PL210833B1

PL210833B1 - Zastosowanie preparatu α-Gal A

Info

Publication number: PL210833B1
Application number: PL350658A
Authority: PL
Inventors: Richard F. Selden; Marianne Borowski; Carol M. Kinoshita; Douglas A. Treco; Melanie D. Williams; Thomas J. Schuetz; Peter Francis Daniel
Original assignee: Shire Human Genetic Therapies
Priority date: 1999-03-11
Filing date: 2000-03-09
Publication date: 2012-03-30
Also published as: ATE386808T1; CN101219213A; HK1245320A1; JP2017014279A; DE60038104D1; JP2002538183A; CN103585621A; DE60038104T2; ES2634317T3; HK1043386A1; EP2314699A1; CA3012663A1; JP6346236B2; CA2365923A1; KR100892334B1; JP2011037867A; DK2186902T3; NO329689B1; PT2314699T; NZ514077A

Description

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie preparatu α-Gal A w leczeniu niedoboru α-Gal A, choroby Fabry'ego i atypowego wariantu choroby Fabry'ego.

Niniejszym opisano także sposoby wytwarzania i oczyszczania α-Gal A oraz preparaty α-Gal A o zmienionym ładunku, o przedłużonym okresie półtrawnia w krwiobiegu ssaka do podawania pacjentowi.

Choroba Fabry'ego jest sprzężoną z chromosomem X dziedziczną lizosomową chorobą spichrzeniową charakteryzującą się poważnym upośledzeniem czynności nerek, rogowcem krwawym oraz nieprawidłowościami sercowo-naczyniowymi, włączając przerost komory oraz niedomykalność zastawki dwudzielnej. Choroba Fabry'ego atakuje również obwodowy układ nerwowy, powodując ataki dręczącego, palącego bólu kończyn. Chorobę Fabry'ego powoduje niedobór enzymu α-galaktozydazy A (α-Gal A) . α-Gal A jest lizosomalną glikohydrolazą odcinającą końcowe reszty α-galaktozylowe różnych glikokoniugatów. Choroba Fabry'ego powoduje blokadę katabolizmu obojętnego glikosfingolipidu, triheksozyd ceramidu (CTH) i akumulację substratów tego enzymu w komórkach i krwioobiegu.

W związku ze wzorem dziedziczenia choroby sprzężonego z chromosomem X, większość chorych z chorobą Fabry'ego stanowią mężczyźni. Choć zaobserwowano poważnie dotknięte chorobą heterozygotyczne kobiety, heterozygotyczne kobiety często nie wykazują objawów choroby lub występują u nich względnie łagodne objawy (jak typowe zmętnienie rogówki). Nietypowy wariant choroby Fabry'ego, o niskiej resztkowej aktywności α-Gal A i objawach bądź bardzo łagodnych, bądź pozbawiony innych objawów choroby Fabry'ego koreluje z przerostem lewej komory i chorobą serca. Nakano i wsp., New Engl. J Med 333: 288-293 (1995). Obniżenie aktywności α-Gal A może być przyczyną takiej niewydolności serca.

Wyizolowano i zsekwencjonowano cDNA i gen kodujący ludzką α-Gal A. Ludzka α-Gal A jest wyrażana jako 429-aminokwasowy polipeptyd, którego 31 aminokwasów z końca N stanowi peptyd sygnałowy. Ludzki enzym wyrażano w komórkach jajnika chomika chińskiego (CHO) (Desnick i wsp., Patent Stanów Zjednoczonych nr 5 356 804; loannou i wsp., J Komórk Biol. 119:1137 (1992)); oraz komórkach owadzich (Calhoun i wsp., WO 90/11353).

Jednakże dotychczasowe preparaty α-Gal A mają ograniczoną skuteczność. Metody przygotowywania stosunkowo wysokiej czystości α-Gal A wymagają użycia chromatografii powinowactwa, z zastosowaniem połączenia chromatografii powinowactwa względem lektyny (konkanawalina A(Con A)Sepharose®) i chromatografii powinowactwa w oparciu o wiązanie α-Gal A z analogiem substratu N-6-aminoheksanoilo-α-D-galaktozyloaminą przyłączoną do złoża z Sepharose®. Patrz np. Bishop i wsp., J Biol. Chem. 256: 1307-1316 (1981). Zastosowanie białkopodobnych lektynowych złóż powinowactwa i złóż analogu substratu zwykle wiąże się z ciągłym wymywaniem czynnika powinowactwa ze stałego podłoża (Marikar i wsp., Anal. Biochem. 201: 306-3 10 (1992), co powoduje zanieczyszczenie oczyszczanego produktu czynnikiem powinowactwa, wolnym w roztworze, bądź związanym z wymywanym białkiem. Takie zanieczyszczenia sprawiają, że produkt nie nadaje się do zastosowania w preparatach farmaceutycznych. Związane analogi substratu i lektyny mogą również wywierać istotny ujemny wpływ na enzymatyczne, funkcjonalne i strukturalne własności białek. Co więcej, wytwarzana uprzednio znanymi w dziedzinie sposobami α-Gal A jest szybko usuwana przez wątrobę.

Wynalazek dotyczy zastosowania preparatów wysoce oczyszczonej α-Gal A.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie preparatu α-Gal A do wytwarzania leku do leczenia niedoboru α-Gal A, przy czym lek jest przeznaczony do podawania raz w tygodniu łub raz na dwa tygodnie w dawce od 0,1 do 0,3 mg α-Gal A na kilogram masy ciała pacjenta, a więcej niż 50% wszystkich glikanów preparatu α-Gal A stanowią glikany złożone.

Korzystnie lek otrzymywany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest przeznaczony do podawania w dawce 0,2 mg preparatu α-Gal A na kilogram masy ciała pacjenta. Również korzystnie dawka jest formułowana do podawania domięśniowo, doustnie, doodbytniczo, podskórnie, dotętniczo, dootrzewnowo, domózgowo, donosowo, dooponowo, przez śluzówkowo, przezskómie lub przez inhalację.

Lek otrzymywany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest korzystnie przeznaczony do podawania raz na dwa tygodnie lub raz w tygodniu. Również korzystnie jest on formułowany do podawania podskórnego. Najkorzystniej lek ten jest przeznaczony do podawania raz w tygodniu lub raz na dwa tygodnie w dawce 0,2 mg preparatu α-Gal A na kg wagi ciała pacjenta. Dawka może być formułowana do podawania przez pompę, przez dostarczanie enkapsułkowanych komórek, dostarczanie

PL 210 833 B1 liposomalne, iniekcje igłowe, iniekcje bezigłowe, nebulizatory, aerozolizery, elektroporację i plastry przezskórne.

W korzystnej postaci wykonania preparat α -Gal A ma aktywność specyficzną wynoszą c ą co najmniej 2,0 x 10⁶ jednostek/mg białka i/lub jest oczyszczony do co najmniej 98% homogenności, mierzonej przez SDS-PAGE albo HPLC w odwróconym układzie faz.

Ponadto co najmniej 67% wszystkich glikanów glikoform α-Gal A preparatu stosowanego według wynalazku stanowią glikany typu złożonego. Korzystnie glikoformy ludzkiej α-Gal A zawierają średnio dwa złożone glikany na monomer α-Gal A. Również korzystnie więcej niż 50% wszystkich glikanów glikoform α-Gal A jest sjalilowana.

W korzystnym aspekcie wynalazku α-Gal A stosowana według wynalazku jest izolowana z ludzkich komórek modyfikowanych genetycznie do wyrażania polipeptydu α-Gal A. Korzystniej komórkami takimi są wtórne fibroblasty.

Korzystnie glikoformy ludzkiej α-Gal A zawierają od 50% do 70% złożonych glikanów z 2-4 resztami kwasu sjalowego.

Stosowany preparat α-Gal A ma aktywność specyficzną wynoszącą co najmniej 2,0 x 10⁶ jednostek/mg białka i jest korzystnie wytworzony przez:

a) dostarczenie genetycznie modyfikowanych ludzkich komórek do ekspresji polipeptydu α-Gal A, korzystnie transfekowanych konstruktem α-Gal A/wektor ekspresyjny ssaka; oraz

b) oczyszczenie polipeptydu α-Gal A z ludzkich komórek lub podłuża hodowlanego ludzkich komórek.

Korzystniej preparat w wyżej opisanym sposobie jest oczyszczony do co najmniej 98% homogenności, mierzonej przez SDS-PAGE albo HPLC w odwróconym układzie faz i 61% jego wszystkich glikanów stanowią glikany typu złożonego. Ponadto korzystnie glikoformy α-Gal A zawierają średnio dwa złożone glikany na monomer α-Gal A, a więcej niż 50% wszystkich glikanów glikoform α-Gal A jest sjalilowana.

W korzystnej postaci wykonania genetycznie modyfikowana ludzka komórka, w szczególności wtórny fibroblast, jest transfekowana kwasem nukleinowym kodującym elementy regulatorowe kontrolujące ekspresję sekwencji kodującej α-Gal A.

Opisane powyżej oczyszczanie polipeptydu α-Gal A obejmuje zastosowanie co najmniej jednej procedury oczyszczania wybranej z grupy składającej się z: chromatografii oddziaływań hydrofobowych, chromatografii oddziaływań jonowych, chromatografii wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek, chromatografii z chromatoogniskowaniem, chromatografii powinowactwa z chelatowaniem metalu lub chromatografii powinowactwa. W korzystnej postaci wykonania sposób oczyszczania polipeptydu α-Gal A obejmuje ponadto etap frakcjonowania glikoformy α-Gal A.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie preparatu α-Gal A do wytwarzania leku do leczenia choroby Fabry'ego, przy czym lek jest przeznaczony do podawania raz w tygodniu lub raz na dwa tygodnie w dawce od 0,1 do 0,3 mg prepratu α-Gal A na kilogram masy ciała pacjenta, a więcej niż 50% wszystkich glikanów preparatu α-Gal A stanowią glikany złożone. Korzystnie lek jest przeznaczony do podawania raz w tygodniu lub raz na dwa tygodnie w dawce 0,2 mg preparatu α-Gal A na kg wagi ciała pacjenta.

W tym aspekcie lek zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest korzystnie formułowany do podawania podskórnego. Pacjent może mieć klasyczną chorobę Fabry'ego, zaburzenie sercowe, zaburzenie nerek. Pacjent dla którego jest przeznaczony lek wytworzony zgodnie z zastosowaniem według wynalazku ma co najmniej jedną chorobę wybraną z grupy składającej się z dystrofii rogówki, naczyniaka skóry z rogowaceniem, bolesnej neuropatii, choroby naczyniowej mózgu, kardiomiopatii, hipertrofii lewej komory, duszności wysiłkowej, niesymetrycznej hipertrofii przegrody, zawału mięśnia sercowego, nacieku mięśnia sercowego i niedomykalności zastawki dwudzielnej.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie preparatu α-Gal A do wytwarzania leku do leczenia atypowego wariantu choroby Fabry'ego, przy czym lek jest przeznaczony do podawania raz w tygodniu lub raz na dwa tygodnie w dawce od 0,1 do 0,3 mg preparatu α-Gal A na kilogram masy ciała pacjenta, a więcej niż 50% wszystkich glikanów preparatu α-Gal A stanowią glikany złożone. Zgodnie z tym aspektem lek jest korzystnie przeznaczony do podawania w dawce 0,2 mg preparatu α-Gal A na kg wagi ciała pacjenta.

U pacjenta z atypowym wariantem choroby Fabry'ego występują nieprawidłowości układu sercowo-naczyniowego, a w szczególności hipertrofia lewej komory (LVH).

PL 210 833 B1

Krótki opis rysunków

Fig. 1 przedstawia sondę długości 210 bp (par zasad), użytą do izolacji α-Gal A z biblioteki cDNA ludzkich fibroblastów (SEKW. NR ID.: 1). Sekwencja pochodzi z egzonu 7 genu α-Gal A. Sondę otrzymano z ludzkiego genomowego DNA łańcuchową reakcją polimerazy (PCR). Obszary podkreślone na rysunku odpowiadają sekwencjom starterów użytych do amplifikacji.

Fig. 2 przedstawia sekwencję fragmentu DNA dopełniającego 5' koniec klonu cDNA α-Gal A (SEKW. NR ID.:2). Ten fragment zamplifikowano z ludzkiego genomowego DNA przez PCR. Obszary podkreślone na rysunku odpowiadają sekwencjom primerów użytych do amplifikacji. Pokazano również pozycje miejsc rozpoznawanych przez endonukleazy restrykcyjne Ncol i SacII, których użyto do subklonowania jak opisano w przykładzie 1.

Fig. 3 przedstawia sekwencję cDNA α-Gal A, włączając sekwencję kodującą peptyd sygnałowy (SEKW. NR ID.:3).

Fig. 4 to schematyczna mapa pXAG-16, konstruktu ekspresyjnego α-Gal A, który obejmuje promotor CMV (cytomegalowirus), egzon 1 i pierwszy intron, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy i pierwszy intron hGH, cDNA α-Gal A (bez sekwencji peptydu sygnałowego α-Gal A) i 3'UTS hGH. pcDNeo oznacza pozycję genu neo, otrzymanego z plazmidu pcDNeo.

Fig. 5 to schematyczna mapa pXAG-28, konstruktu ekspresyjnego α-Gal A, który obejmuje promotor I pierwszy egzon kolagenu I<<2, intron β-aktyny, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy i pierwszy intron hGH, cDNA α-Gal A (bez sekwencji peptydu sygnałowego α-Gal A) i 3'UTS hGH. pcDNeo oznacza pozycję genu neo, otrzymanego z plazmidu pcDNeo.

Fig. 6 przedstawia sekwencję aminokwasową ludzkiego α-Gal A (SEKW. NR ID.:4).

FIG. 7 przedstawia sekwencję cDNA kodującą ludzki α-Gal A (bez peptydu sygnałowego) (SEKW. NR ID.:5).

FIG. 8 to achromatogram etapu oczyszczania α-Gal A na żywicy Butyl Sepharose. Pokazana jest absorbancja przy długości fali 280 nm (linia ciągła) i aktywność α-Gal A (linia kropkowana) wybranych frakcji.

Fig. 9 to schematyczna mapa pGA213C.

Fig. 10 to diagram przedstawiający konstrukt pGA213C do rekombinacji homologicznej w locus endogenicznej α-galaktozydazy A. pGA213C widoczny jest jako sekwencja docelowa położona ponad odpowiadającymi sekwencjami w X-chromosomalnym locus α-galaktozydazy A. Pozycje względem kodonu inicjacyjnego - metioniny, ATG, zaznaczono liczbami powyżej map liniowych. Część aktywującą, zawierający mysi dhfr, bakteryjny neo i promotor CMV / sekwencję intronu aldolazy, pokazano ponad pozycją (-221), w którą zostały wstawione przez klonowanie DNA. Sekwencje kodujące α-galaktozydazy A zaznaczono cieniowanymi słupkami. Genomowe sekwencje niekodujące α-galaktozydazy A zaznaczono lekko wypełnionymi słupkami. Duże strzałki wskazują kierunek transkrypcji dla kaset ekspresyjnych dhfr i neo. Prawidłowy splicing mRNA GA-GAL i docelową aktywację genu zaznaczono linią przerywaną poniżej mapy zaktywowanego locus α-galaktozydazy A (GA-GAL).

SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU

Wstęp

Opisany w niniejszym zgłoszeniu wynalazek dotyczy zastosowania preparatów α-Gal A o określonych właściwościach. Niniejszym opisano sposoby ich przygotowywania, jak również metody leczenia pacjentów z chorobą Fabry'ego lub nietypowymi postaciami choroby Fabry'ego przy pomocy tych preparatów.

Wynalazek dotyczy zastosowania α-Gal A wytwarzanej przez jakąkolwiek komórkę (komórkę wytwarzającą α-Gal A) w leczeniu choroby Fabry'ego. Ludzka α-Gal A może być wytwarzana przy pomocy metod inżynierii genetycznej (w oparciu o wprowadzenie sklonowanego genu α-Gal A lub cDNA do komórki gospodarza) lub aktywację genu.

Stosowane w rozwiązaniach według wynalazku preparaty zawierają bardziej czystą α-Gal A niż wcześniej otrzymywana w dziedzinie. Przy pomocy metod oczyszczania tu opisanych kompozycje preparatów ludzkiej α-Gal A są oczyszczane do co najmniej 98% homogenności, bardziej korzystnie do co najmniej 99% homogenności, a najkorzystniej do przynajmniej 99,5% homogenności, mierzonej SDS-PAGE lub HPLC w odwróconej fazie. Aktywność właściwa preparatów α-Gal A wynosi korzystnie co najmniej 2,0 x 10⁶ jednostek/mg białka, bardziej korzystnie przynajmniej 3,0 x 10⁶ jednostek/mg białka, i najbardziej korzystnie przynajmniej 3,5 x 10⁶ jednostek/mg białka.

Preparat α-Gal A jest oczyszczany przez oddzielanie różnych glikoform α-Gal A od innych składników na złożu oddziaływań hydrofobowych i nie zawiera kroku opartego na chromatografii

PL 210 833 B1 lektynowej. W korzystnym wykonaniu reszta funkcjonalna złoża oddziaływania hydrofobowego zawiera grupę butylową.

W innym wykonaniu preparat α-Gal A jest oczyszczany wpierw przez wiązanie różnych glikoform α-Gal A na złożu na kationowej kolumnie jonowymiennej przy kwaśnym pH w buforze do równoważenia. Kolumnę następnie przemywa się buforem do równoważenia, aby wypłukać niezwiązany materiał, po czym różne glikoformy α-Gal A wymywa się przy użyciu jako roztworu wymywającego, roztworu soli 10-100 mM, buforowanego roztworu o pH 4-5 lub ich kombinacji. W korzystnym wykonaniu pH buforu do wymywania wynosi około 4,4.

W innym możliwym wykonaniu preparat α-Gal A jest oczyszczany przez oddzielanie różnych glikoform α-Gal A w próbce od pozostałych składników próbki przy pomocy procedury oczyszczania zawierającej jako przynajmniej jeden etap oczyszczania przynajmniej jeden z poniższych etapów: ogniskowanie chromatograficzne, chromatografię powinowactwa chelatowania metalu lub chromatografię immunopowinowactwa.

Preparaty α-Gal A mogą mieć zmieniony ładunek. Te preparaty mogą zawierać różne glikoformy α-Gal A. Zmiany ładunku uzyskuje się zwiększając zawartość kwasu sjalowego w preparatach α-Gal A i/lub zwiększając fosforylację preparatów α- Gal A.

Zawartość kwasu sjalowego w preparatach α-Gal A zwiększa się (i) oddzielając glikoformy α-Gal A bardziej naładowane i/lub o większej masie cząsteczkowej podczas lub po procesie oczyszczania; (ii) dodając reszty kwasu sjalowego przy pomocy genetycznie modyfikowanych komórek (przez zwykłe metody inżynierii genetycznej bądź przez aktywację genu) wyrażających gen sjalotransferazy lub cDNA; lub (iii) wzrost fermentacyjny komórek wyrażających enzym w otoczeniu o niskiej zawartości amoniaku.

Fosforylację preparatów α-Gal A zwiększa się (i) dodając reszty fosforanowe przy pomocy genetycznie modyfikowanych komórek (przez zwykłe metody inżynierii genetycznej bądź przez aktywację genu) wyrażających gen lub cDNA fosforylotransferazy; lub (ii) dodając inhibitory fosfataz do hodowanych komórek.

Przy pomocy opisanych tu metod otrzymuje się preparaty ludzkiej glikozylowanej α-Gal A w których od 35% do 85% oligosacharydów jest naładowane. W korzystnym wykonaniu przynajmniej 35% oligosacharydów jest naładowane. W bardziej korzystnym wykonaniu przynajmniej 50% oligosacharydów jest naładowane.

Inne korzystne preparaty ludzkiej glikozylowanej α-Gal A posiadają rozliczne glikoformy α-Gal A zawierające korzystnie przynajmniej 50%, i najbardziej korzystnie przynajmniej 70% złożonych glikanów o 2-4 resztach kwasu sjalowego. W innym korzystnym wykonaniu preparaty ludzkiej glikozylowanej α-Gal A o rozlicznych glikoformach mają ładunek oligosacharydowy mierzony liczbą Z większy niż 100, korzystnie większy niż 150 i najbardziej korzystnie większy niż 170. W innym korzystnym wykonaniu, preparaty ludzkiej glikozylowanej α-Gal A o rozlicznych glikoformach mają przynajmniej średnio 16-50%, korzystnie 25-50%, bardziej korzystnie przynajmniej 30% glikoform ufosforylowanych. W innym korzystnym wykonaniu, preparaty o rozlicznych glikoformach posiadają 50-75%, korzystnie 60% z wszystkich glikanów sjalowane.

Preparat glikozylowanej α-Gal A o zwiększonym ładunku oligosacharydów wytwarza się wpierw wprowadzając polinukleotyd kodujący GlcNAc transferazę III (GnT-III) do komórki wytwarzającej α-Gal A lub wprowadzając przez rekombinację homologiczną sekwencję regulatorową regulującą ekspresję endogennego genu GNT-III. Następnie komórkę wytwarzającą α-Gal A hoduje się w warunkach prowadzących do wyrażania α-Gal A i GNT-III. Końcowy krok polega na izolacji preparatu α-Gal A o zwiększonym ładunku oligosacharydów.

Preparat glikozylowanej α-Gal A o zwiększonym ładunku oligosacharydów można wytwarzać wpierw wprowadzając polinukleotyd kodujący sjalotransferazę do komórki wytwarzającej α-Gal A lub wprowadzając przez rekombinację homologiczną sekwencję regulatorową regulującą ekspresję endogennego genu sjalotransferazy. Następnie komórkę wytwarzającą α-Gal A hoduje się w warunkach prowadzących do wyrażania α-Gal A i sjalotransferazy. Końcowy krok polega na izolacji preparatu α-Gal A o zwiększonym ładunku oligosacharydów. Korzystne sjalotransferazy obejmują α-2,3-sjalotransferazę i α-2,6-sjalotransferazę. W korzystnym wykonaniu metoda ta obejmuje dodatkowy krok selekcji glikoform α-Gal A na większe lub o zwiększonym ładunku przez frakcjonowanie lub oczyszczanie preparatu.

Preparat glikozylowanej α-Gal A o zwiększonym stopniu sjalowania korzystnie otrzymuje się działając na komórki wytwarzające α-Gal A pożywką hodowlaną zawierającą stężenie amoniaku poniżej

PL 210 833 B1 mM, korzystniej poniżej 2 mM. W korzystnym wykonaniu środowisko o niskiej zawartości amoniaku wytwarza się przez dodanie syntetazy glutaminy do pożywki hodowlanej. W innym korzystnym wykonaniu środowisko o niskim stężeniu amoniaku otrzymuje się przez ciągłą lub przerywaną perfuzję komórek wytwarzających α-Gal A świeżą pożywką hodowlaną w celu utrzymania stężenia amoniaku poniżej 10 mM, bardziej korzystnie poniżej 2 mM.

Preparat glikozylowanej α-Gal A o zwiększonej fosforylacji otrzymuje się wpierw wprowadzając do komórek wytwarzających α-Gal A polinukleotyd kodujący fosforylotransferazę lub wprowadzając przez rekombinację homologiczną sekwencję regulatorową regulującą ekspresję endogennego genu fosforylotransferazy. Następnie komórka wytwarzająca α-Gal A jest hodowana w warunkach prowadzących do ekspresji α-Gal A i fosforylotransferazy. Następnie izoluje się preparat α-Gal A o zwiększonej fosforylacji w porównaniu z α-Gal A z komórek bez polinukleotydu. W innym korzystnym wykonaniu preparaty α-Gal A posiadają różne glikoformy z których 16-50%, korzystnie 25-50%, bardziej korzystnie przynajmniej 30% jest ufosforylowane. W korzystnym wykonaniu ta metoda obejmuje dodatkowy krok selekcji na glikoformy α-Gal A o większym rozmiarze lub zwiększanie ładunku przez frakcjonowanie lub oczyszczanie preparatu.

Preparat glikozylowanej α-Gal A o zwiększonej fosforylacji otrzymuje się korzystnie dodając do hodowanych komórek inhibitor fosfataz, np. bromotetramizol. Niskie stężenia bydlęcej alkalicznej fosfatazy osocza mogą być obecne w płodowej surowicy bydlęcej stosowanej jako dodatek pobudzający wzrost hodowanych komórek. Zwiększa to prawdopodobieństwo, że eksponowane epitopy Man-6-P na wydzielanej α-Gal A będą substratem dla alkalicznej fosfatazy osocza.

Wykazano, że bromotetramizol jest silnym inhibitorem alkalicznej fosfatazy; Ki = 2,8 mM (Metaye i wsp., Biochem. Pharmacol. 15: 4263-4268 (1988)) i pełne hamowanie osiąga się przy stężeniu 0,1 mM (Borgers & Thone, Histochemistry 44: 277-280 (1975)). Zatem, do hodowanych komórek można dodać bromotetramizol, aby maksymalnie zwiększyć korzystne postaci α-Gal A obecne w pożywce hodowlanej zapobiegając hydrolizie grup Man-6-P estrowych.

Opisane tu preparaty α-Gal A wykazują wydłużony okres półtrwania w krwi obiegu u ssaków. Okres półtrwania w krwiobiegu i pobieranie przez komórki zwiększa się przez (i) zwiększenie zawartości kwasu sjalowego α-Gal A (osiągnięte jak powyżej); (ii) zwiększenie fosforylacji α-Gal A (osiągnięte jak powyżej); (iii) dodawanie PEG do α-Gal A; lub (iv) sekwencyjne usuwanie kwasu sjalowego i końcowych reszt galaktozowych lub usuwanie końcowych reszt galaktozowych z łańcuchów oligosacharydowych α-Gal A.

