하는 것이 중요하다.
최근 사용되는 생백신들은 몇가지 문제점을 가지고 있다. 이 백신은 여전히 약간의 병원성을 가지고 있어 경우에 따라 백신 부작용이 나타 날 수 있다. 게다가, 모계로부터 물려받은 항체들이 생백신 바이러스를 중화하여 성공적인 면역 형성이 방해 될 수 있다. 그러므로 1차 백신 접종은 극히 순한 바이러스를 사용하는 것이 중요하며, 모체 이행 항체의 극복이 가능한 백신이 요구된다.
불활화된 백신은 바이러스를 죽이기 위해 포말린 또는 베타프로피오락톤으로 처리되고 적절한 보조제와 혼합된 감염성 요낭액으로부터 보통 생산된다. 불활화된 백신들은 근육 또는 피하 주사로 투여된다. 그러나 불활화된 백신들은 생산하고 적용하는데 비용이 비싼 단점이 있다.
최근 국내외에서 발생하고 있는 강병원성 NDV는 항원성에서 백신주와 많은 차이를 보일 것으로 추정되는데 이에 대한 근거로는 백신주의 유전형과 상당한 차이를 보이는 야외주의 발견과 백신 항체역가가 충분히 높지 않은 경우 폐사는 막을 수 있지만 산란율 저하는 막지 못한다는 사실 등을 들 수 있다.
NDV의 유전형은 F 유전자의 부분 염기서열에 기초한 계통 분석에 의하여 I형부터 IX형까지로 분류된다. 국내에 분포하는 뉴캐슬병 바이러스는 대부분 분자역학 상 VI형과 VII형에 속한다. 이 중, VI형의 경우 집중적인 백신 접종에 의하여 변이주가 출현하였지만, VII형에 비해서는 상대적으로 낮은 분리율을 보이고 있으 며, 2000년 이후에는 대부분 VII형 바이러스만이 분리되고 있어서, 멸종의 가능성도 있는 것으로 생각되고 있다. 따라서 염기서열 분석 및 게놈사업을 통한 최근 NDV의 유전자 구조 결정 및 최근 GenBank에 등록되어 있는 전 세계 NDV와의 유전자 비교를 통한 분자역학 연구는 최적의 백신주 개발에 있어 매우 중요하다.
현재 상용화 된 뉴캐슬병 (ND) 불활화 오일백신은 약병원성 NDV인 클론 30 또는 라소타주를 사용하여 생산된 것이며, 강병원성 NDV를 이용한 불활화 백신은 안전성 문제 때문에 제조가 금지 되어 있다. 따라서 보다 안전하고, 경제적이며, 야외주와 유사한 항원성을 보이는 ND 백신 생산기술의 필요성이 증대되고 있는데 현재 역유전학 (Reverse Genetics) 기술을 이용한 백신 개발이 이러한 요구에 가장 근접한 기술이다.
네거티브 가닥 RNA 바이러스의 역유전학(Reverse Genetics) 기술은 바이러스 게놈으로부터 감염성 있는 바이러스를 회수하는 기술로서 제안된 방식이다 (US Patent No. 5,166,057 등 참조). 이러한 기술은 원래 인플루엔자 바이러스 게놈을 조작하기 위하여 제안된 것이지만, 인플루엔자 바이러스 이외의 RNA 바이러스인 광견병 바이러스(Rabies Virus), 호흡기 합포체 바이러스 (Respiratory Syncytial Virus), 센다이 바이러스 (Sendaivirus)를 비롯하여 다양한 분절과 비분절 네거티브 가닥 RNA 바이러스에 성공적으로 적용되고 있다.
본 발명자들은 상기와 같은 역유전학 기술을 이용하여 신규 백신주 개발을 위한 연구를 거듭한 결과, 야외주와 유사한 항원성을 갖는 안전한 ND 백신주 생산 기술을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 재조합 NDV 게놈 전사 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 병원성 NDV의 표면 항원을 갖는 약병원성 재조합 NDV를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기와 같은 재조합 NDV 게놈 전사 벡터를 사용하여 ND에 대해 탁월한 예방효능을 가지면서 병원성은 낮은 재조합 NDV를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 역유전학 기술을 이용하여 NDV의 면역원성은 높이고 병원성은 낮추는 NDV의 약독화 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 NDV를 함유하는 ND 백신을 제공하는 것이다.
본 발명은 재조합 뉴캐슬병 바이러스 게놈 전사 벡터, 이를 포함하는 병원성 뉴캐슬병 바이러스의 표면 항원을 갖는 약병원성 재조합 뉴캐슬병 바이러스, 상기의 재조합 뉴캐슬병 바이러스 게놈 전사 벡터를 사용하여 ND에 대해 탁월한 예방효능을 가지면서 병원성은 낮은 재조합 NDV를 제조하는 방법, 및 상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 함유하는 뉴캐슬병 백신에 관한 것이다.
본 발명의 F 유전자 (384bp; F 유전자 뉴클레오타이드 위치 1~384bp)와 Neighber-Joining법을 이용한 뉴캐슬바이러스의 계통 분석 결과는 다음과 같다:
상기 그림에 나타난 균주들은 예시에 불과한 것이며, 현재 수많은 종류의 뉴캐슬병 바이러스 균주들이 상기와 같이 I형 내지 IX형으로 분류되어 있으며, 뉴캐슬병 바이러스를 분자 역학적으로 분류한 결과가 많이 보고되어 있어서, 상기와 같은 분류의 기준과 각 유형에 속하는 균주들은 이 발명이 속하는 기술 분야의 통상 의 지식을 가진 자가 용이하게 알 수 있을 것으로 생각된다. 본 명세서에서의 균주 분류 및 그 기준은 다음과 같은 참고 문헌에 기재된 내용을 인용하며, 하기의 문헌들은 모두 본 명세서에 참조로서 포함된다:
1. Kwon H.J. PhD Thesis. Seoul National University, 2000.
2. Lomniczi B., Wehmann E., Herczeg J., Ballagi-Pordㅱny A., Kaleta E.F., Werner O., Meulemans G., Jorgensen P.H., Mante A.P., Gielkens A.L.J., Capua I., and Damoser J., Arch Virol143, 49-64, 1998.
3. Herczeg J., Wehmann E., Bragg R.R., Travassos Dias P.M., Hadjiev G., Werner O., andLomniczi, B. Arch Virol144, 2087-2099, 1999.
4. Yang C.Y., Shieh H.K., Lin Y.L., Chang P.C., Avian Dis 43, 125-130, 1999.
5. Kwon H.J., Cho S.H., Ahn Y.J., Seo S.H., Choi K.S., and Kim S.J. Vet Microbiol95, 39-48,2003.
6. Liu X.F., Wan H.Q., Ni X.X., Wu Y.T., and Liu W.B. (2003). Pathotypical and genotypical characterization of strains of Newcastle disease virus isolated from outbreaks in chicken and goose flocks in some regions of China during 1985-2001. Arch Virol, 148, 1387-1403.
7. Tsai H.J., Chang K.H., Tseng C.H., Frost K.M., Manvell R.J., and Alexander D.J. Vet Microbiol, 104, 19-30, 2004.
현재 백신주로서 사용되는 라소타/46은 II형인데 반하여, 현재 야외주로서 발견되고 있는 균주들은 이와 유전적으로 거리가 먼 VI형 내지 VII형이 대부분이다. 예컨대, NDV의 HN 단백질에서 345-PDEQDYQIR-353 부위가 중화항체를 형성하는 중요한 선형항원으로 알려져 있다. 국내 병원성 NDV는 VI형 (95-98, 99-70, 99-71)과 VII형 바이러스가 공존해 왔으나 VI형 NDV는 1999년을 마지막으로 2000년부터 2006년까지는 전혀 분리되지 않고 있고, 1995년 가금에서 최초로 분리된 VIIa형의 NDV는 이후 분리되지 않고, VIId 형의 NDV만 분리되고 있다. VI 형 바이러스의 경우 선형항원의 변이 (E347K)가 1993년과 1994년 분리주들 (SNU9358GG, SNU9444)에서 처음 확인된 이후로 95-98, 99-70, 99-71에서도 지속적으로 관찰되어 이러한 변이주가 한동안은 면역을 회피하여 생존해왔던 것으로 판단되며, 2000년 이후 VIId형 바이러스의 전국적인 확산 이후 거의 멸종 된 것으로 판단된다. VII형 바이러스들의 경우 1995년부터 2001까지 분리된 바이러스들은 모두 라소타주의 선형항원과 동일하였으나 2002년에 처음으로 선형항원 변이주 (E347K)가 출현하였고, 2005년에는 추가적인 변이를 보이는 NDV가 우점하는 양상을 보여 주었다 (아래 표 참조).
| Classical epitope | Variant epitope | |
| Year | 346DEQDYQIRM354 | 346-K------M/K-354 |
| 1995 | 1 | - |
| 2000 | 16 | - |
| 2001 | 1 | - |
| 2002 | 15 (79%) | 4 (10.5%) |
| 2003 | 1 | 1 |
| 2004 | - | 1 |
| 2005 | 1 (6.25%) | 15 (93.75%) |
| 2006 | - | 2 |
이러한 점을 감안할 때, 기존의 백신주 라소타/46으로는 현재 유행하고 있는 뉴캐슬병에 대한 효과적인 예방이 불가능할 것으로 생각되며, 본 발명은 야외주에 대하여 우수한 항원성을 갖는 백신주 개발 기술을 제공한다는 점에서 가장 큰 의의가 있다고 할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 강병원성 뉴캐슬병 바이러스는, 별도의 언급이 없는 한, 통상적으로 분류되는 강병원성 뉴캐슬병 바이러스 뿐 아니라 중간 이상의 병원성을 갖는 모든 병원성 뉴캐슬병 바이러스를 포함하는 의미로 사용된다. 본 발명에 있어서, 강병원성 뉴캐슬병 바이러스는 동물 감염 시 체내 모든 세포에서 감염성 있는 바이러스가 만들어짐으로써 병원성을 나타내는 것으로, F 단백질의 113번째부터 116번째 아미노산 서열이 다음의 식 1과 같이 표현되는 경우 체내 대부분의 세포 내에 분포하는 퓨린 또는 퓨린 유사 단백질분해효소 (이하 퓨린)에 의해 절단되어 활성을 갖는 구조를 갖게 되므로 바이러스의 감염능력이 생기게 된다. 따라서 병원성 뉴캐슬병 바이러스는 F 단백질의 113번째부터 116번째 아미노산 서열의 코딩 서열로서 다음의 식 1로 표현되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 갖는 것으로 정의된다:
[식 1]
113-X1X2X3X4-116
상기 식 중
X1, X3 및 X4는 각각 독립적으로 아르기닌 (R) 또는 리신 (K)이고,
X2는 알라닌, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 발린, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파르 트산, 글루타민산, 아르기닌, 히스티딘 및 리신으로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산임.
이 때, F의 112번째 아미노산도 아르기닌 또는 리신과 같은 염기성 아미노산인 경우 더욱 강한 병원성을 나타내게 된다.
또한, 본 명세서에 있어서, 약병원성 뉴캐슬병 바이러스는, 별도의 언급이 없는 한, 통상적으로 분류되는 약병원성 뉴캐슬병 바이러스 분 아니라 무독 뉴캐슬병 바이러스를 포함하는 의미로 사용된다. 본 발명에 있어서, 약병원성 뉴캐슬병 바이러스는 동물 감염 시 체내 일부 세포 내와 소화관 및 호흡기관의 세포외 단백질 분해효소에 의해서만 활성화되어 국소적인 바이러스 증식이 일어나 약한 병원성을 나타내는 것으로, F의 113번째부터 116번째 아미노산 서열이 다음의 식 2와 같이 표현되는 경우를 의미한다. 따라서 약병원성 뉴캐슬병 바이러스는 F의 113번째부터 116번째 아미노산 서열의 코딩 서열로서 다음의 식 2로 표현되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 갖는 것으로 정의 된다:
[식 2]
113-X5X6X7X8-116
상기 식 중
X5, X6 및 X7은 각각 독립적으로 알라닌, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 발린, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파르트산, 글루타민산, 아르기닌, 히스티딘 및 리신으로 이 루어진 군 중에서 선택된 아미노산이고, X5와 X7은 동시에 아르기닌 (R) 또는 리신 (K)이 아니며,
X8은 아르기닌 (R) 또는 리신 (K)임.
뉴캐슬병 바이러스는 퓨린에 의하여 F 단백질에 위치하는 퓨린 인식 부위(cleavage site)가 절단되어 세포막과 융합되는 F 단백질의 융합 펩티드 부위가 노출되면 비로소 감염능력을 갖게 된다. 퓨린은 동물의 전신에 분포하는 효소이므로, 퓨린에 의한 바이러스 감염능력 활성화는 전신에서 발생하여 병원성을 나타낸다. 따라서, 뉴캐슬병 바이러스의 병원성은 F 단백질에 위치하는 퓨린 절단 부위가 퓨린에 의하여 인지되고 절단되는 정도에 따라서 달라진다.
뉴캐슬병 바이러스 F 단백질의 퓨린 인식 부위 (113 내지 116번째 아미노산)가 상기의 식 1의 아미노산 서열과 같이 적어도 3개 이상의 염기성 아미노산 (113-R-X-K/R-R-116)을 갖는 경우, 퓨린에 의한 바이러스 감염이 전신적으로 일어나므로 병원성을 나타내게 된다. 그러나 상기의 식 2의 아미노산 서열과 같이, 하나 이상의 염기성 아미노산이 비염기성 아미노산으로 치환되는 경우에는 퓨린에 의한 인식 및 절단이 거의 일어나지 않고, 오로지 국소적으로 존재하는 세포 내 또는 세포 외 단백분해효소에 의해 절단이 이루어지므로 치명적인 전신감염은 일어나지 않아 병원성은 낮다.
본 발명은 약병원성 뉴캐슬병 바이러스의 게놈을 근간으로 하면서, 표면 항원과 관련된 F 단백질 및 HN 단백질 코딩 부위를 국내 및 아시아 지역에서 유행하 는 강병원성 바이러스의 것으로 치환시킴으로써 강병원성 바이러스에 대한 방어효능을 높이는 동시에, 강병원성 뉴캐슬병 바이러스의 115번째 코돈을 비염기성 아미노산을 코딩하는 코돈으로 치환하되 적어도 2번 이상의 점 돌연변이를 거쳐야 염기성 아미노산을 코딩하는 코돈으로 변하는 특정 코돈으로 치환시켜 유전적으로 안정한 약독 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 제작하는 기술에 관한 것이다. 본 발명에 따른 재조합 뉴캐슬병 바이러스는 상기한 바와 같이, 야외주와 동일 또는 유사한 표면 항원을 나타내어 야외주에 대한 항원성이 높고, 효과적으로 약독화되어 있을 뿐 아니라, 115번 코돈에서 적어도 2번 이상의 점 돌연변이를 거쳐야 강병원성으로 변환 가능하므로, 안정성과 안전성 면에서 탁월한 특성을 가지고 있다.
또한, 병원성 뉴캐슬병 바이러스는 세포변성효과에 따라 합포체 (syncytium)를 형성하는 합포체형과 과립 (granules)을 형성하는 과립형 (granulation)으로 분류할 수 있는데, 일반적으로 합포체 형이 과립 형보다 병원성이 강한 것으로 알려져 있다. 본 발명은 F 및 HN 코딩 부위를 제공하는 강병원성 뉴캐슬병 바이러스로서 과립-형에 속하는 바이러스 클론을 사용하여 병원성을 대폭 감소시켰다는 특징이 있다. 또한, 뉴캐슬병 바이러스의 HN에 있어서도, 강병원성 뉴캐슬병 바이러스는 상대적으로 짧은 571개의 아미노산만 갖는 반면, 약병원성 뉴캐슬병 바이러스는 이보다 긴 577개 또는 616개의 아미노산을 가지고 있어서, HN의 C 말단 아미노산 서열에 의해 강병원성주와 약병원성주가 구분될 수 있다. 따라서, 본 발명에서는 상기와 같은 HN의 C 말단을 약병원성주와 같도록 변형 (577개 아미노산)시켜 더욱 더 약독화 된 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 제작하였다.
본 명세서에 있어서, 본 발명에 따른 뉴캐슬병 바이러스의 게놈 전사 벡터와 재조합 뉴캐스병 바이러스에 포함된 것으로 기재된 P, M, F, HN 및 L 단백질의 코딩 서열은 상기 각각의 단백질을 직접 코딩하는 염기서열 뿐 아니라, 발현된 단백질에 영향을 미치지 않는 한, P, M, F, HN 및 L 유전자에 존재할 수 있는 모든 비암호화 (non-coding) 서열도 포함할 수 있는 것으로 해석된다.
보다 구체적으로, 본 발명은 뉴캐슬병 바이러스의 NP, P, M, F, HN 및 L 단백질의 코딩 서열로 구성된 유전자 절편; 상기 유전자 절편에 작동 가능하게 연결된 프로모터 및 터미네이터를 포함하는 뉴캐슬병 바이러스의 게놈 전사 벡터로서,
상기 NP, P, M 및 L 유전자는 약병원성 뉴캐슬병 바이러스인 라소타주 게놈으로부터 유래한 것이고, 상기 F 및 HN 유전자는 강병원성 뉴캐슬병 바이러스인 KBNP-4152 게놈에서 유래한 것이고,
상기 F 단백질 코딩 서열에 있어서, KBNP-4152를 포함하는 강병원성 뉴캐슬병 바이러스 F의 115번째에 위치하는 염기성 아미노산을 코딩하는 코돈이 GCA, GCC, GCG 및 GCU로 이루어진 알라닌 코딩 코돈; GAC 및 GAU로 이루어진 아스파르트산 코딩 코돈; UUC 및 UUU로 이루어진 페닐알라닌 코딩 코돈; AUC 및 AUU로 이루어진 이소류신 코딩 코돈; UUA 및 UUG로 이루어진 류신 코딩 코돈; UCA, UCC, UCG 및 UCU로 이루어진 세린 코딩 코돈; ACC 및 ACU로 이루어진 트레오닌 코딩 코돈; GUA, GUC, GUG 및 GUU로 이루어진 발린 코딩 코돈; 및 UAC 및 UAU로 이루어진 티로신 코딩 코돈으로 이루어진 군 중에서 선택된 코돈으로 치환된 것을 특징으로 하는,
뉴캐슬병 바이러스의 게놈 전사 벡터에 관한 것이다.
상기 벡터의 HN 유전자는 1번부터 569번 코돈까지는 강병원성 뉴캐슬병 바이러스의 아미노산을 코딩하고, 570번 이후의 코돈은 라소타주를 포함하는 약병원성 뉴캐슬병 바이러스의 아미노산을 코딩하도록 추가적으로 변이된 것일 수 있다.
또한, 상기 프로모터와 터미네이터는 사용된 플라스미드에서 뉴캐슬병 바이러스 게놈과 작동가능하게 연결될 수 있는 것이면 제한 없이 사용할 수 있으며, 이러한 프로모터와 터미네이터는 이 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 용이하게 선택하여 사용할 수 있을 것이다. 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 프로모터 및 터미네이터로서 T7 프로모터 및 T7 터미네이터를 사용할 수 있다.
본 발명의 구체예에 있어서, 상기 게놈 전사 벡터는 SEQ ID NOs: 2 내지 7의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 아래의 SEQ ID NO: 1의 염기서열을 갖는 것일 수 있다 (도 23 참조).
Gene start
1 accaaacagagaatccgtgagttacgataaaaggcgaaggagcaattgaagtcgc acggg
61 tagaa ggtgtgaatctcgagtgcgagcccgaagcacaaactcgagaaagccttctgccaa
M S S V F D E Y E Q L L A A Q T R P N G ·
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241 TAACAGTGATGACCCAGAAGATAGATGGAGCTTTGTGGTATTCTGCCTCCGGATTGCTGT
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301 TAGCGAAGATGCCAACAAACCACTCAGGCAAGGTGCTCTCATATCTCTTTTATGCTCCCA
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361 CTCACAGGTAATGAGGAACCATGTTGCCATTGCAGGGAAACAGAATGAAGCCACATTGGC
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601 TACCCTGGAGAGGATCCTCTCTATCCAGGCTCAAGTATGGGTCACAGTAGCAAAAGCCAT
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661 GACTGCGTATGAGACTGCAGATGAGTCGGAAACAAGGCGAATCAATAAGTATATGCAGCA
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1021 GTATCGGATGAAAGGAGATAATGCGCCGTACATGACATTACTTGGTGATAGTGACCAGAT
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1081 GAGCTTTGCGCCTGCCGAGTATGCACAACTTTACTCCTTTGCCATGGGTATGGCATCAGT
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1141 CCTAGATAAAGGTACTGGGAAATACCAATTTGCCAGGGACTTTATGAGCACATCATTCTG
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1321 CGACGATACCAGCAGCATATACATGCCTACTCAACAAGTCGGAGTCCTCACTGGGCTTAG
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1381 CGAGGGGGGGTCCCAAGCTCTACAAGGCGGATCGAATAGATCGCAAGGGCAACCAGAAGC
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·Q D N D T D W G Y
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gene End
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gene start
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M A T F T D A E I D E L
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1981 AGACTGTTGGAAGGAGTGCAATCCCACAAGGCAAGACCAAGGTGCTGAGCGCAGCATGGG
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2041 AGAAGCATGGGAGCATCCAGCCACCGGCCAGTCAAGACAACCCCGATCGACAGGACAGAT
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2101 CTGACAAACAACCATCCACACCCGAGCAAACGACCCCGCATGACAGCCCGCCGGCCACAT
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2161 CCGCCGACCAGCCCCCCACCCAGGCCACAGACGAAGCCGTCGACACACAGTTCAGGACCG
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2221 GAGCAAGCAACTCTCTGCTGTTGATGCTTGACAAGCTCAGCAATAAATCGTCCAATGCTA
ApaI
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2281 AAAA GGGCCC ATGGTCGAGCCCCCAAGAGGGGAATCACCAACGTCCGACTCAACAGCAGG
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2341 GGAGTCAACCCAGTCGCGGAAACAGTCAGGAAAGACCGCAGAACCAAGTCAAGGCCGCCC
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2401 CTGGAAACCAGGGCACAGACGTGAACACAGCATATCATGGACAATGGGAGGAGTCACAAC
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2461 TATCAGCTGGTGCAACCCCTCATGCTCTCCGATCAAGGCAGAGCCAAGACAATACCCTTG
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2521 TATCTGCGGATCATGTCCAGCCGCCTGTAGACTTTGTGCAAGCGATGATGTCTATGATGG
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2581 AGGCGATATCACAGAGAGTAAGTAAGGTTGACTATCAGCTAGATCTTGTCTTGAAACAGA
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2641 CATCCTCCATCCCTATGATGCGGTCCGAAATCCAACAGCTGAAAACATCTGTTGCAGTCA
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2701 TGGAAGCCAACTTGGGAATGATGAAGATTCTGGATCCCGGTTGTGCCAACATTTCATCTC
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2941 AGGACACTGTCCGTGCATTGATCATGTCACGCCCAATGCACCCGAGTTCTTCAGCCAAGC
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3001 TCCTAAGCAAGTTAGATGCAGCCGGGTCGATCGAGGAAATCAGGAAAATCAAGCGCCTTG
· L N G
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Gene End Gene start M D S S ·
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4021 CGTAGATAGGAAGGGGAAGAAAGTGACATTTGACAAGCTGGAAAAGAAAATAAGGAGCCT
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Gene End MluI
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Gene start M G S K ·
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Cleavage site
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NotI
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4921 TGTAGCTCTTGGGGTTGCAACAGCGGCACAGATAACAGCA GCGGCCGC CCTAATACAAGC
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4981 CAACCAGAATGCCGCCAACATCCTCCGGCTTAAGGAGAGCATTGCTGCAACCAATGAAGC
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5041 TGTGCATGAAGTCACCGACGGATTATCACAACTATCAGTGGCAGTTGGGAAGATGCAGCA
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5221 GATCACTTCCCCTGCATTAACTCAGTTGACCATCCAAGCACTTTATAATTTAGCTGGTGG
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6121 CCTGATGTACAAACAGAAGGCACAACAAAAGACCTTGCTATGGCTTGGGAATAATACCCT
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Gene start
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T7 Promoter
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또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 NP, P, M, F, HN 및 L 유전자의 코딩부위를 갖는 뉴캐슬병 바이러스에 있어서, 상기 NP, P, M 및 L 유전자의 코딩부위는 약병원성 뉴캐슬병 바이러스로부터 유래한 것이고, 상기 F 및 HN 단백질 코딩 서열은 강병원성 뉴캐슬병 바이러스로부터 유래한 것이며, 상기 강병원성 뉴캐슬병 바이러스 F 단백질의 115번 아미노산을 코딩하는 코돈이 GCA, GCC, GCG 및 GCU로 이루어진 알라닌 코딩 코돈; GAC 및 GAU로 이루어진 아스파르트산 코딩 코돈; UUC 및 UUU로 이루어진 페닐알라닌 코딩 코돈; AUC 및 AUU로 이루어진 이소류신 코딩 코돈; UUA 및 UUG로 이루어진 류신 코딩 코돈; UCA, UCC, UCG 및 UCU로 이루어진 세린 코 딩 코돈; ACC 및 ACU로 이루어진 트레오닌 코딩 코돈; GUA, GUC, GUG 및 GUU로 이루어진 발린 코딩 코돈; UAC 및 UAU로 이루어진 티로신 코딩 코돈으로 이루어진 군 중에서 선택된 코돈으로 치환된 것을 특징으로 하는, 재조합 뉴캐슬병 바이러스에 관한 것이다. 상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스의 HN 유전자는 1번부터 569번 코돈까지는 강병원성 뉴캐슬병 바이러스의 아미노산을 코딩하고, 570번 이후의 코돈은 라소타주를 포함하는 약병원성 뉴캐슬병 바이러스의 아미노산을 코딩하도록 추가적으로 변이된 것일 수 있다.
