ES2168101T5 - Clonacion y expresion de alfa-galactosidasa a biologicamente activa. - Google Patents

Clonacion y expresion de alfa-galactosidasa a biologicamente activa.

Info

Publication number
ES2168101T5
ES2168101T5 ES94902448T ES94902448T ES2168101T5 ES 2168101 T5 ES2168101 T5 ES 2168101T5 ES 94902448 T ES94902448 T ES 94902448T ES 94902448 T ES94902448 T ES 94902448T ES 2168101 T5 ES2168101 T5 ES 2168101T5
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
gal
enzyme
galactosidase
expression
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES94902448T
Other languages
English (en)
Other versions
ES2168101T3 (es
Inventor
Robert J. Desnick
David F. Bishop
Yiannis A. Ioannou
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Icahn School of Medicine at Mount Sinai
Original Assignee
Mount Sinai School of Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=25529958&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2168101(T5) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Mount Sinai School of Medicine filed Critical Mount Sinai School of Medicine
Application granted granted Critical
Publication of ES2168101T3 publication Critical patent/ES2168101T3/es
Publication of ES2168101T5 publication Critical patent/ES2168101T5/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2465—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on alpha-galactose-glycoside bonds, e.g. alpha-galactosidase (3.2.1.22)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/18—Erythrocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1081—Glycosyltransferases (2.4) transferring other glycosyl groups (2.4.99)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01022—Alpha-galactosidase (3.2.1.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01049—Alpha-N-acetylgalactosaminidase (3.2.1.49)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/61—Fusion polypeptide containing an enzyme fusion for detection (lacZ, luciferase)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/705—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a protein-A fusion

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

EL PRESENTE INVENTO INCLUYE LA PRODUCCION DE GRANDES CANTIDADES DE A ALFA-GAL POR CLONADO Y EXPRESION DE LA SECUENCIA CODIFICADORA DE A ALFA-GAL EN SISTEMAS DE EXPRESION DE CELULAS CON PATRON EUCARIOTICO. ESTOS SISTEMAS DE EXPRESION EUCARIOTICOS, Y EN PARTICULAR LOS SISTEMAS DE EXPRESION CELULAR DE PATRON MAMIFERO DESCRITOS, PROPORCIONAN MODIFICACIONES COTRANSLACIONALES Y POSTTRANSLACIONALES ADECUADAS REQUERIDAS PARA EL ADECUADO PROCESAMIENTO, POR EJ. GLICOSILACION, FOSFORILACION, ETC. Y CLASIFICACION DE LA EXPRESION PRODUCTO DE FORMA QUE SE PRODUZCA UNA ENZIMA ACTIVA. ADEMAS SE DESCRIBE LA EXPRESION DE PROTEINAS DE FUSION QUE SIMPLIFICAN LA PURIFICACION. USANDO ESTOS METODOS, LA A ALFA-GAL RECOMBINANTE SECRETADA POR LAS CELULAS DE PATRON ESPECIFICADO SE RECUPERA DEL MEDIO DE CULTIVO CON BUEN RENDIMIENTO. LA A ALFA-GAL PRODUCIDA SEGUN ESTE INVENTO SE PUEDE UTILIZAR, SIN SER EXCLUSIVAS, EN EL TRATAMIENTO DE LA ENFERMEDAD DE FABRY; PARA LA HIDROLISIS DE RESIDUOS ALFA-GALACTOSILES EN GLICOCONJUNGADOS; Y/O PARA LA CONVERSION DE ANTIGENOS DEL GRUPO SANGUINEO B EN ERITROCITOS DEL ANTIGENO DEL GRUPO SANGUINEO O.

