KR20020021371A - α-갈락토시다제 Ａ 결핍증의 치료 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 고도로 정제된 α-Gal A 및 이를 정제하는 각종 방법; 전하량이 변경된 α-Gal A 제제 및 이들 제제를 제조하는 방법; 포유류 숙주에서 순환 반감기가 연장된 α-Gal A 제제 및 이를 제조하는 방법; 및 α-Gal A 제제를 피험체에게 투여하는 방법 및 용량을 제공한다.

Description

α-갈락토시다제 Ａ 결핍증의 치료{TREATMENT OF α-GALACTOSIDASE A DEFICIENCY}
파브리병은 X-연관 유전되는 리소좀 저장병으로서, 심각한 신장 손상, 각하혈관종 및 심혈관 이상, 예를 들어 심실 확장 및 승모판 부전을 특징으로 한다. 또한, 파브리병은 말초신경계에도 영향을 미치는데, 극심한 작열통의 에피소드를 유발한다. 파브리병은 효소인 α-갈락토시다제 A(α-Gal A)의 결핍에 기인한다. α-Gal A는 여러가지 당복합체의 말단 α-갈락토실 부분을 절단하는 리소좀 당가수분해효소이다. 파브리병은 중성 글리코스핑고리피드, 세라마이드 트리헥소시드(CTH)의 이화작용의 차단 및 세포와 혈류 내에 상기 효소 기질의 축적으로 귀착된다.
상기 질병의 X-연관된 유전 패턴때문에, 대부분의 파브리병 환자들은 남성이다. 심한 영향을 받은 여성 이형접합체가 관찰됨에도 불구하고, 여성 이형접합체는 종종 무증후성이거나, 상대적으로 약한 징후(예를 들어, 각막의 특징적인 불투명)를 나타낸다. 낮은 잔류 α-Gal A 활성과 매우 약한 징후를 나타내거나, 또는 명백히 파브리병의 특징적인 징후를 나타내지 않는 파브리병의 비전형적인 변이는 좌심실 이상비대증 및 심장 질환과 관련되어 있다[참조: Nakano 등,New Engl. J. Med.333: 288-293 (1995)]. α-Gal A의 감소는 이러한 심장 이상의 원인일 수 있다.
인간 α-Gal A를 암호화하는 cDNA 및 유전자는 분리되고, 서열결정되어 왔다. 인간 α-Gal A는 429개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드로 발현되는데, 이의 N-말단 31개의 아미노산은 단일 펩티드이다. 인간 효소는 차이니즈 햄스터 난(CHO) 세포[참조: Desnick 등, 미국 특허 제5,356,804호; Ioannou 등,J. Cell Biol.119: 1137 (1992)] 및 곤충 세포[참조: Calhoun 등, WO 90/11353]에서 발현되어 왔다.
그러나, α-Gal A의 현 제법은 효율이 제한된다. 상대적으로 고순도의 α-Gal A을 제조하기 위한 방법은 렉틴 친화도 크로마토그래피[콘카나발린 A(Con A) 세파로즈(등록상표)]와 세파로즈(등록상표) 매트릭스에 커플링된 기질 유사체 N-6-아미노헥사노일-α-D-갈락토실아민에 대한 α-Gal A의 결합에 기초한 친화도 크로마토그래피를 병용하는 친화도 크로마토그래피에 의존한다[참조: 예를 들어, Bishop 등,J. Biol. Chem.256: 1307-1316 (1981)]. 단백질계 렉틴 친화성 수지와 기질 유사체 수지의 이용은 일반적으로 고형 지지체로부터 친화성 제제의 연속적인 침출과 관련되어 있으며[참조: Marikar 등, Anal. Biochem. 201: 306-310 (1992)], 이는 결국 용액 내에서 유리 형태 또는 용출된 단백질에 결합된 친화성 제제로 인한 정제된 단백질의 오염 문제로 귀착된다. 이러한 오염원으로 인해 생성물은 약학 제제에 사용하기에 부적합하게 된다. 또한, 결합된 기질 유사체 및 렉틴은 단백질의 효소적, 기능적 및 구조적 특성에 실질적으로 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 또한, 종래 기술의 방법에 의해 생성된 α-Gal A는 간에 의해 신속하게 제거되어버린다.
따라서, 공급이 용이하고, 대규모의 상업적인 이용에도 적합한 특질을 보유하며, 친화성 제제를 함유하지 않은 α-Gal A 제제를 생성하는, 종래의 크로마토그래피 수지를 이용하는 정제 프로토콜에 대한 요구가 상존하고 있었다. 또한, 당업계에는 순환 반감기가 증가되고, 간 이외의 특정 조직에서의 흡수가 증가된 α-Gal A 제제에 대한 요구도 상존하고 있다.
본 발명은 α-갈락토시다제 A 결핍증의 치료 방법 및 조성물에 관한 것이다.
도 1은 인간 섬유아세포 cDNA 라이브러리로부터 α-Gal A cDNA를 분리하기위해 사용한 210 bp 프로브(서열 번호 1)를 나타내는 도면이다. 이 서열은 α-Gal A 유전자의 엑손 7에서 유래된다. 상기 프로브는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 인간 게놈 DNA로부터 분리한 것이다. 본 도면에서 밑출 친 영역은 증폭 프라이머 서열에 상응한다.
도 2는 α-Gal A cDNA 클론의 5' 말단을 완성하는 DNA 단편의 서열(서열 번호 2)을 도시한 도면이다. 이 단편은 PCR에 의해 인간 게놈 DNA로부터 증폭하였다. 본 도면에서 밑줄 친 영역은 증폭 프라이머 서열에 상응한다. 실시예 1에서 기술한 바와 같은 서브클로닝을 위해 사용한 NcoI 및 SacII 제한 엔도뉴클레아제 부위의 위치도 표시되어 있다.
도 3은 신호 펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 α-Gal A cDNA의 서열(서열 번호 3)을 나타내는 도면이다.
도 4는 α-Gal A 발현 작제물인 pXAG-16의 개략 지도인데, 이는 CMV(사이토메갈로바이러스) 프로모터, 엑손 1 및 제1 인트론, hGH 신호 펩티드 암호 서열 및 제1 인트론, α-Gal A를 위한 cDNA(α-Gal A 신호 펩티드 서열은 결핍) 및 hGH 3' UTS를 포함한다. pcDNeo는 플라스미드 pcDNeo로부터 유도된 neo 유전자의 위치를 나타낸다.
도 5는 α-Gal A 발현 작제물인 pXAG-28의 개략 지도인데, 이는 콜라겐 Iα2 프로모터 및 제1 엑손, β-액틴 인트론, hGH 신호 펩티드 암호 서열 및 제1 인트론, α-Gal A를 위한 cDNA(α-Gal A 신호 펩티드 서열은 결핍) 및 hGH 3' UTS를 포함한다. pcDNeo는 플라스미드 pcDNeo로부터 유도된 neo 유전자의 위치를 나타낸다.
도 6은 인간 α-Gal A 아미노산 서열(서열 번호 4)을 나타내는 도면이다.
도 7은 인간 α-Gal A(신호 펩티드는 포함하지 않음)를 암호화하는 cDNA 서열(서열 번호 5)을 나타내는 도면이다.
도 8은 부틸 세파로즈(등록상표) 수지를 이용하는 α-Gal A 정제 단계의 크로마토그램을 나타내는 도면이다. 선택된 분획의 280 nm에서의 흡광도(실선) 및 α-Gal A 활성(점선)이 도시되어 있다.
도 9는 pGA213C의 개략 지도이다.
도 10은 표적 작제물인 pGA213C와 내인성 α-갈락토시다제 A 유전자좌와의 상동성 재조합을 나타내는 다이아그램이다. pGA213C는 X-염색체 α-갈락토시다제 A 유전자좌 상의 상응하는 서열상에 배열된 표적 서열로서 나타냈다. 메티오닌 개시 코돈 ATG에 대한 위치는 선형 지도 상에 숫자로 표시하였다. 쥐과동물 dhfr, 박테리아 neo 및 CMV 프로모터/알돌라제 인트론 서열을 함유하는 활성화 단위는 이들이 DNA 클로닝에 의해 삽입된 위치(-221) 상에 나타냈다. α-갈락토시다제 A 암호 서열은 검은 상자로 나타냈다. α-갈락토시다제 A 비암호 게놈 서열은 살짝 칠해진 상자로 나타냈다. 큰 화살표는 dhfr 및 neo 발현 카세트의 전사 방향을 나타낸다. 표적화 및 유전자 활성화 후에 GA-GAL mRNA의 스플라이싱은 활성화된 α-갈락토시다제 A(GA-GAL) 유전자좌 지도 하단의 분할선으로 표시하였다.
발명의 상세한 설명
개요
본 발명은 임의의 신규한 α-Gal A 제제 및 이의 제조 방법 뿐만 아니라 이들 제제를 이용하여 파브리병 환자 또는 파브리병의 비전형적인 변이 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 이하, 대표적인 특정 구체예와 그의 상세한 설명을 기술한다.
본 발명은 파브리병의 치료를 위해 임의 세포(α-Gal A 생산 세포)에서 생성된 α-Gal A을 이용한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 표준 유전자 조작 기법(숙주 세포 내로 클로닝된 α-Gal A 유전자 또는 cDNA를 도입하는 것에 기초함) 또는 유전자 활성화를 이용하여 생성된 인간 α-Gal A를 이용한다.
본 발명은 종래 기술에 의해 제조된 α-Gal A 보다 순도가 더 높은 α-Gal A를 함유하는 제제 및 이의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 제조 방법을 이용하면, 인간 α-Gal A 제제의 조성물은 SDS-PAGE 또는 역상 HPLC에 의해 측정하는 경우, 바람직하게는 98% 이상의 균질성, 더 바람직하게는 99% 이상의 균질성 및 가장 바람직하게는 99.5% 이상의 균질성으로 정제된다. 본 발명의 α-Gal A 제제의 특이 활성은 바람직하게는 2.0 x 106단위/mg 단백질 이상, 더 바람직하게는 3.0 x 106단위/mg 단백질 이상 및 가장 바람직하게는 3.5 x 106단위/mg 단백질 이상이다.
한 구체예에서, α-Gal A 제제는 렉틴 크로마토그래피 단계를 포함하지 않는 소수성 상호작용 수지 상에서 다른 성분으로부터 α-Gal A의 여러가지 당형태를 분리함으로써 정제된다. 바람직한 구체예에서, 상기 소수성 상호작용 수지의 기능적 부분은 부틸 기를 포함한다.
다른 구체예에서, α-Gal A 제제는 일차로 α-Gal A의 여러 가지 당형태를평형 완충액내 산성 pH의 컬럼내에서 양이온 교환 수지에 결합시킴으로써 정제한다. 이어서, 상기 컬럼을 평형 완충액으로 세정하여 결합되지 않은 물질을 용출시키고, α-Gal A의 여러 가지 당형태는 용출 완충액으로서 10∼100 mM의 염 용액, pH 4∼5의 완충 용액 또는 이의 조합물을 이용하여 용출시킨다. 바람직한 구체예에서, 평형 완충액의 pH는 약 4.4 이다.
또 다른 구체예에서, α-Gal A 제제는 1 이상의 크로마토포커싱 크로마토그래피, 금속 킬레이트 친화도 크로마토그래피 또는 정제 단계로서 면역친화도 크로마토그래피 중 하나 이상의 단계를 포함하는 정제 과정을 이용하여 샘플 내의 다른 성분으로부터 샘플 내 α-Gal A의 여러 가지 당형태를 분리함으로써 정제한다.
또한, 본 발명은 전하 특성이 변경된 α-Gal A를 보유하는 제제 및 이의 제조 방법을 제공한다. 상기 제제는 α-Gal A의 상이한 당형태를 포함할 수 있다. 전하 변경은 α-Gal A 제제의 시알산 함량을 증가시키고/시키거나, α-Gal A 제제의 인산화를 증가시킴으로써 수행할 수 있다.
α-Gal A 제제의 시알산 함량은 (i) 정제 과정 중 또는 정제 과정 후에 고도로 하전된 및/또는 고 분자량의 α-Gal A 당형태의 분리; (ii) 시알릴 트랜스퍼라제 유전자 또는 cDNA를 발현하도록 유전자적으로 변형된(종래의 유전자 조작법 또는 유전자 활성화에 의함) 세포를 이용하여 시알산 잔기의 첨가; 또는 (iii) 암모늄 농도가 낮은 환경에서 상기 효소를 발현하는 세포의 발효 또는 성장에 의해 증가된다.
α-Gal A 제제의 인산화는 (i) 유전자적으로 변형된(종래의 유전 공학적 방법에 의하거나 또는 유전자 활성화에 의함) 세포를 사용하여 포스페이트 잔기를 첨가하여 포스포릴 트랜스퍼라제 유전자 또는 cDNA를 발현시키거나; 또는 (ii) 배양된 세포에 포스파타제 억제제를 첨가하여 증가시킨다.
본 발명의 방법을 이용하여, 인간의 글리코실화된 α-Gal A 제제가 얻어지는데, 올리고당의 35∼85%가 하전되어 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 올리고당의 35% 이상이 하전되어 있다. 더욱 바람직한 구체예에서, 올리고당의 50% 이상이 하전되어 있다.
다른 바람직한 인간의 글리코실화된 α-Gal A 제제는 2∼4개의 시알산 잔기를 보유하는 바람직하게는 20% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상 및 가장 바람직하게는 70% 이상의 복합 글리칸을 갖는 복수개의 α-Gal A 당형태를 보유한다. 다른 바람직한 구체예에서, 복수개의 당형태를 보유하는 인간의 글리코실화된 α-Gal A 제제는, Z가(Z number)에 의하여 측정시 올리고당 전하가 100 이상, 바람직하게는 150 이상 및 더욱 바람직하게는 170 이상이다. 다른 바람직한 구체예에서, 복수개의 당형태를 보유하는 인간의 글리코실화된 α-Gal A 제제는 인산화된 당형태를 평균 16∼50%, 바람직하게는 25∼50%, 더욱 바람직하게는 30% 이상 보유한다. 다른 구체예에서, 복수개의 당형태를 보유하는 제제는 50∼75%, 바람직하게는 60%의 시알릴화된 전체 글리칸을 보유한다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 올리고당 전하가 증가된 글리코실화된 α-Gal A 제제는 처음에 GlcNAc 트랜스퍼라제 Ⅲ(GnT-Ⅲ)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 α-Gal A 생산 세포에 도입시키거나, 또는 상동성 재조합에 의하여 내인성 GnT-Ⅲ 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열을 도입시킴으로써 제조된다. 이후 상기 α-Gal A 생산 세포를 α-Gal A 및 GnT-Ⅲ를 발현시키는 배양 조건하에서 배양시킨다. 최종 단계는 올리고당 전하가 증가된 α-Gal A 제제를 분리하는 단계로 이루어진다.
본 발명의 다른 구체예에서, 올리고당 전하가 증가된 글리코실화된 α-Gal A 제제는 처음에 시알릴 트랜스퍼라제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 α-Gal A 생산 세포에 도입시키거나, 또는 상동성 재조합에 의하여 내인성 시알릴 트랜스퍼라제 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열을 도입시킴으로써 제조된다. 상기 α-Gal A 생산 세포를 이후 α-Gal A 및 시알릴 트랜스퍼라제를 발현시키는 배양 조건하에서 배양시킨다. 최종 단계는 올리고당 전하가 증가된 α-Gal A 제제를 분리하는 단계로 이루어진다. 바람직한 시알릴 트랜스퍼라제는 α2,3-시알릴 트랜스퍼라제 및 α2,6-시알릴 트랜스퍼라제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 본 방법은 본 제제의 분류 또는 정제에 의하여 크기 증가 또는 전하 증가된 α-Gal A 당형태를 선택하는 부가적 단계를 포함한다.
다른 구체예에서, 시알릴화가 증가된 글리코실화된 α-Gal A 제제는 암모늄 농도가 10 mM 이하, 더욱 바람직하게는 2 mM 이하인 배양 배지와 α-Gal A 생산 세포를 접촉시킴으로써 얻어진다. 바람직한 구체예에서, 암모늄 농도가 낮은 환경은 상기 배양 배지에 글루타민 신테타제를 첨가함으로써 조성된다. 다른 바람직한 구체예에서, 저 암모늄 환경은 α-Gal A 생산 세포에 연속적으로 또는 간헐적으로 신선한 배양 배지를 주입시켜 암모늄 농도를 10 mM 이하, 더욱 바람직하게는 2 mM 이하로 유지시켜 조성된다.
다른 구체예에서, 인산화가 증가된 글리코실화 α-Gal A 제제는 처음에 α-Gal A 생산 세포에 포스포릴 트랜스퍼라제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 도입시키거나, 또는 상동성 재조합에 의하여 내인성 포스포릴 트랜스퍼라제 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열을 도입시킴으로써 얻어진다. 이후 상기 α-Gal A 생산 세포를 α-Gal A 및 포스포릴 트랜스퍼라제를 발현시키는 배양 조건하에서 배양시킨다. 이후 상기 폴리뉴클레오티드 없이 세포에서 생성된 α-Gal A와 비교하여 인산화가 증가된 α-Gal A 제제를 분리한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법에 의하여 제조된 α-Gal A 제제는 복수의 당형태를 보유하는데, 이 당형태는 16∼50%, 바람직하게는 25∼50%, 더욱 바람직하게는 30% 이상 인산화된다. 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 상기 제제를 분류하거나 또는 정제하여 크기가 증가되었거나 또는 전하가 증가된 α-Gal A 당형태를 선택하는 부가적인 단계를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 인산화가 증가된 글리코실화 α-Gal A 제제는 포스포타제 억제제, 예를 들어 브로모테트라미졸을 배양 세포에 첨가함으로써 얻어진다. 소 혈장 알칼리성 포스파타제는 배양 세포의 생장 첨가물로서 사용된 태아 송아지 혈청에 낮은 수준으로 존재할 수 있다. 이로써 분비된 α-Gal A상에 노출된 Man-6-P 에피토프가 혈청 알칼리성 포스파타제에 대한 기질이 될 수 있는 가능성이 높아진다. 브로모테트라미졸은 알칼리성 포스파타제의 유효 억제제인 것으로 보인다 ; Ki는 2.8 mM(Metaye 등의 문헌,Biochem. Pharmacol.15 : 4263 - 4268 (1988))이고,완전 억제는 0.1 mM의 농도에서 달성된다(Borgers 및 Thone의 문헌,Histochemistry44:277-280 (1975)). 따라서 하나의 구체예에서 포스파타제 억제제, 예를 들어 브로모테트라미졸은 배양 세포에 첨가되어 Man-6-P 에스테르기의 가수분해를 억제하여 배양 배지중에 존재하는 고흡수형의 α-Gal A의 생성을 최대화시킨다.
본 발명은 포유 동물 숙주내에서의 순환 반감기가 연장된 α-Gal A 제제 및 이의 제조 방법을 제공한다. 상기 순환 반감기 및 세포 흡수는 (ⅰ) α-Gal A의 시알산 함량의 증가 (전술한 바와 같이 수행) ; (ⅱ) α-Gal A의 인산화의 증가 (전술한 바와 같이 수행) ; (ⅲ) α-Gal A의 PEG화 ; 또는 (ⅳ) α-Gal A의 올리고당 사슬상의 상기 시알산 잔기 및 말단 갈락토스 잔기를 연속적으로 제거하거나, 또는 말단 갈락토스 잔기를 제거함으로써 증가된다.
α-Gal A 제제의 시알화를 개선시키면 외래 α-Gal A의 순환 반감기를 증가시킨다. 더욱이, α-Gal A의 시알릴화를 개선시킴으로써, 간세포의 것과 비교하여, 예를 들어 간 내피 세포, 간 유동 세포, 허파 세포, 신장 세포, 신경 세포, 내피 세포 또는 심장 세포와 같은 비간세포에서의 이의 흡수율을 상승시킨다. 시알산 함량이 증가된 인간의 글리코실화된 α-Gal A 제제는 바람직하게는 2 ∼ 4개의 시알산 잔기를 보유하는 20% 이상의 복합 글리칸을 보유하는 복수개의 당형태를 포함한다. 다른 바람직한 인간의 글리코실화된 α-Gal A 제제는 복수개의 당형태를 보유하는데, 이들은 전체 글리칸의 50 ∼ 75 %, 바람직하게는 60 % 이상이 시알릴화되었다.
α-Gal A 제제의 인산화는 또한 세포에 도입되는 α-Gal A의 수준을 증가시킨다. 인산화는 α-Gal A를 발현하는 세포내에서 수행된다. 본 발명의 하나의 바람직한 인간 글리코실화 α-Gal A 제제는 평균적으로 당형태의 16 ∼ 50%, 바람직하게는 25 ∼ 50%, 더욱 바람직하게는 30% 이상이 인산화된 복수개의 당형태를 포함하는 것이 바람직하다.
다른 구체예에서, 인간 α-Gal A 제제의 순환 반감기는 α-Gal A를 폴리에틸렌 글리콜과 착화시킴으로써 연장된다. 바람직한 구체예에서, α-Gal A 제제는 트레실 모노메톡시 PEG(TMPEG)를 사용함으로써 착화되어 PEG화된 α-Gal A를 형성한다. 이후 상기 PEG화된 α-Gal A는 정제되어 분리된 PEG화 α-Gal A 제제를 제공한다. α-Gal A의 PEG화에 의하여 순환 반감기는 연장되고 상기 단백질의 생체내 효능이 상승한다.
시알릴화는 단백질의 순환 반감기 및 생체 분포에 영향을 준다. 시알산을 최소한으로 보유하거나 또는 보유하지 않는 단백질은 상기 단백질상의 노출된 갈락토스 잔기에 의하여 간세포상의 비시알로당단백질(Ashwell 수용체)에 의하여 용이하게 내부화된다. 갈락토스 말단화된 α-Gal A의 순환 반감기는 (1) α-Gal A 와 뉴라미다제(시알리다제)를 접촉시켜 시알산을 제거함으로써 말단 갈락토스 잔기를 노출시키는 단계, 및 (2) 탈아실화된 α-Gal A와 β-갈락토시다제를 접촉시킴으로써 말단 갈락토시드 잔기를 제거하는 단계를 연속적으로 수행하여 연장시킬 수 있다. 결과로 생성된 α-Gal A 제제는, 뉴라미다제 및 β-갈락토시다제와 차례로 접촉되지 않은 α-Gal A 제제와 비교하여 올리고당 사슬상의 말단 시알산 및/또는 말단갈락토시드 잔기의 수가 감소된다. 또는 갈락토스 말단 α-Gal A의 순환 반감기는 탈시알릴화된 α-Gal A를 β-갈락토시다제와 접촉시켜 말단 갈락토시드 잔기만을 제거함으로써 연장될 수 있다. 결과로 생성된 α-Gal A 제제의 올리고당 사슬상의 말단 갈락토스 잔기의 수는, β-갈락토시다제와 접촉되지 않은 α-Gal A 제제에 비하여 감소된다. 바람직한 구체예에서, 이하의 일련의 뉴라미다제 및 β-갈락토시다제와의 접촉 단계에서, 결과로 생성된 α-Gal A 제제는 차후에 β-헥소사미다제와 접촉함으로써, 올리고당이 트리만노즈 코어로 절단된다.
더욱이, 시알릴화 수준은 사용된 세포 유형에 따라 다양할 수 있다. 따라서, 다른 바람직한 구체예에서, α-Gal A의 시알화는 α-Gal A 생산 세포와 같은 세포들을 사용하여 비교적 시알릴 트랜스퍼라제 활성이 높은 포유 동물 세포, 예를 들어 인간 세포에 대해서 스크리닝함으로써 증가될 수 있다.
본 발명은 예를 들어 알부민과 같은 비α-Gal A 단백질, 숙주 세포에 의하여 제조되는 비α-Gal A 단백질, 또는 동물 조직 또는 체액으로부터 분리된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 α-Gal A 제제의 배합물을 추가로 제공한다. 하나의 구체예에서, 본 배합물은 부형제를 추가로 포함한다. 바람직한 부형제로서는, 만니톨, 소르비톨, 글리세롤, 아미노산, 지질, EDTA, EGTA, 염화나트륨, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 덱스트란 또는 상기 부형제중 임의의 것들의 조합물을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 배합물은 비이온성 세제를 추가로 포함한다. 바람직한 비이온성 세제로서는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 트리톤 X-100, 트리톤 X-114, 노니뎃 P-40, 옥틸 a-글루코시드, 옥틸 b-글루코시드, 브리즈 35, 플루로닉 및 트윈 20을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 비이온성 세제는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80을 포함한다. 바람직한 배합물은 포스페이트 완충된(바람직하게는 pH 6) 염수를 추가로 포함한다.