Ulepszone usjalowanie preparatów α-Gal A zwiększa okres półtrwania w krwiobiegu egzogennej α-Gal A. Dodatkowo, ulepszone usjalowanie α-Gal A poprawia jego pobieranie przez komórki niehepatocytarne, takie jak komórki śródbłonka wątroby, komórki zatokowe wątroby, komórki płuc, komórki nerek, komórki nerwowe, komórki śródbłonka czy komórki serca. Preparaty ludzkiej glikozylowanej α-Gal A o zwiększonej zawartości kwasu sjalowego zawierają korzystnie różne glikoformy, o co najmniej 20% złożonych glikanów zawierających 2-4 reszty kwasu sjalowego. Inny korzystny preparat ludzkiej glikozylowanej α-Gal A posiada rozmaite glikoformy w których 50-75%, korzystnie przynajmniej 60%, glikanów jest sjalowanych.

Fosforylacja preparatów α-Gal A zwiększa również stopień przenikania α-Gal A do komórek. Fosforylacja następuje w komórkach wyrażających α-Gal A. Jeden z korzystnych preparatów ludzkiej glikozylowanej α-Gal A zawiera różne glikoformy, z których korzystnie średnio przynajmniej 16-50%, korzystniej 25-50%, bardziej korzystnie przynajmniej 30% jest fosforylowane.

Okres półtrwania w krwiobiegu zwiększa się kompleksując α-Gal A z glikolem polietylenowym. W korzystnym wykonaniu preparat α-Gal A kompleksuje się stosując trezylomonometoksy-PEG (TMPEG) by otrzymać PEG-u-Gal A. PEG-u-Gal A następnie się oczyszcza aby otrzymać preparat PEG-α-Gal A. Dołączenie PEG do α-Gal A zwiększa okres półtrwania w krwiobiegu i skuteczność białka in vivo.

Sjalowanie zmienia okres półtrwania w krwiobiegu oraz biodystrybucję białek. Białka bez kwasu sjalowego lub z niewielką jego ilością są łatwo pobierane przez asjaloglikoproteinowy receptor (receptor Ashwella) na hepatocytach dzięki eksponowanym resztom galaktozowym białka. Okres półtrwania w krwiobiegu α-Gal A zakończonych galaktozą można zwiększyć przez sekwencyjne (1) usuwanie kwasu sjalowego przez stykanie α-Gal A z neuraminidazą (sialidazą), następnie pozostawianie eksponowanych końcowych cząsteczek galaktozy oraz (2) usuwanie końcowych reszt galaktozydowych przez kontaktowanie desjalowanej α-Gal A z β-galaktozydazą. Otrzymywany preparat α-Gal A ma zredukowaną liczbę końcowych kwasów sjalowych i/lub końcowych reszt galaktozydowych na łańcuchach oligosacharydowych w porównaniu z preparatami α-Gal A niekontaktowanymi sekwencyjnie

PL 210 833 B1 z neuraminidazą i β -galaktozydazą . Alternatywnie, okres pół trwania w krwiobiegu zakoń czonej galaktozą α-Gal A można zwiększyć przez samo usunięcie końcowych reszt galaktozydowych działając na odsjalowaną α-Gal A β-galaktozydazą. Powstały preparat α-Gal A ma zmniejszoną liczbę końcowych reszt w łańcuchach oligosacharydowych w porównaniu z preparatami α-Gal A, na które nie działano β-galaktozydazą. W korzystnym wykonaniu po sekwencyjnym działaniu neuraminidazą i β-galaktozydazą, powstałe preparaty α-Gal A traktuje się e-hexosaminidazą, w ten sposób odcinając oligosacharyd do rdzenia trimannozowego.

Dodatkowo, stopień usjalowania może się zmieniać w zależności od typu użytych komórek. Zatem usjalowanie α-Gal A można zwiększyć badając przesiewowe np. ludzkie komórki o stosunkowo wysokiej aktywności sjalotransferazy i stosując takie komórki jako komórki do wytwarzania α-Gal A.

Niniejszym opisano formy użytkowe preparatu α-Gal A w istotnym stopniu pozbawione innych niż α-Gal A białek, takich jak albumina, inne niż α-Gal A białka wytwarzane przez komórkę gospodarza lub białka wyizolowane ze zwierzęcej tkanki bądź płynu. W jednym z wykonań preparat użytkowy zawiera rozczynnik. Korzystne rozczynniki obejmują mannitol, sorbitol, glicerol, aminokwasy, lipidy, EDTA, EGTA, chlorek sodu, glikol polietylenowy, poliwinylopirolidon, dekstran, lub połączenie którychkolwiek z tych rozczynników. W innym wykonaniu preparat użytkowy zawiera jeszcze detergent niejonowy. Korzystne detergenty niejonowe obejmują Polysorbate 20, Polysorbate 80, Triton X-100, Triton X-1 14, Nonidet P-40, Oktylo α-glukozyd, Oktylo b-glukozyd, Brij 35, Pluronic i Tween 20. W korzystnym wykonaniu detergent niejonowy zawiera Polysorbate 20 lub Polysorbate 80. Korzystna postać użytkowa zawiera również i sól fizjologiczną buforowaną fosforanem, najkorzystniej przy pH6.

Preparat α-Gal A jest korzystnie preparatem α-Gal A o zmienionym ładunku, np. zwiększonym ładunku oligosacharydów, i/lub wydłużonym okresie półtrwania w krwiobiegu jak to opisano. Dawka do podawania preparatu korzystnie wynosi 0,05-0,5 mg, korzystniej 0,1-0,3 mg preparatu α-Gal A na kilogram wagi ciała tygodniowo lub raz na dwa tygodnie. W korzystnym wykonaniu dawka wynosi około 0,2 mg na kilogram wagi ciała raz na dwa tygodnie. Dawkę można podawać domięśniowo, doustnie, doodbytniczo, podskórnie, dotętniczo, śródotrzewnowo, domózgowo, donosowo, dowewnątrztorebkowo, przez błony śluzowe, przezskórnie lub przez inhalację. Dostarczanie preparatu α-Gal A pacjentowi może polegać na podskórnym podaniu dawki pomiędzy 0,01-10,0 mg, korzystnie 0,1-5,0 mg preparatu α-Gal A na kg wagi ciała tygodniowo lub raz na dwa tygodnie. Preparat a-Gal można również podawać dożylnie, np. w dożylnej jednorazowej iniekcji, w powolnej iniekcji dożylnej lub w ciągłej iniekcji dożylnej. W którejkolwiek z powyższych metod preparat α-Gal można dostarczyć stosując system taki jak pompa infuzyjna, dostarczanie w postaci kapsułkowanych komórek, jako liposomy, dostarczanie liposomalne, dostarczanie przez iniekcje igłowe, iniekcje bezigłowe, nebulizatory, aerozole, elektroporację, i opatrunki przezskórne. Każdy z preparatów α-Gal A opisanych powyżej można dostarczać którąkolwiek z tych metod.

Osoba podejrzana o chorobę Fabry'ego łub chora na chorobę Fabry'ego może być leczona przez podawanie opisanych powyżej preparatów α-Gal A, przy pomocy wyżej opisanych metod podawania i dawek. Niniejszym opisano sposoby leczenia chorych z chorobą Fabry'ego, jak i nietypowych wariantów choroby Fabry'ego, np. specyficznych populacji pacjentów z chorobą Fabry'ego o przeważających nieprawidłowościach układu sercowo-naczyniowego, określonych tu jako chorzy z chorobą Fabry'ego z przerostem komory, np. hipertrofią lewej komory (LVH), i/lub niedomykalnością zastawki dwudzielnej lub pacjenci z chorobą Fabry'ego o przeważającej komponencie nerkowej.

α-Gal A α-Gal A jest homodimeryczną glikoproteiną hydrolizującą końcowe reszty α-galaktozylowe glikolipidów i glikoprotein.

Stosowany tu termin dojrzałe „α-Gal A” i „GA-GAL” oraz „SEKW. NR ID.:5” (patrz FIG. 7) odnosi się do α-Gal A bez peptydu sygnałowego (α-Gal A z peptydem sygnałowym, patrz FIG. 3 oraz SEKW. NR ID.:3). Stosowany tu termin „preparat α-Gal A” stosuje się wymiennie z terminem „preparat glikozylowanej α-Gal A” i zawiera rozmaite glikozylowane glikoformy α-Gal A.

„Peptyd sygnałowy” to sekwencja peptydowa kierująca nowo syntetyzowany polipeptyd do którego jest dołączony peptyd sygnałowy do siateczki wewnątrzplazmatycznej (ER), w celu dalszej obróbki potranslacyjnej i rozprowadzenia.

Stosowany w kontekście α-Gal A termin „heterologiczny peptyd sygnałowy”, oznacza peptyd sygnałowy niebędący peptydem sygnałowym ludzkiego α-Gal A, zwykle peptyd sygnałowy innego niż α-Gal A białka ssaczego.

PL 210 833 B1

Osoby biegłe w dziedzinie stwierdzą, że sekwencja DNA ludzkiej α-Gal A (bądź cDNA [SEKW. NR ID.:5] bądź genomowego DNA), lub sekwencje różniące się od DNA ludzkiej α-Gal A wskutek cichych zmian kodonów lub zmian kodonów powodujących konserwatywne podstawienia aminokwasowe, może zostać użyta do modyfikacji genetycznej hodowanych komórek ludzkich tak, aby nadmiernie wyrażały i wydzielały enzym. Pewne mutacje sekwencji DNA α-Gal A mogą kodować polipeptydy utrzymujące aktywność enzymatyczną lub o większej niż α-Gal A aktywności enzymatycznej. Przykładowo, można się spodziewać, że konserwatywne podstawienia aminokwasowe mają niewielki wpływ lub nie wywierają wpływu na aktywność biologiczną, szczególnie, gdy stanowią mniej niż 10% wszystkich reszt w białku. Konserwatywne podstawienia aminokwasowe zwykle zawierają podstawienia wewnątrz poniższych grup: glicyna, alanina; walina, izoleucyna, leucyna; asparaginian, glutaminian; asparagina, glutamina; seryna, treonina; lizyna, arginina; fenyloalanina, tyrozyna. Patrz przykładowo patent US 5356804.

Choroba Fabry'ego

Choroba Fabry'ego jest chorobą genetyczną powodowaną przez niedobór aktywności enzymu α-Gal A. Przez „niedobór α-Gal A” rozumie się jakikolwiek niedobór w aktywności tego enzymu u pacjenta, z którego wynika nieprawidłowa akumulacja obojętnych glikolipidów (np. globotriaozylceramidu) w histiocytach w ścianach naczyń krwionośnych, rogowce krwawe na udach, pośladkach i genitaliach, zmniejszenie wydzielania potu, bóle kończyn, cornea verticillata oraz promienista tylnia zaćma podtorebkowa. Złogi tego materiału mogą powodować bóle, poważne choroby nerek i sercowonaczyniowe oraz udar. Akumulacja glikolipidów może powodować groźne objawy, jak zwykle obserwowane u mężczyzn cierpiących na chorobę Fabry'ego. Alternatywnie, akumulacja może powodować względnie łagodne objawy, jakie czasem się obserwuje u heterozygotycznych kobiet nosicielek defektywnego genu. Dotknięte chorobą osoby mają znacznie skróconą średnią długość życia; śmierć w wieku około 40 lat zwykle powodują powikłania ze strony nerek, serca, lub układu mózgowo naczyniowego. Nie istnieje specyficzny sposób leczenia tej choroby. Choroba Fabry'ego, określona jako lizosomalna choroba spichrzeniowa co roku dotyka na świecie 15 000 osób.

Choroba Fabry'ego zdefiniowana jak powyżej jest złożonym klinicznie zespołem cechującym się udziałem wielu organów i układów. Pacjenci przejawiający połączenie zaniku rogówki, uszkodzeń skóry (rogowce krwawe), bolesną neuropatię, chorobę mózgowonaczyniową, kardiomiopatię i niewydolność nerek są określani jako wykazujący „klasyczny” fenotyp. Są jednak również pacjenci wykazujący niektóre, lecz nie wszystkie aspekty klasycznego fenotypu. Takich pacjentów określa się jako „nietypowe warianty choroby Fabry'ego”. Istnieje kilka nietypowych wariantów fenotypów związanych z niedoborem α-galaktozydazy A. Przykładowo, niektórzy pacjenci z niedoborem α-galaktozydazy A mają postać choroby Fabry'ego z zajęciem jedynie serca, np. hipertrofię lewej komory (LVH). Istnieje również inny wariant fenotypu, w którym pacjenci mają zajęte jedynie nerki. Choć oba warianty tych fenotypów określono u hemizygotycznych mężczyzn, postaci wariantów choroby Fabry'ego opisywano również u heterozygotycznych kobiet.

U pacjentów z nietypowym sercowym wariantem zwykle objawy pojawiają się później w ciągu życia. Średni wiek diagnozy dla pacjentów z sercowym wariantem fenotypu wynosi około 52 lat w porównaniu do około 29 lat dla fenotypu klasycznego (Desnick, i wsp., w The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, wyd. 6 (1996). Scriver, i wsp., (red.), McGraw-Hill (New York), str. 2741-2784; Meikle i wsp., J Atli. Med. Assoc. 281: 249-254 (1999)). U pacjentów z tym zespołem często występują subtelne objawy zaburzenia czynności serca w postaci duszności wysiłkowej. Zazwyczaj standardowe badanie echokardiograficzne pokazuje u pacjentów z sercowym wariantem fenotypu hipertrofię lewej komory (LVH) lub niesymetryczną hipertrofię przegrody. Jednakże pacjenci mogą również mieć zawał serca lub kardiomiopatię (Scheldt i wsp., New Engel. J. Med. 324: 395 - 399 (1991); Nakao, i wsp., New Engl. J. Med. 333: 288 - 293 (1995)). U takich pacjentów często przeprowadza się biopsję mięśnia sercowego, a patologia wariantu zespołu jest zasadniczo podobna do klasycznej choroby Fabry'ego: naciekanie mięśnia sercowego przez odkładane glikolipidy. Badanie enzymu α-galaktozydazy A u tych pacjentów wykazuje szeroki zakres poziomu enzymu. Przykładowo, u pacjentów z wariantem sercowym donoszono o tak wysokiej aktywności jak 30% prawidłowej aktywności enzymu α-galaktozydazy A i zatem, jak dotąd, nie uważano ich za kandydatów do terapii substytucyjnej α-Gal A.

Twórcy nieoczekiwanie ujawnili, że choć pacjenci z nietypowym wariantem sercowym lub nerkowym mogą mieć poziom aktywności enzymu α-galaktozydazy A względnie wysoki w porównaniu z pacjentami o klasycznym fenotypie choroby Fabry'ego, pacjenci ci również mogą skorzystać na terapii

PL 210 833 B1 enzymem α-galaktozydazą A. Przykładowo, pacjenci mogą mieć mutację powodująca wytwarzanie kinetycznie niestabilnego enzymu α-Gal A w komórce i u takich pacjentów poziom aktywności enzymu α-Gal A można znacząco podnieść podając preparat α-Gal A według wynalazku. Donoszono również o pewnych pacjentach z nietypowym sercowym wariantem fenotypu, że posiadają mutację 215 aminokwasu α-galaktozydazy A. W niezmutowanym białku tym aminokwasem jest asparagina, która jest glikozylowana (Eng i wsp., Am. J Hum. Genet. 53: 1186 - 1197. (1993)). Zatem, terapia substytucyjna enzymem α-Gal A z preparatem właściwie glikozylowanej α-galaktozydazy A według wynalazku może być skuteczna u tych pacjentów. Dalej, wśród pacjentów z nietypowym nerkowym wariantem opisywano takich, u których jedynym objawem klinicznym choroby Fabry'ego jest łagodny białkomocz. Biopsja nerek jednakże wykazuje u nich typowe dla choroby Fabry'ego glikolipidowe inkluzje, a badanie aktywności enzymu α-Gal A pokazuje niższy od prawidłowych poziom aktywności α-Gal A. Jednakże, ponieważ odłożone w nerkach triheksozydy ceramidu można wykryć w złuszczonych komórkach kanalików nerkowych w osadzie moczu tych pacjentów, podawanie preparatów α-Gal A może znacząco obniżyć ten poziom. Enzymy lizosomalne, takie jak α-Gal A są kierowane do przedziału lizosomalnego komórki przez interakcje z receptorem mannozo-6-fosforanu (M6P), wiążącym się do reszt M6P obecnych w oligosacharydowych fragmentach cząsteczki enzymu przeznaczonego do przedziału lizosomalnego. Komfeld i Mellmaii, Ann. Rev. Komórk Biol. 5: 483-525 (1989). Pierwotne oddziaływanie ma miejsce w aparacie Golgiego, gdzie związane z receptorem Golgi M6P enzymy są segregowane do transportu do lizosomów. Uważa się, że drugi typ oddziaływań ma miejsce między zewnątrzkomórkową α-Gal A i receptorami M6P na powierzchni komórki. Enzymy uciekające z systemu kierowania są wydzielane przez komórkę przez konstytutywne drogi wydzielania i są często ponownie wychwytywane na powierzchni komórek przez receptory M6P cofające α-galaktozydazę A do lizosomu szlakiem endocytozy. Zewnątrzkomórkowe substancje pobierane przez komórki są transportowane poprzez cytoplazmę w pęcherzykach endocytarnych, które ulegają fuzji z pierwotnymi lizosomami i wyrzucają swoją zawartość do lizosomów. W tym procesie receptory M6P powierzchni komórki są również włączane w pęcherzyki endocytarne i transportowane do lizosomów. W szczególności, preparaty α-Gal według wynalazku, w których jest wysoki poziom usjalowania i/lub fosforylacji, są korzystne do leczenia pacjentów z nietypowymi wariantami choroby Fabry'ego. Takie preparaty, na przykład, minimalizują część wstrzykniętej α-Gal A usuwaną przez hepatocyty i pozwalają na wysoki poziom pobierania α-Gal A przez komórki niewątrobowe, takie jak komórki nerek, komórki naczyń, komórki kanalików nerkowych, komórki kłębuszkowe, miocyty serca i sercowe komórki naczyniowe.

Zewnątrzkomórkowa α-Gal A niosąca reszty M6P może się związać z receptorami powierzchni komórek M6P i zostać przetransportowana do przedziału lizosomalnego. Znalazłszy się w przedziale lizosomalnym, α-Gal A może wykonywać właściwą sobie funkcję. To w tym aspekcie obrót enzymu lizosomalnego czyni terapię substytucyjną enzymem α-galaktozydazą A realnym leczeniem dla pacjentów z chorobą Fabry'ego. Zatem, nawet jeśli komórka jest genetycznie defektywna w wytwarzaniu α-Gal A, komórka może pobierać zewnątrzkomórkowa α-Gal A, jeśli α-Gal A jest odpowiednio glikozylowana i defektywna komórka posiada receptory M6P. U pacjentów z chorobą Fabry'ego, komórki śródbłonka naczyń nerki i serca wykazują poważne zaburzenia histopatologiczne i biorą udział w klinicznej patologii choroby. Te komórki, które niosą receptory M6P, są szczególnym celem terapeutycznym dla α-Gal A. Celem wynalazku jest dostarczenie preparatów α-Gal A w których M6P jest obecny w przyłączonych do N końca oligosacharydach.

Stopień, w jakim przyłączone do N końca oligosacharydy α-Gal A są modyfikowane przez sjalowanie wywiera znaczący wpływ na farmakokinetykę i biodystrybucję α-Gal A. Przy barku odpowiedniego usjalowania α-Gal A jest szybko usuwany z krwioobiegu wskutek wiązania się z wątrobowymi receptorami asjaloglikoproteinowymi (receptory Ashwella), a następnie wchłonięcie i degradację przez hepatocyty. Ashwell i Harford, Ann. Rev. Blochem. 51: 531-554 (1982). Zmniejsza to ilość dostępnego α-Gal A w krwioobiegu dla wiązania przez receptory M6P na komórkach, takich jak komórki śródbłonka naczyń nerki i serca, co przyczynia się do patologii klinicznej choroby Fabry'ego. Wydzielana przez genetycznie modyfikowane ludzkie komórki α-Gal A ma właściwości glikozylacji odpowiednie do leczenia choroby Fabry'ego bądź przez konwencjonalne podawanie oczyszczonego wydzielonego białka lub przez terapię genową, nie wymagając dodatkowych modyfikacji enzymatycznych, jakie opisywano dla enzymu lizozomalnego, glukocerebrozydazy, którego pobieranie przez klinicznie określone jako potrzebujące komórki wymaga skomplikowanych modyfikacji enzymatycznych enzymu po oczyszczeniu z ludzkiego łożyska. Beutier, New Engl. J Med. 325:1354-1360 (1991).

PL 210 833 B1

Komórki odpowiednie do wytwarzania α-Gal A

Osobę podejrzaną o niedobór α-Gal A, jak w postaci choroby Fabry'ego można leczyć oczyszczoną ludzką α-Gal A otrzymaną z hodowanych genetycznie modyfikowanych komórek, korzystnie komórek ludzkich.

Jeśli komórki mają być genetycznie modyfikowane do leczenia choroby Fabry'ego, można je modyfikować konwencjonalnymi metodami inżynierii genetycznej lub przez aktywację genu.

Zgodnie z konwencjonalnymi metodami cząsteczka DNA zawierająca cDNA lub sekwencje genomową α-Gal A może się zawierać w konstrukcie ekspresyjnym którym zostaną transfekowane pierwotne, wtórne lub unieśmiertelnione linie komórkowe za pomocą standardowych metod obejmujących transfekcję przy pomocy liposomów, polibrenu lub DEAE dekstranu, elektroporację, strącanie fosforanem wapnia, mikroiniekcję, lub mikropociski („biolistyka”) (patrz np. zgłoszenie US o nr 08//334,797).

Alternatywnie, można użyć układu dostarczającego informację genetyczną za pośrednictwem wektora wirusowego. Wirusy znane jako użyteczne do transferu genów obejmują adenowirusy, wirusy związane z adenowirusami, wirus opryszczki, wirus świnki, wirus polio, retrowirusy, wirus Sindbis oraz wirus krowianki, taki jak wirus ospy wietrznej.

Alternatywnie, komórki mogą być modyfikowane podejściem aktywacji genu („GA”), jak opisano w patentach US 5733761 i 5750376 . α-Gal A wytworzony wskutek aktywacji genu jest opisywany w niniejszym zgłoszeniu jako GA-GAL.

Odpowiednio, termin „genetycznie modyfikowany” stosowany tu w odniesieniu do komórek obejmuje komórki wyrażające szczególny produkt genu po wprowadzeniu cząsteczki DNA kodującej produkt tego genu i/lub elementów regulatorowych kontrolujących ekspresję sekwencji kodującej produktu genu.

Cząsteczkę DNA można prowadzić przez kierowanie do genu lub rekombinację homologiczną, tj. wprowadzenie cząsteczki DNA do szczególnego miejsca w genomie. Rekombinację homologiczną można stosować do zastąpienia defektywnego genu samego w sobie (defektywny gen α-Gal A lub jego część może zostać we własnych komórkach pacjenta z chorobą Fabry'ego zastąpiony całym genem bądź jego częścią).

Stosowany tu termin „komórki pierwotne” obejmuje komórki obecne w zawiesinie komórek wyizolowanych ze źródłowej tkanki kręgowca (przed ich wysianiem, tj. przyczepieniem do podłoża dla hodowli tkankowej, jak szalka czy butelka), komórki obecne w eksplancie otrzymanym z tkanki, oba poprzednie typy komórek wysiane po raz pierwszy oraz zawiesiny komórkowe otrzymane z takich wysianych komórek.

„Komórki wtórne” odnosi się do komórek we wszystkich kolejnych etapach hodowli. To znaczy, że po pierwszym usunięciu wysianych komórek z podłoża hodowlanego i wysianiu (pasaż), komórki już są wtórne i takimi są komórki ze wszystkich kolejnych pasaży.

„Linia komórkowa” składa się z wtórnych komórek pasażowanych raz lub więcej; wykazuje skończoną liczbę podwojeń populacji w hodowli; wykazuje właściwości hamowanego kontaktem i zależnego od zakotwiczenia wzrostu (z wyjątkiem komórek hodowanych w zawiesinie); oraz nie jest nieśmiertelna.

Jako „komórki unieśmiertelnione” rozumie się komórki z ustalonej linii komórkowej wykazującej wyraźnie nieograniczony czas życia w hodowli.

Przykłady pierwotnych lub wtórnych komórek obejmują fibroblasty, komórki nabłonka włączając nabłonek sutka i jelit, komórki śródbłonak, uformowane ciałka krwi włączając limfocyty i komórki szpiku kostnego, komórki glejowe, hepatocyty, keratynocyty, komórki mięśniowe, komórki nerwowe lub prekursory tych rodzajów komórek. Przykłady unieśmiertelnionych ludzkich linii komórkowych użytecznych w niniejszych metodach obejmują między innymi komórki czerniaka Bowes (Nr dostępu ATCC CRL 9607), komórki Daudi (Nr dostępu ATCC CCL 213), komórki HeLa i pochodne komórek HeLa (Nr dostępu ATCC CCL 2, CCL 2.1, oraz CCL 2.2), komórki HL-60 (Nr dostępu ATCC CCL 240), komórki HT-1080 (Nr dostępu ATCC CCL 121), komórki Jurkat (Nr dostępu ATCC TIB 152), komórki raka K-B (Nr dostępu ATCC CCL 17), komórki białaczki K-562 (Nr dostępu ATCC CCL 243), komórki raka sutka MCF-7 (Nr dostępu ATCC BTH 22), komórki MOLT-4 (Nr dostępu ATCC 1582), komórki Namalwa (Nr dostępu ATCC CRL 1432), komórki Raji (Nr dostepu ATCC CCL 86), komórki RPMI 8226 (Nr dostępu ATCC CCL 155), komórki U-937 (Nr dostępu ATCC 1593), komórki WI-3 8VAI 3 sublinia 2R4 (Nr dostępu ATCC CLL 75. 1), komórki CCRF-CEM (Nr dostępu ATCC CCL 119), komórki raka jajnika

PL 210 833 B1

2780AD (Van der Blick i wsp., Cancer Res. 48: 5927-5932, 1988), oraz heterohybrydowe komórki wytworzone przez fuzję ludzkich komórek i komórek innego gatunku.