본 발명의 구체예에 있어서, 상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스는 KCTC 10984BP일 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 뉴캐슬병 바이러스는 강병원성 야외주와 동일 또는 유사한 표면 항원을 갖기 때문에 야외주와 동일 또는 유사한 항원성을 나타내면서도, 기존의 약병원성 백신주보다도 감소된 병원성을 나타내는 것을 특징으로 한다. 병원성 뉴캐슬병 바이러스는 F에 퓨린 절단부위를 가지며, 퓨린에 절단됨으로써 세포막과 융합되는 F 단백질의 융합 펩티드가 노출됨으로써 바이러스의 감염능력이 생긴다. 퓨린은 체내 대부분의 세포 내에 분포하므로 뉴캐슬병 바이러스의 전신감염이 일어나므로 강병원성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 게놈 전사 벡터에 있어서, 상기 약병원성 뉴캐슬병 바이러스는 상기에 정의된 바와 같으며, 예컨대, 뉴캐슬병 바이러스 I형 또는 II형에 속하는 균주들로 이루어진 군 중에서 선택된 것일 수 있으며, 본 발명의 구체예에 있어서, II형에 속하는 라소타/46 균주 (AY845400)를 사용할 수 있다. 상기 강병원성 뉴캐 슬병 바이러스는 상기에 정의된 바와 같으며, 현재 전 세계적으로 유행하는 야외주로서 III, V, VI, VII, VIII, XI형을 사용할 수 있고, 바람직하게는 뉴캐슬병 바이러스 VI형 및 VII형 균주들로 이루어진 군 중에서 선택된 것일 수 있다. 본 발명의 구체예에 있어서, 상기 강병원성 뉴캐슬병 바이러스는 KBNP-4152(기탁번호: KCTC 10919BP)일 수 있다. 상기 KBNP-4152 균주의 제조 방법 및 특성은 대한민국 특허출원 제2006-0026667호 및 'Cho SH, Ahn YJ, Kim SJ, Kwon HJ. Characterization of a Newcastle disease virus with variation in the major Hemagglutinin-Neuraminidase (HN) linearepitope. The49th Annual Meeting of the Korean Society of Veterinary Science 2005, 45 (3,suppl),199.'에 기재된 바와 같다 (상기 문헌들은 모두 본 명세서에 참조로서 포함된다). 본 명세서에 있어서, 강병원성 뉴캐슬병 바이러스와 약병원성 뉴캐슬병 바이러스는 특별한 언급이 없는 한, 상기와 같이 정의된다.
이전의 역 유전학을 이용한 뉴캐슬병 바이러스의 약독화에서는 115번째 아미노산을 글리신으로 치환시킨 예가 있었으나, 이와 같이 글리신으로 치환된 경우에는 이를 코딩하는 코돈 중 단지 하나의 염기만 변이되어도 염기성 아미노산인 리신 또는 아르기닌으로 치환되어 다시 병원성을 회복하게 된다는 문제점이 있다.
그러나, 본 발명에 따른 재조합 뉴캐슬병 바이러스는 F 단백질의 115번째 코돈이 적어도 2번 이상의 점 돌연변이를 거쳐야 염기성 아미노산을 코딩하는 코돈으로 변하는 비 염기성 아미노산 코딩 코돈을 가지므로, 병원성을 회복할 가능성이 매우 낮으며, 기존의 약 독화된 변이주와 비교하여 안정성이 현저하게 증가된 것을 특징으로 한다. 본 발명과 같이 F 단백질의 퓨린 절단부위가 변형된 경우에는, 퓨린에 의한 절단이 일어나지 않아 전신감염이 일어나지 않으며, 일부 체내 세포, 호흡기 및 소화기관에 분포하는 트립신 또는 트립신 유사 효소에 의해서만 분해되므로 국소 감염만이 일어나게 되는 것이다.
이러한 효과를 달성하기 위하여, 본 발명의 F 단백질의 115번째 코돈은 GCA, GCC, GCG 및 GCU로 이루어진 알라닌 코딩 코돈; GAC 및 GAU로 이루어진 아스파르트산 코딩 코돈; UUC 및 UUU로 이루어진 페닐알라닌 코딩 코돈; AUC 및 AUU로 이루어진 이소류신 코딩 코돈; UUA 및 UUG로 이루어진 류신 코딩 코돈; UCA, UCC, UCG 및 UCU로 이루어진 세린 코딩 코돈; ACC 및 ACU로 이루어진 트레오닌 코딩 코돈; GUA, GUC, GUG 및 GUU로 이루어진 발린 코딩 코돈; 및 UAC 및 UAU 티로신 코딩 코돈으로 이루어진 군 중에서 선택된 코돈으로 치환된 것을 특징으로 하는 것이다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 약병원성 뉴캐슬병 바이러스의 F 단백질 및 HN 단백질 코딩 부위를 강병원성 뉴캐슬병 바이러스의 F 및 HN 단백질 코딩 서열로 치환시키고, 상기 F 유전자의 115번 코돈을 GCA, GCC, GCG 및 GCU로 이루어진 알라닌 코딩 코돈; GAC 및 GAU로 이루어진 아스파르트산 코딩 코돈; UUC 및 UUU로 이루어진 페닐알라닌 코딩 코돈; AUC 및 AUU로 이루어진 이소류신 코딩 코돈; UUA 및 UUG로 이루어진 류신 코딩 코돈; UCA, UCC, UCG 및 UCU로 이루어진 세린 코딩 코돈; ACC 및 ACU로 이루어진 트레오닌 코딩 코돈; GUA, GUC, GUG 및 GUU로 이루어진 발린 코딩 코돈; 및 UAC 및 UAU 티로신 코딩 코돈으로 이루어진 군 중에서 선택된 코돈으로 치환시켜, 강병원성 뉴캐슬병 바이러스와 동일 또는 유사한 항원성을 발현시키고, 병원성을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 재조합 뉴캐슬병 바이러스의 제조 방법에 관한 것이다.
상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스의 제조를 위해 상기 HN 유전자는 1번부터 569번 코돈까지는 강병원성 뉴캐슬병 바이러스의 아미노산을 코딩하고, 570번 이후의 코돈은 라소타주를 포함하는 약병원성 뉴캐슬병 바이러스의 아미노산을 코딩하도록 추가적으로 변이시킨 것일 수 있다.
본 발명의 재조합 뉴캐슬병 바이러스의 제조 방법은 상기한 바와 같은 본 발명에 따른 뉴캐슬병 바이러스의 게놈 전사 벡터를 숙주 세포에서 발현시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 숙주 세포에는 제한이 없으며, 본 발명의 구체예에 있어서 Hep2 및 BHK21로 이루어진 군 중에서 선택된 동물 세포를 사용할 수 있다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 약병원성 뉴캐슬병 바이러스의 F 및 HN 유전자의 코딩부위를 강병원성 뉴캐슬병 바이러스의 F 및 HN 단백질 코딩 서열로 치환시키고, 상기 F 유전자의 115번 염기성 아미노산 코딩 코돈을 GCA, GCC, GCG 및 GCU로 이루어진 알라닌 코딩 코돈; GAC 및 GAU로 이루어진 아스파르트산 코딩 코돈; UUC 및 UUU로 이루어진 페닐알라닌 코딩 코돈; AUC 및 AUU로 이루어진 이소류신 코딩 코돈; UUA 및 UUG로 이루어진 류신 코딩 코돈; UCA, UCC, UCG 및 UCU로 이루어진 세린 코딩 코돈; ACC 및 ACU로 이루어진 트레오닌 코딩 코돈; GUA, GUC, GUG 및 GUU로 이루어진 발린 코딩 코돈; UAC 및 UAU 티로신 코딩 코돈으로 이루어진 군 중에서 선택된 코돈으로 치환시키는 것을 특징으로 하는, 뉴캐슬병 바이러스 의 항원성 및 안정성 증가 및 약독화 방법에 관한 것이다.
상기 방법은 상기 HN 유전자는 1번부터 569번 코돈까지는 강병원성 뉴캐슬병 바이러스의 아미노산을 코딩하고, 570번 이후의 코돈은 라소타주를 포함하는 약병원성 뉴캐슬병 바이러스의 아미노산을 코딩하도록 추가적으로 변이시키는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 방법은 본 발명에 따른 재조합 뉴캐슬병 바이러스 게놈 전사 벡터를 사용하는 것일 수 있다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 상기와 같은 항원성이 증가하고 병원성이 감소된 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 함유하는 뉴캐슬병 백신에 관한 것이다. 상기 뉴캐슬병 백신은 상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 불활화시킨 사독 백신형태일 수 있다. 상기 불활화는 이 발명이 속하는 기술 분야에 알려진 모든 통상적인 방법을 사용할 수 있으며, 예컨대, 포름알데하이드 또는 브로모메틸아민 하이드로브로마이드 등을 사용하는 것일 수 있다. 또한, 상기 뉴캐슬병 백신은 병원성이 매우 낮고 안정성 및 안전성이 높은 균주이기 때문에, 생백신 형태로 사용하거나, 수정란에 직접 사용하는 in ovo 백신 형태로 사용할 수 있다. 생백신 형태로 사용되는 경우, 그 투여 방법에는 제한이 없으며, 증상 및 목적에 따라서, 피하 또는 근육 투여, 직접적인 계태아 주사법 (in ovo 백신), 또는 스프레이 또는 음수 등을 이용하여 투여할 수 있다. 본 발명의 백신 투여량은 투여 방법 및 투여 대상 개체의 상태에 따라서 달라지며, 예컨대, 101 EID50 내지 1012 EID50 균주/개체의 양으로 사용 가능하다. 구체적으로, 사독 백신의 경우 바람직하게는 106.0~12 EID50/수 가 적당하며, 보다 바람직하게는 108.0~10 EID50/수 양으로 사용 가능하다. In ovo 백신의 경우 종란의 모체이행항체 정도에 따라 101~9.0 EID50/종란의 양으로 사용이 가능하지만, 보다 바람직하게는 103.0~7.0 EID50/종란 의 양으로 사용 될 수 있다.
상기한 바와 같이, 뉴캐슬병 바이러스의 병원성은 F 단백질의 퓨린 절단부위 아미노산 서열에 따라 결정된다. 즉, F 단백질의 퓨린 절단부위의 아미노산 서열이 R-X-K/R-R (113번째부터 116번째 아미노산 위치, 이하, 특별한 언급이 없는 한, 모든 아미노산 테트라머에 적용됨)이면 모든 세포내에 존재 하는 퓨린에 의해 잘라져 활성화 되므로 전신감염이 일어나 강병원성을 나타낸다. 그러나 R-Q-G-R 또는 G-Q-G-R과 같이 염기성 아미노산이 단 1개 혹은 떨어져서 1개만 존재하게 되면 일부 세포내, 소화관 및 기관의 상피세포 일부에 존재하는 트립신 및 유사 효소에 의해서만 활성화 되므로 국소감염만 일어나게 되어 병원성이 낮다. HN에 있어서도, 강병원성 바이러스는 상대적으로 짧은 571개의 아미노산만 가지고 있다. 반면, 약병원성 뉴캐슬병 바이러스의 경우에는 보다 긴 577개 또는 616개의 아미노산을 가지고 있으며, 이 뒷부분의 아미노산에 의해 강병원성주와 구분된다. 그러므로 F의 퓨린 절단부위와 HN의 C 말단 부위를 다양하게 조합한 재조합 바이러스를 만들어 다양한 단계의 병원성을 가진 바이러스를 제작할 수 있는 것이다.
특히, 본 발명은, 유전적 변이에 의해 병원성을 획득하지 못하도록 F의 퓨린 절단 부위의 아미노산 서열을 보다 안전한 아미노산 서열로 바꾼 것을 특징으로 한다. 약병원성의 F의 퓨린 절단 부위의 아마노산 서열은 R-Q-G-R또는 K-Q-G-R이다. 강병원성주가 되기 위해서는 R-X-K/R-R로 변해야 하므로 3번째 위치하고 있는 글리신 (G)이 아르기닌 (R) 또는 리신 (K)으로 바뀌어야만 한다. 그러나 G에서 R/K로의 변환은 한 개의 점 돌연변이만으로 쉽게 일어날 수 있다. 즉 글리신의 코돈은 GGA, GGC, GGG 또는 GGU인데 아르기닌/리신의 코돈은 AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, CGU, AAA 또는 AAG이므로 글리신의 코돈이 무엇이든 단 한 번의 돌연변이로도 쉽게 아르기닌이나 리신으로 치환되어 강병원성 뉴캐슬병 바이러스로 변환될 수 있는 것이다. 실제로 2001년 호주에서는 비병원성 NDV인 울스터주가 유사한 기전으로 병원성이 증가하여 NDV가 발생한 사례가 보고되었다.
따라서 본 발명에서는 이러한 백신주의 점 돌연변이에 의한 병원성 증가 확률을 기존의 백신주보다 현저히 낮추기 위하여, PTDS (PCR based Two steps DNA synthesis) 기법 등 통상적으로 알려진 기술을 이용하여 점 돌연변이에 의한 리신/아르기닌으로의 아미노산 변화가 일어날 확률이 낮은 아미노산과 코돈을 갖는 재조합 바이러스를 제작한 것이다. 즉, R-Q-A-R 또는 G-Q-A-R과 같이, 기존의 약병원성 뉴캐슬병 바이러스 F의 115번 아미노산 글리신을 알라닌, 아스파르트산, 페닐알라닌, 이소류신, 류신, 세린, 트레오닌, 발린 및 티로신으로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산으로 치환시킴으로써, 이들 아미노산의 코딩 코돈의 전부 또는 일부는 최소 2 개 이상의 염기가 동시에 변이된 경우만 R/K로 변이가 일어나므로, 보 다 안전한 백신주의 제조가 가능하게 된 것이다.
본 발명에 따라 제작된 재조합 뉴캐슬병 바이러스의 병원성 정도는 평균치사시간 (Mean Death Time; MDT) 및 뇌 내 병원성 지수 (Intracerebral Pathogenicity Index; ICPI)를 측정하여 결정하였으며, 그 생물학적 성상은 EID50 (50% egg-infectious dose) 및 혈구 응집 해리 양상 등에 의하여 확인하였다. 이와 같은 측정 결과, 본 발명의 재조합 뉴캐슬병 바이러스는 기존의 약병원성 균주보다도 병원성이 감소된 것으로 나타났다.
이하, 본 발명을 실시예를 들어 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: 바이러스 유전자 클로닝
1.1. 바이러스 cDNA의 합성
최근 국내에서 유행하는 강병원성 항원성 변이주 뉴캐슬병 바이러스를 대표할 수 있는 바이러스로서, 서울대학교 수의과대학 조류질병학실에서 분리된 SNU4152주를 선정하였다. 이 바이러스를 계태아섬유아세포 (CEF) 상에서 3회 플라크 정제를 하여 클로닝 하였고, SPF 발육란에서 2회 계배배양 하여 KBNP-4152(기탁번호 KCTC 10919BP)로 명명하였다.
RNA의 조작은 RNase가 없는 유리제품 및 플라스틱 제품에서 수행되었고, 사 용된 모든 용액은 1% 디에틸-피로카보네이트 (DEPC)를 처리하여 고압멸균 한 3차 증류수 (DEPC-DW)를 사용하였다. 이후 바이러스를 Beckman SW40 로터 (Beckman)에서 40℃, 21000rpm에서 70분간 원심분리 하였고, 펠렛을 완충용액 (50mM Tris HCl pH7.5, 50mM EDTA, 0.5% SDS)에 재부유시켜 교반하면서 37℃에서 90분간 프로테아제 K(200㎍/ml, Invitrogen co.)를 처리한 후 산성 페놀 추출법으로 RNA를 추출하였다. 그 후 에탄올 침전법으로 RNA를 침전시킨 후, 75% 에탄올로 세척하여 건조한 후 DEPC-DW에 부유시켰다. 자외선 분광기(Eppendorf, Biophotometer)로 정량 (15㎍/㎕) 하여 RNA 1㎕와 아래의 표 1에 나타낸 프라이머 (10pmol/㎕) 1㎕를 DEPC-DW 10㎕와 혼합하고, 70℃에서 10분간 변성시킨 후, 5ㅧ RT 완충용액 4㎕ (250mM Tris-HCl, pH 8.3, 375 mM KCl, 15mM MgCl2; GibcoBRL/Life Technologies), 0.1M DTT 2㎕ 및 10mM dNTPs (각각 2.5mM) 2㎕를 첨가해 42℃에서 2분간 배양하였다. 그 후 역전사효소 1㎕(200unit, Invitrogen co.)를 첨가하고 42℃에서 60분간 배양하였다.
[표 1] KBNP-4152 cDNA 합성용 프라이머
| 프라이머 | 프라이머 서열 (5'->3') |
| ND-ZJ-1F | cgtctcgaccaaacagagaatctgtgaggtac (SEQ ID NO: 8) |
| ND-ZJ-1746F | gacaacacaggcacagctcg (SEQ ID NO: 9) |
| ND-ZJ-2827F | catctccttacgtgacacaagg (SEQ ID NO: 10) |
| ND-ZJ-F-F | tcgcgacgcaatatgg ctccaaactt tc (SEQ ID NO: 11) |
| ND-ZJ-HN-F | ccgcggcaccgacaac aagagtcaat catg (SEQ ID NO: 12) |
| ND-ZJ-8100F | actagttgagatcctcaaggatgatag (SEQ ID NO: 13) |
| ND-ZJ-11648F | catgcaatgttgtccagagatg (SEQ ID NO: 14) |
| ND-ZJ-12539F | tcagagagagatttcgcgagac (SEQ ID NO: 15) |
| ND-ZJ-14021F | cattgtgacattgagattcctcc (SEQ ID NO: 16) |
1.2. 바이러스 유전자의 클로닝
GeneBank의 데이터를 기초로 하여 15,192bp에 달하는 상기 합성된 9종의 바이러스 cDNA를 다음의 표 2에 나타난 바와 같은 9개의 프라이머 쌍으로 PCR 법을 통해 유전자를 증폭하였고, 클로닝하여 얻어진 클론을 Z1 내지 Z9이라 명명하였다.
[표 2] KBNP-4152 유전자 클로닝용 프라이머
| 프라이머 | 프라이머 서열 (5'->3') |
| ND-ZJ-1F | cgtctcgaccaaacagagaatctgtgaggtac (SEQ ID NO: 8) |
| ND-ZJ-1844R | tcgtcttggtctctggatgtctc (SEQ ID NO: 17) |
| ND-ZJ-1746F | gacaacacaggcacagctcg (SEQ ID NO: 9) |
| ND-ZJ-2948R | cttctccactcccatgtcagg (SEQ ID NO: 18) |
| ND-ZJ-2827F | catctccttacgtgacacaagg (SEQ ID NO: 10) |
| ND-ZJ-4612R | cagcataatccgggtgatcagc (SEQ ID NO: 19) |
| ND-ZJ-F-F | tcgcgacgcaatatggctccaaactttc (SEQ ID NO: 11) |
| ND-ZJ-F-R | ccgcggtagaacggatgttgtgaagcctaa (SEQ ID NO: 20) |
| ND-ZJ-HN-F | ccgcggcaccgacaacaagagtcaatcatg (SEQ ID NO: 12) |
| ND-ZJ-HN-R | ctcaacta g taagggaacgatcctaaattcc (SEQ ID NO: 21) |
| ND-ZJ-8100F | actagttgagatcctcaaggatgatag (SEQ ID NO: 13) |
| ND-ZJ-11815R | tatggtatcagggttggatacacc (SEQ ID NO: 22) |
| ND-ZJ-11648F | catgcaatgttgtccagagatg (SEQ ID NO: 14) |
| ND-ZJ-12591R | agctcataactcttgaagatagc (SEQ ID NO: 23) |
| ND-ZJ-12539F | tcagagagagatttcgcgagac (SEQ ID NO: 15) |
| ND-ZJ-14110R | cacagaatgcatggcaatcagg (SEQ ID NO: 24) |
| ND-ZJ-14021F | cattgtgacattgagattcctcc (SEQ ID NO: 16) |
| ND-ZJ-15118R | actgaatccgaatacgacttcc (SEQ ID NO: 25) |
PCR 과정 중에 발생하는 인위적인 돌연변이율을 낮추기 위해 교정 기능이 있는 DNA 중합효소 Pwo (Invitrogen co.)를 사용하였고, PCR 증폭산물은 용액의 경우 Boehringer Mannheim 사의 정제키트를 아가로스 겔인 경우 Qiagen사의 정제 키트를 사용하였다.
상기 PCR 결과 얻어진 KBNP-4152 바이러스 유전자 RT-PCR및 각 PCR산물의 위치를 도 1에 나타내었다.
상기에서 정제된 9종의 증폭산물은 XL-topo, pCR8/GW/Topo 또는 pcDNA3.1V5 topo 벡터 (Invitrogen co.)에 TA 클로닝 하였으며, 각각 3개 이상의 클론을 확보하여 플라스미드를 추출 정제하여 염기서열을 결정하였다.