본 발명은 피험체에 α-Gal A 제제를 투여하는 방법을 추가로 제공한다. 바람직한 구체예에서, 상기 α-Gal A 제제는 전하가 변경되고, 예를 들어 올리고당 전하가 증가되고, 및/또는 본원에 기술된 바와 같이 순환 반감기가 연장된 α-Gal A 제제이다. α-Gal A 제제의 투여량은 매주 또는 격주에 체중 1㎏ 당 바람직하게는 0.05 ∼ 5.0 ㎎, 더욱 바람직하게는 0.1 ∼ 0.3 ㎎이다. 바람직한 구체예에서, 투여량은 격주에 체중 1㎏ 당 약 0.2 ㎎의 양이다. 상기 방법에서, 투여 방법으로서는 근육내, 구강, 직장, 피하, 동맥내, 복강내, 대뇌내, 비강내, 피내, 초내, 경점막, 경피 또는 흡입 투여 방법이 있다. 하나의 구체예에서, 피험체에 α-Gal A 제제를 전달하는 방법은 격주 또는 매주 체중 1㎏당 α-Gal A 제제를 0.01 ∼ 10.0 ㎎, 바람직하게는 0.1 ∼ 5.0 ㎎의 양으로 피하 투여하는 단계를 포함한다. 상기 α-Gal A 제제는 또한 정맥내, 예를 들어 정맥내 환괴 주사, 서입형(slow push) 정맥내 주사, 또는 연속적 정맥내 주사에 의하여 투여될 수도 있다. 전술한 방법들중 임의의 방법에서, α-Gal A 제제는 펌프 전달법, 캡슐화 세포 전달법, 리포좀 전달법, 바늘 전달 주사법, 무바늘 주사법, 분무기, 연무기, 전기 천공법 및 경피성 패치와 같은 전달계를 사용하여 전달될 수 있다. 전술한 α-Gal A 제제중 임의의 것은 상기 방법들에 의하여 투여될 수 있다.
파브리병이 발병된 것으로 의심되는 또는 발병된 것으로 알려진 개체는, 전술한 투여 방법 및 투여량으로, 전술한 바와 같이 α-Gal A 제제를 투여하여 치료될 수 있다. 본 발명은 본원에서 심실이 확장된 파브리 환자로 정의되는, 예를 들어 좌심실 비대증(LVH) 및/또는 승모판 부전과 같은 심혈관 이상이 우세하게 나타나는 파브리 환자 또는 신장 관련 이상 현상이 우세하게 나타나는 파브리 환자의 특정 개체군과 같이, 일반적인 피브리병을 보유하는 개체("파브리 환자") 및 파브리병의 비전형적인 변이를 보유하는 개체의 치료에 관한 것이다.
α-Gal A
α-Gal A는 당지질 및 당단백질로부터 말단 α-갈락토실 부위를 가수분해시키는 호모이량체 당단백질이다.
성숙 "α-Gal A" 및 "GA-GAL" 및 "서열 번호: 5"(도 7 참조)란 용어는 신호 펩티드가 없는 α-Gal A를 칭한다(신호 펩티드를 지닌 α-Gal A에 대해서는, 도 3 및 서열 번호: 3 참조). 본 명세서에서 정의한 바와 같이 " α-Gal A 제제"라는 용어는 "글리코실화된 α-Gal A 제제"와 교환하여 사용될 수 있으며, 다양한 글리코실화된 α-Gal A 당형태를 포함한다.
"신호 펩티드"란 신호 펩티드가 부착되어 있는 새로이 합성된 폴리펩티드를 추가로 번역후 가공 및 분포시키기 위해 소포체(ER)로 향하게 하는 펩티드 서열이다.
α-Gal A와 관련하여 본 명세서에서 사용되는 "이종 구조 신호 펩티드"란 사람 α-Gal A 신호 펩티드가 아니라, 일반적으로 α-Gal A 이외의 몇몇 포유류 단백질의 신호 펩티드를 의미한다.
당업자라면 사람 α-Gal A DNA 서열(cDNA[서열 번호: 5] 또는 게놈 DNA), 또는 침묵 코돈 변화 또는 보존성 아미노산 치환체를 생성하는 코돈 변화로 인해 사람 α-Gal A DNA와는 다른 서열을, 배양된 사람 세포를 유전적으로 변화시키는데 사용하여, 이들이 효소를 과다발현 및 분비하도록 할 수 있다는 것을 알 것이다. α-Gal A DNA 서열의 특정 돌연변이는 향상된 α-Gal A 효소 활성을 보유 또는 나타내는 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 예를 들면, 보존성 아미노산 치환은, 특히 치환이 단백질의 총 잔기 수의 10% 미만일 경우는 생물학적 활성에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않는다는 것을 예상할 것이다. 보존성 치환은 일반적으로 다음 군에 속하는 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌; 발린, 이소루신, 루신; 아스파르트산, 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신. 이에 대해서는, 예컨대 미국 특허 제5,356,804호를 참조할 수 있으며, 이는 본 명세서에서 참고 인용한다.
파브리병
파브리병은 효소 α-Gal A의 활성 결핍에 의해 유발되는 유전적 장애이다. "α-Gal A 결핍증"이란 환자에게 이 효소의 양 또는 활성이 결핍됨으로 인해 혈관 벽의 조직구에 비정상적으로 중성 당지질이 축적되어(예컨대, 글로보트리아오실세라마이드), 넓적다리, 엉덩이, 생식기의 혈관각화종, 수족의 발한감소증, 감각이상, 윤생각막, 및 스포크형 후부 피막하 백내장을 유발시키는 것을 의미한다. 이러한 물질의 침적은 통증, 심각한 신장 및 심혈관 질환, 그리고 뇌졸중을 일으킬 수 있다. 당지질 축적은 파브리병을 앓고 있는 남성에게서 일반적으로 관찰되는 것과같은 심각한 증상을 유발시킬 수 있다. 또한, 이러한 축적은 때때로 결함 유전자의 이형 접합체 여성 보균자에게서 관찰할 수 있는 것과 같은 비교적 약한 증상을 유발시킬 수 있다. 병에 걸린 환자들은 예상 수명이 상당히 단축되며, 신장, 심장 또는 뇌혈관 합병증으로 인해 일반적으로 약 40세에 사망하게 된다. 이 질병의 특수 치료법은 없는 실정이다. 리소좀 저장 장애로서 분류되는 파브리병의 환자는 전 세계적으로 15,000명 이상이 존재한다.
상기 정의한 바와 같이 파브리병은 여러 기관과 여러 시스템이 관련되어 있는 것이 특징인 복합적 임상 증후군이다. 각막 영양장애, 피부 병변(혈관각화종), 통증성 신경장해, 뇌혈관 질환, 심근증, 및 신장 기능장애를 복합적으로 나타내는 환자는 "전형적" 표현형을 나타내는 것으로 분류된다. 그러나, 전형적 표현형의 모든 양상이 아니라 일부를 나타내는 환자도 존재한다. 이러한 환자는 "파브리병의 비전형적 변이"로서 분류된다. α-갈락토시다제 A 결핍증과 관련된 여러 비전형적 변이 표현형이 존재한다. 예를 들면, α-갈락토시다제 A 결핍증을 지닌 몇몇 환자들은 단지 심장과 관련된 파브리병의 변이, 예컨대 좌심실 비대증(LVH)을 지닌다. 환자가 단지 신장에만 문제를 나타내는 또 다른 변이 표현형도 존재한다. 이러한 변이 표현형 모두는 남성 반접합체에서 밝혀졌지만, 파브리병의 변이 형태는 여성 이형 접합체에서도 규명되었다.
비전형적 심장 변이를 지닌 환자는 일반적으로 노년기에 질병의 증상이 나타난다. 심장 변이 표현형을 지닌 환자의 진단시의 중간 연령은 약 52세이며, 전형적 표현형의 경우는 약 29세이다[Desnick 등, The Metabolic and Molecular Bases ofInherited Disease, 6판(1996), Scriver 등(eds), McGraw-Hill(뉴욕), pp. 2741-2784; Meikle 등, J. Am. Med. Assoc. 281: 249-254(1999)]. 이러한 증후군을 지닌 환자는 종종 운동성 호흡곤란과 같은 심장 기능장애의 미세한 증상을 나타낸다. 통상적으로 표준 초음파심장동태진단 분석 결과를 보면 심장 변이 표현형을 지닌 환자는 좌심실 비대증(LVH) 또는 비대칭 격벽 비대증을 지니는 것으로 나타난다. 그러나, 심근 경색 또는 심근증을 나타낼 수도 있다[Scheit 등, New Engl. J. Med. 324: 395-399(1991); Nakao 등, New Engl. J. Med. 333: 288-293(1995)]. 이러한 환자들은 종종 심근 생검을 경험하게 되고, 변이 증후군의 병리는 전형적 파브리병과 실질적으로 유사하다: 침적된 당지질에 의한 심근 침윤. 이러한 환자들에서의 α-갈락토시다제 A 효소 분석은 광범위한 효소 수준을 나타낸다. 예를 들면, 심장 변이 환자들은 α-갈락토시다제 A 효소 활성이 정상 수준의 30%를 보유한다고 보고되었으며, 따라서 현재까지는 α-Gal A 대체 치료법의 후보로서 간주되지 않았다.
본 발명자들은 예기치 않게, 비전형적 심장 변이 또는 비전형적 신장 변이 환자가 파브리병의 전형적 표현형을 지닌 환자와 비교하여 비교적 높은 α-갈락토시다제 A 효소 활성 수준을 보유할 수 있지만, 이 환자들 역시 α-갈락토시다제 A 효소 치료로부터 이익을 얻을 수 있다는 사실을 발견하였다. 예를 들면, 환자는 세포내에서 속도론적으로 불안정한 α-Gal A 효소를 생성하는 돌연변이를 지닐 수 있으며, 이러한 환자들에서 α-Gal A 효소 수준은 본 발명의 α-Gal A 제제의 투여에 의해 상당히 증가될 수 있다. 또한, 비전형적 심장 변이 표현형을 지닌 일부 환자는 α-Gal A 효소의 아미노산 215에서 점 돌연변이를 보유한다고 보고되었다. 비돌연변이 단백질에서의 이 아미노산은 글리코실화된 아스파라긴이다[Eng 등, Am, J. Hum. Genet. 53: 1186-1197(1993)]. 따라서, 본 발명의 적절히 글리코실화된 α-갈락토시다제 A 제제를 이용한 α-Gal A 효소 대체 치료법은 이러한 환자에게서 효험을 나타낼 수 있다. 또한, 비전형적 신장 변이를 지닌 환자에서는 파브리병의 유일한 임상적 징후가 가벼운 단백뇨라는 사실이 보고되었다. 그러나, 신장 생검은 파브리병의 일반적인 당지질 함량을 나타내고, α-Gal A 효소 분석은 정상적인 α-Gal A 수준보다 더 적은 양을 나타낸다. 그러나, 신장에 침적된 세라마이드 트리헥소시드는 이러한 환자들의 뇨 침전물에서 쉐드 신장 관상 세포에서 검출될 수 있기 때문에, 본 발명의 α-Gal A 제제를 투여하면 이러한 수준을 상당히 감소시킬 수 있다. α-Gal A와 같은 리소좀 효소는 만노오스-6-포스페이트(M6P) 수용체와의 상호작용을 통해 세포의 리소좀 구획으로 표적화되며, 이것은 리소좀 구획으로 이동될 효소의 올리고당 부위에 존재하는 M6P 잔기에 결합한다. 이에 대해서는 Kornfield & Mellman의 문헌[Ann. Rev. Cell Biol. 5: 483-525(1989)]을 참조할 수 있다. 제1 상호작용은 골지에서 일어나고, 여기서 골지 M6P 수용체에 결합된 효소는 운송을 위해 리소좀으로 격리된다. 제2 유형의 상호작용은 세포외 α-Gal A와 M6P 수용체 사이에서 세포 표면에서 일어나는 것으로 보인다. 전달 시스템을 벗어난 효소는 구성적 분비 경로를 통해 세포에 의해 분비되고, 종종 세포 표면 M6P 수용체에 의해 재포획되어서, 엔도사이토시스 경로에 의해 α-갈락토시다제 A를 다시 리소좀으로 이동시킨다. 세포에 의해 내부화된 세포외 물질들은 세포질을 통해 엔도사이토시스 소포로 운반되고, 이것은 제1 리소좀과 융합되어 이들의 내용물을 리소좀으로 비운다. 이 과정에서, 세포 표면 M6P 수용체 역시 엔도사이토시스 소포로 혼입되고 리소좀으로 운반된다. 특히, 고도의 시알릴화 및/또는 인산화가 존재하는 본 발명의 α-Gal A 제제는 파브리병의 비전형적 변이를 지닌 환자의 치료에 바람직하다. 이러한 제제는, 예를 들면 간세포에 의해 제거되는 주입된 α-Gal A의 비율을 최소화하고, 간세포가 아닌 세포, 예컨대 신장 세포, 혈관 세포, 관상 세포, 사구 세포, 심장 근세포 및 심장 혈관 세포에 의해 높은 수준의 α-Gal A가 흡수되도록 한다.
M6P 잔기를 보유하는 세포외 α-Gal A는 세포 표면 M6P 수용체에 결합할 수 있고, 리소좀 구획으로 운반될 수 있다. 일단 리소좀 구획에 들어오면, α-Gal A는 적절한 기능을 수행할 수 있다. 리소좀 효소 운반의 이러한 양상은 α-갈락토시다제 A 효소 대체 치료법이 파브리병 환자를 위한 적절한 치료가 되게한다. 따라서, 세포가 α-Gal A를 생성하는 데 있어서 유전적으로 결함이 있을지라도, α-Gal A가 적절히 글리코실화되고, 결함 세포가 M6P 수용체를 보유한다면 세포는 세포외 α-Gal A를 취할 수 있다. 파브리병을 지닌 환자에서, 신장 및 심장의 혈관 내피 세포는 심각한 조직병리학적 이상을 나타내고, 질병의 임상적 병리에 기여한다. M6P 수용체를 지닌 이러한 세포는 α-Gal A의 특수한 치료적 표적이다. 본 발명의 목적은 M6P가 N-결합 올리고당에 존재하는 α-Gal A 제제를 제공하는 것이다.
α-Gal A의 N-결합 올리고당이 시알릴화에 의해 변형되는 정도는 α-Gal A 약물동력학 및 생체내분포에 중대한 영향을 미친다. 적절한 시알릴화가 없을 경우, α-Gal A는 간의 비시알로당단백질 수용체(Ashwell 수용체)에 의한 결합으로 인해순환계에서 급속이 제거되고, 이어서 간세포에 의해 내부화 및 분해된다. 이에 대해서는 Ashwell & Harford의 문헌[Ann. Rev. Biochem. 51: 531-554(1982)]을 참조할 수 있다. 이것은 순환계내에서 파브리병의 임상적 병리에 기여하는 세포, 예컨대 신장 및 심장의 혈관 내피 세포 상의 M6P 수용체에 결합하는 데 이용될 수 있는 α-Gal A의 양을 감소시킨다. 유전적으로 변형된 사람 세포에 의해 분비되는 α-Gal A는 정제된 분비된 단백질의 통상적인 약제 투여 또는 유전자 치료에 의해 파브리병을 치료하는 데 적합한 글리코실화 특성을 지니며, 리소좀 효소, 글루코세레브로시다아제가 필요하다고 보고된 추가의 효소 변형을 요구하지 않는다(이 경우 임상적으로 적절한 세포에 의한 정제된 글루코세레브로시다아제 효소의 업테이크는 사람 태반으로부터 정제한 효소의 복잡한 효소적 변형을 요구한다). 이에 대해서는 Beutler 등의 문헌[New Engl. J. Med. 325: 1354-360(1991)]을 참조할 수 있다.
α-Gal A의 생성을 위한 적절한 세포
파브리병과 같은 α-Gal A 결핍증을 지닌 것으로 추측되는 사람은 배양된, 유전적으로 변형된 세포, 바람직하게는 사람 세포로부터 수득한 정제된 사람 α-Gal A로 치료할 수 있다.
세포를 파브리병의 치료를 목적으로 유전적으로 변형시킬 경우, 세포를 통상적인 유전 공학 방법 또는 유전자 활성화에 의해 변형시킬 수 있다.
통상적인 방법에 따르면, α-Gal A cDNA 또는 게놈 DNA 서열을 포함하는 DNA 분자를 발현 작재물 내에 포함시켜서 1차, 2차, 또는 불사화된 세포로, 리포솜-, 폴리브렌-, 또는 DEAE 덱스트란-매개 형질감염, 일렉트로포레이션, 인산칼슘 침전법, 마이크로주입, 또는 속도 구동 마이크로프로젝타일("바이오리스틱스")을 비롯한 표준 방법(이에 국한되지는 않음)에 의해 형질감염시킬 수 있다(예컨대, 동시 계류중인 출원 USSN 08/334,797을 참조할 수 있으며, 이는 본 명세서에서 참고 인용한다). 대안으로, 바이러스 벡터를 이용하여 유전 정보를 전달하는 시스템을 이용할 수 있다. 유전자 전달에 유용한 것으로 알려진 바이러스에는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 허피스 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 폴리오바이러스, 레트로바이러스, 신드비스 바이러스 및 백시니아 바이러스(예컨대, 카나리아 폭스 바이러스)를 들 수 있다.
대안으로, 세포를 유전자 활성화("GA") 방법, 예컨대 미국 특허 제5,733,761호 및 제5,750,376호에 기술된 방법을 이용하여 변형시킬 수 있으며, 이들 특허 각각은 본 명세서에서 참고 인용한다. 유전자 활성화에 의해 생성된 α-Gal A는 본 명세서에서 GA-GAL로 칭한다.
따라서, 세포와 관련하여 본 명세서에서 사용되는 "유전적으로 변형된"이란 용어는, 유전자 생성물을 암호화하는 DNA 분자 및/또는 유전자 생성물의 암호화 서열의 발현을 조절하는 조절 성분을 도입한 후 특정 유전자 생성물을 발현하는 세포를 포함한다. DNA 분자는 유전자 표적화 또는 동종 구조 재조합에 의해 도입할 수 있는데, 즉 DNA 분자를 특정 게놈 부위에 도입할 수 있다. 동종 구조 재조합은 결함 유전자 그 자체를 대체하는 데 이용될 수 있다(결함 α-Gal A 유전자 또는 이것의 일부분은 파브리병 환자 자신의 세포에서 전체 유전자 또는 이것의 일부분으로 대체될 수 있다).
본 명세서에 사용된 바와 같이, "1차 세포"라는 용어는 척추동물 조직 공급원으로부터 분리된 세포의 현탁액 중에 존재하는 세포(배양되기 이전, 즉 접시 또는 플라스크와 같은 조직 배양 기재에 부착되기 이전), 조직 유래의 이식편(explant) 중에 존재하는 세포, 처음으로 플레이트된 상기 양 유형 세포, 및 이들 플레이트된 세포 유래의 세포 현탁액을 포함한다.
"2차 세포"는 배양 공정 중 모든 후속 단계의 세포를 의미한다. 즉, 처음으로 플레이트된 1차 세포가 배양 기재로부터 제거되고 재플레이트(계대배양)되어, 후속 계대 배양 단계의 모든 세포를 2차 세포라고 칭한다.
"세포계"는 1 회 이상 계대배양된 2차 세포로 구성되고, 배양에서 유한수로 평균 개체수가 2배가 되며, 접촉에 의해 억제되는 고정(anchorage) 의존성 성장(현탁액 배양에서 증식된 세포는 제외함)의 특성을 나타내고, 불사화되지 않는다.
"불사화 세포"라는 용어는 배양 중 명백하게 비제한된 수명을 나타내는 수립 세포주로부터 얻은 세포를 의미한다.
1차 세포 또는 2차 세포의 예로는 섬유아세포, 유방 및 장 상피 세포를 비롯한 상피 세포, 내피 세포, 림프구 및 골수 세포를 비롯한 혈액의 구성된 성분, 신경교 세포, 간세포, 각질 세포, 근육 세포, 신경 세포 또는 이들 세포 유형의 전구체를 들 수 있다. 본 발명의 방법에 유용한 불사화된 인간 세포주의 예로는 바우즈 멜라노마(Bowes Melanoma) 세포(ATCC 수탁 번호 CRL 9607), 다우디(Daudi) 세포(ATCC 수탁 번호 CCL 213), 헬라(HeLa) 세포 및 헬라 세포 유도체(ATCC 수탁 번호 CCL 2, CCL 2.1 및 CCL 2.2), HL-60 세포(ATCC 수탁 번호 CCL 240), HT-1080세포(ATCC 수탁 번호 CCL 121), 주카트(Jurkat) 세포(ATCC 수탁 번호 TIB 152), KB 암종 세포(ATCC 수탁 번호 CCL 17), K-562 백혈병 세포(ATCC 수탁 번호 CCL 243), MCF-7 유방암 세포(ATCC 수탁 번호 BTH 22), MOLT-4 세포(ATCC 수탁 번호 1582), 나말와(Namalwa) 세포(ATCC 수탁 번호 CRL 1432), 라지 세포(Raji) 세포(ATCC 수탁 번호 CCL 86), RPMI 8226 세포(ATCC 수탁 번호 CCL 155), U-937 세포(ATCC 수탁 번호 CRL 1593), WI-38VA13 서브 라인 2R4 세포(ATCC 수탁 번호 CLL 75.1), CCRF-CEM 세포(ATCC 수탁 번호 CCL 119) 및 2780 AD 난소 암종 세포(반 데르 블리크 등,Cancer Res. 48:5927-5932, 1988) 뿐만 아니라 인간 세포 및 또다른 종 세포의 융합에 의해 생산된 헤테로하이브리도마 세포를 들 수 있지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
α-Gal A를 분비하는 세포를 생성하도록 인간 세포를 유전자적 변형시키면, 유전자적으로 동일하게 배양된 다수개의 1차 인간 세포를 주요 성분으로 구성하는 클론성 세포계, 또는 세포가 불사화되어 있는 경우, 유전자적으로 동일한 불사화된 인간 세포를 주요 성분으로 구성하는 클론성 세포주를 형성시킬 수 있다. 한 구체예에서, 클론성 세포계 또는 클론성 세포주의 세포는 섬유아세포이다. 바람직한 구체예에서, 세포는 2차 인간 섬유아세포, 예를 들면 BRS-11 세포이다.
유전자적 변형 후, 세포는 α-Gal A의 분비를 허용할 수 있는 조건 하에 배양한다. 단백질은, 세포가 성장되어 있는 배지를 수집하고/수집하거나, 세포를 용해시켜 그 내용물을 유리시킨 후, 단백질 정제 기법을 적용함으로써 배양된 세포로부터 분리한다.
안정하게 형질감염된 세포의 조정 배지로부터 α-Gal A의 정제
본 발명의 방법에 따라, α-Gal A 단백질은, 세포가 성장되어 있는 배지를 수집하거나 또는 세포를 용해시켜 그 내용물을 유리시킨 시킨 후 레시틴 친화도 크로마토그래프를 사용하는 일 없이 단백질 정제 기법을 적용함으로써 배양된 세포("α-Gal A 생산 세포")로부터 분리한다. 바람직한 정제 공정은 하기 실시예 2에 요약 설명되어 있다.
