NO329689B1

NO329689B1 - Medisinske preparater til behandling av <alfa>-galaktosidase-A-defisiens

Info

Publication number: NO329689B1
Application number: NO20014415A
Authority: NO
Inventors: Douglas A Treco; Richard F Selden; Carol M Kinoshita; Melanie D Williams; Thomas J Schuetz; Peter Francis Daniel; Marianne Borowski
Original assignee: Shire Human Genetic Therapies
Priority date: 1999-03-11
Filing date: 2001-09-11
Publication date: 2010-11-29
Also published as: EP2186902B1; EP3231871A1; DE60038104D1; EP2314699B1; CN106110309A; MXPA01009222A; JP5615648B2; WO2000053730A3; JP6626071B2; KR20070090277A; CA2833396A1; DE60038104T2; JP6081980B2; IL145381A; US20110280856A1; JP2002538183A; ES2391221T3; WO2000053730A9; PL350658A1; CN1354796A

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av et medikament for behandling av ot-galaktosidase A-mangel, hvor nevnte medikament er for administrasjon av en dose på mellom 0,1 til 0,3 mg av nevnte ot-Gal A-preparat per kg kroppsvekt av et individ.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Fabrys sykdom er en X-bundet arvelig lysosomlagringssykdom som kjenetegnes av alvorlig nyresvikt, angiokeratomaer og kardiovaskulære abnormaliteter omfattende en ventri ku lær forstørrelse og mitralklaffinsuffisiens. Fabrys sykdom rammer også

det perifere nervesystem og forårsaker episoder med kvalfulle, brennende smerter i ekstremitetene. Fabrys sykdom forårsakes av en mangel i enzymet a-galaktosidase (ot-Gal A). ot-Gal A er det lysosomale glykohydrolase som spalter de terminale ot-galaktosylenheter av forskjellige glykokonjugater. Fabrys sykdom fører til en blok-kering av katabolismen av det neutrale glykosfingolipid, ceramid triheksosid (CTH), og en oppsamling av dette enzymsubstrat i celler og i blodstrømmen.

Grunnet det X-bundne arvelighetsmønster av sykdommen er de fleste pasienter med Fabrys sykdom menn. Selv om alvorlig rammede kvinnelige heterozygoter er blitt observert, er kvinnelige heterozygoter ofte asymptomatiske eller har relativt svake symptomer (såsom en karakteristisk flekk på hornhinnen). En atypisk variant av Fabrys sykdom som oppviser en lav restaktivitet av ot-Gal A og enten meget svake symptomer eller tilsynelatende ingen andre symptomer som er karakteristis-ke for Fabrys sykdom, korrelerer med venstre ventrikkelhypertrofi og hjertesyk-dom. Nakano et al., New Engl. J. Med. 333: 288-293 (1995). En reduksjon av a-Gal A-mengden kan være årsaken til slike hjerteabnormaliteter.

Humant ot-Gal A har blitt renset fra plasma og milt.(Desnick et al. Proe. Nati. Acad. Sei., USA 76: 3526(1979)).

cDNA og genet som koder for humant ot-Gal A, er blitt isolert og sekvensiert. Humant ot-Gal A uttrykkes som et 429 aminosyrer langt polypeptid, hvorav de 31 N-terminale aminosyrer er signalpeptidet. Det humane enzym er blitt uttrykt i kinesisk hamster-ovarieceller (CHO-celler) (Desnick era/., US-patent 5.356.804; Desnick et al. Europeisk patentsøknad EP 1020528; Ioannou et al., J. Cell. Biol. 119: 1137 (1992)) humane celler (Seiden et al, internasjonal patentsøknad WO/98/11206, og insektceller (Calhoun et al., WO 90/11353).

Konjugat av superoksyd-dismutase har blitt fremstilt ved å koble polyetylenglykol (Saifer et al., US-patent nr. 5.283.317).

Imidlertid har dagens preparater av a-Gal A en begrenset virkning. Fremgangsmåter ved fremstilling av a-Gal A med en relativt høy renhet er avhengige av bruk av affinitetskromatografi ved bruk av en kombinasjon av lektin-affinitetskromatografi (concavalin A (Con A)-"Sepharose") og affinitetskromatografi basert på bindingen av a-Gal A til substrata na logen N-6-aminoheksanoyl-a-D-galaktosylamid koblet til en "Sepharose"-matriks. Se f.eks. Bishop et al., J. Biol. Chem. 256: 1307-1316

(1981). Anvendelse av proteinholdige lektin-affinitetsharpikser og substratanalog-harpikser er vanligvis forbundet med en kontinuerlig utvasking av affinitetsmidlet fra den faste bærer (Marikar er al., Anal. Biochem. 201: 306-310 (1992), hvilket fører til en forurensning av det rensede produkt med affinitetsmidlet, enten fritt i oppløsning eller bundet til eluert protein. Slike forurensniner gjør produktet uegnet for bruk i farmasøytiske preparater. Bundne substratanaloger og lektiner kan også ha en betydelig negativ virkning på de enzymatiske, funksjonelle og strukturelle egenskaper av proteiner. Videre elimineres a-Gal A som er fremstilt ved dagens metoder, raskt av leveren.

Dermed er det egnet å benytte en renseprotokoll ved bruk av konvensjonelle kro-matografiharpikser som er lett tilgjengelige i en mengde og kvalitet som er egnet for kommersiell anvendelse i stor skala og som daner et a-Gal A-preparat som er fritt for affinitetsmiddel. Ved dette kan det fremstilles a-Gal A-preparater med en økt sirkulasjonshalveringstid og et økt opptak i bestemte vev, unntatt leveren.

SAMMENFATNING AV OPPFINNELSEN

Oppfinnelsen tilveiebringer anvendelse av a-Gal A-preparater for fremstilling av

medikamenter som angitt i krav 1. Slike a-Gal A-preparater kan ha endret ladning. Ladningsendringer kan oppnås ved å øke sialsyreinnholdet av a-Gal A og/eller ved å øke fosforylasjonen av a-Gal A. Det kan også benyttes a-Gal A-preparater som har en forlenget sirkulasjonshalveringstid i en pattedyrvert. De aktuelle a-Gal A-preparatene vil være nyttige for behandling av individer md Fabrys sykdom eller atypiske varianter av Fabrys sykdom, f.eks. bestemte grupper av Fabry-pasienter med overveiende kardiovaskulære abnormaliteter, såsom ventrikulær forstørrelse, f.eks. venstre ventrikkel hy pertrofi (LVH) og/eller mitralklaffinsuffisiens, eller Fabry-pasienter med overveiende nyrerammelse.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Fig. 1 viser 210 bp-proben som ble brukt for å isolere et ot-Gal A-cDNA fra en human fibroblast-cDNA-samling (SEKV. ID NR: 1). Sekvensen er fra ekson 7 av a-Gal A-genet. Proben ble isolert fra humant genomisk DNA ved polymerase-kjedereaksjon (PCR). Områdene som er understreket på figuren, tilsvarer sekvensene av amplifikasjonsprimerne. Fig. 2 viser sekvensen av DNA-fragmentet som fullfører 5'-ende av a-Gal A-cDNA-klonen (SEKV. ID NR: 2). Dette fragment ble amplifisert fra humant genomisk DNA ved PCR. Områdene som er understreket, tilsvarer sekvensene av amplifikasjonsprimerne. Posisjonene av Ncol- og SacII-restriksjonsendonukleasesetene, som ble brukt for delkloningen beskrevet i eksempel 1, vises også. Fig. 3 viser sekvensen av a-Gal A-cDNA, også sekvensen som koder for signalpeptidet (SEKV. ID NR: 3). Fig. 4 er et skjematisk kart over pXAG-16, et a-Gal A-ekspresjonskonstrukt som omfatter CMV (cytomegalovirus)-promoter, ekson 1 og det første intron, hGH-signalpeptid-kodende sekvens og første intron, cDNA for a-Gal A (som mangler a-Gal A-signalpeptidsekvensen) og hGH-3'-UTS. pcDNeo viser til posisjonen av neo-genet som ble avledet fra plasmidet pcDNeo. Fig. 5 er et skjematisk kart over pXAG-28, et a-Gal A-ekspresjonskonstrukt som omfatter kollagen Ia2-promoter og det første ekson, et p-aktin-intron, hGH-signalpeptid-kodende sekvens og første intron, cDNA for a-Gal A (som mangler a-Gal A-signalpeptidsekvensen) og hGH-3'-UTS. pcDNeo viser til posisjonen av neo-genet som ble avledet fra plasmidet pcDNeo.

Fig. 6 viser human a-Gal A-aminosyresekvens (SEKV. ID NR: 4).

Fig. 7 viser cDNA-sekvensen som koder for humant a-Gal A (uten signalpeptid)

(SEKV. ID NR: 5).

Fig. 8 er et akromatogram av a-Gal A-rensetrinnet ved bruk av butyl-"sepharose"-harpiks. Absorbansen ved 280 nm (enkel strek) og a-Gal A-aktivitet (stiplet linje) av valgte fraksjoner vises.

Fig. 9 er et skjematisk kart over pGA213C.

Fig. 10 viser diagrammatisk målrettingskonstruktet pGA213C og en homolog rekombinasjon med endogent a-galaktosidase A-lokus. pGA213C vises som målret-tingssekvenser linjestilt over de tilsvarende sekvenser på X-kromosomal a-galaktosidase A-lokus. Posisjoner i forhold til metionin-initierende kodon, ATG, vises med tallene ovenfor de lineære kart. Aktiveringsenheten som inneholder murint dhfr, bakterielt neo og CMV-promoter/aldolase-intronsekvenser, vises ovenfor posisjonen (-221) som de ble innføyd i ved DNA-kloning. a-galaktosidase A-kodende sekvenser vises med de mørke boksene. Ikke-kodende genomiske sekvenser vises med de svakt skyggelagte boksene. Store pilspisser angir retningen av transkripsjonen for dhfr og neo-ekspresjonskassettene. En skjøting av GA-GAL-mRNA etter en fremgangsrik målretting og genaktivering vises med den segmenterte linjen under kartet for aktivert a-galaktosidase A (GA-GAL)-lokus.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Innledning

Det er beskrevet heri visse a-Gal A-preparater, fremgangsmåter ved fremstilling av dem, samt anvendelse av slike for fremstilling av medikamenter til behandling av pasienter med Fabrys sykdom eller atypiske varianter av Fabrys sykdom. Visse in-teressante og representative utførelser skal oppsummeres og beskrives i større detalj i det følgende.

Oppfinnelsen benytter seg av a-Gal A fremstilt i hvilken som helst celle (en a-Gal A-produksjonscelle) for fremstilling av medikamenter til behandling av Fabrys sykdom. I en foretrukken utførelse benytter seg oppfinnelsen av humant a-Gal A fremstilt ved bruk av standard genkonstruksjonsteknikker (basert på innføring av det klonede a-Gal A-gen eller cDNA inn i en vertcelle) eller genaktivering.

Oppfinnelsen anvender preparater, som inneholder a-Gal A av høy renhet. Det kan anvendes sammensetninger med humane a-Gal A-preparater fortrinnsvis med minst 98% homogenisitet, mer foretrukket til minst 99% homogenisitet og mest foretrukket til minst 99,5% homogenisitet, ifølge målinger ved SDS-PAGE eller reversfase-HPLC. Den spesifikke aktivitet av a-Gal A-preparatene er fortrinnsvis minst 2,0 x IO<6> enheter pr. mg protein, mer foretrukket minst 3,6 x IO<6> enheter pr. mg protein og mest foretrukket minst 3,5 x IO<6> enheter pr. mg protein.

Det aktuelle ot-Gal A-preparatet kan renses ved å adskille de forskjellige glykoformer for a-Gal A fra andre komponenter på en hydrofob vekselvirkningsharpiks, men dette omfatter ikke noe lektin-kromatografisk trinn. Fortrinnsvis omfatter den fun-skjonelle enhet av den hydrofobe vekselvirkningsharpiks en butylgruppe.

Alternativt renses a-Gal A-preparatet ved å først binde de forskjellige glykoformer for a-Gal A til en kationbytteharpiks i en kolonne ved sur pH i ekvilibreringsbuffer. Kolonnen vaskes deretter md ekvilibreringsbufferen for å eluere det ubundne materiale, og de forskjellige glykoformer for a-Gal A elueres ved bruk av en saltoppløs-ning på 10-100 mM, en bufret oppløsning med pH 4-5 eller en kombinasjon derav som elueringsoppløsning. Ekvilibreringsbufferen kan ha en pH på ca. 4,4.

a-Gal A-preparat kan også renses ved å separere de forskjellige glykoformer av a-Gal A i en prøve fra de øvrige komponenter i prøven ved bruk av en renseprosedyre omfattende et trinn med minst én metode valgt fra kromatofokuserende kromatografi, metallchelat-affinitetskromatografi og immunoaffinitetskromatografi, som renseprosedyre.

Det kan videre anvendes a-Gal A-preparater som har a-Gal A med endret ladning. Preparatene kan omfatte forskjellige glykoformer for a-Gal A. Ladningsendringene oppnås ved å øke sialsyreinnholdet i a-Gal A-preparater og/eller ved å heve fosforylasjonen av a-Gal A-preparater.

Sialsyreinnholdet i a-Gal A-preprater økes ved å (i) isolere a-Gal A-glykoformene med høy ladning og/eller høyere molekylvekt under eller etter renseprosessen; (ii) tilsette sialsyreresiduer ved bruk av celler som er blitt genetisk modifisert (enten ved konvensjonelle genkonstruksjonsmetoder eller genaktivering) til å uttrykke et sialyltransferase-gen eller -cDNA; eller (iii) fermentere eller dyrke celler som uttrykker enzymet i et lavt ammoniumholdig miljø.

Fosforylering av a-Gal A-preparater kan heves ved å (i) tilsette fosfatresiduer ved bruk av celler som er blitt genetisk modifisert (enten ved konvensjonelle genkonstruksjonsmetoder eller genaktivering) til å uttrykke et fosforyltransferasegen eller -cDNA; eller (ii) tilsette fosfataseinhibitorer til de dyrkede celler.

Det kan foretrukket anvendes humane glykosylerte a-Gal A-preparater hvor mellom 35% og 85% av oligosakkaridene er ladet, og helst hvor minst 35% av oliosakkari-dene er ladet og enda mer foretrukket hvor minst 50% av oligosakkaridene er ladet.

Alternative foretrukne preparater av humant glykosylert a-Gal A har flere a-Gal A-glykoformer med fortrinsvis minst 20%, mer foretrukket minst 50% og mest foretrukket minst 70% komplekse glykaner med 2-4 sialsyreresiduer. I en alternativ foretrukken utførelse har preparater av humant glykosylert a-Gal A med flere glykoformer, en oligosakkaridladning, målt ifølge Z-tallet, over 100, fortrinnsvis over 150 o mer foretrukket over 170. I en annen alternativ foretrukken utførelse er i preparatene med flere glykoformer, 50-75%, fortrinnsvis 60% av de samlede glykaner sialylert.

I én utførelse kan det anvendes et glykosylert a-Gal A-preparat som har en hevet oligosakkaridladning. Dette kan fremstilles ved å først innføre et polynukleotid som koder for GIcNAc-transferase III (GnT-III), i en a-Gal A-produksjonslinje, eller inn-føre en regulatorisk sekvens som regulerer ekspresjonen av et endogent GnT-III-gen, ved homolog rekom bi nasjon. a-Gal A-produksjonslinjen dyrkes deretter under kulturbetingelser som fører til en ekspresjon av a-Gal A og GnT-III. Til slutt kan a-Gal A-preparatet med hevet oligosakkaridladning isoleres.

Alternativt kan det anvendes et glykosylert a-Gal A-preparat som har en hevet oligosakkaridladning, hvor dette preparat er fremstilt ved å først innføre et polynukleotid som koder for sialyltransferase, i en a-Gal A-produksjonscelle, eller innfø-re en regulatorisk sekvens som regulerer ekspresjonen av et endogent sialyltransferasegen, ved homolog rekombinasjon. a-Gal A-produksjonscellen dyrkes deretter under kulturbetingelser som fører til ekspresjon av a-Gal A og sialyltransferaset. Det endelige trinn omfatter å isolere a-Gal A-preparatet med hevet oligosakkaridladning. Foretrukne sialyltransferaser omfatter et a2,3-sialyltransferase og et a2,6-sialyltransferase. I en foretrukken utførelse kan det utføres det ytterligere trinn å velge a-Gal A-glykoformer med økt størrelse eller økt ladning, ved fraksjonering eller rensing av preparatet.

Det kan også benyttes et glykosylert a-Gal A-preparat med økt sialylering hvor preparatet er fremstilt ved å bringe en a-Gal A-produksjonscelle i berøring med et kulturmedium som har en ammoniumkonsentrasjon under 10 mM, mer foretrukket under 2 mM. Det lavt ammoniumholdige miljø kan oppnås ved tilsetning av gluta-minsyntetase til kulturmediet, eller det lavt ammoniumholdige miljø kan oppnås ved kontinuerlig eller tidvis perfusjon av a-Gal A-produksjonscellen med ferskt kulturmedium for å holde ammoniumkonsentrasjonen under 10 mM, mer foretrukket under 2 mM.

Det kan også anvendes et glykosylert a-Gal A-preparat med økt fosforylasjon hvor dette er fremstilt ved å først innføre et polynukleotid som koder for fosforyltransferase, i en a-Gal A-produksjonscelle, eller innføre en regulatorisk sekvens som regulerer ekspresjonen av et endogent fosforyltransferasegen, ved homolog rekombinasjon. a-Gal A-produksjonscellen dyrkes deretter under kulturbetingelser som fø-rer til en ekspresjon av a-Gal A og fosforyltransferase. a-Gal A-preparatet med økt fosforylasjon sammenlignet med a-Gal A fremstilt i en celle uten polynukleotidet, isoleres deretter. a-Gal A-preparatene har flere glykoformer, hvor mellom 16-50%, fortrinnsvis 25-50%, mer foretrukket minst 30%, av glykoformene er fosforylert. Det er også mulig ytterligere å velge a-Gal A-glykoformer med økt størrelse eller økt ladning, ved fraksjonering eller rensing av preparatet.

Det kan også anvendes et glykosylert a-Gal A-preparat med økt fosforylasjon. Dette kan fremstilles ved å tilsette en fosfataseinhibitor, f.eks. bromtetramisol, til dyrkede celler. Lave nivåer av bovint plasma-alkalifosfatase kan foreligge i det føtale kalveserum som brukes som vekstadditiv for dyrkede celler. Dette gjør det mulig at utsatte Man-6-P-epitoper på utsondret a-Gal A kunne være et substrat for serum-alkalifosfatase. Bromtetramisol har vist seg å være en sterk inhibitor av alkalifosfatase; Ki = 2,8 mM (Metaye et al., Biochem. Pharmacol 15: 4263-4268 (1988)), og en fullstendig inhibering oppnås ved en konsentrasjon på 0,1 mM (Borgers &Tho-ne, Histochemistry 44: 277-280 (1975)). Derfor kan en fosfataseinhibitor, f.eks. bromtetramisol, tilsettes til de dyrkede celler, for å maksimere formen av a-Gal A med høyt opptak som foreligger i kulturmediet, ved å forebygge en hydrolyse av Man-6-P-estergruppene.