모든 염기서열은 cyclic sequencing kit (PRISM Ready Reaction Dye terminator kit)와 자동염기서열분석기 (ABI310, Applied Biosystems Co.)로 결정하였다.
염기서열 분석에 사용된 primer는 M13 forward, M13 reverse primer를 사용하였고, 이들 프라이머로 모두 읽히지 않는 fragments의 경우 primer walking의 방법에 의해 다음 표 3의 프라이머를 사용하여 분석하였다.
[표 3] KBNP-4152 바이러스 염기서열 분석용 프라이머.
| Primer | Primer sequence (5'->3') |
| ND-ZJ-597F | ctgacactctggaaagaatcc (SEQ ID NO: 26) |
| ND-ZJ-3421F | gatccagcgc cttgattcgt (SEQ ID NO: 27) |
| ND-ZJ-8662F | caggtgtttagaagaactggc (SEQ ID NO: 28) |
| ND-ZJ-5759F | cctcctggtatcatatcgca (SEQ ID NO: 29) |
| ND-ZJ-4679 | gtaacaggagataaggcagtc (SEQ ID NO: 30) |
| ND-ZJ-7670 | ttcttgtaccaacgagggtc (SEQ ID NO: 31) |
| ND-ZJ-9328F | cctacaggagctcaaagacac (SEQ ID NO: 32) |
| ND-ZJ-9977F | ctaagagatgacagtgtggc (SEQ ID NO: 33) |
| ND-ZJ-10588F | acttgctgcagcaagatctc (SEQ ID NO: 34) |
| ND-ZJ-13052F | gtggtctcaggcttatatgc (SEQ ID NO: 35) |
상기와 같은 TA-클로닝 벡터를 아래의 도 2B에 나타내었으며, PCR을 통하여 EcoRI으로 처리하여 삽입된 절편의 크기를 확인하여 2A에 나타내었다.
KBNP-4152 균주는 중국의 거위 유래 SF02와 가장 높은 염기서열 및 아미노산 서열 상동성을 보였는데, 바이러스 단백질 중 NP, P, M, L의 경우 98% 이상의 높은 상동성을 보인 반면 P, V 및 HN의 경우 각각 96.2%, 95.0%와 97.6%의 비교적 낮은 상동성을 보였다. 서열 상동성 측정 결과를 표 4에 나타내었다.
[표 4] 분리된 KBNP-4152 균주와 다른 균주와의 서열 상동성
| KBNP-4152 | NP aaa (ntb) | P aa (nt) | V aa (nt) | M aa (nt) | F aa (nt) | HN aa (nt) | L aa (nt) |
| VII(SF02) (AF473851) VII(ZJ-1) (AF431744) Ulster (AY562991) La Sota (AY845400) | 99.2 (97.1) 99.0 (97.0) 94.1 (87.2) 91.3 (84.5) | 96.2 (97.6) 94.7 (97.1) 81.6 (83.1) 80.9 (81.6) | 95.0 (96.8) 92.9 (95.7) 75.5 (79.0) 76.3 (78.6) | 98.6 (98.0) 98.1 (97.4) 89.1 (86.6) 87.4 (84.7) | 98.4 (97.6) 97.7 (97.5) 90.3 (86.2) 88.8 (84.2) | 97.6 (97.6) 97.9 (97.7) 89.9 (84.4) 88.5 (81.7) | 98.9 (98.0) 98.9 (98.0) 94.3 (87.2) 92.0 (85.9) |
a: 아미노산 서열 상동성 퍼센티지 (%)
b: 뉴클레오타이드 서열 상동성 퍼센티지 (%)
특히 세포내 인터페론 발현을 방해하는 V 단백질에서의 변이가 큰 것은 세포내 방어 체계를 극복하는 과정에서 아미노산 변이가 축적된 결과일 수 있으며, HN 단백질의 변이가 비교적 큰 것은-선형항원의 변이에서 알 수 있듯이-체액성 면역 반응을 회피하는 과정에서 특정 아미노산 변이를 갖는 바이러스들이 선택되었기 때문인 것으로 사료된다. 상기 KBNP-4152 균주의 유전자 염기서열 및 각 유전자의 코딩 아미노산 서열을 GenBank에 등록하였다 (Accession No. DQ839397).
이 외에도 HN 및 F 단백질의 시스테인 및 N-linked glycosylation 위치의 변화, HN의 구조 및 극성에 영향을 줄 수 있는 아미노산의 변화 및 F의 구조 및 극성에 영향을 줄 수 있는 아미노산의 변화를 측정하여 각각 표 5 내지 7에 나타내었다.
[표 5] HN 및 F 단백질의 시스틴 및 N-linked glycosylation 위치의 변화
[표 6] HN의 구조 및 극성에 영향을 줄 수 있는 아미노산의 변화
| KBNP-4152 | (508-510) NVS | 60 L | 128 C | 256 G | 269 S | 293 K | 310 D | 323 D | 340 H | 347 K | 354 K | 384 K | 479 H | 494 D | 495 E |
| VII(SL03) | NIS | S | - | - | - | - | - | N | - | - | M | - | - | - | - |
| VII(consensus) | NIS | S | - | - | - | - | - | N | - | E | M | - | - | - | - |
| Ulster | SIS | P | - | E | - | E | N | N | Y | E | M | E | Y | - | K |
| La Sota | STS | P | W | E | R | G | S | N | Y | E | M | E | Y | G | V |
| VGGA | STS | P | W | E | R | G | S | N | Y | E | M | E | Y | G | - |
a Not done.
[표 7] F의 구조 및 극성에 영향을 줄 수 있는 아미노산의 변화
| KBNP-4152 | 27 R | 76 C | 104 G | 112 R | 115 K | 145 N | 192 N | 195 R | 232 Q | 247 N | 403 D | 422 H | 430 D | 480 S | 486 S |
| VII(consensus) | - | - | - | - | - | - | - | - | - | D | - | - | - | R | - |
| Ulster | C | F | E | G | G | - | K | Q | - | D | - | Q | - | K | - |
| La Sota | C | - | E | G | G | K | K | Q | K | D | N | Q | G | K | R |
| VGGA | C | - | E | G | G | K | K | Q | K | D | N | Q | G | K | R |
상기한 결과들로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에서 사용된 KBNP-4152 균주는 VII형과 유사한 유전자형을 갖는 것으로 나타났으며, 기존의 백신주인 La Sota주를 비롯하여 다른 유형의 바이러스와 유전적으로 차이가 있는 균주인 것으로 나타났다.
실시예 2: 라소타주를 기본 백본(back bone)으로 한 재조합 뉴캐슬병 바이러스 게놈 전사 벡터의 제조
2.1. 뉴캐슬병 바이러스 (NDV) 발현 모벡터 pTMH의 설계 및 제작
NDV의 cDNA로부터 바이러스를 만들어내기 위해서는 바이러스 게놈의 5'과 3'양쪽 끝에 불필요한 염기의 첨가 없이 바이러스 게놈과 똑같은 구조로 전사되어야 한다. 이러한 구조를 얻기 위해서 다음과 같은 특징의 모벡터 pTMH를 제조하였다 (SEQ ID NO: 84):
1) 전사(transcription) 개시부 바로 앞에 T7 프로모터가 위치하도록 하였다. (도 3 및 4 참조).
2) NDV 안티게놈(antigenomic) RNA 직후에는 간염 델타 바이러스(Hepatitis delta virus; HDV) 리보자임 (ribozyme) RNA을 위치시켜 self cleavage가 일어날 수 있도록 하였다.
3) T7프로모터와 HDV 리보자임 사이에는 최종적으로 NDV 게놈을 클로닝 할 수 있는 Multi-Cloning Site (MCS)를 갖도록 하였다 (도 4 참조).
4) 15 kb에 달하는 NDV 안티게놈 전체를 포함하고도 클로닝 벡터가 대장균 내에서 안정적으로 존재 할 수 있도록 pBR322의 복제 개시 염기서열 (ori)을 갖도록 하였다.
5) T7 프로모터와 NDV 전사 개시가 되는 안티게놈 5'-말단 사이, 및 NDV전사가 끝나는 안티게놈 3'-말단과 HDV 리보자임 사이에 각각 인식부위와 절단부위가 상이한 BsmB I과 Bsa I 인식 염기서열을 위치시켜 NDV 안티게놈으로부터 바이러스 게놈 RNA의 양쪽 말단이 정확하게 전사되도록 하였다 (도 3 참조).
도 4에 나타낸 바와 같이, 링커 제작용 프라이머 TM p1-p4중 TM p2와 TM p3는 1.5pmole 씩 그리고 TM p1과 TM p4는 30pmole 씩을 한 PCR tube에 넣고, 10xPCR buffer 5㎕, 2.5mM dNTP 5㎕, Taq polymerase 2.5U을 각각 넣어 총 부피가 50㎕가 되도록 DW를 넣어 준 후, 94℃-1분, 90℃-30초- 55℃-45초-72℃-15초 반응을 25회 반복 하였고, 72℃-5분 반응시켰다. PCR amplicon을 확인한 후 pCR8/GW/Topo TA 클로닝 벡터에 클로닝 하였고, 정확한 염기서열을 갖는 클론을 pCR-TM vector로 명명하였다.
상기의 HDV F, R primer를 이용하여 pTV vecter (목암 생명공학연구소 박만훈 박사 제공)부터 HDV ribozyme과 T7 terminator부분을 PCR방법으로 증폭하여 얻은 fragments 역시 pCR8/GW/Topo TA cloning 벡터에 클로닝 하였고, 정확한 염기서열을 갖는 클론을 pCR-HDV로 명명하였다.
pCR-HDV vector를 BsaI과 NdeI 제한 효소로 절단하여 얻은 HDV fragment와 BsaI과 NdeI 제한 효소로 절단한 pCR-TM 벡터를 T4 DNA ligase로 ligation 하였고, Top10F' competent cell에 transformation하여 얻은 벡터를 pCR-TMH라 명명하였다. 대장균에 안정적으로 클로닝 할 수 있도록 pBR322 벡터 (Promega co, Cat. # D1511) 에 pCR-TMH 벡터의 T7 promoter-MCS-HDV ribozyme 부분을 EcoRI과 NdeI 제한효소를 이용하여 subcloning하였으며, 이를 pTMH 벡터라 명명하였다 (SEQ ID NO: 84).
상기의 pTMH 벡터 제작 과정을 도 5에 모식적으로 나타내었으며, 제작된 모벡터 pTMP의 개략적인 개열 지도와 주요 부위 염기서열을 도 6에 나타내었으며, 제작된 pTMH 벡터의 염기서열을 도 7에 나타내었다.
본 실시예에서 제작된 모벡터 pTMH의 제한효소 인식 부위는 다음과 같다:
인식부위가 없는 경우 (No site found)
AccI AflII AgeI AvaI BclI BglII BsaAI BsaBI BsmF I BsmI BspMI BssHII BstBI BstEII Bsu36I EagI EcoRV HindIII HpaI KpnI Mfe I MluI NaeI NcoI NheI NotI NsiI PmeI PvuII SalI SfiI SmaI SphI XbaI Xcm I XhoI XmaI
인식부위가 하나인 경우
XmnI 1959 SspI 2166 SpeI 64 SacII 55
SacI 175 RsrI 0 PstI 1605 NspI 471
NruI 49 NdeI 293 HincII 1903 FspI 1584
EcoRI 0 EaeI 1752 ClaI 43 BstXI 155
BsmB I 30 BsiWI 70 Bmr I 1404 BglI 1478
BanI 1312 BamHI 181 AvrII 76 AseI 1535
Apo I 0 ApaI 35 AlwNI 882 AflIII 471
인식부위가 2개인 경우
StyI 76, 256 RsaI 71, 1843 HaeII 345, 715
ApaLI 785, 2031 AatII 147, 2282 Bsa I 82, 1431*
2.2. 라소타주의 전체 cDNA 클로닝
라소타/46 균주(AY845400)에 대한 RNA 추출 및 cDNA 합성은 상기 실시예 1에 기재된 방법에 따라 실시하였다.
2.2.1. NDV 전장 cDNA의 PCR
GenBank의 data를 기초로 하여, 총 15,186bp에 달하는 NDV cDNA 전체를 클로닝하기 위해 모두 8부분 (S1 내지 S9)으로 나누어 아래의 표 4에 기재한 프라이머를 사용하여 실시예 1에 기재된 방법에 따라 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하였다.
[표 8] 라소타 전체 게놈 유전자 클로닝용 프라이머
| Primer | Primer sequence (5'->3') |
| S1-F | cgtctcgaccaaacagagaatccgtgagttacg (SEQ ID NO: 36) |
| S1-R | ccatgggccc tttttagcat tggacg (SEQ ID NO: 37) |
| S2-F | aaaagggccc atggtcgagc cc (SEQ ID NO: 38) |
| S2-R | tatcatcgat catgccgaca gtg (SEQ ID NO: 39) |
| S3-F | catgatcgat gataaaccca agc (SEQ ID NO: 40) |
| S3-R | tcgcgaatgagccggt cgggatccag ac (SEQ ID NO: 41) |
| S4-F | tcgcgacgcaatatgg ctccaaactt tc (SEQ ID NO: 42) |
| S4-R | ccgcggtagaacggat gttgtgaagc ctaa (SEQ ID NO: 43) |
| S5-F | ccgcggcaccgacaac aagagtcaat catg (SEQ ID NO: 44) |
| S5-R | ctcaacta g t aagggaacga tcctaaattc c (SEQ ID NO: 45) |
| S6-F | a c tagt tgagat cctcaaggat gatag (SEQ ID NO: 46) |
| S7-R | gatccgtacg aatgcagctg aactc (SEQ ID NO: 47) |
| S9-F | cctagg tatt accaaactca aaga (SEQ ID NO: 48) |
| S9-R | GGTCTCaaccaaacaaa gatttggtga atg (SEQ ID NO: 49) |
상기와 같은 라소타주 유전자 RT-PCR 및 각 PCR산물의 위치를 도 8에 나타내었다.
라소타주의 유전자 8부분을 각각 TA-클로닝 벡터에 클로닝한 모습을 도 9B에 나타내었으며, PCR로 EcoRI으로 처리하여 삽입된 절편의 크기를 확인하여 도 9A에 나타내었다.
2.2.2. NDV 전장 cDNA의 클로닝 및 염기서열 결정
상기 PCR에 의해 얻어진 산물은 아가로스 겔에서 전기영동한 뒤 GeneClean IIITM (Qbio co.)를 사용하여 정제하고, Topo cloning kit (Invitrogen) 또는 XL-Topo Tcloning kit (Invitrogen)를 사용하여 클로닝 하였다. 클로닝 된 각 클론들 은 벡터 내에 있는 M13 forward, M13 reverse등과 같은 프라이머를 이용하거나, 아래의 표 9에 기재된 프라이머를 사용하여 전체 염기서열 분석을 통해 이미 알려진 라소타주의 염기서열과 동일한, 즉 돌연변이가 발생하지 않은 클론들만 선별하였다.
[표 9] 라소타주 게놈 염기서열 분석용 프라이머.
| Primer | Primer sequence (5'->3') |
| La-601 | taccctggagaggatcctc (SEQ ID NO: 50) |
| La-1261 | cgagctaaagctaaccccag (SEQ ID NO: 51) |
| La-1901 | agatgcagagatcgacgagc (SEQ ID NO: 52) |
| La-2581 | aggcgatatcacagagagta (SEQ ID NO: 53) |
| La-3271 | gtgccccaattgtgccaag (SEQ ID NO: 54) |
| S6-F-La | actagttgagatcctcaaagatgacgg (SEQ ID NO: 55) |
| S6-R-La | tgctctgccctttcaggaccggagctcgccatg (SEQ ID NO: 56) |
| S7-F-La | catggcgagctccggtcctgaaagggcagagca (SEQ ID NO: 57) |
| La-5121 | cagctcaggaattagactgc (SEQ ID NO: 58) |
| La-5711 | gtcatcgccaactgcaagat (SEQ ID NO: 59) |
| La-7042 | ctccggacatctgcaacag (SEQ ID NO: 60) |
| La-8591 | aaactcggaagggcagtac (SEQ ID NO: 61) |
| La-9311 | ttcgcattcaacctgcagg (SEQ ID NO: 62) |
| La-9971 | cttagagatgacaatgtggc (SEQ ID NO: 63) |
| La-10661 | gtaagatcagacgactctcc (SEQ ID NO:64) |
| La-11321 | tttgagactgttgcaagcc (SEQ ID NO: 65) |
| La-12012 | tgtcgccacatgtaaaggc (SEQ ID NO: 66) |
| La-12721 | tacccgaaattggatcagtg (SEQ ID NO: 67) |
| La-13339 | catgtctcggaagagcctc (SEQ ID NO: 68) |
| La-13981 | atctgcagtgccctacaga (SEQ ID NO: 69) |
| La14976 | acagtaactgtgactcttaacgaaaatcacatattaataggctcc (SEQ ID NO: 70) |
| La15020R | ggagcctattaatatgtgattttcgttaagagtcacagttactgt (SEQ ID NO: 71) |
| S7-R | gatccgtacgaatgctgctgaactc (SEQ ID NO: 72) |
| NDV-Pt-R | tgccactgmtagttgygata (SEQ ID NO: 73) |
| NDcomF156 | atacacctcrtcycagacag (SEQ ID NO: 74) |
| La-8892R | gagccatgcaaacttggctgtggacc (SEQ ID NO: 75) |
| La-14708 | acagtgcacgagacagatcc (SEQ ID NO: 76) |
| La-15092R | gtcctaaggagtcagggttc (SEQ ID NO: 77) |
염기서열에 변이가 없는 모든 클론들은 모벡터인 pTMH의 다중 제한효소 부위로 각각 순차적으로 도 10에 표시한 바와 같이 클로닝 하였다. L gene 사이에 새로운 제한효소 인식 부위 (ClaI)를 도입하였다. 상기 클로닝 과정을 도 10에 나타내었다.
2.2.3. RNP 복합체를 형성하기 위한 NP, P 및 L 유전자 게놈 전사 벡터 제조
뉴캐슬 바이러스 NP, P 및 L 유전자 게놈 전사 벡터를 제조하기 위하여 아래의 표 10의 프라이머로 라소타주의 NP, P 및 L 유전자를 각각 RT-PCR 하였고, 이를 TA-클로닝 벡터에 클로닝 하였다. 클론들을 염기서열 분석한 후, 돌연변이가 없는 클론들만 NotI으로 처리하여 pcDNA6/V5 벡터의 NotI 위치로 서브-클로닝 하였다.
[표 10] 라소타주 NP, P, L 유전자 증폭 및 클로닝 용 프라이머
| Primer | Primer sequence (5'->3') |
| NDV-NP-F | gagcggccgc-accatgagtacgagcagctcc (SEQ ID NO: 78) |
| NDV-NP-R | gagcggccgc-tcagtacccccagtcggtg (SEQ ID NO: 79) |
| NDV-P-F | gagcggccgc-accatggccacctttacagatg (SEQ ID NO: 80) |
| NDV-P-R | gagcggccgc-ttagccatttagagcaaggc (SEQ ID NO: 81) |
| NDV-L-F | gagcggccgc-accatggcgagcctccgatcctgaaa (SEQ ID NO: 82) |
| NDV-L-R | gagcggccgc-ttaagagtcacagttactgtaatatcc (SEQ ID NO: 83) |
상기 RT-PCR에 의한 NP, P, L 유전자 증폭 결과를 도 11의 A에 나타내었다. 각 유전자는 TA-cloning vector에 클로닝 하여 염기서열을 분석하여 돌연변이 없는 클론을 선발하였다. 이와 같이 선발된 클론을 도 11의 B에 나타내었다.
2.3. 야외 강병원성 NDV의 표면 항원을 갖는 재조합 약병원성 NDV 제조
2.3.1. 강병원성 KBNP-4152의 F와 HN 유전자를 약독화한 재조합 클론 제작
본 실시예에서는 최근 국내에서 유행하는 강병원성 뉴캐슬병 바이러스인 KBNP-4152의 F와 HN 유전자를 라소타주를 기본 백본으로 한 라소타주 전사 벡터(rNDV)에 삽입한 재조합 NDV 게놈 전사 벡터를 제작하였다.
2.3.2. 재조합 바이러스의 유전자 합성
각각의 F와 HN 유전자는 site-directed mutagenesis 또는 PTDS (PCR based Two steps DNA synthesis)를 이용하여 퓨린 절단 부위가 변형된 각각의 F와 HN 유전자를 얻었다 (Xiong, A. S. et al., 2004, Nucleic Acids Research, Vol32,No.12 e98). 상기 제작 과정을 도 12 내지 도 15에 나타내었다.
(가) 라소타의 M 유전자 3′-말단 부, KBNP-4152 F 유전자 연결부 및 퓨린 절단 부위의 염기서열이 변이된 유전자를 합성하였다.
재조합 바이러스를 제조하기 위하여, M 유전자 3′-말단까지는 라소타주의 게놈 서열을 갖도록 하고, 유전자간 염기서열 (intergenic sequence)과 유전자 시작 염기서열 (gene start sequence)부터는 KBNP-4152의 염기서열을 갖도록 두 개의 유전자를 융합시켰다 (도 13 참조). F 유전자를 약독화 하기 위하여 퓨린 절단 부위의 코돈들을 염기성 아미노산이 2개 또는 1개만 코딩 (112-RRQKRF-117에서 112-GRQARL-117)되도록 유전자 변이를 일으키고, 도 14와 같이 프라이머를 합성하여 화살표 방향대로 조합된 프라이머를 넣어, site directed mutagenesis 법 및 PTDS 법으로 인공합성 하였다.
(나) 그 후, KBNP-4152 HN (1-569) 유전자와 라소타주의 HN 유전자 말단 (570-577번)을 연결시켰다. 이와 같이 연결된 연결부위의 염기서열은 아래와 같다 (SEQ ID NO: 85, 밑줄 그은 부분부터 라소타주의 HN C-말단 코딩 염기서열임).
ccctttACTAGTTGAGATTCTCAAGGATGATGGGGTTAGGGAGGCCAGGGCTGGCCGCTT
GAGTCAATTGCGAGAGGGTTGGAAAGATGACATTGTATCACCTATCTTTTGCGACGCCAA
GAATCAAACTGAGTACCGGCGTGAGCTCGAGTCTTACGCTGCCAGCTGGCCA TAA TCAGC
TAGCGCTAATGTGATTAGATTAAATCTTGTCGATAGTCACTTGATTAAGAAAAAATGTAA
GTGGCAATGAGATACAAGGCAAAACAGCTCATGGTAAATAATACGGGTAGGACATGGCGA
(다) 상기와 같이 KBNP-4152 HN 유전자 (1-569)와 라소타주의 HN 유전자 말단 (570-577)을 연결하기 위해 도 15와 같이 프라이머를 설계하여 PTDS를 수행하였다.