Description

Clonación y expresión de \alpha-galactosidasa A biológicamente activa.
1. Introducción
La presente invención se refiere a la producción de \alpha-galactosidasa humana biológicamente activa (\alpha-Gal A), que supone la clonación y expresión de la secuencia de codificación genética para \alpha-Gal A en sistemas de expresión eucariótica, los cuales proporcionan las adecuadas modificaciones posteriores a la traducción y el procesado del producto de expresión.
La invención se demuestra aquí realizando ejemplos en los que se produjeron niveles elevados de \alpha-Gal A en sistemas de expresión en mamíferos. La enzima \alpha-Gal producida de acuerdo con la invención se puede utilizar para varios fines, incluyendo, pero no estando limitados a, terapia de sustitución enzimática para la enfermedad de Fabry, procedimientos industriales que implican la hidrólisis de restos de \alpha-D-galactosilo de glicoconjugados, y para la conversión del antígeno del grupo sanguíneo B en eritrocitos al antígeno del grupo sanguíneo 0.
2. Antecedentes de la invención
A comienzos de los años 70, varios investigadores demostraron la existencia de dos isoenzimas de \alpha-galactosidasa denominadas A y B, las cuales hidrolizaban los enlaces \alpha-galactosídicos en 4-MU- y/o r-NP-\alpha-D- -galactopiranósidos (Kint, 1971, Arch. Int. Physiol. Biochem. 79: 633-644; Beutler & Kuhl, 1972, Amer. J. Hum. Genet. 24: 237-249; Romeo, et al., 1972, FEBS Lett. 27: 161-166; Wood & Nadler, 1972, Am. J. Hum. Genet. 24: 250-255; Ho, et al., 1972, Am. J. Hum. Genet. 24: 256-266; Desnick, et al., 1973, J. Lab. Clin. Med. 81: 157-171; y Desnick, et al., 1989, en: The Metabolic Basis of Inherited Disease, Scriver, C.R., Beaudet, A.L. Sly, W.S. and Valle, D., eds. pp. 1751-1796. McGraw Hill, New York). En tejidos, alrededor del 80-90% de la actividad de \alpha-galactosidasa (\alpha-Gal) total era debida a una isoenzima \alpha-Gal A termolábil, que puede inhibirse por mioinositol, mientras que el resto lo justificaba una \alpha-Gal B, relativamente termoestable. Las dos isoenzimas se podían separar por electroforesis, isoelectroenfoque y cromatografía de intercambio iónico. Después de un tratamiento con neuraminidasa, las migraciones electroforéticas y los valores del pI (punto isoeléctrico) de \alpha-Gal A y B eran similares (Kint, 1971; Arch. Int. Physiol. Biochem. 79: 633-644), sugiriendo inicialmente que las dos enzimas eran los productos del mismo gen glicosilados de forma diferente. El hallazgo de que las enzimas glicoproteicas purificadas tenían similares propiedades físicas incluyendo un peso molecular de subunidad (\sim 46 kDa), estructuras homodiméricas y composiciones de aminoácidos, también indicaba su afinidad estructural (Beutler & Kulh, 1972,J. Biol. Chem. 47: 7195-7200; Callahan et al., 1973, Biochem Med. 7: 424-431; Dean et al., 1977, Biochem. Biophys. Res. Comm. 77: 1411-1417; Scram, et al., 1977, Biochim. Biophys. Acta. 482: 138-144; Kusiak, et al., 1978, J. Biol. Chem. 253: 184-190; Dean, et al., 1979, J. Biol. Chem. 254: 10001-10005; and Bishop, et al., 1980, en Enzyme Therapy in Genetic Disease: 2, Desnick, R.J. ed., pp. 17-32, Alan R. Liss, Inc., New York). Sin embargo, la demostración posterior de que los anticuerpos policlonales frente a \alpha-Gal A o B no presentaban reacción cruzada con la otra enzima (Beutler & Kuhl, 1972, J. Biol. Chem. 247: 7195-7200; y Schram, et al., 1977, Biochim. Biophys. Acta. 482: 138-144); de que solamente la actividad \alpha-Gal A era deficiente en hemicigotos con enfermedad de Fabry (Kint, 1971, Arch. Int. Physiol. Biochem. 79: 633-644; Beutler & Kuhl, 1972, Amer. J. Hum. Genet. 24: 237-249; Romeo, et al., 1972, FEBS Lett. 27: 161-166; Wood & Nadler, 1972, Am. J. Hum. Genet. 24: 250-255; Ho, et al., 1972, Am. J. Hum. Genet. 24: 256-266; Desnick, et al., 1973, J. Lab. Clin. Med. 81: 157-171; y Desnick, et al., 1989, en: The Metabolic Basis of Inherited Disease, Scriver, C.R., Beaudet, A.L. Sly, W.S. and Valle, D., eds. pp. 1751-1796. McGraw Hill, New York; y (Beutler & Kuhl, 1972, J. Biol. Chem. 247:7195-7200); y de que los genes para \alpha-Gal A y B correspondían a diferentes cromosomas (Desnick, et al., 1989, en: The Metabolic Basis of Inherited Disease, Scriver, C.R., Beaudet, A.L. Sly, W.S. and Valle, D., eds. pp. 1751-1796, McGraw Hill, New York; deGroot, et al., 1978, Hum. Genet. 44: 305-312), claramente demostraban que estas enzimas eran genéticamente distintas.
2.1. La \alpha-Gal A y la enfermedad de Fabry
En la enfermedad de Fabry, una enfermedad de almacenamiento en lisosomas que resulta de una deficiente actividad de la \alpha-Gal A, la identificación del defecto enzimático en 1967 (Brady, et al., 1967, N. Eng. J. Med. 276: 1163) condujo a los primeros ensayos terapéuticos in vitro (Dawson et al., 1973, Pediat. Res. 7: 694-690m) e in vivo (Mapes et al., 1970, Science 169:987) de sustitución de \alpha-Gal A, en 1969 y 1970, respectivamente. Estos y posteriores ensayos (Mapes et al., 1970, Science 169: 987; Desnick et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 5326; y Brady, et al., 1973, N. Engl. J. Med. 289:9), demostraron la efectividad bioquímica de la sustitución directa del enzima para esta enfermedad. Se administraron inyecciones repetidas de \alpha-Gal A de plasma y bazo purificadas (100.000 U/inyección) a hemicigotos afectados durante un periodo de cuatro meses (Desnick et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 5326). Los resultados de estos estudios demostraron que (a) el aclaramiento en plasma de la forma de bazo era 7 veces más rápida que la de la forma de plasma (10 min vs 70 min); (b) en comparación con la forma de bazo de la enzima, la forma de plasma llevaba a cabo una reducción del substrato en plasma 25 veces más grande durante un periodo de tiempo más largo (48 horas vs 1 hora); (c) no había evidencia de una respuesta inmunológica a seis dosis de cualquiera de las formas, administradas intravenosamente durante una periodo de cuatro meses, a dos hemicigotos afectados; y (d) se obtuvo una evidencia sugestiva que indicaba que el substrato almacenado en tejido se movilizaba hacia el interior de la circulación después de la reducción de la forma de plasma, pero no de la forma de bazo de la enzima. Por lo tanto, la enzima administrada no solo reducía el substrato de la circulación (un sitio principal de acumulación), sino que también posiblemente movilizaba el substrato previamente almacenado, desde otros depósitos hacia el interior de la circulación, para un posterior aclaramiento. Estos estudios indicaban el potencial para eliminar, o reducir de forma significativa, el almacenamiento glicolipídico patológico mediante una sustitución repetida de enzima.
Sin embargo, no se ha demostrado la efectividad bioquímica y clínica de la sustitución enzimática en la enfermedad de Fabry, debido a la falta de suficiente enzima humana para dosis adecuadas y una evaluación a largo plazo.
2.2. La enzima \alpha-Gal A
La enzima \alpha-Gal A humana tiene un peso molecular de aproximadamente 101.000 Da. En electroforesis en gel-SDS migra como una única banda de aproximadamente 49.000 Da, indicando que la enzima es un homodímero (Bishop & Desnick, 1981, J. Biol. Chem. 256: 1307). La enzima \alpha-Gal A se sintetiza como un precursor de 50.500 Da que contiene oligosacáridos fosforilados sensibles a endoglicosidasa H. Este precursor se procesa en una forma madura de aproximadamente 46.000 Da, a los 3-7 días después de su síntesis. Los intermediarios de este procesado no han sido definidos (Lemansky, et al., 1987, J. Biol. Chem. 262: 2062). Como con muchas enzimas lisosomales, la \alpha-Gal A fija el objetivo hacia los lisosomas vía el receptor de manosa-6-fosfato. Esto se pone de manifiesto por la elevada tasa de secreción de esta enzima en células de mucolipidosis II y en fibroblastos tratados con NH_{4}Cl.
Se ha visto que la enzima contiene 5-15% de hidratos de carbono unidos a Asn (Ledonne, et al., 1983, Arch. Biochem. Biophys. 224: 186). Se vio que la forma de tejido de esta enzima tenía \sim 52% de un tipo de elevado contenido en manosa y 48% de oligosacáridos de tipo complejo. El tipo elevado en manosa eluía a la vez, en cromatografía en Bio-gel, con Man_{8-9}GlcNAc, mientras que los oligosacáridos tipo complejo eran de dos categorías que contenían 14 y 19-39 unidades de glucosa. Por iso-electroenfoque, se observan muchas formas de esta enzima dependiendo de las fuentes de la enzima purificada (forma de tejido vs plasma). Sin embargo, mediante tratamiento con neuraminidasa, se observa una única banda (pI-5,1) que indica que esta heterogeneidad es debida a los diferentes grados de sialilación (del inglés "sialylation", en relación con el contenido en restos de ácido siálico)(Bishop & Desnick, 1981, J. Biol. Chem. 256: 1307). Los esfuerzos iniciales de expresar el cDNA de longitud total que codifica la \alpha-Gal A implicaron utilizar diversos vectores de expresión procariótica (Hantzopoulos and Calhoun, 1987, Gene 57:159; Ioannou, 1990, PhD. Thesis, City University of New York). Aunque se consiguió la expresión microbiana, como se puso de manifiesto por los ensayos enzimáticos de células de E.coli intactas y el crecimiento en melibiosa como la fuente de carbono, la proteína humana se expresó a niveles bajos y no fue posible purificarla de la bacteria. Estos resultados indican que la enzima recombinante era inestable debido a la falta de una glicosilación normal y/o la presencia de proteasas endógenas citoplásmicas o periplásmicas.
2.3. Enzimas lisosomales: biosíntesis y fijación del objetivo
Las enzimas lisosomales se sintetizan en polisomas unidos a membrana en el retículo endoplásmico rugoso. Cada proteína se sintetiza en forma de un precursor más grande que contiene un péptido señal amino-terminal hidrófobo. Este péptido interacciona con una partícula de reconocimiento de señal, una ribonucloproteína 11S, y por la misma se inicia el transporte vectorial de la proteína naciente a través de la membrana del retículo endoplásmico hacia el interior del lumen (Erickson, et al., 1981, J. Biol. Chem. 256: 11224; Erickson, et al., 1983, Biochem. Biophys. Res. Commun. 115: 275; Rosenfeld, et al., 1982, J. Cell Biol. 93: 135). Las enzimas lisosomales son glicosiladas cotraslacionalmente por la transferencia "en bloc" de un gran oligosacárido preformado, glucosa-3, manosa-9, N-acetilglucosamina-2, a partir de un intermediario unido a lípido en el resto Asn de una secuencia consenso Asn-X-Ser/Thr en el polipéptido naciente (Kornfeld, R. & Kornfeld, S., 1985, Annu. Rev. Biochem. 54:631). En el retículo endoplásmico, el péptido señal se escinde, y el procesado del oligosacárido unido a Asn comienza con la escisión de los tres restos de glucosa y una manosa de la cadena del oligosacárido.
Las proteínas se muevan vía un transporte vesicular al saco de Golgi donde sufren una serie de modificaciones posteriores a la traducción, y son acortadas para una adecuada fijación del objetivo hacia los destinos específicos: lisosomas, secreción, membrana plasmática. Durante el movimiento a través del Golgi, la cadena oligosacarídica en las glicoproteínas de membrana y secretoras es procesada al tipo complejo que contiene ácido siálico. Mientras que algunas de las cadenas oligosacarídicas en las enzimas lisosomales sufre un procesado similar, la mayoría sufren una serie diferente de modificaciones. La modificación más importante es la adquisición de restos fosfomanosílicos, los cuales sirven como componente esencial en el proceso de fijación del objetivo de estas enzimas hacia el lisosoma (Kaplan, et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 2026). Este marcador de reconocimiento es generado por la acción secuencial de dos enzimas del Golgi. Primero, la N-acetilglucosaminil-fosfotransferasa transfiere N-acetilglucosamina-1-fosfato del azúcar nucleotídico uridina difosfato-N-acetilglucosamina a los restos de manosa seleccionados en las enzimas lisosomales, para dar lugar a un intermediario fosfodiester (Reitman & Kornfeld, 1981, J. Biol. Chem. 256: 4275; Waheed, et al., 1982, J. Biol. Chem. 257: 12322). A continuación, la N-acetilglucosamina-1-fosfodiester \alpha-N-acetilglucosa-minidasa separa el resto N-acetilglucosamina para exponer la señal de reconocimiento, manosa-6-fosfato (Varki & Kornfeld, 1981, J. Biol. Chem. 256:9937; Waheed, et al., 1981, J. Biol. Chem. 256:
5717).
Después de la generación de los restos fosfomanosílicos, las enzimas lisosomales se unen a los receptores de manosa-6-fosfato (M-6-P) en el aparato de Golgi. De esta forma las enzimas lisosomales permanecen intracelulares y se segregan de las proteínas las cuales están destinadas para secreción. A continuación el complejo ligando-receptor sale del aparato de Golgi vía una vesícula recubierta y es descargado en una zona de organización prelisosomal donde la disociación del ligando se produce por acidificación del compartimento (Gonzalez-Noriega, et al., 1980, J. Cell. Biol. 85:839). El receptor se recicla de vuelta al aparato de Golgi, mientras que las enzimas lisosomales son empaquetadas en el interior de vesículas para formar lisosomas primarios. Aproximadamente, del 5-20% de las enzimas lisosomales no circulan hacia los lisososmas y presumiblemente son secretadas, por defecto. Una parte de estas enzimas secretadas pueden ser recapturadas por el receptor de M-6-P encontrado en la superficie de las células y ser internalizadas y descargadas en los lisosomas (Willingham, et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:
6967).
Se han identificado dos receptores de manosa-6-fosfato. Se ha purificado una glicoproteína de 215 kDa de una diversidad de tejidos (Sahagian, et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 4289; Steiner & Rome, 1982, Arch. Biochem. Biophys. 214: 681). La unión de este receptor es independiente de catión divalente. También se ha aislado un segundo receptor de M-6-P, el cual difiere del receptor de 215 kD en que tiene un requerimiento para cationes divalentes. Por consiguiente, este receptor se denomina el cation-dependiente (M-6-P^{CD}), mientras que el de 215 kDa se denomina cation-independiente (M-6-P^{Cl}). El receptor M-6-P^{CD} parece ser un oligómero con tres subunidades con un peso molecular de subunidad de 46 kDa.
3. Sumario de la invención
La presente invención implica la producción de grandes cantidades de \alpha-Gal A humana por clonación y expresión de la secuencia codificadora de \alpha-Gal A en sistemas de expresión en células hospedantes eucarióticas. Los sistemas de expresión en células hospedantes de mamífero descritos aquí, proporcionan la adecuada sialilación, junto con la traducción y posterior a la traducción, que se requiere para un adecuado procesado, y el acortamiento del producto de expresión, de forma que se produce una enzima activa. También se describe la expresión de proteínas de fusión con \alpha-galactosidasa A, las cuales son fácilmente purificadas. Estas proteínas de fusión son manipuladas por ingeniería genética de forma que se escinden y recuperan fácilmente.
Utilizando los métodos descritos aquí, la \alpha-Gal A recombinante es secretada por las células hospedantes manipuladas por ingeniería genética, de forma que se recupera del medio de cultivo en un buen rendimiento. La \alpha-Gal A producida de acuerdo con la invención se puede utilizar para una variedad de fines, incluyendo, pero no estando limitados a, el tratamiento de la enfermedad de Fabry, la conversión del tipo sanguíneo B a 0, o en cualquier proceso comercial que implique la hidrólisis de restos \alpha-D- -galactosilo de glicoconjugados.
Además, la invención describe un método por el cual se sobreexpresan y secretan de líneas de células de mamífero recombinantes, proteínas que normalmente fijan su objetivo intracelularmente.
3.1. Definiciones
Según se utiliza aquí, los siguientes términos y abreviaturas tendrán el significado indicado:
\alpha-Galactosidasa A \alpha-Gal A
\alpha-N-Acetilgalactosaminidasa \alpha-GalNAc
pares de bases bp
Ovario de hámster chino CHO
DNA complementario cDNA
cuentas por minuto cpm
ácido desoxiribonucleico DNA
Medio de Eagle modificado de Dulbecco DMEM
suero de ternera fetal FCS
pares de kilobases kb
kilodalton kDa
manosa-6-fosfato M-6-P
metotrexato MTX
4-metilumbeliferil-\alpha-D- -galactósido 4-Mu-\alpha-Gal
4-metil-umberiliferil-\alpha-N-acetil-galactosamina 4-Mu-\alpha-GalNac
microgramos \mug
micrómetro \mum
nanogramos ng
nanometro nm
nucleótido nt
p-nitrofenil-\alpha-N-Acetilgalactosaminida pNp-\alpha-GalNac
electroforesis en gel de poliacrilamida PAGE
reacción en cadena de la polimerasa PCR
ácido ribonucleico RNA
dodecilsulfato sódico SDS
unidades u
4. Descripción de las figuras
Fig. 1A-1C. Secuencia de cDNA de longitud competa de \alpha-Gal humana. Las secuencias de aminoácidos de péptidos N-terminales, por bromuro de cianógeno (CB) y trípticos (T), obtenidas por microsecuenciación peptídica, se indican mediante subrayado. Se muestran las diferencias de la secuencia predicha a partir del cDNA. Se indican los cuatro sitios putativos de N-glicosilación y los señales de terminación 3' se señalan con una línea cortada por encima.
Fig 2A-2B. Aclaramiento en plasma después de la administración intravenosa a ratones de la \alpha-galactosidasa A humana recombinante secretada que contiene restos de \alpha 2,6-ácido siálico (\Delta- -\Delta) y la glicoforma no sialilada en \alpha 2,6 (\bullet- -\bullet) gráfico superior, en comparación con el aclaramiento en plasma de estas glicoformas después del tratamiento con fosfatasa ácida. Cada punto representa la media de los valores de dos inyecciones independientes. Los valores T_{1/2} se estimaron por extrapolación.
Fig. 3. Distribución en tejido de diferentes formas de \alpha-Gal recombinante humana secretada después de la administración intravenosa en ratones. Cada punto representa la media de los valores de dos inyecciones independientes.
5. Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a la producción de \alpha-Gal humana, biológicamente activa, que supone la clonación y expresión de secuencias codificadoras de nucleótidos para la enzima, en sistemas de expresión eucariótica. La producción y expresión con éxito de esta enzima purificada, biológicamente activa, según se describe y ejemplifica aquí, es particularmente significativa por una serie de razones. Por ejemplo, los esfuerzos en el pasado de expresar el cDNA de longitud total que codifica la \alpha-Gal humana utilizando varios vectores de expresión procariótica, dio por resultado la expresión del enzima, como se puso de manifiesto por ensayos enzimáticos de células hospedantes microbianas intactas y el crecimiento sobre melibiosa como la fuente de carbono; sin embargo, la enzima humana se expresaba a niveles bajos y no se podía purificar de las bacterias. Estos resultados indican que la enzima recombinante expresada en sistemas microbianos era inestable debido a la falta de glicosilación normal y/o la presencia de proteasas citoplásmicas o periplásmicas endógenas.
Los esfuerzos para expresar esta enzima en sistema de expresión eucariótica eran igualmente difíciles por diferentes razones. La \alpha-Gal es una enzima lisosomal codificada por un gen "housekeeping". El producto de traducción primaria está altamente modificado y procesado, requiriendo una serie compleja de sucesos que implican una secuencia señal, glicosilación, fosforilación y sialilación, los cuales pueden ser efectuados correctamente solamente por células hospedantes adecuadas. Además, puesto que el producto de expresión está destinado para el lisosoma, el cual permanece intracelular, es bastante sorprendente que los métodos descritos aquí permitan la secreción de una molécula adecuadamente procesada, biológicamente activa.
La \alpha-Gal biológicamente activa, producida de acuerdo con la invención, tiene una variedad de utilizaciones, siendo probablemente la más significativa su utilización en terapia de sustitución de enzima para el trastorno de almacenamiento lisosomal, la enfermedad de Fabry. Por ejemplo, el defecto metabólico en fibroblastos cultivados de la enfermedad de Fabry se puede corregir in vitro por la adición de \alpha-Gal A exógena en el medio de cultivo. Además, ensayos limitados en humanos han mostrado la efectividad bioquímica de la sustitución de enzima para reducir el substrato en circulación antes de la deposición vascular. Sin embargo, antes de la presente invención no se podían producir grandes cantidades de \alpha-Gal A humana purificada, biológicamente activa, para su utilización en terapias de sustitución. La \alpha-Gal A producida de acuerdo con la invención también tiene una serie de usos industriales, p.e. en cualquier proceso que implique la hidrólisis de \alpha-D- -galactosil glicoconjugados, la conversión de grupo sanguíneo B a grupo 0, etc., según se describe aquí.
La invención se divide en las siguientes secciones únicamente para la finalidad de descripción: (a) la secuencia codificadora para \alpha-Gal A; (b) construcción de un vector de expresión el cual dirigirá la expresión de la secuencia codificadora del enzima; (c) transfección de células hospedantes adecuadas, las cuales pueden replicar, traducir y procesar adecuadamente los transcriptos primarios con el fin de expresar un producto génico biológicamente activo; y (d) identificación y/o purificación de la enzima producida de esa manera. Una vez que se identifica un transformante que expresa elevados niveles de enzima biológicamente activa, la práctica de la invención implica la ampliación y utilización de ese clon en la producción y purificación de \alpha-Gal A biológicamente activa.
La invención se demuestra aquí por medio de ejemplos en los cuales se clonaron cDNA de \alpha-Gal A y se expresaron en un sistema de expresión de mamífero. También se describen las modificaciones a las secuencias codificadoras de cDNA las cuales mejoran el rendimiento y simplifican la purificación sin restar valor a la actividad biológica. Además, se describen modificaciones para las células hospedantes que permiten la expresión de glicoformas sialiladas y asialiladas de la enzima, ambas las cuales se pueden purificar fácilmente.
Diversos aspectos de la invención se describen en más detalle en las subsecciones más adelante y en los ejemplos que siguen.
5.1. La secuencia codificadora de \alpha-Gal A
La secuencia codificadora de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida para la \alpha-Gal A se muestra en la Fig. 1A-1C. Esta secuencia de nucleótidos, o fragmentos o equivalentes funcionales de la misma, se pueden utilizar para generar moléculas de DNA recombinante que dirigen la expresión del producto enzimático, o péptidos funcionalmente activos o equivalentes funcionales de los mismos, en células hospedantes adecuadas.
Debido a la degeneración de la secuencia codificadora de nucleótidos, en la práctica de la invención se pueden utilizar otras secuencias de DNA que codifican sustancialmente las mismas secuencias de aminoácidos que las mostradas en la Fig. 1A-1C, para la clonación y la expresión de \alpha-Gal A. Dichas alteraciones incluyen deleciones, adiciones o sustituciones de diferentes restos de nucleótidos que dan por resultado una secuencia que codifica el mismo producto génico, o uno funcionalmente equivalente. El producto génico puede contener deleciones, adiciones o sustituciones de restos de aminoácidos dentro de la secuencia, lo cual da por resultado un cambio silencioso de forma que se produce un producto bioactivo. Dichas sustituciones de aminoácidos se pueden realizar basándose en la semejanza en la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad, la naturaleza anfipática de los restos implicados y/o basándose en datos cristalográficos. Por ejemplo, aminoácidos cargados negativamente incluyen el ácido aspártico y el ácido glutámico; aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina; aminoácidos con grupos polares en cabeza, sin carga, con valores de hidrofilicidad similares, incluyen los siguientes: leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina, tirosina.
Las secuencias codificadoras para la \alpha-Gal A se pueden obtener de forma adecuada a partir de microorganismos o líneas celulares manipuladas por ingeniería genética que contienen las secuencias codificadoras del enzima, tales como las realizaciones depositadas descritas aquí. Por otra parte, las secuencias genómicas o las secuencias codificadoras de cDNA para estas enzimas se pueden obtener a partir de genotecas genómicas humanas o de cDNA. Las genotecas bien sea genómicas, o de cDNA, se pueden preparar a partir de fragmentos de DNA generados de fuentes de células humanas. Los fragmentos que codifican la \alpha-Gal A se pueden identificar rastreando dichas genotecas con una sonda nucleotídica que es sustancialmente complementaria a cualquier parte de la secuencia que se muestra en la Fig. 1A-1C. De hecho, las secuencias generadas por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se pueden ligar para formar la secuencia de longitud total. Aunque se pueden utilizar las partes de las secuencias codificadoras, pueden ser preferibles para la expresión los clones de longitud completa, es decir, los que contienen la región codificadora completa. Por otra parte, las secuencias codificadoras que se presentan en la Fig. 1A-1C, se pueden alterar por la adición de secuencias que se pueden utilizar para incrementar los niveles de expresión y/o facilitar la purificación. Se pueden manipular por ingeniería genética otros substratos de escisión enzimática y proteínas de unión para la producción de \alpha-Gal A, los cuales se pueden purificar fácilmente y liberar en su forma biológicamente activa.
Se pueden utilizar métodos bien conocidos para los expertos en la técnica para el aislamiento de DNA, generación de los fragmentos de restricción adecuados, construcción de clones y genotecas, y rastreo de recombinantes. Para una revisión de dichas técnicas, véase, por ejemplo, Sambrook, et al., 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2^{nd} Ed. Cold Spring Harbor Press, N.Y. Capítulos 1-18.
En una realización alternativa de la invención, se podría sintetizar la secuencia codificadora de la Fig. 1A-1C, en su totalidad o en parte, utilizando métodos químicos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Caruthers, et al., 1980, Nuc. Res. Sym. Ser. 7: 215-233; Crea & Horn, 1980, Nuc. Acids Res. 9(10): 2331; Matteucchi & Carruthers, 1980, Tetrahedron Letters 21: 719; and Chow and Kempe, 1981, Nuc. Acids Res. 9(12): 2807-2817.
La \alpha-Gal A humana es una glicoproteína homodimérica. El cDNA de longitud completa de la \alpha-Gal A predice una subunidad madura de 398 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos tiene una homología, en conjunto, de alrededor del 50% con la \alpha-N-acetilgalactosaminidasa (\alpha-Gal B). Búsquedas de homología con bases de datos computerizadas revelaron regiones cortas de homología de \alpha-Gal A con las secuencias de aminoácidos Mel 1 de levaduras y Mel A de E.coli (véase Fig. 1D-1F). Es probable que estas regiones conservadas sean importantes para la conformación, estabilidad, asociación de subunidades y/o catálisis. Así, se prefiere no alterar dichas regiones conservadas. Sin embargo, de-
terminadas modificaciones en la secuencia codificadora pueden ser ventajosas. Por ejemplo, se podrían borrar de forma selectiva las cuatro secuencias consenso de glicosilación ligada a N, alterando de ese modo la glicosilación del
enzima y afectando a la fosforilación, sialilación, sulfatación, etc. Dichas enzimas modificadas pueden tener propiedades de aclaramiento y de fijación de objetivo alteradas, cuando se inyectan en pacientes con enfermedad de Fabry.
Las modificaciones de oligosacáridos pueden ser útiles en la fijación del objetivo de la \alpha-Gal A, para una terapia enzimática efectiva. Algunos ejemplos de dichas modificaciones se describen en más detalle más adelante. Estudios previos demostraron que la glicoforma de plasma de la \alpha-Gal, la cual está más altamente sialilada que la glicoforma de bazo, era más efectiva en la reducción del substrato tóxico acumulado en circulación de pacientes con enfermedad de Fabry (Desnick et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:5326-5330). Los estudios que caracterizaron as glicoformas de plasma y bazo purificadas de la enzima, revelaron diferencias solamente en sus restos de oligosacáridos (Desnick et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 5326-5330). Así, los esfuerzos para fijar el objetivo de la enzima recombinante para un tratamiento efectivo de la enfermedad de Fabry pueden ser potenciados por la modificación de los sitios de N-glicosilación.
También, las regiones codificadoras y no traducidas 5' de la secuencia de nucleótidos se podría alterar para mejorar la eficacia de traducción del mRNA de la \alpha-Gal A. Por ejemplo, la sustitución de una citosina por la guanosina en posición +4 del cDNA de \alpha-Gal A podría mejorar la eficacia de traducción del mRNA de \alpha-Gal A, de 5 a 10 veces (Kozak, 1987, J. Mol. Biol. 196:947-950).
Además, basándose en datos de cristalografía de rayos X, se podrían llevar a cabo alteraciones de secuencia para mejorar la estabilidad proteica, p.e., introduciendo puentes disulfuro en las posiciones adecuadas, y/o eliminando o sustituyendo los aminoácidos que se predice que causan inestabilidad de proteínas. Estos solamente son ejemplos de modificaciones que se pueden introducir por ingeniería genética en la enzima \alpha-Gal A para producir una proteína más activa o estable, más proteína enzimática, o incluso cambiar la especificidad catalítica de la enzima.
5.2. Producción de \alpha-Gal A recombinante
Con el fin de expresar una \alpha-Gal A biológicamente activa, se inserta la secuencia codificadora para la enzima, un equivalente funcional, o una secuencia modificada, según se describe en la Sección 5.1., anterior, en un vector de expresión en mamíferos adecuado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificadora insertada en células hospedantes de mamífero adecuadas, las cuales poseen la maquinaria celular y los elementos para un adecuado procesamiento, es decir, escisión de señal, glicosilación, fosforilación, sialilación, y acortamiento de la proteína. Cuando se administra en humanos, dichos productos de expresión deben mostrar una adecuada fijación del objetivo en tejidos y ninguna reacción inmunológica adversa.
5.2.1. Construcción de vectores de expresión y preparación de transfectantes
Se pueden utilizar métodos que son bien conocidos por los expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contienen la secuencia codificadora de \alpha-Gal A, y señales de control de transcripción/traducción adecuadas. Estos métodos incluyen recombinación in vitro/recombinación genética. Véase, por ejemplo, las técnicas descritas en Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. Capítulo 12.
Se pueden utilizar una diversidad de sistemas de expresión en hospedantes mamíferos para expresar la secuencia codificadora de \alpha-Gal A. Aunque los sistemas procarióticos ofrecen la clara ventaja de facilidad de manipulación y bajo coste de escalado, su mayor inconveniente en la expresión de \alpha-Gal A es su falta de las adecuadas modificaciones posteriores a la traducción de las proteínas de mamífero expresadas. Los sistemas de expresión en mamíferos permiten que se produzca la adecuada modificación. Las células de mamífero, las cuales poseen la maquinaria celular para un adecuado procesado del transcripto primario, glicosilación, fosforilación, y de forma ventajosa, la secreción del producto génico, se deben utilizar como células hospedantes para la expresión de la \alpha-Gal A. Dichas células hospedantes pueden incluir, pero no están limitadas a, CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, -293, WI38, etc. Por otra parte, se pueden modificar las células hospedantes que poseen algo de, pero no toda, la maquinaria celular requerida para el procesado opcional del transcripto primario, y/o el procesado posterior a la traducción y/o secreción del producto génico, para potenciar las capacidades de procesado de las células hospedantes. Por ejemplo, se puede manipular por ingeniería genética en la línea celular hospedante una secuencia de nucleótidos recombinante que codifica un producto peptídico que lleva a cabo una función de procesado que la célula hospedante no había sido capaz de realizar previamente. Una secuencia de ese tipo puede ser, bien sea co-transfectada en la célula hospedante junto con el gen de interés, o incluida en la biomolécula artificial recombinante que codifica el gen de interés. Por otra parte, se pueden producir líneas celulares que contienen esta secuencia, las cuales a continuación son transfectadas con el gen de interés.
Se deben utilizar vectores de expresión en mamíferos adecuados para dirigir la expresión de \alpha-Gal A en la célula hospedante elegida. Por ejemplo, se pueden seguir al menos dos métodos básicos para el diseño de vectores en SV40. El primero es sustituir la región temprana de SV40 con el gen de interés, mientras que el segundo es sustituir la región tardía (Hammarskjold, et al., 1986, Gene 43:41). Los vectores con sustitución de las regiones temprana y tardía también se pueden complementar in vitro por el mutante adecuado de SV40 que carece de la región temprana o tardía. Dicha complementación producirá recombinantes los cuales están metidos en cápsidas infecciosas y los cuales contienen el gen \alpha-Gal A. A continuación una línea celular permisiva puede ser infectada para producir la proteína recombinante. Los vectores que se basan en SV40 también se pueden utilizar en estudios de expresión transitoria, donde los mejores resultados se obtienen cuando se introducen en células COS (CV-1, origen de SV40), un derivado de CV-1 (células de riñón de mono verde), las cuales contienen una única copia de un genoma de SV40 defectuoso en origen, integrado en el cromosoma. Estas células sintetizan activamente el antígeno T grande (SV40), iniciando así la replicación desde cualquier plásmido que contenga un origen de replicación de SV40.
Además del SV40, se pueden utilizar casi todos los virus o retrovirus clonados molecularmente como vehículo de clonación o expresión. Para la expresión se pueden utilizar vectores virales en base a una serie de retrovirus (aviar y múrido), adenovirus, virus vacunal (Cochran, et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:19) y poliomavirus. Otros virus clonados, tales como JC (Howley, et al., J.Virol. 36:878), BK y los virus de papiloma humano (Heilman, et al., 1980, J. Virol. 36:395), ofrecen el potencial de ser utilizados como vectores de expresión eucariótica. Por ejemplo, cuando se utilizan vectores de expresión en adenovirus, la secuencia codificadora de \alpha-Gal A se puede ligar a un complejo de control de transcripción/traducción de adenovirus, p.e. la secuencia líder tripartita y promotora tardía. A continuación se puede insertar este gen quimérico en el genoma del adenovirus, por recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma viral (p.e. región E1 o E3), dará por resultado un virus recombinante que es viable y que puede expresar la enzima humana en hospedantes infectados [p.e., véase Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81:3655-3659]. Alternativamente, se puede utilizar el promotor 7.5K del virus vacunal. (p.e., véase, Mackett et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79: 7415-7419; Macket et al., 1984, J. Virol. 49:857-864; Panicali et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. 79:4927-4931). Los vectores en base a virus de papiloma bovino (Sarver, et al., 1981, Mol. Cell. Biol. 1: 486) son de particular interés. Estos vectores tienen la capacidad de replicarse como elementos extracromosomales. Poco después de la entrada de este DNA a las células de ratón, el plásmido se replica a alrededor de 100 a 200 copias por célula. La transcripción del DNA insertado no requiere la integración del plásmido en el cromosoma del hospedante, produciendo de ese modo un elevado nivel de expresión. Estos vectores se pueden utilizar para una expresión estable incluyendo un marcador seleccionable en el plásmido, tal como el gen neo. También se puede conseguir un elevado nivel de expresión utilizando promotores inducibles tales como el promotor IIA de metalotionina, promotores de choque térmico, etc.