De aktuelle a-Gal A-preparater, har en forlenget sirkulasjonshalveringstid i en pattedyrvert. Sirkulasjonshalveringstiden og det cellulære opptak forsterkes ved å (i) øke sialsyreinnholdet i a-Gal A (oppnås som beskrevet ovenfor); (ii) øke fosforylasjonen av a-Gal A (oppnås som beskrevet ovenfor); (iii) PEGylere a-Gal A; eller (iv) sekvensielt fjerne sialsyre og terminale galaktoseresiduer, eller fjerne terminale galaktoseresiduer, på oligosakkaridkjedene på a-Gal A.

En forbedret sialylering av a-Gal A-preparater øker sirkulasjonshalveringstiden av eksogent a-Gal A. I tillegg fører en forbedret sialylering av a-Gal A til et forbedret opptak sammenlignet med opptaket av hepatocytter, i ikke-hepatocytter såsom le-verendotelceller, leversinusoidceller, pulmonære celler, nyreceller, neuralceller, endotelceller eller hjerteceller. Preparatet med humant glykosylert ot-Gal A med et økt innhold av sialsyre, omfatter fortrinnsvis flere glykoformer, med minst 20% komplekse glykaner som har 2-4 sialsyreresiduer. Et alternativt foretrukket preparat av humant glykosylert a-Gal A har flere glykoformer, hvor mellom 50-70%, fortrinnsvis mist 60%, av de samlede glykaner er sialylert.

Fosforylasjon av a-Gal A-preparater forbedrer også nivået av a-Gal A som inntrer i cellene. Fosforylasjonen finner sted i cellene som uttrykker a-Gal A. Et foretrukket preparat av humant glykosylert a-Gal A omfatter fortrinnsvis flere glykoformer hvor gjennomsnittlig minst 16-50%, fortrinnsvis 25-50%, mer foretrukket minst 30%, av glykoformene er fosforylert.

Det er også mulig å forbedre sirkulasjonshalveringstiden av et humant a-Gal A-preparat ved å kompleksere a-Gal A med polyetylenglykol. Således komplekseres a-Gal A-preparatet ved bruk av tresylmonometoksy-PEG (TMPEG) for å danne et PEGylert a-Gal A. Det PEGylerte a-Gal A renses deretter for å tilveiebringe et isolert, PEGylert a-Gal A-preparat. PEGyleringen av a-Gal A øker sirkulasjonshalveringstiden og in wVo-effekten av proteinet.

Sialylering påvirker sirkulasjonshalveringstiden og biofordelingen av proteiner. Proteiner med lite eller ingen sialsyre internaliseres raskt av asialoglykoproteinreseptor (Ashwell-reseptor) på hepatocytter av fremviste galaktoseresiduer på proteinet. Sirkulasjonshalveringstiden av galaktoseterminert a-Gal A kan forsterkes ved å sekvensielt (1) fjerne sialsyre ved å bringe a-Gal A i berøring med neuraminidase (sialidase), hvilket blottlegger de terminale galaktoseenheter, og (2) fjerne de terminale galaktosidaseresiduer ved å bringe det desialylerte a-Gal A i berøring med p-galaktosidase. Det dannede a-Gal A-preparat har et antall terminale sialsyre-og/eller terminale galaktosid-residuer på oligosakkaridkjedene sammenlignet med a-Gal A-preparater som ikke er blitt bragt i sekvensiell berøring med neuraminidase og p-galaktosidase. Alternativt kan sirkulasjonshalveringstiden av galaktoseterminert a-Gal A forbedres ved å kun fjerne de terminale galaktosidresiduer ved å bringe det desialylerte a-Gal A i berøring med p-galaktosidase. Det dannede a-Gal A-preparat har et nedsatt antall terminale galaktosidresiduer på oligosakkaridkjedene sammenlignet med a-Gal A-preparater som ikke er blitt brakt i be-røring med p-galaktosidase. I en foretrukken utførelse bringes, etter en sekvensiell berøring med neuraminidase og p-galaktosidase, de dannede a-Gal A-preparater deretter i berøring med p-heksosaminidase, hvilket spalter oligosakkaridet til tri-mannose-kjernen.

I tillegg kan sialyleringsnivået variere avhengig av hvilken celletype som brukes. Derfor kan sialyleringen av a-Gal A forsterkes ved å teste for pattedyrceller, f.eks. humane celler, som har en relativt høy sialyltransferaseaktivitet, og å bruke slike celler som a-Gal A-produksjonsceller.

Det er ved anvendelsen ifølge oppfinnelsen mulig å benytte formuleringer av et a-Gal A-preparat som er i det vesentlige frie for ikke-a-Gal A-proteiner såsom albumin, ikke-ataI-proteiner fremstilt i vertcellen eller proteiner isolert fra dyrevev eller -væske. Formuleringen kan i tillegg omfatte en eksipiens. Foretrukne eksipienser omfatter mannitol, sorbitol, glycerol, aminosyrer, lipider, EDTA, EGTA, natriumklorid, polyetylenglykol, polyvinylpyrrolidon, dekstran eller kombinasjoner av disse eksipienser. Formuleringen kan i tillegg omfatte et ikke-ionisk rensemiddel. Foretrukne ikke-ioniske rensemidler omfatter Polysorbat 20, Polysorbat 80, Triton X-100, Triton X-114, Nonidet P-40, Oktyl a-glukosid, Oktyl b-glukosid, Brij 35, Plu-ronic og Tween 20. Alternativt omfatter det ikke-ioniske rensemiddel Polysorbat 20 eller Polysorbat 80. En alternativ formulering omfatter ytterligere fosfatbufret salin, fortrinnsvis ved pH 6.

Administrasjonsdosen av det fremstilte medikamentet er fortrinnsvis mellom 0,05-5,0 mg, mer foretrukket mellom 0,1-0,3 mg, a-Gal A-preparat pr. kg kroppsvekt ukentlig eller annenhver uke. Fortrinnsvis er administrasjonsdosen ca. 0,2 mg pr. kg kroppsvekt annenhver uke. Dosen kan administreres intramuskulært, oralt, rektalt, subkutant, intraarterielt, intraperitonealt, intracerebralt, intranasalt, intrader-malt, intratekalt, transmukosalt, transdermalt eller ved inhalasjon. a-Gal A-preparatet kan tilpasses å subkutant administrere en dose i området mellom 0,01-10,0 mg, fortrinnsvis 0,1-5,0 mg, a-Gal A-preparat pr. kg kroppsvekt annenhver uke eller ukentlig. a-Gal A-preparatet kan også administreres intravenøst eller ved en kontinuerlig intravenøs injeksjon. I hvilken som helst av de ovennevnte metoder kan a-Gal A-preparatet leveres ved bruk av et leveringssystem såsom pumpeleve-ring, innkapslet celle-levering, liposomal levering, nållevert injeksjon, nålløs injeksjon, forstøver, aerosoliserer, elektroporasjon og transdermalt plaster. Hvilket som helst av de ovenfor beskrevne a-Gal A-preparater kan administreres ved disse metoder.

ot- Gal A

ot-Gal A er et homodimert glykoprotein som hydrolyserer de terminale ot-galaktosylenheter fra glykolipider og glykoproteiner.

Begrepene modent "a-Gal A" og "GA-GAL" og "SEKV. ID NR: 5" (se fig. 7) viser til a-Gal A uten signalpeptid (for a-Gal A med signalpeptidet, se fig. 3 og SEKV. ID NR: 3). Begrepet "a-Gal A-preparat" som definert heri, benyttes synonymt med begrepet "glykosylert a-Gal A-prepatat" og omfatter forskjellige glykosylerte a-Gal A-glykoformer.

Et "signalpeptid" er en peptidsekvens som styrer et nytt syntetisert polypeptid som signalpeptidet er bundet til, mot endoplasmatisk retikulum (ER) for videre post-translasjonell prosessering og fordeling.

Et "heterologt signalpeptid" betyr når det brukes heri i sammenheng med a-Gal A, et signalpeptid som ikke er humant a-Gal A-signalpeptid, vanligvis signalpeptidet for et annet pattedyrprotein enn a-Gal A.

Fagmannen vil forstå at den humane a-Gal A-DNA-sekvens (enten cDNA [SEKV. ID NR: 5] eller genomisk DNA), eller sekvenser som skiller seg fra humant a-Gal A-DNA grunnet enten stumme kodonendringer eller kodonendringer somfører til konservative aminosyreendringer, kan brukes for å genetisk modifisere dyrkede humane celler slik at disse vil overuttrykke og utsondre enzymet. Visse mutasjoner i a-Gal A-DNA-sekvensen kan kode for polypeptider som bevarer eller oppviser forbedret a-Gal A-enzymatisk aktivitet. For eksempel ville man forvente at konservative aminosyresubstitusjoner vill ha liten eller ingen virkning på den biologiske aktivitet, spesielt hvis de representerer færre enn 10% av det samlede antall residuer i proteinet. Konservative substitusjoner omfatter vanligvis substitusjoner i de følgen-de grupper: glycin, alanin; valin, isoleucin, leucin; aspa ragi nsyre, glutamsyre; asparagin, glutamin; serin, treonin; lysin, arginin; og fenylalanin, tyrosin. Se f.eks. US-patent 5.356.804.

Fabrvs svkdom

Fabrys sykdom er en genetisk forstyrrelse som forårsakes av en manglende aktivitet av enzymet a-Gal A. Med "a-Gal A-mangel" menes hvilken som helst mangel i mengden eller aktiviteten av dette enzym i en pasient som fører til abnormale opp-hopninger av neutrale glykolipider (f.eks. globotriaosylceramid) i histiocytter i blod-karvegger, med angiokeratomaer på hoftene, baken og genitaliene, hypohidrose, parastesi i ekstremitetene, cornea verticillata og knottlignende posteriore subkap-sulære katarakter. Avsettelsene av dette materiale kan føre til smerter, alvorlig ny-resykdom og kardiovaskulær sykdom samt slag. Glykolipidopphopningen kan indusere alvorlige symptomer som typisk kan observeres i menn som lider av Fabrys sykdom. Alternativt kan opphopningen indusere relativt svake symptomer, slik de iblant kan observeres i heterozygote kvinnelige bærere av det defekte gen. Rammede individer kan ha en meget kort livsforventning; døden skyldes vanligvis nyre-, hjerte- eller cerebrovaskulære komplikasjoner i omkring 40 års alder. Det finnes ingen spesiell behandling for dene sykdom. Fabrys sykdom, som klassifiseres som en lysosomal lagringsforstyrrelse, rammer over 15.000 mennesker i verden.

Fabrys sykdom som definert ovenfor er et komplekst klinisk syndrom som kjenne-tegnes av flerorgan- og flersystem-innblanding. Pasienter som manifesterer kombi-nasjonen av korneal dystrofi, hudlesjoner (angiokeratomata), smertelig neuropati, cerebral vaskulær sykdom, kardiomyopati og nyresvikt, kategoriseres som å oppvise den "klassiske" fenotype. Det finnes imidlertid også pasienter som oppviser noen av, men ikke alle, aspektene av den klassiske fenotype. Disse pasienter klassifiseres som "atypiske varianter av Fabrys sykdom". Det finnes flere atypiske variantfe-notyper forbundet med a-galaktosidase A-mangel. F.eks. har noen pasienter med a-galaktosidase A-mangel en variasjon av Fabrys sykdom med kun hjerterammel-se, f.eks. venstre ventrikulær hypertrofi (LVH). Det finnes også en annen variantfe-notype hvor pasientene kun har en nyrerammelse. Selv om begge disse variantfe-notyper er blitt definert i manlige hemizygoter, er variantformene for Fabrys sykdom også blitt beskrevet i kvinnelige heterozygoter.

Pasienter med den atypiske hjertevariant har generelt en symptomatisk sykdom senere i livet. Den midlere diagnosealder for pasienter med hjertevariantfenotypen er ca. 52 år, sammenlignet med ca. 29 år for den klassiske fenotype (Desnick er al., i The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. 6. utgave (1996), Scriver et al. (utg.), McGraw-Hill (New York), s. 2741-2784; Meikle et al., J. Am. Med. Assoc. 281: 249-254 (1999)). Pasienter med dette syndrom viser seg generelt å ha svake symptomer av hjertedysfunksjon såsom anstrengelsesdyspné. Vanligvis viser en standard ekkokardiografisk analyse at pasienter med hjertevariantfenotype har venstre ventrikulær hypertrofi (LVH) eller asymmetrisk septal hypertrofi. Imidlertid kan pasientene også vise seg å ha myokardialt infarkt eller kardiomyopati (Scheidt et al., New Engl. J. Med. 324: 395-399 (1991); Nakao et al., New Engl. J. Med. 333: 288-293 (1995)). Disse pasienter gjennomgår ofte myokardiale biopsier, og patologien av variantsyndromet er i det vesentlige likt den klassiske Fabrys sykdom: myokardial infiltrasjon av avsatt glykolipid. a-galaktosidase A-enzymassayer viser et bredt område for enzymnivået. F.eks. har hjertevariantpasienter blitt beskrevet å ha opptil 30% av det normale nivå for a-galaktosidase a-aktivitet og har inntil idag ikke blitt ansett å være kandidater for a-Gal A-erstatningsterapi.

Oppfinnerne har nå overraskende oppdaget at selv om atypiske hjertevariant- eller atypiske nyrevariantpasienter kan ha a-galaktosidase A-enzym-aktivitetsnivåer som er relativt høye sammenlignet med pasienter med klassisk fenotype av Fabrys sykdom, kan også disse pasienter ha nytte av en a-galaktosidase A-enzymterapi. F.eks. kan pasienter ha en mutasjon som danner et kinetisk ustabilt a-Gal A-enzym i cellen, og i disse pasienter kan a-Gal A-enzymnivået forsterkes vesentlig ved administrasjon av et a-Gal A-preparat anvendt ifølge foreliggende oppfinnelse. Dess-uten er det blitt beskrevet at noen pasienter med den atypiske hjertevariantfenotype har en punktmutasjon i aminosyre 215 av a-galaktosidase A. Denne aminosyre i det umuterte protein er et asparagin som er glykosylert (Eng et al., Am. 3. Hum. Genet. 53: 1186-1197 (1993)). Dermed kan en a-Gal A-enzym-erstatningsterapi med et ordentlig glykosylert a-galaktosidase A-preparat være virksomt i disse pasienter. Videre er det blitt beskrevet pasienter med atypisk nyre-variant, hvis eneste kliniske manifestasjon av Fabrys sykdom er en svak proteinu-ria. En renal biopsi viser imidlertid de for Fabrys sykdom typiske glykolipidoppsam-linger, og et a-Gal A-enzymassay viser lavere a-Gal A-nivåer enn normalt. På grunn av at avsatt ceramidtriheksosid i nyren kan påvises i utskilte nyretubuliceller i urin-sedimentet av disse pasienter, kan en administrasjon av et a-Gal A-preparat nedsette dette nivå betydelig. Lysosomale enzymer såsom a-Gal A målrettes mot det lysosomale rom i en celle ved vekselvirkning med mannose-6-fosfat (M6P)-reseptor, som bindes til M6P-residuer som foreliger i oligosakkaridenheten av enzymer på vei til det lysosomale rom. Kornfeld & Mellman, Ann. Rev. Cell Biol. 5: 483-525 (1989). Den primære vekselvirkning finner sted i Golgi, hvor enzymer som er bundet til Golgi-M6P-reseptorer adskilles for en transport til lysosomene. En sekundær type av vekselvirkning antas å finne sted mellom ekstracellulært a-Gal A og M6P-reseptorene på celleflaten. Enzymer som ikke tas opp i rutesystemet, utsondres av cellen via den konstitutive sekretoriske bane, og gjeninnfanges ofte av celle-fl a te-M 6 P-reseptorer, som tilbakefører a-galaktosidase A til lysosomet via den eno-cytiske bane. Ekstracellulære substanser som internaliseres av celler, transporteres gjennom cytoplasma i endocytiske vesikler, som sammensmelter med primære lysosomer og tømmer sitt innhold i lysosomene. I denne prosess innlemmes cellevev-fl a te-M 6 P-reseptorer også i endocytiske vesikler, og transporteres til lysosomer. Spesielt er det aktuelt å bruke ot-Gal A-preparater hvor det foreligger høye nivåer av sialylering og/eller fosforylering, for behandling av pasienter med atypiske varianter av Fabrys sykdom. Slike preparater minimerer f.eks. andelen av det injiserte a-Gal A som fjernes av hepatocyttene, og muliggjør et høyt nivå av a-Gal A-opptak i ikke-lever-celler, såsom nyreceller, vaskulære celler, tubuliceller, glomerulære celler, hjertemyocytter og hjertevaskulære celler.

Ekstracellulært a-Gal A som bærer M6P-residuer, kan bindes til celleflate-M6P-reseptorer og transporteres inn i det lysosomale rom. Når de befinner seg i det lysosomale rom, kan a-Gal A utføre den riktige funksjon. Det er dette trekk av lysosomal enzymbevegelse som gjør a-galaktosidase A-enzym-erstatningsterapi til en tenkelig terapeutisk behandling for pasienter med Fabrys sykdom. Selv om en celle har en genetisk mangelfull produksjon av a-Gal A, kan cellen ta opp ekstracellulært a-Gal A hvis a-Gal A er glykosylert på egnet måte, og den manglende celle bærer M6P-reseptorer. I pasienter med Fabrys sykdom oppviser de vaskulære endotelceller i nyre og hjerte alvorlige histopatologiske abnormaliteter og bidrar til den kliniske patologi av sykdommen. Disse celler, som bærer M6P-reseptorer, er et spesielt terapeutisk mål for a-Gal A.

I hvilken grad de N-bundne oligosakkarider av a-Gal A modifiseres ved sialylering, har en betydelig virkning på a-Gal A's farmakokinetikk og biofordeling. I fravær av en egnet sialylering, utskilles a-Gal A raskt fra sirkulasjonen fordi de bindes til he-patiske asialoglykoproteinreseptorer (Ashwell-reseptorer), fult av en internalisering og degradering av hepatocytter. Ashwell & Harford, Ann. Rev. Biochem. 51: 531-554 (1982). Dette nedsetter mengden av a-Gal A som er tilgjengelig i sirkulasjonen for binding til M6P-reseptorer på celler som bidrar til den kliniske patologi av Fabrys sykdom, såsom de vaskulære endotelceller i nyre og hjere. a-Gal A som utsondres av genetisk modifiserte humane celler, har glykosylasjonsegenskaper som er egnet for behandling av Fabrys sykdom ved enten en konvensjonell farmasøytisk administrasjon av det rensede utsondrede protein eller ved genterapi, uten at det er nødvendig med noen ytterligere enzymatisk modifikasjon, slik som hva som er blitt beskrevet å være nødvendig for det lysosomale enzym glukocerebrosidase, hvor opptaket av renset glukocerebrosidaseenzym av de klinisk relevante celler krever en komplisert enzymatisk modifikasjon av enzymet etter rensing fra human placen-ta. Beutler, New Engl. J. Med. 325: 1354-1360 (1991).