2.3.3. 키메라 NDV (KBNP-C4152R2L) rescue
Hep-2 (한국유전자은행) 또는 BHK21 세포주 (목암생명공학 연구소의 박만훈 박사팀으로부터 제공받음)를 6웰 플레이트에서 80% 가량 키워놓은 후(37℃, 5% CO2), vaccinia T7 바이러스 (목암생명공학 연구소의 박만훈 박사팀으로부터 제공받음)를 감염시켰다. 상기 세포주에 NDV의 RNP복합체를 형성하기 위한 NP, P, L 유전자 게놈 전사 벡터인 pcDNA3.1-NP, pcDNA3.1-P 및 pcDNA3.1-L 3 개의 벡터 (도 11의 B)와 약독화 된 KBNP-4152 F 유전자의 전사 시작부에서 HN 유전자 569까지를 라소타주 게놈 전사 벡터 (rNDV?) 중 M 유전자 뒤의 유전자간 서열 (intergenic sequence) 부분과 HN 유전자의 570사이에 삽입하여 재조합 NDV 게놈을 전사 할 수 있는 pTMH C4152-R2L (SEQ ID NO: 1, 도 23 참조)를 제작하였다.
상기 플라스미드 벡터를 각각 1:1:0.1:1비율로 섞은 플라스미드 DNA 4㎍당 10㎕의 LipofectamineTM(Invitrogen Co.)과 혼합하여 트랜스펙션 하였다. 여기에 1㎕/ml 의 아세틸화 트립신을 첨가하여 약병원성 재조합 바이러스가 생성되어 감염성을 갖도록 하였다. 얻어진 세포주를 2-3일간 37℃에서 배양한 후 6웰의 세포 및 세포 배양액을 수확하여 급동결 및 급해동을 3회 거쳐 9~11일령의 SPF 발육란에 접종하고, 요막액을 수확하여 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 얻었으며, 이를 KBNP-C4152R2L이라 명명하였다. 상기 균주 KBNP-C4152R2L는 2006년 9월 12일자로 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52번지에 소재하는 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하여, 기탁번호 KCTC 10984BP를 부여받았다.
이와 같은 KBNP-C4152R2L의 생성 과정을 도 16에 나타내었다.
상기와 동일한 방법으로, F 단백질의 퓨린 절단 부위에 4 개의 염기성 아미노산을 갖는 강병원성 NDV (RRQKRF; KBNP-C4152R4L이라 명명)와 1 개의 염기성 아미노산을 갖는 약병원성 NDV (GGQARL; KBNP-C4152R1L이라 명명)을 각각 제조하였다. 상기 균주 이름은 퓨린 절단 부위의 염기성 아미노산 수에 따라 정한 것으로, R 뒤의 숫자는 퓨린 절단 부위의 112에서 116번 아미노산 중의 염기성 아미노산의 개수를 의미하며, L (long)은 HN 단백질의 길이가 라소타주와 같은 577개 아미노산인 것을 나타낸다.
상기 얻어진 KBNP-C4152R1L, KBNP-C4152R2L 및 KBNP-C4152R4L의 모식도를 도 17에 나타내었다.
실시예 3: KBNP-C4152R2L 분석
3.1. 키메라 NDV의 일반적 특성 조사
상기에서 얻어진 KBNP-C4152R2L을 9~10령의 SPF 발육란에 접종한 후, 3~5일 뒤 요막액을 수확하여 평판 혈구응집검사를 통해 재조합 NDV가 증식하였는지 확인하였다. 그 결과를 도 18에 나타내었다. 도 18에서 알 수 있는 바와 같이, KBNP- C4152R2L을 접종하여 얻은 요막액에서 혈구 응집이 관찰되었으며, 이를 통하여 KBNP-C4152R2L의 증식을 확인하였다.
KBNP-C4152R2L은 대부분의 F 및 HN 유전자가 야외 강병원성 주인 KBNP-4152와 동일하지만, F의 퓨린 절단 부위가 인공적으로 합성된 바이러스로, 강병원성 NDV 특이 프라이머를 사용한 PCR로는 바이러스의 RNA가 검출 되지 않으며, 모든 NDV를 공통적으로 검출하는 프라이머를 통해서만 바이러스의 RNA가 검출되는 것으로 나타났다. 이러한 사실은 표 5의 NDV-pt-R과 NDVcomF156 프라이머를 사용하는 RT-PCR로 증폭된 바이러스의 RNA 염기서열을 결정하여 재조합 NDV의 유전자 표지를 확인하였다. 상기의 RT-PCR 방법을 통하여 키메라 바이러스를 검출하고 병원성 유형을 확인하여 그 결과를 도 19에 나타내었다. 도 19에 나타낸 바와 같이, KBNP-C4152R2L은 NDV 공통 프라이머로(NDVcomF156)는 검출 가능하지만, 병원성주 특이 프라이머(NDV-pt-R)(특허 제0451883호)로는 검출이 불가능하였다.
보다 정밀한 바이러스 동정을 위하여 RT-PCR 후 염기서열을 분석하여 인공적으로 합성된 F의 퓨린 절단 부위를 코딩하는 유전자 염기서열을 확인하여 그 결과를 도 20에 나타내었다. 도 20에 나타낸 바와 같이, 모 균주인 KBNP-4152의 F의 퓨린 절단 부위는 112-RRQKRF-117의 구조를 갖는 반면, KBNP-C4152R2L은 112-GRQARL-117의 구조를 갖는 것으로 나타났다. 특히 115번째 아미노산 위치에 존재하는 알라닌(A)은 자연계의 NDV는 가지고 있지 않는 본 발명의 키메라 바이러스만의 특징이라고 할 수 있다.
3.2. 키메라 NDV의 혈청학적 특성 조사
KBNP-C4152R2L의 F 및 HN은 KBNP-4152와 유사하고 라소타주와는 뚜렷한 차이를 보이므로, KBNP-C4152R2L는 KBNP-4152와 혈청학적으로 유사하나 라소타주와는 차이를 보일 것으로 예상된다. 이를 확인하기 위하여 교차-혈구응집억제 검사를 실시하여 혈청학적 특성을 조사하였으며, 그 결과를 도 21에 나타내었다. 예상한 바와 같이, KBNP-C4152R2L은 KBNP-4152와 유사한 혈청학적 특성을 보이는 것으로 나타났다. 즉 항라소타 항혈청은 라소타주와 비교하여 KBNP-C4152R2L 및 KBNP-4152에 대해 4 내지 8배 낮은 혈구응집역가를 보였고, 항KBNP-4152 항혈청은 자신이나 KBNP-C4152R2L에 대해 거의 유사한 혈구응집역가를 보이는 것으로 나타났다.
3.3. KBNP-C4152R2L의 병원성 지수 측정
3.3.1. 평균치사시간 (Mean Death Time; MDT) 측정
MDT측정은 Alexander(1988)의 방법에 준하여 실시하였다. 본 발명의 KBNP-C4152R2L을 멸균 PBS로 10-6으로 희석한 바이러스를 10개의 발육 계란을 5개씩 두 그룹으로 나누어 접종하였다. 첫 번째 그룹은 오전 9시에 접종을 실시하며, 두 번째 그룹은 오후 5시에 실시하였다. 접종 후 7 일간 37℃에서 배양하면서 매일 오전 9시와 5시에 검란을 실시하여 치사시간을 기록하여 MDT를 계산하였다. 측정된 MDT가 60시간 이내의 경우 강병원성, 60-90시간 이상의 경우 중간 독, 90~120시간은 약병원성, 그리고 120~∞는 무병원성으로 판정하였다. 백신 바이러스의 MDT는 최소 90시간이상이어야 한다. 그 결과, 본 발명의 KBNP-C4152R2L은 평균치사시간이 168시간 이상으로 측정되어 무병원성 NDV로 분류되었다.
3.3.2. 뇌 내 병원성 지수 (Intracerebral Pathogenicity Index, ICPI) 측정
1 일령 병아리 각각 10마리에 멸균 식염수로 10배 희석한 요막액 (실시예 12.3.3) 50㎕를 1cc주사기를 이용해 뇌 내로 접종한 후 매일 정상 병아리는 0, 병증을 보인 병아리는 1, 죽은 병아리는 2로 점수를 매겨 매일 합계를 내어 8일간의 총 점수를 80으로 나누어 계산하였다. 무병원성은 0.0~0.2, 약병원성은 0.2~0.5, 중병원성은 1.0~1.5, 강병원성은 1.5~2.0으로 분류하였다. 국내에서 백신 바이러스로 활용하기 위해서는 최소 0.5이하의 병원성 지수를 보여야하므로, 0.0~0.5까지의 재조합 바이러스를 선정하였다.
KBNP-4152, KBNP-C4152R2L 및 라소타주의 ICPI를 측정한 결과를 각각 표 11 내지 13에 나타내었다.
[표 11] KBNP-4152의 ICPI 측정.
| Day | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | Sum(index) |
| Sign | 6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 6 x 1 |
| Dead | 4 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 74 x 2 |
| Normal | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Total = | 154 | ||||||||
ICPI = 154/80 = 1.925
[표 12] KBNP-C4152R2L의 ICPI 측정.
| Day | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | Sum(index) |
| Sign | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 x 1 |
| Dead | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 x 2 |
| Normal | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | |
| Total = | 154 | ||||||||
ICPI = 0/80 = 0.0
[표 13] 라소타주의 ICPI 측정.
| Day | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | Sum(index) |
| Sign | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3 | 5 | 2 | 10 x 1 |
| Dead | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 4 | 5 x 2 |
| Normal | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | |
| Total = | 20 | ||||||||
ICPI = 20/80 = 0.25
상기 평균치사시간(MDT) 및 ICPI 결과를 보면, KBNP-C4152R2L은 MDT가 168시간 이상이었으며, ICPI 또한 0.0으로 병원성이 거의 없는 바이러스로 확인되었다. 이러한 병원성 감소 결과는 본 발명의 KBNP-C4152R2L 균주가 기존의 약독화 된 라소타주보다도 훨씬 약독화 되어 병원성이 낮다는 것을 보여주며, 이러한 병원성의 급격한 저하는 세포변성 효과에 있어서 합포체 형성능력이 뛰어난 야외주의 F와 HN 유전자 대신 과립형의 세포 변성 효과를 보이는 야외 NDV의 F 및 HN 유전자를 도입하여 만든 재조합 바이러스에서 나타 날 수 있는 결과이다. 지금까지 강병원성 NDV 중 합포체형과 과립형의 세포변성효과를 나타내는 클론이 존재한다는 사실은 전세계적으로도 국내에서 거의 멸종한 것으로 의심되는 VI형 바이러스에서만 알려져 있었는데 합포체형 NDV 클론인 SNU9358GS (서울대학교 수의과대학 조류질병학실 보유)의 ICPI 수치 (1.95)보다 과립형 클론인 SNU9358GG (AF535861)의 수치 (1.78)가 더 낮아 병원성이 낮다는 것이 알려져 있었다. 그러나 VII형을 포함한 나머지 III, IV, V, VIII, XI 형 병원성 NDV에서는 이러한 과립형 세포변성효과를 일으키는 NDV 클론은 전혀 알려져 있지 않았는 바 본 연구자들은 VII형 NDV에서 과립형 NDV를 최초로 클로닝 하는데 성공하여 이 바이러스의 F 및 HN 유전자를 이용하여 과립형 세포변성효과를 나타내는 라소타주 보다 낮은 병원성을 갖는 재조합 NDV를 제작하는데 성공하였다.
3.4.
KBNP-C4152R2L의 유전적 안정성 시험
본 발명의 재조합 바이러스 KBNP-C4152R2L을 계태아에서 9번 이상 계대 배양한 후, 키메라 게놈 뉴클레오티드 4030~8889까지를 RT-PCR로 증폭한 후 염기서열 분석한 결과, 염기서열에 변화가 없어 매우 안정한 것으로 확인되었다.
3.5. KBNP-C4152R2L의 생산성 측정: EID
50
(50% egg-infectious dose) 측정
바이러스를 10진 희석하여 각 희석 배수 당 9~10일령 계태아 5~7개에 0.1ml 씩 요막강 내로 접종하고, 5~7일 간 37℃에서 배양한 후 계태아를 chilling 하며 요막액을 수확하여 혈구응집 반응을 통해 바이러스의 증식 여부를 판정하여 정해진 계산식에 따라 산출하였다. 그 결과, KBNP-C4152R2L의 EID50는 1010.1/㎖로 기존의 라소타주와 유사하여 생산성이 매우 높은 것으로 나타났다.
3.6. 혈구해리양상 측정
혈구응집 해리에 대한 조사는 Spalatin (1970)의 방법에 준하여 실시하였다. 즉 macro플레이트 웰에 CMF-PBS로 2진 희석한 라소타주와 KBNP-C4152R2L 각각 0.5ml에 1% 닭혈구를 0.25ml씩 넣고 실온에서 1시간 반응시킨 후 혈구응집 역가를 측정하였다. 1차 판독이 끝난 후 플레이트를 4℃에서 24시간 정치한 후에 혈구응집 역가를 측정하고 재 부유 2시간 후에 다시 혈구응집역가를 측정한다. 역가는 응집이 일어나는 최고 희석배수의 역수로 하였다. 판정 방법은 해리양상의 판정은 혈구응집 반응 24시간 후에 완전하게 해리가 일어나고 재 부유 2시간 후에도 혈구응집이 나타나지 않을 때 rapid eluter, 그렇지 않을 때 slow eluter로 판정하였 다.
그 결과, 라소타주는 slow eluter였으나 KBNP-C4152R2L은 rapid eluter로서 KBNP-4152와 동일한 생물학적 특성을 갖는 것으로 나타났다.
3.7. 세포변성 효과 측정
계태아 섬유아세포(CEF)를 96웰 플레이트 전면에 단층을 형성하도록 배양한 후 라소타주, KBNP-4152 및 KBNP-C4152R2L로 각각 감염시킨 후 (각각 200 TCID50/well), FBS 0.5%, trypsin 20㎍/㎖을 첨가한 배지로 교체하여 배양하고, 3일 뒤에 관찰한 결과를 도 22에 나타내었다. 사진 중간의 붉은 화살표는 NDV의 전형적인 세포변성 효과인 합포체가 형성된 모습을 나타내는 것으로, 실제로 KBNP-C4152R2L는 트립신 첨가 시 NDV의 특징적인 합포체를 형성하는 것을 확인할 수 있다 (도 22의 E의 붉은 화살표).
이러한 세포 변성 효과는 키메라 바이러스가 합포체 형성에 트립신 의존성을 갖는 약 병원성주임을 의미하나, 라소타주와 KBNP-4152주와는 달리 전형적인 합포체를 거의 형성하지 않고, 도 22의 D와 같이 과립형의 세포변성효과를 보였다.
3.8. KBNP-C4152R2L의 불활화 백신 실험
KBNP-C4152R2L의 계태아 배양 원액, 이를 10배 농축한 농축액 및 라소타주 계태아 배양액을 각각 0.3% 포름알데히드로 불활화 하였으며, 불활화 된 각각의 바이러스 항원 부유액 30%에 ISA70오일 70%를 유화하여 각각의 불활화 백신을 제조하였다. 이와 같이 제조된 불활화 백신을 6주령의 SPF 닭의 피하에 접종하였으며, 백신 접종 3주 후에 검역원에서 표준으로 사용하는 교정원주 106TCID50 (AY6304009)를 비강 및 구강으로 공격하였다. 공격 접종 후 10일까지의 폐사율을 관찰하였으며, 그 결과를 아래의 표 14에 나타내었다.
[표 14]
상기 표 14에 나타낸 바와 같이, KBNP-C4152R2L은 라소타주에 비하여 HA역가로 계산한 항원량이 낮은 경우에도 항체를 형성시키는 능력은 기존 백신에 비해 탁월한 것으로 나타났으며, 특히 혈청학적으로 라소타주에 비해 야외주에 대한 면역을 더욱 잘 형성하는 것으로 나타났다.
3.9. KBNP-C4152R2L의 in ovo 백신 실험
KBNP-C4152R2L은 현재 백신으로 사용되고 있는 균주보다도 병원성이 매우 낮아 in ovo 백신의 가능성이 높아 이를 확인하기 위해 18일령 상용계의 계태아를 이용하여 in ovo 백신을 투여했으며, 부화율 및 부화 2주 후의 증체율을 대조군과 비교하였고, 2주령 이후의 항체가를 검사함으로써 모체이행 항체 극복 여부와 면역 수준을 비교하였으며, 2주 후 강병원성 바이러스를 공격 접종하여 방어율을 확인하였다.
시험에 사용한 계태아는 상용 산란계로 18일령의 계태아에 107.0 EID50/ml이 되도록 희석한 각 백신주를 0.1cc씩 접종하였다. 또한 음성 대조군에는 멸균 PBS 0.1cc를 접종하였다. 모체이행항체의 수준을 알아보기 위해서 음성 대조군 중 5수를 부화 직후 희생시켜 혈청을 확보하였다. 부화 후 17일령에 각 그룹 당 개체 별 체중을 측정하고 채혈 하였으며, 강독주인 KBNP-4152 106.5 TCID50를 비강 및 구강으로 공격 접종하였다. 생존율은 공격 접종 후 10일까지 관찰하였다. 이와 같이 하여 얻은 결과를 아래의 표 15에 나타내었다.
[표 15] KBNP-C4152R2L의 in ovo 백신 효능 비교.
상기 표 15와 같이 KBNP-C4152R2L 접종군과 음성 대조군은 부화율 및 증체율에서 유의적인 차이가 없었으나, 부화 후 17일령의 항체 역가는 대조군에 비해 KBNP-C4152R2L 접종군에서 높게 유지되고 있음을 확인할 수 있다. 즉, 대조군의 경우 1일령의 경우 모체이행항체가 라소타주에 대한 혈구 응집 억제(HI)역가가 평균 5.8 ± 2.7에서 2.7 ± 1.7로 떨어진 반면 KBNP-C4152R2L 접종군은 라소타주에 대해서는 4.9 ± 1.1 그리고 자신에 대해서는 5.5 ± 1.4로 비교적 높은 역가를 보여 주었다. 또한 공격 접종 후 대조군에서 33.3%의 폐사를 보였으나 재조합 백신 접종군의 경우 100% 생존하였다.
이와 같은 결과는 Akzo Nobel N.V.(NL)사가 가지고 있는 기존의 "Recombinant Newcastle disease virus as an embryo vaccine"을 제목으로 하는 "US6,699,479B1" 특허 보다 월등한 결과 이며, P gene editing에 의한 약독화를 이 용하지 않고, 새로운 방법으로 개발된 KBNP-C4152R2L로부터 얻어진 것이라는 점에서 의미가 있다.
최근 선진국에서는 접종의 용이성 및 경제성 등의 이유로 병아리가 부화되기 전인 계태아에 직접 백신 하는 In ovo 백신이 선호되고 있지만, 뉴캐슬병의 경우 현재까지 알려진 생독 백신주들은 계태아 병원성이 있어 적용에 한계가 있었다. 그러나 본 발명의 KBNP-C4152R2L은 경우 계태아 병원성이 없는 것으로 확인되어 in ovo 백신으로서의 활용 가치가 매우 높을 것으로 기대된다.
상기에서 살펴본 바와 같이 본 발명의 재조합 뉴캐슬병 바이러스는 국내 및 아시아 지역에서 유행하는 강병원성 뉴캐슬병바이러스와 항원성이 유사하며, 병원성은 현재 사용되고 있는 백신주들과 유사하거나 현저하게 낮아 in ovo 백신으로 사용할 수 있고, 점 돌연변이에 의한 병원성 획득 가능성도 기존의 백신주에 비해 훨씬 낮은 유전자 구조를 가지고 있어 국내 뿐 아니라 아시아 지역의 뉴캐슬병 예방을 위한 사독백신 뿐 아니라 생독백신 및 in ovo 백신 제조에 유용하게 사용할 수 있다.
<110> KBNP, INC.