또한, 대체적인 소수성 상호작용 수지, 예컨대 소오스 이소(Source Iso)(파마시아 제품), 매크로-프레프(Macro-Prep: 등록상표) 메틸 서포트(Methyl Support)(바이오-래드 제품), TSK 부틸(토소하스 제품) 또는 페닐 세파로스(Phenyl Sepharose: 등록상표)(파마시아 제품)은 α-Gal A를 정제하는 데 사용할 수 있다. 컬럼은 pH 5.6의 완충액 중에서 염의 비교적 높은 농도, 예를 들면 1 M 황산암모늄 또는 2 M 염화나트륨으로 평형화시킬 수 있다. 정제하고자 하는 샘플은 pH와 염의 농도를 평형 완충액의 것들로 조정함으로써 제조한다. 샘플을 컬럼에 가하고, 그 컬럼을 평형 완충액로 세정하여 미결합된 물질을 제거한다. α-Gal A는 보다 낮은 이온 세기 완충액, 물, 또는 수중의 유기 용매, 예를 들면 20% 에탄올 또는 50% 프로필렌 글리콜을 사용하여 컬럼으로부터 용출시킨다. 대안으로, α-Gal A는 평형 완충액 및 샘플 중의 보다 낮은 염의 농도를 사용하거나 또는 상이한 pH를 사용함으로써 컬럼을 통해 흘러 보낼 수 있다. 다른 단백질은 컬럼에 결합할 수 있는데, 이는 컬럼에 결합하지 않은 α-Gal A 함유 샘플을 정제시킨다. 바람직한 제1 정제 단계는 히드록시아파타이트 컬럼을 사용하는 것이다.
대안적인 정제 단계는 α-Gal A를 정제하는 데 양이온 교환 수지, 예를 들면 SP 세파로스(등록상표) 6 패스트 플로우(Fast Flow)(파마시아 제품), 소오스 30S(파마시아 제품), CM 세파로스(등록상표) 패스트 플로우(파마시아 제품), 매크로-프레프(등록상표) CM 서포트(바이오-래드 제품) 또는 매크로-프레프(등록상표) 하이 S 서포트(바이오-래드 제품)를 사용할 수 있다. "제1 크로마토그래피 단계"는 샘플을 크로마토그래피 컬럼에 최초로 가하는 단계(샘플의 제조와 관련된 모든 단계는 배제됨)이다. α-Gal A는 pH 4.4에서 컬럼에 결합할 수 있다. 완충액, 예컨대 10 mM 아세트산나트륨, pH 4.4, 10 mM 시트르산 나트륨, pH 4.4, 또는 약 pH 4.4에서 적당한 완충 성능을 갖는 다른 완충액은 컬럼을 평형화시키는 데 사용할 수 있다. 정제하고자 하는 샘플은 평형 완충액의 pH 및 이온 세기로 조정한다. 샘플을 컬럼에 가하고, 컬럼을 적재 후 세정하여 미결합된 물질을 제거한다. 염, 예컨대 염화나트륨 또는 염화칼륨은 α-Gal A를 컬럼으로부터 용출시키는 데 사용할 수 있다. 대안으로, α-Gal A는 보다 높은 pH의 완충액을 사용하거나, 또는 보다 높은 염 농도와 보다 높은 pH의 조합을 이용하여 컬럼으로부터 용출시킬 수 있다. 또한, α-Gal A는 평형 완충액 및 적재 샘플 중에서 염 농도를 증가시킴으로써, 컬럼을 보다 높은 pH에서 작동시킴으로써, 또는 상기 증가된 염과 보다 높은 pH를 조합함으로써 적재 동안 컬럼을 통해 흘러 보낼 수 있다.
또다른 정제 단계는 α-Gal A를 정제하는데 Q 세파로스(등록상표) 6 패스트 플로우를 사용할 수 있다. Q 세파로스(등록상표) 6 패스트 플로우는 비교적 강한 음이온 교환 수지이다. 또한, 보다 약한 음이온 교환 수지, 예컨대 DEAE 세파로스(등록상표) 패스트 플로우(파마시아 제품) 또는 매크로-프레프(등록상표) DEAB(바이오-래드 제품)은 α-Gal A를 정제하는 데 사용할 수 있다. 컬럼은 완충액, 예를 들면 10 mM 황산나트륨, pH 6으로 평형화시킨다. 샘플의 pH는 pH 6으로 조정하고, 낮은 이온성 세기는 샘플의 희석 또는 투석여과(diafilteration)에 의해 얻는다. 샘플은 α-Gal A를 결합시키는 조건 하에 컬럼에 가한다. 컬럼을 평형 완충액로 세정하여 미결합된 물질을 제거한다. α-Gal A은 염, 예를 들면 염화나트륨 또는 염화칼륨을 가하거나, 또는 보다 낮은 pH 완충액을 가하거나, 또는 증가된 염과 보다 낮은 pH의 조합을 가함으로써 용출시킨다. 또한, α-Gal A는 적재 중에서 염 농도를 증가시키거나, 또는 보다 높은 pH에서 컬럼을 작동시키거나, 또는 증가된 염과 보다 낮은 pH의 조합을 가함으로써 적재 동안 컬럼을 통해 흘러 보낼 수 있다.
또다른 정제 단계는 α-Gal A를 정제하는 데 수퍼덱스(Superdex: 등록상표) 200(파마시아 제품) 크기 배제 크로마토그래피를 사용할 수 있다. 또한, 다른 크기 배제 크로마토그래피 수지, 예컨대 세파크릴(Sephacryl: 등록상표) S-200 HR 또는 바이오-겔(Bio-Gel: 등록상표) A-1.5 m은 α-Gal A를 정제하는 데 사용할 수 있다. 크기 배제 크로마토그래피에 바람직한 완충액은 25 mM 인산나트륨, pH 6.0이고, 0.15 M 염화나트륨을 함유한다. 또한, 다른 제제와 상용성을 갖는 완충액, 예를 들면 10 mM 시트르산나트륨 또는 시트르산칼륨을 사용할 수 있다. 완충액의 pH는 pH 5 내지 pH 7 사이에 존재할 수 있고, 염, 예를 들면 염화나트륨 또는 염화나트륨과 염화칼륨과의 혼합물을 함유해야 한다.
또다른 정제 단계는 α-Gal A를 정제하는 데크로마토포커싱(chromatofocusing) 수지, 예컨대 폴리버퍼 익스체인저(Polybuffer Exchanger) PBE 94(파마시아 제품)을 사용할 수 있다. 컬럼은 비교적 높은 pH(예를 들면, pH 7 또는 그 이상)에서 평형화시키고, 정제하고자 하는 샘플의 pH는 상기 동일한 pH로 조정하며, 샘플은 상기 컬럼에 가한다. 단백질은 완충 시스템, 예를 들면 폴리버퍼 74(파마시아 제품)를 사용하여 감소하는 pH 구배에서 pH, 예컨대 pH 4에 이르는 구배로 용출시키는데, 이것은 pH 4로 조정된다.
대안으로, 면역친화도 크로마토그래피는 α-Gal A를 정제하는 데 사용할 수 있다. α-Gal A에 대한 적당한 다클론 또는 단일클론 항체(α-Gal A와의 면역화 또는 표준 기법을 이용하여 α-Gal A 서열로부터 유도된 펩티드와의 면역화에 의해 생성됨)는 활성화된 커플링 수지, 예를 들면 NHS-활성화된 세파로스(등록상표) 4 패스트 플로우(파라시아 제품) 또는 CNBr-활성화된 세파로스(등록상표) 4 패스트 플로우(파마시아 제품) 상에서 부동화시킬 수 있다. 정제하고자 하는 샘플은 약 pH 6 또는 pH 7에서 부동화된 항체 컬럼에 가할 수 있다. 컬럼은 세정하여 미결합된 물질을 제거한다. α-Gal A는 낮은 pH, 예를 들면 pH 3과 같이 친화성 컬럼 용출에 이용되는 통상의 시약, 변성제(denaturant), 예를 들면 구아니딘 HCl 또는 티오시아네이트, 또는 유기 용매, 예를 들면 pH 6 완충액 중의 50% 프로필렌 글리콜을 사용하여 컬럼으로부터 용출시킨다. 또한, 정제 절차는 α-Gal A를 정제하는 데 금속 킬레이트 친화성 수지, 예를 들면 킬레이팅 세파로스(Chelating Sepharose: 등록상표) 패스프 플로우(파마시아 제품)를 사용할 수 있다. 컬럼은 금속 이온, 예를 들면 Cu2+, Zn2+, Ca2+, Mg2+또는 Cd2+로 예비 하전시킨다. 정제하고자 하는 샘플은 적당한 pH, 예를 들면 pH 6 내지 7.5에서 컬럼에 가하고, 그 컬럼은 세정하여 미결합된 단백질을 제거한다. 결합된 단백질은 이미다졸 또는 히스티딘으로 경쟁적으로 용출시킴으로써, 또는 시트르산나트륨 또는 아세트산나트륨을 사용하여 pH를 6 미만의 pH로 저하시킴으로써, 또는 킬레이트화제, 예컨대 EDTA 또는 EGTA를 도입시킴으로써 용출시킨다.
전술한 프로토콜에 따라, 본 발명은 선행 기술에서 제조된 것보다 높은 순도 α-Gal A 제제를 지니고, SDS-PAGE 또는 역상 HPLC에 의해 측정했을 때, 바람직하게는 98% 이상의 균질성, 보다 바람직하게는 99% 이상의 균질성, 가장 바람직하게는 99.5% 이상의 균질성으로 정제되는 제제를 제공한다. 본 발명의 α-Gal A 제제는 다수의 α-Gal A 당형태를 포함할 수 있다. 따라서, "균질성"이라는 용어는, α-Gal A 제제에 관한 내용에서 사용되는 바와 같이, α-Gal A 제외한 단백질이 실질적으로 없는(총 단백질의 ＜ 2 %) 제제를 의미한다. 예로서, 알부민 등의 비-α-Gal A 단백질, 숙주 세포에 의해 생성된 비-α-Gal A 단백질, 동물 조직 또는 유체로부터 분리된 비-α-Gal A 단백질 등이 있다. 본 발명의 α-Gal A 제제의 특이적 활성은 바람직하게는 적어도 2.0 ×106단위/mg 단백질, 보다 바람직하게는 적어도 3.0 ×106단위/mg 단백질, 가장 바람직하게는 적어도 3.5 ×106단위/ mg 단백질이다.
글리칸 재구성에 의해 α-Gal A 제제의 순환 반감기를 향상시켜 올리고당 전하량을 증가시키는 방법
본 발명은 간 및 대식세포를 제외한 특이적 조직에서 치료적 효소의 흡수가 증가되는 당단백질 변형 프로그램을 제공한다. 본 발명의 방법을 이용하면, 인간 글리코실화된 α-Gal A 제제가 얻어지는데, 여기서 올리고당의 35% 내지 85%, 바람직하게는 올리고당의 50% 이상이 하전된다.
단백질 N-글리코실화는 올리고당 구조를 지닌 단백질의 적당한 아스파라긴 잔기를 변형시킴으로써 그 단백질의 특성 및 생물활성에 영향을 미치는 작용을 한다{쿠쿠루진스카 & 렌논의 문헌[Crit. Rev. Oral. Biol. Med. 9:415-48(1998)] 참조}. 본 발명은 주로 1개 내지 4개의 시알산(sialic acid) 잔기를 착물 글리칸 상에 첨가하거나, 또는 1개 또는 2개의 포스페이트 부위를 고급 만노스 글리칸 상에 첨가하거나, 또는 단일 포스페이트 및 단일 실리알산을 하이브리드 글리칸 상에 첨가함으로써 올리고당의 높은 비율이 음의 전하를 띠는 분리된 α-Gal A 제제를 제공한다. 또한, 보다 적은 양의 황산화된 복합 글리칸이 존재할 수 있다. 고비율의 하전된 구조는 2가지 주기능을 수행한다. 2,3- 또는 2,6- 결합된 시알산에 의해 2번째 단락의 갈락토스 잔기를 캡핑하는 제1 기능은 간 세포 상에 존재하는 비시알로당단백질 수용체에 의해 순환으로부터의 조기 제거를 방지한다. 이 수용체는 말단 갈락토스 잔기로 당단백질을 인지한다. α-Gal A의 순환 반감기를 증가시키는 것은 중요한 표적 기관, 예컨대 심장 및 신장에 효소 주입을 수행하는 혈장으로부터 보다 많은 양의 효소를 엔도사이토시스시키는 기회를 제공한다. 제2 기능은 고급 만노스 또는 하이브리드 글리칸 상의 Man-6-포스페이트의 존재가 양이온 비의존성 Man-6-포스페이트 수용체(CI-MPR)에 의한 수용체 매개된 흡수 기회를 제공한다.이 수용체 매개된 흡수는 파브리 환자에 있어서 CTH의 주요 저장 부위인 혈관 내피 세포를 비롯한 많은 세포의 표면 상에서 발생한다. 2개의 Man-6-포스페이트 잔기를 지닌 효소 분자는 단일 Man-6-포스페이트를 지닌 잔기보다 CI-MPR에 대하여 훨씬 더 큰 친화성을 갖고 있다. 대표적인 글리칸 구조식은 하기 표 1에 제공된다.
대표적인 글리칸 구조
2촉각 글리칸
4촉각 글리칸
고급 만노스 글리칸
인산화된 하이브리드 글리칸
2인산화된 글리칸
N-당단백질 생합성은 다수의 효소, 글리코실 트랜스퍼라제 및 글리코시다제를 포함한다. 대다수의 이들 효소는 정돈되고 잘 조직화된 방법으로 소포체(ER) 및 골지체에서 작용한다. 동일한 폴리펩티드내에 있는 상이한 아스파라긴 잔기가 다른 올리고당 구조로 변형된다는 사실에 의해 N-글리코실화 반응의 복잡성은 증가되고, 다양한 단백질들은 이들의 탄수화물 부분의 특성에 의해 서로 구분된다. 분자 유전학의 최근의 발전이 N-글리코실화 유전자의 확인, 분리 및 특성화를 진척시켰다. 그 결과, N-글리코실화와 다른 세포 작용 사이의 상관 관계에 관한 정보가 밝혀졌다.
세포에서 N-결합된 당단백질의 프로세싱은, Glc3Man9GlcNAc2를 갖는 올리고당 쇄가 ER의 루멘내 초기 펩티드 상의 수용체 아스파라긴에 단일 단위로서 첨가되는 경우에 개시된다. Glc3Man9GlcNAc2로 이루어진 14개의 당 올리고당 쇄는 하기의 매우 긴 지방쇄 알콜인 돌리콜 상에 만들어진다:
이 올리고당은 단일 유닛으로서 ER의 루멘내 초기 펩티드쇄 상의 수용체 아스파라긴 잔기로 이동된다. 펩티드에 비하여 글리칸의 크기가 크면 단백질의 폴딩을 초래할 수 있다. 3개의 글루코스 잔기는 올리고당이 완성되어 올리고당 전달 효소에 의해 이동할 준비가 되었다는 신호로서 작용한다. 이 효소는 또한 비글루코실화된 올리고당이 차선의 기질이기 때문에 단지 완성된 쇄의 일정 비율로 비글루코실된 올리고당을 이동시킬 수 있다. 인간에게 있어 탄수화물 결핍성 당단백질 증후군의 한 형태는 돌리콜-P-Glc: Man9GlcNAc2-PP-돌리콜 글루코실 트랜스퍼라제(글루코스 첨가 경로의 제1 효소)의 결핍에 의해 초래되는 것으로 밝혀졌는데, 이것은 결국 혈장 단백질을 과글리코실화시킨다. [Korner 등,Proc. Natl. Acad. Sci.USA95: 13200-13205(1998)]. 3개의 글루코스 잔기를 제거하고 올바른 형태를 만든 후, 새로이 합성된 당단백질은 골지로 이송된다. 단백질 폴링 후에 골지 만노시다제로의 글리칸의 접근성에 따라, 글리칸 쇄는 5-9개의 만노스 잔기를 갖는 고급 만노스 쇄로서 머무를 수 있다. 대안적으로, 글리칸 쇄는 트리만노실 코어로 더 가공되어, 더 많은 GlcNAc 잔기 후에, Gal, NeuAc 및 Fuc를 첨가하여 복합 쇄를 형성하는 다른 글리코실 트랜스퍼라제를 위한 수용체가 될 수 있다. 단백질이 정확하게 34Å 떨어져서 고급 만노스 쇄에 대해 올바른 공간적 상관 관계에 있는 2개의 리신 잔기를 갖는 경우에, 제3 가능성은 GlcNAcα-1-PO4가 하나 또는 때때로 두개의 만노스 잔기의 6 번 탄소에 첨가된다는 것이다. [Cuozzo 등,J. Biol. Chem., 273:21069-21076(1998)]. 특이적 효소에 의해 α-결합된 GlcNAc를 제거한 후, 말단 M6P 에피토프가 생성되며, 이 에피토프는 트랜스 골지 망상조직내 M6P 수용체에 의해 인식된 다음에 이들 효소를 중배엽 기원 세포의 리소좀으로 표적화시킨다.
가능한 한 많은 여러 조직들에 α-Gal A를 표적화시키기 위해, 많은 여러 탄수화물 구조(당형태)들이 유용하다. 마츠우라 등의 문헌[Matsuura 등,Glycobiology8:329-339(1998)]은 CHO 세포에서 만들어진 인간 α-Gal A상의 글리칸 구조는 41%의 고급 만노스 글리칸을 가지고 인산화 수준은 24%임을 보고하였다. 그러나, 시알릴화된 복합 글리칸의 수준은 단지 11%이었다. 따라서, 복합 쇄의 2/3가 시알릴화되지 않았고, 그 결과 간에 의해 α-Gal A가 재빨리 제거되었다. 본 발명의 인간 세포에서 제조된 α-Gal A는 CHO 세포에서 제조된 선행 기술의 α-Gal A 보다 하전된 올리고당의 비율이 더 높다. 예를 들면, 본 명세서에 기술된 HT-1080 세포에서 합성된 α-Gal A가 특히 적절한데, 이것은 HT-1080 세포에서 제조된 α-Gal A가 중성 구조(고급 만노스 및 하이브리드) 약 15%, 인산화된 글리칸 약 16%, 및 2 내지 4개의 시알산 잔기를 갖는 복합 글리칸 약 67%를 포함하기 때문이다. 따라서, 복합 쇄들 모두는 본질적으로 CHO 세포에서 제조된 α-Gal A와 비교해서 시알릴화되었다. HT-1080 세포 α-Gal A는 3개의 N-결합된 글리코실화 부위를 갖는다. 2개의 부위는 골지체에서 복합 글리칸으로 가공되는 반면, 제3 부위는 고급 만노스 글리칸에 의해 점유되고, 이들 중 50%는 리소좀 효소 특이적 인산화에 의해 변형되어 1인산화 및 2인산화된 종들 모두를 생성한다.
제4 방법은 N-결합된 글리칸 쇄를 함유하는 단백질 상에서 탄수화물을 재구성하는 것이다. 먼저, 하전된 α-Gal A의 비율은 정제 과정 동안 당형태의 선택적 분리에 의해 증가될 수 있다. 본 발명은 정제 과정 동안 및/또는 정제과정 후에 크로마토그래피 칼럼 수지 상에서 α-Gal A 종을 분류하여 높게 하전된 고분자량의 α-Gal A 당형태의 비율을 증가시킨다. α-Gal A의 더 높게 하전된 당형태 종은 더 많은 시알산 및/또는 더 많은 인산염을 포함하고, 더 고분자량의 당형태도 완전 글리코실화된 고분지성의 고하전된 종을 포함할 것이다. 하전된 종들을 선택하거나, 또는 비글리코실화되거나, 불충분하게 글리코실화되거나 또는 불충분하게 시알릴화 및/또는 인산화된 α-Gal A 종을 제거하게 되면 결국 더 많은 시알산 및/또는 더 많은 인산염을 갖는 α-Gal A 당형태들의 집단이 되므로, 더 높은 반감기 및 유효 치료 효능을 갖는 α-Gal A 제제를 제공하게 된다.
이러한 분류 과정은 α-Gal A를 정제 또는 분리하는데 사용되는 적당한 크로마토그래피 칼럼 수지에서 일어날 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 예를 들면, 분류는 양이온 교환수지(예, SP-Sepharose(등록상표명)), 음이온 교환수지(Q-Sepharose(등록상표명)), 친화성 수지(Heparin Sepharose(등록상표명), 렉틴 칼럼) 크기 배제 칼럼(Superdex(등록상표명)200) 및 소수성 상호작용 칼럼(Butyl Sepharose(등록상표명)) 및 당기술 분야에 공지된 다른 크로마토그래피 칼럼 수지에서 일어날 수 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
α-Gal A가 세포에서 분자량 및 전하가 다른 당형태의 불균일 혼합물로서 제조되기 때문에, α-Gal A는 크로마토그래피 수지로부터 비교적 넓은 피크 형태로 용출되는 경향이 있다. 이러한 용출물내에 있는 당형태는 사용하는 수지의 특성에 좌우되어 특정 방법으로 분배된다. 예를 들면, 크기 배제 크로마토그래피 상에서 가장 큰 당형태는 더 작은 당형태보다 용출 프로파일에서 더 일찍 용출되는 경향이 있다.
이온 교환 크로마토그래피에서, 가장 크게 음으로 하전된 당형태는 더 적게 음으로 하전된 당형태 보다 더 높은 친화력으로 양으로 하전된 수지(예, Q-Sepharose(등록상표명))에 결합하는 경향이 있으므로, 용출 프로파일에서 더 늦게 용출되는 경향이 있다. 반대로, 이들 음하전이 높은 당형태는 음하전이 더 낮은 종 보다 음하전된 수지(예, SP Sepharose(등록상표명))에 대한 결합력이 낮거나, 또는 전혀 결합되지 않는다.
크로마토그래피 수지 상에서의 당형태 종의 분류는 pH, 이온 세기, 완충염선택, 점성 및/또는 기타 파라미터(예, 수지 선택)에 의해 영향을 받을 수 있다. 다양한 형태의 구배 용출(직선 선형 기울기, 곡선, 예를 들면 지수 기울기)의 사용 또는 크로마토그래피 칼럼으로부터 α-Gal A 종을 선택적으로 용출시키는 일련의 단단계 용출의 사용 또한 α-Gal A 분류를 위해 최적화될 수 있다. 이들 인자 모두는 단독 또는 조합해서 당형태의 효과적인 분류를 달성하도록 최적화될 수 있다. 또한, 분류는 정제 과정이 완료된 후에 목적하는 당형태 집단의 분류 및 선택을 위해 선택적으로 최적화된 특정 크로마토그래피 수지에서 일어날 수 있다.
분류된 α-Gal A 종으로부터 당형태 집단의 선택은 용출된 α-Gal A 당형태의 분석 후에 달성될 수 있다. 용출 피크는 SDS-PAGE, 등전 포커싱, 모세관 전기 영동법, 분석용 이온 교환 HPLC 및/또는 분석용 크기 배제 HPLC와 같은 다양한 기술에 의해 분석될 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 목적하는 크기 또는 하전 프로파일에 속하는 특정 분획을 선택할 수 있다. 선택은 이 과정의 모든 크로마토그래피 단계에서 이루어질 수 있어서 목적하는 당형태 집단을 점차적으로 얻을 수 있거나, 또는 단계(들)의 분류 효율이 높은 경우에 특정 단계(들)로 제한될 수 있다. 분류는 정제 과정이 완료된 후에 목적하는 당형태 집단의 분류 및 선택을 위해 선택적으로 최적화된 특정 크로마토그래피 수지에서 일어날 수도 있다.
α-Gal A의 고하전 및/고분자량의 당형태의 분류 및 선택은 종래 유전 공학적 방법 또는 유전자 활성화(GA)에 의해 변형된 세포와 같은 유전적으로 변형된 세포로부터 유래된 것들과 같은 임의의 α-Gal A 제제에서 수행될 수 있다. 전술한 더 높은 시알릴화 및 인산화, 또는 후술할 PEG화된 α-Gal A를 제공하는 최적화된계에서 성장된 세포주에서 실시될 수 있다.