Celler som er egnet for produksjon av g- Gal A

Et individ som man tror at har en a-Gal A-mangel såsom Fabrys sykdom, kan behandles med renset humant a-Gal A erholdt fra dyrkede, genetisk modifiserte celler, fortrinnsvis humane celler.

Når celler skal modifiseres genetisk for behandling av Fabrys sykdom, kan cellene modifiseres ved konvensjonelle genkonstruksjonsmetoder eller ved genaktivering.

Ifølge konvensjonelle metoder kan et DNA-molekyl som inneholder et a-Gal A-cDNA eller en genomisk DNA-sekvens, føyes inn i et ekspresjonskonstrukt og transfiseres inn i primære, sekundære eller udødeliggjorte celler ved standardmetoder, omfattende liposom-, polybren- eller DEAE-dekstran-mediert transfeksjon, elektroporasjon, kalsiumfosfatfelning, mikroinjeksjon eller hastighetsdrevne mikropro-jektiler ("biolistika") (se f.eks. en samtidig svevende søknad, USSN 08/334.797). Alternativt kunne man bruke et system som leverer den genetiske informasjon via en viral vektor. Viruser som er kjent for å være nyttige ved genoverføring, omfatter adenoviruser, adenoforbundet virus, herpesvirus, kusmavirus, poliovirus, retroviru-ser, Sindbis-virus og vacciniavirus såsom kanariepoxvirus.

Alternativt kan cellene modifiseres ved bruk av fremgangsmåten med genaktivering ("GA"), slik som beskrives i US-patentene 5.733.761 og 5.750.376, begge innlemmet heri ved henvisning. a-Gal A fremstilt ved genaktivering, benevnes heri

GA-GAL.

Følgelig skal begrepet "genetisk modifisert" slik det brukes heri under henvisning til celler, omfatte celler som uttrykker et bestemt genprodukt etter innføring av et DNA-molekyl som koder for genproduktet og/eller regulatoriske elementer som regulerer ekspresjonen av en kodende sekvens for genprduktet. DNA-molekylet kan innføres ved genmålretting eller homolog rekombinasjon, dvs. inføring av DNA-molekylet i et bestemt genomisk sete. En homolog rekombinasjon kan brukes til å erstatte selve det defekte gen (det defekte a-Gal A-gen eller en del derav kunne erstattes i en Fabry-pasients egne celler med hele genet eller en del derav).

Anvendt heri omfatter begrepet "primær celle" celler som foreligger i en suspensjon av celler isolert fra en kilde for virveldyrvev (før de strykes på plate, dvs. festes på et vevkultursubstrat såsom en skål eller kolbe), celler som foreligger i et eksplantat avldet fra vev, hvor begge de sistnevnte celletyper strykes på plater for første gang, og cellesuspensjoner avledet fra disse platepåstrøkne celler.

"Sekundære celler" viser til celler i et senere dyrkingstrinn. Dvs. at den første gang en platepåstrøken celle fjernes fra kultursubstratet og strykes på en plate på nytt (passeres), benevnes den en sekundær celle, slik som også alle celler i senere passasjer.

En "cellestamme" består av sekundære celler som er blitt passert én eller flere ganger, oppviser et endelig antall midlere populasjonsfordoblinger under kultur; oppviser egenskaper med kontakthemmet, forankringsavhengig vekst (unntatt celler som forøkes i suspensjonskultur og som ikke er blitt gjort udødeliggjort).

Med "udødeliggjort celle" menes en celle fra en etablert cellelinje som oppviser en tilsynelatende ubegrenset livsvarighet i kultur.

Eksempler på primære eller sekundære celler omfatter fibroblaster, epitelceller omfattende bryst- og tarmepitelceller, endotelceller, formede elementer av blod omfattende lymfocytter og benmargceller, glialceller, hepatocytter, keratinocytter,

muskelceller, neurale celler eller forløpere for disse celletyper. Eksempler på udøde-liggjorte humane cellelinjer omfatter Bowes Melanomaceller (ATCC-tilgangsnummer CRL9607), Daudi-celler (ATCC-tilgangsnummer CCL 213), HeLa-celler og derivater av HeLa-celler (ATCC-tilgangsnumre CCL 2, CCL 2.1 og CCL 2.2), HL-60-celler (ATCC-tilgangsnummer CCL 240), HT-1080-celler (ATCC-tilgangsnummer CCL 121), Jurkat-celler (ATCC-tilgangsnummer TIB 152), KB-karsinomaceller (ATCC-tilgangsnummer CCL 17), K-562-lekuemiceller (ATCC-tilgangsnummer CCL 243), MCF-7-brystkreftceller (ATCC-tilgangsnummer BTH 22), MOLT-4-celler (ATCC-tilgangsnummer 1582), Namalwa-celler (ATCC-tilgangsnummer CRL 1432), Raji-celler (ATCC-tilgangsnummer CCL 86), RPMI 8226-celler (ATCC-tilgangsnummer CCL 155), U-937-celler (ATCC-tilgangsnummer CRL 1593), WO-38VA13-underlinje 2R4-celler (ATCC-tilganganummer CLL 75.1), CCRF-CEM-celler (ATCC-tilganganummer CCL 119). og 2780AD-ovariekarsinomaceller (Van der Blick era/., Cancer Res. 48: 5927-5932, 1988) samt heterohybridomaceller dannet ved fusjon av humance celler og celler av en annen art.

Etter den genetiske modifikasjon av humane celler for å danne en celle som utsondrer ot-Gal A, kan en klonal cellestamme som i det vesentlige består av et flertall genetisk identiske dyrkede primære humane celler, eller, når cellene er udødelig-gjort, en klonal cellelinje som i det vesentlige består av et flertall genetisk identiske udødeliggjorte humane celler, genereres. I én utførelse er cellene av den klonale cellestamme eller klonale cellelinje fibroblaster, eller sekundære humane fibroblaster, f.eks. BRS-ll-celler.

Etter genetisk modifikasjon, dyrkes cellene under betingelser som tillater en utsondring av a-Gal A. Proteinet isoleres fra de dyrkede celler ved å samle mediet hvor cellene dyrkes, og/eller spalte cellene for å frigi deres innhold, og å deretter anvende proteinrenseteknikker.

Rensing av a- Gal A fra det kondisjonerte medium av stabilt transfiserte celler

a-Gal A-protein fra de dyrkede celler ("a-Gal A-produksjonsceller") kan isoleres ved å samle mediet som cellene dyrkes i, eller spalte cellene for å frigi deres innhold, og deretter anvende proteinrenseteknikker uten bruk av lektin-affinitetskromatografi. Den foretrukne renseprosess sammenfattes i det følgende eksempel 2.

Alternativt kan også hydrofobe vekselvirkningsharpikser, såsom Source Iso (Pharmacia), "Macro-Prep" Methyl Support (Bio-Rad), TSK Butyl (Tosohaas) eller fenyl-"Sepharose" (Pharmacia) brukes til å rense a-Gal A. Kolonnen kan ekvilibreres i en relativt høy konsentrasjon av et salt, f.eks. 1 M ammoniumsulfat eller 2 M natriumklorid, i en buffer med pH 5,6. Prøven som skal renses, prepareres ved å justere pH og saltkonsentrasjonen tilpasset hva som foreligger i ekvilibreringsbufferen. Prøven påføres på kolonnen, og kolonnen vaskes med ekvilibreringsbuffer for å fjerne ubundet materiale. a-Gal A elueres fra kolonnen med en buffer med lavere ionisk styrke, vann eller et organisk løsemiddel i vann, f.eks. 20% etanol eller 50% propylenglykol. Alternativt kan a-Gal A fås til å flyte gjennom kolonnen ved bruk av en lavere saltkonsentrasjon i ekvilibreringsbufferen og i prøven, eller ved bruk av en annen pH. Andre proteiner kan bindes til kolonnen, hvilket fører til en rensing av den a-Gal A-holdige prøve som ikke ble bundet til kolonnen. Et foretrukket første rensetrinn er bruk av en hydroksyapatittkolonne.

Et alternativt rensetrinn kan benytte seg av en kationbytteharpiks, f.eks. SP-"Sepharose" 6 Fast Flow (Pharmacia), Source 30S (Pharmacia), CM-"Sepharose" Fast Flow" (Pharmacia), "Macro-Prep" CM Support (Bio-Rad) eller "Macro-Prep" High S Support (Bio-Rad) for å rense a-Gal A. Det "første kromatografitrinn" er den første påføring av en prøve på en kromatografikolonne (alle trinnene forbundet med prepareringen av prøven utelukkes). a-Gal A kan bindes til kolonnen ved pH 4,4. En buffer, såsom 10 mM natriumacetat pH 4,4, 10 mM natriumcitrat pH 4,4 eller en annen buffer med egnet bufringskapasitet ved ca. pH 4,4 kan også brukes for å ekvilibrere kolonnen. Prøven som skal renses, justeres til pH og den ioniske styrke av ekvilibreringsbufferen. Prøven påføres på kolonnen, og kolonnen vaskes etter påfyllingen for å fjerne ubundet materiale. Et salt, såsom natriumklorid eller kaliumklorid, kan brukes forå eluere a-Gal A fra kolonnen. Alternativt kan a-Gal A elueres fra kolonnen med en buffer med høyere pH eller en kombinasjon av en høyere saltkonsentrasjon og høyere pH. a-Gal A kan også fås til å flyte gjennom kolonnen under påfyllingen ved å øke saltkonsentrasjonen av ekvilibreringsbufferen og i prø-vefyllet, ved å skylle kolonnen ved en høyere pH eller ved en kombinasjon av både økt saltmengde og høyere pH.

Et annet rensetrinn kan benytte seg av en Q-"Sepharose" 6 Fast Flow for rensing av a-Gal A. Q-"Sepharose" 6 fast Flow er en relativt sterk anionbytteharpiks. En sva-kere anionbytteharpiks, såsom dEAE "Sepharose" Fast Flow (Pharmacia) eller "Macro-Prep" DEAB (Bio-Rad) kan også brukes for å rense a-Gal A. Kolonnen ekvilibreres i en buffer, f.eks. 10 mM natriumfosfat, pH 6. pH i prøven justeres til pH 6, og en lav ionstyrke oppnås ved fortynning eller diafiltrering av prøven. Prøven påfø-res på kolonnen under betingelser som binder a-Gal A. Kolonnen vaskes med ekvilibreringsbuffer for å fjerne ubundet materiale. a-Gal A elueres ved påføring av salt, f.eks. natriumklorid eller kaliumklorid, eller anvendelse av en buffer med lavere pH, eller en kombinasjon av økt saltmengde og lavere pH. a-Gal A kan også fås til å flyte gjennom kolonnen under fyllingen ved å øke saltkonsentrasjonen i fyllet eller ved å skylle kolonnen ved lavere pH, eller ved en kombinasjon av økt saltmengde og

lavere pH.

Et annet rensetrinn kan benytte seg av "Superdex" 200 (Pharmacia) størrelseseks-klusjonskromatografi for rensing av a-Gal A. Andre størrelseseksklusjonsharpikser såsom "Sephacryl" S-200 HR eller "Bio-Gel" A-I,5 m kan også benyttes for å rense a-Gal A. Den foretrukne buffer for størrelseseksklusjonskromatografi er 25 mM natriumfosfat pH 6,0 som inneholder 0,15 M natriumklorid. Andre formule-ringskompatible buffere kan også brukes, f.eks. 10 mM natrium- eller kaliumcitrat. pH av bufferen kan være mellom pH 6 og pH 7, og bør inneholde et salt, f.eks. natriumklorid eller en blanding av natriumklorid og kaliumklorid.

Et annet rensetrinn kan benytte seg av en kromatofokuserende harpiks såsom Po-lybuffer Exchanger PBE 94 (Pharmacia) for å rense a-Gal A. Kolonnen ekvilibreres ved relativt høy pH (f.eks. pH 7 eller mer), pH av prøven som skal renses, justeres til den samme pH, og prøven påføres på kolonnen. Proteiner elueres med en syn-kende pH-gradient til en pH såsom pH 4, ved bruk av et buffersystem, f.eks. Poly-buffer 74 (Pharmacia), som er blitt justert til pH 4.

Alternativt kan immunoaffinitetskromatografi benyttes for å rense a-Gal A. Et egnet polyklonalt eller monoklonalt antistoff mot a-Gal A (generert ved immunisering med a-Gal A eller med et peptid avledet fra a-Gal A-sekvensen ved bruk av standard teknikker) kan immobiliseres på en aktivert koblingsharpiks, f.eks. NHS-aktivert "Sepharose" 5 Fast Flow (Pharmacia) eller CNBr-aktivert "Sepharose" 4 Fast Flow

(Pharmacia). Prøven som skal renses, kan påføres på den immobiliserte antistoffko-lonne ved ca. pH 6 eller pH 7. Kolonnen vaskes forå fjerne ubundet materiale. a-Gal A elueres fra kolonnen med typiske reagensmidler som benyttes for affinitetskolon-neeluering, såsom lav pH, f.eks. pH 3, denatureringsmiddel, f.eks. guanidin-HCI eller tiocyanat, eller organisk løsemiddel, f.eks. 50% propylenglykol i en pH 6-buffer. Renseprosedyren kan også benytte seg av en metallchelat-affinitetsharpiks, f.eks. Chelating "Sepharose" Fast Flow (Pharmacia) for å rense a-Gal A. Kolonnen for-håndslades med metallioner, f.eks. Cu<2+>, Zn<2+>, Ca<2+>, Mg<2+> eller Cd<2+>. Prøven som skal renses, påføres på kolonnen ved egnet pH, f.eks. pH 6 til 7,5, og kolonnen vaskes for å fjerne ubundne proteiner, de bundne proteiner elueres ved kompetitiv eluering med imidazol eller histidin eller ved å nedsette pH ved bruk av natriumcitrat eller natriumacetat til en pH under 6, eller ved å innføre chelateringsmidler, såsom EDTA eller EGTA.

I henhold til de ovennevnte protokoller tilveiebringes preparater med renere ag-preparat enn hva som er blitt fremstilt tidligere, renset til minst 98% homogenisitet, mer foretrukket til minst 99% homogenisitet og mest foretrukket til minst 99,5% homogenisitet, ifølge målinger ved SDS-PAGE eller reversfase-HPLC. a-Gal A-preparatene anvendt ifølge foreliggende oppfinnesle kan omfatte flere a-Gal A-glykoformer. Følgelig viser begrepet "homogenisitet" slik det brukes i sammenheng med a-Gal A-preparater, til preparater som er i det vesentlige frie (< 2% av de samlede proteiner) for andre proteiner enn a-Gal A. Eksempler på ikke-a-Gal A-proteiner såsom albumin, ikke-a-Gal A-proteiner som fremstilles av vertcellen, og ikke-a-Gal A-proteiner isolert fra dyrevev eller -væske. Den spesifikke aktivitet av a-Gal A-preparatene er fortrinnsvis minst 2,0 x IO<6> enheter pr. mg protein, mer foretrukket minst 3,0 x IO<6> enheter pr. mg protein og mest foretrukket minst 3,5 x IO<6> enheter pr. mg protein.

Forbedring av sirkulasjonshalveringstiden av ot- Gal A- preparater ved glvkan-ommodellering for å øke oligosakkaridladningen

Preparatet fremstilt ved anvendelsen ifølge oppfinnelsen kan benytte et glykopro-teinmodifikasjonsprogram for et økt opptak av et terapeutisk enzym i bestemte andre vev enn lever og makrofager. Det anvendes humane glykosylerte a-Gal A-preparater hvor mellom 35% og 85% av oligosakkaridene er ladet, fortrinnsvis hvor minst 50% av oligosakkaridene er ladet.

Protein N-glykosylasjon virker ved å modifisere egnede asparaginresiduer av proteiner med oligosakkaridstruktur, hvorved deres egenskaper og bioaktivitet påvirkes. Kukuruzinska & Lennon, Crit. Rev. Oral. Biol. Med. 9: 415-448 (1998). Det kan således benyttes et isolert a-Gal A-preparat hvor en høy prosentdel av oligosakkaridene er negativt ladet, primært ved tilsetning av ett til fire sialsyreresiduer på komplekse glykaner, ett eller to fosfatenheter på høyt mannoseholdige glykaner, eller ett enkelt fosfat og en enkelt sialsyre på hybride glykaner. Mindre mengder sulfaterte komplekse glykaner kan også foreligge. En høy andel ladede strukturer tjener to hovedfunksjoner. For det første vil en avkapping av nestsiste galaktoseresiduer med 2,3- eller 2,6-bundet sialsyre forebygge en for tidlig fjerning fra sirkulasjonen ved innvirkning av asialoglykoproteinreseptor som foreligger på hepatocytter. Denne reseptor gjenkjenner glykoproteiner med terminale galaktoseresiduer. En økt sirkulasjonshalveringstid av a-Gal A gir viktige målorganer såsom hjer-tet og nyren anledning til å endocytose større mengder av enzym fra plasma etter enzym infusjonen. For det andre vil nærværet av Man-6-fosfat på høyt mannoseholdige eller hybride glykaner muliggjøre et reseptormediert opptak via kation-uavhengig Man-6-fosfatreseptor (CI-MPR). Dette reseptomedierte opptak finner sted på overflaten av mange celler, bl.a. vaskulære endotelceller, som er et viktig opphopningssted for CTH i pasienter med Fabrys sykdom. Enzymmolekyler med to Man-6-fosfatresiduer har en meget større affinitet for CI-MPR enn slike med ett enkelt Man-6-fosfat. Representative glykanstrukturer vises i tabell 1. N-glykoproteinbiosyntese omfatter flere enzymer, glykosyltransferaser og glykosidaser. Hovedparten av disse enzymer virker i endoplasmatisk retikulum (ER) og Golgi-apparatet på ordnet og velorganisert måte. Kompleksiteten av N-glyko-syleringen forsterkes av at forskjellige asparaginresiduer i ett og samme polypeptid kan modifiseres med forskjellige oligosakkaridstrutkurer, og forskjellige proteiner skiller seg fra hverandre ved egenskapene av sine karbohydratenheter. Nylige fremskritt innen den molekylære genetikk har fremmet identifikasjonen, isolasjonen og karakteriseringen av N-glykosylasjonsgener. Som et resultat har det kommet frem informasjon om forholdet mellom N-glykosylasjon og andre cellulære funksjo-ner.