Se prefiere una expresión estable para una producción a elevado nivel de proteínas recombinantes, a largo plazo. Por ejemplo, después de la introducción del DNA extraño, se puede dejar que las células manipuladas por ingeniería crezcan durante 1-2 días en medios enriquecidos y a continuación cambiar a un medio selectivo. Más que utilizar vectores de expresión que contengan orígenes de replicación virales, las células hospedantes se pueden transformar con la \alpha-Gal A o DNA controlado por elementos adecuados de control de expresión (p.e., promotor, potenciador, secuencias, finalizadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren establemente el plásmido en sus cromosomas y crezcan para formar focos, que a su vez se pueden clonar y ampliar en líneas celulares. Se pueden utilizar una serie de sistemas de selección, incluyendo, pero no estando limitados a genes de timidina quinasa (Wigler, et al., 1977, Cell 11:223), hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026), y adenina fosforibosiltransferasa del virus del herpes simple (Lowy, et al., 1980, Cell 22:817) se pueden emplear en células tk, hgprt o aprt, respectivamente. También se puede utilizar la resistencia a antimetabolitos como la base de la selección para genes dhfr, el cual confiere resistencia al metotrexato (Wigler, et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567; O'hare, et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527), gpt, el cual confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072; neo, el cual confiere resistencia al aminoglicósido G-418 (Colberre-Garapin, et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1), e hygro, el cual confiere resistencia a higromicina (Santerre, et al., 1984, Gene 30:147). Recientemente, se han descrito más genes seleccionables, a saber, trpB, el cual permite utilizar indol en lugar de triptófano; hisD, el cual permite que las células utilicen histinol en lugar de histidina (Hartman & Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047) y ODC (orinitina descarboxilasa), el cual confiere resistencia al inhibidor de ornitina descarboxilasa, 2-(difluorometil)-DL-orinitina, DFMO (McConlogue L., 1987, en: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.).
5.2.2. Identificación de transfectantes o transformantes que expresan el producto \alpha-Gal A
Las células hospedantes que contiene la secuencia codificadora de \alpha-Gal A y que expresan el producto génico biológicamente activo, se pueden identificar mediante al menos cuatro métodos generales: (a) hibridación DNA-DNA o DNA-RNA; (b) la presencia o ausencia de funciones génicas "marcadoras"; (c) evaluando el nivel de transcripción según se mide por la expresión de transcriptos de mRNA de \alpha-Gal A en la célula hospedante; y (d) detección del producto génico según se mide por inmunoensayo o por su actividad biológica.
En el primer método, se puede detectar la presencia de la secuencia codificadora de \alpha-Gal A insertada en el vector de expresión mediante hibridación DNA-DNA o DNA-RNA, utilizando sondas que comprenden secuencias de nucleótidos que son homólogas a la secuencia codificadora de \alpha-Gal A, sustancialmente como se muestra en la Fig. 1A-1C, o partes o derivados de la misma.
En el segundo método, se puede identificar el sistema vector de expresión recombinante/hospedante y seleccionar basándose en la presencia o ausencia de determinadas funciones génicas "marcadoras" (p.e., actividad timidina-quinasa, resistencia a antibióticos, resistencia a metotrexato, fenotipo de transformación, formación de cuerpo de oclusión en baculovirus, etc.). Por ejemplo, si se inserta la secuencia codificadora de \alpha-Gal A dentro de una secuencia génica marcadora del vector, se pueden identificar los recombinantes que contienen la secuencia codificadora de \alpha-Gal A por la ausencia de la función génica marcadora. Por otra parte, se puede colocar un gen marcador en tándem con la secuencia de \alpha-Gal A, bajo el control del mismo, o diferente, promotor utilizado para controlar la expresión de la secuencia codificadora de \alpha-Gal A. La expresión del marcador en respuesta a la inducción o selección indica la expresión de la secuencia codificadora de \alpha-Gal A.
En el tercer método, se puede evaluar la actividad de transcripción para la región codificadora de \alpha-Gal A, mediante ensayos de hibridación. Por ejemplo, se puede aislar RNA y analizar mediante hibridación Northern, utilizando una sonda homóloga a la secuencia codificadora de \alpha-Gal A, o a partes particulares de la misma, sustancialmente como se muestra en la Fig. 1A-1C. Por otra parte, se puede extraer el total de ácidos nucleicos de la célula hospedante y se pueden ensayar para hibridación con dichas sondas.
En el cuarto método, la expresión del producto proteico Gal A se puede evaluar inmunológicamente, por ejemplo, mediante hibridaciones Western, inmunoensayos tales como radioinmunoprecipitación, ensayos de inmunoabsorción con enzimas ligadas y similares. Sin embargo, el ensayo final del éxito del sistema de expresión, implica la detección del producto del gen \alpha-Gal A biológicamente activo. Puesto que la célula hospedante secreta el producto génico, se puede ensayar el medio exento de células, obtenido de la célula hospedante transfectante cultivada, para la actividad \alpha-Gal A. Se pueden utilizar una serie de ensayos para detectar actividad \alpha-Gal A, incluyendo, pero no estando limitados, a: (a) ensayos que utilizan los \alpha-D-galactósidos sintéticos, fluorogénicos o cromogénicos, tales como 4-metilumbeliferil-\alpha-D- -galactopiranósido (Desnick et al., 1973, J. Lab. Clin. Invest. 81:157); (b) ensayos que utilizan los substratos naturales marcados, fluorescentes o marcados radiactivamente, tales como una globotriasolilceramida tritiada o pireno-dodecanoil-esfingosina-trihéxosido (Bishop and Desnick, 1981, J. Biol. Chem. 256:1307); y (c) ensayos que utilizan X-\alpha-Gal.
5.2.3. Purificación del producto del gen \alpha-Gal A
Una vez que se identifica un clon que produce elevados niveles de \alpha-Gal A biológicamente activa, el clon se puede ampliar y utilizar para producir elevadas cantidades de la enzima, la cual se puede purificar utilizando métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo, pero no estando limitados a, purificación de afinidad, métodos cromatográficos que incluyen cromatografía líquida de alta resolución y similares. Puesto que la enzima es secretada por las células cultivadas, la \alpha-Gal A puede ser rápidamente recuperada del medio de cultivo.
Como se demuestra en los ejemplos de realización descritos más adelante, la \alpha-Gal A recombinante se purificó del medio bruto por cromatografía de afinidad en \alpha-GalNH_{2}-C_{12}-Sepharosa, seguido por cromatografía hidrófoba en octil-Sepharosa y filtración en gel en una columna de Superosa 6 de 100 cm. La enzima recombinante fue esencialmente homogénea después de la etapa de filtración en gel y fue >98% pura a juzgar por SDS-PAGE.
La \alpha-Gal A humana recombinante se purificó hasta homogeneidad del medio de la línea de células CHO, DG5.3, la cual se vio que secretaba la mayor parte de la enzima recombinante. El medio de cultivo de este clon estaba altamente enriquecido en \alpha-Gal A cuando se utilizaba medio exento de suero, constituyendo más del 95% de la proteína extracelular total. Así, la purificación hasta la homogeneidad se pudo llevar a cabo en solamente tres etapas cromatográficas. Se produjo más de medio gramo de enzima en tres meses, y de una parte de esta se purificaron 280 mg con un rendimiento del 80% utilizando solamente equipamiento a escala de laboratorio. Especialmente, la enzima recombinante tenia plena actividad enzimática con una actividad específica igual a la de la enzima humana previamente purificada (Bishop, et al., 1978, Biochim. Biophys. Acta. 525:399; Bishop and Desnick, 1981, J. Biol. Chem. 256:1307). La enzima recombinante podía reconocer y escindir de forma efectiva un análogo del substrato natural, la globotriaosilceramida.
Cuando se manipula por ingeniería genética la secuencia codificadora de \alpha-Gal A para que codifique una proteína de fusión que se puede escindir, la purificación de la \alpha-Gal A se puede llevar a cabo fácilmente utilizando técnicas de purificación por afinidad.
En particular, se utilizó el método de extensión del solapamiento (Ho, et al., 1989, Gene 77: 51; Kadowaki, et al., 1989, Gene 76:161), para fusionar el cDNA de \alpha-Gal A de longitud completa al dominio E de la proteína A de Staphylococcus aureus. Después de la transfección por electroporación, se incrementó la actividad de \alpha-Gal A en extractos de células COS-1, de 6 a 7 veces. Además, las células transfectadas secretaron cantidades significativas de la proteína de fusión en el medio de cultivo (400 U/ml). La proteína de fusión secretada se purificó rápidamente mediante una única etapa de purificación por afinidad con IgG. La manipulación por ingeniería genética de una secuencia consenso de reconocimiento de escisión por colagenasa entre estos dos polipéptidos, facilitó la escisión de la proteína de fusión de forma que el polipéptido \alpha-Gal A humano purificado se pudo separar fácilmente del dominio de proteína A mediante una segunda etapa de purificación con IgG. El hecho de la biomolécula artificial de fusión retuviera la actividad de \alpha-Gal resultaba de interés, indicando presumiblemente que el polipéptido enzimático formaba la configuración homodimérica activa, aunque el extremo carboxilo estuviera unido a 56 restos más del dominio de la proteína A. Puesto que las células COS-1 transfectadas con una biomolécula artificial de \alpha-Gal A muestran niveles similares de expresión y distribución entre células y el medio, parece que el dominio de la proteína A no interfiere con, bien sea el plegamiento, o el adecuado procesado de esta enzima lisosomal. Además, la presencia del polipéptido \alpha-Gal A dimerizado no inhibía la unión del dominio de la proteína A a la columna de afinidad con IgG. La inserción de la secuencia de reconocimiento de escisión por colagenasa de cuatro restos entre los polipeptidos \alpha-Gal A y proteína A, permitió la escisión de la proteína de fusión, dejando solamente dos de los restos de colágeno en cada uno de los péptidos.
La facilidad de construcción de cDNA utilizando la reacción en cadena de la polimerasa, transfección y purificación de la proteína expresada, permite el aislamiento de una pequeña, pero suficiente, cantidad de \alpha-Gal A para la caracterización de las propiedades físicas y cinéticas de la enzima. Utilizando la mutagénesis dirigida de sitio, o secuencias mutantes que se producen de forma natural, este sistema proporciona un método razonable para determinar los efectos de la estructura primaria alterada en la función de la proteína. También se pueden manipular por ingeniería genética las biomoléculas artificiales de fusión con el dominio E de proteína A que precede al extremo amino terminal y que sigue al extremo carboxilo terminal, para evaluar cual será la biomolécula artificial que interfiera menos, o nada, con la función biológica de la proteína y la capacidad de unir la IgG.
Utilizando este aspecto de la invención, se puede manipular por ingeniería genética cualquier sitio de escisión o substrato de escisión enzimática, entre la secuencia de \alpha-Gal A y un segundo péptido o proteína que tenga una pareja de unión que se pueda utilizar para purificación, p.e., cualquier antígeno para el que se pueda preparar una columna de inmunoafinidad.
5.2.4. Caracterización de la enzima recombinante
La enzima recombinante purificada producida en los sistemas de expresión en mamíferos descritos aquí (p.e., el sistema de expresión CHO), tenía valores de peso molecular, pH óptimo, km y punto isoeléctrico que eran esencialmente idénticos a los de la enzima purificada de plasma humano (Bishop, et al., 1978, Biochim. Biophys. Acta 525:39; Bishop and Desnick, 1981, J. Biol. Chem. 256:1307). El análisis de los restos de hidratos de carbono en esta enzima reveló la presencia de tres cadenas de oligosacáridos en el polipéptido \alpha-Gal A. Estas cadenas eran una mezcla de tipos complejo, híbrido y de elevado contenido en manosa, según se evidenció por estudios de endoglicosidasa y QAE-Shepadex. Lo más importante, la enzima también era similar a la forma nativa de plasma de \alpha-Gal A, en que tenía restos de ácido siálico terminales (Bishop & Desnick, 1981, J. Biol. Chem. 256:1307). En el ensayo clínico limitado descrito anteriormente, se vio que la forma de plasma de la enzima era más efectiva en degradar GbOse_{3}Cer que la forma de bazo. Por consiguiente, la enzima recombinante, o una enzima recombinante modificada, incluyendo, pero no estando limitada a, modificaciones de sus cadenas de hidratos de carbono o secuencia de aminoácidos, puede ser la forma más adecuada para la terapia de sustitución de enzima de la enfermedad de Fabry. De hecho, la incorporación saturable de \alpha-Gal A recombinante por fibroblastos normales y de Fabry se demuestra en los ejemplos aquí, y se muestra que se inhibe específicamente por manosa-6-fosfato 2 mM.
Además, el sistema de expresión descrito aquí es muy prometedor para estudios de la biología celular de la biogénesis lisosomal y procesado de glicohidrolasas. La microscopía óptica reveló un citoplasma altamente vacuolado en las células CHO DG5.3, sugiriendo una proliferación de membranas lisosomales y ofreciendo el potencial para análisis de biogénesis lisosomal. Los estudios preliminares han indicado que la enzima recombinante se sintetiza muy rápidamente, abandona el retículo endoplásmico en los 5-10 min posteriores a su síntesis y se secreta 45-60 min después. Estas rápidas cinéticas de la biosíntesis de la \alpha-Gal A recombinante permiten interesantes estudios que implican la biosíntesis de la enzima lisosomal y ofrecen una metodología que, hasta la fecha, solamente encuentra rival en los sistemas virales. De hecho, la \alpha-Gal A recombinante se sintetiza tan rápidamente que un solo pulso radiactivo de 3 min es suficiente para marcar suficiente enzima para estos estudios. La secreción inesperadamente específica de solamente la \alpha-Gal A recombinante sobreproducida y no de otras enzimas lisosomales, parece análoga a la "secreción dependiente de dosis génica", descrita por Rothman, et al. (Stevens et al., 1986, J. Cell Biol. 102:1551; Rothman et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:3248) y plantea interesantes cuestiones que podrían ser evaluadas en este sistema.
5.2.5. Glicoformas modificadas de \alpha-Gal a para terapia enzimática en la enfermedad de Fabry
Experimentos iniciales para evaluar las cinéticas de aclaramiento y distribución en tejidos de la \alpha-Gal A recombinante en ratones revelaron que un 50% fijaba su objetivo en el hígado, distribuyéndose el resto de la enzima a muchos otros tejidos, incluyendo una significativa fijación del objetivo hacia el riñón, corazón y piel. Mientras que esta distribución es similar a la observada previamente para la forma de plasma de la \alpha-Gal A humana en ratones, puede ser adecuado modificar la enzima para una fijación del objetivo en tejidos alterada. Modificaciones de la \alpha-Gal A recombinante para potenciar la fijación del objetivo en tejidos, que incluyen una desglicosilación selectiva de los restos de hidratos de carbono complejos y de alto contenido en manosa, unidos covalentemente a la enzima recombinante. La invención incluye la modificación de células hospedantes que permite la expresión de glicoformas sialiladas de la enzima, las cuales pueden ser fácilmente purificadas (véase Sección 6 más adelante). Por ejemplo, cuando se utilizan células CHO para expresar \alpha-Gal A, las células CHO se cotransfectan con una biomolécula artificial génica de sialil-transferasa que suple la función perdida a la célula CHO, con el fin de expresar la glicoforma sialilada de \alpha-Gal A.
Para el análisis del destino in vivo de las diversas glicoformas, incluyendo las cinéticas de aclaramiento en plasma y los estudios de distribución en tejidos, se puede marcar la \alpha-Gal A antes de la modificación. Por ejemplo, la \alpha-Gal A recombinante se puede marcar radiactivamente mediante crecimiento en la línea de células CHO DG5.3 en presencia de 50 \muCi/ml de [^{35}S]metionina (>1.000 Ci/mmol) durante 24 horas. La enzima marcada radiactivamente secretada se puede purificar del medio recogido por cromatografía de afinidad en \alpha-galactosamina-Sepharosa, como se ha descrito antes. Esencialmente el 100% de la proteína marcada radiactivamente, secretada por estas células, es \alpha-Gal A, la cual a continuación se puede utilizar para la generación secuencial de las glicoformas.
5.3 Usos de la \alpha-Gal A recombinante
Los productos purificados obtenidos de acuerdo con la invención pueden ser utilizados de forma ventajosa para terapia de sustitución de enzima en pacientes con el trastorno de almacenamiento lisosomal, enfermedad de Fabry. Por otra parte, los productos purificados obtenidos de acuerdo con la invención se pueden utilizar in vitro para modificar \alpha-D- -galacto-gliconjugados en una variedad de procesos; p.e., para convertir eritrocitos del grupo sanguíneo B al grupo sanguíneo 0; en procesos comerciales que requieren la conversión de azúcares tales como rafinosa a sacarosa o melibiosa a galactosa y glucosa; etc. Estos se discuten en más detalle en las subsecciones más adelante.