예를 들면, 본 명세서에서 기술한 α-Gal A 정제 과정에서, α-Gal A 당형태의 분류는 이 과정의 여러 단계에서 일어날 수 있다. 소수성 수지인 Butyl Sepharose(등록상표명) 패스트 플로우에서, 최고 하전된 α-Gal A 당형태가 먼저 용출된 후, 더 낮게 하전된 종들이 용출된다. Heparine Sepharose(등록상표명)에서도, 최고 하전된 종들이 용출 피크에서 먼저 용출된 후, 더 낮게 하전된 종들이 용출된다. Q-Sepharose(등록상표명)에서는 반대 현상이 발생하는데, 최저 하전된 종들이 먼저 용출된 후에 최고 하전된 당형태가 용출된다. Superdex(등록상표명) 200의 크기 배제 크로마토그래피에서, 분자량이 가장 높은 당형태가 먼저 유출된 후에 저분자량의 덜 글리코실화된 α-Gal A 종들이 용출된다. 특정 α-Gal A 당형태 집단의 효과적인 분류를 위해, 복수개의 크로마토그래피 단계들을 조합할 수 있는데, 이들 모두는 다른 물리적 방법으로 분류한다. 예를 들면, 푸울링을 제한하는 최저 pI(가장 높은 음하전을 포함한 것)를 포함한 α-Gal A 당형태를 얻기 위해, 초기에 용출되는 부틸 분획에는 더 높게 하전된 α-Gal A가 증가될 것이다. 헤파린 칼럼 상에서 이러한 선택된 푸울로 처리하고, 다시 이 푸울을 더 초기의 더 높게 음하전된 α-Gal A 종으로 제한하는 것은 푸울에서 낮은 pI α-Gal A 당형태의 비율을 더 증가시킨다. 또한, SDS-PAGE 및 등전 포커싱에 의해 용출 푸울의 크기 및 하전 분포를 모니터링함으로써 정제 과정의 여러 단계에서 당형태 집단의 미세 조정이 행해질 수 있다. 크기 및 하전에 의한 분류의 예는 실시예 2.4에서 후술될 것이다.
제2의 탄수화물 재구성 연구는 정제된 글리코실 트랜스퍼라제 및 적당한 뉴클레오티드 당 공여체를 사용하여 추가의 말단 당 잔기를 부착시키는 것에 의해 정제된 α-Gal A상의 특정 당형태를 변경시키는 것에 관한 것이다. 이러한 처리는 사용되는 글리코실 트랜스퍼라제의 수용체로서 작용하도록 적당한 자유 말단 당 잔기를 가진 당형태에만 영향을 미친다. 예를 들면, α2,6-시알릴 트랜스퍼라제는 뉴클레오티드 당 공여체로서 CMP-시알산을 사용하여 말단 Gal β1,4GlcNAc-R 수용체에 2,6-결합 형태의 시알산을 첨가한다. 시판되고 있는 효소 및 그것의 원료 종에는 푸코스 α1,3- 트랜스퍼라제 III, V 및 VI(인간); 갈락토스 α1,3 트랜스퍼라제(돼지); 갈락토스 β1,4 트랜스퍼라제(소); 만노스 α1,2 트랜스퍼라제(효모); 시알산 α2,3 트랜스퍼라제(래트); 및 시알산 α2,6 트랜스퍼라제(래트)가 포함된다. 반응이 완료된 후, 글리코실 트랜스퍼라제는 피로포스페이트(GDP, UDP) 또는 포스페이트(CMP) 결합에 의해 6개의 탄소 스페이서를 통해 겔에 결합된 적당한 뉴클레오티드로 이루어지는 글리코실 트랜스퍼라제 특이적 친화성 컬럼을 이용하여, 또는 당분야에 공지된 다른 크로마토그래피법을 이용하여 반응 혼합물로부터 제거할 수 있다. 위에서 예시한 글리코실 트랜스퍼라제 중에서, 시알릴 트랜스퍼라제가 환자(인간)의 효소 대체 요법을 위한 α-Gal A와 같은 효소의 변성에 특히 유용하다. 임의의 시알릴 트랜스퍼라제를 뉴클레오티드 당 공여체인 CMP-5-플루오레시닐-뉴라민산과 함께 사용하면, 형광 표지화된 당단백질이 얻어지는데, 이것의 소비와 조직의 편재화는 용이하게 모니터할 수 있다.
제3의 탄수화물 재구성 연구는 당질-공학에 관한 것이다. 예를 들면 세포의글리코실화 메카니즘에 영향을 미치는 유전자를 α-Gal A 생산 세포에 도입하여 골지체에서의 후번역 가공을 변경하는 방법이 바람직한 접근 방법이다.
제4의 탄수화물 재구성 연구는 α-Gal A를 적당한 글리코시다제로 처리하여 존재하는 다른 당형태의 수를 감소시키는 것에 관한 것이다. 예를 들면, 복합 글리칸 쇄를 뉴라미니다제, β-갈락토시다제 및 β-헥소사미니다제로 연속 처리하면 올리고당이 트리만노스 코어로 분해된다.
N-결합 글리칸의 구조는 단백질이 폴딩 처리된 후 골지 가공 만노시다제에 대한 글리칸쇄의 접근성과 골지 내의 글리코실 트랜스퍼라제군 및 적당한 뉴클레오티드 당 공여체의 존재 여부에 의존한다. 대부분의 글리코실 트랜스퍼라제는 경쟁 반응을 촉매 작용하는데, 그러한 반응은 제일 먼저 반응하는 효소에 따라 양립가능한 여러가지 다양한 방법으로 글리칸쇄를 연장시킬 수 있다. 이것은 미세 이종성(microheterogeneity)과 당형태의 착체 군의 형성을 유발한다. 몇몇 구조는 GlaNAc-4-SO4의 첨가에 의해 특정 뇌하수체 호르몬의 변성과 같이 단일 조직에 특이성을 갖거나, 몇몇 조직에 제한적이다.
후자의 예를 들면, 신장에서는 글루타밀트랜스펩티다제의 복합 글리칸에 소위 양분(bisecting) GlcNAc(핵 β-만노스 잔기에 β1,4 결합된 GlcNAc)가 형성되지만, 간에서는 형성되지 않는다. γ-글루타밀트랜스펩티다제 상의 양분된 2촉각 구조물은 하기 식으로 표시된다:
포유 동물에서, 효소 반응성 GlcNAc 트랜스퍼라제 III(GnT-III)는 뇌 및 신장의 특정 세포와 간암 환자의 간의 특정 세포에서 발견된다. GnT-III는 N-결합 당 쇄의 트리만노실 핵의 β-결합 만노스에 대한 β1,4-결합 형태의 N-아세틸글루코사민의 첨가 반응을 촉매 작용하여 양분 GlcNAc 잔기를 형성한다. GnT-III의 마우스, 래트 및 인간의 유전자를 클로닝한 바 있다[Ihara 등의J.Biochem.(Tokyo) 113: 692-698(1993)].
인간 세포에 추가의 GlcNAc T-III가 존재하면 비-, 트리- 및 테트라촉각 복합 글리칸이 희생되고 모노포스포릴화된 하이브리드 글리칸의 증가가 유발될 수 있다. 이것은 플라스마 반감기에 역효과를 미치지는 않지만, 혈관 내피 세포에 대한 표적화를 증가시킬 수 있다. 대표적인 구조식은 다음과 같다:
α-Gal A 중 일부는 신장에 의해 소비되며 축적된 당지질의 현저한 감소를 유발한다. 신장은 양분 GlcNAc 잔기에 의해 N-글리칸을 형성할 수 있기 때문에, 신장 상피 세포는 특히 높은 특이성을 가진 그 에피토프에 의해 당단백질을 인식할 수 있다.
증가된 GnT-III 활성은, 기질의 수준에서 GnT-II, IV, V 및 Gal β1,4-트랜스퍼라제에 의해 추가의 측쇄화를 억제함으로써 트리만노실 코어의 측쇄화에 불균형을 초래할 수 있다. 최근, 당단백질 상의 양분된 올리고당을 생산할 수 있는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포주가 재조합 GnT-III의 과잉 발현에 의해 생성되었다[Sburlati 등의Biotechnol. Progr. 14: 189-192(1998)]. 인터페론 β(IFN-β)를 모델 및 강력한 치료제를 분비하는 이종 단백질로서 선택하였으며 그 단백질에 대해 생성물 글리코실화에 대한 GnT-III-발현 효과를 평가하였다. 양분된 올리고당을 가진 IFN-β는 GnT-III-가공 CHO 세포에 의해 생산되지만, 비변성 모체 세포주에 의해서는 생산되지 않는다.
당단백질 치료제의 제조는 로트-로트 일관성과 관련한 글리코실화의 특성화가 필요하다. '가상의 N-글리칸 전하 Z'는 간단하고 효율적인 방법으로 단백질 글리코실화를 특성화하는 파라미터로서 사용되어 왔다. Z의 결정은 다수의 반복적 실험을 통해 유효화되었으며 정확도 및 신뢰도가 높은 것으로 확인되었다[Hermentin 등Glycobiology 6: 217-230(1996)]. 소정 당단백질의 가상의 N-글리칸 전하는 고성능 음이온 교환 크로마토그래피(HPAEC)/펄스화 전류계 검출(PAD)을 통해 얻은 N-글리칸 지도화 프로파일로부터 추정한다. HPAEC에서, N-글리칸은 그 전하에 따라, 예를 들면 시알산 잔기의 수에 따라 명확하게 구별되는데, 이것은 중성 구조는 물론 모노-, 디-, 트리- 및 테트라시알릴화 N-글리칸의 분리된 영역을 제공한다. Z는 아시알로, 모노시알로, 디시알로, 트리시알로, 테트라시알로 및 펜타시알로 영역에서의 각각의 면적(A)을 해당하는 전하와 곱한 값의 합으로서 정의되며, 하기 식으로 나타낼 수 있다:
상기 식 중,i는 아시알로 영역에서는 0, 모노시알로(MS) 영역에서는 1, 디시알로(DiS) 영역에서는 2, 트리시알로(TriS) 영역에서는 3, 테트라시알로(TetraS) 영역에서는 4, 그리고 펜타시알로(PentaS) 영역에서는 5이다.
따라서, 대부분 C4-4*구조를 가진 당단백질은 Z가 대략 400이고, 거의 대부분 C2-2*구조를 가진 당단백질은 Z가 대략 200이며, 고급 만노스 타입 또는 절두형 구조만을 가진 당단백질은 Z가 대략 0이다.
본 발명의 인간 글리코실화 α-Gal A 제제는 올리고당 전하를 갖는데, Z가로 측정했을 때 100 이상, 바람직하게는 150 이상, 더욱 바람직하게는 170 이상이다.
포스포릴화에 의한 혈청 α-Gal A의 반감기의 변경
α-Gal A의 포스포릴화는 α-Gal A의 순환 반감기 및 α-Gal A 도입 세포의 레벨에 영향을 미치도록 변경할 수 있다. 포스포릴화는 α-Gal A를 발현하는 세포 내에서 실현하는 것이 바람직하다. 특히 고려한 것은 포스포릴 트랜스퍼라제를 암호화하는 DNA 서열을 α-Gal A 생산 세포에 먼저 도입하거나, 내인성 포스포릴 트랜스퍼라제 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열을 상동성 재조합에 의해 도입하여 포스포릴화가 증가된 글리코실화 α-Gal A 제제를 얻는 것이다. 이어서 α-Gal A 생산 세포를 α-Gal A 및 포스포릴 트랜스퍼라제를 발현할 수 있는 배양 조건 하에서 배양한다. 그 다음, 폴리뉴클레오티드가 없는 세포에서 제조한 α-Gal A에 비해 포스포릴화가 증가된 α-Gal A 제제의 분리를 수행할 수 있다. 그러한 포스포릴 트랜스퍼라제는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 미국 특허 제5,804,413호 및 제5,789,247호를 참조할 수 있으며, 이들 각 특허의 내용은 본 명세서에 참고 인용한다.
2개의 세포막이 결합된 골지 효소의 집중적인 작용은 리소솜 전구효소 상에 Man-6-포스페이트 인식 마커를 발생시키는 데 필요하다. 먼저, UDP-N-아세틸글루코사민: 당단백질N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스퍼라제(GlcNac 포스포트랜스퍼라제)는 정확히 34Å 떨어져서 고-만노스 쇄에 대해 올바른 공간 관계에 있는 2개의 리신 잔기로 이루어진 리소솜 효소상의 단백질 인식 결정인자가 필요하다. 그 다음,N-아세틸글루코사민-1-포스포디에스테르N-아세틸글루코사미니다제(포스포디에스테르 GlcNAc아제)는 α-GlcNAc-포스페이트 결합을 가수분해하여 Man-6-포스페이트 인식 부위를 노출시킨다.
본 발명의 방법에 의하면, 본 발명에 의해 제조된 α-Gal A 제제는 포스포릴화된 당형태가 16 내지 50%, 바람직하게는 25 내지 50%, 더욱 바람직하게는 30% 이상인 다중 당형태를 함유한다.
증가된 시알릴화에 의한 혈청 α-Gal A의 반감기의 변경
덜 시알릴화된 글리칸을 말단 갈락토스 잔기로 시알릴화를 증가시키는 것은 시알릴 트랜스퍼라제 유전자로 포유 동물, 바람직하게는 인간 세포를 감염시킴으로써 수행할 수 있다.
본 발명은 시알릴 트랜스퍼라제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 먼저 α-Gal A 생산 세포에 도입하거나, 또는 내인성 시알릴 트랜스퍼라제 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열을 상동성 재조합에 의해 도입함으로써 생성된 증가된 올리고당 전하량을 가진 글리코실화 α-Gal A 제제를 제공한다. 그 다음, α-Gal A 생산 세포는 α-Gal A 및 시알릴 트랜스퍼라제를 발현하는 배양 조건 하에서 배양한다. 그 후의 단계는 증가된 올리고당 전하량을 가진 α-Gal A 제제를 분리하는 단계로 구성된다. 바람직한 시알릴 트랜스퍼라제로는 α-2,3-시알릴 트랜스퍼라제 및 α-2,6-트랜스퍼라제가 있다. 이들 시알릴 트랜스퍼라제는 공지되어 있다. 예를 들면, 본 명세서에서 참고 인용하는 미국 특허 제5,858,751호 참조.
바람직한 구체예에서, 이러한 시알릴화 증가 방법은 제제의 분류 또는 정제(하기 논의됨)에 의해 증가된 크기 또는 증가된 전하를 가진 α-Gal A 당형태에 대해 선별하는 단계를 더 포함한다.
대안으로, 본 발명은 세포를 저 암모늄 환경에서 유지시킴으로써 시알릴화를 증가시키는 방법을 제공한다. 특히, 증가된 시알릴화를 가진 글리코실화 α-Gal A 제제는 α-Gal A 생산 세포를 암모늄 농도가 10 mM 이하, 보다 바람직하게는 2 mM 이하인 배양 배지에 접촉시킴으로써 얻어진다. 증가된 시알릴화는 암모늄과 같은 독성 대사물을 주기적으로 배양 배지에서 제거하는 생산 세포의 관류에 의해 달성된다. 바람직한 구체예에서, 저 암모늄 환경은 글루타민 합성 효소 유전자 또는 cDNA를 생산 세포에 첨가함으로써 달성된다. 대안으로, 저 암모늄 환경은 α-Gal A 생산 세포를 배양 배지로 관류하여 암모늄 농도를 10 mM 이하, 보다 바람직하게는2 mM 이하로 유지시킴으로써 달성된다. 생산 세포는 암모늄 농도가 10 mM 이하, 보다 바람직하게는 2 mM 이하인 새로운 배양 배지로 연속적으로 관류할 수 있다. 대안으로, 생산 세포는 새로운 배양 배지로 간헐적으로 관류할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 간헐적 관류는 규칙적, 주기적 시간 간격으로의 관류, 또는 표적 농도(즉, 10 mM, 보다 바람직하게는 2 mM)에 도달하는 암모늄 농도의 측정 후의 관류에 관한 것이다. 간헐적 관류는 암모늄 농도가 결코 표적 농도를 초과하지 않도록 충분한 빈도수로 간격을 두고 실시되어야 한다. 생산 세포는 총 글리칸의 50 내지 70%, 바람직하게는 60%가 시알릴화된 α-Gal A 제제를 얻는 데 필요한 시간 동안 관류된다.
α-Gal A의 PEG화에 의한 혈청 α-Gal A의 순환 반감기 증가
또한, 본 발명에 따르면, 인간 글리코실화 α-Gal A 제제의 순환 반감기는 α-Gal A를 폴리에틸렌 글리콜과 착화시킴으로써 향상된다. 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)은 단백질에 공유 결합될 때, 그 잠재적 용도를 연장하는 방식으로 이들의 성질을 변경시키는 수용성 중합체이다. 폴리에틸렌 글리콜 변성("PEG화")은 단백질과 펩티드 약제의 문제점을 해결하거나 또는 경감할 수 있는 능력을 가진, 널리 입증된 기술이다.
PEG-단백질의 개선된 약리학적 효능은 이들의 미변성 대응물과 비교했을 때 치료제로서 이 유형의 접합체의 개발을 자극하였다. 천연 효소로의 치료가 비효율적인(급속한 제거율 및/또는 면역 반응에 기인함) 효소 결핍증은 이제 등가의 PEG-효소로 치료할 수 있다. 예를 들면, PEG-아데노신 디아미나제는 이미 FDA 승인을받았다{Delgado 등,Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst.9: 249-304(1992)}.
그린 커피콩으로부터의 α-갈락토시다제에 PEG를 공유 결합하면, 분자 상의 특이적인 결정 부위를 마스킹함으로써 효소의 촉매 성질이 변경된다. 이것은 p-니트로페닐 기질 유사체에 대한 Km을 증가시키고 Vmax값을 감소시킨다{Wieder & Davis,J. Appl. Biochem.5: 337-47(1983)}. α-갈락토시다제는 여전히 인간 타액 혈액군 물질 B로부터 말단 갈락토스 잔기를 절단할 수 있었다. 항체 및 렉틴 특이적인 결합은 PEG-α-갈락토시다제로부터 손실되었다. 천연 α-갈락토시다제로부터 발생된 항체는 효소 활성을 차단할 수 있으며, 이 저해는 점진적으로 더 많은 양의 PEG로 효소의 제제에 대해 테스트하는 경우, 점차적으로 손실된다. 이와는 대조적으로, PEG-α-갈락토시다제로 면역화된 동물로부터의 항혈청은 α-갈락토시다제 제제 또는 PEG-α-갈락토시다제 제제에서 효소 활성을 저해하지 않았다. 이러한 결과는 PEG가 렉틴 특이적인 탄수화물 부분과 항원성 결정 인자를 덮어 감추려는 경향이 있으며, PEG-효소의 생체내 프로세싱 중에 이러한 부위들이 잠재되어 있다는 것을 가리킨다.
PEG의 단백질에 대한 공유 결합은 리신의 ε-아미노 말단 및 N-말단의 α-아미노기의 친핵성 공격에 의해 치환될 수 있는 적절한 이탈기로 중합체의 히드록시 말단기를 활성화시킬 것이 요구된다. 몇가지 화학기가 PEG를 활성화시키는 데 이용되어 왔다. 특정 적용 각각의 경우 상이한 커플링 방법이 독특한 장점을 제공한다. 상이한 PEG화 방법이 생성된 PEG화 단백질 및 펩티드의 생활성, 안정성 및 면역원성의 유지와 같은 인자들에 놀랍고도 극적인 영향을 주었다{Francis 등,Int. J.Hematol.68(1): 1-18(1998)}. 예를 들면, 연결기가 없는 PEG화 기술은 단지 PEG만을 표적 분자에 부착시킨다. 보다 상세하게는, 트레실 모노메톡시 PEG(TMPEG)를 사용하여 생물학적으로 최적화된 PEG화 기술을 다양한 표적 단백질에 적용함으로써 문헌{Francis 등,Int. J. Hematol.68(1): 1-18(1998)}에 기재된 바와 같이, 표적의 생물학적 활성을 보호하는 이례적인 능력이 밝혀졌다. 이러한 점과, PEG(인간 치료에 안전한 것으로 밝혀짐) 이외에 아무것도 단백질에 첨가하지 않는 이점은 α-Gal A의 변성에 대해 이 방법을 이상적으로 만든다.
PEG를 단백질에 커플링하는 데 있어 네 가지 가능한 부위는 (1) 아미노기(N-말단 및 리신); (2) 카르복실기(아스파르트산 및 글루탐산); (3) 술프히드릴기(시스테인); 및 (4) 탄수화물기(과요오드산염 처리 후 생성된 알데히드)이다. 단백질의 카르복실기 및 탄수화물 상의 알데히드에 커플링하기 위해서는 친핵성 아미노기를 가진 PEG 시약이 필요하다. 이 화학 물질은 음전하를 띠는 카르복실기가 PEG에 의해 결합된 후 α-Gal A의 pI를 변화시킨다. 임의의 pI 변화는 α-Gal A의 생물학적 활성에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 탄수화물 사슬에의 PEG 커플링은 M6P 수용체에 의한 α-Gal A의 흡수에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 생물학적 활성에 중요하다. 또한, 술프히드릴 화학 물질은 분자의 물리적 구조에 영향을 미치므로, 권장되지 않는다.
통상적으로 사용되는 PEG화 방법은 단백질의 아미노기와 모노메톡시-PEG 상의 메톡시기 간에 아미드 결합을 형성한다. NHS-PEG는 시판되며, 단백질과 PEG 간의 아미드 결합을 생성한다. 그러나, 아미드 결합 형성은 -NH2기의 양전하 손실로인하여 pI를 변화시킨다.
pI에 영향을 미치지 않으면서 PEG를 α-Gal A에 커플링하는 방법은 트레실-PEG를 사용한다. 트레실-PEG는 아미노기를 통해 커플링하며, 안정한 2차 아민을 형성한다. 2차 아민은 아미노기의 양전하를 유지시키는 이점을 제공한다. 트레실-PEG 시약은 시판되며, 동결 건조 및 건조 분말로서 안정하다. 트레실-PEG는 완전히 특성화되었으며, 그 반응 및 부산물은 잘 알려져있다. 따라서, 바람직한 구체예에서, α-Gal A 제제는 트레실 모노메톡시 PEG(TMPEG)를 사용하여 착화되어 PEG화-α-Gal A를 형성한다. 그 다음 PEG화-α-Gal A를 정제하여 단리된 PEG화-α-Gal A를 제공한다.
반응식
CH3(OCH2CH2)rOSO2CH2CF3+ H2N-단백질 →
CH3(OCH2CH2)n-HN-단백질-트레실화 모노메톡시-PEG
α-Gal A는 18 개의 아미노기, 17 개의 ε-아미노기(리신) 및 한 개의 α-아미노기(N-말단)를 함유한다. 반응을 조절하여 최소 치환을 가진 α-Gal A를 생성할 수 있으며, 이어서 분자당 한 개의 PEG를 가진 분자, 또는 분자당 PEG 부분의 더 적은 평균 수를 가진 분자를 비치환 및 다중 치환 형태로부터 정제할 수 있다. α-Gal A 상의 다중 치환은 생물학적 활성에 유의적인 영향을 주지 않을 수 있으며; 따라서, 최종 생성물은 1 내지 18 개의 결합된 PEG 분자의 불균질 혼합물로 구성될 수 있다. 치환도는 유지하는 효소 활성의 정도에 의존한다. 순환 반감기를 연장하고, α-Gal A의 면역 인식을 저하시키는 것으로부터 유도된 향상된 치료 효과에 의해 효소 활성 감소가 보상될 수 있다는 것을 주목해야 한다. 그러므로, PEG-α-Gal A 생성물을 개발함에 있어서, PEG 대 α-Gal A의 비율은 생물학적 활성 뿐만 아니라 효소 활성에도 의존해야 한다.
PEG화 반응은 조절된 pH, 완충제 조성 및 단백질 농도를 요구한다. 적절한 반응 조건은 제조 공정에서 현재 사용되고 있는 한외 여과/투석여과 단계에 의해 달성될 수 있다. 반응 직후, 트레실-PEG는 계속 교반하면서 물에서 신속하게 안정화시킨다. 그 다음, 이 용액을 제조된 α-Gal A에 첨가하고, 조절된 시간 동안 조절된 온도에서(예를 들면, 250℃에서 2 시간) 반응시킨다. PEG화는 최종 정제 공정 전에 일어날 수 있으며, 첨가 단계 내지 정제 과정을 제거할 것이다. 커플링이 종결된 후, PEG-α-Gal A를 정제 공정의 나머지 단계에 의해 처리한다. Q 컬럼(음이온 교환) 전에 반응을 실행하면, 두 개의 정제 단계에 대해서 반응 부산물을 제거할 수 있다. PEG는 음전하를 함유하지 않기 때문에, Q Sepharose(등록 상표)에 의해 유지되지 않을 것이며, 공극 부피에서 용출될 것이다.