Po genetycznej modyfikacji ludzkich komórek w celu wytworzenia komórek wydzielających α-Gal A można wytworzyć klonalny szczep komórkowy, składający się w zasadzie z dużej liczby genetycznie identycznych pierwotnych komórek ludzkich lub, gdy komórki są unieśmiertelnione, klonalną linię komórkową składającą się w zasadzie z dużej liczby genetycznie identycznych unieśmiertelnionych ludzkich komórek. W jednym z wykonań komórki klonalnego szczepu komórkowego lub klonalnej linii komórkowej są fibroblastami. W innym wykonaniu komórki są wtórnymi ludzkimi fibroblastami, np. komórki BRS-11.

Po genetycznej modyfikacji komórki hoduje się w warunkach pozwalających na wydzielanie α-Gal A. Białko izoluje się z hodowanych komórek zbierając pożywkę, w której komórki były poddane wzrostowi i/lub poddaje komórki lizie w celu uwolnienia ich zawartości, następnie stosując techniki oczyszczania białek.

Oczyszczenie α-Gal A z kondycjonowanej pożywki stabilnie transfekowanych komórek

Zgodnie z metodami niniejszego wynalazku białko α-Gal A izoluje się z hodowanych komórek („komórek wytwarzających α-Gal A”) przez zbieranie pożywki, w której rosły komórki lub lizę komórek w celu uwolnienia ich zawartości, a następnie zastosowanie technik oczyszczania białek bez stosowania chromatografii powinowactwa z lektyną. Korzystny proces oczyszczania jest opisany w przykładzie 2 poniżej.

Alternatywnie do oczyszczenia α-Gal A można również użyć złoża oddziaływań hydrofobowych, takiego jak Source Iso (Pharmacia), Macro-Prep® Methyl Support (Bio-Rad), TSK Butyl (Tosohaas) lub Phenyl Sepharose® (Pharmacia). Kolumnę można zrównoważyć względnie wysokim stężeniem soli np. 1 M siarczan amonu lub 2 M chlorek sodu w buforze o pH 5,6. Próbka do oczyszczania jest przygotowywana przez doprowadzenie pH i stężenia soli do takich, jak w buforze do równoważenia. Próbkę nakłada się na kolumnę i kolumnę przemywa się buforem do równoważenia, aby usunąć niezwiązany materiał. α-Gal A wymywa siq z kolumny buforem o mniejszej sile jonowej, wodą, lub rozpuszczalnikiem organicznym w wodzie, np. 20% etanol lub 50% glikol propylenowy. Alternatywnie, można wypłukać α-Gal A stosując niższe stężenie soli w buforze do równoważenia i w próbie lub stosując różne pH. Korzystnym pierwszym krokiem oczyszczania jest kolumna hydroksyapatytowa.

Jako alternatywny krok oczyszczania α-Gal A można stosować złoże jonowymienne kationowe, np. SP Sepharose® 6 Fast Flow (Pharmacia), Source 30S (Pharmacia), CM Sepharose® Fast Flow (Pharmacia), Macro-Prep®CM Support (Bio-Rad) lub Macro-Prep®High S Support(Bio-Rad).

„Pierwszym krokiem chromatografii” jest pierwsze nałożenie próbki na kolumnę chromatograficzną (wszystkie kroki związane z przygotowaniem próbki są wyłączone), α-Gal A może się wiązać z kolumną przy pH 4,4. Do zrównoważenia kolumny stosuje się bufor 10 mM octan sodu, pH 4,4 i 10 mM cytrynian sodu lub inny bufor z odpowiednią zdolnością buforowania przy około pH 4,4. Oczyszczaną próbkę doprowadza się do pH i siły jonowej buforu równoważącego. Próbę nakłada się na kolumnę i przemywa, aby wypłukać niezwiązany materiał. Do elucji α-Gal A z kolumny można użyć soli, takiej jak chlorek sodu czy chlorek potasu. Można też wymywać α-Gal A z kolumny buforem o wyższym pH lub kombinacją wyższego stężenia soli i wyższego pH. α-Gal A z kolumny można również wypłukać podczas nakładania, zwiększając stężenie soli w buforze równoważącym i nakładanej próbie, puszczając kolumnę przy wyższym pH lub przez połączenie zwiększonego stężenia soli i wyższego pH.

Inny krok oczyszczania korzysta z Q Sephrarose® 6 Fast Flow do oczyszczania α-Gal A. Q Sephrarose® 6 Fast Flow jest stosunkowo silnym złożem anionowymiennym. Słabsze złoża anionowymienne, takie jak DEAE Sepharose® Fast Flow (Pharmacia) lub Macro-Prep® DEAB(Bio-Rad) również można użyć do oczyszczenia α-Gal A. Kolumnę równoważy się buforem, np. 10 mM fosforanem sodu, pH 6. pH próbki doprowadza się do i poprzez rozcieńczanie lub dializę próby osiąga się niską siłę jonową próby. Próbkę nakłada się na kolumnę w warunkach pozwalających na wiązanie się α-Gal A. Kolumnę przemywa się buforem równoważącym, aby usunąć niezwiązany materiał. α-Gal A wymywa się przy pomocy soli, np. chlorku sodu lub chlorku potasu lub użycie niższego pH buforu lub połączenie obydwu. α-Gal A można również wypłukać z kolumny podczas nakładania zwiększając stężenie soli podczas ładowania lub płukanie kolumny przy niższym pH, lub przez połączenie zarówno zwiększenia stężenia soli jak i niższego pH.

Inny krok oczyszczania może obejmować chromatografię wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek Superdex® 200 (Pharmacia) do oczyszczenia α-Gal A. Można również użyć złoża o innych

PL 210 833 B1 rozmiarach do chromatografii wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek jak Sephacryl® S-200 HR lub Bio-Gelg A-1.5 Korzystnym buforem do chromatografii wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek jest 25 mM fosforan sodu, pH 6,0, zawierający 0,15 M chlorek sodu. Również można użyć inne zgodne z preparatem bufory, np. 10 mM cytrynian sodu lub potasu. pH buforu musi być pomiędzy pH 5 a pH 7 i powinien on zawierać sól, np. chlorek sodu lub mieszaninę chlorku sodu i potasu. W innym kroku oczyszczania można do oczyszczenia α-Gal A użyć złoża do chromatoogniskowania, takiego jak Polybuffer Exchanger PBE 94 (Pharmacia). Kolumnę równoważy się przy stosunkowo wysokim pH (np. pH 7 lub więcej), pH oczyszczanej próbki doprowadza się do tego samego pH, a następnie nanosi się ją na kolumnę. Białka wymywa się z obniżającym się gradientem pH do pH takiego, jak pH 4, stosując układ buforujący, np. Polybuffer 74 (Pharmacia), dopasowany do pH4.

Alternatywnie można do oczyszczenia α-Gal A użyć chromatografii immunopowinowactwa. Odpowiednie poliklonalne lub monoklonalne przeciwciało przeciwko α-Gal A (wytworzone przez immunizację α-Gal A pepetydem otrzymanym przy użyciu standardowych technik z α-Gal A można unieruchomić na aktywowanej żywicy do koniugowania np. aktywowanej NHS Sepharose® 4 Fast Flow (Pharmacia) lub aktywowanej CNBr Sepharose® 4 Fast Flow (Pharmacia). Próbkę do oczyszczania nakłada się na immobilizowane przeciwciało na kolumnie przy pH 6 lub pH 7. Kolumnę przemywa się tak, aby usunąć niezwiązany materiał. α-Gal A wymywa się z kolumny typowymi odczynnikami stosowanymi do wymywania kolumny powinowactwa jak o niskim pH, np. pH 3, denaturant, np. chlorowodorek guanidyny lub tiocyjanian, lub rozpuszczalnik organiczny np. 50% glikol propylenowy w buforze pH 6. Procedura oczyszczania α-Gal A może się również opierać na złożu chelatowaniu metali np. Chelating Sepharose Fast Flow® (Pharmacia). Kolumna jest wcześniej naładowana jonami np. Cu²⁺, Zn²⁺, Ca²⁺, Mg²⁺ lub Cd²⁺. Oczyszczaną próbę nakłada się na kolumnę przy odpowiednim pH, np. pH 6 to 7,5, i przemywa się kolumnę, aby usunąć niezwiązane białka. Związane białka eluuje się przez elucję kompetycyjną z imidazolem i histydyną przez obniżenie pH przy pomocy cytrynianu sodu lub octanu sodu do pH niższego niż 6 lub przez wprowadzenie czynników chelatujących, jak EDTA lub EGTA.

Zgodnie z poniższymi protokołami dostarczone są preparaty o wyższej czystości prepratu α-Gal A niż wcześniej znane w dziedzinie, oczyszczonych do co najmniej 98% homogenności, bardziej korzystnie do co najmniej 99% homogenności i najbardziej korzystnie do co najmniej 99,5%) homogenności mierzonej SDS-PAGE lub HPLC w odwróconej fazie. Preparaty α-Gal A mogą zawierać liczne glikoformy α-Gal A. Odpowiednio, stosowany tu w kontekście preparatów α-Gal A termin „homogenność”, odnosi się do preparatów w istotnym stopniu wolnym (<2% wszystkich białek) od białek innych niż α-Gal A. Przykładami białek innych niż α-Gal A są albumina, inne niż α-Gal A białka wytwarzane przez komórkę gospodarza, oraz inne niż α-Gal A białka izolowane ze zwierzęcej tkanki lub płynu. Aktywność specyficzna preparatów α-Gal A według niniejszego wynalazku wynosi korzystnie przynajmniej 2,0 x 10⁶ jednostek/mg białka, bardziej korzystnie przynajmniej 3,0 x 10⁶ jednostek/mg białka i najbardziej korzystnie przynajmniej 3,5 x 10⁶ jednostek/mg białka.

Zwiększenie okresu półtrwania krążących preparatów α-Gal A przez remodelowanie glikanów w celu zwiększenia ładunku oligosacharydów

Niniejszym przedstawiono program modyfikacji glikoprotein w celu zwiększenia pobierania leczniczego enzymu w specyficznych tkankach innych niż wątroba i makrofagi. Przy użyciu metod tu opisanych otrzymywane są preparaty ludzkiego glikozylowanego α-Gal A, przy czym między 35% a 85% oligosacharydów posiada ładunek, korzystnie co najmniej 50%o oligosacharydów posiadających ładunek.

N-glikozylacje białek działają przez modyfikowanie odpowiednich reszt asparaginy białek zawierających struktury oligosacharydowe, wpływające na ich właściwości i aktywność biologiczną. Kukuruzinska i Lennon, Crit. Rev. Oral. Biol. Med 9: 415-48 (1998). Wyizolowany preparat α-Gal A, w którym wysoki procent oligosacharydów posiada ładunek negatywny, otrzymany jest głównie przez dodanie jednej do czterech reszt kwasu sjalowego do złożonych glikanów lub jedną do dwóch reszt fosforanowych na glikanach bogatych w mannozę lub jedną resztę fosforanową i jedną resztę kwasu sjalowego na glikanach hybrydowych. Mogą być obecne również mniejsze ilości złożonych glikanów siarczanowych. Duży udział cząstek obdarzonych ładunkiem pełni dwie główne funkcje. Po pierwsze, czapeczkowanie przedostatnich reszt galaktozy przez 2,3- lub 2,6-połączony kwas sjalowy zapobiega przedwczesnemu ich usunięciu z krążenia przez receptor asialoglikoproteiny obecny na hepatocytach. Receptor ten rozpoznaje glikoproteiny z terminalną resztą galaktozy. Zwiększenie okresu półtrwania krążących α-Gal A daje ważnym narządom docelowym, takim jak serce czy nerki szansę na endocytozę większych ilości enzymu z osocza. Po drugie, obecność Man-6-fosforanu na glikanach bogatych

PL 210 833 B1 w mannozę lub hybrydowych daje moż liwość zachodzą cego przez receptor pobierania preparatu przez niezależny od kationów receptor Man-6-fosforanu (CI-MPR). To pobieranie za pośrednictwem receptora zachodzi na powierzchni wielu komórek, w tym komórek śródbłonka naczyń, które są głównym miejscem przechowywania CTH u pacjentów chorych na chorobę Fabry'ego. Cząsteczki enzymu z dwiema resztami Man-6-fosforanu mają dużo większe powinowactwo do CI-MPR niż te z jedną resztą Man-6-fosforanu.

Przykładowe struktury glikanów przedstawia Tabela 1.

Tabela 1

Przykładowe struktury glikanów

Glikan o dwóch rozgałęzieniach:

±Fucał,6

SAa2,3/6Gaipi,4GlcNAcpl,2Manal,ó \ |

Manp 1,4GlcNAcpi,4GlcNAc-Asn

SAa2,3/6Gaip 1,4GlcNAcp 1,2Manai,3 /

Glikan o czterech rozgałęzieniach:

SAa2,3/6Gaipi,4GlcNAcpl,6\ ±Fucctł,6

SAa2,3/6Gaipi_ł4GlcNAcpi,2Manal,6 \ j

ManI3 l,4GlcNAcf31,4GlcNAc-Asn SAa2_s3/6Gaipi,4GlcNAcpi,2Manal,3 /

SAa2,3/6Galpl,4GlcNAcpl,4 /

Glikan o wysokiej zawartości mannozy:

Mana 1,2Manal,6 \

Manal.ć \

Mana!,2Mana 1,3 / Manpi,4GlcNAcpl,4GlcNAc-Asn

Manal,2Manal,2Manal,3 /

Glikan hybrydowy ufosforylowany:

P-Manal,6 \

Manal,6 \

Mana 1,3 / Manpi,4GlcNAcpl,4GlcNAc-Asn SAa2,3/6GaIpł,4GlcNAcpl,2Manal,3 /

Glikan dwuufosforylowany:

P-Manal,2Manal,6 \

Mance.1,6 \

Mana 1,3 / Manp 1,4GlcNAcp 1,4GłcNAc-Asn P-Manal,2Manal,3 /

Biosynteza N-glikoprotein angażuje szereg enzymów, glikozylotransferaz i glikozydaz. Większość tych enzymów działa w retikulum endoplazmatycznym (ER) i aparacie Golgiego w uporządkowany i dobrze kierowany sposób. Złożoność N-glikozylacji zwiększa jeszcze fakt, że różne reszty asparaginy w tym samym polipeptydzie mogą być modyfikowane różnymi strukturami oligosacharydów i różne białka są rozróżniane od innych przez charakterystyczne reszty węglowodanowe. Dzięki ostatnim odkryciom genetyki molekularnej zidentyfikowano, wyizolowano i scharakteryzowano geny N-glikozylacji. W rezultacie pojawiły się informacje odnośnie powiązań między N-glikozylacją a innymi funkcjami komórki.

Obróbka N-połączonych glikoprotein w komórce zaczyna się, gdy łańcuch oligosaccharydu z Glc3Man9GlcNAc2 jako jedna całość dodawany jest do akceptorowej asparaginy na powstającym

PL 210 833 B1 peptydzie w świetle ER. 14-cukrowy łańcuch oligosacharydu złożony z Glc3Man9GlcNAc2 przenoszony jest na dolichol, bardzo długołańcuchowy alkohol alifatyczny:

ManaI,2Mancd ,6 \

Manal,6 \

Manal,2Mana 1,3 / Manpi,4GlcNAcpl,4GlcNAc-PP-Dolichol

Gica 1,2Glca 1,3Glca 1,3Mana 1,2Mana 1,2Mana 1,3 /

Ten oligosacharyd jako jedna całość dodawany jest do akceptorowej asparaginy na powstającym peptydzie w świetle ER. Duży rozmiar glikanu względem peptydu może odgrywać rolę w fałdowaniu białka. Trzy reszty glukozy służą jako sygnał, że oligosacharyd jest ukończony i gotowy do transferu przez transferazę oligosacharydową. Ten enzym również przenosi nieglukozylowane oligosacharydy, ale tylko w niewielkim stopniu niż ukończone łańcuchy, gdyż nieglukozylowane oligosacharydy są substratami suboptymalnymi. Jedna z form zespołu niedoboru węglowodanów u ludzi spowodowana jest niedoborem Dolicholo-P-Glc: Man9GlcNAc2-PP-Dolichol glukozylo transferazy, pierwszego enzymu szlaku dodawania glukozy, czego rezultatem jest hipoglikozylacja białek osocza. Komer i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13200-13205 (1998). Po usunięciu 3 reszt glukozy i przybraniu prawidłowej konformacji, nowo zsyntetyzowana glikoproteina jest eksportowana do aparatu Golgiego. Zależnie od dostępności glikanu dla mannozydaz w aparacie Golgiego, po sfałdowaniu łańcuch glikanu może stać się glikanem o dużej zawartości mannoz z 5-9 resztami mannozy, lub też łańcuch glikanu może podlegać dalszej obróbce do rdzenia trimannozylowego i stać się akceptorem dla innych glikozylotransferaz, które tworzą złożone łańcuchy przez dodanie więcej reszt GlcNAc, a nastę pnie Gal, NeuAc and Fuc. Trzecia moż liwość, jeś li biał ko ma dwie reszty lizyny, odległ e dokładnie o 34 angstremy w prawidłowej orientacji przestrzennej do łańcucha o dużej zawartości mannozy, do węgla 6 dodawany jest do jednej lub czasem dwóch reszt mannozy, łańcuch GlcNAca-1-PO₄. Cuozzo i wsp., J. Biol. Chem. 273: 21069-21076 (1998). Po usunięciu α-przyłączonej GIcNAc przez specyficzny enzym, powstaje terminalny epitop M6P, rozpoznawany przez receptor M6P części trans aparatu Golgiego, który kieruje te enzymy do lizosomów w komórkach pochodzenia mezenchymatycznego.

Aby dostarczyć α-Gal A do tak wielu tkanek, jak to możliwe, użyteczne jest wiele różnych struktur węglowodanów (glikoform). Matsuura i wsp., Glycobiology 8: 329-339 (1998) odkryli, że struktury glikanów na ludzkim α-Gal A wytworzonym w komórkach CHO miały 41% glikanów o wysokiej zawartości mannozy, a poziom fosforylacji wynosił 24%. Jednakże poziom usjalowanych glikanów złożonych wynosił tylko 11%. Dlatego też 2/3 złożonych łańcuchów nie było usjalowanych, co doprowadziło do szybkiego usunięcia α-Gal A przez wątrobę. α-Gal A wytwarzany w ludzkich komórkach ma wyższy procent obdarzonych ładunkiem oligosacharydów niż wcześniej znany w dziedzinie α-Gal A wytwarzany w komórkach CHO. Na przykład, α-Gal A zsyntetyzowany w komórkach HT-1080 opisanych tutaj jest szczególnie odpowiedni, gdyż α-Gal A wytworzony w komórkach HT-1080 zawiera około 15% struktur neutralnych (wysoko-mannozowych i hybrydowych), około 16% ufosoforylowanych glikanów i około 67% glikanów złożonych z 2 do 4 resztami sjalowymi. Niemal wszystkie łańcuchy złożone są usjalowane w porównaniu do α-Gal A w komórkach CHO. α-Gal A komórki HT-1080 ma 3 N-przyłączone miejsca glikozylacji. Dwa obrabiane są do glikanów złożonych w aparacie Golgiego, podczas gdy trzecie zajęte jest przez glikan wysokomannozowy, 50% którego modyfikowane jest przez specyficzną fosforylacje lizosomalną, co prowadzi zarówno do mono-, jak i di-ufosforylowanych struktur.

Przedstawione są cztery metody remodelingu węglowodanów na białku zawierającym N-przyłączone łańcuchy glikanów. W pierwszej, udział naładowanych α-Gal A może być zwiększony przez selektywną izolacje glikoform podczas procesu oczyszczania. Niniejszy wynalazek przedstawia dla zwiększenia udziału glikoform α-Gal A o dużym ładunku i większej masie cząsteczkowej frakcjonowanie cząstek α-Gal A na kolumnie chromatograficznej podczas i/lub po procesie oczyszczania. Więcej glikoform α-Gal A o dużym ładunku zawiera więcej kwasu sjalowego i/lub więcej fosforanu; glikoformy o większej masie cząsteczkowej będą również zawierać w pełni uglikozylowane, najbardziej rozgałęzione i wysoko naładowane cząsteczki. Selekcja tych naładowanych rodzajów lub usunięcie niezglikozylowanych, mało zglikozylowanych lub słabo usjalowanych i/lub ufofsforylowanych rodzajów α-Gal A da w rezultacie populację glikoform α-Gal A z większą zawartością kwasu sjalowego i/lub fosforanu, tym samym zapewniając preparat α-Gal A o dłuższym okresie półtrwania i większym potencjale terapeutycznym.

PL 210 833 B1

Proces frakcjonowania może wystąpić na odpowiedniej żywicy chromatograficznej używanej do oczyszczania bądź izolacji α-Gal A, choć nie jest do niej ograniczony. Na przykład, frakcjonowanie można przeprowadzić, choć nie ogranicza się do, na żywicach kationowymiennych (takich jak SP-Sepharose®), żywicach anionowymiennych (takich jak Q-Sepharose®), żywicach chromatografii powinowactwa (Heparin Sepharose®, kolumny lektynowe), kolumnach chromatografii wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek (Superdex® 200) i kolumnach interakcji hydrofobowych (Butyl Sepharose®) oraz innych kolumnach chromatograficznych znanych w dziedzinie.

Ponieważ α-Gal A jest wytwarzany w komórkach jako heterogenna mieszanina glikoform o różnych masach i ładunku, α-Gal A eluowane jest względnie szerokim pikiem z kolumny. Podczas eluowania, glikoformy rozmieszczone są w szczególny sposób zależnie od żywicy, z jaka była użyta. Na przykład, podczas chromatografii wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek, największe glikoformy będą wymywane wcześniej niż glikoformy mniejsze.

W chromatografii jonowymiennej, najbardziej ujemnie naładowane glikoformy będą silniej wiązać się z dodatnio naładowanymi żywicami (takimi jak Q-Sepharose®) niż mniej ujemnie naładowane glikoformy, i dlatego będą wymywane później w profilu elucji. Przeciwnie, te bardzo ujemnie naładowane glikoformy mogą wiązać się słabiej do ujemnie naładowanej żywicy, takiej jak SP Sepharose®, niż mniej ujemnie naładowane glikoformy, lub mogą nawet nie wiązać się wcale.

Na frakcjonowanie glikoform na żywicach chromatograficznych może wpływać pH, siła jonowa, wybór soli buforu, lepkość i/lub inne parametry jak wybór typu żywicy. Eluowanie w gradiencie (gradienty prostoliniowe, krzywe, np. Wykładnicze) lub użycie serii krótkich etapów wymywania, aby selektywnie wymyć różne rodzaje α-Gal A z kolumny chromatograficznej może być również zoptymalizowane w celu frakcjonowania α-Gal A. Wszystkie te czynniki, pojedynczo lub łącznie, mogą być zoptymalizowane w celu osiągnięcia wydajnego frakcjonowania glikoform. Frakcjonowanie może również nastąpić po procesie oczyszczania, na szczególnej żywicy chromatograficznej, zoptymalizowanej do frakcjonowania i selekcji żądanej populacji glikoform.

Selekcję populacji glikoform spośród sfrakcjonowanych rodzajów α-Gal A można osiągnąć po analizie wymytych glikoform α-Gal A. Pik elucji może być analizowany różnymi technikami takimi, jak, ale nieograniczająco, SDS-PAGE, ogniskowanie izoelektryczne, elektroforeza kapilarna, analityczna jonowymienna HPLC i/lub analityczna HPLC wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek.

Konkretne frakcje mogą być wybrane, jeśli pasują do danego profilu rozmiaru lub ładunku. Selekcję można przeprowadzić na każdym etapie chromatografii, umożliwiając stopniowe budowanie żądanej populacji glikoform lub też może być ograniczona do konkretnego kroku, jeśli wydajność danego etapu frakcjonowania jest wysoka. Frakcjonowanie może również nastąpić po ukończeniu procesu oczyszczania, na szczególnej żywicy chromatograficznej, zoptymalizowanej do frakcjonowania i selekcji żądanej populacji glikoform.