5.3.1. Terapia con la enzima \alpha-Gal A en la enfermedad de Fabry
Entre los errores innatos del metabolismo, los estudios de pacientes con trastornos de almacenamiento lisosomal han proporcionado un entendimiento básico de la biología del aparato lisosomal y sus hidrolasas, su biosíntesis y procesado (Rosenfeld, et al., 1982, J. Cell Biol. 93:135; Lemansky, et al., 1984, J. Biol. Chem. 259:10129), el mecanismo de su transporte a los lisosomas (Neufeld, et al., 1975, Ann. Rev. Biochem. 44:357; Sly et al., 1982, J. Cell Biochem. 18:67; Kornfeld, S., 1986, J. Clin. Invest. 77:1), y sus requerimientos de cofactor (Verheijen, et al., 1985, Eur. J. Biochem. 149:315; d'Azzo, et al., 1982, Eur. J. Bichem. 149:315; Mehl, et al., 1964, Physiol. Chem. 339:260; Conzelman, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3979). De los más de 30 trastornos de almacenamiento lisosomal, la enfermedad de Fabry es un candidato ideal para la aplicación de las técnicas de DNA recombinante descritas aquí para evaluar y utilizar diversos métodos terapéuticos en sistemas modelo, así como para correlacionar los efectos de los cambios específicos de sitio en la estructura y función enzimática. La enfermedad no tiene una implicación del sistema nervioso central; así, la barrera sangre/cerebro no representa un obstáculo a la terapia de sustitución de la enzima. La enzima defectuosa, la \alpha-Gal A, es un homodímero (Bishop & Desnick, 1981, J. Bio. Chem. 256: 1307), en contraste con las enzimas lisosomales que tienen diferentes subunidades tales como la \beta-hexosaminidasa A (Mahuran, et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 1602); por consiguiente, solamente se debe obtener un único producto génico. El defecto metabólico en fibroblastos cultivados de enfermedad de Fabry ha sido corregido in vitro por la adición de enzima exógena en el medio de cultivo (Cline, et al., 1986, DNA 5: 37). También se han identificado variantes atípicas con enfermedad de Fabry, estos varones son clínicamente asintomáticos, con suficiente actividad \alpha-Gal A residual (3 a 10%) para protegerlos de las manifestaciones mórbidas más importantes de la enfermedad (Lemansky, et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:2062; Clarke, et al., 1971, N. Engl. J. Med. 284: 233; Romeo, et al., 1975, Biochem. Genet. 13: 615; Bishop, et al., 1981, Am. J. Hum. Genet. 71: 217A; Bach et al., 1982, Clin. Genet. 21: 59; y Kobayashi, et al., 1985, J. Neurol. Sci. 67: 179). Finalmente, como se apuntó antes, ensayos limitados en humanos han demostrado la eficacia bioquímica de la sustitución de la enzima para reducir el substrato en circulación antes de la deposición vascular, así como la ausencia de complicaciones inmunológicas (Brady, et al., 1973, N. Engl. J. Med. 289: 9; Desnick, et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:5326; Bishop, et al., 1981, Enzyme Therapy XX: en: Lysosomes and Lysosomal Storage Diseases, Callaghan, J.W. and Lowden, J. A., (eds.), Raven Press, New York, pp 381; Desnick, et al., 1980, Enzyme Therapy XVII: en: Enzyme Therapy in Gnenetic Disease: 2, Desnick, R.J. (ed.), Alan, R. Liss, Inc., New York, pp 393).
En estos estudios, se administraron intravenosamente las isoformas tanto de plasma, como de bazo, de la enzima \alpha-Gal A. La semivida en circulación de la isoenzima de bazo fue alrededor de 10 minutos, mientras que para la isoenzima de plasma fue aproximadamente 70 minutos. Después de cada dosis de la isoenzima de bazo, la concentración del substrato en circulación acumulado disminuyó de forma máxima en 15 minutos. En contraste, la inyección de la isoenzima de plasma disminuyó los niveles de substrato en circulación gradualmente durante 36-72 horas. Puesto que la forma secretada de la \alpha-Gal A recombinante parece ser similar a la isoenzima de plasma, la forma secretada de la enzima recombinante podría ser efectiva para la reducción a largo plazo, y el control, de los niveles de substrato en circulación.
La dosis de las isoenzimas de bazo y plasma parcialmente purificadas administradas en los ensayos clínicos anteriores, fue de 2000 U/kg de peso corporal, o una dosis equivalente para dar 1 \mug/kg de enzima pura. Puesto que esta dosis se comprobó que era efectiva al reducir el nivel de substrato en circulación, una dosis similar de la enzima recombinante debería tener un efecto similar. Sin embargo, la enzima recombinante se podría administrar en una dosis que variara de 0,1 \mug/kg a alrededor de 10 mg/kg y, preferiblemente de alrededor de 0,1 mg/kg a alrededor de 2 mg/kg. La capacidad de producir grandes cantidades de la enzima recombinante de acuerdo con esta invención permitirá la evaluación del efecto terapéutico de dosis significativamente superiores.
5.3.2. Usos in vitro de la \alpha-Gal A
La \alpha-Gal A es una galactosil-hidrolasa la cual tiene actividad frente a varios oligosacáridos, glicoproteínas, glicopéptidos y glicolípidos con enlaces \alpha-galactósidicos terminales. Así, la enzima se puede utilizar in vitro para modificar estos \alpha-galacto-glicoconjugados. Por ejemplo, la \alpha-Gal A recombinante de la invención se podría utilizar para una diversidad de modificaciones deseables, incluyendo, pero no estando limitadas, a: (a) la conversión de eritrocitos del grupo sanguíneo B a células que expresan el antígeno del grupo sanguíneo 0 (Harpaz, et al., 1977, Eur. J. Biochem. 77:419-426); y (b) la hidrólisis de estaquiosa a rafinosa, rafinosa al disacárido sacarosa, o la hidrólisis de melibiosa a galactosa y glucosa (Silman, et al., 1980, Biotechnol. Bioeng. 22:533). Dichas hidrolasas tienen aplicación comercial, como es en la degradación de melazas como substrato para a producción de levaduras (Liljestrom-Suominen, et al., 1988, Appl. Environ. Micro. 54:245-249).
6. Ejemplo
Modificación in vivo de la glicosilación de la \alpha-Gal A recombinante por \alpha 2,6-sialiltransferasa
El ejemplo que se presenta aquí describe un método por el que la enzima \alpha-Gal A humana recombinante se produce en una forma que se parece más estrechamente a la glicoforma de plasma nativa de la enzima. Específicamente, la \alpha-Gal A humana se produce en líneas de células CHO que se han manipulado por ingeniería genética para que contengan un gen \alpha 2,6-sialiltransferasa, de forma que la proteína \alpha-Gal A producida en estas líneas celulares está sialilada. Los resultados que se presentan más adelante demuestran que la enzima \alpha-Gal A biológicamente activa producida utilizando dichas líneas celulares, presenta una distribución en tejidos más amplia, lo cual puede potenciar el valor terapéutico de esta \alpha-Gal A.
6.1. Materiales y métodos 6.1.1. Construcción del vector de expresión de \alpha 2,6-sialiltransferasa, pST26
Se subclonó el cDNA de rata de 1,6 kb (ST3) que codifica la secuencia de aminoácidos completa de la \beta-galactósido \alpha 2,6-sialiltransferasa (Gal \alpha 2,6ST; Weinstein et al., 1987, J. Biol. Chem. 262: 17735), en el sitio Bam HI del vector de expresión en mamíferos pRLDN, un regalo de Smith, Kline and French Laboratories, dando por resultado el vector denominado pST26. Esta biomolécula artificial se introdujo por electroporación en la línea de células CHO DG5.3-1000Mx, un sobreexpresor de \alpha-galactosidasa A. Se seleccionaron clones por crecimiento en medio que contenía 500 \mug/ml de G418 para seleccionar para la expresión del gen neo de pST26. Los clones positivos se aislaron individualmente utilizando anillos de clonación y a continuación se analizó cada uno para expresión de la \alpha-galactosidasa A humana recombinante secretada total. Además, se determinó el porcentaje de la \alpha-galactosidasa A recombinante secretada que contenía restos de \alpha2,6-ácido siálico, por cromatografía con aglutinina de Sambucus nigra (SNA) en una columna de SNA-Shepharosa, según describen Lee et al., (1989, J. Biol. Chem. 264:13848-
13855).
6.1.2 Microscopía de fluorescencia con SNA-lecitina
Para la microscopía de fluorescencia, se crecieron clones DG5.3-1000Mx-ST26 positivos en portas de vidrio de 12 mm, y a continuación se tiñeron con SNA marcada con isotiocinato de fluoresceína (FITC), como se ha descrito previamente (Lee et al., 1989, J. Biol. Chem. 264:13848-13855). Brevemente, las células se fijaron con una solución recién preparada de para-formaldehido al 2%, glutaladehido al 0,1% en solución salina tamponada con fosfatos (PBS), pH 7,0, durante 1 hora a 23ºC y posteriormente se bloquearon con NH_{4}Cl 50 mM en PBS durante 30 min a 23ºC. Las células se incubaron con FITC-SNA en una concentración de 25 mg/ml en PBS durante 30 min a 23ºC. Después de lavar en PBS, los portas se montaron en alcoholpolivinílico al 15%, glicerol al 33%, azida sódica al 0,1% en Tris 100 mM, pH 8,5. Las células se visualizaron con un microscopio de fluorescencia Photomat III Zeiss, y se fotografiaron utilizando una película de color Gold Kodak de 25 ASA.
6.1.3. Purificación de \alpha-Gal humana marcada radiactivamente con y sin restos de \alpha2,6-acido sialico
Se crecieron células DG5.3-1000Mx parentales y células DG5.3-ST26.1 modificadas en botellas giratorias de 1 litro (\sim 5 x 10^{8} células) con 125 ml de DMEM, que contenía suero de ternera fetal dializado al 10% (GIBCO, Grand Island, NY) y 500 \muCi de [^{35}S]-metionina. El medio radiactivo se cambió diariamente durante tres días, y se recogió el medio usado de cada línea, se agrupó y se concentró utilizando un concentrador celular agitado (Amicon, Beverly, MA). Aproximadamente 2 mg (4x10^{6} U) de enzima recombinante secretada de las líneas celulares DG5.3-1000Mx y DG5.31000Mx-ST26.1, respectivamente, se purificaron individualmente hasta una actividad específica de 100 cpm/U de enzima. Se trataron individualmente las preparaciones de \alpha-galactosidasa A recombinante, secretada, marcada radiactivamente, purificada (0,5 mg cada una), con 5 unidades de fosfatasa ácida (Sigma) y las formas desfosforiladas también se utilizaron para inyecciones intravenosas.
6.1.4. Distribución en tejidos y semivida in vivo de la \alpha-Gal A recombinante
Para las determinaciones de semivida en plasma, se inyectó cada forma de \alpha-Gal A en la vena de la cola de dos ratones hembras CDI. Cada animal se sangró a través del plexo del seno, a intervalos de tiempo durante un periodo de 10-20 minutos. Se centrifugaron muestras de sangre en una centrífuga Microhematocrit IEC y se añadieron 50 \mul de plasma a un líquido de centelleo acuoso (AquaSol, NEN, Boston, MA) para contaje. Para evaluar la distribución en tejido de las diferentes formas enzimáticas, se sacrificaron dos ratones para cada enzima por decapitación 4 horas después de la inyección de enzima, se separaron los tejidos seleccionados, y se determinó la radiactividad en varios tejidos y se expresó por gramo de peso fresco de tejido. Cada valor es la media de dos experimentos independientes.
6.2. Resultados 6.2.1. Introducción de pST26 en celulas CHO DG5.3-1000Mx y demostración de actividad \alpha2,6-sialiltransferasa en clones seleccionados para G418
Después de la electroporación del plásmido pST26 en células CHO DG5.3-1000Mx, las células transformadas se seleccionaron las que eran resistentes al antibiótico G418. Del conjunto de células resistentes, se aislaron 10 clones individuales y se ampliaron para más estudios. Estos clones se denominaron DG5.3-1000Mx-ST26.1 a ST26.10. Como se puso en evidencia por la presencia de actividad \alpha2,6-sialiltransferasa en estas células, cada línea celular se tiñó con FITC-SNA y a continuación se examinó por microscopía de fluorescencia y contraste de fase. Las diez líneas celulares DG5.3-1000Mx-ST26 se tiñeron positivamente por la lecitina fluorescente, indicando que las diversas glicoproteínas de membrana celular servían como aceptores para la \alpha2,6-sialiltransferasa expresada. En contraste, la FITC-lecitina no teñía las células DG5.3-1000Mx parentales.
6.2.2. Caracterización de \alpha-Gal A \alpha2,6-sialilada recombinante humana secretada
Se crecieron cada una de las diez líneas celulares DG5.3-1000Mx-ST26 y las células DG5.3-1000Mx parentales en placas de 100 mm en la misma densidad celular. Se determinó la cantidad de actividad \alpha-Gal A humana secretada por mg de proteína de células cultivadas totales para cada línea celular. Las líneas DG5.3-1000Mx-ST26 secretaban del 28 al 100% de la \alpha-Gal A secretada por la línea celular parental (16.000 U/mg proteína, Tabla XI).
Para determinar el porcentaje de la \alpha-Gal A humana recombinante secretada que contenía restos de \alpha2,6-ácido siálico, la enzima secretada se cromatografió en la columna con SNA inmovilizada, y la enzima unida se eluyó con lactosa 0,4 M. Como se muestra en la Tabla XI, los clones individuales tenían de 55 a 100% de la actividad enzimática aplicada que estaba específicamente unida y se eluía de la columna de lecitina. Especialmente, el clon DG5.3-1000Mx-ST.1 producía la mayor cantidad de \alpha-Gal A recombinante, esencialmente toda la forma enzimática estaba sialilada y se unía a la columna con SNA inmovilizada. En contraste, la \alpha-Gal A recombinante secretada por las células DG5.3-1000Mx tenían poca, si acaso, unión a la lecitina específica de \alpha2,6-ácido siálico (Tabla XI).
50
6.2.3. Semivida en plasma y distribución en tejidos de \alpha-Gal A \alpha2,6-sialilada humana en ratones
Para determinar si el aclaramiento in vivo del la \alpha-Gal A \alpha2,6-sialilada humana recombinante era diferente del de la enzima no sialilada, se inyectó cada forma a ratones y se determinó su semivida en circulación. Como se muestra en la Figura 2A, la presencia de restos de ácido \alpha2,6-siálico incrementaba la semivida de la enzima en circulación de 14 a casi 30 minutos. Además, el tratamiento con fosfatasa ácida de las enzimas recombinantes \alpha2,6-sialiladas y no sialiladas en \alpha2,6, incrementaba la semivida en plasma in vivo de la enzima no sialilada en \alpha2,6 (T_{1/2} de 14 a 24 minutos), mientras que la enzima \alpha2,6-sialilada tratada con fosfatasa permanecía igual en alrededor de 28 minutos. (Fig. 2B).
Como se muestra en la Figura 3, la presencia o ausencia de restos de \alpha2,6-ácido siálico y/o restos de fosfato, en las formas de \alpha-Gal A humana recombinante secretadas, tenía un marcado efecto en sus respectivas distribuciones en tejido después de la administración intravenosa a ratones. Se recuperaba un porcentaje superior del total de \alpha-Gal A \alpha2,6-sialilada inyectada, en pulmones, riñón y corazón, en comparación con la enzima no sialilada en \alpha2,6; en contraste, se recuperaba menos de la enzima \alpha2,6-sialilada en el bazo. De forma interesante, cuando la enzima \alpha2,6-sialilada se trataba con fosfatasa ácida, la enzima modificada se redistribuía en el hígado y bazo, presumiblemente hacia sus células del retículo endotelial (Fig 3). El tratamiento con fosfatasa ácida de la enzima no sialilada en \alpha2,6, resultaba en la recuperación de significativamente más enzima que su forma no tratada con fosfatasa, en los pulmones y corazón, mientras que se recuperaba menos en el riñón (Fig 3).
7. Deposito de microorganismos
Las siguientes cepas de E. coli que llevan los plásmidos de la lista se han depositado en la Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Peoria, IL y se les ha asignado el siguiente número de entrada:
Célula hospedante Cepa Plásmido N^{o} de entrada
E.coli k12 p91.AGA B 18722
E.coli k12 pAGA-PA B 18723
La presente invención no está limitada en su objetivo por los microorganismos depositados ya que las realizaciones depositadas pretenden ilustrar aspectos individuales de la invención, y cualquier microorganismo o biomolécula artificial que sean funcionalmente equivalentes, está dentro del objetivo de esta invención. De hecho, para los expertos en la técnica se pondrán de manifiesto varias modificaciones de la invención, además de las mostradas y descritas aquí, a partir de la memoria descriptiva anterior y los dibujos anexos. Se pretende que dichas modificaciones estén incluidas en el objetivo de las reivindicaciones anexas.
(1) INFORMACION GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: Desnick, Robert J.
\hskip3.9cm
Bishop, David F. 
\hskip3.9cm
Ioannou, Yiannis A. 
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TITULO DE LA INVENCION: Clonación y expresión de alfa-Galactosidasa A biológicamente activa
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 13
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: PENNIE & EDMONDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 1155 Avenue of the Americas
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: New York
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: New York
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: EEUU
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 10036
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA DE LECTURA EN ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC compatible de IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release nº 1.0, Version nº 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: US 07/983.451
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 30-NOV-1992
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DEL AGENTE/ABOGADO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Coruzzi, Laura A.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 07/983.451
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/ETIQUETA: 6923-030
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: 212-790-9090
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: 212-869-8864/9741
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TELEX: 66141 PENNIE
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº ID.: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1393 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(x)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 61..1350
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. Nº ID. 1:
1
3