PEG화의 양은 공지된 기술에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, 플루오레스카민(fluorescamine)은 단백질의 α-아미노기 및 ε-아미노기에 결합된 경우에 형광을 발한다. PEG화 후의 형광 손실%는 α-Gal A에 결합된 PEG의 백분율에 해당한다. 총 단백질에 대한 피어스 BCA 분석을 사용하여 단백질 농도를 측정할 수 있다. 메틸움벨리페릴-α-D-갈락토피라노시드(4-MUF-α-Gal) 활성 분석을 사용하여 PEG-α-Gal A 효소 활성의 효과를 평가한다. α-Gal A는 리소솜으로의 흡수에 요구되는M6P를 함유한다. M6P 수용체 인식에 대한 PEG로부터의 간섭은 세포계 분석을 사용하여 평가하여 리소솜으로의 PEG-α-Gal A의 세포질 흡수를 모니터할 수 있다.
α-Gal A 제제의 투여 방법
본 발명의 조성물(즉, 다양한 α-Gal A 당형태을 포함함)은 α-Gal A 제제에 적합한 임의의 경로에 의해 투여할 수 있다. 정제된 α-Gal A 제제는 불충분하거나 결함이 있는 α-Gal A 단백질을 생성하는 개체, 또는 α-Gal A 활성으로 이점을 얻는 개체에게 투여할 수 있다. 본 발명의 치료 제제는 임의의 적절한 수단에 의해 직접적(예를 들면, 조직 좌위에의 주사, 이식 또는 국소 투여에 의한 국소적 투여) 또는 전신적(경구 또는 비경구)으로 개체에 제공할 수 있다.
투여 경로는 정맥내, 피하, 동맥내, 복강내, 안내, 근육내, 구강내, 장내, 질내, 안와내, 뇌내, 피내, 두개내, 척추내, 경막, 경피 또는 흡입 투여를 비롯한 경구 또는 비경구일 수 있다. 폐내 전달 방법, 장치 및 약제 제법은, 예를 들면 본 명세서에서 참고 인용하는 미국 특허 제5,785,049호, 제5,780,019호 및 제5,775,320호에 기재되어 있다. 피내 전달의 바람직한 방법은 패치에 의한 이온 삼투 전달에 의한 것이며, 그러한 전달의 한 가지 예가 본 명세서에서 참고 인용하는 미국 특허 제5,843,015호에 교시되어 있다.
투여의 특히 유용한 경로는 피하 주사에 의한다. 본 발명의 α-Gal A 제제는 총 요구 투여량이 1 또는 2 밀리리터의 단일 주사로 투여될 수 있도록 조제된다. 1 또는 2 밀리리터의 주사 부피를 얻기 위하여, 본 발명의 α-Gal A 제제는 바람직한 투여량이 1 내지 2 밀리리터 부피로 전달되는 농도에서 조제할 수 있거나, 또는α-Gal A 제제는 투여 전에 물 또는 적절한 생리학적 상용성 완충제 내에서 재구성되는 동결 건조 형태로 조제할 수 있다. α-Gal A 제제의 피하 주사는 특히 자가 투여를 허용함으로써 환자에게 편리하다는 이점을 가지는 한편, 예를 들면 정맥내 투여와 비교하였을 때 연장된 혈장 반감기를 가져오는 이점을 갖는다. 혈장 반감기의 연장은 보다 장기간에 걸쳐서 효과적인 혈장 α-Gal A 레벨을 유지할 수 있게 하며, 그 이점은 주사된 α-Gal A에 임상적으로 영향을 받는 조직의 노출을 증가시키며, 그 결과 그러한 조직에 대한 α-Gal A의 흡수를 증가시킨다는 것이다. 이러한 점은 환자에게 보다 유리한 효과를 주고, 및/또는 투여 빈도의 감소를 제공한다. 더욱이, 재충전용 주사 펜 및 무바늘 주사 장치와 같은 환자 편이성을 위해 설계된 여러 가지 장치는 본 명세서에 논의된 바와 같은 본 발명의 α-Gal A 제제와 함께 사용할 수 있다.
투여는 제제 환약의 주기적 투여에 의할 수 있거나, 또는 외부(예를 들면, IV 백) 또는 내부(예를 들면, 생분해성 이식물, 생체 인공 기관 또는 이식된 α-Gal A 생산 세포의 개체군)일 수 있는 저장소로부터 정맥내 또는 복강내 투여에 의해 투여될 수 있다. 예를 들면, 본 명세서에서 참고 인용하는 미국 특허 제4,407,957호 및 제5,798,113호 참조. 폐내 전달 방법 및 장치는, 예를 들면 본 명세서에서 참고 인용하는 미국 특허 제5,654,007호, 제5,780,014호 및 제5,814,607호에 기재되어 있다. 다른 유용한 비경구 전달 시스템으로는 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체 입자, 삼투 펌프, 이식용 주입 시스템, 펌프 전달, 캡슐화 세포 전달, 리포좀 전달, 바늘 전달 주사, 무바늘 전달, 분무기, 연무기, 일렉트로포레이션 및 경피 패치 등이 있다. 무바늘 주사기 장치는 본 명세서에서 참고 인용하는 미국 특허 제5,879,327호, 제5,520,639호, 제5,846,233호 및 제5,704,911호에 기재되어 있다. 전술한 α-Gal A 제제의 어느 것도 이들 방법에서 투여할 수 있다.
투여 경로와 전달된 단백질의 양은 당업계의 숙련자의 능력 범위 내에서 접근할 수 있는 인자에 의해 결정할 수 있다. 더욱이, 당업계의 숙련자라면, 치료제 투여량 수준이 얻어질 때까지 투여 경로와 치료제 단백질의 투여량이 달라질 수 있음을 잘 알 수 있을 것이다.
α-Gal A 단백질의 약학적 배합물
본 발명은 알부민과 같은 비-α-Gal A 단백질, 숙주 세포에 의해 생성된 비-α-Gal A 단백질 또는 동물의 조직 또는 체액으로부터 분리된 단백질을 실질적으로 포함하지 않는 α-Gal A 제제의 신규한 배합물을 추가로 제공하고자 한다.
이러한 제제는 수성 또는 생리학적으로 혼화성을 갖는 유체 현탁제 또는 액제의 일부를 포함하는 것이 바람직하다. 담체 또는 부형제는 생리적 혼화성을 지녀서 환자에게 소정의 제제의 전달 이외에, 환자의 전해질 및/또는 체적 균형에 있어서 유해한 영향을 미치지 않는다. 비경구 투여에 유용한 액제는 당업자에게 주지되어 있는 임의의 방법에 의해 생성될 수 있다. 참고 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, A. 편저, 맥 퍼블리슁, 1990]. 비-비경구용 제제, 예컨대 좌제 및 경구용 제제도 사용할 수 있다.
제제는 부형제를 함유하는 것이 바람직하다. 제제에 포함될 수 있는 α-Gal A를 위한 약학적으로 허용 가능한 부형제는 완충액, 예컨대 구연산염 완충액, 인산염 완충액, 아세트산염 완충액 및 중탄산염 완충액, 아미노산, 우레아, 알콜, 아스코르브산, 인지질; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 콜라겐 및 젤라틴; 염, 예컨대 EDTA 또는 EGTA 및 염화나트륨; 리포좀; 폴리비닐피롤리돈; 당, 예컨대 덱스트란, 만니톨, 소르비톨 및 글리세롤; 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜 (예, PEG-4000, PEG-6000); 글리세롤; 글리신 또는 기타의 아미노산; 지질 등이 있다. α-Gal A 제제와 사용하기 위한 완충액계는 구연산염, 아세트산염, 중탄산염 및 인산염 완충액 (이들 모두는 시그마로부터 입수 가능함)을 포함할 수 있다. 인산염 완충액이 바람직한 예이다. α-Gal A 제제를 위한 pH 범위는 pH 4.5∼7.4이다.
또한, 제제는 비이온계 세정제를 함유하는 것이 바람직하다. 비이온계 세정제의 바람직한 예로는 Polysorbate 20, Polysorbate 80, Triton X-100, Triton X-114, Nonidet P-40, 옥틸 α-글루코시드, 옥틸 β-글루코시드, Brij 35, Pluronic 및 Tween 20 (모두 시그마로부터 입수 가능) 등이 있다.
제제는 Polysorbate 20 또는 Polysorbate 80 비이온계 세정제 및 인산염 완충 염수를 함유하는 것이 특히 바람직하며, pH는 6인 것이 가장 바람직하다.
α-Gal A 제제의 동결건조의 경우, 단백질의 농도는 0.1∼10 ㎎/㎖가 될 수 있다. 부피부여제(bulking agent), 예컨대 글리신, 만니톨, 알부민 및 덱스트란을 동결건조 혼합물에 첨가할 수 있다. 또한, 가능한한 동결방지제, 예컨대 이당류, 아미노산 및 PEG도 동결건조 혼합물에 첨가할 수 있다. 제시된 임의의 완충액, 부형제 및 세정제도 첨가될 수 있다.
주사용으로 바람직한 α-Gal A 제제는 농도가 1 ㎎/㎖이다.
투여용 제제는 소정의 위치에서 제제가 유지되는 것을 돕는 글리세롤 및 기타의 고점도 조성물을 포함할 수 있다. 생체혼화성 중합체, 예컨대 생체재흡수성, 생체혼화성 중합체 (예, 히알루론산, 콜라겐, 폴리부티레이트, 락티드 및 글리콜리드 중합체 및 락티드/글리콜리드 공중합체)는 제제의 생체내 방출을 조절하는 유용한 부형제가 될 수 있다. 비경구 투여용 제제는 협측 투여를 위한 글리코콜레이트, 직장 투여를 위한 메톡시살리실레이트 또는 질내 투여를 위한 쿠트르산 등이 있다. 직장 투여용 좌제는 본 발명의 α-Gal A 제제를 비자극성 부형제, 예컨대 실온에서는 고형이나 체온에서는 액상인 코코아 버터 또는 기타의 조성물과 혼합하여 생성될 수 있다.
흡입 투여용 제제는 락토스 또는 기타의 부형제를 함유할 수 있거나 또는 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 글리코콜레이트 또는 데옥시코콜레이트를 함유할 수 있는 수용액제가 될 수 있다. 바람직한 흡입 에어로졸은 질량 밀도가 작고 입도가 큰 입자를 포함하는 것을 특징으로 한다. 질량 밀도가 0.4 g/㎤ 미만이고 평균 직경이 5 ㎛를 초과하는 입자는 흡입된 제제를 전신성 순환에 전달하기에 효과적이다. 이러한 입자를 폐에 깊게 들이쉰 후, 흡입된 입자가 치료의 유효하중(payload)으로 전달할 때까지 폐의 자연 제거 기능을 일탈시킨다. 참고 문헌[Edwards et al.,Science276: 1868-1872 (1997)]. 본 발명의 α-Gal A 제제는 예를 들면 본 명세서에서 참고로 인용하는 미국 특허 제5,654,007호, 동제5,780,014호 및 동제5,814,607호에 기재된 바와 같은 제법 및 제제를 사용하여 에어로졸화 형태로 투여될 수 있다. 비강내 투여의 경우, 비강 드롭, 또는 비강내 적용하기 위한 겔의형태로 투여하기 위한 유상 액제를 포함할 수 있다.
피부면에 국소 투여하기 위한 제제는 α-Gal A 제제를 피부과적으로 허용 가능한 담체, 예컨대 로션, 크림, 연고 또는 비누로 분산시켜 생성될 수 있다. 도포를 국소화하고, 제거를 방지하기 위해 피부에 막 또는 층을 형성할 수 있는 담체가 특히 유용하다. 내부 조직면에 국소 투여하기 위해, α-Gal A 제제는 조직면에 흡수를 증대시키기는 것으로 공지된 기타의 물질 또는 액상 조직용 접착제에 분산시킬 수 있다. 예를 들면, 다수의 점막 접착제 및 협측 정제는 본 명세서에서 참고로 인용하는 미국 특허 제4,740,365호, 동제4,764,378호 및 동제5,780,045호 등에서와 같이 경점막 약물 전달에 대해 기재되어 있다. 또한, 히드록시프로필셀룰로스 또는 피브리노겐/트롬빈 액제를 혼입시킬 수도 있다. 또한, 조직 코팅 액제, 예컨대 펙틴 함유 제제를 사용할 수도 있다.
본 발명의 제제는 살균 상태의 유지, 적절한 분배와 저장동안 활성 성분의 활성 보호 및, 환자에게 투여하기 위한 제제의 간편하고 유효한 접근 가능성을 제공하기에 적절한 용기로 제공될 수 있다. α-Gal A 제제의 주사 가능한 제제는 바늘 및 주사기를 사용하여 내용물을 취하기에 적절한 스토퍼가 장착된 바이알 내에서 제공될 수 있다. 이 바이알은 1회 사용 또는 다수회 사용하기 위한 것이다. 또한, 제제는 예비충전시킨 주사기로서 제공될 수도 있다. 특정의 경우, 내용물은 액상 제제로 제공되나, 기타에서는 이들은 건조하거나 또는 동결건조 상태로 제공될 수 도 있으며, 특정의 경우, 표준 또는 공급된 희석제를 액상의 상태로 제조직화하는 것이 필요할 경우도 있다. 제제가 정맥내 투여를 위한 액제로서 공급되는 경우,이는 정맥내 투여 라인 또는 카테터에 접속시키기에 적절한 무균 백 또는 용기내에서 제공될 수도 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 제제는 소정 투여량의 제제를 간편하게 투여하는 장치내에서 액상 또는 분말 형태의 제제로 제공되며, 이러한 장치의 예로는 피하 또는 근육내 주사를 위한 바늘을 사용하지 않는 주사기, 계량기가 달린 에어로졸 전달 장치 등이 있다. 기타의 경우에 있어서, 제제는 경피 투여를 위한 피부에 적용하기 위한 패취 또는 드레싱과 같은 서방형에 적절한 형태 또는 경점막 투여를 위한 침식성 장치를 통해 제공될 수 있다. 제제가 정제 또는 환제의 형태로 경구 투여되는 경우, 제제는 제거 가능한 뚜껑을 지닌 병으로 제공될 수도 있다. 용기에는 예를 들면 제제의 유형, 제조업자명 또는 분배업자명, 징후, 제안된 투여량, 적절한 저장에 대한 지시 사항, 투여에 대한 지시 사항 등에 관한 정보가 기재된 라벨이 부착될 수 있다.
α-Gal A 제제의 투여를 위한 투여량
본 발명은 파브리병, 파브리병의 부정형 변종 또는, α-Gal A 의 감소된 농도 또는 돌연변이체 형태로 존재하는 임의의 증상을 앓고 있는 환자에게 α-Gal A 제제의 투여하기 위한 방법을 추가로 제공하고자 한다. 투여량은 바람직하게는 체중 1 ㎏당 α-Gal A 제제 0.05∼5.0 ㎎, 더욱 바람직하게는 0.1∼0.3 ㎎이며, 이는 매주 또는 격주로 투여한다. 바람직한 구체예로는 2 주 단위로 약 0.2 ㎎/㎏의 투여량으로 투여한다. 환자의 일생에 걸쳐서 단백질을 규칙적으로 반복해서 투여하여야만 한다. 피하 주사는 약물에 장시간 동안 전신성 노출을 유지하고자 하는데 사용될 수 있다. 피하 투여량은 매주 또는 격주 단위로 체중 1 ㎏당 α-Gal A 제제0.01∼10.0 ㎎, 바람직하게는 0.1∼5.0 ㎎이 될 수 있다. 근육내 주사에 의해 투여되는 α-Gal A 제제의 투여량은 피하 주사되는 것과 동일하거나 또는 상이할 수 있으며, 바람직한 구체예에서는 근육내 투여량이 더 적으며, 더 낮은 빈도로 투여된다. 또한, α-Gal A 제제는 예를 들면 정맥내 환괴 주사, 완속 정맥내 주사 또는 연속 정맥내 주사에 의해 정맥내 투여될 수 있다. 연속 정맥내 주입(예, 2∼6 시간에 걸쳐)은 혈액내에 소정의 농도를 유지할 수 있다.
환자에게 α-Gal A 제제를 투여하는 또다른 바람직한 방법은 수년에 걸쳐서, 예를 들면 3 년 이하 동안 매주 또는 격주 단위로 바람직한 투여량의 α-Gal A 제제를 투여하는 것을 포함하며, 이 기간 동안 환자는 질환의 상태를 임상적으로 모니터하게 된다. 예를 들면, 신장 또는 심장 기능 또는 환자의 전체적인 안녕(예, 통증)에 있어서의 증진에 의해 측정된 임상적 증진 또는 예를 들면, 소변, 혈장 또는 조직 CTH 농도의 감소로 측정되는 실험적 증진은 환자의 건강 상태를 평가하는데 사용할 수 있다. 임상적 증진이 이러한 치료 및 모니터 기간 이후에 관찰되는 경우, α-Gal A 투여 빈도수를 감소시킬 수 있다. 예를 들면, α-Gal A 제제를 매주 투여하는 환자는 격주 단위의 주사로 변경시킬 수 있다. 또는, α-Gal A 제제를 2 주 단위로 주사받는 환자는 월 단위 주사로 변경시킬 수도 있다. 이러한 투여 빈도를 변화시킨 후, 환자를 수년간, 예를 들면 3 년간 모니터하여야만 한다. 바람직한 구체예에서, 투여 빈도를 변경하였을 경우, 투여된 투여량은 변화시키지 않아도 된다. 이는 특정의 약물학적 매개변수 (예, 최대 혈장 농도 [Cmax], 시간 대 최대 혈장 농도 [tmax], 혈장, 반감기 [t1/2], 곡선 아래의 면적[AUC]에 의해 측정된 노출)는 각각의 투여된 투여량 이후 비교적 일정하게 유지된다. 이러한 약물학적 매개변수의 유지에 의해 투여량 빈도 변화에 따른 수용체 매개된 α-Gal A의 흡수율이 비교적 일정한 농도로 유지되었다.
예를 들면, 주로 심혈관 부전 또는 신장 관련 파브리병을 나타내는 파브리병의 부정형 변종을 앓고 있는 환자는 동일한 용법, 예를 들면 0.05 ㎎/㎏∼5 ㎎/㎏로 매주 또는 격주 단위로 치료한다. 이러한 투여는 필요에 따라 변경한다. 예를 들면, α-갈락토시다제 A 효소 대체법으로 치료하는 심장 변종 표현형을 갖는 환자는 이들의 심장의 조성의 변화 및 치료후의 심 기능이 개선된다. 이러한 변화는 표준의 초음파 심장 동태 진단법으로 측정될 수 있으며, 이는 파브리병을 앓고 있는 환자에게서의 증가된 좌심실벽 두께를 검출할 수 있다. 참고 문헌[Goldman et al.,J. Am. Coll. Cardiol.7: 1157-1161 (1986)]. 일련의 초음파 심장 동태 진단법을 사용한 좌심실벽 두께의 측정은 처치 동안 수행할 수 있으며, 좌심실벽의 크기의 감소는 치료의 반응에 대한 표시가 된다. 또한, α-Gal A 효소 대체 요법으로 처치한 환자를 심장 자기 공명 영상화법(MRI)을 실시한다. MRI는 소정의 조직의 상대적인 조성을 평가할 수가 있다. 예를 들면, 파브리병을 앓고 있는 환자의 심장 MRI는 대조예의 환자에 비하여 심근내에 지질이 부착되어 있는 것으로 밝혀졌다. 참고 문헌[Matsui et al.,Am. Heart J. 117: 472-474 (1989)]. 효소 대체 요법을 실시한 환자에게서의 일련의 심장 MRI 평가에 의하면 환자의 심장내의 지질 부착에 변화가 있는 것을 밝혀졌다. 신장 변종 표현형을 갖는 환자는 α-갈락토시다제 A 효소 대체 요법에 유리하다. 이러한 요법의 효과는 예를 들면 24 시간의 소변내의 단백질 농도, 크레아티닌 청소율 및 사구체 여과율과 같은 신 기능의 표준 테스트에 의해 측정될 수 있다. 이하의 실시예는 본 발명의 바람직한 구체예를 보다 완전하게 예시하기 위해 제시하는 것이다. 이러한 실시예는 첨부된 특허청구의 범위에서 정의된 바와 같이, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석하여서는 아니한다.
발명의 개요
본 발명은 고순도의 α-Gal A 제제 및 α-Gal A 당형태(glycoform)를 정제하는 여러 가지 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 변경된 전하 특성을 갖는 α-Gal A 제제 및 이들 제제를 제조하는 방법을 제공한다. 전하 변경은 α-Gal A의 시알산 함량을 증가시키고/시키거나, α-Gal A의 인산화를 증가시키므로써 수행할 수 있다. 또한, 본 발명은 포유동물 숙주에서 순환 반감기가 연장된 α-Gal A 제제 및 이의 제조 방법도 제공한다. 마지막으로, 본 발명은 α-Gal A 제제를 피험체에 투여하는 방법 및 투여량을 제공한다. 본 발명의 α-Gal A 제제는 파브리병 또는 파브리병의 비전형적인 변이, 예를 들어 심실 확장(예, 좌심실 이상 비대증(LVH)) 및/또는 승모판 부전과 같은 현저한 심혈관 이상을 가진 파브리병 환자, 또는 현저하게 신장과 관련된 파브리병 환자의 특정 개체군을 치료하는데 유용할 것이다.
실시예 1: α-Gal A의 전달 및 발현을 위하여 디자인된 작제물의 제조 및 사용
2 종의 발현 플라스미드인 pXAG-16 및 pXAG-28을 작제하였다. 이들 플라스미드는 α-Gal A 효소(α-Gal A 신호 펩티드 없음)의 398 아미노산을 암호화하는 인간 α-Gal A cDNA; 인간 성장 호르몬(hGH) 유전자의 제1 인트론에 의하여 차단되는 hGH 신호 펩티드 게놈 DNA 서열; 및 폴리아데닐화를 위한 신호를 포함하는 hGH 유전자의 3' 미번역 서열(UTS)을 포함한다. 플라스미드 pXAG-16은 인간 시토메갈로바이러스 직초기(CMV IE) 프로모터 및 제1 인트론(비-코딩 엑손 서열이 양측에 인접해 있음)을 보유하는 반면, pXAG-28은 콜라겐 Iα2 프로모터 및 엑손 1로부터 유도되며, 또한 β-액틴 유전자의 5'UTS를 포함하는데, 이는 β-액틴 유전자의 제1 인트론을 함유한다.
1.1 α-Gal A cDNA의 클로닝, 및 α-Gal A 발현 플라스미드 pXAG-16의 작제
인간 α-Gal A cDNA는 다음과 같이 작제된 인간 섬유아세포 cDNA 라이브러리로부터 클로닝하였다. 전장 RNA로부터 폴리-A+mRNA를 분리하고, 제조자의 지시에 따라 람다 Zap ⅡR시스템용 시약(스트레이터진 인코포레이티드, 라졸라, 캘리포니아)을 사용하여 cDNA 합성을 수행하였다. 요약하면, "제1 가닥" cDNA는 내부 XhoI 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함하는 올리고-dT 프라이머의 존재하에 역전사에 의하여 생성시켰다. RNase H로 처리한 후, DNA 폴리머라제 I을 사용하여 cDNA를 닉-트랜슬레이션(nick-translation)시켜 이중 가닥 cDNA를 생성시켰다. T4 DNA 폴리머라제를 사용하여 상기 cDNA를 블런트-말단(blunt-end)으로 만들고, EcoRI 어댑터에 결찰시켰다. 상기 결찰 생성물은 T4 DNA 키나제로 처리하였고, XhoI로 소화시켰다. cDNA는 세파크릴(Sephacryl)R-400 크로마토그래피로 분류하였다. 큰 사이즈의 분획 및 중간 사이즈의 분획을 모으고, cDNA를 EcoRI 및 XhoI-소화 람다 ZapII 아암(arm)에 결찰시켰다. 그 후, 상기 결찰 생성물을 패키징하고, 적정하였다. 제1 라이브러리는 1.2 x 107pfu/mL의 역가 및 925 bp의 평균 삽입 크기를 가졌다.