<120> ATTENUATED RECOMBINANT NEWCASTLE DISEASE VIRUS AND VACCINE
CONTAINING THE SAME
<160> 85
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 17481
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of full length genomic clone of pTMH
c4152-R2L
<220>
<221> CDS
<222> (122)..(1588)
<223> NP protein coding site
<220>
<221> CDS
<222> (1887)..(3071)
<223> P protein coding site
<220>
<221> CDS
<222> (3290)..(4381)
<223> M protein coding site
<220>
<221> CDS
<222> (4550)..(6208)
<223> F protein coding site
<220>
<221> CDS
<222> (6418)..(8148)
<223> HN protein coding site
<220>
<221> CDS
<222> (8387)..(14998)
<223> L protein coding site
<400> 1
accaaacaga gaatccgtga gttacgataa aaggcgaagg agcaattgaa gtcgcacggg 60
tagaaggtgt gaatctcgag tgcgagcccg aagcacaaac tcgagaaagc cttctgccaa 120
c atg tct tcc gta ttt gat gag tac gaa cag ctc ctc gcg gct 163
Met Ser Ser Val Phe Asp Glu Tyr Glu Gln Leu Leu Ala Ala
1 5 10
cag act cgc ccc aat gga gct cat gga ggg gga gaa aaa ggg agt acc 211
Gln Thr Arg Pro Asn Gly Ala His Gly Gly Gly Glu Lys Gly Ser Thr
15 20 25 30
tta aaa gta gac gtc ccg gta ttc act ctt aac agt gat gac cca gaa 259
Leu Lys Val Asp Val Pro Val Phe Thr Leu Asn Ser Asp Asp Pro Glu
35 40 45
gat aga tgg agc ttt gtg gta ttc tgc ctc cgg att gct gtt agc gaa 307
Asp Arg Trp Ser Phe Val Val Phe Cys Leu Arg Ile Ala Val Ser Glu
50 55 60
gat gcc aac aaa cca ctc agg caa ggt gct ctc ata tct ctt tta tgc 355
Asp Ala Asn Lys Pro Leu Arg Gln Gly Ala Leu Ile Ser Leu Leu Cys
65 70 75
tcc cac tca cag gta atg agg aac cat gtt gcc att gca ggg aaa cag 403
Ser His Ser Gln Val Met Arg Asn His Val Ala Ile Ala Gly Lys Gln
80 85 90
aat gaa gcc aca ttg gcc gtg ctt gag att gat ggc ttt gcc aac ggc 451
Asn Glu Ala Thr Leu Ala Val Leu Glu Ile Asp Gly Phe Ala Asn Gly
95 100 105 110
acg ccc cag ttc aac aat agg agt gga gtg tct gaa gag aga gca cag 499
Thr Pro Gln Phe Asn Asn Arg Ser Gly Val Ser Glu Glu Arg Ala Gln
115 120 125
aga ttt gcg atg ata gca gga tct ctc cct cgg gca tgc agc aac gga 547
Arg Phe Ala Met Ile Ala Gly Ser Leu Pro Arg Ala Cys Ser Asn Gly
130 135 140
acc ccg ttc gtc aca gcc ggg gca gaa gat gat gca cca gaa gac atc 595
Thr Pro Phe Val Thr Ala Gly Ala Glu Asp Asp Ala Pro Glu Asp Ile
145 150 155
acc gat acc ctg gag agg atc ctc tct atc cag gct caa gta tgg gtc 643
Thr Asp Thr Leu Glu Arg Ile Leu Ser Ile Gln Ala Gln Val Trp Val
160 165 170
aca gta gca aaa gcc atg act gcg tat gag act gca gat gag tcg gaa 691
Thr Val Ala Lys Ala Met Thr Ala Tyr Glu Thr Ala Asp Glu Ser Glu
175 180 185 190
aca agg cga atc aat aag tat atg cag caa ggc agg gtc caa aag aaa 739
Thr Arg Arg Ile Asn Lys Tyr Met Gln Gln Gly Arg Val Gln Lys Lys
195 200 205
tac atc ctc tac ccc gta tgc agg agc aca atc caa ctc acg atc aga 787
Tyr Ile Leu Tyr Pro Val Cys Arg Ser Thr Ile Gln Leu Thr Ile Arg
210 215 220
cag tct ctt gca gtc cgc atc ttt ttg gtt agc gag ctc aag aga ggc 835
Gln Ser Leu Ala Val Arg Ile Phe Leu Val Ser Glu Leu Lys Arg Gly
225 230 235
cgc aac acg gca ggt ggt acc tct act tat tat aac ctg gta ggg gac 883
Arg Asn Thr Ala Gly Gly Thr Ser Thr Tyr Tyr Asn Leu Val Gly Asp
240 245 250
gta gac tca tac atc agg aat acc ggg ctt act gca ttc ttc ttg aca 931
Val Asp Ser Tyr Ile Arg Asn Thr Gly Leu Thr Ala Phe Phe Leu Thr
255 260 265 270
ctc aag tac gga atc aac acc aag aca tca gcc ctt gca ctt agt agc 979
Leu Lys Tyr Gly Ile Asn Thr Lys Thr Ser Ala Leu Ala Leu Ser Ser
275 280 285
ctc tca ggc gac atc cag aag atg aag cag ctc atg cgt ttg tat cgg 1027
Leu Ser Gly Asp Ile Gln Lys Met Lys Gln Leu Met Arg Leu Tyr Arg
290 295 300
atg aaa gga gat aat gcg ccg tac atg aca tta ctt ggt gat agt gac 1075
Met Lys Gly Asp Asn Ala Pro Tyr Met Thr Leu Leu Gly Asp Ser Asp
305 310 315
cag atg agc ttt gcg cct gcc gag tat gca caa ctt tac tcc ttt gcc 1123
Gln Met Ser Phe Ala Pro Ala Glu Tyr Ala Gln Leu Tyr Ser Phe Ala
320 325 330
atg ggt atg gca tca gtc cta gat aaa ggt act ggg aaa tac caa ttt 1171
Met Gly Met Ala Ser Val Leu Asp Lys Gly Thr Gly Lys Tyr Gln Phe
335 340 345 350
gcc agg gac ttt atg agc aca tca ttc tgg aga ctt gga gta gag tac 1219
Ala Arg Asp Phe Met Ser Thr Ser Phe Trp Arg Leu Gly Val Glu Tyr
355 360 365
gct cag gct cag gga agt agc att aac gag gat atg gct gcc gag cta 1267
Ala Gln Ala Gln Gly Ser Ser Ile Asn Glu Asp Met Ala Ala Glu Leu
370 375 380
aag cta acc cca gca gca atg aag ggc ctg gca gct gct gcc caa cgg 1315
Lys Leu Thr Pro Ala Ala Met Lys Gly Leu Ala Ala Ala Ala Gln Arg
385 390 395
gtc tcc gac gat acc agc agc ata tac atg cct act caa caa gtc gga 1363
Val Ser Asp Asp Thr Ser Ser Ile Tyr Met Pro Thr Gln Gln Val Gly
400 405 410
gtc ctc act ggg ctt agc gag ggg ggg tcc caa gct cta caa ggc gga 1411
Val Leu Thr Gly Leu Ser Glu Gly Gly Ser Gln Ala Leu Gln Gly Gly
415 420 425 430
tcg aat aga tcg caa ggg caa cca gaa gcc ggg gat ggg gag acc caa 1459
Ser Asn Arg Ser Gln Gly Gln Pro Glu Ala Gly Asp Gly Glu Thr Gln
435 440 445
ttc ctg gat ctg atg aga gcg gta gca aat agc atg agg gag gcg cca 1507
Phe Leu Asp Leu Met Arg Ala Val Ala Asn Ser Met Arg Glu Ala Pro
450 455 460
aac tct gca cag ggc act ccc caa tcg ggg cct ccc cca act cct ggg 1555
Asn Ser Ala Gln Gly Thr Pro Gln Ser Gly Pro Pro Pro Thr Pro Gly
465 470 475
cca tcc caa gat aac gac acc gac tgg ggg tat tg atggacaaaa 1600
Pro Ser Gln Asp Asn Asp Thr Asp Trp Gly Tyr
480 485
cccagcctgc ttccacaaaa acatcccaat gccctcaccc gtagtcgacc cctcgatttg 1660
cggctctata tgaccacacc ctcaaacaaa catccccctc tttcctccct ccccctgctg 1720
tacaactccg cacgccctag ataccacagg cacaatgcgg ctcactaaca atcaaaacag 1780
agccgaggga attagaaaaa agtacgggta gaagagggat attcagagat cagggcaagt 1840
ctcccgagtc tctgctctct cctctacctg atagaccagg acaaac atg gcc acc 1895
Met Ala Thr
1
ttt aca gat gca gag atc gac gag cta ttt gag aca agt gga act gtc 1943
Phe Thr Asp Ala Glu Ile Asp Glu Leu Phe Glu Thr Ser Gly Thr Val
5 10 15
att gac aac ata att aca gcc cag ggt aaa cca gca gag act gtt gga 1991
Ile Asp Asn Ile Ile Thr Ala Gln Gly Lys Pro Ala Glu Thr Val Gly
20 25 30 35
agg agt gca atc cca caa ggc aag acc aag gtg ctg agc gca gca tgg 2039
Arg Ser Ala Ile Pro Gln Gly Lys Thr Lys Val Leu Ser Ala Ala Trp
40 45 50
gag aag cat ggg agc atc cag cca ccg gcc agt caa gac aac ccc gat 2087
Glu Lys His Gly Ser Ile Gln Pro Pro Ala Ser Gln Asp Asn Pro Asp
55 60 65
cga cag gac aga tct gac aaa caa cca tcc aca ccc gag caa acg acc 2135
Arg Gln Asp Arg Ser Asp Lys Gln Pro Ser Thr Pro Glu Gln Thr Thr
70 75 80
ccg cat gac agc ccg ccg gcc aca tcc gcc gac cag ccc ccc acc cag 2183
Pro His Asp Ser Pro Pro Ala Thr Ser Ala Asp Gln Pro Pro Thr Gln
85 90 95
gcc aca gac gaa gcc gtc gac aca cag ttc agg acc gga gca agc aac 2231
Ala Thr Asp Glu Ala Val Asp Thr Gln Phe Arg Thr Gly Ala Ser Asn
100 105 110 115
tct ctg ctg ttg atg ctt gac aag ctc agc aat aaa tcg tcc aat gct 2279
Ser Leu Leu Leu Met Leu Asp Lys Leu Ser Asn Lys Ser Ser Asn Ala
120 125 130
aaa aag ggc cca tgg tcg agc ccc caa gag ggg aat cac caa cgt ccg 2327
Lys Lys Gly Pro Trp Ser Ser Pro Gln Glu Gly Asn His Gln Arg Pro
135 140 145
act caa cag cag ggg agt caa ccc agt cgc gga aac agt cag gaa aga 2375
Thr Gln Gln Gln Gly Ser Gln Pro Ser Arg Gly Asn Ser Gln Glu Arg
150 155 160
ccg cag aac caa gtc aag gcc gcc cct gga aac cag ggc aca gac gtg 2423
Pro Gln Asn Gln Val Lys Ala Ala Pro Gly Asn Gln Gly Thr Asp Val
165 170 175
aac aca gca tat cat gga caa tgg gag gag tca caa cta tca gct ggt 2471
Asn Thr Ala Tyr His Gly Gln Trp Glu Glu Ser Gln Leu Ser Ala Gly
180 185 190 195
gca acc cct cat gct ctc cga tca agg cag agc caa gac aat acc ctt 2519
Ala Thr Pro His Ala Leu Arg Ser Arg Gln Ser Gln Asp Asn Thr Leu
200 205 210
gta tct gcg gat cat gtc cag ccg cct gta gac ttt gtg caa gcg atg 2567
Val Ser Ala Asp His Val Gln Pro Pro Val Asp Phe Val Gln Ala Met
215 220 225
atg tct atg atg gag gcg ata tca cag aga gta agt aag gtt gac tat 2615
Met Ser Met Met Glu Ala Ile Ser Gln Arg Val Ser Lys Val Asp Tyr
230 235 240
cag cta gat ctt gtc ttg aaa cag aca tcc tcc atc cct atg atg cgg 2663
Gln Leu Asp Leu Val Leu Lys Gln Thr Ser Ser Ile Pro Met Met Arg
245 250 255
tcc gaa atc caa cag ctg aaa aca tct gtt gca gtc atg gaa gcc aac 2711
Ser Glu Ile Gln Gln Leu Lys Thr Ser Val Ala Val Met Glu Ala Asn
260 265 270 275
ttg gga atg atg aag att ctg gat ccc ggt tgt gcc aac att tca tct 2759
Leu Gly Met Met Lys Ile Leu Asp Pro Gly Cys Ala Asn Ile Ser Ser
280 285 290
ctg agt gat cta cgg gca gtt gcc cga tct cac ccg gtt tta gtt tca 2807
Leu Ser Asp Leu Arg Ala Val Ala Arg Ser His Pro Val Leu Val Ser
295 300 305
ggc cct gga gac ccc tct ccc tat gtg aca caa gga ggc gaa atg gca 2855
Gly Pro Gly Asp Pro Ser Pro Tyr Val Thr Gln Gly Gly Glu Met Ala
310 315 320
ctt aat aaa ctt tcg caa cca gtg cca cat cca tct gaa ttg att aaa 2903
Leu Asn Lys Leu Ser Gln Pro Val Pro His Pro Ser Glu Leu Ile Lys
325 330 335
ccc gcc act gca tgc ggg cct gat ata gga gtg gaa aag gac act gtc 2951
Pro Ala Thr Ala Cys Gly Pro Asp Ile Gly Val Glu Lys Asp Thr Val
340 345 350 355
cgt gca ttg atc atg tca cgc cca atg cac ccg agt tct tca gcc aag 2999
Arg Ala Leu Ile Met Ser Arg Pro Met His Pro Ser Ser Ser Ala Lys
360 365 370
ctc cta agc aag tta gat gca gcc ggg tcg atc gag gaa atc agg aaa 3047
Leu Leu Ser Lys Leu Asp Ala Ala Gly Ser Ile Glu Glu Ile Arg Lys
375 380 385
atc aag cgc ctt gct cta aat ggc taattacta ctgccacacg tagcgggtcc 3100
Ile Lys Arg Leu Ala Leu Asn Gly
390 395
ctgtccactc ggcatcacac ggaatctgca ccgagttccc ccccgcagac ccaaggtcca 3160
actctccaag cggcaatcct ctctcgcttc ctcagcccca ctgaatgatc gcgtaaccgt 3220
aattaatcta gctacattta agattaagaa aaaatacggg tagaattgga gtgccccaat 3280
tgtgccaag atg gac tca tct agg aca att ggg ctg tac ttt gat tct gcc 3331
Met Asp Ser Ser Arg Thr Ile Gly Leu Tyr Phe Asp Ser Ala
1 5 10
cat tct tct agc aac ctg tta gca ttt ccg atc gtc cta caa gac aca 3379
His Ser Ser Ser Asn Leu Leu Ala Phe Pro Ile Val Leu Gln Asp Thr
15 20 25 30
gga gat ggg aag aag caa atc gcc ccg caa tat agg atc cag cgc ctt 3427
Gly Asp Gly Lys Lys Gln Ile Ala Pro Gln Tyr Arg Ile Gln Arg Leu
35 40 45
gac ttg tgg act gat agt aag gag gac tca gta ttc atc acc acc tat 3475
Asp Leu Trp Thr Asp Ser Lys Glu Asp Ser Val Phe Ile Thr Thr Tyr
50 55 60
gga ttc atc ttt caa gtt ggg aat gaa gaa gcc act gtc ggc atg atc 3523
Gly Phe Ile Phe Gln Val Gly Asn Glu Glu Ala Thr Val Gly Met Ile
65 70 75
gat gat aaa ccc aag cgc gag tta ctt tcc gct gcg atg ctc tgc cta 3571
Asp Asp Lys Pro Lys Arg Glu Leu Leu Ser Ala Ala Met Leu Cys Leu
80 85 90
gga agc gtc cca aat acc gga gac ctt att gag ctg gca agg gcc tgt 3619
Gly Ser Val Pro Asn Thr Gly Asp Leu Ile Glu Leu Ala Arg Ala Cys
95 100 105 110
ctc act atg ata gtc aca tgc aag aag agt gca act aat act gag aga 3667
Leu Thr Met Ile Val Thr Cys Lys Lys Ser Ala Thr Asn Thr Glu Arg
115 120 125
atg gtt ttc tca gta gtg cag gca ccc caa gtg ctg caa agc tgt agg 3715
Met Val Phe Ser Val Val Gln Ala Pro Gln Val Leu Gln Ser Cys Arg
130 135 140
gtt gtg gca aac aaa tac tca tca gtg aat gca gtc aag cac gtg aaa 3763
Val Val Ala Asn Lys Tyr Ser Ser Val Asn Ala Val Lys His Val Lys
145 150 155
gcg cca gag aag att ccc ggg agt gga acc cta gaa tac aag gtg aac 3811
Ala Pro Glu Lys Ile Pro Gly Ser Gly Thr Leu Glu Tyr Lys Val Asn
160 165 170
ttt gtc tcc ttg act gtg gta ccg aag aag gat gtc tac aag atc cca 3859
Phe Val Ser Leu Thr Val Val Pro Lys Lys Asp Val Tyr Lys Ile Pro
175 180 185 190
gct gca gta ttg aag gtt tct ggc tcg agt ctg tac aat ctt gcg ctc 3907
Ala Ala Val Leu Lys Val Ser Gly Ser Ser Leu Tyr Asn Leu Ala Leu
195 200 205
aat gtc act att aat gtg gag gta gac ccg agg agt cct ttg gtt aaa 3955
Asn Val Thr Ile Asn Val Glu Val Asp Pro Arg Ser Pro Leu Val Lys
210 215 220
tct ctg tct aag tct gac agc gga tac tat gct aac ctc ttc ttg cat 4003
Ser Leu Ser Lys Ser Asp Ser Gly Tyr Tyr Ala Asn Leu Phe Leu His
225 230 235
att gga ctt atg acc acc gta gat agg aag ggg aag aaa gtg aca ttt 4051
Ile Gly Leu Met Thr Thr Val Asp Arg Lys Gly Lys Lys Val Thr Phe
240 245 250
gac aag ctg gaa aag aaa ata agg agc ctt gat cta tct gtc ggg ctc 4099
Asp Lys Leu Glu Lys Lys Ile Arg Ser Leu Asp Leu Ser Val Gly Leu
255 260 265 270
agt gat gtg ctc ggg cct tcc gtg ttg gta aaa gca aga ggt gca cgg 4147
Ser Asp Val Leu Gly Pro Ser Val Leu Val Lys Ala Arg Gly Ala Arg
275 280 285
act aag ctt ttg gca cct ttc ttc tct agc agt ggg aca gcc tgc tat 4195
Thr Lys Leu Leu Ala Pro Phe Phe Ser Ser Ser Gly Thr Ala Cys Tyr
290 295 300
ccc ata gca aat gct tct cct cag gtg gcc aag ata ctc tgg agt caa 4243
Pro Ile Ala Asn Ala Ser Pro Gln Val Ala Lys Ile Leu Trp Ser Gln
305 310 315
acc gcg tgc ctg cgg agc gtt aaa atc att atc caa gca ggt acc caa 4291
Thr Ala Cys Leu Arg Ser Val Lys Ile Ile Ile Gln Ala Gly Thr Gln
320 325 330
cgc gct gtc gca gtg acc gcc gac cac gag gtt acc tct act aag ctg 4339
Arg Ala Val Ala Val Thr Ala Asp His Glu Val Thr Ser Thr Lys Leu
335 340 345 350
gag aag ggg cac acc ctt gcc aaa tac aat cct ttt aag aaa taagctgcg 4390
Glu Lys Gly His Thr Leu Ala Lys Tyr Asn Pro Phe Lys Lys
355 360
tctctgagat tgcgctccgc ccactcaccc agatcatcat gacacaaaaa actaatctgt 4450
cttgattatt tacagttagt ttacctgtct atcaagttag aaaaaacacg cgtacgggta 4510
gaagagtctg gatcccgacc ggcacattca ggacgcaat atg ggc tcc aaa ctt 4564
Met Gly Ser Lys Leu
1 5
tct acc agg att cca gca cct ctg atg ctg acc acc cgg att acg ctg 4612
Ser Thr Arg Ile Pro Ala Pro Leu Met Leu Thr Thr Arg Ile Thr Leu
10 15 20
ata ttg agc tgt atc cgt ccg aca agc tct ctt gac ggc agg cct ctt 4660
Ile Leu Ser Cys Ile Arg Pro Thr Ser Ser Leu Asp Gly Arg Pro Leu
25 30 35
gca gct gca gga att gta gta aca gga gat aag gca gtc aat gta tac 4708
Ala Ala Ala Gly Ile Val Val Thr Gly Asp Lys Ala Val Asn Val Tyr
40 45 50
acc tcg tct cag aca ggg tca atc ata gtc aag ttg ctc ccg aat atg 4756
Thr Ser Ser Gln Thr Gly Ser Ile Ile Val Lys Leu Leu Pro Asn Met
55 60 65
ccc agg gat aaa gag gcg tgt gca aaa gcc cca tta gag gca tat aac 4804
Pro Arg Asp Lys Glu Ala Cys Ala Lys Ala Pro Leu Glu Ala Tyr Asn
70 75 80 85
aga aca ctg act act ttg cta act cct ctt ggc gac tcc atc cgc aag 4852
Arg Thr Leu Thr Thr Leu Leu Thr Pro Leu Gly Asp Ser Ile Arg Lys
90 95 100
atc caa ggg tct gtg tcc acg tct gga gga ggc aga caa gca cgc ctg 4900
Ile Gln Gly Ser Val Ser Thr Ser Gly Gly Gly Arg Gln Ala Arg Leu
105 110 115
ata ggt gct gtt att ggc agt gta gct ctt ggg gtt gca aca gcg gca 4948
Ile Gly Ala Val Ile Gly Ser Val Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala Ala
120 125 130
cag ata aca gca gcg gcc gcc cta ata caa gcc aac cag aat gcc gcc 4996
Gln Ile Thr Ala Ala Ala Ala Leu Ile Gln Ala Asn Gln Asn Ala Ala
135 140 145
aac atc ctc cgg ctt aag gag agc att gct gca acc aat gaa gct gtg 5044
Asn Ile Leu Arg Leu Lys Glu Ser Ile Ala Ala Thr Asn Glu Ala Val
150 155 160 165
cat gaa gtc acc gac gga tta tca caa cta tca gtg gca gtt ggg aag 5092
His Glu Val Thr Asp Gly Leu Ser Gln Leu Ser Val Ala Val Gly Lys
170 175 180
atg cag cag ttc gtc aat gac cag ttt aat aat aca gca cga gaa ttg 5140
Met Gln Gln Phe Val Asn Asp Gln Phe Asn Asn Thr Ala Arg Glu Leu
185 190 195
gac tgt ata aaa atc aca caa cag gtt ggt gta gag cta aac cta tac 5188
Asp Cys Ile Lys Ile Thr Gln Gln Val Gly Val Glu Leu Asn Leu Tyr
200 205 210
cta act gaa ttg act aca gta ttc ggg cca cag atc act tcc cct gca 5236
Leu Thr Glu Leu Thr Thr Val Phe Gly Pro Gln Ile Thr Ser Pro Ala
215 220 225
tta act cag ttg acc atc caa gca ctt tat aat tta gct ggt ggc aat 5284
Leu Thr Gln Leu Thr Ile Gln Ala Leu Tyr Asn Leu Ala Gly Gly Asn
230 235 240 245
atg aat tac tta tta act aag tta ggt ata ggg aac aat caa ctc agc 5332
Met Asn Tyr Leu Leu Thr Lys Leu Gly Ile Gly Asn Asn Gln Leu Ser
250 255 260
tca tta att ggt agc ggc ctg atc act ggt tac cct ata ctg tat gat 5380
Ser Leu Ile Gly Ser Gly Leu Ile Thr Gly Tyr Pro Ile Leu Tyr Asp
265 270 275
tca cag act caa ctc ttg ggc ata caa gtg aat ttg ccc tca gtc ggg 5428
Ser Gln Thr Gln Leu Leu Gly Ile Gln Val Asn Leu Pro Ser Val Gly
280 285 290
aac tta aat aat atg cgt gcc acc tat ttg gag acc tta tct gta agt 5476
Asn Leu Asn Asn Met Arg Ala Thr Tyr Leu Glu Thr Leu Ser Val Ser
295 300 305
aca acc aaa gga tat gcc tca gca ctt gtc ccg aaa gta gtg aca cag 5524
Thr Thr Lys Gly Tyr Ala Ser Ala Leu Val Pro Lys Val Val Thr Gln
310 315 320 325
gtc ggt tct gtg ata gaa gag ctc gac acc tca tac tgc ata gag tcc 5572
Val Gly Ser Val Ile Glu Glu Leu Asp Thr Ser Tyr Cys Ile Glu Ser
330 335 340
gat ctg gat tta tat tgt act aga ata gtg aca ttc ccc atg tcc cca 5620
Asp Leu Asp Leu Tyr Cys Thr Arg Ile Val Thr Phe Pro Met Ser Pro
345 350 355
ggt att tat tcc tgc ttg agc ggc aac aca tca gct tgc atg tat tca 5668
Gly Ile Tyr Ser Cys Leu Ser Gly Asn Thr Ser Ala Cys Met Tyr Ser
360 365 370
aag act gaa ggc gca ctc act acg ccg tat atg gcc ctt aaa ggc tcg 5716
Lys Thr Glu Gly Ala Leu Thr Thr Pro Tyr Met Ala Leu Lys Gly Ser