Claims (9)

1. Un método para producir \alpha-galactosidasa A humana, que comprende:
(a)
cultivar una célula de mamífero transformada, transformada con un gen \beta galactósido \alpha2,6 sialiltransferasa, el cual expresa una \beta galactósido \alpha2,6-sialiltransferasa tal que la célula puede sialilar péptidos, que además contiene una secuencia de nucleótidos heteróloga integrada cromosomalmente que codifica una \alpha-galactosidasa A humana, asociada operativamente con una secuencia de nucleótidos que regula la expresión génica y un marcador seleccionable controlado por la misma, o una secuencia reguladora diferente, de forma que la secuencia de nucleótidos de la \alpha-galactosidasa A se sobreexpresa establemente y la célula de mamífero secreta una glicoforma sialilada enzimáticamente activa de la enzima \alpha-galactosidasa A; y
(b)
aislar la enzima \alpha-galactosidasa A, enzimáticamente activa, del cultivo de células de mamífero.
2. El método conforme a la reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica la \alpha-galactosidasa A comprende la secuencia que se muestra en la SEC. Nº ID. 1, desde los nucleótidos 61 a 1350.
3. El método conforme a la reivindicación 1, en el cual la secuencia de nucleótidos que codifica la \alpha-galactosidasa A comprende la secuencia que se muestra en la SEC. Nº ID. 1, desde los nucleótidos nº 151 a 1350.
4. El método conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la secuencia de nucleótidos que regula la expresión génica comprende un promotor viral.
5. El método conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el cual la secuencia de nucleótidos que regula la expresión génica comprende un promotor inducible.
6. El método conforme a la reivindicación 1, en el que, en presencia de selección, se amplifican las secuencias de nucleótidos integradas cromosomalmente.
7. El método conforme a la reivindicación 1, en el cual el marcador seleccionable es dihidrofolato reductasa.
8. El método conforme a la reivindicación 6, en el cual el marcador seleccionable es dihidrofolato reductasa y la selección es metotrexato.
9. El método conforme a la reivindicación 1, en el cual la célula de mamífero es una línea celular de ovario de hámster chino.
ES94902448T 1992-11-30 1993-11-30 Clonacion y expresion de alfa-galactosidasa a biologicamente activa. Expired - Lifetime ES2168101T5 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/983,451 US5401650A (en) 1990-10-24 1992-11-30 Cloning and expression of biologically active α-galactosidase A
US983451 1992-11-30