N-bundet glykoproteinprosessering i cellen starter når en oligosakkaridkjede med et Glc3Man9GlcNAc2 tilsettes til et mottakerasparagin på et vordende peptid i lumen av ER som en enkelt enhet. En fjorten sukkers oligosakkaridkjede bestående av Glc3Man9GlcNAc2 bygges opp på dolikol, en meget langkjedet alifatisk alkohol:

Dette oligosakkarid overføres som en enkelt enhet til et akseptor-asparaginresiduum på en vordende peptidkjede i lumen av ER. Den store størrelse av glyhkanet i forhold til peptidet kan styre proteinfoldingen. De tre glukoseresiduer tjener som signal for at oligosakkaridet er fullstendig og klart for overføring ved hjelp av oligosakkaryltransferase. Dette enzym vil også overføre ikke-glukosylerte oligosakkarider, men bare med en brøkdel av raten for den fullførte kjede, fordi dette er suboptimale substrater. Én form for karbohydratmanglende glykoprotein-syndrom har vist seg å forårsakes av en mangel på dolikol-P-GIc: Man9GlcNAc2-PP-dolikolglukosyltransferase, det første enzym i glukosetilsetningsbanen, hvilket fører til en hypoglykosylason av serumproteiner. Korner et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 95: 13200-13205 (1998). Etter fjerning av de tre glukoseresiduer og når den riktige konformasjon er oppnådd, eksporteres det nylig syntetiserte glykoprotein til Golgi. Avhengig av tilgjengeligheten av glykanet for Golgi-mannosidaser etter proteinfoldingen, kan glykankjeden holde seg som en høyt mannoseholdig kjede med 5-9 mannoseresiduer. Alternativt kan glykankjeden videreprosesseres til en trima-nosylkjerne og bli en mottaker for ytterligere glykosyltransferaser, som danner komplekse kjeder ved tilsetning av flere GIcNAc-residuer, fulgt av Gal, NeuAc og Fuc. En tredje mulighet, hvis proteinet har to lysinresiduer nøyaktig 34 Ångstrøm frahverandre og i det riktige romforhold til en høyt mannoseholdig kjede, er tilsetning av GlcNAca-l-P04 på karbon 6 av ett, eller iblant to, mannoseresiduer. Cuozzo era/., 3. Biol. Chem. 273: 21069-21076 (1998). Etter fjerning av det a-bundne GIcNAc med et bestemt enzym, genereres en terminal M6P-epitop som gjenkjennes av en M6P-reseptor i trans-Golgi-nettet, som deretter målretter disse enzymer mot lysosomer i celler av mesenkymt opphav.

For å målrette ot-Gal A mot så mange forskjellige vev som mulig, er det nyttig med mange forskjellige karbohydratstrukturer (glykoformer). Matsuura et al., Glycobiology 8: 329-339 (1998) beskrev at glykanstrukturene på humant a-Gal A fremstilt i CHO-celler hadde 41% høyt mannoseholdige glykaner, og at fosforylasjonsnivået var 24%. Imidlertid var mengden av sialylerte komplekse glykaner kun 11%. Dermed ble 2/3 av de komplekse kjeder ikke sialylert, hvilket fører til en rask elimine-ring av a-Gal A i leveren. a-Gal A fremstilt i de humane celler ifølge oppfinnelsen har en høyere prosentdel ladede oligosakkarider enn a-Gal A i teknikkens stand som er fremstilt i CHO-celler. F.eks. er a-Gal A fremstilt i HT-1080-celler som beskrevet heri, spesielt godt egnet, fordi a-Gal A fremstilt i HT-1080-celler inneholder ca. 15% nøytrale strukturer (høyt mannoseholdige og hybride), ca. 16% fosforylerte glykaner og ca. 67% komplekse glykaner med 2 til 4 sialsyreresiduer. dermed sialyleres i det vesentlige alle de komplekse kjeder, sammenlignet med a-Gal A fremstilt i CHO-celler. HT-1080-celle-a-Gal A har tre N-bundne glykosylasjonsse-ter. To seter prosesseres til komplekse glykaner i Golgi-apparatet, mens det tredje sete opptas av et høyt mannoseholdig glykan, hvorav 50% modifiseres ved lysosomal enzymspesifikk fosforylering for å gi både monofosforylerte og difosforylerte arter.

Fire fremgangsmåter tilveiebringes for karbohydrat-ommodellering på et protein som inneholder N-bundne glykankjeden For det første kan andelen av ladet a-Gal A økes ved selektiv isolasjon av glykoformer under renseprosessen. Forbindelser med en øket andel av høyt ladede a-Gal A-glykoformer med høyere molekylvekt kan fremskaffes ved fraksjonering av a-Gal A-artene på kromatografikolonneharpikser under og/eller etter renseprosessen. Den mer høyt ladede glykoformart av a-Gal A inneholder mer sialsyre og/eller mer fosfat, og glykoformene med høyere molekylvekt ville også inneholde de fullstendig glykosylerte, mest sterkt forgrenede og høyt ladede arter. Utvalg av de ladede arter, eller fjerning av de ikke-glykosylerte, dårlig glykosylerte eller dårlig sialylerte og/eller fosforylerte a-Gal A-arter ville føre til en populasjon av ot-Gal A-glykoformer med mer sialsyre og/eller mer fosfat, hvilket ville gi et ot-Gal A-preparat med lengre halveringstid og potensielt bedre terapeutisk virkning.

Fraksjoneringsprosessen kan utføres på egnede kromatografiske kolonneharpikser som brukes for å rense eller isolere a-Gal A. F.eks. kan en frakjsonering utføres på kationbytteharpikser (såsom SP-"Sepharose"), anionbytteharpikser (Q-"Sepharose"), affinitetsharpikser (Heparin-"Sepharose", lektinkolonner), størrelses-eksklusjonskolonner ("Superdex" 200) og hydrofobe vekselvirkningskolonner (butyl-"sepharose") og andre kromatografiske kolonneharpikser som er kjent innen faget.

Fordi a-Gal A produseres i celler som en heterogen blanding av glykoformer med forskjellig molekylvekt og ladning, tenderer a-Gal A til å eluere i relativt brede top-per fra kromatografiharpiksen. Under disse elueringer er glykoformene fordelt på bestemt måte avhengig av naturen av harpiksen som brukes. F.eks. vil på størrel-seseksklusjonskromatografi, de største glykoformene tendere til å elueres tidligere på elueringsprofilen enn de mindre glykoformer.

Ved ionbyttekromatografi vil de mest negativt ladede glykoformer tendere til å bindes til en positivt ladet harpiks (såsom Q-"Sepharose") med en høyere affinitet enn de mindre negativt ladede glykoformer, og vil derfor tendere til å elueres senere i elueringsprofilen. derimot kan disse høyt negativt ladede glykoformer bindes mindre svakt til en negativt ladet harpiks, såsom SP-"Sepharose", enn mindre negativt ladede arter, eller bindes eventuelt ikke i det hele tatt.

Fraksjoneringen av glykoformartene på kromatografiske harpikser kan påvirkes av pH, den ioniske styrke, valget av buffersalt, viskositet og/eller andre parametre, såsom valget av harpikstype. Bruk av forskjellige typer gradientelueringer (rettlin-jede lineære gradienter, krunnede, f.eks. eksponensielle gradienter) eller anvendelse av en rekke korte trinn-elueringer for å selektivt eluere a-Gal A-arter fra kroma-tografikolonnen, kan også optimeres for en a-Gal A-fraksjonering. Alle disse faktorer, alene eller i kombinasjon, kan optimeres for å oppnå en virksom fraksjonering av glykoformene. Fraksjonering kan også finne sted etter at renseprosessen er full-ført, på en bestemt kromatografisk harpiks som er selektivt optimert for fraksjonering og valg av den ønskede glykoformpopulasjon.

Valget av glykoformpopulasjoner fra de fraksjonerte ot-Gal A-arter kan foretas etter analyse av de eluerte a-Gal A-glykoformer. Elueringstoppen kan analyseres ved forskjellige teknikker, så som SDS-PAGE, isoelektrisk fokusering, kapillær elektroforese, analytisk ionbytte-HPLC og/eller analytisk størrelseseksklusjons-HPLC. Bestemte fraksjoner kan velges som tenderer mot den ønskede størrelse eller lad-ningsprofil. Valget kan foretas under hvert kromatografiske trinn under prosessen, hvilket muliggjør en gradvis oppnåelse av den ønskede glykoformpopulasjon, eller kan begrenses til ett eller flere bestemte trinn hvis effekten av fraksjoneringstrin-net(ene) er høy. Fraksjoneringen kan også finne sted etter at renseprosessen er fullført, på en bestemt kromatografisk harpiks som er selektivt optimert for fraksjonering og valg av den ønskede glykoformpopulasjon.

Fraksjonering og valg av glykoformer av a-Gal A med høy ladning og/eller høy molekylvekt kan utføres på hvilket som helst a-Gal A-preparat, såsom hva som erholdes fra genetisk modifiserte celler, såsom celler somer blitt modifisert ved konvensjonelle genkonstruksjonsmetoder eller ved genaktivering (GA). Det kan utføres på cellelinjer dyrket i optimerte systemer for å gi en høyere sialylering og fosforylasjon som beskrevet ovenfor, eller på PEGylert a-Gal A som skal beskrives i det følgende.

F.eks. i a-Gal A-renseprosessen som beskrives heri, kan en fraksjonering av a-Gal A-glykoformer utføres under forskjellige trinn i prosessen. På den hydrofobe harpiks butyl-"sepharose" Fast Flow, elueres de sterkest ladede a-Gal A-glykoformer først, fulgt av de mindre sterkt ladede arter. For Heparin-"Sepharose" elueres de sterkest ladede arter også først i elueringstoppen, fulgt av de mindre sterkt ladede arter. Det motsatte finner sted med Q-"Sepharose", hvor den minst sterkt ladede art elueres først, fulgt av de mest sterkt ladede glykoformer. Ved størrelseseksklu-sjonskromatografi på "Superdex" 200 elueres glykoformene med høyest molekylvekt først, fulgt av de mindre glykosylerte a-Gal A-arter med lavere molekylvekt. For å muliggjøre en effektiv fraksjonering av bestemte a-Gal A-glykoformpopulasjoner kan flere kromatografiske trinn kombineres, som alle frak-sjonerer basert på forskjellige fysiske metoder. For å f.eks. erholde a-Gal A-glykoformene som inneholder minst pl (de som har den mest negative ladning), ville en begrensning av oppsamlingen til de tidlig eluerte butylfraksjoner fremme det mer sterkt ladede a-Gal A. Idet man fortsetter med denne valgte samling på en Heparin-kolonne, og igjen begrenset oppsamlingen til de tidligere, mer sterkt negativt ladede a-Gal A-arter, økes andelen av lavt pI-a-Gal A-glykoformer i samlingen ytterligere. Ytterligere finjustering av glykoformpopulasjonen kan utføres under forskjellige trinn i renseprosessen ved å overvåke størrelses- og ladningsfordelingen av elueringssamlingene ved SDS-PAGE og isolelektrisk fokusering. Et eksempel på en fraksjonering ifølge størrelse og ladning sammenfattes i det følgende i eksempel 2.4.

Den andre fremgangsmåte ved karbohydrat-ommodellering omfatter å modifisere visse glykoformer på det rensede a-Gal A ved å feste et ytterligere terminalt sukkerresiduum ved bruk av et renset glykosyltransferase og den egnede nukleotid-sukkerdonor. Denne behandling påvirker kun slike glykoformer som har et egnet fritt terminalt sukkerresiduum for å virke som mottaker for glykosyltransferaset som skal brukes. F.eks. tilfører a2,6-sialyltransferase sialsyre i en 2,6-binding på en terminal Galpl,5GlcNAc-R-mottaker ved bruk av CMP-sialysre som nukleotid-sukkerdonor. Handelstilgjengelige enzymer og deres opphavsart omfatter: fukose-al,3-transferasene III, V og VI (humane); galaktose-al,3-transferase (porkint); galaktose-pl,4-transferase (bovint); mannose-al,2-transferase (gjær); sialsyre-a2,3-transferase (rotte) og sialsyre-a2,6-transferase (rotte). Etter at reaksjonen er fullført, kan glykosyltransferaset fjernes fra reaksjonsmediet ved hjelp av en glykosyltransferase-spesifikk affinitetskolonne bestående av det egnede nukleotid bundet til en gel via en 6-karbon-avstandsholer med en pyrofosfat (GDP, UDP)- eller fosfat (CMP)-binding, eller ved andre kromatografiske metoder som er kjent innen faget. Av de ovennevnte glykosyltransferaser, er sialyltransferasene spesielt nyttige ved modifikasjon av enzymer, såsom a-Gal A, for enzymerstatningsterapi i humane pasienter. Anvendelse av enten sialyltransferase med CMP-5-fluoresceinyl-neuraminsyre som nukleotid-sukkerdonor gir et fluorescerende merket glykoprotein hvis opptak og vevplassering lett kan overvåkes.

Den tredje fremgangsmåte ved karbohydrat-ommodellering omfatter glyko-konstruksjon, f.eks. innføring av gener som påvirker cellens glykosylasjonsmeka-nismer, av a-Gal A-produksjonscellen for å modifisere den posttranslasjonelle prosessering i Golgi-apparatet er en foretrukken fremgangsmåte.

Den fjerde fremgangsmåte ved karbohydrat-ommodellering omfatter å behandle a-Gal A med egnede glykosidaser for å nedsette antallet forskjellige glykoformer som foreligger. For eksempel vil en sekvensiell behandling av komplekse glykan-kjeder med neuraminidase, p-galaktosidase og p-heksosaminidase spalte oligosakkaridet til trimannosekjernen.

Strukturen av et N-bundet glykan er avhengig av glykankjedens tilgjengelighet for Golgi-prosesserende mannosidaser etter at proteinet har foldet seg, og nærværet i

Golgi av en familie av glykosyltransferaser og de egnede nukleotid-sukkerdonore.

Mange av glykosyltransferasene katalyserer konkurrerende reaksjoner, hvilket kan føre til at glykankjeden forlenges på flere forskjellige og kompatible måter, avhengig av hvilket enzym som reagerer først, dette fører til mikroheterogenisitet og dannelse av en kompleks familie av glykoformer. Noen strukturer er ensartede for et bestemt vev, såsom modifikasjonen av visse hypofysehormoner ved tilsetning av GalNAc-4-S04, eller er begrenset til noen få organer.

Et eksempel på sistnevnte er dannelse av et såkalt todelende GIcNAc (GIcNAc-bundet pi,4 til kjerne-p-mannoseresiduet) på komplekse glykaner av gluta-myltranspeptidase i nyren, men ikke i leveren. En todelt biantennær struktur på y-glutamyltranspeptidase vises i det følgende:

I pattedyr finnes det ansvarlige enzym, GIcNAc-transferase III (GnT-III), i visse celler i hjerne og nyre og i visse celler av leveren i pasienter med hepatokarsino-maer. GnT-III katalyserer tilsetningen av N-acetylglukosamin i pi-4-binding til det p-bundne mannose av trimannosylkjernen av N-bundne sukkerkjeder for å danne et todelende GIcNAc-residuum. Muse-, rotte- og humane gener for GnT-III er blitt klonet. Ihara et al., J. Biochem. ( Tokyo) 113: 692-698 (1993).

Nærværet av ytterligere GIcNAcT-III-aktivitet i humane celler kan føre til et hevet antall monofosforylerte hybride glykaner på bekostning av bi-, tri- og tetraanten-nære komplekse glykaner. Dette skulle ikke påvirke plasmahalveringstiden på ugunstig måte, men kan øke målrettingen mot vaskulære endotelceller. En repre-sentativ struktur vises nedenfor:

Noe ot-Gal A tas opp i nyren og fører til en betydelig nedsettelse av mengden lagret glykolipider. Fordi nyren kan danne N-glykaner med todelende GIcNAc-residuer, kan renale epitelceller gjenkjenne glykoproteiner med denne epitop med en spesielt høy spesifisitet.

En hevet GnT-III-aktivitet kan forårsake ubalanse i forgreningen på trimannosylkjernen ved å inhibere en ytterligere forgrening ved GnT-II, IV, V og Gal-pl,4-transferase på substratnivå. Nylig ble en kinesisk hamsterovarie-cellelinje (CHO-cellelinje) som hadde evnen til å danne todelte oligosakkarider på glykoproteiner, dannet ved overekspresjon av rekombinant GnT-III. Sburlati et al., Biotechnol. Progr. 14: 189-192 (1998). Interferon p (IFN-p) ble valgt som modell og potensielt terapeutisk utsondret heterologt protein som virkningen av GnT-III-ekspresjonen på produktglykosylasjonen kunne bedømmes på. IFN-p med todelte oligosakkarider ble dannet av de GnT-III-endrede CHO-celler, men ikke av den umodifiserte opp-havscellelinje.

Produksjonen av glykoproteinterapeutika krever en karakterisering av glykosylasjo-nen med hensyn til ensartetheten av batcher. Den "hypotetiske N-glykanladning Z" er blitt brukt som parameter for å kjennetegne proteinglykosylasjonen på enkel og virksom måte. Bestemmelsen av Z er blitt validert i flere repetitive eksperimenter, og viste seg å være meget nøyaktig og pålitelig. Hermentin et al., Glycobiology 6: 217-230 (1996). Den hypotetiske N-glykanladning av et gitt glykoprotein avledes fra N-glykan-kartleggingsprofilen som erholdes ved høyytelses anionbyttekromatografi (HPAEC)/pulserende amperometrisk påvisning (PAD). I HPAEC adskilles N-glykanene klart i henhold til sin ladning, dvs. deres antall sialsyreresiduer, hvilket gir klare områder fr neutrale strukturer sam for de mono-, di-, tri- og tetrasia ly leite N-glykaner. Z defineres som summen av produktene av de aktuelle områder (A) i asialo-, monosialo-, disialo-, trisialo-, tetrasialo- og pentasialoområdet, hver multi-plisert med den tilsvarende ladning:

hvor I er 0 I asialoområde, 1 I monosialo (MS)-område, 2 I disialo (DiS)-område, 3 I trisialo (TriS)-område, 4 I tetrasialo (TetraS)-område og 5 I pentasialo (PentaS)-område.

Dermed vil et glykoprotein med hovedsakelig C4-4<*->strukturer gi Z = 400, et glykoprotein som hovedsakelig bærer C2-2<*->strukturer, vil gi Z = 200, og et glykoprotein som kun bærer høyt mannoseholdig type eller avkortede strukturer, vil gi Z = 0.

Humane glykosylerte a-Gal A-preparater anvendt ifølge foreliggende oppfinnelse har en oligosakkaridladning, målt i henhold til Z-tallet, over 100, fortrinnsvis over 150 og mer foretrukket over 170.

Endring av halveringstiden av serum- g- Gal A ved fosforvlerinq

Fosforyleringen av a-Gal A kan endres for å påvirke sirkulasjonshalveringstiden av a-Gal A og mengden av a-Gal A som inntrer i celler. Fosforyleringen oppnås fortrinnsvis i cellen som uttrykker a-Gal A. Spesielt tenker man her på å erholde et glykosylert a-Gal A-preparat med økt fosforylering ved å først innføre i en a-Gal A-produserende celle, en DNA-sekvens som koder for fosforyltransferase, eller ved å innføre en regulatorisk sekvens ved homolog rekombinasjon som regulerer ekspresjonen av et endeogent fosforyltransferasegen. a-Gal A-produksjonscellen dyrkes deretter under kulturbetingelser som fører til ekspresjon av a-Gal A og fosforyltransferase. Isolasjon kan deretter utføres av a-Gal A-preparatet med økt fosforylering sammenlignet med a-Gal A fremstilt i en celle uten polynukleotidet. Slike fosforyltransferaser er velkjent innen faget. Se f.eks. US-patent 5.804.413 og 5.789.247.