Frakcjonowanie i selekcja silnie naładowanych i/lub glikoform o dużej masie cząsteczkowej preparatu α-Gal A może być przeprowadzona na każdym preparacie α-Gal A, takim jak genetycznie zmodyfikowane komórki takie jak komórki zmodyfikowane konwencjonalnymi metodami inżynierii genetycznej lub przez aktywacje genu (GA). Może być przeprowadzona na liniach komórkowych wzrastających w zoptymalizowanych warunkach zapewniających większe usjalowanie i ufosforylowanie, jak opisano powyżej, lub na PEGylowanym α-Gal A, jak opisano poniżej. Na przykład, w procesie oczyszczania α-Gal A jak tutaj opisano, frakcjonowanie glikoform α-Gal A może nastąpić na różnych etapach procesu. Na żywicy hydrofobowej. Butyl Sepharose Fast Flow®, najsilniej naładowane glikoformy będą wymywane pierwsze, a po nich dopiero glikoformy o mniejszym ładunku. Dla Heparin Sepharose® najsilniej naładowane glikoformy także będą pierwsze w piku elucji, po nich dopiero glikoformy o mniejszym ładunku. Przeciwnie zachowuje się Q-Sepharose, gdzie najsłabiej naładowane glikoformy będą wymyte pierwsze, a po nich glikoformy naładowane najsilniej. W chromatografii wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek na Superdex® 200, glikoformy o największej masie cząsteczkowej wymywane są pierwsze, a po nich glikoformy o mniejszej masie cząsteczkowej. Aby umożliwić wydajne frakcjonowanie konkretnej populacji α-Gal A, można połączyć wiele etapów frakcjonowania chromatograficznego, nawet opartych na różnych metodach fizycznych.

Na przykład, aby otrzymać glikoformę α-Gal A o najniższym pl (tych o najbardziej ujemnym ładunku), ograniczenie zbierania do wcześnie wymywanych frakcji butylowych zwiększy proporcję najsilniej ujemnie naładowanych α-Gal A. Tak wyselekcjonowany zbiór należy przenieść na kolumnę Heparin i znów ograniczenie zbierania do wcześniejszej, silnie ujemnie naładowanej frakcji różnych rodzajów α-Gal A bardziej zwiększy proporcję glikoform α-Gal A o niskim pl w eluacie. Dalsze

PL 210 833 B1 dokładniejsze zbieranie populacji glikofom może być przeprowadzone na różnych etapach procesu oczyszczania przez monitorowanie rozkładu ładunku i rozmiaru w eluatach przez SDS-PAGE i ogniskowanie izoelektryczne. Przykład frakcjonowania według rozmiaru i ładunku przedstawia Przykład 2.4.

Drugi sposób remodelowania węglowodanów obejmuje modyfikacje pewnych glikoform na oczyszczonym α-Gal A przez przyłączenie dodatkowych terminalnych reszt cukrowych przy użyciu oczyszczonej transferazy glikozylowej i odpowiedniego donora nukleotydo cukru. To postępowanie wpłynie tylko na te glikoformy, które mają odpowiednią wolną terminalną resztę cukrową będącą akceptorem dla użytej transferazy glikozylowej. Na przykład, α2,6-sjalotransferaza dodaje kwas sjalowy wiązaniem typu 2,6 do terminalnego akceptora Galel,4GlcNAc-R, używając CMP-kwasu sjalowego jako donora nukleotydocukru. Komercyjnie dostępne enzymy i gatunki, z których pochodzą, obejmują: fukozo-αΐ,3-transferazy III, V i VI (człowiek); galaktozo-αΐ,3-transferaza (świnia); galaktozo-ei,4transferaza (bydlęca); mannozo-αΐ ,2-transferaza (drożdże); sjalo-A2,3-transferaza (szczur) i sjalo-A2,6-transferaza (szczur). Po ukończeniu reakcji transferaza glikozylowa może być usunięta z mieszaniny reakcyjnej przez odpowiednią kolumnę powinowactwa, złożoną z odpowiedniego nukleotydu przyłączonego do żelu przez 6 węglowy spacer przez pirofosforan (GDP, LTDP) lub fosforan (CMP) lub inną metodą chromatograficzną znaną w dziedzinie. Z wymienionych powyżej transferaz glikozylowych, sjalotransferaza jest szczególnie użyteczna do modyfikowania enzymów, takich jak α-Gal A w terapii substytucji enzymu u ludzi. Zastosowanie sjalotransferazy z CMP-5-fluoresceino-kwasem neuraminowym jako donorem nukleotydocukru prowadzi do fluorescencyjnie wyznakowanej glikoproteiny, której pobieranie i lokalizacja tkankowa mogą być łatwo monitorowane.

Trzeci sposób remodelingu węglowodanów obejmuje gliko-inżynierię, gdzie korzystnym zastosowaniem jest np. dodanie genów wpływających na mechanizm glikiozylacji w komórce, na komórki wytwarzające α-Gal A w celu modyfikacji obróbki potranslacyjnej w aparacie Golgiego.

Czwarty sposób remodelingu węglowodanów obejmuje działanie na α-Gal A odpowiednimi glikozydazami w celu zredukowania liczby obecnych glikoform. Na przykład, kolejne działanie na złożone łańcuchy glikanów neuraminidazą, β-galaktozydazą i β-heksoaminidazą obcina oligosacharyd do trimannozowego rdzenia.

Struktura N-przyłączonego glikanu zależy od dostępności łańcucha glikanowego dla obróbki mannozydaz w aparacie Golgiego po sfałdowaniu białka, w obecności w aparacie Golgiego rodziny glikozylotransferaz i odpowiednich donorów nukleotydocukrów. Wiele z glikozylotransferaz katalizuje reakcje kompetycyjne, co może skutkować wydłużeniem łańcucha glikanowego na kilka różnych, ale zgodnych sposobów, zależnie od tego, który enzym zadziała pierwszy. Skutkuje to mikroheterogennością i powstaniem złożonej rodziny glikoform. Niektóre struktury są charakterystyczne dla jednej tkanki, takiej jak modyfikacja pewnych hormonów przysadki przez dodanie GalNAc-4-SO4, lub są ograniczone do kilku narządów.

Przykładem drugiego typu modyfikacji jest tworzenie tzw. dzielącego na pół GlcNAc (GlcNAc połączony wiązaniem β1,4 do rdzenia reszty β-mannozy) na złożonych glikanach glutamylotranspeptydaz w nerce, ale nie w wątrobie. Dzieląca struktura o dwóch rozgałęzieniach na γ-glutamylotranspeptydazie jest pokazana poniżej:

±Fucal,6

SAa2,3/6Galpl,4GlcNAcpł,2Manctl,6\ |

G1 cN Acp 1,4Manp 1,4GlcNAcp 1,4GlcNAc-Asn

S Aa2,3/6Gaipi,4GlcNAcp 1,2Manct 1,3 /

U ssaków enzym odpowiedzialny za tę reakcję, GlcNAc transferaza III (GnT-III), występuje w pewnych komórkach mózgu, nerek i wątroby u pacjentów z rakiem wątroby. GnT-III katalizuje dodanie N-acetyloglukozaminy wiązaniem β1-4 do β-połączonej mannozy rdzenia trimannozylowego N-przyłączonego łańcucha cukrowego, z wytworzeniem reszty dzielącego GlcNAc. Sklonowane geny GnT-III myszy, szczura i człowieka. Ihara i wsp., J Biochem. (Tokyo) 113: 692-698 (1993).

Dodatkowa aktywność GlcNAc T-III w komórkach człowieka może spowodować wzrost zawartości monoufosforylowanych hybrydowych glikanów kosztem podwójnie, potrójnie i poczwórnie rozgałęzionych glikanów złożonych. Nie powinno to znacząco wpłynąć na okres półtrwania w osoczu, ale może wzrosnąć dostarczanie do komórek śródbłonka naczyń.

PL 210 833 B1

Odpowiednia struktura jest pokazana poniżej:

P-Manotl,6 \ GlcNAcpi,4

Manal,6 \ |

Manal,3 / Manpi,4GlcNAcpl ,4GlcNAc-Asn SAa2,3/6Galp 1,4GlcNAcp 1,2Manal,3 /

Część α-Gal A jest pobierana przez nerki, co prowadzi do znaczącego obniżenia stężenia przechowywanych glikolipidów. Ponieważ w nerce mogą powstawać formy N-glikanów z resztami dzielącymi GlcNAc, nerkowe komórki śródbłonka mogą rozpoznać glikoproteiny z tym epitopem ze szczególnie wysoką specyficznością.

Podwyższona aktywność GnT-III może doprowadzić do nierównowagi w rozgałęzianiu rdzenia trimannozylowego hamując dalsze rozgałęzianie przez GnT-II, IV, V i Gal-e1,4-transferazę na poziomie substratu. Ostatnio przez nadekspresję rekombinowanego GnT-III otrzymano linię komórek jajnika chomika Chińskiego (CHO), mogącą wytwarzać dzielące oligosacharydy na glikoproteinach. Sburlati i wsp., Biotechnol. Progr. 14: 189-192 (1998). Jako model i potencjalne lecznicze białko wydzielnicze, na którym można badać efekty ekspresji GnT-III na glikozylację produktu wybrano interferon β (IFN-β). IFN-β z dzielącymi oligosacharydami wytworzono ze zmienionych GnT-III komórek CHO, ale nie przez niezmodyfikowane macierzyste linie komórkowe.

Wytwarzanie leczniczych glikoprotein wymaga scharakteryzowania stopnia glikozylacji przy zachowaniu stałych parametrów od partii do partii. „Hipotetyczny ładunek Z N-glikanu” wykorzystano jako parametr charakteryzujący glikozylację białka w prosty i efektywny sposób. Określenie Z zostało potwierdzone w wielu powtarzalnych eksperymentach i okazało się być wysoce dokładne i niezawodne. Hermentin i wsp., Glycobiology 6: 217-230 (1996). O hipotetycznym ładunku Z N-glikanu danej glikoproteiny wnioskuje się na podstawie profilu mapowania N-glikanu otrzymanego przez wysoko wydajną anionową chromatografię jonowymienną (HPAEC)/pulsową detekcję amperometryczną (PAD). HPAEC, N-glikany są wyraźnie rozdzielone według ich ładunku, np. liczby reszt kwasu sjalowego, dając oddzielne obszary dla neutralnych struktur, jak również dla mono- di-, tri- i tetrasjalo-N-glikanów. Z definuje się jako sumę produktów odpowiednich obszarów (A) w regionach asjalo, monosjalo, disjalo, trisjalo, tetrasjalo i pentasjalo, każdy pomnożony przez odpowiadający mu ładunek:

Z = A(asialo) · + A(MS) · 1 + A(DiS) · 2 + A(TriS) · 3 + A(TetraS) · 4 [+ A(PentaS) · 5]

Z = IA(i)-(/) gdzie i to 0 w regionie asjalo, 1 w regionie monosjalo (MS), 2 w regionie disjalo (DiS), 3 w regionie trisjalo (TriS), 4 w regionie tetrasjalo (TetraS) i 5 w regionie pentasjalo (PentaS).

Dlatego też, glikoproteina z większością struktur C4-4* będzie miała Z = 400, glikoproteina zawierająca struktury C2-2* będzie miała Z = 200, a glikoproteina tylko ze strukturami bogatymi w mannozę lub skrócona będzie miała Z = 0.

Preparat ludzkiego glikozylowanego α-Gal A według niniejszego wynalazku posiada ładunek oligosacharydowy, mierzony wartością Z, większy niż 100, korzystnie większy niż 150, korzystniej większy niż 170.

Zmiana okresu półtrwania α-Gal A w osoczu przez fosforylację

Fosforylacja α-Gal A może być zmieniona, aby wpłynąć na okres półtrwania α-Gal A w krążeniu i poziom α-Gal A wchodzącej do komórek. Fosforylacja jest korzystnie przeprowadzana wewnątrz komórki wyrażającej α-Gal A. Rozważane jest zwłaszcza otrzymanie glikozylowanego preparatu α-Gal A o zwiększonej fosforylacji przez, po pierwsze, wprowadzenie do komórki wytwarzającej α-Gal A sekwencji DNA kodującej fosforylotransferazę, lub przez wprowadzenie przez rekombinację homologiczną sekwencji regulatorowej, regulującej ekspresję genu endogennej fosforylotransferazy. Komórkę wytwarzającą α-Gal A hoduje się w warunkach hodowli komórkowej, co skutkuje ekspresją α-Gal A i fosforylotransferazy. Następnie można przeprowadzić izolację bardziej ufosforylowanego preparatu α-Gal A w porównaniu do α-Gal A wytworzonego w komórce bez polinukleotydu. Takie fosforylotransferazy są dobrze znane w dziedzinie. Patrz, na przykład, patenty US 5804413 i 5789247.

Połączone działanie dwóch enzymów związanych z błoną aparatu Golgiego jest niezbędne do wytworzenia markera Man-6-fosforanu rozpoznawanego na lizosomalnym proenzymie. Pierwszy, UDP-N-acetyloglulkozamina: glikoproteina N-acetylglukozamina-1-fosfotransferaza (GlcNAc fosfotransferaza), wymaga białkowej determinanty rozpoznawanej przez enzymy lizosomalne złożonej

PL 210 833 B1 z dwóch reszt lizyny odległych dokładnie o 34 A i w prawidłowej orientacji przestrzennej do wysokiego łańcucha mannozy. Drugi, N-acetyloglukozamino-1-fosfodiester a-N-acetyloglukozaminidazy (fosfodiester α-GlcNAcazy), hydrolizuje wiązanie α-GIcNAc-fosforanu eksponując miejsce rozpoznawania Man-6-fosforanu.

Preparat α-Gal A wytworzony metodami tu opisanymi występuje w wielu glikoformach, z których ufosforylowane wynosi między 16-50%, korzystnie 25-50%, a bardziej korzystnie co najmniej 30%.

Zmiana okresu półtrwania α-Gal A osocza przez zwiększone usjalowanie Zwiększone usjalowanie glikanów z terminalnymi resztami galaktozy o obniżonej zawartości kwasu sjalowego może być dokonane przez transfekcję ssaczych a korzystnie ludzkich komórek genem sjalotransferazy.

Niniejszy wynalazek przedstawia preparat glikozylowanego α-Gal A o zwiększonym ładunku oligosacharydowym wytworzony po pierwsze przez wprowadzenie polinukleotydu kodującego sjalotransferazę do komórek wytwarzających α-Gal A lub wprowadzenie przez rekombinację homologiczną sekwencji regulatorowej, regulującej ekspresję genu endogennej sjalotransferazy. Komórkę wytwarzającą α-Gal A hoduje się w warunkach hodowli komórkowej, co skutkuje ekspresją α-Gal A i sjalotransferazy. Kolejny etap obejmuje izolację preparatu α-Gal A o zwiększonym ładunku oligosacharydów. Preferowane sjalotransferazy obejmują α2,3-sjalotransferazy i α2,6-sjalotransferazy. Te sjalotransferazy są dobrze znane. Na przykład, patrz patent US 5858751.

Metoda zwiększenia sjalizacji może obejmować dodatkowy etap selekcji glikoform α-Gal A, większych lub o zwiększonym ładunku przez frakcjonowanie lub oczyszczenie preparatu (jak omówiono poniżej).

Poza tym, wynalazek przedstawia sposób zwiększenia sjalizacji przez trzymanie komórek w środowisku o niskiej zawartości amoniaku. W szczególności, glikozylowany preparat α-Gal A o zwiększonej sjalizacji otrzymywany jest przez kontakt komórek wytwarzających α-Gal A z pożywką o zawartości amoniaku w stężeniu poniżej 10 mM, korzystniej poniżej 2 mM. Zwiększoną sjalizację można otrzymać przez perfuzję komórek wytwarzających, w której toksyczne metabolity, takie jak amoniak są regularnie usuwane z pożywki hodowlanej. W korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku, środowisko o niskiej zawartości amoniaku wytwarzane jest przez dodanie genu lub cDNA syntetazy glutaminy do komórek wytwarzających. Poza tym, środowisko o niskiej zawartości amoniaku może być wytworzone przez perfuzję komórek wytwarzających α-Gal A świeżą pożywką, aby utrzymać stężenie amoniaku poniżej 10 mM, korzystniej poniżej 2 mM. Komórki wytwarzające mogą być ciągle przemywane świeżą pożywką o stężeniu amoniaku poniżej 10 mM, korzystniej poniżej 2 mM. Poza tym komórki wytwarzające mogą być ciągle przemywane świeżą pożywką co jakiś czas. Przerywane przemywanie, jak użyte tutaj, odnosi się zarówno do perfuzji w regularnych odstępach czasu lub do perfuzji przeprowadzanych po zmierzeniu stężenia amoniaku w pożywce, kiedy stężenie osiągało wartość graniczną (np. 10 mM, korzystniej poniżej 2mM). Przerywane przemywanie powinno odbywać się wystarczająco często, by stężenie amoniaku nigdy nie przekroczyło wartości granicznej. Komórki wytwarzające przemywane są w odstępach czasu pozwalających otrzymać preparat α-Gal A z glikanami usjalowanymi między 50-70%, korzystnie 60% wszystkich usjalowanych glikanów.

Zwiększanie okresu półtrwania α-Gal A krążącego w osoczu przez kompleksowanie α-Gal A PEG

Okres półtrwania ludzkiego glikozylowanego preparatu α-Gal A w krwioobiegu jest wydłużony dzięki skompleksowaniu α-Gal A z glikolem polietylenowym. Poli(etylenowy glikol) (PEG) to rozpuszczalny w wodzie polimer, który, kiedy jest kowalencyjnie związany z białkami, zmienia ich właściwości w sposób, który zwiększa zakres ich potencjalnych zastosowań. Modyfikacje glikolem polietylenowym („PEGylacja”) do dobrze znana technika, dzięki której można rozwiązać lub ulepszyć wiele problemów farmaceutyków białek i peptydów.

Ulepszone działanie farmakologiczne białek-PEG w porównaniu z ich niezmodyfikowanymi odpowiednikami zapoczątkowało rozwój tego typu koniugatów jako środków terapeutycznych. Niedobory enzymów, dla których terapie z natywnym enzymem były niewystarczające (z powodu szybkigo usunięcia z organizmu i/lub reakcji immunologicznych), może być obecnie leczone z odpowiednikami enzymami-PEG. Na przykład, PEG-deaminaza adenozyny niedawno otrzymała zgodę FDA. Delgado i wsp., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 9: 249-304 (1992).

Kowalencyjne przyłączenie PEG do α-galaktozydazy z zielonych nasion kawy zmienia katalityczne właściwości enzymu przez maskowanie specyficznych determinant na cząsteczce. Skutkuje to zwiększeniem wartości Km i zmniejszeniem Vmax w reakcji z analogami substratu p-nitrofenolu. Wieder i Davis, J. Appl. Biochem. 5: 337-47 (1983). α-galaktozydaza wciąż mogła odcinać terminalne reszty galaktozy z pochodzącej ze śliny krwi substancji B. Specyficzne miejsca wiązania przeciwciała

PL 210 833 B1 i lektyny zostały utracone w PEG-α-galaktozydazie. Przeciwciała otrzymane z natywnej α-galaktozydazy blokują aktywność enzymatyczną, i to hamowanie jest stopniowo tracone podczas testów w reakcji z enzymem przygotowanym ze stopniowo większymi dawkami PEG. Przeciwnie, surowice odpornościowe z i mmunizowanych zwierząt z PEG-α-galaktozydazą nie hamują aktywności enzymatycznej zarówno w preparacie a-galaktozydazy jak i PEG-α-galaktozydazy. Te wyniki oznaczają, że PEG wiąże specyficzne dla lektyny części węglowodanów oraz determinanty antygenowe i że te miejsca prawdopodobnie pozostają kryptyczne podczas obróbki enzymów PEG in vivo.

Kowalencyjne przyłączenie PEG do białek wymaga aktywacji terminalnej grupy hydroksyowej polimeru z odpowiednią grupą opuszczającą, która może być zastąpiona przez atak nukleofilowy ε-amino końca lizyny oraz α-aminowej grupy N-końca. Znaleziono kilka grup chemicznych aktywujących PEG. Dla każdego konkretnego zastosowania, różne metody łączenia dają odmienne korzyści. Różne metody PEGylacji mają zaskakujący i dramatyczny wpływ na takie czynniki jak retencja aktywności biologicznej, stabilność i immunogenność otrzymanych PEGylowanych białek i peptydów. Francis i wsp., Int. J Hematol. 68(l): 1-18 (1998). Na przykład, technika PEGylacji bez linkera przyłącza tylko PEG do cząsteczki docelowej. Dokładniej, zastosowanie biologicznie zoptymalizowanej techniki PEGylacji z użyciem tresylu monometoksy PEG (TMPEG), do różnych białek docelowych ujawnia, jak opisano przez Francis i wsp., Int. J Hematol. 68(l): 1-18 (1998), wyjątkowe zdolności do zachowania aktywności biologicznej cząsteczki docelowej. To, a także korzyść z dodania niczego więcej oprócz PEG (który pokazano jako bezpieczny do użycia w lekach dla ludzi) do białka czyni tę metodę idealną do modyfikacji α-Gal A.

Cztery możliwe miejsca do przyłączania PEG do białek to (1) grupy aminowe (N-koniec oraz lizyna); (2) grupy karboksylowe (kwas asparaginowy i glutaminowy); (3) grupy siarkowe (cysteina); i (4) grupy węglanowe (aldehydy powstałe po terapii nadjodanem). Przyłączanie do grupy karboksylowej białek oraz do grup aldehydowych węglanów wymaga reagenta PEG z nukleofilowa grupą aminową. Ta chemia zmienia pl α-Gal A, po tym, jak negatywnie naładowane grupy karboksylowe są przyłączone przez PEG. Jakiekolwiek zmiany pl mogą wpłynąć na biologiczną aktywność α-Gat A. Co więcej, przyłączenie PEG do łańcuchów węglowodanowych może wpłynąć na pobieranie α-Gal A przez receptor M6P, krytyczny dla aktywności biologicznej. Chemia grupy tiolowej również wypływa ma fizyczną strukturę cząsteczki i nie jest polecana.

Zwyczajowo używane metody PEGylacji tworzą wiązanie amidowe między grupami aminowymi białka a grupą methoksy monomethoksy-PEG. NHS-PEG jest komercyjnie dostępny i daje właśnie wiązanie amidowe między białkiem i PEG. Jednakże tworzenie wiązania amidowego zmienia pl z powodu utraty pozytywnego ładunku grupy -NH2.

Metoda przyłączania PEG do α-Gal A bez naruszania jego pl wykorzystuje tresyl-PEG. Tresyl-PEG wiąże się przez grupy aminowe i tworzy stabilną drugorzędową aminę. Zaletą drugorzędowych amin jest to, że zachowują one pozytywny ładunek grupy aminowej. Trezyl-PEG jest komercyjnie dostępny i jest stabilny w formie zliofilizowanej oraz suchego proszku. Trezyl-PEG został szczegółowo scharakteryzowany i reakcja oraz produkty pośredne są dobrze poznane. W korzystnym zastosowaniu, preparat α-Gal A jest kompleksowany z użyciem trezylu monometoksy-PEG (TMPEG) tworząc PEGylated-u-Gal A. PEGylated -α-Gal A jest następnie oczyszczany dając wyizolowany, PEGylowany-α-Gal A.

Schemat reakcji

CH3(OCH2CH2)rOSO2CH2CF3 + H2N-białko i

CH3(OCH2CH2)n-HN-białko-trezylowany monometoksy-PEG α-Gal A zawiera 18 grup aminowych, 17 grup ε-aminowych (lizyna) i jedną grupę α-aminową (N-koniec). Reakcja może być kontrolowana, aby wytwarzać α-Gal A z minimalnymi podstawieniami, a następnie cząsteczki z jednym PEG na cząsteczkę lub mniejszą średnią liczbą cząstek PEG na cząsteczkę, które mogą być oczyszczane z form niepodstawionych i wielokrotnie podstawionych. Wielokrotne podstawienia w α-Gal A nie muszą znacząco wpływać na aktywność biologiczną; dlatego też ostateczny produkt może składać się z heterogenicznej mieszaniny od 1 do 18 przyłączonych cząsteczek PEG. Stopień podstawienia będzie zależał od poziomu zachowanej aktywności enzymatycznej. Trzeba zauważyć, ze obniżenie aktywności enzymatycznej może być wyrównane przez wzmocniony

PL 210 833 B1 efekt terapeutyczny powstały przez wydłużenie krążeniowego okresu półtrwania i zredukowania rozpoznania immunologicznego α-Gal A. Dlatego, wytwarzając produkt PEG-u-Gal A, stosunek PEG do α-Gal A powinien zależeć od aktywności biologicznej, a nie wyłącznie od aktywności enzymatycznej.

Reakcja PEGylacji wymaga kontrolowanego pH, odpowiedniego składu buforu i stężenia białka. Właściwe warunki reakcji można osiągnąć przez ultrafiltrację/diafiltrację, co obecnie jest stosowane w procesie wytwarzania. Tuż przed reakcją trezyl-PEG jest szybko rozpuszczany w wodzie z ciągłym mieszaniem. Roztwór jest wtedy dodawany do przygotowanego α-Gal A i pozostawiany do przereagowania przez pewien okres czasu w pewnej temperaturze (np. 2 godz. przy 250°C). PEGylacja może zajść wcześniej niż ostateczny proces oczyszczania, co wyeliminuje dodatkowe kroki procedury oczyszczania. Po ukończeniu przyłączania, PEG-K-Gal A jest przetwarzany w pozostałych etapach procesu oczyszczania. Wykonanie reakcji przed kolumną Q (kolumna anionowymienna) umożliwia usunięcie produktów pośrednich reakcji w dwóch etapach oczyszczania. Ponieważ PEG nie zawiera żadnego ładunku negatywnego, nie będzie zatrzymywany przez Q Sepharose® na kolumnie i zostanie wymyty z kolumny.