인간 α-Gal A 유전자(도 1, 서열 번호 1)의 엑손 7로부터의 210 bp 프로브(probe)를 사용하여 cDNA를 분리하였다. 상기 프로브 자체는 하기 올리고뉴클레오티드를 사용하는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의하여 게놈 DNA로부터 분리시켰다: 5'-CTGGGCTGTAGCTATGATAAAC-3'(올리고 1; 서열 번호 6) 및 5'-TCTAGCTGAAGCAAAACAGTG-3'(올리고 2; 서열 번호 7). 그 후, 상기 PCR 생성물을 사용하여 섬유아세포 cDNA 라이브러리를 스크리닝하였고, 양성 클론을 분리하여 추가로 특성을 나타내었다. 하나의 양성 클론인 파아지 3A를 제조자의 지시에 따라 람다 ZapIIR시스템 절제 프로토콜(스트레이터진 인코포레이티드, 라졸라, 캘리포니아)로 처리하였다. 이러한 방법으로 플라스미드 pBSAG3A를 수득하였는데, 이 플라스미드는 p블루스크립트SK-TM플라스미드 골격 중의 α-Gal A cDNA 서열을 포함하는 것이다. DNA 서열 결정은 이 플라스미드가 cDNA 서열의 완전한 5' 말단을 함유하지 않았다는 것을 보여주었다. 따라서, 상기 5' 말단은 인간 게놈 DNA로부터 증폭시킨 PCR 단편을 사용하여 재작제하였다. 이를 달성하기 위하여, 하기 올리고뉴클레오티드를 사용하여 268 bp 게놈 DNA 단편(도 2, 서열 번호 2)을 증폭시켰다: 5'-ATTGGTCCGCCCCTGAGGT-3'(올리고 3; 서열 번호 8) 및 5'-TGATGCAGGAATCTGGCTCT-3'(올리고 4; 서열 번호 9). 이 단편은 "TA" 클로닝 플라스미드(인비트로젠 코포레이션, 샌디에고, 캘리포니아)로 서브클로닝시켜 플라스미드 pTAAGEI를 생성시켰다. 주로 α-Gal A cDNA 서열을 포함하는 플라스미드 pBSAG3A 및 α-Gal A cDNA의 5'-말단을 포함하는 pTAAGEI를 각각 SacII 및 NcoI로 소화시켰다. 증폭된 DNA 단편 내의 관련 SacII 및 NcoI 부위의 위치를 도 2에 나타낸다. pTAAGEI로부터의 SacII-NcoI 단편 0.2kb를 분리하고 동등하게 소화된 pBSAG3A에 결찰시켰다. 상기 플라스미드 pAGAL은 α-Gal A 신호 펩티드를 암호화하는 서열을 비롯하여 완전한 α-Gal A cDNA 서열을 포함한다. 상기 cDNA는 완전하게 서열결정되었고(α-Gal A 신호 펩티드를 포함하는 도 3 참조; 서열 번호 3), 인간 α-Gal A cDNA에 대한 공지된 서열(유전자 은행 서열 HUMGALA)과 동일함이 밝혀졌다.
하기와 같은 방법으로 몇몇 중간체를 통하여 플라스미드 pXAG-16을 작제하였다. 우선, pAGAL을 SacII 및 XhoI로 소화시켜 블런트-말단으로 만들었다. 둘째로, 완전한 α-Gal A cDNA의 말단을 XbaI 링커에 결찰시키고, XbaI 소화된 pEF-BOS(Mizushima 등,Nucl. Acids Res.18:5322, 1990)로 서브클로닝시켜 pXAG-1을 생성시켰다. 이러한 작제물은 인간 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF) 3' UTS, 및 α-Gal A cDNA의 5' 말단이 신장 인자-1a(EF-1a) 프로모터에 융합되도록 α-Gal A + α-Gal A 신호 펩티드를 암호화하는 cDNA가 양측에 인접한 인간 신장 인자-1a(EF-1a) 프로모터를 포함한다. CMV IE 프로모터 및 제1 인트론을 사용하여 작제물을 제조하기 위하여, α-Gal A cDNA 및 G-CSF 3' UTS를 2kb XbaI-BamHI 단편으로 pXAG-1로부터 제거하였다. 상기 단편은 블런트-말단화시켰고, BamHI 링커에 결찰시켰으며, BamHI 소화 pCMVflpNeo(이는 하기에 기술하는 바와 같이 구성함)에 삽입하였다. 상기 배향은 α-Gal A cDNA의 5'말단이 CMV IE 프로모터 영역에 융합되도록 하였다.
pCMVflpNeo는 하기와 같이 제조하였다. CMV IE 유전자 프로모터 단편을 주형 및 올리고뉴클레오티드로서 CMV 게놈 DNA를 사용하여 PCR에 의하여 증폭시켰다: 5'-TTTTGGATCCCTCGAGGACATTGATTATTGACTAG-3'-(서열 번호 10) 및 5'-TTTTGGATCCCGTGTCAAGGACGGTGAC-3'(서열 번호 11). 생성물(1.6kb 단편)을 BamHI로 소화시켜 응집성 BamHI-소화 말단을 갖는 CMV 프로모터-함유 단편을 수득하였다. 네오 발현 단위는 1.1kb XhoI-BamHI 단편으로 플라스미드 pMC1neopA(스트레이터진 인코포레이티드, 라졸라, 캘리포니아)로부터 분리하였다. 상기 CMV 프로모터-함유및 네오 단편을 BamHI-, XhoI- 소화 플라스미드(pUC12)에 삽입하였다. 특히, pCMVflpNeo는 (유전자 은행 서열 HS5MIEP의) 뉴클레오티드 546에서 출발하여 뉴클레오티드 2105에서 종결되는 CMV IE 프로모터 영역을 포함하고, CMV IE 프로모터 단편 5' 바로 옆에 위치한 단순 포진 바이러스(HSV) 티미딘 키나제 프로모터(TKneo 유전자)에 의하여 유도되는 네오마이신 내성 유전자를 포함한다. 네오 유전자의 전사 방향은 CMV 프로모터 단편의 전사 방향과 동일하다. 이 중간체 작제물을 pXAG-4라고 부른다.
hGH 3' UTS를 추가하기 위하여, GCSF 3' UTS를 XbaI-SmaI 단편으로 pXAG-4로부터 제거하였고, pXAG-4의 말단을 블런트로 만들었다. hGH 3' UTS를 0.6kb SmaI-EcoRI 단편으로 pXGH5(셀덴 등,Mol. Cell. Biol. 6:3173-3179, 1986)으로부터 제거하였다. 상기 단편의 블런트-말단화 후, 그것을 pXAG-4의 블런드-말단 XbaI 부위 뒤에 바로 위치한 pXAG-4내로 결찰시켰다. 이러한 중간체를 pXAG-7이라고 부른다. TKneo 단편을 HindIII-ClaI 단편으로 상기 플라스미드로부터 제거하였고, 상기 플라스미드의 말단을 DNA 폴리머라제 I의 클레노우(Klenow) 단편을 사용하여 "필링-인(filling-in)"에 의하여 블런트화하였다. SV40 초기 프로모터에 의하여 유도되는 네오마이신 내성 유전자를 pcDNeo(첸 등,Mol. Cell. Biol.7: 2745-2752, 1987)의 소화로부터 블런트된 ClaI-BsmBI 단편으로 결찰시켜 α-Gal A 전사 단위와 동일한 배향에 네오 전사 단위를 위치시켰다. 이 중간체를 pXAG-13이라고 부른다.
26 아미노산 hGH 신호 펩티드 코딩 서열 및 hGH 유전자의 제1 인트론을 갖는 pXAG-16을 완성하기 위하여, 우선 pXAG-13의 EcoRI-BamHI 단편 2.0kb를 제거하였다. 상기 단편은 α-Gal A cDNA 및 hGH 3' UTS를 포함하였다. 이러한 커다란 단편을 3 단편으로 치환시켰다. 제1 단편은 코자크 공통 서열(Kozak consensus sequence)의 상류에 바로 위치한 합성 BamHI 부위 내지 hGH 신호 펩티드 코딩 서열의 말단의, hGH 제1 인트론 서열을 포함하고 hGH 신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 pXGH5의 PCR 생성물 0.3kb로 구성되었다. 하기 올리고뉴클레오티드를 사용하여 상기 단편(제1 단편)을 증폭시켰다: 5'-TTTTGGATCCACCATGGCTA-3'(올리고 HGH101; 서열 번호12) 및 5'-TTTTGCCGGCACTGCCCTCTTGAA-3'(올리고 HGH102; 서열 번호13). 제2 단편은 398 아미노 산 α-Gal A 효소(즉, α-Gal A 신호 펩티드 결핍)를 암호화하는 cDNA의 출발점 내지 NheI 부위에 상응하는 서열을 포함하는 PCR 생성물 0.27kb로 구성되었다. 하기 올리고뉴클레오티드를 사용하여 상기 단편(제2 단편)을 증폭시켰다: 5'-TTTTCAGCTGGACAATGGATTGGC-3'(올리고 AG10; 서열 번호 14) 및 5'-TTTTGCTAGCTGGCGAATCC-3'(올리고 AG11; 서열 번호15). 제3 단편은 hGH 3' UTS 및 나머지 α-Gal A 서열을 포함하는 pXAG-7의 NheI-EcoRI 단편으로 구성되었다(제3 단편).
제1 단편(BamHI 및 NaeI로 소화됨), 제2 단편(PvuII 및 NheI로 소화됨) 및 제3 단편은 CMV IE 프로모터 및 네오 유전자를 포함하는 pXAG-13의 BamHI-EcoRI 단편 6.5kb와 혼합시키고 함께 결찰시켜 플라스미드 pXAG-16을 생성시켰다(도 4).
1.2 α-Gal A 발현 플라스미드 pXAG-28의 구성
α-Gal A 발현 작제물 pXAG-28에 사용하기 위하여 인간 콜라겐 Iα2 프로모터를 하기와 같이 분리하였다. 하기 올리고뉴클레오티드를 사용하여 인간 콜라겐Iα2 프로모터의 부분을 포함하는 인간 게놈 DNA의 PCR 단편 408bp를 분리하였다: 5'-TTTTGGATCCGTGTCCCATAGTGTTTCCAA-3'(올리고 72; 서열 번호16) 및 5'-TTTTGGATCCGCAGTCGTGGCCAGTACC-3'(올리고 73; 서열 번호17).
상기 단편을 사용하여 EMBL3(클론테크 인코포레이티드, 팔로알토, 캘리포니아) 중의 인간 백혈구 라이브러리를 스크리닝하였다. EcoRI 단편 3.8kb를 포함하는 하나의 양성 클론(파아지 7H)을 분리하고, pBSIISK+(스트레이터진 인코포레이티드, 라졸라, 캘리포니아)의 EcoRI 부위에 클로닝하였다(pBS/7H.2 생성). pBSIISK + 폴리링커 내를 분리하는 SpeI로 소화시키고, DNA 폴리머라제 I의 클레노우 단편으로 "필링-인"하고, 올리고뉴클레오티드 5'-CTAGTCCTAGGA-3'(서열 번호18)을 삽입함에 의하여 AvrII 부위를 pBSIISK+에 도입시켰다. pBSIISK+의 이러한 변종을 BamHI 및 AvrII로 소화시키고, 전술한 오리지날 408bp 콜라겐 Iα2 프로모터 PCR 단편의 121 bp BamHI-AvrII 단편에 결찰시켜 pBS/121COL.6을 제조하였다.
플라스미드 pBS/121COL.6을 pBSIISK+폴리링커 서열 내를 분리하는 XbaI로 소화시키고, DNA 폴리머라제 I의 클레노우 단편으로 "필링-인"하고, AvrII로 소화시켰다. pBS/7H.2의 BamHI-AvrII 단편 3.8kb를 분리하고, BamHI 부위를 클레노우 효소로 처리하여 블런트-말단으로 만들었다. 그 후, 상기 단편을 AvrII로 소화시키고, AvrII-소화 벡터에 결찰시킴으로써 콜라겐 프로모터 플라스미드 pBS/121bpCOL 7H.18을 제조하였다.
다음에 상기 콜라겐 프로모터를 인간 β-액틴 유전자의 제1 인트론을 포함하는 인간 β-액틴 유전자의 5' UTS에 융합시켰다. 이 서열을 분리하기 위하여, 하기 올리고뉴클레오티드를 사용하여 인간 게놈 DNA로부터 PCR 단편 2kb를 분리하였다: 5'-TTTTGAGCACAGAGCCTCGCCT-3'(올리고 BA1; 서열 번호19) 및 5'-TTTTGGATCCGGTGAGCTGCGAGAATAGCC-3'(올리고 BA2; 서열 번호20).
상기 단편을 BamHI 및 BsiHKAI로 소화시켜서 β-액틴 5' UTS 및 인트론을 포함하는 단편 0.8kb를 방출시켰다. 그 후, SalI-SrfI 단편 3.6kb를 콜라겐 프로모터 플라스미드 pBS/121bpCOL7H.18로부터 다음과 같이 분리하였다. pBS/121bpCOL7H.18을 BamHI를 사용하여 부분적으로 소화(BamHI 부위는 콜라겐 Iα2 프로모터 단편의 5' 말단에 위치함)시키고, 클레노우 단편으로 처리하여 블런트-말단을 만들고, SalI 링커(5'-GGTCGACC-3')에 결찰시킴으로써 콜라겐 Iα프로모터의 상부 SalI 부위를 위치시켰다. 그 후, 상기 플라스미드를 SalI 및 SrfI로 소화(SrfI 부위는 콜라겐 Iα2 프로모터 CAP 부위의 상부 110bp에 위치함)시키고, 단편 3.6kb를 분리시켰다. 0.8kb 및 3.6kb의 단편을 SalI - 및 BamHI- 소화된 pBSIISK-(스트레이터진 인코포레이티드, 라졸라, 캘리포니아)와 결합시키고, 하기 4개의 올리고뉴클레오티드로 구성된 단편을 함께 어닐링(annealing)시켰다(블런트 말단 및 BsiHKAI 말단을 갖는 단편을 형성시킴):
5'-GGGCCCCCAGCCCCAGCCCTCCCATTGGTGGAGGCCCTTTTGGAGGCACCCTAGGGCCAGGAAACTT TTGCCGTAT-3'(올리고 COL-1; 서열 번호21),
5'-AAATAGGGCAGATCCGGGCTTTATTATTTTAGCACCACGGCCGCCGAGACCGCGTCCGCCCCGCGAG CA-3'(올리고 COL-2; 서열 번호22),
5'-TGCCCTATTTATACGGCAAAAGTTTCCTGGCCCTAGGGTGCCTCCAAAAGGGCCTCCACCAATGGGAGGGCTGGG GCTGGGGGCCC-3'(올리고 COL-3; 서열 번호23), 및
5'-CGCGGGGCGGACGCGGTCTCGGCGGCCGTGGTGCTAAAATAATAAAGCCCGGATC-3'(올리고 COL-4; 서열 번호24).
어닐링시에, 이들 4개의 올리고뉴클레오티드는 콜라겐 프로모터의 SrfI 부위 개시 영역 및 β-액틴 프로모터의 BsiHKAI 부위를 통한 연속 영역에 상응한다. 생성된 플라스미드는 pCOL/β-액틴으로 디자인되었다.
pXAG-28의 작제를 완결하기 위하여, 콜라겐 Iα2 프로모터 및 β-액틴 5' UTS를 포함하는 pCOL/β-액틴의 SalI-BamHI 단편을 분리하였다. 상기 단편을 pXAG-16(실시예 1.1 및 도 4 참조)으로부터의 두개의 단편에 결찰시켰다: (1)6.0kb BamHI 단편(네오 유전자, 플라스미드 백본, 398 아미노산 α-Gal A 효소를 암호화하는 cDNA 및 hGH 3' UTS를 포함), 및 (2) 0.3kb BamHI-XhoI 단편(pcDneo로부터의 SV 40 폴리 A 서열을 포함). pXAG-28은 인간 β-액틴 5' UTS에 융합된 인간 콜라겐 Iα2 프로모터, hGH 신호 펩티드(hGH 제1 인트론에 의하여 차단됨), α-Gal A 효소를 암호화하는 cDNA, 및 hGH 3' UTS를 포함한다. 완전한 발현 작제물 pXAG-28의 지도를 도 5에 나타낸다.
1.3 α-Gal A 발현 플라스미드로 일렉트로포레이션된 섬유아세포의 형질감염 및 선택
섬유아세포에서 α-Gal A 를 발현시키기 위하여, 2차 섬유아세포를 배양하고 공지 방법(Selden 등, WO 93/09222호)에 따라 형질감염시켰다.
플라스미드 pXAG-13, pXAG-16 및 pXAG-28을 일렉트로포레이션에 의해 인간포피 섬유아세포로 형질감염시켜 안정적으로 형질감염된 클론 세포 균주를 생성하였고, 생성된 α-Gal A 발현 수준을 실시예 1.4에 개시한 바와 같이 모니터링하였다. 정상 포피 섬유아세포에 의한 α-Gal A의 분비는 2∼10 단위/106세포/24시간 이다. 반대로, 형질감염된 섬유아세포는 표2에서와 같이 평균의 발현 수준을 나타낸다.
평균 α-Gal A 발현 수준 (±표준 편차)
pXAG-13 420±344 U/106세포/일N=26 클론 균주(범위: 3∼1133 U/106세포/일)
pXAG-16 2,051±1253 U/106세포/일N=24 클론 균주(범위: 422∼5200 U/106세포/일)
pXAG-28 141±131 U/106세포/일N=38 클론 균주(범위: 20∼616 U/106세포/일)
이들 데이터는 발현 작제물 3개 모두가 형질 감염되지 않은 섬유아세포 보다 α-Gal A 발현을 몇 배 증가시킬 수 있다는 것을 나타낸다. α-Gal A 신호 펩티드에 연결된 α-Gal A를 암호화하는 pXAG-13으로 안정적으로 형질감염된 섬유아세포에 의한 발현은 실질적으로 상기 신호 펩티드가 hGH 신호 펩티드이고, 암호화 서열은 hGH 유전자의 첫번째 인트론에 의해 단절된다는 점에서만 상이한 pXAG-16 으로 형질감염된 섬유아세포에 의한 발현 정도 보다 실질적으로 낮았다.
형질전환된 세포가 계대될 때 마다, 분비된 α-Gal A 활성을 측정하고, 세포수를 세고, 세포의 밀도를 계산하였다. 수집한 세포의 수와 α-Gal A를 분비하는데드는 시간을 기초로 하여, α-Gal A의 비발현속도(specific expression rate)를 측정하고 24시간 당 및 106개의 세포수 당 (α-Gal A의) 분비된 단위로 표3 및 표4에 기록하였다. 유전자 치료 또는 α-Gal A의 정제용 물질의 생성에 사용되는 바람직한 세포 균주는 수차례의 계대에 걸쳐 안정적인 성장과 발현을 나타내야만 한다. α-Gal A 발현 작제물 pXAG-16으로 안정적으로 형질감염시킨 것인 표3 및 표4에 나타낸 세포 균주의 데이터는 α-Gal A 발현이 연속적인 계대 동안 안정적으로 유지된다는 사실을 나타낸다.
α-Gal A 발현 작제물 pXAG-16을 포함하는 BRS-11 세포의 성장 및 발현
계대 발현 (단위/106세포/24시간) 세포 밀도(세포수/cm2)
13 2601 4.80 x 104
14 1616 4.40 x 104
15 3595 4.40 x 104
α-Gal A 발현 작제물 pXAG-16을 포함하는 HF-503-242 세포의 성장 및 발현
계대 발현 (단위/106세포/24시간) 세포 밀도(세포수/cm2)
5 4069 2.80 x 104
6 7585 3.55 x 104
7 5034 2.48 x 104
1.4 α-Gal A 발현의 정량
α-Gal A의 활성을 Ioannou 등,J Cell Biol. 119; 1137-1150(1992)에 기재된 프로토콜을 개질하여 4-메틸움벨리페릴-α-D-갈락토피라노시드(4-MUF-gal;Research Products, Inc.)를 이용하여 측정하였다. 기질을 기질 완충액(0.1 M 시트레이트-포스르페이트, pH 4.6)에 1.69 mg/mL의 농도(5 mM)로 용해시켰다. 통상, 배양물 상청액 10 mL 를 75mL 의 기질 용액에 첨가하였다. 튜브를 덮고 37 ℃ 수조에서 60 분 동안 항온배양하였다. 항온 배양이 끝나갈 무렵, 2 mL 의 글리신-카보네이트 완충액(130 mM 글리신, 83mM 탄산나트륨, pH 10.6)을 사용하여 반응을 중단시켰다. 각 샘플의 상대 형광도를 여기 파장이 365 nm로 고정된 모델번호 TK0100 형광측정기(Hoefer Scientific Instrument)로 측정하여 460 nm 의 고정된 방출 파장을 검출하였다. 샘플을 판독하여 메틸움벨리페론(Sigma Chemical Co.) 1 mM 로 제조한 표준물과 비교하고, 가수분해된 기질의 양을 계산하였다. α-Gal A의 활성은 단위로 표현되고, 1 α-Gal A 활성 단위는 37 ℃에서 시간 당 가수분해된 기질의 1 나노미터에 상응한다. 세포 발현 데이터는 통상 분비된 α-Gal A 활성 단위/106세포/24시간으로 표현된다. 또한 이들 분석은 하기와 같이, 다양한 α-Gal 정제 단계로부터의 샘플 및 세포 리세이트에서 α-Gal 활성양을 측정하는 데 이용된다.
1.5 유전자 활성화된 α-Gal A(GA-GAL)의 제조
유전자-활성화된 α-Gal A (GA-GAL)의 제조는 인간 α-Gal A 암호화 서열의 조절 및 구조적 DNA 상단 서열의 삽입에 의해 일어나고, 본원 명세서에 참고 문헌으로 삽입된 미국 특허 제5,733,761호에 기재된 바와 같이, 실질적으로 GA-기술을 이용한다. 유전자-활성화 서열의 정확한 삽입은 인간 세포에서 α-Gal A 좌의 게놈 DNA 상단 서열 및 형질감염된 DNA 분절 상에 존재하는 DNA 사이의 상동성 재조합의 결과로서 발생한다. 유전자-활성 서열 그 자체는 신호 펩티드 절단부까지(절단부는 포함하지 않음)의 α-Gal A 암호화 서열을 포함한다. 활성화된 α-Gal A 좌를 포함하는 세포를 분리하고 GA-GAL 생산을 증진시키는 세포를 분리하기 위한 약물을 선택한다.
적절한 유전자-활성 서열을 포함하는 표적 DNA 분절을 일렉트로포레이션에 의하여 숙주 인간 세포주에 도입한다. 상기 하나의 세포주는 HT-1080으로서, ATCC(Rockville, Maryland)로부터 수득가능한 확인된 세포주이다. 상기 DNA 분절을 포함하는 유전자 활성 플라스미드(표적 작제물)pGA213C은 표9에 도시하고 있다. 상기 플라스미드는 숙주 세포주에서 내재성 α-Gal A 좌의 일부를 활성화하도록 고안된 서열을 포함하며, 신호 펩티드를 암호화하는 서열을 포함하지만, 인간 α-Gal A를 포함하지는 않는다. 또한 표적 작제물은 세균neo및 마우스dhfr유전자에 대한 발현 카세트를 포함한다. 이들은 안정적으로 집적된 표적 분절을neo유전자를 통해 선택할 수 있게 하고 단계식의 메토트렉세이트(MTX) 선택을 이용하여dhfr유전자를 계속 선택할 수 있게 한다.
또한, pGA213C 는 상동성 재조합에 의해 내재성 α-Gal A 좌의 크로모좀 상단 서열을 표적화하기 위해 고안된 서열을 포함한다. 내재성 α-Gal A 좌와 pGA213C 의 9.6 kb DNA 분절 사이의 상동성 재조합이 도10에 도시되어 있다.