Publications (2)

Publication Number Publication Date
ES2168101T3 ES2168101T3 (es) 2002-06-01
ES2168101T5 true ES2168101T5 (es) 2005-10-16

Family

ID=25529958

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES07022356T Expired - Lifetime ES2344431T3 (es) 1992-11-30 1993-11-30 Metodo para producir proteinas secretadas.
ES94902448T Expired - Lifetime ES2168101T5 (es) 1992-11-30 1993-11-30 Clonacion y expresion de alfa-galactosidasa a biologicamente activa.
ES10157183T Expired - Lifetime ES2431293T3 (es) 1992-11-30 1993-11-30 Método para producir proteínas secretadas

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES07022356T Expired - Lifetime ES2344431T3 (es) 1992-11-30 1993-11-30 Metodo para producir proteinas secretadas.

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10157183T Expired - Lifetime ES2431293T3 (es) 1992-11-30 1993-11-30 Método para producir proteínas secretadas

Country Status (14)

Country Link
US (2) US5401650A (es)
EP (4) EP0670896B2 (es)
JP (2) JP4005629B2 (es)
AT (2) ATE464386T1 (es)
AU (1) AU691795B2 (es)
CA (1) CA2150555C (es)
DE (3) DE122010000028I1 (es)
DK (3) DK0670896T3 (es)
ES (3) ES2344431T3 (es)
IL (4) IL107814A (es)
LU (2) LU91703I2 (es)
PT (3) PT2210947E (es)
SE (1) SE2210947T5 (es)
WO (1) WO1994012628A1 (es)