En felles virkning av to membranbundne Golgi-enzmer er nødvendig for å generere enMan-6-fosfatgjenkjenningsmarkør på et lysosomalt proenzym. Det første, UDP-/V-acetylglukosamin: glykoprotein-W-acetylglukosamin-l-fosfotransferase (GIcNAc-fosfotransferase), krever en proteingjenkjennelsesbestemmer på lysosomale enzymer som består av to lysinresiduer som er nøyaktig 34 Ångstrøm fra hverandre og står i riktig romforhold til en høyt mannoseholdig kjede. Det andre, /V-acetylglukosamin-l-fosfodiester a-/V-acetylglukosaminidase (fosfodiester a-GIcNAcase), hydrolyserer a-GIcNAc-fosfatbindingen og blottlegger Man-6-fosfatgjenkjenningssetet.

I henhold til oppfinnelsen har a-Gal A-preparatene som anvendes flere glykoformer hvor mellom 16-50%, fotrinnsvis 25-50%, mer foretrukket minst 30%, av glykoformene er fosforylert.

Endringen av halveringstiden av serum- ot- Gal A ved økt sialylering

En økt sialylering av undersialylerte glykaner med terminale galaktoseresiduer kan oppnås ved transfeksjon av pattedyrceller og fortrinnsvis humane celler med sia-lyltransfera segen.

Foreliggende oppfinnelse benytter et glykosylert a-Gal A-preparat som har en økt oligosakkaridladning, fremstilt ved å først innføre et polynukleotid som koder for sialyltransferase, i en a-Gal A-produserende celle, eller å innføre en regulatorisk sekvens ved homolog rekombinasjon som regulerer ekspresjonen av et endogent sialyltransferasegen. a-Gal A-produksjonslinjen dyrkes deretter under kulturbetingelser som fører til ekspresjon av a-Gal A og sialyltransferase. Det følgende trinn består i å isolere a-Gal A-preparatet med økt oligosakkaridladning. Foretrukne sialyltransferaser omfatter a2,3-sialyltransferase og a2,6-sialyltransferase. Disse sialyltransferaser er velkjent. Se f.eks. US-patent 5.858.751.

Ved heving av sialyleringen kan det benyttes det ytterligere trinn å velge ut a-Gal A-glykoformer som har økt størrelse eller økt ladning, ved fraksjonering eller rensing av preparatet (som skal diskuteres i det følgende).

Alternativt kan sialyleringen økes ved å holde cellene i et lavt ammoniumholdig mil-jø. Spesielt erholdes et glykosylert a-Gal A-preparat med økt sialylering ved å bringe en a-Gal A-produksjonscelle i berøring med et kulturmedium som har en ammoniumkonsentrasjon under 10 mM, mer foretrukket under 2 mM. En økt sialylering kan oppnås ved perfusjon av produksjonsceller, hvorved toksiske metabolit-ter, såsom ammoniakk, periodisk fjernes fra kulturmediet. Fortrinnsvis oppnås det lavt ammoniumholdige miljø ved tilsetning av glutaminsyntetasegen eller -cDNA til produksjonscellene. Alternativt oppnås det lavt ammoniumholdige miljø ved perfusjon av a-Gal A-produksjonscellen med ferskt kulturmedium for å holde ammoniumkonsentrasjonen under 10 mM, mer foretrukket under 2 mM. Produksjonscellene kan perfuseres kontinuerlig med ferskt kulturmedium med en ammoniumkonsentrasjon under 10 mM, mer foretrukket under 2 mM. Alternativt kan produksjonscellene perfuseres tidvis med ferskt kulturmedium. En tidvis perfusjon betyr, slik det brukes heri, enten perfusjon i regelmessige, periodiske tidsintervaller eller etter at det er blitt målt at ammoniumkonsentrasjonen nærmer seg målkonsentra-sjonen (dvs. 10 mM, mer foretrukket under 2 mM). De tidvise perfusjoner bør utfø-res tilstrekkelig ofte til at ammoniumkonsentrasjonen aldri overskrider målkonsent-rasjonen. Produksjonscellene perfuseres over et tidsrom som er nødvendig for å oppnå et a-Gal A-preparat hvor mellom 50-70%, fortrinnsvis 60%, av de samlede glykaner er sialylert.

Økning av sirkulasjonshalveringstiden av serum- g- Gal A ved PEGvlerinq av g- Gal A

Sirkulasjonshalveringstiden av et humant glykosylert a-Gal A-preparat kan økes ved å kompleksere a-Gal A med polyetylenglykol. Poly(etylenglykol) (PEG) er en vannløselig polymer som når den er kovalent bundet til proteiner, endrer deres egenskaper på en måte som utvider deres potensielle anvendelsesområde. Polyety-lenglykolmodifikasjon ("PEGylering") er en veletablert teknikk som har evnen til å løse eller mildne mange av problemene med protein- og peptidfarmasøytika.

Den forbedrede farmakologiske ytelse av PEG-proteiner sammenlignet med deres umodifiserte motparter ga anledning til utvikling av denne type konjugat som terapeutisk middel. Enzymmangler hvor en terapi med det native enzym var uvirksom (grunnet en rask utskilling og/eller immunologiske reaksjoner) kan nå behandles med tilsvarende PEG-enzymer. F.eks. har PEG-adenosindeaminase allerede fått en FDA-godkjenning. Delgado et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 9: 249-304

(1992).

Den kovalente binding av PEG til a-galaktosidase fra grønne kaffebønner endrer de katalytiske egenskaper av enzymet ved å maskere bestemte determinantseter på molekylet. Dette fører til en økt Km-verdi og nedsatt Vmaks-verdi mot p-nitrofenylsubstratanaloger. Wieder & Davis, J. Appl. Biochem. 5: 337-347 (1983). a-Galaktosidase kunne fortsatt spalte terminale galaktoseresiduer fra huma spytt - blodgruppe-substans B. Antistoffbindingen og denne lektinspesifikke binding var tapt i PEG-a-galaktosidase. Antistoffer generert fra nativt a-galaktosidase kan blok-kere enzymaktiviteten, og denne inhibering går gradvis tapt når man tester mot preparater av enzymet med progressivt større mengder PEG. Antisera fra dyr som var blitt immunisert med PEG-a-galaktosidase, inhiberte derimot ikke enzymaktiviteten i noe a-galaktosidase- eller PEG-a-galaktosidasepreparat. Disse resultater tyder på at PEG tenderer til å dekke over lektinspesifikke karbohydratenheter og an-tigendeterminanter, og at disse seter sannsynligvis holdes kryptiske under in vivo-prosesseringen av PEG-enzymer.

En kovalent binding av PEG til proteiner krever en aktivering av den hydroksylter-minale gruppe av polymeren med en egnet utgående gruppe som kan løsnes ved et nukleofilt angrep av e-a m i note rm i na I av lysin og a-aminogruppe av N-terminus. Flere kjemiske grupper er blitt utnyttet for å aktivere PEG. For hver bestemte anvendelse gir forskjellige koblingsmetoder bestemte fordeler. Forskjellige PEGyleringsmetoder har en overraskende og dramatisk innvirkning på fakorer såsom re-tensjon av bioaktiviteten, stabiliteten og immunogenisiteten av de dannede PEGylerte proteiner og peptider. Francis et al., Int. J. Hematol. 68 ( 1) : 1-18 (1998). F.eks. binder en bindemiddelløs PEGyleringsteknikk kun PEG til målmolekylet. Nærmere bestemt vil anvendelse av en biologisk optimert PEGyleringsteknikk ved bruk av tresylmonometoksy-PEG (TMPEG) på forskjellige målproteiner, slik det beskrives av Francis et al., Int. J. Hematol. 68 ( 1) : 1-18 (1998) gi en eksepsjonell evne til å konservere den biologiske aktivitet av målet. Dette, og fordelen ved å ikke tilsette noe annet enn PEG (som har vist seg å være sikker i bruk i humante-rapeutika) til proteinet, gjør metoden ideell for modifikasjon av a-Gal A.

Fire mulige seter for kobling av PEG til proteiner er (1) aminogruppene (N-terminus og lysin); (2) karboksylgrupper (asparaginsyre og glutamsyre); (3) sulfn-hydrylgrupper (cystein); og (4) karbohydratgrupper (aldehyder generert etter per-jodatbehandling). Kobling til karboksylgruppene av proteiner og til aldehydgrupper på karbohydrater krever et PEG-reagensmiddel med en nukleofil aminogruppe. Denne kjemi endrer pl av a-Gal A etter at de negativt ladede karboksylgrupper bindes av PEG. Endringer i pl kan påvirke den biologiske aktivitet av a-Gal A. Videre kan en kobling av PEG til karbohydratkjedene påvirke M6P-reseptors opptak av a-Gal A, hvilket er kritisk for en biologisk aktivitet. Sulfhydrylkjemien påvirker også den fysiske struktur av molekylet, og anbefales ikke.

Vanlige brukte PEGyleringsmetoder danner en amidbinding mellom aminogruppene av et protein og metoksygruppen på monometoksy-PEG. NHS-PEG er handelstilgjengelig, og fører til en amidbinding mellom proteinet og PEG. Imidlertid endrer amidbindingsdannelser pl-verdien grunnet tap av den positive ladning av -NH2-gruppen.

En fremgangsmåte for å koble PEG til a-Gal A uten å påvirke dets pl, benytter seg av tresyl-PEG. Tresyl-PEG kobler seg via aminogrupper og danner et stabilt sekun-dært amin. Sekundære aminer har den fordel at de bevarer den positive ladning av aminogruppen. Tresyl-PEG-reagensmiddel er handelstilgjengelig og er stabilt som et lyofilisert og tørket pulver. Tresyl-PEG er blitt grundig kjennetegnet, og reaksjonen og biproduktene er godt forstått. Følgelig komplekseres i en foretrukken utfø-relse a-Gal A-preparatet ved bruk av tresylmonometoksy-PEG (TMPEG) for å danne et PEGylert ot-Gal A. Det PEGylerte ot-Gal A renses deretter for å gi et islert, PEGylert ot-Gal A.

a-Gal A inneholder 18 aminogrupper, nemlig 17 e-aminogrupper (lysin) og én a-aminogruppe (N-terminus). Reaksjonen kan reguleres til å danne a-Gal A med minimale substitusjoner, og deretter kan molekyler med ett PEG pr. molekyl, eller et midlere gjennomsnittlig antall PEG pr. molekyl, renses fra de usubstituerte og mul-tippelt substituerte former. Multiple substitusjoner på a-Gal A endrer kanske ikke vesentlig den biologiske aktivitet, og derfor kan sluttproduktet bestå av en heterogen blanding av ett til 18 bundne PEG-molekyuler. Substitusjonsgraden vil avhenge av nivået av bevart enzymatisk aktivitet. Det bør bemerkes at en nedsatt enzymatisk aktivitet kan gjøres opp av en forsterket terapeutisk virkning som skyldes en forlenget sirkulasjonshalveringstid og nedsatt immungjenkjenning av a-Gal A. Dermed bør forholdet av PEG og a-Gal A under utvikling av et PEG-a-Gal A-produkt avhnge av den biologiske aktivitet, og ikke utelukkende av den enzymatiske aktivitet.

PEGyleringsreaksjonen krever en regulert pH, buffersammensetning og proteinkon-sentrasjon. Riktige reaksjonsbetingelser kan oppnås ved hjelp av et ultrafiltra-sjons/diafiltrasjonstrinn, som brukes idag under fremstillingen. Umiddelbart før reaksjonen, løseliggjøres tresyl-PEG raskt i vann under kontinuerlig omrøring. Denne oppløsning tilsettes deretter til det fremstilte a-Gal A og får reagere over et regulert tidsrom og ved en regulert temperatur (f.eks. 2 timer ved 250°C). PEGylering kan finne sted før den endelige renseprosess, hvilket vil gjøre det unødvendig å føye flere trinn til renseprosessen. Etter at koblingen er fullført, prosesseres PEG-a-Gal A ved de gjenværende trinn av renseprosessen. Å utføre reaksjonen før Q-kolonnen (anionbytte) gjør det mulig med to rensetrinn for å fjerne reaksjonsbiproduktene. Fordi PEG ikke inneholder noen negativ ladning, vil det ikke holdes fast av Q-"Sepharose", og vil elueres i det tomme volum.

Graden av PEGylering kan måles ved kjente teknikker. F.eks. fluorescerer fluresca-min når det bindes til a-amino- og e-aminogrupper av proteiner. Prosentdelen tapt fluorescens etter PEGyleringen korrelerer med prosentdelen PEG som er bundet til ot-Gal A. Pierce's BCA-assay for samlet protein kan brukes for å bestemme proteinkonsentrasjonen. Metylumbelliferyl-ot-D-galaktopyranosid (4-MUF-g<->Gal)-aktivitets-assayet brukes for å bedømme virkningen på PEG-ot-Gal A-enzymatisk aktivitet. a-Gal A inneholder M6P, som er nødvendig for opptaket i lysosomer. Hvis PEG for-styrrer M6P-reseptorgjenkjenningen, kan dette påvises ved bruk av et cellebasert assay for å overvåke det cellulære opptak av PEG-a-Gal A i lysosomer.

Fremgangsmåter ved administrasjon av g- Gal A- preparater

De aktuelle fremstilte sammensetninger (dvs. omfattende forskjellige a-Gal A-glykoformer) kan administreres ved oral rute. Det rensede a-Gal A-preparat kan administreres til individer som daner utilstrekkelig eller defekt a-Gal A-protein, eller som kan ha nytte av en a-Gal A-terapi.

Mengden av protein som skal leveres, kan bestemmes ved faktorer som det ligger innen den behandlende leges skjønn å kunne bedømme. Videre er fagmannen kjent med at doseringen av et terapeutisk protein kan varieres for en gitt pasient inntil det oppnås et terapeutisk doseringsnivå.

Farmasøytisk formulering av g- Gal A- protein

De aktuelle orale formuleringer som benyttes av et g-Gal A-preparat er i det vesentlige er frie for ikke-g-Gal A-proteiner, såsom albumin, ikke-g-Gal A-proteiner produsert i vertcellen eller proteiner isolert fra dyrevev eller -væske.

For lyofilisering av g-Gal A-preparater, kan proteinkonsentrasjonen være 0,1-10 mg/ml. Bulkstoffer, såsom glycin, mannitol, albumin og dekstran, kan tilsettes til lyofiliseringsblandingen. I tillegg kan mulige kryobeskyttelsesmidler, såsom disak-karider, aminosyrer og PEG, tilsettes til lyofiliseringsblandingen. Hvilke som helst av de ovennevnte buffere, eksipienser og rensemidler kan også tilsettes.

De følgende eksempler presenteres for å illustrere de foretrukne utførelser av oppfinnelsen i større detalj.

Eksempel 1 Fremstilling og bruk av konstrukter utformet for å levere og

uttrykke ot-Gal A

To ekspresjonsplasmider, pXAG-16 og pXAG-28, ble konstruert. Disse plasmider inneholder humant a-Gal A-cDNA som koder for de 398 aminosyrer av a-Gal A-enzym (uten a-Gal A-signalpeptid); humant veksthormon (hGH)-signalpeptid-genomisk DNA-sekvens, som avbrytes av det første intron av hGH-gen; og 3'-utranslatert sekvens (UTS) av hGH-gen, som inneholder et signal for polyadeny-lasjon. Plasmid-pXAG-16 har human cytomegalovirus-umiddelbar-tidlig (CMV IE)-promoter og første intron (flankert av ikke-kodende ekson-sekvenser), mens pXAG-28 drives av kollagen Ia2-promoter og ekson 1, og også inneholder p-aktin-genets 5'-UTS, som inneholder det første intron av p-aktin-gen.

1. 1 Kloning av den fullstendige a- Gal A- cDNA, og konstruksjon av a- Gal A-ekspresjonsplasmidet pXAG- 16

Humant a-Gal A-cDNA ble klonet fra en human fibroblast-cDNA-samling som ble konstruert som følger. Poly-A<+->mRNA ble isolert fra det samlede RNA, og cDNA-syntese ble utført ved bruk av reagensmidler for lambda-"ZapII"-systemet i henhold til produsentens anvisninger (Stratagene Inc., LaJolla, CA). Først ble "første kjede"-cDNA generert ved revers transkripsjon i nærvær av en oligo-dT-primer som inneholdt en intern Xhol-restriksjonsendonukleasestilling. Etter behandling med RNase H, ble cDNA "nick"-translatert med DNA-polymerase I for å generere dob-beltkjedet cDNA. Dette cDNA ble buttgjort med T4-DNA-polymerase og ligert til EcoRI-adaptorer. Produktene av denne ligering ble behandlet med T4-DNA-kinase og spaltet med Xhol. cDNA'et ble frasjonert ved "Sephacryl"-400-kromatografi. Store og middels store fraksjoner ble samlet, og cDNa'ene ble ligert md EcoRI- og Xhol-spaltede Lamda ZapII-armer. Produktene av denne ligering ble deretter for-pakket og titrert. Den primære samling hadde en titer på 1,2 x IO<7> pfu/ml og en midlere innføyningsstørrelse på 925 bp.

En 210 bp probe fra ekson 7 av humant a-Gal A-gen (fig. 1, SEKV. ID NR: 1) ble brukt for å isolere cDNa. Proben ble i og for seg isolert fra genomisk DNA ved po-lymerasekjedereaksjon (PCR) ved bruk av de følgende oligonukleotider: 5'-CTGGGCTGTAGCTATGATAAAC-3' (Oligo 1; SEKV. ID NR: 6) og 5'-TCTAGCTGAAGCAAAACAGTG-31 (Oligo 2; SEKV. ID NR: 7). PCR-produktet ble deretter brukt for å teste fibroblast-cDNA-samlingen, og positive kloner ble isolert og karakterisert nærmere. Én positiv klon, fag 3A, ble underkastet utskjæ-ringsprotokollen med lambda "ZapII"-systemet (Stratagene, Inc., La Jolla, CA) i henhold til produsentens anvisninger. Denne prosedyre gav plasmid pBSAG3A, som inneholder ot-Gal A-cDNA-sekvensen i "pBluescriptSK"-plasmid-grunnstrukturen. DNA-sekvensiering viste at dette plasmid ikke inneholdt den fullstendige 5'-ende av cDNA-sekvensen. Derfor ble 5'-ende rekonstruert ved bruk av et PCR-fragment som var amplifisert fra humant genomisk DNA. For å oppnå dette ble et 268 bp genomisk DNA-fragment (fig. 2, SEKV. ID NR: 2) amplifisert ved bruk av de følgende oligonukleotider: 5'-ATTGGTCCGCCCCTGAGGT-3' (Oligo 3; SEKV. ID NR: 8) og 5'-TGATGCAGGAATCTGGCTCT-3' (Oligo 4; SEKV. ID NR: 9). Dette fragment ble delklonet inn i en "TA"-kloningsplasmid (Invitrogen Corp., San Diego, CA) for å generere plasmidet pTAAGEI. Plasmidet pBSAG3A, som inneholder hovedparten av a-Gal A-cDNA-sekvensen, og pTAAGEI, som inneholder 5'-ende av a-Gal A-cDNA, ble begge spaltet med SacII og Ncol. Posisjonene av de relevante SacII- og Ned-seter i det amplifiserte DNA-fragment vises på fig. 2. Det 0,2 kb lange SacII-NcoI-fragment fra pTAAGEI ble isolert og ligert med pBSAG3A som var blitt spaltet på same måte. Dette plasmid, pAGAL, inneholder den fullstendige a-Gal A-cDNA-sekvens, også omfattende sekvensen som koder for a-Gal A-signalpeptidet. cDNA'et ble sekvensiert fullstendig (vist på fig. 3, omfatende a-Gal A-signalpeptidet; SEKV. ID NR: 3) og viste seg å være identisk med den publiserte sekvens for humant a-Gal A-cDNA (Genbank-sekvens HUMGALA).