375 380 385
gtt att gcc aat tgt aag ata aca aca tgt aga tgt aca gac cct cct 5764
Val Ile Ala Asn Cys Lys Ile Thr Thr Cys Arg Cys Thr Asp Pro Pro
390 395 400 405
ggt atc ata tcg caa aat tat gga gaa gcc gta tcc ctg ata gat aga 5812
Gly Ile Ile Ser Gln Asn Tyr Gly Glu Ala Val Ser Leu Ile Asp Arg
410 415 420
cat tcg tgc aat gtc tta tca tta gac ggg ata act ctg agg ctc agt 5860
His Ser Cys Asn Val Leu Ser Leu Asp Gly Ile Thr Leu Arg Leu Ser
425 430 435
ggg gaa ttt gat gca act tat caa aag aac atc tca ata cta gat tct 5908
Gly Glu Phe Asp Ala Thr Tyr Gln Lys Asn Ile Ser Ile Leu Asp Ser
440 445 450
caa gtc atc gtg aca ggc aat ctt gat atc tca act gaa ctt gga aac 5956
Gln Val Ile Val Thr Gly Asn Leu Asp Ile Ser Thr Glu Leu Gly Asn
455 460 465
gtc aac aat tca atc agc aat gcc ttg gat agt ttg gca gaa agc aac 6004
Val Asn Asn Ser Ile Ser Asn Ala Leu Asp Ser Leu Ala Glu Ser Asn
470 475 480 485
agc aag ctg gaa aaa atc aat gtc aga cta acc agc aca tct gct ctc 6052
Ser Lys Leu Glu Lys Ile Asn Val Arg Leu Thr Ser Thr Ser Ala Leu
490 495 500
att acc tat att gtt cta act gtc att tct cta gtt ttc ggt gca ttt 6100
Ile Thr Tyr Ile Val Leu Thr Val Ile Ser Leu Val Phe Gly Ala Phe
505 510 515
agt ttg ggt tta gcg tgt tac ctg atg tac aaa cag aag gca caa caa 6148
Ser Leu Gly Leu Ala Cys Tyr Leu Met Tyr Lys Gln Lys Ala Gln Gln
520 525 530
aag acc ttg cta tgg ctt ggg aat aat acc ctc gat cag atg aga gcc 6196
Lys Thr Leu Leu Trp Leu Gly Asn Asn Thr Leu Asp Gln Met Arg Ala
535 540 545
act aca aga gca tg aatgcagata agaggtgggt atatacccaa cagcagcctg 6250
Thr Thr Arg Ala
550
tgtatcaatt ccgataacct gtcaagtaga agacttaaga aaaaactact gggaataagc 6310
aaccaaagag cactacacgg gtagaacgat cagaggagcc acccttcaat cggaaattag 6370
gcttcacaac atccgttcta ccgcatcacc aacaacaaga gtcaatc atg gac cgc 6426
Met Asp Arg
1
gcg gtt aac aga gtc gtg ctg gag aat gag gaa aga gaa gca aag aac 6474
Ala Val Asn Arg Val Val Leu Glu Asn Glu Glu Arg Glu Ala Lys Asn
5 10 15
aca tgg cgc ctg gtt ttc cgg atc gca gtt tta ctt tta atg gta atg 6522
Thr Trp Arg Leu Val Phe Arg Ile Ala Val Leu Leu Leu Met Val Met
20 25 30 35
act cta gct atc tcc tca gct gcc ctg gca tac agc acg ggg gcc agt 6570
Thr Leu Ala Ile Ser Ser Ala Ala Leu Ala Tyr Ser Thr Gly Ala Ser
40 45 50
acg ccg cac gac ctc gca agc ata ttg act gtg atc tcc aag aca gaa 6618
Thr Pro His Asp Leu Ala Ser Ile Leu Thr Val Ile Ser Lys Thr Glu
55 60 65
gat aag gtt acg tct tta ctc agt tca agt caa gac gtg ata gat agg 6666
Asp Lys Val Thr Ser Leu Leu Ser Ser Ser Gln Asp Val Ile Asp Arg
70 75 80
ata tac aag cag gtg gct ctt gaa tcc ccg ctg gca cta cta aac act 6714
Ile Tyr Lys Gln Val Ala Leu Glu Ser Pro Leu Ala Leu Leu Asn Thr
85 90 95
gaa tct gta att atg aat gca ata acc tct ctt tct tat caa att aac 6762
Glu Ser Val Ile Met Asn Ala Ile Thr Ser Leu Ser Tyr Gln Ile Asn
100 105 110 115
ggg gct gcg aac aat agc gga tgt ggg gcg cct gtt cat gac cca gat 6810
Gly Ala Ala Asn Asn Ser Gly Cys Gly Ala Pro Val His Asp Pro Asp
120 125 130
tat atc ggg ggg ata ggc aaa gaa ctc ata gtg gac gac atc agt gat 6858
Tyr Ile Gly Gly Ile Gly Lys Glu Leu Ile Val Asp Asp Ile Ser Asp
135 140 145
gtt aca tca ttt tat cct tct gca tat caa gaa cac ttg aat ttc atc 6906
Val Thr Ser Phe Tyr Pro Ser Ala Tyr Gln Glu His Leu Asn Phe Ile
150 155 160
ccg gca cct act aca gga tcc ggt tgc act cgg ata ccc tcg ttt gac 6954
Pro Ala Pro Thr Thr Gly Ser Gly Cys Thr Arg Ile Pro Ser Phe Asp
165 170 175
atg agc acc acc cat tat tgt tat act cac aat gtg ata cta tcc ggt 7002
Met Ser Thr Thr His Tyr Cys Tyr Thr His Asn Val Ile Leu Ser Gly
180 185 190 195
tgc aga gat cac tca cac tca cat caa tac tta gca ctt ggt gtg ctt 7050
Cys Arg Asp His Ser His Ser His Gln Tyr Leu Ala Leu Gly Val Leu
200 205 210
cgg aca tct gca aca ggg agg gta ttc ttt tct act ctg cgc tct atc 7098
Arg Thr Ser Ala Thr Gly Arg Val Phe Phe Ser Thr Leu Arg Ser Ile
215 220 225
aat tta gat gac acc caa aat cgg aag tcc tgc agt gtg agt gca acc 7146
Asn Leu Asp Asp Thr Gln Asn Arg Lys Ser Cys Ser Val Ser Ala Thr
230 235 240
cct tta ggt tgt gat atg ctg tgc tcc aag gtc aca ggg act gaa gag 7194
Pro Leu Gly Cys Asp Met Leu Cys Ser Lys Val Thr Gly Thr Glu Glu
245 250 255
gag gat tac aag tca gtt gcc ccc aca tca atg gtg cac gga agg cta 7242
Glu Asp Tyr Lys Ser Val Ala Pro Thr Ser Met Val His Gly Arg Leu
260 265 270 275
ggg ttt gac ggt caa tac cat gaa aag gac tta gac acc acg gtc tta 7290
Gly Phe Asp Gly Gln Tyr His Glu Lys Asp Leu Asp Thr Thr Val Leu
280 285 290
ttt aag gat tgg gtg gca aat tac cca gga gcg gga gga ggg tct ttt 7338
Phe Lys Asp Trp Val Ala Asn Tyr Pro Gly Ala Gly Gly Gly Ser Phe
295 300 305
att gac gac cgt gta tgg ttc cca gtt tac gga ggg ctc aaa ccc gat 7386
Ile Asp Asp Arg Val Trp Phe Pro Val Tyr Gly Gly Leu Lys Pro Asp
310 315 320
tca ccc agt gac act gca caa gaa ggg aaa tac gta ata tac aag cgc 7434
Ser Pro Ser Asp Thr Ala Gln Glu Gly Lys Tyr Val Ile Tyr Lys Arg
325 330 335
cat aac aac aca tgc ccc gat aaa caa gat tac caa att cgg aag gct 7482
His Asn Asn Thr Cys Pro Asp Lys Gln Asp Tyr Gln Ile Arg Lys Ala
340 345 350 355
aag tct tca tat aaa ccc ggg cga ttt ggt ggg aag cgc gta cag caa 7530
Lys Ser Ser Tyr Lys Pro Gly Arg Phe Gly Gly Lys Arg Val Gln Gln
360 365 370
gcc atc tta tcc atc aaa gtg tca aca tct ttg ggt aag gac ccg gtg 7578
Ala Ile Leu Ser Ile Lys Val Ser Thr Ser Leu Gly Lys Asp Pro Val
375 380 385
ctg act att cca cct aat aca atc aca ctc atg gga gcc gaa ggc aga 7626
Leu Thr Ile Pro Pro Asn Thr Ile Thr Leu Met Gly Ala Glu Gly Arg
390 395 400
att ctc aca gtg ggg aca tct cac ttc ttg tac caa cga ggg tct tca 7674
Ile Leu Thr Val Gly Thr Ser His Phe Leu Tyr Gln Arg Gly Ser Ser
405 410 415
tat ttc tcc cct gcc tta tta tat ccc atg aca gta aat aac aaa acg 7722
Tyr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Tyr Pro Met Thr Val Asn Asn Lys Thr
420 425 430 435
gct aca ctc cat agt cct tat acg ttt aat gct ttc act cgg cca ggt 7770
Ala Thr Leu His Ser Pro Tyr Thr Phe Asn Ala Phe Thr Arg Pro Gly
440 445 450
agt gtc cct tgc cag gca tca gca aga tgc ccc aac tca tgc att act 7818
Ser Val Pro Cys Gln Ala Ser Ala Arg Cys Pro Asn Ser Cys Ile Thr
455 460 465
gga gtc tat act gat cca tat ccc tta atc ttc cat agg aat cat act 7866
Gly Val Tyr Thr Asp Pro Tyr Pro Leu Ile Phe His Arg Asn His Thr
470 475 480
cta cga ggg gtc ttc gga acg atg ctt gat gat gaa caa gcg aga ctt 7914
Leu Arg Gly Val Phe Gly Thr Met Leu Asp Asp Glu Gln Ala Arg Leu
485 490 495
aac ccc gta tcc gca gta ttc gac aac gta tcc cgc agt cgt gtc acc 7962
Asn Pro Val Ser Ala Val Phe Asp Asn Val Ser Arg Ser Arg Val Thr
500 505 510 515
cgg gtg agt tca agc agc acc aag gca gca tac acg aca tcg aca tgt 8010
Arg Val Ser Ser Ser Ser Thr Lys Ala Ala Tyr Thr Thr Ser Thr Cys
520 525 530
ttc aaa gtt gtc aag acc aat aaa act tat tgt ctt agt att gca gaa 8058
Phe Lys Val Val Lys Thr Asn Lys Thr Tyr Cys Leu Ser Ile Ala Glu
535 540 545
ata tcc aat acc ctg ttc ggg gaa ttt agg atc gtt ccc tta cta gtt 8106
Ile Ser Asn Thr Leu Phe Gly Glu Phe Arg Ile Val Pro Leu Leu Val
550 555 560
gag atc ctc aag gat gac ggg gtt aga gaa gcc agg tct ggc ta 8150
Glu Ile Leu Lys Asp Asp Gly Val Arg Glu Ala Arg Ser Gly
565 570 575
gttgagtcaa ttataaagga gttggaaaga tggcattgta tcacctatct tctgtgacat 8210
caagaatcaa accgaatgcc ggcgcgtgct cgaattccat gttgccagtt gaccacaatc 8270
agccagtgct catgcgatca gattaagcct tgtcaatagt ctcttgatta agaaaaaatg 8330
taagtggcaa tgagatacaa ggcaaaacag ctcatggtaa ataatacggg taggac 8386
atg gcg agc tcc ggt cct gaa agg gca gag cat cag att atc cta cca 8434
Met Ala Ser Ser Gly Pro Glu Arg Ala Glu His Gln Ile Ile Leu Pro
1 5 10 15
gag tca cac ctg tct tca cca ttg gtc aag cac aaa cta ctc tat tac 8482
Glu Ser His Leu Ser Ser Pro Leu Val Lys His Lys Leu Leu Tyr Tyr
20 25 30
tgg aaa tta act ggg cta ccg ctt cct gat gaa tgt gac ttc gac cac 8530
Trp Lys Leu Thr Gly Leu Pro Leu Pro Asp Glu Cys Asp Phe Asp His
35 40 45
ctc att ctc agc cga caa tgg aaa aaa ata ctt gaa tcg gcc tct cct 8578
Leu Ile Leu Ser Arg Gln Trp Lys Lys Ile Leu Glu Ser Ala Ser Pro
50 55 60
gat act gag aga atg ata aaa ctc gga agg gca gta cac caa act ctt 8626
Asp Thr Glu Arg Met Ile Lys Leu Gly Arg Ala Val His Gln Thr Leu
65 70 75 80
aac cac aat tcc aga ata acc gga gtg ctc cac ccc agg tgt tta gaa 8674
Asn His Asn Ser Arg Ile Thr Gly Val Leu His Pro Arg Cys Leu Glu
85 90 95
gaa ctg gct aat att gag gtc cca gat tca acc aac aaa ttt cgg aag 8722
Glu Leu Ala Asn Ile Glu Val Pro Asp Ser Thr Asn Lys Phe Arg Lys
100 105 110
att gag aag aag atc caa att cac aac acg aga tat gga gaa ctg ttc 8770
Ile Glu Lys Lys Ile Gln Ile His Asn Thr Arg Tyr Gly Glu Leu Phe
115 120 125
aca agg ctg tgt acg cat ata gag aag aaa ctg ctg ggg tca tct tgg 8818
Thr Arg Leu Cys Thr His Ile Glu Lys Lys Leu Leu Gly Ser Ser Trp
130 135 140
tct aac aat gtc ccc cgg tca gag gag ttc agc agc att cgt acg gat 8866
Ser Asn Asn Val Pro Arg Ser Glu Glu Phe Ser Ser Ile Arg Thr Asp
145 150 155 160
ccg gca ttc tgg ttt cac tca aaa tgg tcc aca gcc aag ttt gca tgg 8914
Pro Ala Phe Trp Phe His Ser Lys Trp Ser Thr Ala Lys Phe Ala Trp
165 170 175
ctc cat ata aaa cag atc cag agg cat ctg atg gtg gca gct agg aca 8962
Leu His Ile Lys Gln Ile Gln Arg His Leu Met Val Ala Ala Arg Thr
180 185 190
agg tct gcg gcc aac aaa ttg gtg atg cta acc cat aag gta ggc caa 9010
Arg Ser Ala Ala Asn Lys Leu Val Met Leu Thr His Lys Val Gly Gln
195 200 205
gtc ttt gtc act cct gaa ctt gtc gtt gtg acg cat acg aat gag aac 9058
Val Phe Val Thr Pro Glu Leu Val Val Val Thr His Thr Asn Glu Asn
210 215 220
aag ttc aca tgt ctt acc cag gaa ctt gta ttg atg tat gca gat atg 9106
Lys Phe Thr Cys Leu Thr Gln Glu Leu Val Leu Met Tyr Ala Asp Met
225 230 235 240
atg gag ggc aga gat atg gtc aac ata ata tca acc acg gcg gtg cat 9154
Met Glu Gly Arg Asp Met Val Asn Ile Ile Ser Thr Thr Ala Val His
245 250 255
ctc aga agc tta tca gag aaa att gat gac att ttg cgg tta ata gac 9202
Leu Arg Ser Leu Ser Glu Lys Ile Asp Asp Ile Leu Arg Leu Ile Asp
260 265 270
gct ctg gca aaa gac ttg ggt aat caa gtc tac gat gtc gta tca cta 9250
Ala Leu Ala Lys Asp Leu Gly Asn Gln Val Tyr Asp Val Val Ser Leu
275 280 285
atg gag gga ttt gca tac gga gct gtc cag cta ctc gag ccg tca ggt 9298
Met Glu Gly Phe Ala Tyr Gly Ala Val Gln Leu Leu Glu Pro Ser Gly
290 295 300
aca ttt gca gga gat ttc ttc gca ttc aac ctg cag gag ctt aaa gac 9346
Thr Phe Ala Gly Asp Phe Phe Ala Phe Asn Leu Gln Glu Leu Lys Asp
305 310 315 320
att cta att ggc ctc ctc ccc aat gat ata gca gaa tcc gtg act cat 9394
Ile Leu Ile Gly Leu Leu Pro Asn Asp Ile Ala Glu Ser Val Thr His
325 330 335
gca atc gct act gta ttc tct ggt tta gaa cag aat caa gca gct gag 9442
Ala Ile Ala Thr Val Phe Ser Gly Leu Glu Gln Asn Gln Ala Ala Glu
340 345 350
atg ttg tgt ctg ttg cgt ctg tgg ggt cac cca ctg ctt gag tcc cgt 9490
Met Leu Cys Leu Leu Arg Leu Trp Gly His Pro Leu Leu Glu Ser Arg
355 360 365
att gca gca aag gca gtc agg agc caa atg tgc gca ccg aaa atg gta 9538
Ile Ala Ala Lys Ala Val Arg Ser Gln Met Cys Ala Pro Lys Met Val
370 375 380
gac ttt gat atg atc ctt cag gta ctg tct ttc ttc aag gga aca atc 9586
Asp Phe Asp Met Ile Leu Gln Val Leu Ser Phe Phe Lys Gly Thr Ile
385 390 395 400
atc aac ggg tac aga aag aag aat gca ggt gtg tgg ccg cga gtc aaa 9634
Ile Asn Gly Tyr Arg Lys Lys Asn Ala Gly Val Trp Pro Arg Val Lys
405 410 415
gtg gat aca ata tat ggg aag gtc att ggg caa cta cat gca gat tca 9682
Val Asp Thr Ile Tyr Gly Lys Val Ile Gly Gln Leu His Ala Asp Ser
420 425 430
gca gag att tca cac gat atc atg tta aga gag tat aag agt tta tct 9730
Ala Glu Ile Ser His Asp Ile Met Leu Arg Glu Tyr Lys Ser Leu Ser
435 440 445
gca ctt gaa ttt gag cca tgt ata gaa tat gac cct gtc acc aac ctg 9778
Ala Leu Glu Phe Glu Pro Cys Ile Glu Tyr Asp Pro Val Thr Asn Leu
450 455 460
agc atg ttc cta aaa gac aag gca atc gca cac ccc aac gat aat tgg 9826
Ser Met Phe Leu Lys Asp Lys Ala Ile Ala His Pro Asn Asp Asn Trp
465 470 475 480
ctt gcc tcg ttt agg cgg aac ctt ctc tcc gaa gac cag aag aaa cat 9874
Leu Ala Ser Phe Arg Arg Asn Leu Leu Ser Glu Asp Gln Lys Lys His
485 490 495
gta aaa gaa gca act tcg act aat cgc ctc ttg ata gag ttt tta gag 9922
Val Lys Glu Ala Thr Ser Thr Asn Arg Leu Leu Ile Glu Phe Leu Glu
500 505 510
tca aat gat ttt gat cca tat aaa gag atg gaa tat ctg acg acc ctt 9970
Ser Asn Asp Phe Asp Pro Tyr Lys Glu Met Glu Tyr Leu Thr Thr Leu
515 520 525
gag tac ctt aga gat gac aat gtg gca gta tca tac tcg ctc aag gag 10018
Glu Tyr Leu Arg Asp Asp Asn Val Ala Val Ser Tyr Ser Leu Lys Glu
530 535 540
aag gaa gtg aaa gtt aat gga cgg atc ttc gct aag ctg aca aag aag 10066
Lys Glu Val Lys Val Asn Gly Arg Ile Phe Ala Lys Leu Thr Lys Lys
545 550 555 560
tta agg aac tgt cag gtg atg gcg gaa ggg atc cta gcc gat cag att 10114
Leu Arg Asn Cys Gln Val Met Ala Glu Gly Ile Leu Ala Asp Gln Ile
565 570 575
gca cct ttc ttt cag gga aat gga gtc att cag gat agc ata tcc ttg 10162
Ala Pro Phe Phe Gln Gly Asn Gly Val Ile Gln Asp Ser Ile Ser Leu
580 585 590
acc aag agt atg cta gcg atg agt caa ctg tct ttt aac agc aat aag 10210
Thr Lys Ser Met Leu Ala Met Ser Gln Leu Ser Phe Asn Ser Asn Lys
595 600 605
aaa cgt atc act gac tgt aaa gaa aga gta tct tca aac cgc aat cat 10258
Lys Arg Ile Thr Asp Cys Lys Glu Arg Val Ser Ser Asn Arg Asn His
610 615 620
gat ccg aaa agc aag aac cgt cgg aga gtt gca acc ttc ata aca act 10306
Asp Pro Lys Ser Lys Asn Arg Arg Arg Val Ala Thr Phe Ile Thr Thr
625 630 635 640
gac ctg caa aag tac tgt ctt aat tgg aga tat cag aca atc aaa ttg 10354
Asp Leu Gln Lys Tyr Cys Leu Asn Trp Arg Tyr Gln Thr Ile Lys Leu
645 650 655
ttc gct cat gcc atc aat cag ttg atg ggc cta cct cac ttc ttc gaa 10402
Phe Ala His Ala Ile Asn Gln Leu Met Gly Leu Pro His Phe Phe Glu
660 665 670
tgg att cac cta aga ctg atg gac act acg atg ttc gta gga gac cct 10450
Trp Ile His Leu Arg Leu Met Asp Thr Thr Met Phe Val Gly Asp Pro
675 680 685
ttc aat cct cca agt gac cct act gac tgt gac ctc tca aga gtc cct 10498
Phe Asn Pro Pro Ser Asp Pro Thr Asp Cys Asp Leu Ser Arg Val Pro
690 695 700
aat gat gac ata tat att gtc agt gcc aga ggg ggt atc gaa gga tta 10546
Asn Asp Asp Ile Tyr Ile Val Ser Ala Arg Gly Gly Ile Glu Gly Leu
705 710 715 720
tgc cag aag cta tgg aca atg atc tca att gct gca atc caa ctt gct 10594
Cys Gln Lys Leu Trp Thr Met Ile Ser Ile Ala Ala Ile Gln Leu Ala
725 730 735
gca gct aga tcg cat tgt cgt gtt gcc tgt atg gta cag ggt gat aat 10642
Ala Ala Arg Ser His Cys Arg Val Ala Cys Met Val Gln Gly Asp Asn
740 745 750
caa gta ata gca gta acg aga gag gta aga tca gac gac tct ccg gag 10690
Gln Val Ile Ala Val Thr Arg Glu Val Arg Ser Asp Asp Ser Pro Glu
755 760 765
atg gtg ttg aca cag ttg cat caa gcc agt gat aat ttc ttc aag gaa 10738
Met Val Leu Thr Gln Leu His Gln Ala Ser Asp Asn Phe Phe Lys Glu
770 775 780
tta att cat gtc aat cat ttg att ggc cat aat ttg aag gat cgt gaa 10786
Leu Ile His Val Asn His Leu Ile Gly His Asn Leu Lys Asp Arg Glu
785 790 795 800
acc atc agg tca gac aca ttc ttc ata tac agc aaa cga atc ttc aaa 10834
Thr Ile Arg Ser Asp Thr Phe Phe Ile Tyr Ser Lys Arg Ile Phe Lys
805 810 815
gat gga gca atc ctc agt caa gtc ctc aaa aat tca tct aaa tta gtg 10882
Asp Gly Ala Ile Leu Ser Gln Val Leu Lys Asn Ser Ser Lys Leu Val
820 825 830
cta gtg tca ggt gat ctc agt gaa aac acc gta atg tcc tgt gcc aac 10930
Leu Val Ser Gly Asp Leu Ser Glu Asn Thr Val Met Ser Cys Ala Asn
835 840 845
att gcc tct act gta gca cgg cta tgc gag aac ggg ctt ccc aaa gac 10978
Ile Ala Ser Thr Val Ala Arg Leu Cys Glu Asn Gly Leu Pro Lys Asp
850 855 860
ttc tgt tac tat tta aac tat ata atg agt tgt gtg cag aca tac ttt 11026
Phe Cys Tyr Tyr Leu Asn Tyr Ile Met Ser Cys Val Gln Thr Tyr Phe
865 870 875 880
gac tct gag ttc tcc atc acc aac aat tcg cac ccc gat ctt aat cag 11074
Asp Ser Glu Phe Ser Ile Thr Asn Asn Ser His Pro Asp Leu Asn Gln
885 890 895
tcg tgg att gag gac atc tct ttt gtg cac tca tat gtt ctg act cct 11122
Ser Trp Ile Glu Asp Ile Ser Phe Val His Ser Tyr Val Leu Thr Pro
900 905 910
gcc caa tta ggg gga ctg agt aac ctt caa tac tca agg ctc tac act 11170
Ala Gln Leu Gly Gly Leu Ser Asn Leu Gln Tyr Ser Arg Leu Tyr Thr
915 920 925
aga aat atc ggt gac ccg ggg act act gct ttt gca gag atc aag cga 11218
Arg Asn Ile Gly Asp Pro Gly Thr Thr Ala Phe Ala Glu Ile Lys Arg
930 935 940
cta gaa gca gtg gga tta ctg agt cct aac att atg act aat atc tta 11266
Leu Glu Ala Val Gly Leu Leu Ser Pro Asn Ile Met Thr Asn Ile Leu
945 950 955 960
act agg ccg cct ggg aat gga gat tgg gcc agt ctg tgc aac gac cca 11314
Thr Arg Pro Pro Gly Asn Gly Asp Trp Ala Ser Leu Cys Asn Asp Pro
965 970 975
tac tct ttc aat ttt gag act gtt gca agc cca aat att gtt ctt aag 11362
Tyr Ser Phe Asn Phe Glu Thr Val Ala Ser Pro Asn Ile Val Leu Lys
980 985 990
aaa cat acg caa aga gtc cta ttt gaa act tgt tca aat ccc tta ttg 11410