Poziom PEGylacji może być zmierzona znanymi technikami. Na przykład, fluorescamina fluoryzuje przyłączona do grup α- i ε-aminowych białek. Procent utraty fluorescencji po PEGylacji odpowiada procentowi PEG przyłączonemu do α-Gal A. Test Pierce'a BCA na całkowitą zawartość białka może być użyty do określenia stężenia białka. Test aktywności metylouberiferylo-α-D-galaktopiranozydu (4-MUF -α-Gal) używany jest do określenia efektu aktywności enzymatycznej PEG-α- Gal A. α- Gal A zawiera M6P, który jest niezbędny do pobrania α-Gal A do lizosomów. Interferencja PEG przy rozpoznawaniu receptora M6P może być określona przy użyciu testu komórkowego monitorującego pobieranie przez komórki PEG-iz-Gal A do lizosomów.

Sposoby dostarczania preperatu α-Gal A

Opisane niniejszym kompozycje (np. zawierające różne glikoformy α-Gal A) mogą być dostarczane dowolną drogą zgodną z preparatem α-Gal A. Oczyszczony preparat α-Gal A może być podawany osobom wytwarzającym niewystarczające ilości lub nieprawidłowe białko α-Gal A lub które mogą skorzystać na terapii α-Gal A. Lecznicze preparaty wynalazku mogą być podawane wszelkimi odpowiednimi drogami, bezpośrednio (np. domiejscowo, przez iniekcję, implantację lub miejscowe do tkanki) lub układowo (np. doustnie lub pozajelitowo).

Droga podawania może być doustna lub pozajelitowa, włączając dożylną, podskórną, dotętniczą, środotrzewnową, dooczną, domięśniową, podjęzykową, doodbytniczą, dopochową, dooczodołową, domózgowo, śródskórna, doczaszkową, dordzeniową, dokomorową, dooponową, dozbiornikową, dowewnątrztorebkową, dopłucną, donosową, przez błony śluzowe, przezskómie lub przez inhalację. Metody, przyrządy i przygotowanie leku do dostarczania dopłucnego opisano np. patentach US 5785049, 5780019 i 5775320. Preferowany sposób dostarczenia śródskómego to dostarczanie jonoforetyczne przez opatrunek; przykład takiego sposobu opisano w patencie US 5843015.

Szczególnie użytecznym sposobem dostarczania jest iniekcja podskórna. Preparat α-Gal A można przygotować tak, aby całkowita wymagana dawka była podana w pojedynczej iniekcji o objętości jednego lub dwóch mililitrów. Aby przygotować iniekcję jednego lub dwóch mililitrów, preparat α-Gal A według niniejszego wynalazku może być przygotowany w stężeniu, w którym pożądana dawka dostarczana jest w objętości jednego lub dwóch mililitrów lub preparat α-Gal A może być przygotowany w formie liofilizowanej, który zawiesza się w wodzie lub odpowiednim buforze przed podaniem. Zaletą podskórnych iniekcji preparatu α-Gal A jest wygoda dla pacjenta, zwłaszcza umożliwienie podawania sobie leku przez samego pacjenta, co również skutkuje przedłużonym okresem półtrwania preparatu w osoczu w porównaniu do, na przykład, podawania drogą dożylną. Przedłużony okres półtrwania preparatu w osoczu powoduje utrzymanie efektywnego poziomu α-Gal A w osoczu przez dłuższy okres czasu, czego korzystnym skutkiem jest zwiększenie ekspozycji dotkniętych chorobą tkanek na podany α-Gal A i, w rezultacie, zwiększenie pobierania α-Gal A do tych tkanek. U pacjenta daje to lepsze efekty i/lub zmniejszenie częstości podawania leku. Co więcej, różne urządzenia zwiększające wygodę pacjenta, jak na przykład pisaki-strzykawki wielorazowego użytku i bezigłowe urządzenia do iniekcji, mogą do podawania preparatów α-Gal A.

Podawanie leku może odbywać się przez okresowe iniekcje jednorazowej, dużej dawki preparatu lub przez podawanie dożylne lub dootrzewnowe ze źródła zewnętrznego (np. torebka IV) lub wewnętrznego (np. biodegradowalnego implantu, sztucznego organu lub grupy wszczepionych komórek wytwarzających α-Gal A). Patrz np. patenty US 4407957 i 5798113. Sposoby i przyrządy dostarczania dopłucnego opisano np. w patentach US 5654007, 5780014, i 5814607. Inne użyteczne systemy

PL 210 833 B1 dostarczania pozajelitowego obejmują cząstki kopolimeru octanu etyleno-winylowego, pompy osmotyczne, wszczepialne systemy infuzyjne, dostarczanie pompą, dostarczanie kapsułkowanych komórek, dostarczanie liposomalne, dostarczanie przez iniekcje igłowe, iniekcje bezigłowe, nebulizatory, aerozole, elektroporację, i opatrunki przezskóme. Iniektory bezigłowe opisano w patentach US 5879327; 5520639; 5846233 i 5704911, opis których zawarty jest w wymienionych odniesieniach. Każdy preparat α-Gal A opisany powyżej może być dostarczany tymi metodami.

Droga podawania oraz ilość dostarczanego białka mogą być określone czynnikami będącymi w zakresie możliwości oceny przez osobę biegłą w dziedzinie. Co więcej, osoby biegłe w dziedzinie wiedzą, że droga podania i dawka leczniczego białka może zmieniać się dla danego pacjenta, do momentu, aż ustalony zostanie poziom dawki leczniczej.

Preparat farmaceutyczny białka α-Gal

Preparaty α-Gal A, które są zasadniczo wolne od białek niebędących α-Gal A, takich jak albumina, białek niebędących α-Gal A wytwarzanych przez komórkę-gospodarza lub białek wyizolowanych z tkanki lub płynu ustrojowego zwierzęcia.

Preparat korzystnie powinien składać się w części z wodnej lub fizjologicznie zgodnej płynnej zawiesiny lub roztworu. Nośnik jest fizjologicznie zgodny tak, że poza dostarczeniem pacjentowi żądanego preparatu, nie wpływa znacząco na elektrolity pacjenta lub równowagę objętości płynów. Użyteczne roztwory do dostarczania pozajelitowego mogą być przygotowane każdą z tych metod, dobrze znaną w sztuce farmaceutycznej. Patrz np. REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Gennaro, A., red.), Mack Pub., 1990. Preparaty inne niż pozajelitowe, takie, jak czopki i preparaty doustne, również mogą być wykorzystane.

Preparat korzystnie powinien zawierać rozczynnik. Farmaceutycznie dopuszczalne rozczynniki dla α-Gal A, które mogą być zawarte w preparacie to bufory, takie jak bufor cytrynianowy, bufor fosforanowy, bufor octanowy i bufor węglanowy, aminokwasy, mocznik, alkohole, kwas askorbinowy, fosfolipidy; białka, takie jak albumina osocze, kolagen i żelatyna; sole, takie jak EDTA lub EGTA i chlorek sodu; liposomy; poliwinylopirolidon; cukry, takie jak dekstran, mannitol, sorbitol i glicerol; glikol propylenowy i glikol poletylenowy (np.PEG-4000, PEG-6000); glicerol; glicyna lub inne aminokwasy; oraz lipidy. Układy buforów do użycia z preparatami α-Gal A obejmują cytrynian; octan; węglan; bufory fosforanowe (wszystkie dostępne w Sigma). W korzystne wykonanie stanowi bufor fosforanowy. Korzystny zakres pH dla preparatów α-Gal A to pH 4,5-7,4.

Preparat również korzystnie zawiera niejonowy detergent. Korzystne niejonowe detergenty to Polysorbate 20, Polysorbate 80, Triton Χ-100, Triton Χ-114, Nonidet P-40, oktyl α-glukozydu, oktyl β-glukozydu, Brij 35, Pluronic i Tween 20 (wszystkie dostępne w Sigma).

Szczególnie korzystnie preparat zawiera niejonowe detergenty Polysorbate 20 lub Polysorbate 80 i sól fizjologiczną buforowaną fosforanem, najkorzystniej przy pH 6.

Do liofilizacji preparatów α-Gal A, stężenie białka może pozostawać w zakresie 0,1-10 mg/ml. Środki spęczniające, takie jak glicyna, mannitol, albumina i dekstran mogą być dodane do mieszaniny liofilizacyjnej. Dodatkowo, możliwe krioprotektanty takie jak disacharydy, aminokwasy i PEG, mogą być dodane do mieszaniny liofilizacyjnej. Można również dodać każdego z buforów, rozczynników i detergentów wymienionych wyżej.

W korzystnym preparacie do iniekcji α-Gal A jest w stężeniu 1 mg/ml.

Preparaty do podawania mogą zawierać glicerol i inne składniki o wysokiej lepkości, pomagające w utrzymaniu środka w żądanym miejscu. Polimery biokompatybilne, korzystnie biowchłanialne, polimery biokompatybilne (włączając np. kwas hialuronowy, kolagen, polimaślan, mleczan i polimery glikolidowe oraz kopolimery mleczanu/glikolidu) mogą być użytecznymi rozczynnikami kontrolującymi uwalnianie środka in vivo. Preparaty do podawania pozajelitowego mogą zawierać glikocholan do podawania podjęzykowego, kwas metoksysalicylowy do podawania doodbytniczego lub kwas cytrynowy do podawania dopochwowego. Czopki do podawania doodbytniczego mogą być przygotowane przez zmieszanie preparatu α-Gal A z niepodrażniającym rozczynnikiem, takim jak masło kakaowe, lub innymi składnikami, które są stałe w temperaturze pokojowej, a płynne w temperaturze ciała.

Preparaty do inhalacji mogą zawierać laktozę lub inne rozczynniki lub mogą być wodnymi roztworami mogącymi zawierać eter polioksyetyleno-9-laurylowy, glikocholan lub deoksykocholan. Korzystny aerozol do inhalacji charakteryzuje się małymi cząstkami o małej gęstości i dużego rozmiaru. Cząstki o gęstości mniejszej niż 0,4 gramy na centymetr sześcienny i średniej średnicy przekraczającej 5 μm efektywnie dostarczają inhalowany preparat do układu krwionośnego. Takie cząstki wdychane są głęboko do płuc i unikają naturalnych mechanizmów oczyszczania płuc; będąc w stanie dostarczyć

PL 210 833 B1 swój terapeutyczny ładunek. (Edwards i wsp., Science 276: 1868-1872 (1997)). Preparaty α-Gal A mogą być dostarczane w formie aerozoli, np. z użyciem metod przygotowania opisanych w patentach

US 5654007, 5780014 i 5814607. Preparat do dostarczania donosowego może zawierać roztwory olejowe do dostarczania w formie kropli do nosa lub jako żel do stosowania donosowego.

Preparaty do dostarczania miejscowego na powierzchnię skóry mogą być przygotowane przez zawieszenie preparatu α-Gal A w dermatologicznie dopuszczalnym nośniku, takim jak lotion, krem, maść lub mydło. Szczególnie użyteczne do zastosowania miejscowego i ograniczania usuwania są nośniki tworzące film lub warstwę na skórze. W celu miejscowego dostarczania do powierzchni wewnętrznych tkanek preparat α-Gal A może być zawieszony w płynnej substancji przylegającej do tkanki lub innej substancji zwiększającej adsorpcję do powierzchni tkanki. Na przykład, kilka substancji przylegających do błon śluzowych i tabletek podjęzykowych opisano w celu dostarczania leku przez błony śluzowe, jak w patencie US 4740365, 4764378 i 5780045. Hydroksypropyloceluloza lub roztwór fibrynogenu/trombiny również mogą być użyte. Alternatywnie mogą być użyte roztwory pokrywające tkankę, takie jak preparaty zawierające pektynę.

Preparaty mogą być dostarczane w opakowaniach odpowiednich do zachowania sterylności, chroniących aktywność aktywnych składników w czasie prawidłowej dystrybucji i przechowywania oraz zapewniające wygodną i efektywną dostępność preparatu do podania pacjentowi. Preparat α-Gal A do iniekcji może być dostarczany w zamykanej probówce odpowiedniej do wyjmowania zawartości za pomocą igły i strzykawki. Probówka może być jedno- lub wielorazowego użytku. Preparat może być dostarczany jako wstępnie napełniona strzykawka. W pewnych przypadkach zawartość może być dostarczana w formie ciekłej, podczas gdy w innych w formie suchej lub liofilizowanej, co w pewnych przypadkach może wymagać przywrócenia pierwotnej postaci ze standardowym lub dostarczonym rozcieńczalnikiem. Preparat dostarczany jako ciecz do podawania dożylnego, może być dostarczany w sterylnej torebce lub pojemniku odpowiednim do przyłączenia rurki lub cewnika do podawania dożylnego. Preparat może być dostarczany w formie ciekłej lub proszku w urządzeniach wygodnie dozujących określone porcje preparatu; przykłady takich urządzeń obejmują iniektory bezigłowe do iniekcji podskórnych lub domięśniowych oraz dawkowniki. W innych przypadkach, preparat może być dostarczany w formie odpowiedniej do ciągłego uwalniania leku, takiej jak opatrunek lub plaster do zastosowania na skórę do podawania przezskórnego lub przez rozpuszczalne urządzenia do dostarczania przez błony śluzowe. W przypadkach, gdy preparat jest podawany doustnie w formie tabletki lub pigułki, preparat może być dostarczony w butelce z usuwanym przykryciem. Pojemniki mogą mieć informację np. o rodzaju preparatu, nazwie producenta lub dystrybutora, wskazania, sugerowane dawkowanie, instrukcje prawidłowego przechowywania lub instrukcje podawania.

Dawki do podawania preparatu α-Gal A

Niniejszy wynalazek dalej zawiera metody podawania preparatu α-Gal A pacjentowi z chorobą Fabry'ego, nietypowym wariantem choroby Fabry'ego lub innym stanem, w którym występuje obniżony poziom lub zmutowana forma α-Gal A. Dawka podawania wynosi korzystnie 0,05-5,0 mg, bardziej korzystnie między 0,1-0,3 mg preparatu α-Gal A na kilogram masy ciała podawana co tydzień lub co dwa tygodnie. W korzystnym wykonaniu dawka około 0,2 mg/kg jest podawana co dwa tygodnie. Regularnie powtarzane przyjmowanie dawki białka jest konieczne przez cały okres życia pacjenta. Podskórne iniekcje mogą być użyte w celu utrzymania dłuższego czasu ekspozycji organizmu na lek. Podskórna dawka może wynosić między 0,01-10,0 mg, korzystnie 0,1-5,0 mg preparatu α-Gal A na kilogram masy ciała podawana co tydzień lub co dwa tygodnie. Dawki preparatu α-Gal A dostarczane domięśniowo mogą być takie same lub różne od tych dostarczanych podskórnie; w korzystnym wykonaniu wynalazku, domięśniowe dawki są mniejsze i podawane są rzadziej. Preparat α-Gal A może również być dostarczany dożylnie, np. dożylna iniekcja dużej dawki leku, w powolnej iniekcji dożylnej lub przez ciągłą iniekcję dożylną. Ciągła infuzja IV (np. przez 2-6 godzin) umożliwia utrzymanie stałego poziomu leku we krwi.

Alternatywna korzystna metoda podawania preparatu α-Gal A pacjentowi obejmuje podawanie wybranej dawki preparatu α-Gal A co tydzień lub co dwa tygodnie przez okres kilku lat np. do trzech lat, podczas których pacjent jest pod obserwacją kliniczną w celu określenia przebiegu choroby. Kliniczna poprawa, mierzona np. poprawą funkcji nerek lub serca lub ogólne polepszenie stanu pacjenta (np. ból), i poprawa laboratoryjna mierzona np. obniżeniem poziomu CTH w moczu, osoczu lub tkankach, mogą być wykorzystane do określenia stanu zdrowia pacjenta. W przypadku gdy po tym okresie terapii i obserwacji zauważa się poprawę, częstość podawania α-Gal A może być zmniejszona. Na przykład, pacjent otrzymujący cotygodniowe iniekcje preparatu α-Gal A może zacząć otrzymywać

PL 210 833 B1 iniekcje co dwa tygodnie. Alternatywnie, pacjent otrzymujący iniekcje co dwa tygodnie preparatu α-Gal A, może je otrzymywać co miesiąc. Po takiej zmianie częstości podawania leku pacjent powinien być obserwowany przez kilka następnych lat np. przez okres trzech lat w celu określenia klinicznych i laboratoryjnych parametrów związanych z chorobą Fabry'ego. W korzystnym wykonaniu, podawana dawka nie zmienia się, jeśli zmienia się częstość podawania leku. To zapewnia, że pewne parametry farmakokinetyczne (np. maksymalne stężenie w osoczu [Cmax], czas do osiągnięcia maksymalnego stężenia w osoczu [tmax], osocze, okres półtrwania [t1/2] i ekspozycja mierzona polem powierzchni pod krzywą [AUG]) pozostają względnie stałe po każdej dostarczonej dawce. Utrzymanie tych parametrów farmakokinetycznych skutkuje względnie stałym poziomem zachodzącego przez receptory pobierania α-Gal A do tkanek, kiedy zmienia się częstość dawkowania.

Pacjent z nietypowym wariantem choroby Fabry'ego np. wykazujący przeważające nieprawidłowości sercowo-naczyniowe lub upośledzenie funkcji nerek, leczony jest według tego samego trybu dawkowania np. od 0,05 mg/kg do 5 mg/kg co tydzień lub co dwa tygodnie. Dawka jest dostosowana według potrzeb. Na przykład, pacjent z fenotypem wariantu sercowego, leczony terapią zastępowania enzymu α-galaktozydazy A będzie wykazywał zmiany w obrazie serca oraz poprawę jego funkcji w czasie terapii. Ta zmiana może być mierzona standardową echokardiografią, która może wykryć grubszą ścianę lewej komory serca u pacjentów z chorobą Fabry'ego (Goldman i wsp., J Am Coll Cardiol 7: 1157 - 1161 (1986)). Powtarzane pomiary echokardiograficzne grubości ściany lewej komory serca mogą być przeprowadzane podczas terapii i zmniejszenie rozmiaru ściany komory serca jest oznaką odpowiedzi na terapię. Pacjenci poddawani terapii zastępowania enzymu α-Gal A mogą również być obserwowani za pomocą obrazowania serca metodą rezonansu magnetycznego (MRI). MRI ma możliwość określenia względnego składu danej tkanki. Na przykład, MRI serca u pacjentów z chorobą Fabry'ego ujawnia odłożony tłuszcz wewnątrz mięśnia sercowego w porównaniu z pacjentami z grupy kontrolnej. (Matsui i wsp., Am Heart J 117: 472 474. (1989)). Powtarzane pomiary MRI serca u pacjentów poddawanych terapii zastępowania enzymu mogą ujawnić zmianę w złogach tłuszczu wewnątrz serca pacjenta. Pacjenci z fenotypem wariantu nerkowego również mogą skorzystać na terapii zastępowania enzymu α-galaktozydazy A. Efekt terapii można zmierzyć standardowymi testami funkcji nerek, takimi jak, 24-godzinny poziom białek w moczu, klirens kreatyniny, szybkość przesączania kłębkowego.

Następujące przykłady przedstawiono w takiej formie, aby pełniej zilustrować korzystne wykonanie niniejszego wynalazku. Te przykłady nie powinny być w żaden sposób odbierane jako ograniczające zakres wynalazku, jak określono w dołączonych zastrzeżeniach.

P r z y k ł a d 1

Otrzymywanie i zastosowanie konstruktów zaprojektowanych do dostarczenia i wyrażenia α-Gal A

Skonstruowano dwa plazmidy ekspresyjne pXAG-16 i XAG-28. Plazmidy te zawierają ludzki DNA dla α-Gal kodujący 398 aminokwasów enzymu α-Gal A (bez peptydu sygnałowego α- Gal A); genomową sekwencja DNA peptydu sygnałowego ludzkiego hormonu wzrostu (hGH), która jest przerwana przez pierwszy intron genu hGH oraz nie ulegającą translacji sekwencję 3'(UTS) genu hGH, która zawiera sygnał dla poliadenylacji. Plazmid pXAG-16 zawiera najwcześniejszy promotor ludzkiego cytomegalowirusa (CMV IE) i pierwszy intron (oflankowany przez niekodujące sekwencje eksonowe), podczas gdy pXAG-28 jest kierowany przez promotor Ia2 i ekson 1 i zawiera ponadto 5'UTS genu β-aktyny, który zawiera pierwszy intron genu β-aktyny.

1.1 Klonowanie kompletnego cDNA α-Gal A, konstrukcja pXAG-16, plazmidu ekspresyjnego dla α-Gal A

Ludzki cDNA α-Gal A sklonowano z biblioteki DNA z ludzkich fibroblastów, która została skonstruowana jak następuje. mRNA poli A⁺ wyizolowano z całkowitego RNA i syntezę cDNA przeprowadzono przy zastosowaniu odczynników dla systemu lambda ZapII® zgodnie z instrukcjami producentów (Stratagene Inc., LaJolla, CA). Pokrótce, „pierwszą nić” cDNA wytworzono poprzez odwrotną transkrypcję w obecności startera oligo-dT zawierającego wewnętrzne miejsce dla endonukleazy restrykcyjnej Xhol. Po potraktowaniu RNazą H, wobec cDNA zastosowano metodę „nick-translation” przy zastosowaniu polimerazy DNA I w celu wytworzenia dwuniciowego cDNA. W tym cDNA wytępiono końce przy użyciu polimerazy DNA T4 i poddano ligacji z adaptorami EcoRI. Produkty tej ligacji traktowano kinazą DNA T4 i strawiono Xhol. cDNA frakcjonowano poprzez chromatografię na złożu Sephacryl®-400. Frakcje zawierające duże i średnie fragmenty łączono razem i cDNA poddawano ligacji z ramionami Lambda ZapII strawionymi EcoRI i XhoI. Produkty tej ligacji pakowano następnie

PL 210 833 B1 i miareczkowano. Pierwotna biblioteka miała miano 1,2 x 10⁷ pfu/ml i średnią wielkość wstawki wynoszącą 925 bp.

Sondę o wielkości 210 bp z eksonu 7 ludzkiego genu α-Gal A (Fig. 1, SEKW. NR ID.: 1) użyto do wyizolowania cDNA. Samą sondę wyizolowano z genomowego DNA poprzez łańcuchową reakcję polimerazy (PCR) stosując następujące oligonukleotydy:

5'-CTGGGCTGTAGCTATGATAAAC-3'(Oligo 1; SEKW. NR ID.:6) i

5'-TCTAGCTGAAGCAAAACAGTG-3'(Oligo 2; SEKW. NR ID.:7).

Produkt PCR użyto następnie do przeszukania biblioteki cDNA fibroblastów i klony pozytywne izolowano i dalej charakteryzowano. Wobec jednego pozytywnego klonu, faga 3A zastosowano następnie protokół wycinania dla systemu lambda ZapII® (Stratagene, Inc., La Jolla, CA), zgodnie z instrukcjami producentów. Dzięki tej procedurze uzyskano plazmid pBSAG3A, który zawiera sekwencję cDNA α-Gal A, w szkielecie plazmidowym pBluescriptSK-™. Sekwencjnowanie DNA wykazało, że plazmid ten nie zawiera pełnej sekwencji końca 5' cDNA. Dlatego też odtworzono koniec 5' przy użyciu fragmentu PCR powielonego z ludzkiego genomowego DNA. Aby to osiągnąć, genomowy fragment DNA o wielkości 268 bp (Fig. 2, SEKW. NR ID.:2) powielono przy użyciu następujących oligonukleotydów:

5'-ATTGGTCCGCCCCTGAGGT-3' (Oligo 3; SEKW. NR ID.:8) i

5'-TGATGCAGGAATCTGGCTCT-3' (Oligo 4; SEKW. NR ID.:9).

Fragment ten subklonowano w plazmidzie do klonowania „TA (Invitrogen Corp., San Diego, CA) w celu uzyskania plazmidu pTAAGEI. Plazmid pBSAG3A, który zawiera większa część sekwencji cDNA α-Gal A, oraz pTAAGEI, który zawiera koniec 5' cDNA α-Gal A, strawiono Sacll i Ncol. Pozycje odpowiednich miejsc SacII i Ncol w obrębie powielonego fragmentu DNA są pokazane na Fig. 2. Fragment SacII-NcoI o wielkości 0,2 kb z pTAAGEI wyizolowano i poddano ligacji z tak samo strawionym pBSAG3A. Uzyskany plazmid, pAGAL, zawiera kompletną sekwencję cDNA α-Gal A, łącznie z sekwencją kodującą peptyd sygnałowy α-Gal A. cDNA w pełni zsekwencjonowano (pokazane na Fig. 3, łącznie peptydem sygnałowym α-Gal A; SEKW. NR ID.:3) i stwierdzono, że jest identyczny z opublikowaną sekwencją dla ludzkiego cDNA α-Gal A (sekwencja HUMGALA w Genbank).

Skonstruowano plazmid pXAG-16 poprzez szereg form pośrednich jak następuje. Najpierw pAGAL strawiono Sacll i Xhol i końce stępiono. Następnie końce kompletnego cDNA α-Gal A poddano ligacji z linkerami Xbal i subklonowano w pEF-BOS strawionym Xbal (Mizushima i wsp.. Nucl. Acids Res. 18: 5322, 1990), z wytworzeniem pXAG-1. Konstrukt ten zawiera 3'UTS ludzkiego czynnika stymulującego kolonie granulocytów oraz promotor ludzkiego czynnika elongacyjnego 1a (EF-1a) flankujące cDNA kodujący α-Gal A plus peptyd sygnałowy α-Gal A, tak, że koniec 5' cDNA α-Gal jest połączony z promotorem EF-1a. W celu utworzenia konstruktu z promotorem i pierwszym intronem CMV IE, cDNA α-Gal A oraz 3'UTS G-CSF zostały wycięte z pXAG-1 jako fragment Xbal-BamHI o wielkości 2 kb. Końce fragmentu wytępiono, poddano ligacji z linkerami BamHI i wstawiono do pCMVflpNeo (który skonstruowano jak opisano poniżej) strawionego BamHI. Orientacja była taka, że koniec 5' cDNA α-Gal A był połączony z regionem promotorowym CMV IE.

pCMVflpNeo wytworzono jak następuje. Promotor genu CMV IE powielono w reakcji PCR stosując genomowy DNA jako matrycę oraz oligonukleotydy:

5'-TTTTGGATCCCTCGAGGACATTGATTATTGACTAG-3'(SEKW. NR ID.: 10) i

5'-TTTTGGATCCCGTGTCAAGGACGGTGAC-3'(SEKW. NR ID.: 11).