Plasmidet pXAG-16 ble konstruert via flere mellomprodukter, som følger. Først ble pAGAL spaltet med SacII og Xhol, og endene ble gjort butte. Dernest ble endene av det fullstendige a-Gal A-cDNA ligert md Xbal-bindeledd og delklonet inn i Xbal-spaltet pEF-BOS (Mizushima era/., Nucl. Acids Res. 18: 5322, 1990), hvilket gav pXAG-1. Dette konstrukt inneholder human granulocytt-kolonistimulerende faktor (G-CSF)-3'-UTS og human forlengelsesfaktor la (EF-la)-promoter som flankerer cDNA som koder for a-Gal A plus a-Gal A-signalpeptidet, slik at 5'-ende av a-Gal A-cDNA er kondensert med EF-la-promoter. For å danne et konstrukt med CMV-IE-promoter og første intron, ble a-Gal A-cDNA og G-CSF-3'-UTS fjernet ra pXAG-1 som et 2 kb langt Xbal-BamHI-fragment. Fragmentets ender ble gjort butte, ligert med BamHI-bindeledd og innføyd i BamHI-spaltet pCMVflpNeo (som ble konstruert slik det skal beskrives i det følgende). Orienteringen var slik at 5'-ende av a-Gal A-cDNA ble sammensmeltet med CMV-IE-promoterområde.

pCMVflpNeo ble fremstilt som føler. Et CMV-IE-genpromoterfragment ble amplifisert ved PCR ved bruk av CMV-genomisk DNA som sjablone og oligonukleotidene: 5'-TTTTGGATCCCTCGAGGACATTGATTATTGACTAG-3' (SEKV. ID NR: 10) og 5'-

TTTTGGATCCCGTGTCAAGGACGGTGAC-3' (SEKV. ID NR: 11). Det dannede produkt (et 1,6 kb langt fragment) ble spaltet med BamHI, hvilket gav et CMV-promoter-holdig fragment med kohesive BamHI-spaltede ender, neo-ekspresjonsenheten ble isolert fra plasmidet pMClneopA (Stratagene Inc., La Jolla, CA) som et 1,1 kb Xhol-BamHI-fragment. Det CMV-promoterholdige fragment og neo-fragmentet ble inn-føyd i et BamHI-, Xhol-spaltet plasmid (pUC12). Spesielt inneholder pCMVflpNeo CMV-IE-promoterområde, startende ved nukleotid 546 og sluttende ved nukleotid 2105 (av Genbank-sekvensen HS5MIEP), og neomycin-resistensgen drevet av her-pes simplex-virus (HSV)-tymidinkinase-promoter (TKneo-gen) umiddelbart i 5'-retning for CMV-IE-promoterfragment. Transkripsjonsretningen av neo-genet er det samme som for CMV-promoterfragment. Dette mellomkonstrukt ble kalt pXAG-4.

For å tilsette hGH-3'-UTS, ble GCSF-3'-UTS fjernet fra pXAG-4 som et Xbal-Smal-fragment, og endene av pXAG-4 ble gjort butte. hGH-3'-UTS ble fjernet fra pXGH5 (Seiden et al., Mol. Cell. Biol. 6: 3173-3179, 1986) som et 0,6 kb Smal-EcoRI-fragment. Etter at endene av dette fragment var blitt gjort butte, ble det liert inn i pXAG-4 umiddelbart etter det butt-endede Xbal-sete av pXAG-4. Dette mellomprodukt ble benevnt pXAG-7. TKneo-fragmentet ble fjernet fra denne plasmid som et Hindlll-Clal-fragment, og endene av plasmidet ble gjort butte ved "innfylling" med Klenow-fragment av DNA-polymerase I. Et neomycin-resistensgen drevet av SV40-tidlig promoter ble ligert inn som et buttgjort Clal-BsmBI-fragment fra et spalt-ningsprodukt av pcDNeo (Chen et al., Mol. Cell. Biol. 7: 2745-2752, 1987), hvilket plasserte neo-transkripsjonsenheten i samme orientering som ot-Gal A-transkripsjonsenheten. Dette mellomprodukt ble benevnt pXAG-13.

For å fullføre pXAG-16, som har den 26 aminosyrer lange hGH-signalpeptid-kodende sekvens og første intron av hGH-gen, ble først et 2,0 kb EcoRI-BamHI-fragment fra pXAG-13 fjernet. Dette fragment omfattet ot-Gal A-cDNA og hGH-3'-UTS. Dette store fragment ble erstattet med 3 fragmenter. Det første fragment bestod av et 0,3 kb PCR-produkt av pXGH5, som inneholder hGH-signalpeptid-kodende sekvens og omfatter hGH-første intron-sekvens, fra et syntetisk BamHI-sete plassert rett oppstrøms for Kozak-konsenssekvensen mot enden av hGH-signalpeptid-kodende sekvens. De følgende oligonukleotider ble brukt for å amplifisere dette fragment (fragment 1): 51 -TTTTGGATCCACCATGGCTA-3' (Oligo HGH101; SEKV. ID NR: 12) og 51 -TTTTG CCGGC ACTGCCCTCTTG A A- 3' (Oligo HGH102; SEKV. ID NR: 13). Det andre fragment bestod av et 0,27 kb PCR-produkt som inneholdt sekvenser som tilsvarte starten av cDNA som kodet for det 398 aminosyrer lange a-Gal A-enzym (dvs. som manglet a-Gal A-signalpeptidet) til Nhal-sete. De følgen-de oligonukleotider ble brukt for å amplifisere dette fragment (fragment 2): 5'-TTTTCAGCTGGACAATGGATTGGC-3' (Oligo AG10; SEKV. ID NR: 14) og 5'-TTTTGCTAGCTGGCGAATCC-3' (Oligo AG11; SEKV. ID NR: 15). Det tredje fragment bestod av Nhel-EcoRI-fragment av pXAG-7 som inneholdt resten av a-Gal A-sekvensen samt hGH-3'-UTS (fragment 3).

Fragment 1 (spaltet med BamHI og Nael), fragment 2 (spaltet med PvuII og Nhel) og fragment 3 ble blandet med det 6,5 kb lange BamHI-EcoRI-fragment av pXAG-13 som inneholdt neo-gen og CMV-IE-promoter, og ligert sammen for å generere plasmidet pXAG-16 (fig. 4).

1. 2 Konstruksjon av a- Gal A- ekspresjonsplasmidet pXAG- 28

Human kollagen-Ia2-promoter ble isolert for bruk i a-Gal A-ekspresjonskonstruktet pXAG-28 som følger. Et 408 bp langt PCR-fragment av humant genomisk DNA som inneholdt deler av human kollagen-Ia2-promoter, ble islert ved bruk av de følgende oligonukleotider:

Dette fragment ble brukt til å teste en human leukocyttsamling i EMBL3 (Clontech Inc., Palo Alto, CA). Én positiv klon (fag 7H) som inneholdt et 3,8 kb EcoRI-fragment, ble isolert og klonet inn i pBSIISK<+> (Stratagene Inc., La Jolla, CA) i EcoRI-sete (under spaltning av pBS/7H.2). Et Avrll-sete ble innført i pBSIISK<+> ved å spalte med Spel, som spalter innen pBSIISK<+->polybindeleddet, "innfylling" med Klenow-fragmentet av DNA-polymerase I og innføye oligonukleotidet 5'-CTAGTCCTAGGA-3' (SEKV. ID NR: 18). Denne variant av pBSIISK<+> ble spaltet med BamHI og Avrll og ligert til det 121 bp lange BamHI-Avrll-fragment av det opprin-nelig 408 bp lange kollagen-Ia2-promoter-PCR-fragment som ble beskrevet ovenfor, hvilket gav pBS/121COL6.

Plasmidet pBS/121COL.6 ble spaltet med Xbal, som spalter innen pBSIISK<+->polybindeleddssekvensen, "innfylt" med Klenow-fragmentet av DNA-polymerase I og spaltet med Avrll. Det 3,8 kb lange BamHI-Avrll-fragment av pBS/7H.2 ble isolert, og BamHI-setets ender ble buttgjort ved behandling med Klenow-enzym. Fragmentet ble deretter spaltet med Avrll og ligert til Avrll-spaltet vektor, hvilket gav kollagen-promoterplasmid pBS/121bpCOL7H.18.

Deretter ble kollagen-promoteren kombinert med 5'-UTS av humant p-aktin-gen, som inneholder det første intron av humant p-aktin-gen. For å isolere denne sekvens ble et 2 kb langt PCR-fragment isolert fra humant genomisk DNA ved bruk av de følgende oligonukleotider:

Dette fragment ble spaltet med bamHI og BsiHKAI forå frigi et 0,8 kb fragment som inneholdt p-aktin-5'-UTS og intron. Et 3,6 kb Sall-Srfl-fragment ble deretter isolert fra kollagenpromoterplasmidet pBS/121bpCOL7H.18 som følger. pBS/121bpCOL7H.18 ble delvis spaltet med BamHI (BamHI-setet ligger i 5'-ende av av kollagen-Ia2-promoterfragment), endene ble gjort butte ved behandling med Klenow-fragmentet, og det hele ble ligert til et Sall-bindeledd (5'-GGTCGACC-3'); hvorved man plasserte et Sall-sete oppstrøms for kollagen-Iot2-promoter. Dette plasmid ble deretter spaltet med Sali og SrfI (Srfl-setet ligger 110 bp oppstrøms for kollagen-Iot2-promoter-CAP-sete), og det 3,6 kb lange fragment ble isolert. Det 0,8 hhv. 3,6 kb lange fragment ble slått sammen med Sali- og BamHI-spaltet pBSIISK" (Stratagene Inc., La Jolla, CA), og et fragment bestående av de følgende fire oligonukleotider ble ligert (hvorved det dannes et fragment med en butt ende og en BsiHKAI-ende):

Disse fire oligonukleotider tilsvarer, når de er ligert, området startende ved Srfl-sete av kollagenpromoter og fortsettende forbi BsiHKAI-sete av p-aktinpromoter. Det dannede plasmid ble benevnt pCOL/p-aktin.

For å fullføre konstruksjonen av pXAG-28 ble Sall-BamHI-fragmentet av pCOL/p-aktin, som inneholdt kollagen-Ia2-promoter og p-aktin-5'-UTS, isolert. Dette fragment ble ligert med to fragmenter fra pXAG-16 (se eksempel 1.1 og fig. 4): (1) det 6,0 kb lange BamHI-fragment (inneholdende neo-genet, plasmidgrunnstrukturen, cDNA som kodet for den 398 lange aminosyre a-Gal A-enzym, og hGH-3'-UTS); og (2) 0,3 kb BamHI-XhoI-fragment (som inneholder SV40-poly-A-sekvensen fra pcDneo). pXAG-28 inneholder human kollagen-Ia2-promoter kondensert til humant f}-aktin-5'-UTS, hGH-signalpeptidet (som avbrytes av hGH-første intron), cDNA som koder for a-Gal A-enzm, og hGH-3'-UTS. Et kart over det fullstendige ekspresjonskonstrukt pXAG-28 vises på fig. 5.

1. 3 Transfeksjon og seleksjon av fibroblaster som er blitt elektroporert med or Gal A- ekspresjonsplasmider

For å uttrykke a-Gal A i fibroblaster, ble sekundære fibroblaster dyrket og transfisert i henhold til publiserte prosedyrer (Seiden eta/., WO 93/09222).

Plasmidene pXAG-13, pXAG-16 og pXAG-28 ble transfisert ved elektroporasjon i humane forhud-fibroblaster for å generere stabilt transfiserte klonale cellestammer, og de resulterende a-Gal A-ekspresjonsnivåer ble overvåket som beskrevet i eksempel 1.4. Utsondringen av a-Gal A fra normale forhud-fibroblaster er i området 2-10 enheter/10<6> celler/24 timer. Derimot oppviste de transfiserte fibroblaster de midlere ekspresjonsnivåer som oppgis i tabell 2.

Denne data viser at alle tre ekspresjonskonstrukter har evnen å øke a-Gal A-ekspresjonen til det mangfoldige sammenlignet med ikke-transfiserte fibroblaster. Ekspresjonen i fibroblaster som var blitt stabilt transfisert me pXAG-13, som koder for a-Gal A bundet til a-Gal A-signalpeptidet, var vesentlig lavere enn espresjonen i fibroblaster som var blitt transfisert med pXAG-16, som kun skiller seg i at signalpeptidet er hGH-signalpeptidet, hvis kodende sekvens avbrytes av det første intron av hGH-gen.

Hver gang de transfiserte celler ble passert, ble den utsondrede a-Gal A-aktivitet bestemt, cellene ble telt, og celletettheten ble beregnet. Pa grunnlag av antallet celler som ble samlet, og tiden som sto til rådighet for utsondring av a-Gal A, ble den spesifikke ekspresjonsrate av a-Gal A bestemt, og oppgis i tabellene 3 og 4 som utsondrede enheter (av a-Gal A) pr. IO<6> celler pr. 24 timer. Cellestammer som var ønskelige for genterapi eller for bruk ved generering av materiale for isolasjon av a-Gal A, bør oppvise en stabil vekst og ekpresjon over flere passasjer. Data fra cellestammene som vises i tabellene 3 og 4, som var stabilt transfisert med a-Gal A-ekspresjonskonstruktet pXAG-16, illustrerer det faktum at a-Gal A-ekspresjonen holdes stabil under seriell passasje.

1. 4 Kvantifisering av a- Gal A- ekspresjonen

Akiviteten av ot-Gal A-aktiviteten ble mål ved bruk av det vannløselige substrat 4-metylumbelliferyl-a-D-galaktopyranosid (4-MUF-gal; Research Products, Inc.) ved en modifikasjon av protokollen som beskrives av Ioannou et al., J. Cell Biol. 119: 1137-1150 (1992). Substratet ble løst opp i substratbuffer (0,1 M eit rat/fosfat, pH 4,6) til en konsentrasjon på 1,69 mg/ml (5 mM). Typisk ble 10 ml kultur-supernatant tilsatt til 75 ml av substratoppløsningen. Rørene ble dekket til og fikk inkubere i et 37°C vannbad i 60 minutter. I slutten av inkubasjonsperioden ble 2 ml glycin/karbonat-buffer (130 mM glycin, 83 mM natriumkarbonat, pH 10,6) brukt for å stanse reaksjonen. Den relative fluorescens av hver prøve ble målt ved bruk av et fluorometer, modell TK0100 (Hoefer Scientific Instrument), som har en fast eksita-sjonsbølgelengde på 365 nm og påviser en fast emisjonsbølgelengde på 460 nm. Avlesningene fra prøvene ble sammenlignet med standarder fremstilt fra en 1 mM stamoppløsning av metylumbelliferon (Sigma Chemical Co.), og mengden av hydrolysert substrat ble beregnet. Aktiviteten av a-Gal A uttrykkes i enheter; én enhet a-Gal A-aktivitet er likeverdig med én nanomol substrat hydrolysert pr. time vd 37°C. Celleekspresjonsdataen ble generelt uttrykt som enheter a-Gal A-aktivitet utsondret/10<6> celler/24 timer. Dette assay ble også brukt til å måle mengden a-Gal A-aktivitet i cellelysater og i prøver fra forskjellige a-Gal A-rensetrinn, slik det skal beskrives i det følgende.

1. 5 Fremstilling av gen- aktivert o- Gal A ( GA- GAL)

Produksjon av gen-aktivert a-Gal A (GA-GAL) fant sted ved innføyelse av regulatoriske og strukturelle DNA-sekvenser oppstrøms for human a-Gal A-kodende sekvens, ved bruk av GA-teknologi i det vesentlige som beskrevet i US-patent

5.733.761. Den nøyaktige innføring av den genaktiverende sekvens finner sted som et resultat av en homolog rekombinasjon mellom DNA som foreligger på et transfisert DNA-fragment, og genomiske DNA-sekvenser oppstrøms for a-Gal A-lokus i en human celle. Den genaktiverende sekvens i og for seg inneholder a-Gal A-kodende sekvens opptil, men ikke inklusive signalpeptid-spaltningssetet. Celler som inneholder et aktivert a-Gal A-lokus, ble isolert og underkastet legemiddelseleksjon for å isolere celler med hevet GA-GAL-produksjon.

Et målrettende DNA-fragment som inneholdt en egnet genaktiverende sekvens, ble innført i humane vertcellelinjer ved elektroporasjon. Én slik cellelinje er HT-1080, en sertifisert cellelinje som er tilgjengelig fra ATCC (Rockville, Maryland). Genakti-veringsplasmidet (målrettingskonstruktet) pGA213C som inneholder et slikt DNA-fragment, vises på fig. 9. Dette plasmid inneholder sekvenser som er utviklet til å aktivere en del av den endogene a-Gal A-lokus i vertcellelinjen, og inneholder sekvenser som koder for signalpeptidet, men ikke humant a-Gal A. Målrettingskonstruktet inneholder også ekspresjonskassetter for bakterielt neo- og muse-cf/7fr-gen. Disse muliggjør en seleksjon av stabilt integrerte målrettingsfragmenter (via neo-genet) og en påfølgende seleksjon av dhfr- genet ved bruk av trinnvis metotreksat (MTX)-seleksjon.

I tillegg inneholder pGA213C sekvenser utviklet for å målrette kromosomale sekvenser oppstrøms for endogen a-Gal A-lokus ved homolog rekombinasjon. Homolog rekombinasjon mellom endogen a-Gal A-lokus og det 9,6 kb lange DNA-fragment av pGA213C vises på fig. 10.

pGA213C ble konstruert for å slette 962 bp av genomiske sekvenser som strakk seg fra posisjonene -1183 til -222 i forhold til metionin-initieringskodonet av a-Gal A, etter homolog rekombinasjon av pGA213C-fragmentet med X-kromosomal a-Gal A-lokus. Transkripsjonen aktivering av a-Gal A-lokus finner sted ved nøyaktig målretting av de eksogene regulatoriske sekvenser oppstrøms for a-Gal A-kodende parti. Den dannede GA-GAL-lokus gjør at transkripsjonen initieres fra CMV-promoter og fortsetter forbi CMV-ekson 1, aldolase-inron og de syv eksoner og seks introner av a-Gal A-kodende sekvens. Skjøting av det store forløper-mRNA føyer sammen eksogent CMV-ekson (innføyd ved målretting) med det fullstendige endogene første ekson av a-Gal A-transkriptet. En translasjon av GA-GAL-mRNA fører til pre-GA-GAL med et 31 aminosyrers signalpeptid. Etter utsondring fra vertcellen,

fjernes signalpeptidet. Riktig målrettede cellelinjer identifiseres først ved polymera-sekjedereaksjonstesting for nærvær av GA-GAL-mRNA. Kloner som produserer GA-GAL-mRNA, viser seg også å utsondre enzymatisk aktivt a-Gal A i kulturmediet. En senere bekreftelse av målrettingshendelsene utføres ved restriksjonsenzym-spaltning og "southern blot"-hybridiseringsanalyse av genomisk DNA.