Lys His Thr Gln Arg Val Leu Phe Glu Thr Cys Ser Asn Pro Leu Leu
995 1000 1005
tct gga gtg cac aca gag gat aat gag gca gaa gag aag gca ttg gct 11458
Ser Gly Val His Thr Glu Asp Asn Glu Ala Glu Glu Lys Ala Leu Ala
1010 1015 1020
gaa ttc ttg ctt aat caa gag gtg att cat ccc cgc gtt gcg cat gcc 11506
Glu Phe Leu Leu Asn Gln Glu Val Ile His Pro Arg Val Ala His Ala
1025 1030 1035 1040
atc atg gag gca agc tct gta ggt agg aga aag caa att caa ggg ctt 11554
Ile Met Glu Ala Ser Ser Val Gly Arg Arg Lys Gln Ile Gln Gly Leu
1045 1050 1055
gtt gac aca aca aac acc gta att aag att gcg ctt act agg agg cca 11602
Val Asp Thr Thr Asn Thr Val Ile Lys Ile Ala Leu Thr Arg Arg Pro
1060 1065 1070
tta ggc atc aag agg ctg atg cgg ata gtc aat tat tct agc atg cat 11650
Leu Gly Ile Lys Arg Leu Met Arg Ile Val Asn Tyr Ser Ser Met His
1075 1080 1085
gca atg ctg ttt aga gac gat gtt ttt tcc tcc agt aga tcc aac cac 11698
Ala Met Leu Phe Arg Asp Asp Val Phe Ser Ser Ser Arg Ser Asn His
1090 1095 1100
ccc tta gtc tct tct aat atg tgt tct ctg aca ctg gca gac tat gca 11746
Pro Leu Val Ser Ser Asn Met Cys Ser Leu Thr Leu Ala Asp Tyr Ala
1105 1110 1115 1120
cgg aat aga agc tgg tca cct ttg acg gga ggc agg aaa ata ctg ggt 11794
Arg Asn Arg Ser Trp Ser Pro Leu Thr Gly Gly Arg Lys Ile Leu Gly
1125 1130 1135
gta tct aat cct gat acg ata gaa ctc gta gag ggt gag att ctt agt 11842
Val Ser Asn Pro Asp Thr Ile Glu Leu Val Glu Gly Glu Ile Leu Ser
1140 1145 1150
gta agc gga ggg tgt aca aga tgt gac agc gga gat gaa caa ttt act 11890
Val Ser Gly Gly Cys Thr Arg Cys Asp Ser Gly Asp Glu Gln Phe Thr
1155 1160 1165
tgg ttc cat ctt cca agc aat ata gaa ttg acc gat gac acc agc aag 11938
Trp Phe His Leu Pro Ser Asn Ile Glu Leu Thr Asp Asp Thr Ser Lys
1170 1175 1180
aat cct ccg atg agg gta cca tat ctc ggg tca aag aca cag gag agg 11986
Asn Pro Pro Met Arg Val Pro Tyr Leu Gly Ser Lys Thr Gln Glu Arg
1185 1190 1195 1200
aga gct gcc tca ctt gca aaa ata gct cat atg tcg cca cat gta aag 12034
Arg Ala Ala Ser Leu Ala Lys Ile Ala His Met Ser Pro His Val Lys
1205 1210 1215
gct gcc cta agg gca tca tcc gtg ttg atc tgg gct tat ggg gat aat 12082
Ala Ala Leu Arg Ala Ser Ser Val Leu Ile Trp Ala Tyr Gly Asp Asn
1220 1225 1230
gaa gta aat tgg act gct gct ctt acg att gca aaa tct cgg tgt aat 12130
Glu Val Asn Trp Thr Ala Ala Leu Thr Ile Ala Lys Ser Arg Cys Asn
1235 1240 1245
gta aac tta gag tat ctt cgg tta ctg tcc cct tta ccc acg gct ggg 12178
Val Asn Leu Glu Tyr Leu Arg Leu Leu Ser Pro Leu Pro Thr Ala Gly
1250 1255 1260
aat ctt caa cat aga cta gat gat ggt ata act cag atg aca ttc acc 12226
Asn Leu Gln His Arg Leu Asp Asp Gly Ile Thr Gln Met Thr Phe Thr
1265 1270 1275 1280
cct gca tct ctc tac agg gtg tca cct tac att cac ata tcc aat gat 12274
Pro Ala Ser Leu Tyr Arg Val Ser Pro Tyr Ile His Ile Ser Asn Asp
1285 1290 1295
tct caa agg ctg ttc act gaa gaa gga gtc aaa gag ggg aat gtg gtt 12322
Ser Gln Arg Leu Phe Thr Glu Glu Gly Val Lys Glu Gly Asn Val Val
1300 1305 1310
tac caa cag atc atg ctc ttg ggt tta tct cta atc gaa tcg ata ttt 12370
Tyr Gln Gln Ile Met Leu Leu Gly Leu Ser Leu Ile Glu Ser Ile Phe
1315 1320 1325
cca atg aca aca acc agg aca tat gat gag atc aca ctg cac cta cat 12418
Pro Met Thr Thr Thr Arg Thr Tyr Asp Glu Ile Thr Leu His Leu His
1330 1335 1340
agt aaa ttt agt tgc tgt atc aga gaa gca cct gtt gcg gtt cct ttc 12466
Ser Lys Phe Ser Cys Cys Ile Arg Glu Ala Pro Val Ala Val Pro Phe
1345 1350 1355 1360
gag cta ctt ggg gtg gta ccg gaa ctg agg aca gtg acc tca aat aag 12514
Glu Leu Leu Gly Val Val Pro Glu Leu Arg Thr Val Thr Ser Asn Lys
1365 1370 1375
ttt atg tat gat cct agc cct gta tcg gag gga gac ttt gcg aga ctt 12562
Phe Met Tyr Asp Pro Ser Pro Val Ser Glu Gly Asp Phe Ala Arg Leu
1380 1385 1390
gac tta gct atc ttc aag agt tat gag ctt aat ctg gag tca tat ccc 12610
Asp Leu Ala Ile Phe Lys Ser Tyr Glu Leu Asn Leu Glu Ser Tyr Pro
1395 1400 1405
acg ata gag cta atg aac att ctt tca ata tcc agc ggg aag ttg att 12658
Thr Ile Glu Leu Met Asn Ile Leu Ser Ile Ser Ser Gly Lys Leu Ile
1410 1415 1420
ggc cag tct gtg gtt tct tat gat gaa gat acc tcc ata aag aat gac 12706
Gly Gln Ser Val Val Ser Tyr Asp Glu Asp Thr Ser Ile Lys Asn Asp
1425 1430 1435 1440
gcc ata ata gtg tat gac aat acc cga aat tgg atc agt gaa gct cag 12754
Ala Ile Ile Val Tyr Asp Asn Thr Arg Asn Trp Ile Ser Glu Ala Gln
1445 1450 1455
aat tca gat gtg gtc cgc cta ttt gaa tat gca gca ctt gaa gtg ctc 12802
Asn Ser Asp Val Val Arg Leu Phe Glu Tyr Ala Ala Leu Glu Val Leu
1460 1465 1470
ctc gac tgt tct tac caa ctc tat tac ctg aga gta aga ggc cta gac 12850
Leu Asp Cys Ser Tyr Gln Leu Tyr Tyr Leu Arg Val Arg Gly Leu Asp
1475 1480 1485
aat att gtc tta tat atg ggt gat tta tac aag aat atg cca gga att 12898
Asn Ile Val Leu Tyr Met Gly Asp Leu Tyr Lys Asn Met Pro Gly Ile
1490 1495 1500
cta ctt tcc aac att gca gct aca ata tct cat ccc gtc att cat tca 12946
Leu Leu Ser Asn Ile Ala Ala Thr Ile Ser His Pro Val Ile His Ser
1505 1510 1515 1520
agg tta cat gca gtg ggc ctg gtc aac cat gac gga tca cac caa ctt 12994
Arg Leu His Ala Val Gly Leu Val Asn His Asp Gly Ser His Gln Leu
1525 1530 1535
gca gat acg gat ttt atc gaa atg tct gca aaa cta tta gta tct tgc 13042
Ala Asp Thr Asp Phe Ile Glu Met Ser Ala Lys Leu Leu Val Ser Cys
1540 1545 1550
acc cga cgt gtg atc tcc ggc tta tat tca gga aat aag tat gat ctg 13090
Thr Arg Arg Val Ile Ser Gly Leu Tyr Ser Gly Asn Lys Tyr Asp Leu
1555 1560 1565
ctg ttc cca tct gtc tta gat gat aac ctg aat gag aag atg ctt cag 13138
Leu Phe Pro Ser Val Leu Asp Asp Asn Leu Asn Glu Lys Met Leu Gln
1570 1575 1580
ctg ata tcc cgg tta tgc tgt ctg tac acg gta ctc ttt gct aca aca 13186
Leu Ile Ser Arg Leu Cys Cys Leu Tyr Thr Val Leu Phe Ala Thr Thr
1585 1590 1595 1600
aga gaa atc ccg aaa ata aga ggc tta act gca gaa gag aaa tgt tca 13234
Arg Glu Ile Pro Lys Ile Arg Gly Leu Thr Ala Glu Glu Lys Cys Ser
1605 1610 1615
ata ctc act gag tat tta ctg tcg gat gct gtg aaa cca tta ctt agc 13282
Ile Leu Thr Glu Tyr Leu Leu Ser Asp Ala Val Lys Pro Leu Leu Ser
1620 1625 1630
ccc gat caa gtg agc tct atc atg tct cct aac ata att aca ttc cca 13330
Pro Asp Gln Val Ser Ser Ile Met Ser Pro Asn Ile Ile Thr Phe Pro
1635 1640 1645
gct aat ctg tac tac atg tct cgg aag agc ctc aat ttg atc agg gaa 13378
Ala Asn Leu Tyr Tyr Met Ser Arg Lys Ser Leu Asn Leu Ile Arg Glu
1650 1655 1660
agg gag gac agg gat act atc ctg gcg ttg ttg ttc ccc caa gag cca 13426
Arg Glu Asp Arg Asp Thr Ile Leu Ala Leu Leu Phe Pro Gln Glu Pro
1665 1670 1675 1680
tta tta gag ttc cct tct gtg caa gat att ggt gct cga gtg aaa gat 13474
Leu Leu Glu Phe Pro Ser Val Gln Asp Ile Gly Ala Arg Val Lys Asp
1685 1690 1695
cca ttc acc cga caa cct gcg gca ttt ttg caa gag tta gat ttg agt 13522
Pro Phe Thr Arg Gln Pro Ala Ala Phe Leu Gln Glu Leu Asp Leu Ser
1700 1705 1710
gct cca gca agg tat gac gca ttc aca ctt agt cag att cat cct gaa 13570
Ala Pro Ala Arg Tyr Asp Ala Phe Thr Leu Ser Gln Ile His Pro Glu
1715 1720 1725
ctc aca tct cca aat ccg gag gaa gac tac tta gta cga tac ttg ttc 13618
Leu Thr Ser Pro Asn Pro Glu Glu Asp Tyr Leu Val Arg Tyr Leu Phe
1730 1735 1740
aga ggg ata ggg act gca tct tcc tct tgg tat aag gca tcc cat ctc 13666
Arg Gly Ile Gly Thr Ala Ser Ser Ser Trp Tyr Lys Ala Ser His Leu
1745 1750 1755 1760
ctt tct gta ccc gag gta aga tgt gca aga cac ggg aac tcc tta tac 13714
Leu Ser Val Pro Glu Val Arg Cys Ala Arg His Gly Asn Ser Leu Tyr
1765 1770 1775
tta gct gaa ggg agc gga gcc atc atg agt ctt ctc gaa ctg cat gta 13762
Leu Ala Glu Gly Ser Gly Ala Ile Met Ser Leu Leu Glu Leu His Val
1780 1785 1790
cca cat gaa act atc tat tac aat acg ctc ttt tca aat gag atg aac 13810
Pro His Glu Thr Ile Tyr Tyr Asn Thr Leu Phe Ser Asn Glu Met Asn
1795 1800 1805
ccc ccg caa cga cat ttc ggg ccg acc cca act cag ttt ttg aat tcg 13858
Pro Pro Gln Arg His Phe Gly Pro Thr Pro Thr Gln Phe Leu Asn Ser
1810 1815 1820
gtt gtt tat agg aat cta cag gcg gag gta aca tgc aaa gat gga ttt 13906
Val Val Tyr Arg Asn Leu Gln Ala Glu Val Thr Cys Lys Asp Gly Phe
1825 1830 1835 1840
gtc caa gag ttc cgt cca tta tgg aga gaa aat aca gag gaa agt gac 13954
Val Gln Glu Phe Arg Pro Leu Trp Arg Glu Asn Thr Glu Glu Ser Asp
1845 1850 1855
ctg acc tca gat aaa gca gtg ggg tat att aca tct gca gtg ccc tac 14002
Leu Thr Ser Asp Lys Ala Val Gly Tyr Ile Thr Ser Ala Val Pro Tyr
1860 1865 1870
aga tct gta tca ttg ctg cat tgt gac att gaa att cct cca ggg tcc 14050
Arg Ser Val Ser Leu Leu His Cys Asp Ile Glu Ile Pro Pro Gly Ser
1875 1880 1885
aat caa agc tta cta gat caa cta gct atc aat tta tct ctg att gcc 14098
Asn Gln Ser Leu Leu Asp Gln Leu Ala Ile Asn Leu Ser Leu Ile Ala
1890 1895 1900
atg cat tct gta agg gag ggc ggg gta gta atc atc aaa gtg ttg tat 14146
Met His Ser Val Arg Glu Gly Gly Val Val Ile Ile Lys Val Leu Tyr
1905 1910 1915 1920
gca atg gga tac tac ttt cat cta ctc atg aac ttg ttt gct ccg tgt 14194
Ala Met Gly Tyr Tyr Phe His Leu Leu Met Asn Leu Phe Ala Pro Cys
1925 1930 1935
tcc aca aaa gga tat att ctc tct aat ggt tat gca tgt cga gga gat 14242
Ser Thr Lys Gly Tyr Ile Leu Ser Asn Gly Tyr Ala Cys Arg Gly Asp
1940 1945 1950
atg gag tgt tac ctg gta ttt gtc atg ggt tac ctg ggc ggg cct aca 14290
Met Glu Cys Tyr Leu Val Phe Val Met Gly Tyr Leu Gly Gly Pro Thr
1955 1960 1965
ttt gta cat gag gtg gtg agg atg gca aaa act ctg gtg cag cgg cac 14338
Phe Val His Glu Val Val Arg Met Ala Lys Thr Leu Val Gln Arg His
1970 1975 1980
ggt acg ctt ttg tct aaa tca gat gag atc aca ctg acc agg tta ttc 14386
Gly Thr Leu Leu Ser Lys Ser Asp Glu Ile Thr Leu Thr Arg Leu Phe
1985 1990 1995 2000
acc tca cag cgg cag cgt gtg aca gac atc cta tcc agt cct tta cca 14434
Thr Ser Gln Arg Gln Arg Val Thr Asp Ile Leu Ser Ser Pro Leu Pro
2005 2010 2015
aga tta ata aag tac ttg agg aag aat att gac act gcg ctg att gaa 14482
Arg Leu Ile Lys Tyr Leu Arg Lys Asn Ile Asp Thr Ala Leu Ile Glu
2020 2025 2030
gcc ggg gga cag ccc gtc cgt cca ttc tgt gcg gag agt ctg gtg agc 14530
Ala Gly Gly Gln Pro Val Arg Pro Phe Cys Ala Glu Ser Leu Val Ser
2035 2040 2045
acg cta gcg aac ata act cag ata acc cag atc atc gct agt cac att 14578
Thr Leu Ala Asn Ile Thr Gln Ile Thr Gln Ile Ile Ala Ser His Ile
2050 2055 2060
gac aca gtt atc cgg tct gtg ata tat atg gaa gct gag ggt gat ctc 14626
Asp Thr Val Ile Arg Ser Val Ile Tyr Met Glu Ala Glu Gly Asp Leu
2065 2070 2075 2080
gct gac aca gta ttt cta ttt acc cct tac aat ctc tct act gac ggg 14674
Ala Asp Thr Val Phe Leu Phe Thr Pro Tyr Asn Leu Ser Thr Asp Gly
2085 2090 2095
aaa aag agg aca tca ctt aaa cag tgc acg aga cag atc cta gag gtt 14722
Lys Lys Arg Thr Ser Leu Lys Gln Cys Thr Arg Gln Ile Leu Glu Val
2100 2105 2110
aca ata cta ggt ctt aga gtc gaa aat ctc aat aaa ata ggc gat ata 14770
Thr Ile Leu Gly Leu Arg Val Glu Asn Leu Asn Lys Ile Gly Asp Ile
2115 2120 2125
atc agc cta gtg ctt aaa ggc atg atc tcc atg gag gac ctt atc cca 14818
Ile Ser Leu Val Leu Lys Gly Met Ile Ser Met Glu Asp Leu Ile Pro
2130 2135 2140
cta agg aca tac ttg aag cat agt acc tgc cct aaa tat ttg aag gct 14866
Leu Arg Thr Tyr Leu Lys His Ser Thr Cys Pro Lys Tyr Leu Lys Ala
2145 2150 2155 2160
gtc cta ggt att acc aaa ctc aaa gaa atg ttt aca gac act tct gta 14914
Val Leu Gly Ile Thr Lys Leu Lys Glu Met Phe Thr Asp Thr Ser Val
2165 2170 2175
ctg tac ttg act cgt gct caa caa aaa ttc tac atg aaa act ata ggc 14962
Leu Tyr Leu Thr Arg Ala Gln Gln Lys Phe Tyr Met Lys Thr Ile Gly
2180 2185 2190
aat gca gtc aaa gga tat tac agt aac tgt gac tct ta acgaaaatca 15010
Asn Ala Val Lys Gly Tyr Tyr Ser Asn Cys Asp Ser
2195 2200
catattaata ggctcctttt ttggccaatt gtattcttgt tgatttaatc atattatgtt 15070
agaaaaaagt tgaaccctga ctccttagga ctcgaattcg aactcaaata aatgtcttaa 15130
aaaaaggttg cgcacaatta ttcttgagtg tagtctcgtc attcaccaaa tctttgtttg 15190
gtgggtcggc atggcatctc cacctcctcg cggtccgacc tgggcatccg aaggaggacg 15250
tcgtccactc ggatggctaa gggagagctc ggatccggct gctaacaaag cccgaaagga 15310
agctgagttg gctgctgcca ccgctgagca ataactagca taaccccttg gggcctctaa 15370
acgggtcttg aggggttttt tgcatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag 15430
aaaataccgc atcaggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt 15490
tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc 15550
aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa 15610
aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa 15670
tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc 15730
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ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat 16450
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ctcttgcccg gcgtcaacac gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct 17050
catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc 17110
cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag 17170
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ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt 17350
tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgtctaa gaaaccatta ttatcatgac 17410
attaacctat aaaaataggc gtatcacgag gccctttcgt cttcaagaat tctaatacga 17470
ctcactatag g 17481
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Met Ala Ser Val Leu Asp Lys Gly Thr Gly Lys Tyr Gln Phe Ala Arg
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245 250 255
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260 265 270
Gly Arg Leu Gly Phe Asp Gly Gln Tyr His Glu Lys Asp Leu Asp Thr
275 280 285
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290 295 300
Gly Ser Phe Ile Asp Asp Arg Val Trp Phe Pro Val Tyr Gly Gly Leu
305 310 315 320
Lys Pro Asp Ser Pro Ser Asp Thr Ala Gln Glu Gly Lys Tyr Val Ile
325 330 335
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340 345 350
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Asp Pro Val Leu Thr Ile Pro Pro Asn Thr Ile Thr Leu Met Gly Ala
385 390 395 400
Glu Gly Arg Ile Leu Thr Val Gly Thr Ser His Phe Leu Tyr Gln Arg
405 410 415
Gly Ser Ser Tyr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Tyr Pro Met Thr Val Asn
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Gly
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<211> 2204
<212> PRT
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Lys Phe Thr Cys Leu Thr Gln Glu Leu Val Leu Met Tyr Ala Asp Met
225 230 235 240
Met Glu Gly Arg Asp Met Val Asn Ile Ile Ser Thr Thr Ala Val His
245 250 255
Leu Arg Ser Leu Ser Glu Lys Ile Asp Asp Ile Leu Arg Leu Ile Asp
260 265 270
Ala Leu Ala Lys Asp Leu Gly Asn Gln Val Tyr Asp Val Val Ser Leu
275 280 285
Met Glu Gly Phe Ala Tyr Gly Ala Val Gln Leu Leu Glu Pro Ser Gly
290 295 300
Thr Phe Ala Gly Asp Phe Phe Ala Phe Asn Leu Gln Glu Leu Lys Asp
305 310 315 320
Ile Leu Ile Gly Leu Leu Pro Asn Asp Ile Ala Glu Ser Val Thr His
325 330 335
Ala Ile Ala Thr Val Phe Ser Gly Leu Glu Gln Asn Gln Ala Ala Glu
340 345 350
Met Leu Cys Leu Leu Arg Leu Trp Gly His Pro Leu Leu Glu Ser Arg
355 360 365
Ile Ala Ala Lys Ala Val Arg Ser Gln Met Cys Ala Pro Lys Met Val
370 375 380
Asp Phe Asp Met Ile Leu Gln Val Leu Ser Phe Phe Lys Gly Thr Ile
385 390 395 400
Ile Asn Gly Tyr Arg Lys Lys Asn Ala Gly Val Trp Pro Arg Val Lys
405 410 415
Val Asp Thr Ile Tyr Gly Lys Val Ile Gly Gln Leu His Ala Asp Ser
420 425 430
Ala Glu Ile Ser His Asp Ile Met Leu Arg Glu Tyr Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Ala Leu Glu Phe Glu Pro Cys Ile Glu Tyr Asp Pro Val Thr Asn Leu
450 455 460
Ser Met Phe Leu Lys Asp Lys Ala Ile Ala His Pro Asn Asp Asn Trp
465 470 475 480
Leu Ala Ser Phe Arg Arg Asn Leu Leu Ser Glu Asp Gln Lys Lys His
485 490 495
Val Lys Glu Ala Thr Ser Thr Asn Arg Leu Leu Ile Glu Phe Leu Glu
500 505 510
Ser Asn Asp Phe Asp Pro Tyr Lys Glu Met Glu Tyr Leu Thr Thr Leu
515 520 525
Glu Tyr Leu Arg Asp Asp Asn Val Ala Val Ser Tyr Ser Leu Lys Glu
530 535 540
Lys Glu Val Lys Val Asn Gly Arg Ile Phe Ala Lys Leu Thr Lys Lys
545 550 555 560
Leu Arg Asn Cys Gln Val Met Ala Glu Gly Ile Leu Ala Asp Gln Ile
565 570 575
Ala Pro Phe Phe Gln Gly Asn Gly Val Ile Gln Asp Ser Ile Ser Leu
580 585 590
Thr Lys Ser Met Leu Ala Met Ser Gln Leu Ser Phe Asn Ser Asn Lys
595 600 605
Lys Arg Ile Thr Asp Cys Lys Glu Arg Val Ser Ser Asn Arg Asn His
610 615 620
Asp Pro Lys Ser Lys Asn Arg Arg Arg Val Ala Thr Phe Ile Thr Thr
625 630 635 640
Asp Leu Gln Lys Tyr Cys Leu Asn Trp Arg Tyr Gln Thr Ile Lys Leu
645 650 655
Phe Ala His Ala Ile Asn Gln Leu Met Gly Leu Pro His Phe Phe Glu
660 665 670
Trp Ile His Leu Arg Leu Met Asp Thr Thr Met Phe Val Gly Asp Pro
675 680 685
Phe Asn Pro Pro Ser Asp Pro Thr Asp Cys Asp Leu Ser Arg Val Pro
690 695 700
Asn Asp Asp Ile Tyr Ile Val Ser Ala Arg Gly Gly Ile Glu Gly Leu
705 710 715 720
Cys Gln Lys Leu Trp Thr Met Ile Ser Ile Ala Ala Ile Gln Leu Ala
725 730 735