Otrzymany w rezultacie produkt (fragment o wielkości 1,6 kb) strawiono BamHI, uzyskując fragment zawierający promotor z lepkimi końcami strawionymi BamHI. Jednostkę ekspresyjną neo wyizolowano z plazmidu pMC1neopA (Stratagene Inc., La Jolla, CA) jako fragment Xhol-BamHI o wielkości 1,1 kb. Fragmenty zawierające promotor CMV i neo wstawiono do plazmidu strawionego BamHI, Xhol (pUC12). Warto wspomnieć, że pCMVflpNeo zawiera region promotorowy CMV IE, rozpoczynający się w pozycji nukleotydowej 546 i kończący się w pozycji nukleotydowej 2105 (w sekwencji Genbank HS5MIEP), oraz gen oporności na neomycynę (gen TKneo) kierowany przez promotor kinazy tymidynowej wirusa opryszczki, Herpes Simplex Virus (HSV), bezpośrednio po stronie 5' fragmentu promotorowego CMV IE. Kierunek transkrypcji genu neo jest taki sam jak fragmentu promotorowego CMV. Ten konstrukt pośredni został nazwany pXAG-4.

W celu dodania 3'UTS hGH, 3'UTS GCSF został usunięty z pXAG-4 jako fragment Xbal-Smal i końce pXAG-4 stępiono. 3'UTS hGH wycięto z pXGH5 (Selden i wsp., Mol Cell. Biol 6: 3173-3179, 1986) jako fragment Smal-EcoRI o wielkości 0,6 kb. Po wytępieniu końców tego fragmentu, poddano go ligacji z pXAG-4 bezpośrednio za wytępionym końcem Xbal pXAG-4. Ten konstrukt pośredni został

PL 210 833 B1 nazwany pXAG-7. Fragment TKneo został wycięty z tego plazmidu jako fragment HindIII-ClaI i końce tego plazmidu stępiono przy użyciu fragmentu Klenowa polimerazy DNA I. Gen oporności na neomycynę kierowany przez wczesny promotor SV40 poddano ligacji jako stępiony fragment Clal-BsmBI z trawienia pcDNco (Chen i wsp., Mol Cell. Biol. 7: 2745-2752, 1987), umieszczając jednostkę transkrypcyjną neo w tej samej orientacji, co jednostka transkrypcyjna α-Gal A. Ten konstrukt pośredni został nazwany pXAG-13.

W celu uzyskania pXAG-16, który ma sekwencję kodującą 26 aminokwasów z peptydu sygnałowego hGH oraz pierwszy intron genu hGH, najpierw usunięto z pXAG-13 fragment EcoRl-BamHI o wielkości 2,0. Fragment ten zawiera cDNA α-Gal A i 3'UTS hGH. Ten duży fragment został zastąpiony przez 3 fragmenty. Pierwszy fragment składał się z produktu PCR o wielkości 0,3 kb z pXGH5, który zawiera sekwencję kodującą peptyd sygnałowy hGH i zawiera sekwencję pierwszego intronu hGH od syntetycznego miejsca BamHI znajdującego się tuż przed sekwencją najwyższej zgodności Kozak na końcu sekwencji kodującej peptyd sygnałowy hGH. Następujące nukleotydy zastosowano do powielenia tego fragmentu (Fragment 1):

5'-TTTTGGATCCACCATGGCTA-3' (Oligo HGH 101; SEKW. NR ID.: 12) i

5'-TTTTGCCGGCACTGCCCTCTTGAA-3' (Oligo HGH102; SEKW. NR ID.:13).

Drugi fragment składał się z produktu PCR o wielkości 0,27 kb zawierającego sekwencje odpowiadające początkowi cDNA kodującemu enzym α-Gal A złożony z 398 aminokwasów (tj. α-Gal A pozbawiony peptydu sygnałowego) w miejscu Nhel. Następujące nukleotydy zastosowano do powielenia tego fragmentu (Fragment 1):

5'-TTTTCAGCTGGACAATGGATTGGC-3' (Oligo AG10- SEKW. NR ID.: 14) i

5'-TTTTGCTAGCTGGCGAATCC-3'(Oligo AG11; SEKW. NR ID.:15).

Trzeci fragment składał się z fragmentu Nhel-EcoRI z pXAG-7 zawierającego pozostałą część α-Gal, jak również 3'UTS hGH (Fragment 3).

Fragment 1 (strawiony BamHI i Nael), Fragment 2 (strawiony Pvull i Nhel) oraz Fragment 3 zmieszano z fragmentem BamHI-EcoRI z pXAG-13 o wielkości 6,5 kb zawierającym gen neo oraz promotor CMV IE i poddano razem ligacji z wytworzeniem plazmidu pXAG-16 (Fig. 4).

1.2. Konstrukcja plazmidu ekspresyjnego dla α-Gal, pXAG-28

Promotor ludzkiego kolagenu Ik2 został wyizolowany do zastosowania w konstrukcie do ekspresji α-Gal A, pXAG-28, jak następuje. Fragment PCR o wielkości 408 bp z ludzkiego genomowego DNA zawierającego część promotora ludzkiego kolagenu Ik2 został wyizolowany przy zastosowaniu następujących oligonukleotydów:

5'-TTTTGGATCCGTGTCCCATAGTGTTTCCAA-3' (Oligo 72; SEKW. NR ID.: 16) i

5'-TTTTGGATCCGCAGTCGTGGCCAGTACC-3' (Oligo 73; SEKW. NR ID.: 17).

Fragment ten zastosowano do przeszukania ludzkiej biblioteki dla leukocytów EMBL3 (Clontech Inc., Palo Alto, CA). Jeden klon pozytywny (fag 7H) zawierający fragment EcoRI o wielkości 3,8 kb został wyizolowany i sklonowany w pBSIISK+ (Stratagene Inc., La Jolla, CA) w miejscu EcoRI (z wytworzeniem pBS/7H.2). Miejsce AvrII zostało wprowadzone do pBSIISK+ poprzez trawienie Spel, który przecina w obrębie polilinkera pBSIISK+, wypełnienie końców przy użyciu fragmentu Klenowa polimerazy DNA I i wstawienie oligonukleotydu 5'-CTAGTCCTAGGA-3'(SEKW. NR ID.: 18). Ten wariant pBSIISK+ strawiono BamHI i AvrII i poddano ligacji z fragmentem o BamHI-AvrII wielkości 121 bp z wyjściowego fragmentu PCR o wielkości 408 bp z promotorem ludzkiego kolagenu Ik2, z wytworzeniem plazmidu PBS/121COL.6.

Plazmid pBS/121COL.6 został strawiony Xbal, który przecina w obrębie sekwencji polilinkerowej pBSIISK+, wypełniono końce przy użyciu fragmentu Klenowa polimerazy DNA i strawiono AvrII. Z pBS/7H.2 wyizolowano fragment BamHI-AvrII o wielkości 3,8 kb, miejsce BamHI stępiono poprzez traktowanie enzymem Klenowa. Fragment strawiono następnie AvrII i poddano ligacji z wektorem strawionym AvrII, tworząc w ten sposób plazmid z promotorem kolagenowym, pBS/12lbpCOL7H.18.

Następnie promotor kolagenu połączono z 5'UTS ludzkiego genu β-aktyny, który zawiera pierwszy intron ludzkiego genu β-aktyny. W celu wyizolowania tej sekwencji, fragment PCR o wielkości 2 kb wyizolowano z ludzkiego genomowego DNA przy użyciu następujących oligonukleotydów:

5'-TTTTGAGCACAGAGCCTCGCCT-3' (Oligo BA1; SEKW. NR ID.: 19) i

5'-TTTTGGATCCGGTGAGCTGCGAGAATAGCC-3' (Oligo BA2; SEKW. NR ID.:20).

Fragment ten strawiono BamHI i BsiHKAI w celu uwolnienia fragmentu 0,8 kb zawierającego 5'UTS i intron β-aktyny. Fragment SaII-SrfI o wielkości 3,6 kb wyizolowano następnie z plazmidu z promotorem kolagenu pBS/12lbpCOL7H.18 jak następuje. pBS/12lbpCOL7H.18 strawiono częściowo

PL 210 833 B1

BamHI (miejsce BamHl leży na końcu 5' fragmentu z promotorem Ια2), końce wypełniono przy użyciu fragmentu Klenowa polimerazy DNA i poddano ligacji z linkerem SalI (5'-GGTCGACC-3'), umieszczając w ten sposób miejsce Sali przed promotorem kolagenu Ια2. Plazmid ten strawiono Sali i Srfl (miejsce Srfl leży 10 bp przed miejscem CAP promotora kolagenu Ια2) i wyizolowano fragment 3,6 kb. Fragmenty 0,8 i 3,6 kb łączono z pBSIISK strawionym SalI i BamHI (Stratagene Inc., La Jolla, CA) oraz fragmentem złożonym z następujących czterech połączonych ze sobą oligonukleotydów (tworząc fragment z tępymi końcami i miejscem BsiHKAI):

5’-GGGCCCCCAGCCCCAGCCCTCCCATTGGTGGAGGCCCTTTTGGAGGCAC CC rAGGGCCAGGAAACTTTTGCCGTAT-3' (Oligo COL-ł; SEKW. NR ID.:2l), 5'-AAATAGGGCAGATCCGGGCTTTATTATTTTAGCACCACGGCCGCCGAGA CCGCGTCCGCCCCGCGAGCA-3' (Oligo COL-2; SEKW. NR ID.:22), 5'-TGCCCTATTTATACGGCAAAAGTTTCCTGGCCCTAGGGTGCCTCCAAAAG GGC CTCCACCAATGGGAGGGCTGGGGCTGGGGGCCC-3' (Oligo COL-3; SEKW. NR ID.:23), i

5'-CGCGGGGCGGACGCGGTCTCGGCGGCCGTGGTGCTAAAATAATAAAGCC

CGGATC-3' (Oligo COL-4; SEKW. NR ID.:24).

Te cztery oligonukleotydy po połączeniu ze sobą odpowiadają regionowi rozpoczynającemu się od miejsca Srfl w promotorze kolagenu i rozciągającego się dalej poprzez miejsce BsiHKAI promotora β-aktyny. Otrzymany w rezultacie plazmid został nazwany pCOL/p-actin.

Aby zakończyć konstrukcję pXAG-28 wyizolowano fragment Saii-BamHI z pCOL/e-actin, zawierający promotor kolagenu Iu2 i 5'UTS β-aktyny. Fragment ten poddano ligacji z dwoma fragmentami z pXAG-16 (patrz Przykład 1.1 i Fig. 4): (1) fragmentem BamHl o wielkości 6,0 kb (zawierającym gen neo, szkielet plazmidowy, cDNA kodujący 398 aminokwasów enzymu α-Gal A oraz 3'UTS hGH); i (2) fragmentem BamHI-XhoI o wielkości 0,3 kb (który zawiera sekwencję poli A SV40 z pcDneo). pXAG-28 zawiera ludzki promotor kolagenu Iu2 połączony z 5'UTS ludzkiej β-aktyny, peptyd sygnałowy hGH (który jest przerwany przez pierwszy intron hGH), cDNA kodujący enzym α-Gal A, oraz 3' UTS hGH. Mapa kompletnego konstruktu ekspresyjnego pXAG-28 jest przedstawiona na Fig. 5.

1.3 Transfekcja i selekcja fibroblastów poddanych elektroporacji plazmidami ekspresyjnymi dla α-Gal A

W celu uzyskania ekspresji α-Gal A w fibroblastach, drugorzędowe fibroblasty hodowano i transfekowano według opublikowanych procedur (Selden i wsp., WO 93/09222).

Plazmidy pXAG-13, pXAG-16 i pXAG-28 transfekowano poprzez elektroporację do ludzkich fibroblastów z napletka w celu uzyskania stabilnie transfekowanych klonalnych szczepów komórkowych i otrzymane poziomy ekspresji α-Gal A śledzono tak, jak opisano w Przykładzie 1.4. Wydzielanie α-Gal A przez fibroblasty napletka mieści się w zakresie 2-10 jednostek/10⁶ komorek/24 godziny. W przeciwieństwie do tego, transfekowane fibroblasty wykazywały średnie poziomy ekspresji, jak pokazano w Tabeli 2.

T a b e l a 2

Średnie poziomy ekspresji α-Gal (± odchylenie standardowe)
pXAG-13:	420 ± 344 jedn./10⁶ komórkę/dzień N=26 szczepów klonalnych (zakres 3 - 1133) jedn./10⁶ komórkę/dzień)
pXAG-16:	2,051 ± 1253 jedn./10⁶ komórkę/dzień N=24 szczepów klonalnych (zakres 422 - 5200 jedn./10⁶ komórkę/dzień)
pXAG-28:	141 ± 131 jedn./10⁶ komórkę/dzień N=38 szczepów klonalnych (zakres 20 - 616 jedn./10⁶ komórkę/dzień)

PL 210 833 B1

Dane te pokazują, że wszystkie trzy konstrukty ekspresyjne są zdolne do zwiększania ekspresji α-Gal A wielokrotnie w stosunku do fibroblastów nietransfekowanych. Ekspresja w fibroblastach stabilnie transfekowanych pXAG-13, który koduje α-Gal A połączoną z peptydem sygnałowym α-Gal, była znacząco niższa niż ekspresja fibroblastów transfekowanych pXAG-16, który różni się jedynie tym, że peptyd sygnałowy jest peptydem sygnałowym hGH, którego sekwencja kodująca jest przerwana przez pierwszy intron genu hGH.

Każdorazowo, kiedy komórki pasażowano, oznaczano aktywność wydzielanej α-Gal A, komórki zliczano i mierzono gęstość komórek. W oparciu o liczbę zebranych komórek i czas wydzielania α-Gal A, określano specyficzny poziom ekspresji α-Gal A i wyniki przedstawiono w tabeli 3 i 4 jako wydzielane jednostki (α-Gal A) na 10⁶ komórek w czasie 24 godzin. Komórki szczepów pożądanych do terapii genowych albo do zastosowania do wytwarzania materiału do oczyszczania α-Gal powinny wykazywać stabilny wzrost i ekspresję na przestrzeni kilku pasaży. Dane dla komórek ze szczepów pokazanych w Tabelach 3 i 4, które są stabilnie stransfekowane konstruktem ekspresyjnym dla α-Gal A, pXAG-16, ilustrują fakt, że ekspresja α-Gal A jest stabilnie utrzymywana w czasie serii pasaży.

T a b e l a 3

Wzrost i ekspresja komórek BRS-11 zawierających konstrukt ekspresyjny dla α-Gal A, pXAG-16

Pasaż	Ekspresja (jedn./ 10⁶ komórek/24 godz.)	Gęstość komórek (komórek/cm²)
13	2601	4,80 x 10⁴
14	1616	4,40 x 10⁴
15	3595	4,40 X 10⁴

T a b e l a 4

Wzrost i ekspresja komórek HF503-242 zawierających konstrukt ekspresyjny dla α-Gal A, pXAG-16

Pasaż	Ekspresja (jedn./ 10⁶ komórek/24 godz.)	Gęstość komórek (komórek/cm²)
5	4069	2,80 x 10⁴
6	7585	3,55 x 10⁴
7	5034	2,48 x 10⁴

1.4 Ocena ilościowa ekspresji α-Gal A

Aktywność α-Gal A mierzono przy użyciu rozpuszczalnego w wodzie substratu 4-metyloumbeliferylo-α-D-galaktopiranozydu (4-MUF-gal; Research Products, Inc.) poprzez modyfikację protokołu opisanego przez loannou i wsp., J Cell Biol. 119: 1137-1150 (1992). Substrat rozpuszczano w buforze do substratu (0,1 M cytrynian-fosforan, pH 4,6) do stężenia 1,69 mg/ml (5 mM). Typowo, 10 ml supematantu z hodowli dodawano do 75 ml roztworu substratu. Probówki zamykano i umożliwiano inkubację w łaźni wodnej o temp. 37°C przez 60 minut. Na zakończenie procesu inkubacji, stosowano 2 ml buforu glicyna-węglan (130 mM glicyna, 83 mM węglan wapnia, w pH 10,6), do zatrzymania reakcji. Względną fluorescencję każdej próbki mierzono przy użyciu fluorymetru, model TKO100 (Hoefer Scientific Instruments), który ma stałą długość fali wzbudzenia 365 nm i wykrywa emisje fal o stałej długości 460 nm. Sczytania dla próbek porównywano ze standardami przygotowanymi z 1 mM roztworu wyjściowego metyolumbeliferonu (Sigma Chemical Co.) i obliczano ilość zhydrolizowanego substratu. Aktywność α-Gal A jest wyrażana w jednostkach; jedna jednostka aktywności α-Gal A odpowiada jednemu nanomolowi substratu hydrolizowanemu w ciągu 1 godziny w 37°C. Dane dotyczące ekspresji komórkowej zazwyczaj wyrażano jako jednostki aktywności wydzielanej α- Gal A/10⁶ komórek//24 godziny. Test ten był również stosowany do mierzenia poziomu aktywności α-Gal A w lizatach komórkowych i w próbkach z różnych etapów oczyszczenia α-Gal, jak dyskutowano poniżej.

1.5 Wytwarzanie α-Gal A (GA-GAL) przez aktywację genu

Wytwarzanie aktywowanego genu dla α-Gal A (GA-GAL) nastąpiło poprzez wstawienie regulatorowych i strukturalnych sekwencji DNA przed sekwencję kodującą ludzką α-Gal przy zastosowaniu technologii GA zasadniczo jak opisano w patencie US 5733761. Precyzyjne wstawienie sekwencji

PL 210 833 B1 aktywującej gen następuje w rezultacie homologicznej rekombinacji między DNA obecnym na transfekowanym fragmencie DNA i sekwencjami genomowego DNA przed locus galA w komórkach ludzkich. Sama sekwencja aktywująca gen zawiera sekwencję kodującą α-Gal A do, ale z wyłączeniem miejsca cięcia dla peptydu sygnałowego. Komórki zawierające aktywowany locus α-Gal A będą izolowane i poddane selekcji lekami w celu wyizolowania komórek o zwiększonym wytwarzaniu GA-GAL.

Kierujący fragment DNA zawierający odpowiednią sekwencję aktywującą gen został wprowadzony do linii komórkowych gospodarzy poprzez elektroporację. Jedną z takich linii jest HT-1080, linia z certyfikatem dostępna z ATCC (Rockville, Maryland). Plazmid do aktywacji genu (konstrukt kierujący), pGA213C, zawierający taki fragment DNA jest pokazany na Fig. 9. Plazmid ten zawiera sekwencje zaprojektowane do aktywowania części endogennego locus α-Gal A w linii komórkowej gospodarza i zawiera sekwencje kodujące peptyd sygnałowy, ale nie ludzkiej α-Gal A. Konstrukt kierujący zawiera również kasetę ekspresyjną dla bakteryjnego neo i mysiego dhfr. To umożliwia selekcję stabilnie włączonych fragmentów kierujących (dzięki genowi neo) i następującą po tym selekcję genu dhfr przy użyciu wieloetapowej selekcji metotreksanem (MTX).

Ponadto, pGA213C zawiera sekwencje zaprojektowane do kierowania do celu sekwencji chromosomowych przed endogennym locus poprzez homologiczną rekombinację. Homologiczna rekombinacja pomiędzy endogennym locus α-Gal A i fragmentem DNA o długości 9,6 kb pGA213C jest pokazana na Fig. 10.

pGA213C został skonstruowany w celu usunięcia genomowej sekwencji o długości 962 bp z genomowych sekwencji rozciągających się od pozycji - 1183 do - 222 w stosunku do kodonu inicjacyjnego dla metioniny α-Gal A, w wyniku homologicznej rekombinacji pomiędzy fragmentem pGA213C a locus α-Gal na chromosomie X. Aktywacja transkrypcyjna locus α-Gal następuje poprzez precyzyjne kierowanie zewnętrznych sekwencji regulatorowych przed sekwencję kodującą α-Gal A. Otrzymany w rezultacie locus GA-GAL powoduje zajście inicjacji transkrypcji z promotora CMV i następuje poprzez ekson 1 CMV, intron aldolazy i siedem eksonów i sześć intronów w sekwencji kodującej α-Gal A. Translacja mRNA GA-GAL prowadzi do powstania pre-GA-GAL z trzydziestojedno aminokwasowym peptydem sygnałowym. Po wydzieleniu z komórki gospodarza, peptyd sygnałowy jest usuwany. Prawidłowo skierowane linie komórkowe identyfikuje się najpierw poprzez przeszukiwania w reakcji łańcuchowej polimerazy pod kątem obecności mRNA GA-GAL. Stwierdzono, że klony wytwarzające mRNA GA-GAL wydzielają aktywną enzymatycznie α-Gal A do pożywki hodowlanej. Następujące po tym potwierdzenie właściwego nakierowania do celu uzyskuje się przez trawienie restrykcyjne i analizę genomowego DNA poprzez hybrydyzację na filtrach Southern.

Komórki eksponowano na kilkuetapową selekcję metotreksanem („MTX“). Po selekcji w 0,05 um MTX, izolowano klon komórek i poddawano selekcji na 0,1 um MTX. Z tego procesu izolowano pulę komórek opornych na 0,1 um MTX (linia komórkowa RAGOO1), namnażano w hodowli i charakteryzowano.

P r z y k ł a d 2

Czyszczenie α-Gal A

Podana metoda jest korzystnym sposobem wytwarzania, czyszczenia i testowania α-Gal A. Proces czyszczenia pozwala na utrzymanie α-Gal A w rozpuszczalnej, aktywnej, natywnej formie poprzez cały czas oczyszczania. Białko nie jest poddawane działaniu ekstremalnego pH, rozpuszczalników organicznych czy detergentów, nie jest cięte proteolitycznie podczas czyszczenia i nie tworzy agregatów. Proces czyszczenia jest tak zaprojektowany aby nie zmieniać rozkładu glikoform α-Gal A.

2.1 Czyszczenie α-Gal A

Przykład 2.1 pokazuje, że α-Gal A można oczyścić do prawie całkowitej homogenności z pożywki hodowlanej szczepów komórek ludzkich stabilnie stransfekowanych w celu wytwarzania enzymu. α-Gal A jest wyizolowane z pożywki zawierającej α-Gal A przy zastosowaniu serii pięciu etapów chromatograficznych. Pięć etapów opiera się na różnych składnikach rozdzielających, które wykorzystują różne fizyczne właściwości enzymu do rozdzielenia α-Gal A od zanieczyszczeń. Obejmują one chromatografię oddziaływania hydrofobowego na złożu Butyl Sepharose®, jonowe oddziaływanie na hydroksyapatycie, chromatografię anionowymienną na złożu Q Sepharose oraz chromatografię wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek na złożu Superdex® 200. Chromatografia wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek oprócz tego, że jest ostatnim z etapów procesu oczyszczania daje skuteczny sposób wymiany buforu dla α-Gal A na zgodny dla preparatów.

PL 210 833 B1

A. Zastosowanie chromatografii ze złożem Butyl Sepharose® jako pierwszego etapu czyszczenia α-Gal A

Zimną pożywkę hodowlaną (1,34 l) oczyszczano poprzez wirowanie i filtrowanie za pomocą filtra z octanem celulozy 0,45 μm stosując prefiltrację na włóknach szklanych. W czasie mieszania zimnej, przefiltrowanej pożywki doprowadzano pH do 5,6 poprzez dodawanie kroplami 1N HCl i dodawano siarczan amonu do końcowego stężenia 0,66 M poprzez dodawanie kroplami roztworu podstawowego (temperatura pokojowa) 3,9 M ultra czystego siarczanu amonu. Pożywkę mieszano przez kolejne 5 min. w 4°C, filtrowano jak poprzednio i nanoszono na kolumnę typu Butyl Sepharose® 4 Fast Flow (kolumna o objętości 81 ml; 2,5 x 16,5 cm; Pharmacia, Uppsala, Szwecja) zrównoważoną 10 mM MES-Tris, pH 5,6, zawierającym 0,66 M siarczan amonu (bufor A). Chromatografię prowadzono w 4°C przy użyciu zestawu Gradi-Frac^TM System (Pharmacia, Uppsala, Szwecja) wyposażonego w monitory UV (280 mn) oraz przewodności dla oszacowania, odpowiednio, całkowitego białka i stężenia soli. Po naniesieniu próbki przy szybkości przepływu 10 ml/min, kolumnę płukano buforem A, 10 objętości kolumny. α-Gal A wymywano z kolumny ze złożem Butyl Sepharose® gradientem liniowym od buforu A (zawierającego siarczan amonu) do 10 mM MES-Tris, pH 5,6 (bez siarczanu amonu), 14 objętości kolumny. Frakcje badano pod kątem obecności aktywności α-Gal A za pomocą testu 4-MUFgal i te frakcje, które zawierały znaczną aktywność enzymatyczną łączono w pule. Jak pokazano na Fig. 8 i podsumowaniu oczyszczania (Tabela 5) etap ten usuwał około 99% zanieczyszczeń białkowych (próbka przed kolumną = 8,14 g całkowitego białka; próbka po kolumnie = 0,0638 g całkowitego białka).