Cellene ble underkastet et trinnvis utvalg med metotreksat ("MTX"). Etter utvalg i 0,05 jiM MTX, ble en klon av celler isolert og underkastet 0,1 jiM MTX-utvalg. Fra denne prosess isolerte man en samling av celler som var resistente mot 0,1 jiM MTX (cellelinje RAG001), ekspanderte den i kultur og karakteriserte den.

Eksempel 2 ot-Gal A-rensing

Det følgende er en foretrukken metode for å produsere, rense og teste ot-Gal A. Renseprosessen beholder a-Gal A i løselig, aktiv, nativ form gjennom hele renseprosessen. Proteinet utsettes ikke for ekstrem pH, organiske løsemidler eller rensemidler, spaltes ikke proteolytisk under renseprosessen, og danner ikke aggrega-ter. Renseprosessen er utviklet til å ikke endre fordelingen av a-Gal A-glykoformer.

2. 1 Rensing av a- Gal A

Eksempel 2.1 illustrerer at a-Gal A kan renses til nær homogenisitet fra det kondisjonerte medium av dyrkede humane cellestammer som er blitt stabilt transfisert til å produsere enzymet. a-Gal A isoleres fra a-Gal A-holdig medium ved bruk av en rekke på fem kromatografiske trinn. De fem trinn benytter seg av forskjellige sepa-rasjonsprinsipper som drar fordel av forskjellige fysiske egenskaper av enzymet, for å separere a-Gal A fra forurensende materiale. Omfattet er hydrofob vekselvirk-ningskromatografi på butyl-"Sepharose", ionisk vekselvirkning på hydroksyapatitt, anionbyttekromatografi på Q-"Sepharose" og størrelseseksklusjonskromatografi på "Superdex" 200. I tillegg til å være det endelige trinn i renseprosessen, tjener stør-relseseksklusjonskromatografi også som en virksom måte å overføre det rensede protein til en formuleringskompatibel buffer.

A. Anvendelse av butyl-'' Sepharose''- kromatogral7 som et første trinn ved rensing av o- Gal A

Kaldt kondisjonert medium (1,34 I) ble klarnet ved sentrifugenng og filtrert gjenom et 0,45 jim celluloseacetatfilter ved bruk av glassfiber-forfiltre. Under omrøringen ble pH av det kalde, filtrerte medium justert til 5,6 ved en dråpevis tilsetning av 1 N HCI, og ammoniumsulfat ble tilsatt til en endelig konsentrasjon på 0,66 M ved en dråpevis tilsetning av en stamoppløsning (romtemperatur) av 3,9 M ultrarent ammoniumsulfat. Mediet ble omrørt i ytterligere 5 minutter ved 4°C ,filtrert som beskrevet ovenfor og påført på en butyl-"Sepharose"-kolonne med en 14 kolon-nevolumers lineær gradient fra buffer A (inneholdende ammoniumsulfat) til 10 mM MES-Tris, pH 5,6 (intet ammoniumsulfat). Fraksjonene ble testet for a-Gal A-aktivitet ved 4-MUF-gal-assayet, og fraksjonene som inneholdt en målbar enzymak-tivitet, ble samlet. Slik det fremgår fra fig. 8 og renseoppsummeringen (tabell 5), fjerner dette trinn ca. 99% av de forurensende proteiner (pre-kolonneprøve = 8,14 g samlet protein; post-kolonneprøve = 0,0638 g samlet protein).

fl. Anvendelse av Heparin-" Sepharose"- kromatografi som trinn for rensing av

a- Gal A

Butyl-"Sepharose"-kolonnetoppfraksjonene ble dialysert ved 4°C mot (4 I) 10 mM MES-Tris, pH 5,6 (ladet én gang). Ledeevnen av dialysatet ble justert til 1,0 mMHO ved 4°C ved tilsetning av H20 eller NaCI etter behov. Deretter ble prøven påført på en kolonne av Heparin-"Sepharose" 6 Fast Flow (Pharmacia, Uppsala, Sverige; 29 ml kolonnevolum, 2,5 x 6 cm) som var blitt ekvilibrert i 10 mM MES-Tris, pH 5,6, som inneholdt 9 mM NaCI (buffer B). Dette ble utført ved 4°C ved en strømningsra-te på 10 ml/min. Inline-UV (280 nm) og ledeevne-overvåkningsanordninger målte den samlede protein- og saltkonsentrasjon. Etter at prøven var blitt påført, ble kolonnen vasket med 10 kolonnevolumer buffer B fulgt av 3 kolonnevolumer med en lineær gradient til 8% buffer C/92% buffer B (hvor buffer C er 10 mM MES-Tris, pH 5,6 som inneholder 250 mM NaCI) og vasking med 10 kolonnevolumer av 8% buffer C. Dette ble fulgt av eluering av ot-Gal A med 1,5 kolonnevolumer av en lineær gradient til 29% buffer C og deretter 10 kolonnevolumer med en lineær gradient til 35% buffer C. Fraksjonene ble testet for sin ot-Gal A-aktivitet, og de som inneholdt en målbar aktivitet, ble samlet.

C. Bruk av hydroksyapatittkromatografi som trinn for rensing av a- Gal A

Heparinsamlingen ble filtrert og påført direkte på en kolonne av Ceramic Hydroxya-patite HC (40 (im; American International Chemical, Natick MA; 12 ml kolonnevolum, 1,5 x 6,8 cm) som var blitt ekvilibrert i 1 mM natriumfosfat, pH 6,0 (buffer D). Kromatografien ble utført ved romtemperatur på et hybrid "GradiFrac"/"FPLC"-system (Pharmacia, Uppsala, Sverige) utstyrt med inline-UV (280 nm) og lede-evneovervåkningsapparat. Etter at prøven var blitt påført (5 ml/min), ble kolonnen vasket med 10 kolonnevolumer buffer D. a-Gal A ble eluert med 7 kolonnevolumer lineær gradient til 42% buffer E/57% buffer D (hvor buffer E er 250 mM natriumfosfat, pH 6,0), fulgt av 10 kolonnevolumer med en gradient til 52% buffer E. Fraksjonene ble testet for sin a-Gal A-aktivitet, og fraksjonene som inneholdt en målbar aktivitet, ble samlet.

D. Bruk av Q-" Sepharose"- anionbyttekromatografi som trinn for rensing av

a- Gal A

Hydroksyapatittsamlingen ble fortynnet ca, 1,5 ganger med H20 til en endelig ledeevne på 3,4-3,6 mMHO ved romtemperatur. Etter filtrering ble prøven påført på en kolonne av Q-"Sepharose"-HP (Pharmacia, Uppsala, Sverige; 5,1 ml kolonnevolum, 1,5 x 2,9 cm) ekvilibrert i 10% buffer G (90% buffer F, hvor buffer F er 25 mM natriumfosfat, pH 6,0, o buffer G er 25 mM natriumfosfat, pH 6,0, 250 mM NaCI. Kromatografien ble utført ved romteperatur på "Gradi-Frac"/FPLC"-hybridsystemet (Pharmacia, Uppsala, Sverige), og de samlede protein- og saltkonsentrasjoner ble overvåket ved hjelp av inline-overvåkningsapparatene. Prøven ble påført med en strøm ni ngshastig het på 5 ml/min, og deretter ble de følgende trinn utført: (1) vasking med 5 kolonnevolumer 10% buffer G, (2) vasking med 7 kolonnevolumer 12% buffer G, (3) 3 kolonnevolumer med lineær gradient til 50% buffer G, (4) 10 kolonnevolumer med lineær gradient til 53% buffer G, (5) 3 kolonnevolumer med gradient til 100% buffer G, og (6) vasking med 10 kolonnevolumer 100% buffer G. a-Gal A'et ble primært eluert under trinn 3 og 4. Fraksjonene som inneholdt noen påvisbar aktivitet, ble samlet ("Q-samlingen").

E. Anvendelse av " Superdex" 200- gelfiltrasjonskromatografi som trinn for

rensing av a- Ga IA

Q-samlingen ble konsentrert omtrent 5 ganger ved bruk av "Centriprep" 10-sentrifugalkonsentratorenheter (Amicon, Beverly, MA) og påført på en kolonne med "Superdex" 200 (Pharmacia, Uppsala, Sverige; 189 ml kolonnevolum, 1,6 x 94 cm). Kolonnen ble ekvilibrert og eluert med 25 mM natriumfosfat, pH 6,0, som inneholdt 150 mM NaCI. Kromatografien ble utført på et FPLC-system (Pharmacia, Uppsala, Sverige) ved romtemperatur ved bruk av en inline-UV-overvåkningsanordning (280 nm) for å følge med på elueringen av proteinet. Volumet av prøven som ble påført på kolonnen, vars 2 ml, strømningshastigheten var 0,5 ml/min, og fraksjonsstør-relsen var 2 ml. Flere kolonnegjennomstrømninger ble utført; fraksjonene ble testet for a-Gal A-aktivitet, og fraksjonene som inneholdt en påvisbar aktivitet, ble samlet.

De samlede fraksjoner fra "Superdex" 200-kolonnen ble konsentrert ved bruk av "Centriprep" 100-enheter, alikvotert, sjokkfrosset og lagret ved -80°C over korte tidsrom. En oppsummering av dette eksempel på a-Gal A-rensing vises i tabell 5. Det endelige utbytte av a-Gal A var 59% av utgangsstoffets aktivitet, og den spesifikke aktivitet av det rensede produkt var 2,92 x IO<6> enheter/mg protein. Det dannede produkt oppviste et høyt nivå av renhet etter elektroforese under reduserende betingelser på 4-15% SDS-polyakrylamidgel, som deretter ble sølvfarget.

Sammenfatning

Renseprosessen tilveiebringer høyt renset a-Gal A. Hovedparten av rensingen finner sted under de første 2 trinnene av renseprosessen, mens de siste tre trinn tjener til å finpusse materialet ved å fjerne de gjenværende mindre forurensningene. Det siste trinn, nemlig størrelseseksklusjonskromatografi på "Superdex" 200, tjener også til å overføre a-Gal A'et til en formuleringskompatibel buffer.

2.2 Størrelse av a- Gal A som er blitt produsert av stabilt transfiserte humane

celler i kultur

De strukturelle og funksjonelle egenskaper av renset humant a-Gal A ble under-søkt. Det dannede produkt viste et høyt nivå av renhet etter elektroforese under reduserende betingelser på en 4-15% SDS-polyakrylamidgel, som deretter ble sølv-farget.

Den molekylære masse av a-Gal A ble bedømt ved MALDI-TOF-massespektrometri. Disse resultatene demonstrerer at molekylmassen av dimeren er 102.353 Da, mens molekylmassen av monomeren er 51.002 Da. Den forventede molekylmasse av monomeren, basert på aminosyresammensetningen, er 45.400 Da. Derfor utgjør karbohydratinnholdet av enzymet opptil 5.600 Da av molekylvekten.

2. 3 Karbohydratmodifikasjon av a- Gal A produsert av stabilt transfiserte humane celler

Glykosylasjonsmønstret av a-Gal A ble også bedømt. En riktig glykosylering er viktig for en optimal in wVo-aktivitet av a-Gal A; a-Gal A uttrykt i ikke-glykosylerende systemer er inaktivt eller ustabilt. Hantzopolous et al., Gene 57: 159 (1987). Glykosylering er også viktig for internaliseringen av a-Gal A i de ønskede målceller, og påvirker sirkulasjonshalveringstiden av enzymet in vivo. På hver delenhet av a-Gal A er det fire seter tilgjengelige for asparagin-bundne karbohydratkjeder, hvorav kun tre er tatt opp. Desnick et al., i The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, McGraw Hill, New York, 1995), s. 2741-2780.

En prøve av a-Gal A som var blitt produsert av stabilt transfiserte celler, ble behandlet med neuraminidase, som isoleres fra A. urafaciens (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) for å fjerne sialsyren. Denne reaksjon ble utført ved å behandle 5 mg a-Gal A over natten med 10 mU neuraminidase ved romtemperatur i et endelig volum på 10 ml acetatbufret salin (ABS, 20 mM natriumacetat, pH 5,2, 150 mM NaCI).

Renset a-Gal A som var blitt produsert av stabilt transfiserte celler, ble også defos-forylert ved bruk av alkalifosfatase (kalvetarm-alkalifosfatase, Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN), ved å behandle 5 mg a-Gal A over natten ved romtemperatur med 15 U alkalifosfatase i ABS (pH hevet til 7,5 med 1 M Tris).

Prøvene ble analysert ved SDS-PAGE og/eller isoelektrisk fokusering, fulgt av "western blotting" med et anti-a-Gal A-spesifikt antistoff. Antistoffet som ble brukt, var et polyklonalt kanin-anti-peptid-antistoff, som ble fremstilt ved bruk av et peptid som representerte aminosyrene 68-81 av a-Gal A som immunogen. Etter overføring av proteinet til PVDF (Millipore, Bedford, MA), ble membranen testet med en 1:2000 fortynning av antiserumet i 2,5% blotto (fettfri tørrmelk i 20 mM Tris-HCI, pH 7,5, 0,05% Tween-20). Dette ble fulgt av en påvisning med geite-anti-kanin-IgG konjugert med pepperrot-peroksidase (Organo Technique/Cappella, Durham, NC; l:5000-fortynning) og reagensmidlene i ECL-kjemiluminescens-settet (Amersham, Arlington Heights, IN).

Behandling av ot-Gal A med neuraminidase fulgt av SDS-PAGE-analyse førte til en endring av molekylmassen (ca. 1500-2000 Da eller 4-6 sialsyrer pr. monomer), hvilket tydet på at det forelå en omfattende modifikasjon av ot-Gal A med sialsyre. Til sammenligning har plasmaformen for a-Gal A 5-6 sialsyreresiduer pr. monomer, og placentaformen har 0,5-1,0 sialsyreresiduer pr. monomer. Bishop et al., J. Biol. Chem. 256: 1307 (1981).

En annen metode som ble brukt til å undersøke sialsyren og M6P-modifikasjonene av a-Gal A, var isoelektrisk fokusering (IEF), hvor prøvene adskilles på grunnlag av sitt isoelektriske punkt (pl) eller nettoladningen. Dermed ville en fjerning av ladede residuer såsom sialsyre eller fosfat fra a-Gal A forventes å endre mobiliteten av proteinet i IEF-systemet.

For å utføre IEF-eksperimentet, ble prøver av a-Gal A som var blitt fremstilt i henhold til oppfinnelsen, behandlet med neuraminidase og/eller alkalifosfatase, blandet 1:1 med 2X Novex-prøvebuffer (med 8 M urea, pH 3,0-7,0) og ladet på en 6 M urea-IEF-gel (5,5% polyakrylamid) fremstilt ved bruk av "Pharmalyte" (Pharmacia, Uppsala, Sverige; pH 3,0-6,5; "Pharmalyte" 4-6,5 og 2,5-5,5; 0,25 ml av hver pr. gel). Standarder for det isoelektriske punkt (Bio-Rad) ble også innlemmet. Etter elektroforese ble gelen overført til PVDF, og en "western blot"-analyse ble utført som beskrevet ovenfor.

Neruaminidase-behandling av enzymet økte pl av alle tre isoformene, hvilket tydet på at alle var modifisert i noen grad med sialsyre. Denne data tyder på at a-Gal A-preparatene som er fremstilt slik det beskrives heri, bør ha en ønskelig plasmahal-veringsid, hvilket tyder på at dette materiale er godt egnet for farmakologisk bruk. Videre hevet en behandling av neuraminidase-behandlet a-Gal A med alkalifosfatase pl-verdien av en del av proteinet ytterligere til ca. 5,0-5,1, hvilket tyder på at enzymet bærer ett eller flere M6P-residuer. Denne modifikasjon er nødvendig for en fremgangsrik internalisering av a-Gal A i målcellene.

De N-bundne karbohydratkjeder av a-Gal A ble analysert ved ionbytte-HPLC (Gly-co-Sep C) og merking av den ikke-reduserende ende med den fluorescerende for-bindelse 2-aminobenzamid (AB). Resultatene av analysen av AB-glykaner fra tre forskjellige a-Gal A-preparater er sammenfattet i tabell 6. Alle tre preparater hadde et Z-tal over 170. Videre var 67% av glykanene sialylert, over 16% av glykanene var fosforylert og mindre enn 16% var nøytrale. Disse resultatene er meget gode sammenlignet med resultater som er blitt rapportert i teknikkens stand. F.eks. be-skriver Desnick et al. (US-patent 5.356.804) at over 60% av glykanene var nøyra-le, mens kun 11% var sialylert.

Ytterligere detaljerte trekk av de rensede GA-GAL-preparater oppgis i tabell 7.

2. 4 Økende andel av ladet ce- Gal A ved fraksjonalisering av a- Gal A- arter

Slik det ble beskrevet ovenfor, kan en fraksjonalisering av ot-Gal A-glykoformer ut-føres under forskjellige trinn av renseprosessen som beskrives heri. I foreliggende eksempel ble a-Gal A-glykoformene fraksjonalisert i henhold til størrelse og ladning. Det er også mulig å fraksjonalisere a-Gal A ved en kombinasjon av disse eller andre kromatografiske teknikker som beskrevet ovenfor.

For størrelsesfraksjonalisering av a-Gal A-glykoformer ble størrelseseksklusjons-kromatografi utført på en "Superdex" 200-kolonne (Pharmacia, 1,6 cm x 94,1 cm) ekvilibrert i fosfatbufret salin ved pH 6. a-Gal A (2,6 mg i 1 ml) ble påført på kolonnen, og kolonnen ble eluert ved 0,35 ml/min. Fraksjoner ble samlet over elueringsprofilen, og fraksjonene som omfattet den brede elueringstopp av a-Gal A, ble analysert ved SDS-PAGE og deretter visualisert ved sølvflekking. Fraksjonene av den førende kant av toppen inneholdt a-Gal A med den høyeste molekylvekt, og idet fraksjonene fortsatte over toppen, sank den tilsynelatende molekylvekt av a-Gal A'et gradvis. Fraksjoner av a-Gal A ble deretter valgt og samlet for å gi et a-Gal A-preparat i den ønskede molekylvektområde.

For fraksjonalisering av a-Gal A-glykoformer i henhold til ladningen, ble a-Gal A fraksjonalisert ved Q-"Sepharose"-kromatografi. Q-"Sepharose"-kolonnen (1,5 cm x 9,4 cm) ble ekvilibrert i 20 mM natriumfosfat, pH 6,0, som inneholdt 30 mM NaCI, og strømningshastigheten ble holdt på 5 ml/min. a-Gal A i (130 mg i 166 ml) ble påført på kolonnen, vasket med ekvilibreringsbuffer og deretter eluert med 20 mM natriumfosfat, pH 6,0, som inneholdt 130 mM NaCI. For en mer omfattende fraksjonalisering, kan en gradienteluering (f.eks. 10 kolonnevolumer) fra ekvilibreringsbufferen til elueringsbufferen brukes. Fraksjoner ble deretter samlet over elueringsprofilen, og fraksjonene som omfattet elueringstoppen av a-Gal A, ble analysert ved SDS-PAGE og deretter visualisert ved sølvflekking. Artene med lavest molekylvekt som ble observert på gelen, eluerte i vaskevannet og i den førende kant av toppen, mens glykoformene med høyest molekylvekt eluerte mot slutten av toppen. Artene med lavere molekylvekt tilsvarer de mindre negativt ladede glykoformer av a-Gal A, som bindes mindre sterkt til den positivt ladede Q-"Sepharose"-kolonne (omfattende en kvaternær amin-substituert harpiks). a-Gal A-artene med høyest negativ ladning ble eluert senere i elueringsprofilen, og har en høyere molekylvekt ifølge en SDS-PAGE-analyse. Fraksjonaliseringen i henhold til ladningen ble bekreftet ved en isoelektrisk fokusering av de eluerte fraksjoner eller av utvalgte samlinger.