X-크로모좀 α-Gal A 좌와 pGA213C 분절을 상동성 재조합할 때, pGA213C 를 구조화 하여 α-Gal A 의 메티오닌 개시 코돈에 대해 -1183 위치로부터 -222 위치까지 연장하는 게놈 서열의 962 bp를 삭제하였다. α-Gal A의 암호화 부위의 외재성의 조절 상단 서열을 정확하게 표적화함으로써 α-Gal A좌의 전사활성이 발생한다. 생성된 GA-GAL 좌는 CMV 프로모터로부터 전사를 개시하게 하고 CMV 엑손 1, 알돌라제 인트론과 α-Gal A 암호화 서열의 7개 엑손 및 6개 인트론을 통해 진행하게 한다. 큰 전구체 mRNA의 스플라이싱이 외재성 CMV 엑손을(표적화함으로써 삽입) α-Gal A 전사의 전체 내재성 제1 엑손과 연결시킨다. GA-GAL mRNA 의 번역은 31개의 아미노산 신호 펩티드를 가진 pre GA-GAL 를 생성시킨다. 숙주 세포로부터 분비될 때, 신호 펩티드가 제거된다. 정확하게 표적화된 세포주가 GA-GAL mRNA 를 존재시키기 위한 폴리머라제 연쇄반응 스크리닝에 의해 먼저 동정된다. GA-GAL mRNA 를 제조하는 클론은 효소적으로 활성화된 α-Gal A 를 배양 배지에 분비하는 것으로 밝혀졌다. 표적화 작업의 후속적인 확인 작업은 게놈 DNA의 서던 블롯 하이브리드 형성 분석 및 제한 효소 소화에 의해 수행된다.
세포를 단계적인 메토트렉세이트("MTX") 선택에 노출시킨다. 0.05 μM MTX 에서 분비한 다음, 세포 클론을 분리하고 0.1 μM MTX 선택을 실시하였다. 이러한 공정으로부터, 0.1 μM MTX 에 내성을 갖는 일단의 세포를 분리하고(세포주 RAG001) 배양물에서 팽창시켜 특성화하였다.
실시예 2
α-Gal A 정제
다음은 α-Gal A를 생산하고, 정제하고 시험하는 바람직한 방법에 대해 기술하고자 한다. 정제 공정은, 공정 전반에 걸쳐 용해성이고 활성이며 천연적인 형태로 α-Gal A을 유지하는 공정이다. 단백질을 극단적인 pH, 유기 용매 또는 세제에 노출시키지 않고, 정제 공정 동안 단백질 분해로 절단시키지 않으며 응집물을 형성시키지 않는다. 정제 공정은 α-Gal A 당형태의 분배를 바꾸지 않도록 고안된다.
2.1 α-Gal A의 정제
실시예 2.1은 효소를 생산하기 위하여 안정하게 형질감염된 배양된 인간 세포 균주의 조절된 배지로부터 α-Gal A가 균일성에 근접하게 정제될 수 있다는 것을 설명한다. 일련의 5 단계의 크로마토그래피를 이용하여 α-Gal A을 α-Gal A 함유 배지로부터 분리한다. 상기 5 단계는 다양한 분리 원리를 이용하는데, 오염 물질로부터 α-Gal A를 분리하기 위한 효소의 상이한 물리적인 성질들을 이용하는 것이 유리하다. 이에 포함되는 것으로는 부틸 세파로즈(등록상표)를 이용한 소수성 상호작용 크로마토그래피, 히드록시아파타이트를 이용한 이온성 상호작용, Q 세파로즈(등록상표)를 이용한 음이온 교환 크로마토그래피, 및 수퍼덱스(등록상표)200을 이용한 크기 배제 크로마토그래피가 있다. 또한 정제 공정에서의 마지막 단계에 추가하여, 크기 배제 크로마토그래피는 제제와 혼합성인 완충액에 정제된 단백질을 교환하기 위한 효과적인 수단으로 이용된다.
A. α-Gal A의 정제에 있어서 제1 단계로서 부틸 세파로스(Sepharose) 크로마토그래피의 사용
원심분리에 의해 조정 배지(1.34 리터)를 정화시키고, 유리 섬유 프리필터(prefillter)를 사용하는 0.45 ㎛ 셀룰로오스 아세테이트 필터를 통해 여과시켰다. 교반하는 동안, 1 N HCl을 적가함으로써 조정된 여과 배지의 pH를 5.6으로 조절하고, 3.9 M 초고순도 황산암모늄 모액(실온)의 적가에 의해 최종 농도가 0.66 M이 되도록 황산암모늄를 첨가하였다. 전술한 바와 같이, 4 ℃에서 추가의 5분 동안 배지를 교반하고, 여과시켰으며, 부틸 세파로스4 고속 흐름 칼럼(FastFlow Column)[81 ㎖ 칼럼 부피, 2.5 ×16.5 ㎝; 스웨덴 우프살라 소재 파마시아]에 가하여 0.66 M 황산암모늄를 함유하는 pH 5.6의 10 mM MES-Tris(완충제 A) 중에 평형이 되도록 하였다. 직렬형(in-line) UV(280 nm)와 총 단백질 및 염 농도 측정용 전도도(conductivity) 모니터가 장착된 Gradi-Frac시스템(스웨덴 우프살라 소재 파마시아) 상에서 크로마토그래피를 수행하였다. 10 ㎖/분의 유속으로 샘플을 가한 후, 10 칼럼 부피의 완충제 A로 칼럼을 세척하였다. 완충제 A(황산암모늄 함유)부터 pH 5.6(황산암모늄 비함유)의 10 mM MES-Tris까지의 14 칼럼 부피의 선형 구배(linear gradient) 부틸 세파로스칼럼으로부터 α-Gal A를 용리시켰다. 4-MUF-gal 분석에 의해 α-Gal A 활성에 대한 분획(Fraction) 분석을 하고, 평가 가능한 효소 활성을 갖는 분획을 집결시켰다. 도 8 및 정제 개요(표 5)에 나타나 있듯이, 이 단계는 오염(contaminating) 단백질(칼럼 이전의 시료=8.14g의 총 단백질; 칼럼 이후의 시료=0.0638g의 총 단백질)의 약 99%를 제거한다.
안정하게 형질감염된 인간 섬유아세포의 조정 배지로부터의 α-Gal A의 정제
정제 단계 부피(㎖) α-Gal A 활성(×106단위) 총 단백질(㎎) 비(比) 활성(×106단위/㎎) 정제 배수(누적) 회수율(%)
배양 상청액 1340 14.6 8140 0.0018 =1 =100
부틸 세파로스 417 14.1 63.8 0.221 123 96.6
헤파린 세파로스 134 12.1 14.6 0.829 436 82.9
수산화인회석 47 9.73 4.46 2.18 1220 66.6
Q-세파로스 31.5 8.91 3.31 2.69 1503 61.0
수퍼덱스200 10 5.58 2.93 2.92 1634 59.0
B. α-Gal A 정제 단계로서 헤파린 세파로스 크로마토그래피의 사용
pH 5.6(한 번 변화됨)의 10 mM MES-Tris(4 리터)에 대하여 4 ℃에서 부틸 세파로스칼럼 피이크 분획을 투석시켰다. 필요한 경우, H2O 또는 NaCl을 첨가함으로써 4 ℃에서 투석물의 전도도를 1.0 mMHO로 조절하였다. 그 후, 헤파린 세파로스고속 흐름 칼럼(스웨덴 우프살라 소재 파마시아; 29 ㎖ 칼럼 부피, 2.5 ×6 ㎝)에 시료를 가하여 9 mM NaCl(완충제 B)를 함유하는 pH 5.6의 10 mM MES-Tris 중에 평형이 되도록 하였다. 10 ㎖/분의 유속으로 4 ℃에서 이를 행하였다. 직렬형 UV(280 nm)와 전도도 모니터로 총 단백질 및 염 농도를 측정하였다. 시료를 가한 후, 10 칼럼 부피의 완충제 B로 칼럼을 세척하고, 이어서 8% 완충제 C/92% 완충제 B(여기서, 완충제 C는 250 mM NaCl을 함유하는 pH 5.6의 10 mM MES-Tris이다)에 대한 10 칼럼 부피의 선형 구배로 세척하고, 8% 완충제 C로 10 칼럼 부피를 세척하였다. 이어서, 29% 완충제 C에 대한 1.5 칼럼 부피의 선형 구배로, 연이어 35% 완충제 C에 대한 10 칼럼 부피의 선형 구배로 α-Gal A의 용리를 행하였다. α-Gal A 활성에 대한 분획 분석을 하고, 평가 가능한 효소 활성을 갖는 분획을 집결시켰다.
C. α-Gal A 정제 단계로서 수산화인회석 크로마토그래피의 사용
헤파린 푸울(pool)을 여과시키고, 세라믹 수산화 인회석 HC(40 ㎛; 미국 메사츄세츠주 나틱(Natick) 소재 American International Chemical; 12 ㎖ 칼럼 부피, 1.5 ×6.8 ㎝) 칼럼에 직접 가하여 pH 6.0의 1 mM 인산 나트륨(완충제 D) 중에 평형이 되도록 하였다. 직렬형 UV(280 nm)와 전도도 모니터가 장착된 혼성 Gradi-Frac/FPLC시스템(스웨덴 우프살라 소재 파마시아) 상에서, 실온에서 크로마토그래피를 수행하였다. 시료를 가한 후(5 ㎖/분), 10 칼럼 부피의 완충제 D로 칼럼을 세척하였다. 42% 완충제 E/58% 완충제 D(여기서, 완충제 E는 pH 6.0의 250 mM 인산 나트륨이다)에 대한 7칼럼 부피의 선형 구배로, 이어서 52% 완충제 E에 대한 10 칼럼 부피의 선형 구배로 α-Gal A를 용리시켰다. α-Gal A 활성에 대한 분획 분석을 하고, 평가 가능한 효소 활성을 갖는 분획을 집결시켰다.
D. α-Gal A 정제 단계로서 Q 세파로스 음이온 교환 크로마토그래피의 사용
실온에서 최종 전도도가 3.4-3.6 mMHO이 되도록 H2O로 수산화인회석 푸울을약 1.5배 희석시켰다. 여과 후, 시료를 Q 세파로스HP(스웨덴 우프살라 소재 파마시아; 5.1 ㎖ 칼럼 부피, 1.5 ×2.9 ㎝) 칼럼에 가하여 10% 완충제 G/90% 완충제 F(여기서, 완충제 F는 pH 6.0의 25 M 인산 나트륨이고, 완충제 G는 250 mM NaCl을 함유하는 pH 6.0의 25 mM 인산 나트륨, ) 중에 평형이 되도록 하였다. Gradi-Frac/FPLC혼성 시스템(스웨덴 우프살라 소재 파마시아) 상에서, 실온에서 크로마토그래피를 수행하고, 직렬형 모니터에 의해 총 단백질 및 염 농도를 검측하였다. 5 ㎖/분의 유속으로 시료를 가한 후, 하기 단계를 수행하였다: (1) 10% 완충제 G로 5 칼럼 부피 세척; (2) 12% 완충제 G로 7 칼럼 부피 세척; (3) 50% 완충제 G에 대한 3 칼럼 부피의 선형 구배로 세척; (4) 53% 완충제 G에 대한 10 칼럼 부피의 선형 구배로 세척; (5) 100% 완충제 G에 대한 3 칼럼 부피의 선형 구배로 세척; 및 (6) 100% 완충제 G로 10 칼럼 부피 세척. 우선, 단계 3 및 단계 4의 기간 동안 α-Gal A를 용리시켰다. 평가 가능한 활성을 갖는 분획을 집결시켰다("Q" 푸울).
E. α-Gal A 정제 단계로서 수퍼덱스 - 200 겔 여과 크로마토그래피의 사용
센트리프레프-10 원심분리 농축기 유닛(미국 메사츄세츠주 베버리 소재 아미콘)을 사용하여 Q 푸울을 약 5배 농축시키고, 수퍼덱스-200 칼럼(스웨덴 우프살라 소재 파마시아; 189 ㎖ 칼럼 부피, 1.6 ×94 ㎝)에 가하였다. 칼럼을 평형시키고, 150 mM NaCl을 함유하는 pH 6.0의 25 mM 인산 나트륨으로 용리시켰다. 실온에서, 직렬형 UV 모니터(280 nm)를 사용하는 FPLC시스템(스웨덴 우프살라 소재 파마시아) 상에서 크로마토그래피를 수행하고, 이어서 단백질의 용리를 수행하였다. 칼럼에 가한 시료의 부피는 ≤2 ㎖이고, 유속은 0.5 ㎖/분이며, 분획 크기는 2 ㎖이다. 다중 칼럼 작업(multiple column runs)을 수행하였다; α-Gal A 활성에 대한 분획 분석을 하고, 평가 가능한 효소 활성을 갖는 분획을 집결시켰다.
센트리프레프 10 유닛을 사용하여 수퍼덱스-200 칼럼으로부터 집결된 분획을 농축시키고, 일정 분량으로 분취하며, 급냉시키고, 짧은 기간 동안 -80 ℃에서 저장하였다. 이러한 α-Gal A 정제 실시예의 개요는 표 5에 나타나 있다. α-Gal A의 최종 수득율은 출발 물질 활성의 59%이고, 정제된 생성물의 비(比) 활성은 2.92 ×106단위/㎎ 단백질이었다. 그 결과로 생성된 생성물은, 연이어 은 착색된 4-15% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 환원 조건 하에 전기영동 후 높은 수준의 순도를 나타내었다.
요약
정제 공정은 고도로 정제된 α-Gal A를 제공한다. 대부분의 정제는 공정 중 첫번째 2 단계에서 일어나는 반면에, 최종 세 공정은 잔존하는 소수의 불순물을 제거함으로써 재료를 연마하는 역할을 한다. 또한, 마지막 단계, 즉 수퍼덱스-200 상에서의 크기별 배제 크로마토그래피도 α-Gal A를 제제 상용성(formulation-compatible) 완충제로 교환하는 역할을 한다.
2.2 배양 내에 안정하게 형질감염된 인간 세포에 의해 생산된 α-Gal A의 크기
정제된 α-Gal A의 구조적, 기능적 특성을 조사하였다. 그 결과로 생성된 생성물은, 연이어 은 착색된 4-15% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 환원 조건 하에 전기영동 후 높은 수준의 순도를 나타내었다.
MALDI-TOF 질량 분석법에 의해 α-Gal A의 분자량을 측정하였다. 그 결과는, 이합체의 분자량은 102,353 Da인 반면에, 단량체의 분자량은 51,002 Da임을 입증한다. 아미노산 조성물에 기초하여 예상되는 단량체의 분자량은 45,400 Da이다. 따라서, 효소의 탄수화물 함량은 최대 5,600 Da의 분자량임을 밝힌다.
2.3 안정하게 형질감염된 인간 세포에 의해 생산된 α-Gal A의 탄수화물 변경
또한, 본 발명에 따라서 생산된 α-Gal A의 글리코실화 패턴을 검사하였다. 적당한 글리코실화는 α-Gal A의 최적의 생체내 활성을 위해 중요하다; 비(非)글리코실화 시스템에 의해 발현된 α-Gal A은 불활성이거나 불안정하다. Hantzopolous 등, Gene 57: 159(1987). 또한, 글리코실화는 α-Gal A의 바람직한 표적 세포로의 내재화(internalizaton)를 위해 중요하고, 생체내 효소의 순환 반감기에 영향을 미친다. α-Gal A의 각각의 서브유닛 상에, 아스파라긴 결합 탄수화물 사슬의 첨가에 유용한 4개의 부위가 있는데 이 중 3개 부위만을 차지한다. Desnick 등, In THE METABOLIC AND MOLECULAR BASES OF INHERITED DISEASE,(McGraw Hill, 뉴욕, 1995) pp 2741-2780.
안정하게 형질감염된 세포에 의해 생산된 α-Gal A의 시료를 에이. 우라파시엔스 (A. urafaciens)(미국 인디아나주 인디아나폴리스 소재 뵈링거 만하임)로부터 분리된 뉴라미니다제로 처리하여, 시알산을 제거하였다. 총 부피 10 ㎖의 아세테이트 완충 염수(ABS, 150 mM NaCl을 함유하는 pH 5.2의 20 mM 아세트산 나트륨) 내에 실온에서 밤새도록 10 mU의 뉴라미니다제로 5 ㎎의 α-Gal A를 처리함으로써 상기 반응을 수행하였다.
ABS(1 M Tris로 pH를 7.5로 상승)중 알칼리 포스파타제 15 U로 실온에서 밤새 α-Gal A 5 mg을 처리함으로써, 안정하게 형질감염된 세포에 의하여 생산된 정제된 α-Gal A를 알칼리 포스파타제(송아지 장의 알칼리 포스파타제, 뵈링거 만하임, 인디아나주 인디아나폴리스 소재)를 사용하여 또한 탈인산화시키켰다.
샘플을 SDS-PAGE 및/또는 등전점 전기영동한 후 항-α-Gal A-특이적 항체로 웨스턴 블로팅하여 분석하였다. 사용된 항체는 래빗의 폴리클로날 항-펩티드 항체이였고, 이것은 면역원으로서 α-Gal A의 아미노산 68-81을 나타내는 펩티드를 사용하여 생성되었다. 단백질을 PVDF(메사추세츠주 베드포드의 밀리포어)로 전이한 후, 막을 2.5% 블로토(20 mM Tris-HCl 중 탈지 건유, pH 7.5, 0.05% Tween-20)중에 1:2000 희석된 항-혈청을 사용하여 프로브하였다. 이 후, 양고추냉이 과산화제(Organo Technique/Cappella, 노스캐롤라이나주 더햄; 1:5000 희석)에 접합된 염소 항-래빗 IgG 및 ECL 화학냉광 키트(인디아나주 알링톤 하이츠의 아머샴의 시약)으로 검출하였다.
뉴라미니다제로 α-Gal A를 처리한 후 SDS-PAGE 분석에 의한 결과는 분자량의 이동(약 1500-2000 Da 또는 4-6 시알산/단량체)을 보여주었고, 이는 α-Gal A는 시알산으로 광범위하게 변형됨을 시사한다. 참고로, α-Gal A의 원형질형은 단량체당 5-6개의 시알산 잔기를 갖고, 태반형은 단량체당 0.5-1.0 시알산 잔기를 갖는다. Bishop 등, J. Biol. Chem. 256: 1307 (1981).
α-Gal A의 M6P 변형 및 시알산의 조사에 사용되는 또다른 방법은 등전점 전기영동(IEF)이었으며, 이것은 샘플을 그것의 등전점(pI) 또는 알짜 전하에 기초하여 분리하는 것이다. 따라서, α-Gal-A에서 시알산 또는 포스페이트와 같은 하전된 잔기의 제거는 IEF 시스템에서 단백질 이동능의 변형으로 예상될 수 있다.
IEF 실험을 수행하기 위하여, 본 발명에 따라 생성된 α-Gal A의 샘플은 뉴라미니다제 및/또는 알칼리 포스파타제로 처리하고, 2배 희석된 Novex 샘플 완충액으로 1:1 혼합한 후, 파말리트(Pharmalyte, 등록상표명)(스웨덴 웁살라 소재, 파마시아; pH 3.0-6.5; 파말리트 4-6.5 및 2.5-5.5, 각 겔당 0.25 ml)를 사용하여 6 M 우레아 IEF 겔(5.5% 폴리아크릴아미드)상에 적재하였다. 또한, 등전점 표준(Bio-Rad)를 포함한다. 전기영동 후에, 겔을 PVDF에 이동하고, 상술한 바와 같이 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.
효소의 뉴라미니다제 처리는 3개의 모든 이소형의 pI를 증가시키며, 이는 모두가 시알산에 의하여 어느 정도 변형됨을 시사한다. 이러한 데이터는 본원에서 설명된 바와 같이 제조된 α-Gal A 제조물이 바람직한 원형질 반감기를 갖아야 함을 제시하며, 이것은 상기 물질이 약리학적 용도에 적합함을 시사한다. 나아가, 뉴라미니다제-처리된 α-Gal A를 알칼리 포스파타제로 처리하면 일부 단백질의 pI가 약 5.0-5.1로 증가하며, 이는 효소가 하나 이상의 M6P 잔기를 보유함을 의미한다. 이러한 변형은 표적 세포에 의한 α-Gal A의 효과적 내부화에 필요하다.
α-Gal A의 N-연결된 탄수화물 쇄는 이온-교환 HPLC(Glyco-Sep C) 및 형광화합물 2-아미노벤자미드(AB)로 비환원성 말단을 표지화함으로써 분석하였다. 3개의 분리 α-Gal A 제제에서 AB-글리칸의 분석 결과는 표6에 요약되어 있다. 3개의 모든 제제는 170 이상의 Z 수를 갖는다. 추가로, 67% 이상의 글리칸은 시알화되고, 16% 이상의 글리칸은 인산화되며, 16% 이하는 중성이었다. 이러한 결과는 공지 기술에 보고된 결과에 비하여 매우 바람직한 것이었다. 예를 들면, Desnick 등(미국 특허 5,356,804)은 60% 이상의 글리칸이 중성이고 단지 11%만이 시알화되었음을 보고하였다.
GA-GAL에서 AB-글리칸의 분석 결과
처리 Z가 %중성 %모노 %디 %트리 %테트라
없음 170.04 16.83 22.8 39.45 15.34 5.58
없음 177.71 14.22 20.63 44.62 14.2 6.31
없음 171.68 15.81 20.73 43.2 14.33 5.39
평균값(n=3) 173.14 15.62 21.38 42.42 14.62 5.76
뉴라미니다제 24.36 85.52 5.14 9.61 없음 없음
알칼리 포스파타제 150.93 23.38 24.47 34.28 13.58 4.29
총 백분율 본 발명의 GA-GAL 제제 Desnick 등의 미국 특허 5,356,804
P-글리칸의 합 16.62 24.1
시알화의 합 67.57 11
중성의 합(hih-만노스 및 하이브리드) 15.62 62.9
정제된 GA-GAL 제제의 추가 상세한 특징은 표7에서 제공된다.
GA-GAL 정제된 벌크(bulk)
분석 42-173-KH 42-202-KH
특이적 활성 2.75 2.80
SDS-PAGE 쿠마씨 100% 100%
SDS-PAGE 실버 염색 99.6% 100%
역상 HPLC 100% 99.94%
크기 배제 크로마토그래피 0% 0.01%
포피 섬유아세포에 의한 내부화 123.6% 94.3%
2.4 α-Gal A 종의 분류에 의한 하전된 α-Gal A의 비율 증가
상술된 바와 같이, α-Gal A 글리코형의 분류는 본원에서 설명된 바와 같이 정제 과정중 다양한 단계에서 일어날 수 있다. 본원 실시예에서, α-Gal A 글리코형은 크기 및 전하에 의하여 분류되었다. 또한, 상술된 바와 같은 이러한 또는 기타 크로마토그래피 기법의 조합에 의하여 α-Gal A를 분류할 수 있다.
α-Gal A 글리코형의 크기 분류를 위하여, 크기 배체 크로마토그래피는 pH 6에서 포스페이트 완충된 염수중에 평형화된 등록상표명 수퍼덱스 200 컬럼(파마시아, 94.1 cm의 1.6 cm) 상에서 수행되었다. α-Gal A(1ml중 2.6 mg)을 컬럼상에 적재하고, 컬럼을 0.35 ml/분으로 용출하였다. 분별물을 용출 프로파일을 거쳐 수거하고, α-Gal A의 넓은 용출 피크를 포함하는 분별물을 SDS-PAGE로 분석하였다. 이어서 실버 염색으로 가시화하였다. 피크의 주 봉우리의 분별물은 고분자량의 α-Gal A을 포함하고, 분별물이 피크를 가로질러 이어질수록 α-Gal A의 분자량은 명백히 감소한다. α-Gal A의 분별물을 선택하고 풀화하여 원하는 분자량 범위의 α-Gal A 제제를 제공하였다.