Ala Ala Arg Ser His Cys Arg Val Ala Cys Met Val Gln Gly Asp Asn
740 745 750
Gln Val Ile Ala Val Thr Arg Glu Val Arg Ser Asp Asp Ser Pro Glu
755 760 765
Met Val Leu Thr Gln Leu His Gln Ala Ser Asp Asn Phe Phe Lys Glu
770 775 780
Leu Ile His Val Asn His Leu Ile Gly His Asn Leu Lys Asp Arg Glu
785 790 795 800
Thr Ile Arg Ser Asp Thr Phe Phe Ile Tyr Ser Lys Arg Ile Phe Lys
805 810 815
Asp Gly Ala Ile Leu Ser Gln Val Leu Lys Asn Ser Ser Lys Leu Val
820 825 830
Leu Val Ser Gly Asp Leu Ser Glu Asn Thr Val Met Ser Cys Ala Asn
835 840 845
Ile Ala Ser Thr Val Ala Arg Leu Cys Glu Asn Gly Leu Pro Lys Asp
850 855 860
Phe Cys Tyr Tyr Leu Asn Tyr Ile Met Ser Cys Val Gln Thr Tyr Phe
865 870 875 880
Asp Ser Glu Phe Ser Ile Thr Asn Asn Ser His Pro Asp Leu Asn Gln
885 890 895
Ser Trp Ile Glu Asp Ile Ser Phe Val His Ser Tyr Val Leu Thr Pro
900 905 910
Ala Gln Leu Gly Gly Leu Ser Asn Leu Gln Tyr Ser Arg Leu Tyr Thr
915 920 925
Arg Asn Ile Gly Asp Pro Gly Thr Thr Ala Phe Ala Glu Ile Lys Arg
930 935 940
Leu Glu Ala Val Gly Leu Leu Ser Pro Asn Ile Met Thr Asn Ile Leu
945 950 955 960
Thr Arg Pro Pro Gly Asn Gly Asp Trp Ala Ser Leu Cys Asn Asp Pro
965 970 975
Tyr Ser Phe Asn Phe Glu Thr Val Ala Ser Pro Asn Ile Val Leu Lys
980 985 990
Lys His Thr Gln Arg Val Leu Phe Glu Thr Cys Ser Asn Pro Leu Leu
995 1000 1005
Ser Gly Val His Thr Glu Asp Asn Glu Ala Glu Glu Lys Ala Leu Ala
1010 1015 1020
Glu Phe Leu Leu Asn Gln Glu Val Ile His Pro Arg Val Ala His Ala
1025 1030 1035 1040
Ile Met Glu Ala Ser Ser Val Gly Arg Arg Lys Gln Ile Gln Gly Leu
1045 1050 1055
Val Asp Thr Thr Asn Thr Val Ile Lys Ile Ala Leu Thr Arg Arg Pro
1060 1065 1070
Leu Gly Ile Lys Arg Leu Met Arg Ile Val Asn Tyr Ser Ser Met His
1075 1080 1085
Ala Met Leu Phe Arg Asp Asp Val Phe Ser Ser Ser Arg Ser Asn His
1090 1095 1100
Pro Leu Val Ser Ser Asn Met Cys Ser Leu Thr Leu Ala Asp Tyr Ala
1105 1110 1115 1120
Arg Asn Arg Ser Trp Ser Pro Leu Thr Gly Gly Arg Lys Ile Leu Gly
1125 1130 1135
Val Ser Asn Pro Asp Thr Ile Glu Leu Val Glu Gly Glu Ile Leu Ser
1140 1145 1150
Val Ser Gly Gly Cys Thr Arg Cys Asp Ser Gly Asp Glu Gln Phe Thr
1155 1160 1165
Trp Phe His Leu Pro Ser Asn Ile Glu Leu Thr Asp Asp Thr Ser Lys
1170 1175 1180
Asn Pro Pro Met Arg Val Pro Tyr Leu Gly Ser Lys Thr Gln Glu Arg
1185 1190 1195 1200
Arg Ala Ala Ser Leu Ala Lys Ile Ala His Met Ser Pro His Val Lys
1205 1210 1215
Ala Ala Leu Arg Ala Ser Ser Val Leu Ile Trp Ala Tyr Gly Asp Asn
1220 1225 1230
Glu Val Asn Trp Thr Ala Ala Leu Thr Ile Ala Lys Ser Arg Cys Asn
1235 1240 1245
Val Asn Leu Glu Tyr Leu Arg Leu Leu Ser Pro Leu Pro Thr Ala Gly
1250 1255 1260
Asn Leu Gln His Arg Leu Asp Asp Gly Ile Thr Gln Met Thr Phe Thr
1265 1270 1275 1280
Pro Ala Ser Leu Tyr Arg Val Ser Pro Tyr Ile His Ile Ser Asn Asp
1285 1290 1295
Ser Gln Arg Leu Phe Thr Glu Glu Gly Val Lys Glu Gly Asn Val Val
1300 1305 1310
Tyr Gln Gln Ile Met Leu Leu Gly Leu Ser Leu Ile Glu Ser Ile Phe
1315 1320 1325
Pro Met Thr Thr Thr Arg Thr Tyr Asp Glu Ile Thr Leu His Leu His
1330 1335 1340
Ser Lys Phe Ser Cys Cys Ile Arg Glu Ala Pro Val Ala Val Pro Phe
1345 1350 1355 1360
Glu Leu Leu Gly Val Val Pro Glu Leu Arg Thr Val Thr Ser Asn Lys
1365 1370 1375
Phe Met Tyr Asp Pro Ser Pro Val Ser Glu Gly Asp Phe Ala Arg Leu
1380 1385 1390
Asp Leu Ala Ile Phe Lys Ser Tyr Glu Leu Asn Leu Glu Ser Tyr Pro
1395 1400 1405
Thr Ile Glu Leu Met Asn Ile Leu Ser Ile Ser Ser Gly Lys Leu Ile
1410 1415 1420
Gly Gln Ser Val Val Ser Tyr Asp Glu Asp Thr Ser Ile Lys Asn Asp
1425 1430 1435 1440
Ala Ile Ile Val Tyr Asp Asn Thr Arg Asn Trp Ile Ser Glu Ala Gln
1445 1450 1455
Asn Ser Asp Val Val Arg Leu Phe Glu Tyr Ala Ala Leu Glu Val Leu
1460 1465 1470
Leu Asp Cys Ser Tyr Gln Leu Tyr Tyr Leu Arg Val Arg Gly Leu Asp
1475 1480 1485
Asn Ile Val Leu Tyr Met Gly Asp Leu Tyr Lys Asn Met Pro Gly Ile
1490 1495 1500
Leu Leu Ser Asn Ile Ala Ala Thr Ile Ser His Pro Val Ile His Ser
1505 1510 1515 1520
Arg Leu His Ala Val Gly Leu Val Asn His Asp Gly Ser His Gln Leu
1525 1530 1535
Ala Asp Thr Asp Phe Ile Glu Met Ser Ala Lys Leu Leu Val Ser Cys
1540 1545 1550
Thr Arg Arg Val Ile Ser Gly Leu Tyr Ser Gly Asn Lys Tyr Asp Leu
1555 1560 1565
Leu Phe Pro Ser Val Leu Asp Asp Asn Leu Asn Glu Lys Met Leu Gln
1570 1575 1580
Leu Ile Ser Arg Leu Cys Cys Leu Tyr Thr Val Leu Phe Ala Thr Thr
1585 1590 1595 1600
Arg Glu Ile Pro Lys Ile Arg Gly Leu Thr Ala Glu Glu Lys Cys Ser
1605 1610 1615
Ile Leu Thr Glu Tyr Leu Leu Ser Asp Ala Val Lys Pro Leu Leu Ser
1620 1625 1630
Pro Asp Gln Val Ser Ser Ile Met Ser Pro Asn Ile Ile Thr Phe Pro
1635 1640 1645
Ala Asn Leu Tyr Tyr Met Ser Arg Lys Ser Leu Asn Leu Ile Arg Glu
1650 1655 1660
Arg Glu Asp Arg Asp Thr Ile Leu Ala Leu Leu Phe Pro Gln Glu Pro
1665 1670 1675 1680
Leu Leu Glu Phe Pro Ser Val Gln Asp Ile Gly Ala Arg Val Lys Asp
1685 1690 1695
Pro Phe Thr Arg Gln Pro Ala Ala Phe Leu Gln Glu Leu Asp Leu Ser
1700 1705 1710
Ala Pro Ala Arg Tyr Asp Ala Phe Thr Leu Ser Gln Ile His Pro Glu
1715 1720 1725
Leu Thr Ser Pro Asn Pro Glu Glu Asp Tyr Leu Val Arg Tyr Leu Phe
1730 1735 1740
Arg Gly Ile Gly Thr Ala Ser Ser Ser Trp Tyr Lys Ala Ser His Leu
1745 1750 1755 1760
Leu Ser Val Pro Glu Val Arg Cys Ala Arg His Gly Asn Ser Leu Tyr
1765 1770 1775
Leu Ala Glu Gly Ser Gly Ala Ile Met Ser Leu Leu Glu Leu His Val
1780 1785 1790
Pro His Glu Thr Ile Tyr Tyr Asn Thr Leu Phe Ser Asn Glu Met Asn
1795 1800 1805
Pro Pro Gln Arg His Phe Gly Pro Thr Pro Thr Gln Phe Leu Asn Ser
1810 1815 1820
Val Val Tyr Arg Asn Leu Gln Ala Glu Val Thr Cys Lys Asp Gly Phe
1825 1830 1835 1840
Val Gln Glu Phe Arg Pro Leu Trp Arg Glu Asn Thr Glu Glu Ser Asp
1845 1850 1855
Leu Thr Ser Asp Lys Ala Val Gly Tyr Ile Thr Ser Ala Val Pro Tyr
1860 1865 1870
Arg Ser Val Ser Leu Leu His Cys Asp Ile Glu Ile Pro Pro Gly Ser
1875 1880 1885
Asn Gln Ser Leu Leu Asp Gln Leu Ala Ile Asn Leu Ser Leu Ile Ala
1890 1895 1900
Met His Ser Val Arg Glu Gly Gly Val Val Ile Ile Lys Val Leu Tyr
1905 1910 1915 1920
Ala Met Gly Tyr Tyr Phe His Leu Leu Met Asn Leu Phe Ala Pro Cys
1925 1930 1935
Ser Thr Lys Gly Tyr Ile Leu Ser Asn Gly Tyr Ala Cys Arg Gly Asp
1940 1945 1950
Met Glu Cys Tyr Leu Val Phe Val Met Gly Tyr Leu Gly Gly Pro Thr
1955 1960 1965
Phe Val His Glu Val Val Arg Met Ala Lys Thr Leu Val Gln Arg His
1970 1975 1980
Gly Thr Leu Leu Ser Lys Ser Asp Glu Ile Thr Leu Thr Arg Leu Phe
1985 1990 1995 2000
Thr Ser Gln Arg Gln Arg Val Thr Asp Ile Leu Ser Ser Pro Leu Pro
2005 2010 2015
Arg Leu Ile Lys Tyr Leu Arg Lys Asn Ile Asp Thr Ala Leu Ile Glu
2020 2025 2030
Ala Gly Gly Gln Pro Val Arg Pro Phe Cys Ala Glu Ser Leu Val Ser
2035 2040 2045
Thr Leu Ala Asn Ile Thr Gln Ile Thr Gln Ile Ile Ala Ser His Ile
2050 2055 2060
Asp Thr Val Ile Arg Ser Val Ile Tyr Met Glu Ala Glu Gly Asp Leu
2065 2070 2075 2080
Ala Asp Thr Val Phe Leu Phe Thr Pro Tyr Asn Leu Ser Thr Asp Gly
2085 2090 2095
Lys Lys Arg Thr Ser Leu Lys Gln Cys Thr Arg Gln Ile Leu Glu Val
2100 2105 2110
Thr Ile Leu Gly Leu Arg Val Glu Asn Leu Asn Lys Ile Gly Asp Ile
2115 2120 2125
Ile Ser Leu Val Leu Lys Gly Met Ile Ser Met Glu Asp Leu Ile Pro
2130 2135 2140
Leu Arg Thr Tyr Leu Lys His Ser Thr Cys Pro Lys Tyr Leu Lys Ala
2145 2150 2155 2160
Val Leu Gly Ile Thr Lys Leu Lys Glu Met Phe Thr Asp Thr Ser Val
2165 2170 2175
Leu Tyr Leu Thr Arg Ala Gln Gln Lys Phe Tyr Met Lys Thr Ile Gly
2180 2185 2190
Asn Ala Val Lys Gly Tyr Tyr Ser Asn Cys Asp Ser
2195 2200
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<211> 32
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> S4-R primer
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S5-R primer
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ctcaactagt aagggaacga tcctaaattc c 31
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<223> S6-F primer
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<223> S9-R primer
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<213> Artificial Sequence
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<220>
<223> La-1901 primer
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> La-2581 primer
<400> 53
aggcgatatc acagagagta 20
<210> 54
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> La-3271 primer
<400> 54
gtgccccaat tgtgccaag 19
<210> 55
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S6-F-La priemr
<400> 55
actagttgag atcctcaaag atgacgg 27
<210> 56
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S6-R-La primer
<400> 56
tgctctgccc tttcaggacc ggagctcgcc atg 33
<210> 57
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S7-F-La primer
<400> 57
catggcgagc tccggtcctg aaagggcaga gca 33
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> La-5121 primer
<400> 58
cagctcagga attagactgc 20
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> La-5711 primer
<400> 59
gtcatcgcca actgcaagat 20
<210> 60
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> La-7042 primer
<400> 60
ctccggacat ctgcaacag 19
<210> 61
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> La-8591 primer
<400> 61
aaactcggaa gggcagtac 19
<210> 62
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> La-9311 primer
<400> 62
ttcgcattca acctgcagg 19
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> La-9971 primer
<400> 63
cttagagatg acaatgtggc 20
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> La-10661 primer
<400> 64
gtaagatcag acgactctcc 20
<210> 65
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> La-11321 primer
<400> 65
tttgagactg ttgcaagcc 19
<210> 66
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> La-12012 primer
<400> 66
tgtcgccaca tgtaaaggc 19
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> La-12721 primer
<400> 67
tacccgaaat tggatcagtg 20
<210> 68
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> La-13339 primer
<400> 68
catgtctcgg aagagcctc 19
<210> 69
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> La-13981 primer
<400> 69
atctgcagtg ccctacaga 19
<210> 70
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> La14976 primer
<400> 70
acagtaactg tgactcttaa cgaaaatcac atattaatag gctcc 45
<210> 71
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> La15020R primer
<400> 71
ggagcctatt aatatgtgat tttcgttaag agtcacagtt actgt 45
<210> 72
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S7-R primer
<400> 72
gatccgtacg aatgctgctg aactc 25
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NDV-Pt-R primer
<400> 73
tgccactgmt agttgygata 20
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NDcomF156 primer
<400> 74
atacacctcr tcycagacag 20
<210> 75
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> La-8892R primer
<400> 75
gagccatgca aacttggctg tggacc 26
<210> 76
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> La-14708 primer
<400> 76
acagtgcacg agacagatcc 20
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> La-15092R primer
<400> 77
gtcctaagga gtcagggttc 20
<210> 78
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NDV-NP-F primer
<400> 78
gagcggccgc accatgagta cgagcagctc c 31
<210> 79
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NDV-NP-R primer
<400> 79
gagcggccgc tcagtacccc cagtcggtg 29
<210> 80
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NDV-P-F primer
<400> 80
gagcggccgc accatggcca cctttacaga tg 32
<210> 81
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NDV-P-R primer
<400> 81
gagcggccgc ttagccattt agagcaaggc 30
<210> 82
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NDV-L-F primer
<400> 82
gagcggccgc accatggcga gcctccgatc ctgaaa 36
<210> 83
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NDV-L-R primer
<400> 83
gagcggccgc ttaagagtca cagttactgt aatatcc 37
<210> 84
<211> 2357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of pTMH vector
<400> 84
gaattctaat acgactcact ataggaccaa gagacgggcc catatcgatt cgcgaccgcg 60
ggatactagt cgtacgccta ggggtctctt ggtgggtcgg catggcatct ccacctcctc 120
gcggtccgac ctgggcatcc gaaggaggac gtcgtccact cggatggcta agggagagct 180
cggatccggc tgctaacaaa gcccgaaagg aagctgagtt ggctgctgcc accgctgagc 240
aataactagc ataacccctt ggggcctcta aacgggtctt gaggggtttt ttgcatatgc 300
ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg catcaggcgc tcttccgctt 360
cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact 420
caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag 480
caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata 540
ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc 600
cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg 660
ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc 720
tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg 780
gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc 840
ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga 900
ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg 960
gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa 1020
aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg 1080
tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt 1140
ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat 1200
tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct 1260
aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta 1320
tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa 1380
ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac 1440
gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa 1500
gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag 1560
taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctgca ggcatcgtgg 1620
tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag 1680
ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg 1740
tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc 1800
ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat 1860
tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaaca cgggataata 1920
ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa 1980
aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca 2040
actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc 2100
aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc 2160
tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg 2220
aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac 2280
ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga 2340
ggccctttcg tcttcaa 2357
<210> 85
<211> 300
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of HN gene (1-569) of KBNP-4152 and HN
terminus (570-577) of Lasota stain
<400> 85
ccctttacta gttgagattc tcaaggatga tggggttagg gaggccaggg ctggccgctt 60
gagtcaattg cgagagggtt ggaaagatga cattgtatca cctatctttt gcgacgccaa 120
gaatcaaact gagtaccggc gtgagctcga gtcttacgct gccagctggc cataatcagc 180
tagcgctaat gtgattagat taaatcttgt cgatagtcac ttgattaaga aaaaatgtaa 240
gtggcaatga gatacaaggc aaaacagctc atggtaaata atacgggtag gacatggcga 300
300
Claims (12)
- 삭제
- 삭제
- 약병원성 뉴캐슬병 바이러스인 라소타/46 균주 (AY845400)의 NP, P, M 및 L 단백질 코딩 서열; 및강병원성 뉴캐슬병 바이러스인 KBNP-C4152(기탁번호: KCTC 10919BP)의 F 및 HN 단백질 코딩 서열을 포함하며,상기 F 단백질 코딩 서열에 있어서, 강병원성 뉴캐슬병 바이러스 F 단백질의 115번째 아미노산의 코딩 코돈이 GCA, GCC, GCG 및 GCU로 이루어진 알라닌 코딩 코돈; GAC 및 GAU로 이루어진 아스파르트산 코딩 코돈; UUC 및 UUU로 이루어진 페닐알라닌 코딩 코돈; AUC 및 AUU로 이루어진 이소류신 코딩 코돈; UUA 및 UUG로 이루어진 류신 코딩 코돈; UCA, UCC, UCG 및 UCU로 이루어진 세린 코딩 코돈; ACC 및 ACU로 이루어진 트레오닌 코딩 코돈; GUA, GUC, GUG 및 GUU로 이루어진 발린 코딩 코돈; UAC 및 UAU 티로신 코딩 코돈으로 이루어진 군 중에서 선택된 코돈으로 치환된 것을 특징으로 하는,뉴캐슬병 바이러스의 게놈 전사 벡터.
- 제3항에 있어서, 상기 HN 단백질 코딩 서열이 강병원성 뉴캐슬병 바이러스인 KBNP-C4152(기탁번호: KCTC 10919BP)의 HN의 569번째 아미노산의 C 말단에 약병원성 뉴캐슬병 바이러스인 라소타/46 균주 (AY845400)의 HN 단백질의 570번째 이후의 아미노산 서열이 추가로 삽입된 재조합 HN 단백질을 코딩하는 것인 게놈 전사 벡터.
- 제3항에 있어서, SEQ ID NO: 1의 염기 서열로 표현되는 게놈 전사 벡터.
- 삭제
- 삭제
- 약병원성 뉴캐슬병 바이러스인 라소타/46 균주 (AY845400)의 NP, P, M 및 L 단백질 코딩 서열, 및강병원성 뉴캐슬병 바이러스인 KBNP-C4152 (기탁번호: KCTC 10919BP)의 F 및 HN 단백질 코딩 서열을 가지며,상기 F 단백질 코딩 서열에 있어서, 강병원성 뉴캐슬병 바이러스의 F 단백질의 115번째 아미노산의 코딩 코돈이 GCA, GCC, GCG 및 GCU로 이루어진 알라닌 코딩 코돈; GAC 및 GAU로 이루어진 아스파르트산 코딩 코돈; UUC 및 UUU로 이루어진 페닐알라닌 코딩 코돈; AUC 및 AUU로 이루어진 이소류신 코딩 코돈; UUA 및 UUG로 이루어진 류신 코딩 코돈; UCA, UCC, UCG 및 UCU로 이루어진 세린 코딩 코돈; ACC 및 ACU로 이루어진 트레오닌 코딩 코돈; GUA, GUC, GUG 및 GUU로 이루어진 발린 코딩 코돈; UAC 및 UAU 티로신 코딩 코돈으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 코돈으로 치환된 것을 특징으로 하는,재조합 뉴캐슬병 바이러스 균주
- 제8항에 있어서, 상기 HN 코딩 서열이 강병원성 뉴캐슬병 바이러스인 KBNP-C4152 (기탁번호: KCTC 10919BP)의 HN의 569번 아미노산의 C 말단에 약병원성 뉴캐슬병 바이러스인 라소타/46 균주 (AY845400)의 HN의 570번째 이후의 아미노산 서열이 추가로 연결된 재조합 HN 단백질을 코딩하는 것인 재조합 뉴캐슬병 바이러스 균주.
- 제8항에 있어서, 기탁번호 KCTC 10984BP인 재조합 뉴캐슬병 바이러스 균주.
- 삭제
- 삭제
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-
2007
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Patent Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
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