Dermed muliggjorde både en fraksjonalisering i henhold til størrelsen og en fraksjonalisering i henhold til ladningen et utvalg av høyt ladede glykoformer av ot-Gal A.

2. 5 Mannose- eller mannose- 6- fosfat ( M6P)- mediert internalisering av ot- Gal A

For at a-Gal A som er blitt fremstilt i stabilt transfiserte celler, skal kunne være et virksomt terapeutisk middel mot a-Gal A-mangler, må enzymet internaliseres i de rammede celler. a-Gal A er minimalt aktivt ved fysiologiske pH-nivåer, f.eks. i blo-det eller i interstitielle væsker. a-Gal A metaboliserer akkumulerte lipidsubstrater optimalt bare når det er internalisert i det sure miljø av lysosomen. Denne internalisering medieres av bindingen av a-Gal A til M6P-reseptorer som uttrykkes på celleflaten og leverer enzymet til lysosomen via den endocytiske bane. M6P-reseptor uttrykkes ubikvitært; de fleste somatiske celler uttrykker M6P i noen grad. Mannosereseptor, som er spesifikk for blottede mannoseresiduer på glykoproteiner, er mindre alminnelig utbredt. Mannosereseptorene finnes generelt kun på makrofager og makrofaglignende celler, og gir en ytterligere måte for a-Gal A å tre inn i disse celletyper.

For å demonstrere den M6P-medierte internalisering av a-Gal A, ble hudfibroblaster fra en pasient med Fabrys sykdom (NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository) dyrket over natten i nærvær av økende konsentrasjoner av renset a-Gal A. Noen av prøvene inneholdt 5 mM løselig M6P, som kompetitivt inhiberer bindingen til og internalisering via M6P-reseptor. Andre prøver inneholdt 30 mg/ml mannan, som inhiberer bindingen til og internaliseringen via mannosereseptor. Etter inkubasjonen ble cellene vasket og samlet ved å skrape dem inn i lysisbuffer (10 mM Tris, pH 7,2, 100 mM NaCI, 5 mM EDTA, 2 mM "Pefabloc" (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) og 1% NP-40). De sprengte prøver ble deretter testet for proteinkonsent-rasjon og a-Gal A-akivitet. Resultatene uttrykkes som enheter a-Gal A-aktivitet/mg celleprotein. Fabry-cellene internaliserte a-Gal A på doseavhengig måte. Denne internalisering ble inhibert med M6P, men det fant ikke sted noe inhibering med mannan. Derfor medieres internaliseringen av a-Gal A i Fabry-fibroblaster av M6P-reseptor, men ikke av mannose-reseptor.

a-Gal A internaliseres også in vitro i endotelceller, som er viktige mål for behandling av Fabrys sykdom. Humane endotelceller fra navlestrengvene (HUVEC) ble dyrket over natten med 7500 enheter a-Gal A; noen av brønnene inneholdt M6P. Etter inkubasjonsperioden ble cellene samlet og testet for a-Gal A som beskrevet

ovenfor. Cellene som var blitt inkubert med a-Gal A, hadde nesten 10 ganger høye-re enzymnivåer enn kontrollcellene (ingen inkubasjon med a-Gal A). M6P inhiberte den intracellulære oppsamling av a-Gal A, hvilket tyder på at internaliseringen av a-Gal A i HUVECer medieres av M6P-reseptor. Dermed internaliseres det humane a-Gal A av klinisk relevante celler.

Få dyrkede humane cellelinjer er kjent for å uttrykke mannosereseptor. Imidlertid kan en muse-makrofag-lignende cellelinje (J774.E), som bærer mannosereseptorer, men få eller ingen M6P-reseptorer, brukes til å bestemme om det rensede a-Gal A internaliseres via mannosereseptor. Diment et al., J. Leukocyte Biol. 42: 485-490

(1987). J774.E-celler ble dyrket over natten i nærvær av 10.000 enheter/ml a-Gal A. Utvalgte prøver inneholdt også 2 mM M6P, og andre inneholdt 100 mg/ml mannan. Cellene ble vasket og samlet som beskrevet ovenfor, og det samlede pro-teininnhold og a-Gal A-aktiviteten av hver prøve ble bestemt. M6P inhiberer ikke opptaket av a-Gal A i disse celler, mens mannan nedsetter nivået av akkumulert a-Gal A med 75%. Dermed kan a-Gal A internaliseres via mannosereseptor i celletyper som uttrykker denne bestemte celleoverflatereseptor.

Eksempel 3 Farmasøytisk formulering

a-Gal A, renset, bulk, fortynnes til den endelige konsentrasjon med a-Gal A-fortynningsmiddel. På grunnlag av volumet av renset bulk som skal formuleres, konsentrasjonen av a-Gal A (mg/ml) og den ønskede konsentrasjon av a-Gal A i den endelige formulering, beregnes volumet av a-Gal A-fortynningsmiddel som er nødvendig. a-Gal A-fortynningsmiddel fremstilles innen 24 timer før bruk ved å blande egnede mengder WFI, natriumklorid og natriumfosfat, monobasisk, og justere pH til 6,0 med natriumhydroksidoppløsning. Sammensetningen av a-Gal A-fortynningsmidlet oppgis i tabell 8.

Én liter eller et mindre volum a-Gal A-fortynningsmiddel filtreres ved vakuumfiltra-sjon ved bruk av sterile 0,2 mm nylonfiltre (Nalge Nunc International, Rochester, NY). Større volumer filtreres ved positivt trykk ved bruk av en peristaltisk pumpe og 0,2 mm "Supor"-kapselfiltre (Pall, Port Washington, NY). Alle filtrene underkas-tes en post-filtrasjons boblepunkt-integritetstesting. Blandings- og filtrasjonstrinne-ne utføres i en sertifisert klasse 100-laminærstrømningshette. a-Gal A-fortynningsmiddel tilsettes til a-Gal A i renset bulkform i et blandekar for å gi en 1 mg/ml endelig oppløsning. Deretter tilsettes det egnede volum polysorbat 20 (Tween 20, Spectrum) for å oppnå en endelig konsentrasjon på 0,02%.

Eksempel 4 Desialylert degalaktosylert a-Gal A

For å undersøke virkningen av glykosylasjon på biofordelingen av a-Gal A, ble et renset preparat av a-Gal A sekvensielt deglykosylert, og hver form ble injisert i mus. Organene av musene ble samlet fire timer etter injeksjonen, og det ble utført immunohistokjemi på vevene for å visualisere mulige endringer i biofordelingen av proteinet.

a-Gal A ble først behandlet med neuraminidase (sialidase) for å fjerne sialsyreresiduer, hvilket etterlot seg blottlagte galaktoseenheter. En del av dette sialidase-behandlede materiale ble ytterligere behandlet med p-galaktosidase for å fjerne galaktoseresiduer; dette etterlot seg blottlagte N-acetylglukosamid (GlcNAc)-residuer. GlcNAc'ene ble deretter fjernet ved bruk av N-acetylglukosaminidase, hvilket etterlot seg kjerne-mannosegruppene på proteinet. Ubehandlet a-Gal A (kontroll) eller en av de behandlede former for proteinet ble injisert i mus via halevenen. Fire timer etter injeksjonene, ble lever, milt, hjerte, nyre og lungene fra musene samlet, konservert og immunoflekket for å påvise a-Gal A.

Sammenlignet med kontrolldyr som fikk ubehandlet protein, hadde mus som fikk

det sialidase-behandlede protein (galaktoseresiduer blottlagt) mer ot-Gal A i leveren og tilsvarende mindre av enzymet i de øvrige undersøkte organer. I tillegg var flek-kingsmønstret i leveren helt forskjellig. I kontrolldyr var a-Gal A primært lokalisert i Kupffer-celler og endotelceller, men kun moderat flekking av hepatocytter. I dyr

som fikk det sialidase-behandlede a-Gal A, fantes enzymet kun i hepatocyttene, hvilket stemmer overens med den kjente biofordeling av asialoglykoproteinreseptor. Denne virkning av en deglykosylasjon på biofordelingen ble omgjort når galak-toseresiduene ble fjernet ved hjelp av p-galaktosidase. Fargingsmønstret som ble observert i leveren av musene som fikk dette protein uten galaktoseenheter, lignet fargingen i kontrolldyrene; hovedparten av fargingen ble funnet i Kupffer-celler og endotelceller, med en minimal hepatocytt-flekking. En videre behandling av a-Gal A med N-acetylglukosaminidase endret ikke fargingsmønstret fra hva som ble observert for det p-galaktosidase-behandlede protein; dvs. fjerning av N-acetylglukosaminresiduene virket å ha liten effekt på biofordelingen av a-Gal A.

Eksempel 5 Korrigering av Fabry-fibroblaster med humane fibroblaster

som uttrykker a-Gal A

For genterapi må et implantat av autologe celler som produserer a-Gal A, produsere enzymet i form av en form som er modifisert på riktig måte for å "korrigere" a-Gal A-mangelen i målcellene. For å bedømme virkningen av en a-Gal A-produksjon av transfiserte humane fibroblaster på Fabry-celler, ble fibroblaster som var samlet fra pasienter med Fabrys sykdom (NIGMS Human Genetics Mutant Cell Repository) dyrket sammen med en a-Gal A-produksjonscellestamme (BRS-11) i "Transwells" (Costar, Cambridge, MA). Fabry-cellene ble dyrket i 12-brønners vev-kulturskåler, hvorav noen inneholdt innføyelser ("Transwells", 0,4 mm porestørrel-se) som hadde en overflate som celler kan dyrkes på. Vekstmatriksen av innføyel-sen er porøs og lar makromolekyler passere fra det øvre til det nedre miljø. Ett sett av innføyelser inneholdt normale humane forhud (HF)-fibroblaster, som utsondrer minimale mengder a-Gal A, mens et annet sett inneholdt den stabilt transfiserte humane fibroblaststamme BRS-11, som utsondrer store mengder a-Gal A. I celler som dyrkes sammen med a-Gal A-produksjonsceller, kan a-Gal A tre inn i mediet som dekker Fabry-cellene, og potensielt internaliseres i Fabry-cellene.

Dataene i tabell 9 viser at Fabry-cellene internaliserte det utsondrede a-Gal A. Det intracellulære nivå av a-Gal A ble overvåket i 3 dager. Cellene som var blitt dyrket alene (ingen innføyelse) eller i nærvær av ikke-transfiserte forhud-fibroblaster (HF-innføyelse), hadde et meget lavt inatracellulært invå av ot-Gal A-aktivitet. Fabry-cellene som var blitt dyrket med ot-Gal A-produksjonscellene (BRS-ll-innføyelse), oppviste imidlertid etter dag 2 enzymnivåer som lignet nivået i normale celler (normale fibroblaster har 25-80 enheter a-Gal A prl. mg protein). At korrigeringen kan tilskrives a-Gal A som er blitt tatt opp via M6P-reseptor, demonstreres av inhi-beringen med M6P (BRS-ll-innføyelse + M6P).

Claims

1. Anvendelse av et a-Gal A-preparat ved fremstilling av et medikament for behandling av en a-Gal A-defisiens, hvor nevnte medikament er for administrasjon av en dose på mellom 0,1 til 0,3 mg av nevnte a-Gal A-preparat per kg kroppsvekt av et individ.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvor nevnte medikament er for administrasjon av en dose på 0,2 mg av nevnte a-Gal A-preparat per kg kroppsvekt av et individ.

3. Anvendelse ifølge krav 1, hvor nevnte dose er formulert for administrasjon intramuskulært, oralt, rektalt, subkutant, intra-arterielt, intraperitonealt, intracerebralt, intranasalt, intratekalt, intramukosalt, transdermalt eller via inhalering.

4. Anvendelse ifølge krav 1, hvor a-Gal A-preparatet har en spesifikk aktivitet på minst 2,0 x IO<6> enheter/mg protein.

5. Anvendelse ifølge krav 1, hvor preparatet er renset til minst 98% homogenitet som målt med SDS-PAGE eller revers fase HPLC.

6. Anvendelse ifølge krav 1, hvor preparatet er renset til minst 98% homogenitet som målt med SDS-PAGE eller revers fase HPLC, og har en spesifikk aktivitet på minst 2,0 x IO<6> enheter/mg protein.

7. Anvendelse ifølge krav 1, hvor minst 67% av de totale glykaner av a-Gal A glykoformene av nevnte preparat er kompleks-type glykaner.

8. Anvendelse ifølge krav 1, hvor de humane a-Gal A-glykoformer omfatter et gjennomsnitt på to komplekse glykaner per a-Gal A-monomer.

9. Anvendelse ifølge krav 1, hvor mer enn 50% av de totale glykaner av a-Gal A-glykoformene er sialylert.

10. Anvendelse ifølge krav 1, hvor a-Gal A-materialet er oppnådd fra isolerte humane celler genetisk modifisert til å uttrykke et a-Gal A-polypeptid.

11. Anvendelse ifølge krav 10, hvor de humane celler er sekundære fibroblaster.

12. Anvendelse ifølge krav 1, hvor de humane a-Gal A-glykoformer består av mellom omkring 50% til 70% komplekse glykaner med 2-4 sialinsyreresiduer.

13. Anvendelse ifølge krav 1, hvor preparatet har en spesifikk aktivitet på minst 2,0 x IO<6> enheter/mg protein og er fremstilt ved en fremgangsmåte av: (a) å fremskaffe isolerte humane celler som er genetisk modifisert til å uttrykke et a-Gal A-polypeptid; og (b) å opprenske a-Gal A-polypeptidet fra den humane celle eller et dyrk-ingsmedium av den humane celle.

14. Anvendelse ifølge krav 13, hvor preparatet er renset til minst 98% homogenitet som målt med SDS-PAGE eller revers fase HPLC.

15. Anvendelse ifølge krav 13, hvor minst 67% av de totale glykaner av a-Gal A-glykoformene av nevnte preparat er kompleks-type glykaner.

16. Anvendelse ifølge krav 13, hvor a-Gal A-glykoformene omfatter et gjennomsnitt av to komplekse glykaner per a-Gal A-monomer.

17. Anvendelse ifølge krav 13, hvor mer enn 50% av de totale glykaner av a-Gal A-glykoformene er sialylert.

18. Anvendelse ifølge krav 13, hvor den isolerte humane celle som er genetisk modifisert, er transfektert med et a-Gal A/pattedyr ekspresjonsvektorkonstrukt.

19. Anvendelse ifølge krav 13, hvor den isolerte humane celle som er genetisk modifisert, er transfektert med en nukleinsyre som koder for et regulatorisk ele-ment som kontrollerer ekspresjon av en kodende sekvens for a-Gal A.

20. Anvendelse ifølge krav 13, hvor den isolerte humane celle som er genetisk modifisert, er sekundære fibroblaster.

21. Anvendelse ifølge krav 13, hvor opprenskning av a-Gal A-polypeptidet omfatter å anvende minst en av opprenskningsmetodene valgt fra gruppen bestående av: hydrofobisk interaksjons-kromatografi, ionisk interaksjons-kromatografi, størrelses-ekskluderings-kromatografi, kromatofokuserende kromatografi, metallchelat-kromatografi og affinitetskromatografi.

22. Anvendelse ifølge krav 21, hvor opprenskningen av a-Gal A-polypeptidet ytterligere omfatter trinnet med fraksjonering av en a-Gal A-glykoform.

23. Anvendelse ifølge krav 1, hvor dosen er egnet til å administreres to ganger ukentlig.

24. Anvendelse ifølge krav 1, hvor dosen er egnet til å administreres ukentlig.

25. Anvendelse av et a-Gal A-preparat ved fremstilling av et medikament for behandling av en a-Gal A-defisiens, hvor nevnte medikament er for subkutan administrasjon av en dose på mellom 0,1 til 0,3 mg av nevnte a-Gal A-preparat per kg kroppsvekt av et individ.

26. Anvendelse ifølge krav 3 eller 25, hvor nevnte dose er formulert for administrasjon under anvendelse av et avleveringssystem valgt fra gruppen bestående av pumpe-avlevering, innkapslet celleavlevering, liposomal avlevering, nål-avlevert injeksjon, nålfri injeksjon, nebulisator, aerosolisator, elektroporering og transdermalt plaster.

27. Anvendelse av et a-Gal A-preparat ved fremstilling av et medikament til behandling av Fabrys sykdom, hvor nevnte medikament er for administrasjon av en dose på mellom 0,1 til 0,3 mg av nevnte a-Gal A-preparat per kg kroppsvekt av et individ.

28. Anvendelse ifølge krav 27, hvor nevnte medikament er formulert for subkutan administrasjon.

29. Anvendelse ifølge krav 27, hvor individet oppviser symptomer på Fabrys suk-dom.

30. Anvendelse ifølge krav 27, hvor individet oppviser et symptom på klassisk Fabrys sykdom.

31. Anvendelse ifølge krav 27, hvor individet oppviser et symptom på hjertesvikt.

32. Anvendelse ifølge krav 27, hvor individet oppviser et symptom på nyresvikt.

33. Anvendelse ifølge krav 27, hvor individet oppviser minst et symptom valgt fra gruppen bestående av korneal dystrofi, angiokeratomata, smertefull nevropati, cerebral vaskulær sykdom, kardiomyopati, venstre ventrikulær hypertrofi, anstrengel-sesrelatert dyspnea, asymmetrisk septal hypertrofi, myokardialt infarkt, myokardial infiltrasjon og mitralklaff-insuffisiens.

34. Anvendelse av et a-Gal A-preparat ved fremstilling av et medikament for behandling av en atypisk variant av Fabrys sykdom, hvor nevnte medikament er for administrasjon av en dose på mellom 0,1 til 0,3 mg av nevnte a-Gal A-preparat pr kg kroppsvekt av et individ.

35. Anvendelse ifølge krav 29, hvor nevnte pasient lider av en kardiovaskulær abnormalitet.

36. Anvendelse ifølge krav 35, hvor nevnte kardiovaskulære abnormalitet er venstre ventrikulær hypertrofi (LVH).

37. Anvendelse ifølge krav 25, 27 eller 29, hvor nevnte medikament er for administrasjon av en dose på 0,2 mg av nevnte a-Gal A-preparat per kg kroppsvekt av et individ.

38. Anvendelse ifølge krav 1, 2, 25, 27, 29 eller 32, hvor medikamentet er for ukentlig eller to ganger ukentlig administrasjon.