전하에 의한 α-Gal A 글리코형의 분류를 위하여, α-Gal A를 Q-세파로스(등록상표명) 크로마토그래피에 의하여 분류하였다. Q-세파로스(등록상표명) 컬럼(9.4 cm의 1.5 cm)를 30 mM NaCl을 포함한 pH 6.0에서 20mM 나트륨 포스페이트에서 평형화하고, 유속을 5ml/분으로 유지하였다. α-Gal A(166 ml중 130 mg)을 컬럼상에 적재하고, 평형 완충액으로 세척하고 130 mM NaCl을 포함한 pH 6.0의 나트륨 포스페이트 20 mM으로 용출하였다. 더 광범위한 분류를 위하여, 평형 완충액으로부터 용출 완충액으로의 구배 용출(예, 10 컬럼 부피)을 사용할 수 있다. 분별물을 용출 프로파일을 통하여 수거하고, α-Gal A의 용출 피크를 포함하는 분별물을 SDS-PAGE에 의하여 분석한 후 실버 염색에 의하여 가시화하였다. 겔에서 관찰된 저분자량 종이 세척시 피크의 주 봉우리에서 용출되고, 고분자 글리코형은 피트의 말단을 향하여 용출된다. 저분자 종은 덜 음성으로 하전된 α-Gal A의 글리코형에 상응하고, 이것은 양으로 하전된 Q-세파로스 컬럼(4차 아민 치환된 수지로 구성됨)에 덜 강하게 결합한다. 고도의 음성 전하의 α-Gal A 종은 용출 프로파일의 후반부에서 용출되고 SDS-PAGE에 의하여 분석된 바와 같이, 고분자량을 갖는다. 전하에 의한 분류는 선택된 풀의 또는 용출된 분별물의 등전점 전기영동에 의하여 확인되었다.
따라서, 크기에 의한 분류 및 전하에 의한 분류 모두 α-Gal A의 고도로 하전된 글리코형의 선택을 가능하게 하였다.
2.5 α-Gal A 의 만노스 또는 만노스-6-포스페이트(M6P) 매개된 내부화
안정하게 형질감염된 세포에 의하여 생산된 α-Gal A가 α-Gal A 부족에 효과적인 치료제제이므로, 효소는 감염된 세포에 의하여 내부화되어야 한다. α-Gal A는 생리적 pH 수준에서, 예를 들면, 혈액 또는 간세포액중에서 활성이 최소이다. α-Gal A는 라이소좀의 산성 환경에서 내부화되는 경우에만 축적된 지질 기질에서 대사작용한다. 이러한 내부화는 M6P 수용체에 대한 α-Gal A의 결합에 의하여 매개된다. 상기 M6P 수용체는 세포 표면에서 발현되어 세포내이입 경로를 통하여 효소를 라이소좀으로 전달한다. M6P 수용체는 어디에서나 발현되고, 대부분의 체세포는 M6P를 어느 정도 발현한다. 만노스 수용체는 당단백질상에서 노출된 만노스 잔기에 특이적이고, 널리 퍼져 있지 않다. 만노스 수용체는 대식세포 및 유사 대식세포상에서만 일반적으로 발견되고, α-Gal A가 이러한 세포 유형으로 진입하는 추가적 수단을 제공한다.
α-Gal A의 M6P-매개된 내부화를 보여주기 위하여, 파브리 질병 환자(NIGMS 인간 유전자 돌연변이 세포 저장소)유래의 피부 섬유아세포를 본 발명의 정제된 α-Gal A의 농도 증가시 밤새 배양하였다. 일부 샘플은 M6P 수용체에 결합하여 내부화되는 것을 경쟁적으로 저해하는 가용성 M6P 5 mM를 함유한다. 기타 샘플은 만노스 수용체에 결합하여 내부화되는 것을 저해하는 만난 30 mg/mL을 함유한다. 항온처리후, 세포를 세척하고 세포 용균 완충액(10 mM Tris, pH 7.2, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 2 mM 상표명 페파블록(인디아나주 인디아나폴리스에 소재하는 뵈링거-만하임) 및 1 % NP040)으로 긁어 모아서 수거하였다. 이어서 용균된 샘플을 단백질 농도 및 α-Gal A 활성에 대하여 분석하였다. 결과는 α-Gal A 활성/mg 세포 단백질의 단위로 표현한다. 파브리 세포는 용도 의존적 방식으로 α-Gal A을 내부화한다. 따라서, 파브리 섬유아세포에서 α-Gal A의 내부화는 만노스 수용체에 의한 것이 아니라 M6P 수용체에 의하여 매개화된다.
또한, α-Gal A를 파브리병의 치료에 중요한 표적 세포인 내피 세포에 의해 시험관 내에서 내부화시켰다. 사람의 중앙 정맥 내피세포(HUVEC)는 7500 단위의 α-Gal A와 함께 밤새 배양하였다. 일부 웰은 M6P를 함유하였다. 배양 후, 세포를 수거하고 전술한 바와 같이 α-Gal A에 대해 분석하였다. α-Gal와 함께 배양한 세포는 효소 수준이 대조군(α-Gal A와 함께 배양하지 않은 군) 세포의 거의 10 배 이상이었다. M6P는 α-Gal A의 세포내 축적을 억제하였는데, 이것은 HUVEC에 의한 α-Gal A의 내부화가 M6P 수용체에 의해 매개된다는 것을 말해준다. 따라서, 본 발명의 인간 α-Gal A는 임상적으로 관련있는 세포에 의해 내부화된다.
만노즈 수용체를 형질발현시키는 것으로 공지된 배양된 인간 세포주는 소수에 불과하다. 그러나, 만노즈 수용체는 보유하나 M6P 수용체는 보유한다 하더라도 소수에 불과한 마우스의 마크로파지형 세포주(J774.E)는, 본 발명의 정제된 α-Gal A가 만노즈 수용체를 통해 내부화되는 지의 여부를 결정하는 데 사용할 수 있다. 디멘트 등의 문헌 [J. Leukocyte Biol. 42:485-490(1987)]을 참고한다. J774.E 세포를 10,000 단위/ml의 α-Gal A의 존재 하에 밤새 항온처리하였다. 또한, 선택된 샘플은 2 mM의 M6P를 함유하였고, 나머지 샘플은 100 mg/mL의 만난을 함유하였다. 이어서, 세포를 세정하고 전술한 바와 같이 수거하여, 각 샘플의 전체 단백질과 α-Gal A 활성을 측정하였다. M6P는 이들 세포에 의한 α-Gal A의 흡수를 억제하지 않는 한편, 만난은 축적된 α-Gal A 수준을 75%까지 저하시킨다. 따라서, 본 발명의 α-Gal A는 이 특정 세포 표면 수용체를 발현하는 세포형에서 만노즈 수용체에 의해 내부화될 수 있다.
실시예 3: 약학 제제
완충 용액 및 제제의 제조
α-Gal A 정제된 벌크를 α-Gal A 희석제를 사용하여 최종 농도로 희석시켰다. 제제화하고자 하는 정제된 벌크의 부피에 기준하여, α-Gal A(mg/ml), 및 최종 제제 중의 α-Gal A의 원하는 농도, α-Gal A 희석제의 필요량을 결정하였다. α-Gal A 희석제는 적당량의 WFI, 염화나트륨 및 1가 인산나트륨을 혼합하고, 수산화나트륨 용액을 사용하여 pH를 6.0으로 조절함으로써 24 시간의 사용 기간 내에 제조하였다. α-Gal A 희석제의 조성은 하기 표 8에 제시하였다.
α-Gal A 희석제의 조성(1 리터 당)
성분 부 수치 함량
염화나트륨(USP) 100∼1916 8.8 g
5N 수산화나트륨 200∼1903 pH가 6.0으로 조절될 정도의 적당량
1염기성 인산나트륨(USP) 100∼1913 3.5 g
주사용 물 100∼2301 총량이 1.0 L가 될 때까지적당량
1 리터 이하 부피의 α-Gal A 희석제는, 무균의 0.2 mm 나일론 필터(미국 뉴욕 로체스터 소재의 Nalge Nunc International 제품)를 사용하는 진공 여과에 의해 여과하였다. 보다 다량인 경우에는, 0.2 mm Supor(등록상표) 캡슐 필터(미국 뉴욕 포트 워싱턴 소재의 Pall 제품) 및 연동 펌프를 사용하는 정압에 의해 여과하였다. 모든 필터는 여과후 기포점 보전 시험에 가하였다. 혼합 단계 및 여과 단계는 인증된 클래스 100 래미너 플로우 후드(Class 100 laminar flow hood)에서 수행하였다. 최종 용액 1 ml 당 1 mg이 되도록 혼합 용기에서 α-Gal A 정제된 벌크에 α-Gal A 희석제를 첨가하였다. 이어서, 최종 농도가 0.02%가 되도록 적당량의 폴리솔베이트 20(Tween 20, 스펙트럼)을 첨가하였다.
실시예 4: 탈시알릴화된 탈갈락토실화 α-Gal A
α-Gal A의 생물학적 분포에 대한 글리코실화의 영향을 밝히기 위해, α-Gal A의 정제된 제제를 순차적으로 디글리코실화시킨 후, 각 형태를 마우스에게 주사하였다. 주사하고 4시간 후에 마우스의 기관을 수거하고, 조직에 대해 면역 조직학적 검사를 실시하여, 단백질의 생물학적 분포에 있어서의 가능한 변화를 육안으로 관찰하였다.
먼저, α-Gal A를 뉴라미니다아제(시알리다아제)로 처리하여 시알산 잔기를 제거함으로써, 갈라토즈부를 노출시켰다. 이 시알리다아제 처리된 일부를 β-갈락토시다아제와 더 반응시켜 갈라토즈 잔기를 제거함으로써 N-아세틸글루코사민(GlcNAC) 잔기를 노출시켰다. 이어서, N-아세틸글루코사미니다아제로 처리하여 GlcNAC를 제거함으로써, 단백질의 중심에 만노즈기를 남겼다. 미처리된 α-Gal A(대조군) 또는 처리된 형태의 단백질의 하나를 꼬리 정맥을 통해 마우스에게 주사하였다. 주사하고 4 시간 후, 마우스의 간, 비장, 심장, 신장 및 폐를 수거하고, 보정한 후, α-Gal A의 검출을 위해 면역학적으로 염색하였다.
미처리 단백질을 투여한 대조군 동물과 비교했을 때, 시알리다아제 처리된 효소(갈라토즈 잔기가 노출된 효소)를 투여한 마우스는 보다 많은 양의 α-Gal A가간에 편재하고 있으므로, 다른 검사한 기관에는 상기 효소가 보다 소량으로 존재하였다. 또한, 간의 염색 패턴이 상당히 달랐다. 대조군 동물에 있어, α-Gal A는 커퍼 세포(Kupffer cells) 및 내피 세포에 주로 편재하였으며, 단지 약간의 간세포만이 염색되었다. 시알리다아제 처리된 α-Gal A를 투여한 동물에 있어, 상기 효소는 간세포에만 편재하였으며, 이는 아시알로당단백질 수용체의 공지된 생물학적 분포와 일치하였다. 생물학적 분포에 대한 디글리코실화의 이러한 영향은, β-갈락토시다아제에 의해 갈라토즈 잔기를 제거한 경우에는 역전되었다. 갈락토즈부를 함유하지 않은 이 단백질을 투여한 마우스의 간에서 관찰된 염색 패턴은 대조군 동물의 것과 유사하였다. 대부분의 염색은 커퍼 세포 및 내피 세포에서 이루어졌으며, 간세포의 염색은 최소 수준으로 이루어졌다. N-아세틸글루코사미니다아제로 α-Gal A를 더욱 처리한 결과, β-갈락토시다아제 처리된 단백질에 대해 관찰된 염색 패턴이 변경되지는 않았으며, 즉 N-아세틸글루코사민 잔기의 제거는 α-Gal A의 생물학적 분포에 거의 영향을 미치지 않는 것으로 판단되었다.
실시예 5: α-Gal A을 형질발현하는 인간 섬유아세포에 의한 파브리 섬유아세포의 교정
유전자 치료의 경우, α-Gal A를 형성시키는 자가 세포 이식체는 표적 세포에서 α-Gal A 결핍을 "교정"하기에 적당하게 변성된 형태의 효소를 형성시켜야 한다. 형질 감염된 인간의 섬유아세포에 의한 α-Gal A 형성이 파브리 세포에 미치는 영향을 평가하기 위해, 파브리 질환 환자(NIGMS 인간 유전학 돌연변이 세포 보관소)에서 수거한 섬유아세포를 Transwells(등록상표; 미국 매사츄세츠주 캠브리지소재의 Costar 제품) 내에서 α-Gal A 형성 세포주(BRS-11)와 함께 공동 배양하였다. 파브리 세포는 12웰 조직 배양 디쉬 내에서 배양하고, 그 중 일부는 세포가 증식할 수 있는 표면을 가진 삽입체(Transwells(등룩상표), 0.4 mm의 기공크기))를 함유하였다. 삽입체의 성장 매트릭스는 다공성이므로, 거대분자를 상부 환경에서 하부 환경으로 통과시킬 수 있다. 한 세트의 삽입체는 최소 수준의 α-Gal A를 분비하는 정상의 인간 포피(HF) 섬유아세포를 함유하는 한편, 또다른 세트는 다량의 α-Gal A를 분비하는 안정하게 형질감염된 인간 섬유아세포주(BRS-11)를 함유하였다. α-Gal A 형성 세포와 공동 배양된 웰에서, α-Gal A는 파브리 세포을 둘러싸고 있는 매질 내로 유입될 수 있으며, 파브리 세포에 의해 강력하게 내부화될 수 있다.
표 9에 제시된 데이타는, 파브리 세포가 분비된 α-Gal A를 내부화시킨다는 것을 말해준다. α-Gal A의 세포내 수준은 3일 동안 관측하였다. 단독으로(삽입체 없이) 배양한 파브리 세포 또는 비형질감염된 포피 섬유아세포의 존재 하에(HF 삼입체와 함께) 배양한 파브리 세포는 매우 낮은 세포내 수준의 α-Gal 활성을 나타내 보였다. 그러나, α-Gal A 형성(BRS-11 삽입체) 세포와 배양된 파브리 세포는 2일의 종반까지 정상 세포와 유사한 효소 수준을 나타내 보였다(정상의 섬유아세포는 25∼80 단위의 α-Gal A/mg 단백질을 함유함). 교정이 M6P 수용체를 통해 흡수된 α-Gal A에 기인한 것이라는 사실은 M6P(BRS-11 삽입체 + M6P)에 의한 억제를 통해 입증된다.
α-Gal A 활성을 형질발현하는 인간 섬유아세포에 의한 파브리 섬유아세포의 교정
시간 삽입체 부재 HF 삽입체 BRS-11 삽입체 BRS-11 삽입체 + M6P
1일째 2 ±1 2 ±1 13 ±1 4 ±1
2일째 2 ±1 2 ±1 40 ±1 6 ±2
3일째 2 ±1 5 ±1 85 ±1 9 ±1
전술한 설명은 단지 예시를 위해 제시한 것으로, 개시한 정확한 형태에 본 발명을 국한시키고자 하는 것은 아니며, 본 발명은 첨부한 청구 범위에 의해 제한된다. 명세서 및 첨부한 청구 범위에서, 특별한 지시가 없는 한 단수 형태는 복수를 포함하는 것이다. 본 명세서에 인용된 모든 특허 빛 공보는 참고로 인용한 것이다.

Claims (34)

  1. SDS-PAGE 또는 역상 HPLC로 측정시 99.5% 이상의 균질성으로 정제된 인간 α-Gal A 제제를 포함하는 조성물로서, 상기 제제는 각종 α-Gal A 당형태(glycoform)를 포함하고, 특이적 활성이 단백질 1 ㎎당 3.0 ×106단위 이상이며, 실질적으로 렉틴이 없는 것이 특징인 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 α-Gal A 당형태 중 올리고당의 35% 이상이 하전되는 것이 특징인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 α-Gal A 당형태 중 올리고당의 전하량이 Z가(Z number)로 측정시 150 이상인 것이 특징인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 α-Gal A 당형태 중 총 글리칸의 60% 이상이 시알릴화된 것이 특징인 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 제제는 순환 반감기가 연장된 것이 특징인 조성물.
  6. 각종 α-Gal A 당형태를 포함하는 정제된 α-Gal A 제제를 생성하는 방법에 있어서,
    (a) 평형 완충액 중 산성 pH에서 α-Gal A 당형태를 양이온 교환 수지에 결합시키는 단계,
    (b) 상기 평형 완충액으로 상기 수지를 세척하여 비결합된 물질을 용출시키는 단계, 및
    (c) 10∼100 mM의 염용액, pH 4∼5의 완충 용액 및 이의 조합물로 구성된 군에서 선택된 용출액을 사용하여 상기 α-Gal A 당형태를 용출시키는 단계를 포함하고, 상기 α-Gal A 제제는 99.5% 이상의 균질성으로 정제되고, 실질적으로 렉틴이 없는 것이 특징인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 크로마토포커싱 크로마토그래피, 금속 킬레이트 친화도 크로마토그래피 및 면역친화도 크로마토그래피로 구성된 군에서 선택된 정제 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 방법.
  8. 제6항에 기재된 방법으로 생성되고 99.5% 이상의 균질성으로 정제된 각종 α-Gal A 당형태를 포함하는 α-Gal A 제제.
  9. 올리고당 전하량이 증가된 글리코실화된 α-Gal A 제제를 생성하는 방법에 있어서,
    (a) 발현시 GlcNAc 트랜스퍼라제 III(GnT-III)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 α-Gal A 생산 세포내로 도입하거나, 또는 내인성 GnT-III 유전자의 발현을조절하는 조절 서열을 상동성 재조합으로 도입하는 단계;
    (b) α-Gal A 및 GnT-III의 발현을 산출하는 배양 조건하에서 상기 α-Gal A 생산 세포를 배양하는 단계; 및
    (c) α-Gal A를 분리하는 단계를 포함하고, 상기 α-Gal A 제제는 상기 폴리뉴클레오티드 없이 세포로부터 생성된 α-Gal A와 비교하여 올리고당 전하량이 증가된 것이 특징인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 α-Gal A 제제 중 올리고당의 35% 이상이 하전되는 것이 특징인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 α-Gal A 제제는 2∼4개의 시알산 잔기를 갖는 20% 이상의 복합 글리칸을 포함하는 복수의 당형태를 포함하는 것이 특징인 방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 α-Gal A 제제의 올리고당 전하량은 Z가로 측정시 150 이상인 것이 특징인 방법.
  13. 제9항에 있어서, 상기 제제는 평균 25∼50% 이상 인산화된 복수의 당형태를 포함하는 것이 특징인 방법.
  14. 제9항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 개시된 방법으로 생성되고, 올리고당 전하량이 증가된 글리코실화된 α-Gal A 제제.
  15. 올리고당 전하량이 증가된 글리코실화된 α-Gal A 제제를 생성하는 방법에 있어서,
    (a) 발현시 시알릴 트랜스퍼라제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 α-Gal A 생산 세포내로 도입하거나, 또는 내인성 시알릴 트랜스퍼라제의 발현을 조절하는 조절 서열을 상동성 재조합으로 도입하는 단계;
    (b) α-Gal A 및 시알릴 트랜스퍼라제의 발현을 산출하는 배양 조건하에서 상기 α-Gal A 생산 세포를 배양하는 단계; 및
    (c) α-Gal A를 분리하는 단계를 포함하고, 상기 α-Gal A 제제는 상기 폴리뉴클레오티드 없이 세포에서 생성된 α-Gal A와 비교하여 올리고당 전하량이 증가된 것이 특징인 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    (d) 단계 (c)의 제제의 분류 또는 정제로 크기가 증가되거나 전하량이 증가된 α-Gal A 당형태를 선별하는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 기재된 방법으로 생성되고 올리고당 전하량이 증가된 글리코실화된 α-Gal A 제제.
  18. 시알릴화가 증가된 글리코실화된 α-Gal A 제제를 생성하는 방법에 있어서, 암모늄 농도가 10 mM 이하인 배양 배지와 α-Gal A 생산 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 것이 특징인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 접촉 단계가 상기 α-Gal A 생산 세포를 새로운 배양 배지로 연속적으로 또는 간헐적으로 관류시켜 암모늄 농도를 10 mM 이하로 유지하는 것을 포함하는 것이 특징인 방법.
  20. 인산화가 증가된 글리코실화된 α-Gal A 제제를 생성하는 방법에 있어서,
    (a) 발현시 포스포릴 트랜스퍼라제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 α-Gal A 생산 세포내로 도입하거나, 또는 내인성 포스포릴 트랜스퍼라제의 발현을 조절하는 조절 서열을 상동성 재조합으로 도입하는 단계;
    (b) α-Gal A 및 포스포릴 트랜스퍼라제의 발현을 산출하는 배양 조건하에서 상기 α-Gal A 생산 세포를 배양하는 단계; 및
    (c) α-Gal A를 분리하는 단계를 포함하고, 상기 α-Gal A 제제는 상기 폴리뉴클레오티드 없이 세포에서 생성된 α-Gal A와 비교하여 인산화가 증가된 것이 특징인 방법.
  21. 제20항에 기재된 방법으로 생성되고 인산화가 증가된 글리코실화된 α-Gal A 제제.
  22. 올리고당 사슬 상에 시알산 및 말단 갈락토스 잔기의 수가 감소된 글리코실화된 α-Gal A 제제를 생성하는 방법에 있어서,
    (a) α-Gal A를 뉴라미니다제(시알리다제)와 접촉시켜 시알산 잔기를 제거하여, 말단의 갈락토스 부분을 노출시키는 단계; 및
    (b) 단계 (a)의 탈시알릴화된 α-Gal A를 β-갈락토시다제와 접촉시켜 말단 갈락토스 잔기를 제거하는 단계를 포함하고, 단계 (b)의 탈시알릴화되고 탈갈락토실화된 α-Gal A 생성물은 접촉되지 않은 α-Gal A 유래의 α-Gal A와 비교하여 올리고당 사슬 상의 말단 시알산 또는 갈락토스 잔기의 수가 감소되는 것이 특징인 방법.
  23. 올리고당 사슬 상에 말단 갈락토스 잔기의 수가 감소된 글리코실화된 α-Gal A를 생성하는 방법에 있어서, α-Gal A를 β-갈락토시다제와 접촉시켜 말단 갈락토스 잔기를 제거하는 단계를 포함하며, 생성물은 접촉하지 않은 α-Gal A 유래의 α-Gal A와 비교하여 올리고당 사슬 상의 말단 갈락토스 잔기의 수가 감소되는 것이 특징인 방법.
  24. 제23항에 기재된 방법으로 제조한 탈갈락토실화된 α-Gal A 제제.
  25. α-Gal A 제제를 0.05∼5.0 ㎎의 1주 또는 격주 단위 용량으로 투여하기 위한 약제의 제조에 있어서 α-Gal A 제제의 용도.
  26. 제25항에 있어서, 상기 약제는 피험체의 체중 1 kg당 상기 α-Gal A 제제를 약 0.2 ㎎의 1주 또는 격주 단위 용량으로 투여하기 위한 것이 특징인 용도.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 용량은 근육내, 경구, 직장, 피하, 동맥내, 복강내, 대뇌내, 비강내, 초내, 경점막, 경피 또는 흡입을 통해 투여하기 위해 배합되는 것이 특징인 용도.
  28. 피험체의 체중 1 kg당 상기 α-Gal A 제제를 0.01∼10 ㎎의 1주 또는 격주 단위 용량으로 피하 투여하기 위한 약제의 제조에 있어서 α-Gal A 제제의 용도.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 용량은 펌프 전달, 캡슐화 세포 전달, 리포좀 전달, 바늘 전달 주사, 무바늘 주사, 분무기, 연무기, 일렉트로포레이션 및 경피 패치로 구성된 군에서 선택된 전달계를 사용하여 투여하기 위해 배합되는 것이 특징인 용도.
  30. 파브리병을 치료하기 위한 약제의 제조시 α-Gal A 제제의 용도로서, 상기 약제는 피험체 체중 1 kg당 상기 α-Gal A 제제 0.01∼10 ㎎을 1주 또는 격주 단위 용량으로 투여하기 위한 것이 특징인 용도.
  31. 제30항에 있어서, 상기 약제가 피하 투여용으로 배합되는 것이 특징인 용도.
  32. 파브리병의 비전형적인 변이를 치료하기 위한 약제의 제조시 α-Gal A 제제의 용도로서, 상기 약제는 피험체 체중 1 kg당 상기 α-Gal A 제제 0.05∼5.0 ㎎을 1주 또는 격주 단위 용량으로 투여하기 위한 것이 특징인 용도.
  33. 제32항에 있어서, 환자가 심혈관 이상을 앓고 있는 것이 특징인 용도.
  34. 제33항에 있어서, 상기 심혈관 이상은 좌심실 이상 비대증(LVH)인 것이 특징인 용도.
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