T a b e l a 5:

Oczyszczanie α-Gal A z pożywki hodowlanej stabilnie transformowanych ludzkich fibroblastów

Etap czyszczenia	Objętość (ml)	Atywność α-Gal A (x 10⁶ jednostek)	Białko całk. (mg)	Aktywność swoista (x 10⁶ jednostek/mg)	Krotność oczyszczania (Kumulacja)	Odzysk procentowy
Supernatant hodowli	1340	14,6	8140	0,0018	=1	=100
Butyl Sepharose®	417	14,1	63,8	0,221	123	96,6
Heparin Sepharose®	134	12,1	14,6	0,829	436	82,9
Hydroksyapatyt	47	9,73	4,46	2,18	1220	66,6
Q Sepharose®	31,5	8,91	3,31	2,69	1503	61,0
Superdex® 200	10	8,58	2,93	2,92	1634	59,0

B. Zastosowanie chromatografii ze złożem Heparin Sepharose® jako etapu czyszczenia α-Gal A

Frakcje z pikami po kolumnie ze złożem Butyl Sepharose® dializowano w 4°C wobec (4 l) mM MES-Tris, pH 5,6 (jednokrotna wymiana). Przewodność dializatu doprowadzano do 1,0 mMHO w 4°C przez dodanie H2O lub NaCl jeśli było to konieczne. Następnie, próbkę nanoszono na kolumnę typu Heparin Sepharose® 6 Fast Flow (Phamacia, Uppsala, Szwecja; kolumna o objętości 29 ml; 2,5 x 6 cm) zrównoważoną 10 mM MES-Tris, pH 5,6 zawierającą 9 mM NaCl (bufor B). Przeprowadzano to w 4°C przy szybkości przepływu 10 ml/min. Za pomocą monitorów UV (280 nm) oraz przewodności badano całkowite białko i stężenie soli. Po naniesieniu próbki kolumnę płukano buforem B, 10 objętości kolumny, a następnie liniowym gradientem do 8% bufor C/92% bufor B (gdzie bufor C stanowi 10 mM MES-Tris, pH 5,6, zawierający 250 mM NaCl), 3 objętości kolumny oraz płukano 8% buforem C, 10 objętości kolumny. Następnie α-Gal A wymywano liniowym gradientem do 29% buforu C, 1,5 objętości kolumny a następnie liniowym gradientem do 35% buforu C, 10 objętości kolumny. Frakcje badano pod kątem obecności aktywności α-Gal A i te firakcje, które zawierały znaczną aktywność łączono w pulę.

C. Zastosowanie chromatografii z hydroksyapatytem jako etapu czyszczenia α-Gal A

Pulę po heparynie filtrowano i nanoszono bezpośrednio na kolumnę Ceramic Hydroxyapatite HC (40 gm; American International Chemical, Natick, MA; kolumna o objętości 12 ml; 1,5 x 6,8 cm) zrównoważoną 1 mM fosforanem sodu, pH 6,0 (bufor D). Chromatografię prowadzono w temperaturze pokojowej w hybrydowym systemie GradiFraC™/FPLC® (Pharmacia, Uppsala, Szwecja) wyposażonym w monitory UV (280 mn) i przewodności. Po naniesieniu próbki (5 ml/min) kolumnę płukano buforem D, 10 objętościami kolumny. α-Gal A wymywano liniowym gradientem do 42% buforu E/58%

PL 210 833 B1 buforu D (gdzie bufor E stanowi 250 mM fosforan sodu, pH 6,0), 7 objętościami kolumny, a następnie gradientem do 52% buforu E, 10 objętościami kolumny. Frakcje badano pod kątem aktywności α-Gal A i te frakcje, które zawierały znaczną aktywność łączono w pulę.

D. Zastosowanie chromatografii aninowymiennej ze złożem Q Sepharose® jako etapu czyszczenia α-Gal A

Pulę po hydroksyapatycie rozcieńczano około 1,5 raza H2O do końcowej przewodności 3,4-3,6 mMHO w temperaturze pokojowej. Po filtracji próbkę nanoszono kolumnę ze złożem Q Sepharose® HP (Pharmacia, Uppsala, Szwecja; objętość kolumny 5,1 ml; 1,5 x 2,9 cm) zrównoważoną 10% buforem G/90% buforem F, gdzie bufor F jest 25 M fosforanem sodu, pH 6,0 a bufor G jest 25 mM fosforanem sodu, pH 6,0, 250 mM NaCl. Chromatografię prowadzono w temperaturze pokojowej w systemie hybrydowym Gradi-Frac™/FPLC® (Pharmacia, Uppsala, Szwecja) a całkowite białko i stężenie soli monitorowano za pomocą podłączonych monitorów. Próbkę nanoszono przy prędkości przepływu 5 ml/min a następnie przeprowadzano następujące etapy: (1) płukanie 10% buforem G, 5 objętościami kolumny; (2) płukanie 12% buforem G, 7 objętościami kolumny; (3) płukanie gradientem liniowym do 50% buforu G, 3 objętościami kolumny; (4) płukanie gradientem liniowym do 53% buforu G, 10 objętościami kolumny; (5) płukanie gradientem do 100% buforu G, 3 objętościami kolumny oraz (6) płukanie 100% buforem G, 10 objętościami kolumny. α-Gal A wymywano głównie podczas etapów 3 i 4. Frakcje zawierające znaczną aktywność łączono w pulę („pula Q”).

E. Zastosowanie chromatografii sączenia w żelu ze złożem Superdex® 200 jako etapu czyszczenia α-Gal A

Pulę Q zatężano około 5-krotnie przy użyciu zestawu Centriprep®- 10 centrifugal concentrator units (Amicon, Beverly, MA) i nanoszono na kolumnę ze złożem Superdex® 200 (Pharmacia, Uppsala, Szwecja; kolumna o objętości 189 ml; 1,6 x 94 cm). Kolumna była zrównoważona i wymyta 25 mM fosforanem sodu, pH 6,0, zawierającym 150 mM NaCl. Chromatografię prowadzono przy użyciu systemu FPLC® (Pharmacia, Uppsala, Szwecja) w temperaturze pokojowej stosując monitor UV (280 nm) w celu badania wymywania białka. Objętość próbki nanoszonej na kolumnę wynosiła < 2 ml a prędkość przepływu 0,5 ml/min i wielkość frakcji wynosiła 2 ml. Przeprowadzano wielokrotne przepuszczanie przez kolumnę a frakcje badano pod kątem aktywności α-Gal A i te frakcje, które zawierały znaczną aktywność łączono w pulę.

Połączone w pulę frakcje z kolumny ze złożem Superdex® 200 zatężano przy użyciu zestawu Centriprep 10 units, porcjowano, szybko mrożono i przechowywano w -80°C przez krótki okres czasu. Podsumowanie tego przykładu oczyszczania α-Gal A przedstawiono w Tab. 5. Końcowa wydajność α-Gal A wynosiła 59% aktywności materiału wyjściowego a aktywność specyficzna oczyszczonego produktu wynosiła 2,92 x 10⁶ jedn./mg białka. Uzyskany produkt wykazywał wysoki poziom czystości w elektroforezie przeprowadzonej w warunkach redukcyjnych w 4-15% żelu SDS-polyacryloamidowym, który następnie barwiono srebrem.

Podsumowanie

Proces oczyszczania dostarcza wysoko oczyszczony α-Gal A. Główne oczyszczenie uzyskuje się w dwóch pierwszych etapach procesu, podczas gdy końcowe trzy etapy są doczyszczaniem materiału poprzez usuwanie pozostałych mniejszych zanieczyszczeń. Ostatni etap, chromatografii ekskluzyjnej na Superdex® 200, służy także do zmiany α-Gal A w bufor zgodny z preparatem.

2.2 Wielkość α-Gal A wytwarzanej przez stabilnie stransfekowane komórki ludzkie w hodowli

Badano strukturalne i funkcjonalne właściwości oczyszczonego ludzkiego α-Gal A. Uzyskany produkt wykazywał wysoki poziom czystości po elektroforezie w warunkach redukujących na 4-15% żelu poliakryloamidowym z SDS, następnie barwionym srebrem.

Masę cząsteczkową α-Gal A następnie oszacowano metodą spektrometrii masowej MALDI-TOF. Wyniki pokazują, że masa cząsteczkowa dimeru wynosi 102 353 Da, gdy monomeru wynosi 51 002 Da. Oczekiwana masa monomeru w oparciu o skład aminokwasowy wynosi 45 400 Da. Jednakże zawartość węglowodanów enzymu obliczona jest na do 5 600 Da masy cząsteczkowej.

2.3 Modyfikacje węglowodanowe α-Gal A produkowane przez stabilnie transfekowane komórki ludzkie

Określono także wzór glikozylacji α-Gal A wytwarzanego według wynalazku. Prawidłowa glikozylacja jest ważna dla optymalnej aktywności α-Gal A in vivo; α-Gal A wyrażana w systemach nie glikozylujących jest nieaktywna lub niestabilna. Hantzopolous i wsp., Gene 57:159(1987). Glikozylacja jest także ważna przy włączaniu α-Gal A do żądanej komórki i wpływa na czas półtrwania krążącego

PL 210 833 B1 enzymu in vivo. Na każdej podjednostce α-Gal A są cztery miejsca nadające się do przyłączenia łańcucha węglowodanowego połączonego z asparaginą, z których tylko trzy są zajęte. Desnick i wsp. w The Methabolic and Molecular Bases Of Inherited Diseases, (McGraw Hill, New York, 1995) str. 2741-2780.

Na próbkę α-Gal A wytwarzaną przez stabilnie transfekowane komórki działano neuraminidazą izolowaną z A. urafaciens, (Boehringer-Mannheim, Indianaapolis, IN) by usunąć kwas sjalowy. Reakcję przeprowadzano poprzez działanie 10 mU neuraminidazy na 5 mg α-Gal A przez noc, w temperaturze pokojowej w całkowitej objętości 10 ml soli buforowanej octanem (ABS, 20 mM octan sodu, pH. 5,2, 150 mM NaCl).

Oczyszczona α-Gal A produkowana przez stabilnie transfekowane komórki została także zdefosforylowana przy użyciu alkalicznej fosfatazy (alkaliczna, cielęca, fosfataza jelitowa, Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN), przez działanie 15 U alkalicznej fosfatazy w ABS (pH podniesione do

7,5 za pomocą 1 M Tris) na 5 mg α-Gal A przez noc w temperaturze pokojowej.

Próbki analizowano przez SDS-PAGE i/lub ogniskowanie izoelektryczne po którym następował transfer metodą Western specyficznych przeciwciał przeciw α-Gal A. Użytymi przeciwciałami były królicze poliklonalne przeciwciała przeciw peptydowe, wytworzone z zastosowaniem aminokwasów 68-81 reprezentujących peptyd α-Gal A jako immunogen. Po transferze białka na PVDF (Millipore, Bedford, MA), błonę przeszukiwano rozcieńczeniem surowicy w 2,5% blotto (mleko odtłuszczone w 20 mM Tris-HCI, pH 7,5, 0,05% Tween-20) w stosunku 1:2000. Następnie wykrywano za pomocą kozich przeciw szczurzych IgG skoniugowanych z peroksydazą chrzanu (Organo Technique/Cappella, Durham, NC; rozcieńczenie 1:5000) i odczynników z zestawu do chemiluminescencji ECL (Amersham, Arlington Heights, IN).

Działanie na α-Gal A neuraminidazą, po którym następowała SDS-PAGE prowadziło do przesunięcia w masie cząsteczkowej (około 1500-2000 Da lub 4-6 kwasów sjalowych/monomer), sugerując, że istnieje obszerna modyfikacja α-Gal A kwasem sjalowym. W celu odniesienia, plazmatyczna forma α-Gal A ma 5-6 reszt kwasu sjalowego na monomer, a forma łożyskowa ma 0,5-1,0 reszt kwasu sjalowego na monomer. Bishop i wsp., J. Biol. Chem., 256:1307 (1981).

Inną metodą zastosowaną do badania modyfikacji α-Gal A kwasem sjalowym i M6P było ogniskowanie izoelektryczne (lEF, ang. isoelectric focusing), gdzie próbki rozdziela się na podstawie ich punktu izoelektrycznego (pl) lub ładunku sieciowego. Tak więc oczekuje się, że usunięcie z α-Gal A reszt naładowanych takich jak kwas sjalowy lub fosforan zmieni ruchliwość białka w systemie lEF.

Do przeprowadzenia eksperymentu lEF, próbki α-Gal A produkowane w zgodzie z wynalazkiem traktowano neuraminidazą i/lub alkaliczną fosfatazą, mieszano w stosunku 1:1 z buforem do próbek 2X Novex (z 8 M mocznikiem, pH 3,0-7,0), i nanoszono na żel lEF z 6 M mocznikiem (5,5%) poliakryloamid) stworzony za pomocą Pharmalyte® (Pharmacia, Uppsala, Sweden; pH 3,0-6,5; Pharmalyte® 4-6,5 oraz 2,5-5,5; 0,25 ml każdego na żel). Włączono także standardy punktu izoelektrycznego (Bio-Rad). Po elektroforezie żel przenoszono na PVDF, i przeprowadzano analizę Western jak opisano wyżej.

Działanie na enzym neuraminidazą zwiększało pl dla wszystkich trzech izoform, wskazując, że wszystkie zostały zmodyfikowane do pewnego stopnia kwasem sjalowym. Dane te sugerują, że preparaty α-Gal A produkowane jak niniejszym opisano powinny mieć żądany plazmatyczny czas półtrwania wskazując, że ten materiał dobrze pasuje do zastosowań farmakologicznych. Następnie, działanie na traktowaną neuraminidazą α-Gal A alkaliczną fosfatazą dalej zwiększało pl części białka do około 5,0-5,1 wskazując, że enzym niesie jedną lub więcej reszt M6P. Modyfikacja taka jest wymagana do wydajnego wprowadzania α-Gal A do komórki docelowej.

Przyłączone do N końca α-Gal A łańcuchy węglowodanowe analizowano przez jonowymienne HPLC (Glyco-Sep C) i znakowanie nieredukujące końca związkiem fluorescencyjnym 2-aminobenzaminą (AB). Wyniki analizy AB-glikan z trzech niezależnych preparatyk α-Gal A podsumowano w Tabeli 6. Wszystkie trzy preparaty miały liczbę Z większą niż 170. Następnie, ponad 67% glikanów miało przyłączony kwas sjalowy, ponad 16% glikanów było ufosforylowanych i mniej niż 16% było obojętnych. Wyniki te wypadły bardzo korzystnie w porównaniu do wyników wcześniej opublikowanych. Na przykład, Desnick i wsp., (U.S. Patent 5,356,804) doniósł, że ponad 60% glikanów było obojętnych i tylko 11% miało przyłączony kwas sjalowy.

PL 210 833 B1

T a b e l a 6

Wyniki analizy AB-glikanów z GA-GAL

Sposób działania	Liczba Z	% obojętnych	% Mono-	% Di-	% Tri-	% Tetra-
Brak	170,04	16,83	22,8	39,45	15,34	5,58
Brak	177,71	14,22	20,63	44,62	14,2	6,31
Brak	171,68	15,81	20,73	43,2	14,33	5,39
Średnia (N=3)	173,14	15,62	21,39	42,42	14,62	5,76
Neutraminidaza	24,36	85,25	5,14	9,61	ND	ND
Alk. fosfataza	150,93	23,38	24,47	34,28	13,58	4,29

Procent całości:	Preparaty GA-GAL według niniejszego wynalazku	Desnick i wsp., patent US 5356804
Całkowite P-glikany	16,62	24,1
Całkowite z przyłączonym kwasem sjałowym	67,57	11
Całkowite obojętne (hihmannoza i hybrydy)	15,62	62,9

Dalsze szczegółowe charakterystyki oczyszczonych preparatów GA-GAL dostarczono w Tabeli 7.

T a b e l a 7 Oczyszczona GA-GAL

Test	40-173-KH	42-202-KH
Aktywność specyficzna	2,75	2,80
SDS-PAGE Coomassie	100%	100%
SDS-PAGE barwiona srebrem	99,6%	100%
HPLC w odwróconym układzie faz	100%	99,94
Chromatografia wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek	0%	0,01%
Internalizacja do fibroblasów napletka	123,6%	94,3%

2.4 Zwiększanie proporcji naładowanych α-Gal A przez frakcjonowanie α-Gal A

Jak omówiono powyżej, frakcjonowanie form glikozylowanych α-Gal A może zajść na różnych etapach procesu oczyszczania jak niniejszym opisano. W niniejszym przykładzie formy glikozylowane α-Gal A frakcjonowano pod względem wielkości i ładunku. Możliwe jest także frakcjonowanie α- Gal A kombinacją tych lub innych technik chromatograficznych, jak opisano powyżej.

Do frakcjonowania form glikozylowanych α-Gal A pod względem rozmiaru przeprowadzano sączenie molekularne na kolumnie Superdex® 200 (Pharmacia, 1,6 cm na 94,1 cm) równoważonej buforem fosforanowym o pH 6. α-Gal A (2,6 mg w 1 ml) naniesiono na kolumnę i kolumnę przepłukiwano 0,35 ml/min. Zbierano frakcje poprzez profil wypłukiwania i frakcje obejmujące szeroki pik wypływu α-Gal A analizowano przez SD-PAGE, a następnie uwidaczniano barwiąc srebrem. Frakcje na wstępującym ramieniu piku zawierały α-Gal A o największej masie cząsteczkowej i w miarę kontynuowania frakcji w piku, dostrzegalna masa cząsteczkowa α-Gal A stopniowo malała. Frakcje α-Gal A następnie wybierano i łączono by dostarczyć preparatu o żądanym zakresie masy cząsteczkowej.

W celu frakcjonowania form glikozylowanych pod kątem ładunku, α-Gal A frakcjonowano poprzez chromatografię na Q-Sepharose®. Kolumnę z Q-Sepharose® (1,5 cm na 9,4 cm) równoważono 20 mM fosforanem sodowym, pH 6.0, zawierającym 30 mM NaCl i szybkość przepływu utrzymywano na poziomie 5 ml/min. Na kolumnę naniesiono α-Gal A w (130 mg w 166 ml), przepłukano buforem równoważącym i wypłukano 20 mM fosforanem sodowym, pH 6,0, zawierającym 130 mM NaCl.

PL 210 833 B1

Dla szerszego frakcjonowania można zastosować wypłukiwanie gradientowe (np. 10 objętości kolumny) od buforu równoważącego do buforu wypłukującego. Frakcje zbierano poprzez profil elucji i frakcje obejmujące pik wypływu α-Gal A analizowano przez SDS-PAGE, a następnie uwidaczniano barwiąc srebrem. Formy o najniższej masie cząsteczkowej obserwowane na żelu wypłynęły przy płukaniu i na wznoszącym ramieniu piku. Formy o mniejszej masie cząsteczkowej odpowiadają mniej ujemnie naładowanym formom glikozylowanym α-Gal A, które wiążą się mniej silnie z dodatnio naładowaną kolumną Q-Sepharose® (składając się z żywicy czterokrotnie podstawionej aminami). Gatunki α-Gal A o najwyższym ładunku ujemnym były wypłukiwane później w profilu elucji i miały większą masę cząsteczkową, jak analizowano przez SDS-PAGE. Frakcjonowanie pod względem ładunku potwierdzono przez ogniskowanie izoelektryczne wypłukanych frakcji lub wybranych pul.

Tak więc zarówno frakcjonowanie pod względem wielkości jak i frakcjonowanie pod względem ładunku pozwalało na selekcję silnie naładowanych form glikozylowanych α-Gal A.

2.5 Internalizacja α-Gal A za pośrednictwem mannozy lub mannozo-6-fosforanu (M6P)

Aby α-Gal A wytwarzany przez stabilnie transfekowane komórki był efektywnym czynnikiem terapeutycznym na niedobory α-Gal A, enzym musi być włączany przez dotknięte chorobą komórki. α-Gal A ma minimalną aktywność przy fizjologicznym poziomie pH, na przykład we krwi lub płynach śródmiąższowych. α-Gal A metabolizuje zakumulowane substraty lipidowe optymalnie tylko gdy jest włączona w środowisko kwasowe lizosomu. Internalizacja zachodzi za pośrednictwem wiązania α-Gal A z receptorami M6P, wyrażanymi na powierzchni komórki i dostarczającymi enzym do lizosomu drogą endocytozy. Receptor M6P jest powszechnie wyrażany; większość komórek somatycznych wyraża w pewnym stopniu M6P. Receptor mannozowy, specyficzny wobec eksponowanych reszt mannozy na glikoproteinach jest mniej rozpowszechniony. Receptory mannozowe są ogólnie znajdowane tylko na makro fagach i komórkach podobnych do makro fagów i dostarczają dodatkowych sposobów wejścia α-Gal A do tych typów komórek.

W celu wykazania internalizacji α-Gal A za pośrednictwem M6P, fibroblasty pochodzące od pacjenta z chorobą Fabry'ego (NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository) hodowano przez noc w obecności rosnących stężeń oczyszczonego α-Gal A. Niektóre z próbek zawierały rozpuszczalny 5 mM receptor M6P, który kompetycyjnie hamuje wiązanie i włączanie przez receptor M6P. Inne próbki zawierały 30 mg/ml mannanu, który hamuje wiązanie i internalizacje przez receptor mannozowy. Po inkubacji komórki płukano i zbierano przez zdrapywanie do buforu lizującego (10 mM Tris, pH 7,2, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 2 mM Pefabloc™ (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) i 1% NP-40). Zlizowane próbki testowano pod względem stężenia białka i aktywności α-Gal A. Wyniki przedstawiono jako jednostki aktywności α-Gal A/mg białka komórkowego. Komórki Fabry'ego włączały α-Gal A w sposób zależny od dawki. Takie włączanie było hamowane przez M6P, ale nie było hamowania przez mannan. Tak więc, włączanie α-Gal A do fibroblastów Fabry'ego zachodzi za pośrednictwem receptora M6P, a nie za pośrednictwem receptora mannozowego.

α-Gal A jest także włączana in vitro przez komórki śródbłonkowe, ważne komórki docelowe w leczeniu choroby Fabry'ego. Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępkowej (HUVEC, ang. human umbilical vein endothelial cells) hodowano przez noc z 7500 jednostkami α-Gal A; studzienki zawierały M6P. Po okresie inkubacji, komórki zbierano i testowano pod kątem α-Gal A jak opisano wyżej. Komórki inkubowane z α-Gal A miały poziom enzymu prawie 10 razy wyższy niż komórki kontrolne (brak inkubacji z α-Gal A). M6P hamował wewnątrzkomórkową akumulację α-Gal A, co sugeruje, że włączanie α-Gal A przez komórki HUVEC zachodzi za pośrednictwem receptora M6P. Tak więc ludzka α-Gal A jest włączana przez klinicznie odpowiednie komórki.

Wiadomo o nielicznych hodowanych ludzkich liniach komórkowych, które wyrażają receptor mannozowy. Jednakże, do ustalenia, czy oczyszczona α-Gal A jest włączana poprzez receptor mannozowy, można użyć mysiej linii komórkowej, komórek podobnych do makrofagów (J774.E), która posiada receptory mannozowe lecz niewiele jeśli w ogóle receptorów M6P. Diment i wsp., J. Leukocyte Biol. 42: 485-490 (1987). Komórki J774.E hodowano przez noc w obecności 10000 jednostek/ml α-Gal A. Wybrane próbki zawierały także 2mM M6P, a inne zawierały 100 mg/ml mannanu. Komórki płukano i zbierano jak opisano wyżej i ustalano całkowitą zawartość białka i aktywność α-Gal A w każdej próbce. M6P nie hamuje pobierania α-Gal A przez te komórki, gdy mannan obniża poziom akumulowanego α-Gal A o 75%. Tak więc α-Gal A może być włączana poprzez receptor mannozowy w typach komórek wyrażających szczególny receptor powierzchni komórki.

PL 210 833 B1

P r z y k ł a d 3

Prepart farmaceutyczny

Przygotowanie roztworów buforów i preparatów

Oczyszczoną masę α-Gal A rozcieńcza się do ostatecznego stężenia rozcieńczalnikiem do α-Gal A. W zależności od zaplanowanej objętości oczyszczonego białka do przygotowania preparatu, stężenia α-Gal A (mg/ml) i żądanego stężenie α-Gal A w końcowym preparacie, ustala się objętość potrzebnego rozcieńczalnika dla α-Gal A. Rozcieńczalnik dla α-Gal A przygotowuje się w ciągu 24 godzin do użycia przez zmieszanie odpowiednich ilości WFI, chlorku sodu i jednozasadowego fosforanu sodu i doprowadzając pH do wartości 6,0 roztworem wodorotlenku sodu. Skład rozcieńczalnika dla α-Gal A wymieniono w Tabeli 8

T a b e l a 8

Skład rozcieńczalnika dla α-Gal A (na litr)

Składnik	Numer	Ilość
Chlorek sodu (USP)	100-1916	8,8 g
Wodorotlenek sodu, 5N	200-1903	ilość odp. do doprowadzenia pH do 6,0
Fosforan sodowy, jednozasadowy (USP)	100-1913	3,5 g
Woda do zastrzyków (USP)	100-2301	ilość odp. do dopełnienia do 1,01

Jeden litr lub mniejsze objętości rozcieńczalnika dla α-Gal A filtruje się pod ciśnieniem stosując sterylne filtry nylonowe 0,2 mm (Nalge Nunc International, Rochester, NY). Większe objętości filtruje się pod dodatnim ciśnieniem stosując pompę perystaltyczną i 0,2 mm filtry kapsułowe Supor® (Pall, Port Washington, NY). Wszystkie filtry po filtracji poddaje się testowi punktu bąbelkowania na integralność. Etapy mieszania i filtrowania przeprowadza się w przepływowej komorze laminamej posiadającej certyfikat Class 100. W naczyniu do mieszania do oczyszczonego α-Gal A dodaje się rozcieńczalnika dla α-Gal A by uzyskać końcowe stężenie 1 mg/ml. Następnie dodaje się odpowiednią objętość polysorbate 20 (Tween 20, Spectrum) by osiągnąć końcowe stężenie 0,02%.