Families Citing this family (97)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6846968B1 (en) 1988-02-26 2005-01-25 Large Scale Biology Corporation Production of lysosomal enzymes in plants by transient expression
US20040064855A1 (en) * 1988-02-26 2004-04-01 Large Scale Biology Corporation Production of lysosomal enzymes in plants by transient expression
US5179023A (en) * 1989-03-24 1993-01-12 Research Corporation Technologies, Inc. Recombinant α-galactosidase a therapy for Fabry disease
EP0694081A4 (en) * 1993-03-26 1998-07-15 New York Blood Center Inc RECOMBINANT -g (a) -N-ACETYLGALACTOSAMINIDASE AND c DNA ENCODING THIS ENZYME
US6458574B1 (en) * 1996-09-12 2002-10-01 Transkaryotic Therapies, Inc. Treatment of a α-galactosidase a deficiency
AU2012227349B2 (en) * 1996-09-13 2015-12-24 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Therapy for alpha-galactosidase A deficiency
US6083725A (en) 1996-09-13 2000-07-04 Transkaryotic Therapies, Inc. Tranfected human cells expressing human α-galactosidase A protein
ES2458292T3 (es) * 1996-09-13 2014-04-30 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Producción de alfa-galactosidasa A humana
IL155588A0 (en) * 2003-04-27 2003-11-23 Metabogal Ltd Methods for expression of enzymatically active recombinant lysosomal enzymes in transgenic plant root cells and vectors used thereby
US6455037B1 (en) * 1996-11-01 2002-09-24 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Cells expressing an αgala nucleic acid and methods of xenotransplantation
US6210666B1 (en) 1997-10-21 2001-04-03 Orphan Medical, Inc. Truncated α-galactosidase A to treat fabry disease
EP1027069B1 (en) * 1997-10-29 2006-07-26 Genzyme Corporation Gene therapy for gaucher disease
EP1658857A1 (en) * 1997-10-29 2006-05-24 Genzyme Corporation Compositions and methods for treating lysosomal storage disease
ATE290089T1 (de) * 1998-12-23 2005-03-15 Regeneron Pharma Methode zur verstärkung der biologischen aktivität von liganden
AU2012241170B2 (en) * 1999-03-11 2016-07-28 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Treatment of alpha-Galactosidase A deficiency
AU2016250357B2 (en) * 1999-03-11 2018-11-01 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Treatment of alpha-Galactosidase A deficiency
US6770468B1 (en) 1999-09-14 2004-08-03 Genzyme Glycobiology Research Institute, Inc. Phosphodiester-α-GlcNAcase of the lysosomal targeting pathway
US6642038B1 (en) * 1999-09-14 2003-11-04 Genzyme Glycobiology Research Institute, Inc. GlcNAc phosphotransferase of the lysosomal targeting pathway
CN1312383A (zh) * 2000-03-07 2001-09-12 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——人alpha－半乳糖苷酶A－11和编码这种多肽的多核苷酸
US7138262B1 (en) 2000-08-18 2006-11-21 Shire Human Genetic Therapies, Inc. High mannose proteins and methods of making high mannose proteins
US7629309B2 (en) * 2002-05-29 2009-12-08 Zystor Therapeutics, Inc. Targeted therapeutic proteins
ATE384736T1 (de) * 2001-04-30 2008-02-15 Zystor Therapeutics Inc Subzelluläres targeting von therapeutischen proteinen
US7560424B2 (en) * 2001-04-30 2009-07-14 Zystor Therapeutics, Inc. Targeted therapeutic proteins
US20040005309A1 (en) * 2002-05-29 2004-01-08 Symbiontics, Inc. Targeted therapeutic proteins
JP4742191B2 (ja) * 2001-06-14 2011-08-10 独立行政法人産業技術総合研究所 糖蛋白質およびその製造方法
US7767415B2 (en) 2001-09-25 2010-08-03 Velico Medical, Inc. Compositions and methods for modifying blood cell carbohydrates
NZ532027A (en) 2001-10-10 2008-09-26 Neose Technologies Inc Remodeling and glycoconjugation of peptides
US20030072761A1 (en) * 2001-10-16 2003-04-17 Lebowitz Jonathan Methods and compositions for targeting proteins across the blood brain barrier
US20030124652A1 (en) * 2001-12-21 2003-07-03 Novazyme Pharmaceuticals, Inc. Methods of producing high mannose glycoproteins in complex carbohydrate deficient cells
US6905856B2 (en) * 2001-12-21 2005-06-14 Genzyme Glycobiology Research Institute, Inc. Soluble GlcNAc phosphotransferase
US6800472B2 (en) * 2001-12-21 2004-10-05 Genzyme Glycobiology Research Institute, Inc. Expression of lysosomal hydrolase in cells expressing pro-N-acetylglucosamine-1-phosphodiester α-N-acetyl glucosimanidase
WO2003086452A2 (en) * 2002-04-05 2003-10-23 Genzyme Corporation Methods of enhancing lysosomal storage disease therapy
EP1503788B1 (en) 2002-04-25 2011-06-29 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Treatment of alpha-galactosidase a deficiency
DK2444102T3 (en) 2003-01-31 2015-07-13 Sinai School Medicine Combination therapy for the treatment of protein deficiency disorders
JP4674702B2 (ja) 2003-04-09 2011-04-20 バイオジェネリクス エージー グリコペギレ−ション法およびその方法により生成されたタンパク質／ペプチド
US7951557B2 (en) 2003-04-27 2011-05-31 Protalix Ltd. Human lysosomal proteins from plant cell culture
WO2005046612A2 (en) * 2003-11-12 2005-05-26 Amicus Therapeutics Inc. Hydroxy piperidine derivatives to treat gaucher disease
JP4914224B2 (ja) * 2004-02-10 2012-04-11 バイオマリン ファーマシューティカル インコーポレイテッド 酸性αグルコシダーゼおよびそのフラグメント
US8889127B2 (en) * 2004-07-01 2014-11-18 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Targeted protein replacement for the treatment of lysosomal storage disorders
US20070207194A1 (en) * 2004-08-05 2007-09-06 Baylor Research Institute Gene or drug delivery system
US9181184B2 (en) 2005-05-17 2015-11-10 Amicus Therapeutics, Inc. Method for the treatment of pompe disease using 1-deoxynojirimycin and derivatives
WO2007117505A2 (en) * 2006-04-05 2007-10-18 The Rockefeller University Polypeptides with enhanced anti-inflammatory and decreased cytotoxic properties and relating methods
US8470318B2 (en) 2005-11-07 2013-06-25 The Rockefeller University Polypeptides with enhanced anti-inflammatory and decreased cytotoxic properties and relating methods
JP4368925B2 (ja) 2005-11-18 2009-11-18 財団法人 東京都医学研究機構 基質特異性を変換した新規高機能酵素
DK1986612T3 (da) 2006-02-07 2012-10-29 Shire Human Genetic Therapies Stabiliserede proteinsammensætninger med en fri thioldel
GB0606190D0 (en) 2006-03-28 2006-05-10 Isis Innovation Construct
EP2099523A2 (en) * 2006-11-13 2009-09-16 ZyStor Therapeutics , Inc. Methods for treating pompe disease
SI2150608T1 (en) 2007-05-07 2018-04-30 Protalix Ltd. An extensive disposable bioreactor
WO2009024977A2 (en) * 2007-08-20 2009-02-26 Protalix Ltd. Saccharide-containing protein conjugates and uses thereof
LT2946785T (lt) * 2008-02-12 2019-02-11 Amicus Therapeutics, Inc. Atsako į ligų gydymą farmakologiniu šaperonu prognozavimo būdas
JP2011517960A (ja) 2008-04-22 2011-06-23 ザ ロックフェラー ユニバーシティー 抗炎症化合物の識別方法
US20110223147A1 (en) 2008-05-07 2011-09-15 Zystor Therapeutics, Inc. Lysosomal targeting peptides and uses thereof
US8592555B2 (en) 2008-08-11 2013-11-26 Emd Millipore Corporation Immunoglobulin-binding proteins with improved specificity
ES2434850T3 (es) * 2008-09-30 2013-12-17 Abbvie Inc. Método mejorado de presentación de ARN
SG162687A1 (en) * 2008-12-24 2010-07-29 Millipore Corp Caustic stable chromatography ligands
US9050276B2 (en) 2009-06-16 2015-06-09 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Autism-associated biomarkers and uses thereof
EP3679942A1 (en) 2009-06-17 2020-07-15 BioMarin Pharmaceutical Inc. Formulations for lysosomal enzymes
CN102686237B (zh) 2009-07-28 2018-10-19 夏尔人类遗传性治疗公司 用于治疗戈谢病的组合物
US9194011B2 (en) 2009-11-17 2015-11-24 Protalix Ltd. Stabilized alpha-galactosidase and uses thereof
WO2011108451A1 (ja) * 2010-03-01 2011-09-09 日本ケミカルリサーチ株式会社 遺伝子ノックアウト細胞を用いた組換え体リソソーム酵素の製造方法
WO2011107991A1 (en) 2010-03-02 2011-09-09 Protalix Ltd. Glucocerebrosidase multimers and uses thereof
SG10201502609QA (en) 2010-03-02 2015-05-28 Protalix Ltd Stabilized alpha-galactosidase and uses thereof
EP2595651B1 (en) 2010-07-19 2017-03-29 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Mannose receptor c type 1 (mrc1) codon optimized cell line and uses thereof
US8679478B2 (en) 2010-10-04 2014-03-25 Duke University Methods of lysosomal storage disease therapy
ES2564358T3 (es) 2010-10-15 2016-03-22 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Genes relacionados con la obesidad y sus proteínas y usos de los mismos
ES2746554T3 (es) 2010-11-02 2020-03-06 Univ Columbia Métodos para tratar los trastornos de pérdida de cabello
KR101883803B1 (ko) 2011-01-20 2018-07-31 프로탈릭스 리미티드 식물 및 식물 세포에서 알파-갈락토시다제의 발현용 핵산 작제물
SG10201604554WA (en) 2011-06-08 2016-07-28 Emd Millipore Corp Chromatography matrices including novel staphylococcus aureus protein a based ligands
EP3741384A1 (en) 2011-09-07 2020-11-25 Mount Sinai School Of Medicine Ceramidase and cell differentiation
JP6230160B2 (ja) 2012-03-02 2017-11-15 シャイア ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド Ｉｉｉ型ゴーシェ病を治療するための組成物および方法
KR20140135222A (ko) 2012-03-07 2014-11-25 아미쿠스 세라퓨틱스, 인코포레이티드 폼페병의 치료를 위한 고농도 알파-글루코시다제 조성물
US10039777B2 (en) 2012-03-20 2018-08-07 Neuro-Lm Sas Methods and pharmaceutical compositions of the treatment of autistic syndrome disorders
ES2694681T3 (es) 2012-03-29 2018-12-26 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Métodos para tratar trastornos de pérdida capilar
LT2854910T (lt) 2012-06-01 2020-05-25 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Ceramido lygiai infekcijos gydymo ir prevencijos metu
WO2014016873A1 (en) * 2012-07-26 2014-01-30 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Method for production of recombinant human alpha-galactosidase a
JP6226435B2 (ja) * 2012-07-26 2017-11-08 Ｊｃｒファーマ株式会社 組換えヒトα−ガラクトシダーゼＡの製造方法
DK2968479T3 (da) 2013-03-14 2019-08-12 Icahn School Med Mount Sinai Terapeutiske sure ceramidasesammensætninger og fremgangsmåder til fremstilling og anvendelse heraf
EP3714893A1 (en) * 2013-03-15 2020-09-30 Amicus Therapeutics, Inc. Chemical crosslinkers
BR122021001466B1 (pt) * 2013-09-16 2021-10-13 Genzyme Corporation Sistema de filtração de circuito aberto
TW202332774A (zh) * 2013-10-23 2023-08-16 美商健臻公司 重組醣蛋白及其用途
US9682123B2 (en) 2013-12-20 2017-06-20 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods of treating metabolic disease
CA2961762C (en) 2014-09-30 2024-03-05 Amicus Therapeutics, Inc. Highly potent acid alpha-glucosidase with enhanced carbohydrates
WO2016116966A1 (en) * 2015-01-22 2016-07-28 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Method for purification of recombinant human alpha-galactosidase a from material containing contaminant host cell proteins
US9981021B1 (en) 2015-04-09 2018-05-29 Kinetiq, Inc. Subcutaneous therapeutic enzyme formulations, uses, and methods for generating thereof
EP3347486A4 (en) 2015-09-09 2019-06-19 The Trustees of Columbia University in the City of New York REDUCTION OF ER-MAM-LOCALIZED APP-C99 AND METHOD FOR THE TREATMENT OF ALZHEIMER DISEASE
US10940125B2 (en) 2015-09-18 2021-03-09 Duke University Methods and compositions for the treatment of steatosis-associated disorders
JP2019501178A (ja) 2015-12-30 2019-01-17 アミカス セラピューティックス インコーポレイテッド ポンペ病の処置のための強化酸性アルファ−グルコシダーゼ
US10227577B2 (en) 2016-03-30 2019-03-12 Amicus Therapeutics, Inc. Method for selection of high M6P recombinant proteins
KR102444612B1 (ko) 2016-03-30 2022-09-21 아미쿠스 세라퓨틱스, 인코포레이티드 재조합 산 알파-글루코시다제를 포함하는 제형
NL2017294B1 (en) 2016-08-05 2018-02-14 Univ Erasmus Med Ct Rotterdam Natural cryptic exon removal by pairs of antisense oligonucleotides.
WO2018071814A1 (en) 2016-10-14 2018-04-19 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods of treating alcohol abuse disorder
IL270530B2 (en) 2017-05-15 2024-07-01 Amicus Therapeutics Inc Recombinant human acid alpha-glucosidase
RU2698460C1 (ru) * 2019-03-28 2019-08-27 Общество с ограниченной ответственностью "Международный Биотехнологический Центр "Генериум" Способ получения рекомбинантной в-1,4-галактозидазы bgaa из streptococcus pneumoniae
US20220331408A1 (en) 2019-07-09 2022-10-20 Genethon Treatment of glycogen storage disease (gsd)
JP7610708B2 (ja) * 2020-11-16 2025-01-08 ベイジン・ソロバイオ・ジーンテクノロジー・カンパニー・リミテッド 肝向性が増強された組換えアデノ随伴ウイルス及びその使用
CN112795583A (zh) * 2020-11-16 2021-05-14 上海大学 重组唾液酸外切酶的制备方法、表达基因、重组表达载体及构建方法
IL307770A (en) * 2021-04-20 2023-12-01 Walking Fish Therapeutics Inc Engineering B-cells based on protein production for the treatment of serious diseases

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH585793A5 (es) * 1974-02-01 1977-03-15 Nestle Sa
JPS5322158B2 (es) * 1974-05-02 1978-07-06
IT1130242B (it) * 1980-02-01 1986-06-11 Anic Spa Procedimento per la produzione dell'enzima alfa-galattosidasi e per l'idrolisi del raffinosio mediante l'impiego dell'enzima stesso
US4925796A (en) * 1986-03-07 1990-05-15 Massachusetts Institute Of Technology Method for enhancing glycoprotein stability
US5047335A (en) * 1988-12-21 1991-09-10 The Regents Of The University Of Calif. Process for controlling intracellular glycosylation of proteins
WO1990011353A1 (en) * 1989-03-24 1990-10-04 Research Corporation Technologies, Inc. Recombinant alpha-galactosidase, a therapy for fabry disease
US5032519A (en) * 1989-10-24 1991-07-16 The Regents Of The Univ. Of California Method for producing secretable glycosyltransferases and other Golgi processing enzymes
DE4028800A1 (de) * 1990-09-11 1992-03-12 Behringwerke Ag Gentechnische sialylierung von glykoproteinen
US5382524A (en) * 1990-10-24 1995-01-17 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Cloning and expression of biologically active α-n-acetylgalactosaminidase

Also Published As

Publication number Publication date
DK0670896T3 (da) 2002-05-27
ES2344431T3 (es) 2010-08-26
EP0670896A4 (en) 1997-08-20
IL220131A0 (en) 2012-07-31
LU91703I2 (fr) 2010-08-24
SE2210947T5 (es) 2015-02-03
LU91704I2 (fr) 2010-08-24
PT1942189E (pt) 2010-05-28
CA2150555A1 (en) 1994-06-09
IL200005A (en) 2013-09-30
US5401650A (en) 1995-03-28
DK1942189T3 (da) 2010-06-07
ES2431293T3 (es) 2013-11-25
DE69331550T3 (de) 2006-06-29
EP2210947A2 (en) 2010-07-28
AU5681794A (en) 1994-06-22
EP1942189B1 (en) 2010-04-14
JP3598302B2 (ja) 2004-12-08
DE69334327D1 (de) 2010-05-27
EP1020528A2 (en) 2000-07-19
EP2210947A3 (en) 2010-10-06
JP2004121260A (ja) 2004-04-22
AU691795B2 (en) 1998-05-28
JPH08503615A (ja) 1996-04-23
ATE213020T1 (de) 2002-02-15
US5580757A (en) 1996-12-03
ATE464386T1 (de) 2010-04-15
EP0670896A1 (en) 1995-09-13
ES2168101T3 (es) 2002-06-01
EP0670896B2 (en) 2005-04-27
CA2150555C (en) 2010-11-02
IL220132A0 (en) 2012-07-31
IL107814A (en) 2012-12-31
DE122010000028I1 (de) 2010-08-12
DK2210947T3 (da) 2013-10-07
DE69331550T2 (de) 2002-09-26
EP1942189A3 (en) 2008-09-10
PT2210947E (pt) 2013-10-23
EP0670896B1 (en) 2002-02-06
DE69331550D1 (de) 2002-03-21
PT670896E (pt) 2002-07-31
EP1020528A3 (en) 2000-10-04
EP2210947B1 (en) 2013-07-17
EP1942189A2 (en) 2008-07-09
WO1994012628A1 (en) 1994-06-09
IL107814A0 (en) 1994-02-27
JP4005629B2 (ja) 2007-11-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2168101T5 (es) Clonacion y expresion de alfa-galactosidasa a biologicamente activa.
US5356804A (en) Cloning and expression of biologically active human α-galactosidase A
EP0554385B1 (en) Cloning and expression of biologically active alpha-n-acetylgalactosaminidase
US7122354B2 (en) Nucleic acid encoding a chimeric polypeptide
EP2374876A2 (en) Therapy for alpha-galactosidase a deficiency
NO329689B1 (no) Medisinske preparater til behandling av <alfa>-galaktosidase-A-defisiens
HK1146734A (en) Method for producing secreted proteins
AU2003220717B2 (en) Therapy for alpha-galactosidase a deficiency
AU2008200265B2 (en) Therapy for alpha-galactosidase A deficiency
HK1157398A (en) Therapy for alpha-galactosidase a deficiency
AU2012227349A1 (en) Therapy for alpha-galactosidase A deficiency

Legal Events

Date Code Title Description
FG2A Definitive protection

Ref document number: 670896

Country of ref document: ES