P r z y k ł a d 4 α-Gal A pozbawione reszt sjalowych i galaktozowych

By zbadać wpływ glikozylacji na dystrybucję biologiczną α-Gal A oczyszczony preparat α-Gal A kolejno deglikozylowano i każdą formę wstrzykiwano myszom. Narządy myszy zbierano cztery godziny po zastrzyku i przeprowadzano na tkankach immunocytochemię w celu uwidocznienia możliwych zmian w biologicznej dystrybucji białka.

α-Gal A wpierw traktowano neuraminidazą (sjalidazą) w celu usunięcia reszt kwasu sjalowego, pozostawiając eksponowane reszty galaktozowe. Porcję tak potraktowaną sjalidazą poddano następnie reakcji katalizowanej przez β-galaktozydazę w celu usunięcia reszt galaktozowych; pozostawiało to eksponowane reszty N-acetyloglukozoaminowe (GlcNAC). Reszty GlcNAC następnie usunięto za pomocą N-acetyloglukozoaminidazy pozostawiając grupy mannozowe białka. Nietraktowaną α-Gal A (kontrola) lub jedną z traktowanych form wstrzykiwano myszom poprzez żyłę ogonową. Cztery godziny po zastrzykach zbierano wątrobę, śledzionę, nerkę i płuca myszy, konserwowano i wykonywano barwienie immunologiczne w celu wykrycia α-Gal A.

Gdy porównano ze zwierzętami kontrolnymi, którym podawano nietraktowane białko, myszy, myszy którym podawano enzym traktowany sjalidazą (eksponowane grupy galaktozowe) miały więcej α-Gal A zlokalizowanego w wątrobie i odpowiednio mniej enzymu w innych badanych narządach. Dodatkowo wzór barwienia w wątrobie był nieco inny. U zwierząt kontrolnych α-Gal A lokalizowała się wpierw w komórkach Kupffera i komórkach śródbłonka z tylko ograniczonym barwieniem hepatycytów. U zwierząt otrzymujących α-Gal A traktowane sjalidazą enzym lokalizował się wyłącznie w hepatocytach, zgodnie ze znaną dystrybucją biologiczną receptora asjaloglikoproteinowego. Taki efekt deglikozylacji na dystrybucję biologiczną był odwracany, gdy za pomocą β-galaktozydazy usuwano reszty galaktozowe. Obserwowany wzór barwienia w wątrobach myszy przyjmujących takie białko bez reszt galaktozowych był podobny do zwierząt kontrolnych; większość barwnika obecna była w komórkach Kupffera i komórkach śródbłonkowych z minimalnym zabarwieniem hepatocytów. Dodatkowo, traktowanie α-Gal A N-acetyloglukozoaminidazą nie zaburzało wzoru barwienia w porównaniu z obserwowanym dla białka traktowanego β-galaktozydazą; czyli usunięcie reszt N-acetyloglukozoaminy wydaje się mieć niewielki wpływ na biologiczną dystrybucję α-Gal A.

PL 210 833 B1

P r z y k ł a d 5

Poprawianie fibroblastów Fabry'ego przez ludzkie fibroblasty wyrażające α-Gal A

W celu terapii genowej, implant autologicznych komórek wytwarzających α-Gal A musi produkować enzym w formie zmodyfikowanej odpowiednio by „naprawiać” niedobór α-Gal A w komórkach docelowych. Aby osiągnąć wpływ produkcji α-Gal A przez transfekowane ludzkie fibroblasty na komórki Fabry'ego, fibroblasty zebrane od pacjentów z chorobą Fabry'ego (NIGMS Human Genetics Mutant Cell Repository) hodowano wspólnie ze szczepem produkującym α-Gal A (BRS-11) w Transwells® (Costar, Cambridge, MA). Komórki Fabry'ego hodowano na szalkach do hodowli tkankowych o 12 studzienkach, z których niektóre zawierały wstawki (Transwells®, wielkość porów 0,4 mm) posiadające powierzchnię na której można hodować komórki. Macierz wzrostu wstawki jest porowata i pozwala makrocząsteczkom na przejście z wyższego do niższego środowiska. Jeden zestaw wstawek zawierał prawidłowe ludzkie fibroblasty napletka (HF) wydzielające minimalne poziomy α-Gal A, gdy inny zestaw zawierał szczep stabilnie transfekowanych fibroblastów ludzkich, BRS-11 wydzielający duże ilości α-Gal A. W studzienkach ze wspólną hodowlą z komórkami produkującymi α-Gal A, α-Gal A może przejść do pożywki obmywając komórki Fabry'ego i potencjalnie być włączana przez komórki Fabry'ego.

Dane w Tabeli 9 pokazują, że komórki Fabry'ego włączały wydzielaną α-Gal A. Wewnątrzkomórkowe poziomy α-Gal A obserwowano przez 3 dni. Komórki hodowane samotnie (bez wstawki) lub w obecności nietransfekowanych fibroblastów napletka (wstawka HS) miały bardzo niewielki wewnątrzkomórkowy poziom aktywności α-Gal A. Komórki Fabry'ego hodowane z komórkami produkującymi α-Gal A (wstawka BRS-11) jednakże wykazywały poziomy enzymu podobne do komórek normalnych pod koniec drugiego dnia (normalne fibroblasty mają 25-80 jednostek α-Gal A /mg białka). To, że poprawę można przypisać α-Gal A pobranemu przez receptor M6P pokazano przez hamowanie przez M6P (wstawka BRS-11 + M6P).

T a b e l a 9

Skorygowanie fibroblastów Fabry'ego przez ludzkie fibroblasty wykazujące aktywność α-Gal A (jednostki/mg całkowitego białka)

Czas	Brak wstawki	Wstawka HF	Wstawka BRS-11	Wstawka BRS-11 + M6P
Dzień 1	2 ± 1	2 ± 1	13 + 1	4 ± 1
Dzień 2	2 ± 1	2±1	40 ± 1	6 ± 2
Dzień 3	2 ± 1	5 ± 1	85 ± 1	9 ± 1

Powyższy opis przedstawiono wyłącznie w celu ilustracji i nie ma on na celu ograniczania wynalazku do dokładnie przedstawionej postaci. W opisie i zastrzeżeniach pojedyncze formy obejmują mnogie odniesienia, chyba że kontekst wyraźnie wskazuje inaczej. Wszystkie patenty i publikacje cytowane w niniejszym wyszczególnieniu są włączone na drodze odniesienia.

PL 210 833 B1

Lista sekwencji <110> Transkaryotic Therapies, Inc.

<120> Treatment for alpha-Galactosidase A Deficiency <130> 18082-001 PCT <140> Not yet assigned <141> 2000-03-08 <150> 09/266,014 <151> 1999-03-11 <160> 24 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 210 <212> DNA ^<213> Sztuczna sekwencja <220>

<223= Opis sztucznej sekwencji: sonda z ludzkiej biblioteki z fibroblastów: ekson 7, włączając startery do amplifikacji <400> 1 ctgggctgta gctatgataa accggcagga gattggtgga cctcgctctt 50 ataccatcgc agttgcttcc ctgggtaaag gagtggcctg taatcctgcc 100 tgcttcatca cacagctcct ccctgtgaaa aggaagctag ggttctatga 150 atggacttca aggttaagaa gtcacataaa tcccacaggc actgttttgc 200 ttcagctaga 210 <210> 2 <211> 268 <212> DNA ^<213> Sztuczna sekwencja <220> Opis sztucznej sekwencji: 5' koniec klonu cDNA włącząjac <223>

startery do amplifikacji.

<400> 2 attggtccgc ccctgaggtt aatcttaaaa gcccaggtta cccgcggaaa 50 tttatgctgt ccggtcaccg tgacaatgca gccgaggaac ccagaactac 100 at.ctgggctg cgcgcttgcg cttcgcttcc tagccctcgt ttcctgcgac 150 atccctgggg ctagagcact ggacaatgga ttggcaagga cgcctaccac 200

999^ct99^ct9 cactgggagc gcttcatgtg caaccttgac tgccaggaag 250

PL 210 833 B1 agccagattc ctgcatca <210> 3 <211> 1343 <212 > DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ccgcgggaaa tttatgctgt ccggtcaccg ccagaactac atctgggctg cgcgcttgcg ttcctgggac atccctgggg ctagagcact cgcctaccat gggctggctg cactgggagc tgccaggaag agccagattc ctgcatcagt ggcagagctc atggtctcag aaggctggaa tctgcattga tgactgttgg atggctcccc cttcaggcag accctcagcg ctttcctcat ttatgttcac agcaaaggac tgaagctagg ataaaacctg cgcaggcttc cctgggagtt gcccagacct ttgctgactg gggagtagat ttactgtgac agtttggaaa atttggcaga tggccctgaa taggactggc agaagcattg ctttatatgt ggccctttca aaagcccaat ctgcaatcac tggcgaaatt ttgctgacat taaagagtat cttggactgg acatctttta gttgctggac cagggggttg gaatgaccca ctttggcctc agctggaatc agcaagtaac tcatggctgc tcctttattc atgtctaatg caagccaaag ctctccttca ggataaggac ccccttgggc aagcaagggt accagcttag tgtgggaacg acctctctca ggcttagcct cggcaggaga ttggtggacc tcgctcttat gggtaaagga gtggcctgta atcctgcctg ctgtgaaaag gaagctaggg ttctatgaat cacataaatc ccacaggcac tgttttgctt gatgtcatta aaagacttac tttaaaaaaa

268 tgacaatgca gctgaggaac 50 cttcgcttcc tggccctcgt 100 ggacaatgga ttggcaagga 150 gcttcatgtg caaccttgac 200 gagaagctct tcatggagat 250 ggatgcaggt tatgagtacc 300 aaagagattc agaaggcaga 350 gggattcgcc agctagctaa 400 gatttatgca gatgttggaa 450 ttggatacta cgacattgat 500 ctgctaaaat ttgatggttg 550 tggttataag cacatgtcct 600 tgtactcctg tgagtggcct 650 tatacagaaa tccgacagta 700 tgatgattcc tggaaaagta 750 accaggagag aattgttgat 800 gatatgttag tgattggcaa 850 teagatggcc ctctgggcta 900 acctccgaca catcagccct 950 gtaattgcca tcaatcagga 1000 acagggagac aactttgaag 1050 gggctgtagc tatgataaac 1100 accatcgcag ttgcttccct 1150 cttcatcaca cagctcctcc 1200 ggacttcaag gttaagaagt 1250 cagctagaaa atacaatgca 1300 aaaaaaactc gag 1343

<210>	4
<211>	398
<212>	PRT
<213>	Homo
<400>	4

Leu Asp Asn Gly Leu Ala Arg Thr

5

Glu Arg Phe Met Cys Asn Leu Asp

Ile Ser Glu Lys Leu Phe Met Glu

Pro Thr	Met	Gly	Trp	Leu	His 15	Trp
	10
Cys	Gin	Glu	Glu	Pro	Asp	Ser	Cys
25					30
Met	Ala	Glu	Leu	Met	Val	Ser	Glu

PL 210 833 B1

35

40

45

Gly

Trp

Lys

Asp

Ala

Gly

Tyr

Glu

Tyr

Leu

Cys

Ile

Asp

Cys

Trp

50

55

60

Met

Ala

Pro

Gin

Arg

Asp

Ser

Glu

Gly

Arg

Leu

Gin

Ala

Asp

Pro

Gin

65

70

75

80

Arg

Phe

Pro

His

Gly

Ile

Arg

Gin

Leu

Ala

Asn

Tyr

Val

His

Ser

Lys

85

90

95

Gly

Leu

Lys

Leu

Gly

Ile

Tyr

Ala

Asp

Val

Gly

Asn

Lys

Thr

Cys

Ala

100

105

110

Gly

Phe

Pro

Gly

Ser

Phe

Gly

Tyr

Asp

Ile

Asp

Ala

Gin

Thr

Phe

115

120

125

Ala

Asp

Trp

Gly

Val

Asp

Leu

Lys

Phe

Asp

Gly

Cys

Tyr

Cys

Asp

130

135

140

Ser

Leu

Glu

Asn

Leu

Ala

Asp

Gly

Tyr

Lys

His

Met

Ser

Leu

Ala

Leu

145

150

155

160

Asn

Arg

Thr

Gly

Arg

Ser

Ile

Val

Tyr

Ser

Cys

Glu

Trp

Pro

Leu

Tyr

165

170

175

Met

Trp

Pro

Phe

Gin

Lys

Pro

Asn

Tyr

Thr

Glu

Ile

Arg

Gin

Tyr

cys

180

185

190

Asn

His

Trp

Arg

Asn

Phe

Ala

Asp

Ile

Asp

Ser

Trp

Lys

Ser

Ile

195

200

205

Lys

Ser

Ile

Leu

Asp

Trp

Thr

Ser

Phe

Asn

Gin

Glu

Arg

Ile

Val

Asp

210

215

220

Val

Ala

Gly

Pro

Gly

Trp

Asn

Asp

Pro

Asp

Met

Leu

Val

Ile

Gly

225 230 235 240

PL 210 833 B1

Asn Phe Gly Leu Ser Trp Asn Gin

245

Ala Ile Met Ala Ala Pro Leu Phe

260

Ser Pro Gin Ala Lys Ala Leu Leu

275 280

Asn Gin Asp Pro Leu Gly Lys Gin

290 295

Asn Phe Glu Val Trp Glu Arg Pro

305 310

Ala Met Ile Asn Arg Gin Glu Ile

325

Ala Val Ala Ser Leu Gly Lys Gly

340

Ile Thr Gin Leu Leu Pro Val Lys

355 360

Thr Ser Arg Leu Arg Ser His Ile

370 375

Gin Leu Glu Asn Thr Met Gin Met

385 390

Gin Val Thr Gin Met Ala Leu Trp

250 255

Met Ser Asn Asp Leu Arg His Ile

265 270

Gin Asp Lys Asp Val Ile Ala Ile

285

Gly Tyr Gin Leu Arg Gin Gly Asp

300

Leu Ser Gly Leu Ala Trp Ala Val

315 320

Gly Gly Pro Arg Ser Tyr Thr Ile

330 335

Val Ala Cys Asn Pro Ala Cys Phe

345 350

Arg Lys Leu Gly Phe Tyr Glu Trp

365

Asn Pro Thr Gly Thr Val Leu Leu

380

Ser Leu Lys Asp Leu Leu

395 <210> 5 <211> 1197 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 ctggacaatg gcgcttcatg gtgagaagct aaggatgcag gattggcaag tgcaaccttg cttcatggag gttatgagta gacgcctacc actgccagga atggcagagc cctctgcatt atgggctggc agagccagat tcatggtctc gatgactgtt tgcactggga tcctgcatca agaaggctgg ggatggctcc

100

150

200

PL 210 833 B1 ccaaagagat tcagaaggca gacttcaggc agaccctcag cgctttcctc atgggattcg ccagctagct aattatgttc acagcaaagg actgaagcta gggatttatg cagatgttgg aaataaaacc tgcgcaggct tccctgggag ttttggatac tacgacattg atgcccagac ctttgctgac tggggagtag atctgctaaa atttgatggt tgttactgtg acagtttgga aaatttggca gatggttata agcacatgtc cttggccctg aataggactg gcagaagcat tgtgtactcc tgtgagtggc ctctttatat gtggcccttt caaaagccca attatacaga aatccgacag tactgcaatc actggcgaaa ttttgctgac attgatgatt cctggaaaag tataaagagt atcttggact ggacatcttt taaccaggag agaattgttg atgttgctgg accagggggt tggaatgacc cagatatgtt agtgattggc aactttggcc tcagctggaa tcagcaagta actcagatgg ccctctgggc tatcatggct gctcctttat tcatgtctaa tgacctccga cacatcagcc ctcaagccaa agctctcctt caggataagg acgtaattgc catcaatcag gaccccttgg gcaagcaagg gtaccagctt agacagggag acaactttga agtgtgggaa cgacctctct caggcttagc ctgggctgta gctatgataa accggcagga gattggtgga cctcgctctt ataccatcgc agttgcttcc ctgggtaaag gagtggcctg taatcctgcc tgcttcatca cacagctcct ccctgtgaaa aggaagctag ggttctatga atggacttca aggttaagaa gtcacataaa tcccacaggc actgttttgc ttcagctaga aaatacaatg cagatgtcat taaaagactt actttaa <210> e <2ll> 22 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> opis sztucznej sekwencji: Starter do PGR <400> 6 ctgggctgta gctatgataa ac <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> opis sztucznej sekwencji: Starter do PC.R <400> 7 tctagctgaa gcaaaacagt g

DNA

Sztuczna sekwencja <210>

<211>

<212>

<213>

<220> <223 >

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

800

850

900

950

1000

1050

1100

1150

1197

Opis sztucznej sekwencji: Starter do PGR

PL 210 833 B1 <400> 8 attggtccgc ccctgaggt <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213>

<220>

<223?

Sztuczna sekwencja

Opis sztucznej sekwencji: Starter do PCR <400> 9 tgatgcagga atctggctct <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213? Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztuczne] sekwencji: Starter do PCR <400> 10 ttttggatcc ctcgaggaca ttgattattg actag <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213>

<220>

<223>

Sztuczna sekwencja : Opis sztucznej sekwencji: Starter do PCR <400> 11 ttttggatcc cgtgtcaagg acggtgac <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213>

<220>

<223>

Sztuczna sekwencja

Opis sztucznej sekwencji: Starter do PCR <400? 12 ttttggatcc accatggcta <210? 13 <211>

<212>

<213>

DNA

Sztuczna sekwencja

PL 210 833 B1 <220>

<223>

Opis sztucznej sekwencji: Starter do PGR <400> 13 ttttgccggc actgccctct tgaa 24 <210> 14 <2ll> 24 <212> DNA ^<213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: Starter do PCR <400> 14 ttttcagctg gacaatggat tggc 24 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213>

Sztuczna sekwencja <220>

<223 > Opis sztucznej sekwencji: Starter do PCR <400> 15 ttttgctagc tggcgaatcc <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213>

<220>

Sztuczna sekwencja <223> Opis sztucznej sekwencji: Starter do PCR <400> 16 ttttggatcc gtgtcccata gtgtttccaa <210> 17 <211> 28 <212> DNA ^<213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji

Starter do PCR <400> 17 ttttggatcc gcagtcgtgg ccagtacc

Claims

1. Zastosowanie preparatu α-Gal A do wytwarzania leku do leczenia niedoboru α-Gal A, przy czym lek jest przeznaczony do podawania raz w tygodniu lub raz na dwa tygodnie w dawce od 0,1 do 0,3 mg α-Gal A na kilogram masy ciała pacjenta, a więcej niż 50% wszystkich glikanów preparatu α-Gal A stanowią glikany złożone.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do podawania w dawce 0,2 mg preparatu α-Gal A na kilogram masy ciała pacjenta.

3. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że dawka jest formułowana do podawania domięśniowo, doustnie, doodbytniczo, podskórnie, dotętniczo, dootrzewnowo, domózgowo, donosowo, dooponowo, przez śluzówkowo, przezskómie lub przez inhalację.

4. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że preparat α-Gal A ma aktywność specyficzną wynoszącą co najmniej 2,0 x 10⁶ jednostek/mg białka.

5. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że preparat jest oczyszczony do co najmniej 98% homogenności, mierzonej przez SDS-PAGE albo HPLC w odwróconym układzie faz.

6. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że preparat jest oczyszczony do co najmniej 98% homogenności, mierzonej przez SDS-PAGE albo HPLC w odwróconym układzie faz i ma aktywność specyficzną wynoszącą co najmniej 2,0 x 10⁶ jednostek/mg białka.

7. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że co najmniej 67% wszystkich glikanów glikoform α-Gal A preparatu stanowią glikany typu złożonego.

8. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że glikoformy ludzkiej α-Gal A zawierają średnio dwa złożone glikany na monomer α-Gal A.

9. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że więcej niż 50% wszystkich glikanów glikoform α-Gal A jest sjalilowana.

10. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że α-Gal A jest izolowana z ludzkich komórek modyfikowanych genetycznie do wyrażania polipeptydu α-Gal A.

11. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że ludzkimi komórkami są wtórne fibroblasty.

12. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że glikoformy ludzkiej α-Gal A zawierają od 50% do 70% złożonych glikanów z 2-4 resztami kwasu sjalowego.

13. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że ludzkie komórki są wtórnymi fibroblastami.

14. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że preparat ma aktywność specyficzną wynoszącą co najmniej 2,0 x 10⁶ jednostek/mg białka i jest wytworzony przez:

a) dostarczenie genetycznie modyfikowanych ludzkich komórek do ekspresji polipeptydu α-Gal A;

oraz

15. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że preparat jest oczyszczony do co najmniej 98% homogenności, mierzonej przez SDS-PAGE albo HPLC w odwróconym układzie faz.

16. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że co najmniej 67% wszystkich glikanów glikoform α-Gal A preparatu stanowią glikany typu złożonego.

17. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że glikoformy α-Gal A zawierają średnio dwa złożone glikany na monomer α-Gal A.

18. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że więcej niż 50% wszystkich glikanów glikoform α-Gal A jest sjalilowana.

19. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że genetycznie modyfikowana ludzka komórka jest transfekowana konstruktem α-Gal A/wektor ekspresyjny ssaka.

20. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że genetycznie modyfikowana ludzka komórka jest transfekowana kwasem nukleinowym kodującym elementy regulatorowe kontrolujące ekspresję sekwencji kodującej α-Gal A.

21. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że genetycznie modyfikowane ludzkie komórki są wtórnymi fibroblastami.

22. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że oczyszczanie polipeptydu α-Gal A obejmuje zastosowanie co najmniej jednej procedury oczyszczania wybranej z grupy składającej się z: chromatografii oddziaływań hydrofobowych, chromatografii oddziaływań jonowych, chromatografii

PL 210 833 B1 wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek, chromatografii z chromatoogniskowaniem, chromatografii powinowactwa z chelatowaniem metalu lub chromatografii powinowactwa.

23. Zastosowanie według zastrz. 22, znamienne tym, że oczyszczanie polipeptydu α-Gal A obejmuje ponadto etap frakcjonowania glikoformy α-Gal A.

24. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do podawania raz na dwa tygodnie.

25. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do podawania raz w tygodniu.

26. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że lek jest formułowany do podawania podskórnego.

27. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do podawania raz w tygodniu lub raz na dwa tygodnie w dawce 0,2 mg preparatu α-Gal A na kg wagi ciała pacjenta.

28. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że dawka jest formułowana do podawania przez pompę, przez dostarczanie enkapsułkowanych komórek, dostarczanie liposomalne, iniekcje igłowe, iniekcje bezigłowe, nebulizatory, aerozolizery, elektroporację i plastry przezskóme.

29. Zastosowanie preparatu α-Gal A do wytwarzania leku do leczenia choroby Fabry'ego, przy czym lek jest przeznaczony do podawania raz w tygodniu lub raz na dwa tygodnie w dawce od 0,1 do 0,3 mg prepratu α-Gal A na kilogram masy ciała pacjenta, a więcej niż 50% wszystkich glikanów preparatu α-Gal A stanowią glikany złożone.

30. Zastosowanie według zastrz. 29, znamienne tym, że lek jest formułowany do podawania podskórnego.

31. Zastosowanie według zastrz. 29, znamienne tym, że pacjent ma klasyczną chorobę Fabry'ego.

32. Zastosowanie według zastrz. 29, znamienne tym, że pacjent ma zaburzenie sercowe.

33. Zastosowanie według zastrz. 29, znamienne tym, że pacjent ma zaburzenie nerek.

34. Zastosowanie według zastrz. 29, znamienne tym, że pacjent ma co najmniej jedną chorobę wybraną z grupy składającej się z dystrofii rogówki, naczyniaka skóry z rogowaceniem, bolesnej neuropatii, choroby naczyniowej mózgu, kardiomiopatii, hipertrofii lewej komory, duszności wysiłkowej, niesymetrycznej hipertrofii przegrody, zawału mięśnia sercowego, nacieku mięśnia sercowego i niedomykalności zastawki dwudzielnej.

35. Zastosowanie wdług zastrz. 29, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do podawania raz w tygodniu lub raz na dwa tygodnie w dawce 0,2 mg preparatu α-Gal A na kg wagi ciała pacjenta.

36. Zastosowanie preparatu α-Gal A do wytwarzania leku do leczenia atypowego wariantu choroby Fabry'ego, przy czym lek jest przeznaczony do podawania raz w tygodniu lub raz na dwa tygodnie w dawce od 0,1 do 0,3 mg preparatu α-Gal A na kilogram masy ciała pacjenta, a więcej niż 50% wszystkich glikanów preparatu α-Gal A stanowią glikany złożone.

37. Zastosowanie według zastrz. 36, znamienne tym, że ma nieprawidłowości układu sercowo-naczyniowego.

38. Zastosowanie według zastrz. 37, znamienne tym, że nieprawidłowością układu sercowo-naczyniowego jest hipertrofia lewej komory (LVH).

39. Zastosowanie według zastrz. 36, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do podawania w dawce 0,2 mg preparatu α-Gal A na kg wagi ciała pacjenta.