HU228743B1 - Treatment of alpha-galactosidase a deficiency - Google Patents

Treatment of alpha-galactosidase a deficiency Download PDF

Info

Publication number
HU228743B1
HU228743B1 HU0200467A HUP0200467A HU228743B1 HU 228743 B1 HU228743 B1 HU 228743B1 HU 0200467 A HU0200467 A HU 0200467A HU P0200467 A HUP0200467 A HU P0200467A HU 228743 B1 HU228743 B1 HU 228743B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
galactosidase
alpha
composition
human
protein
Prior art date
Application number
HU0200467A
Other languages
English (en)
Inventor
Richard F Selden
Marianne Borowski
Carol M Kinoshita
Douglas A Treco
Melanie D Williams
Thomas J Schuetz
Peter F Daniel
Original Assignee
Shire Human Genetic Therapies
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=23012821&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU228743(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Shire Human Genetic Therapies filed Critical Shire Human Genetic Therapies
Publication of HUP0200467A2 publication Critical patent/HUP0200467A2/hu
Publication of HUP0200467A3 publication Critical patent/HUP0200467A3/hu
Publication of HU228743B1 publication Critical patent/HU228743B1/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2465—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on alpha-galactose-glycoside bonds, e.g. alpha-galactosidase (3.2.1.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01022—Alpha-galactosidase (3.2.1.22)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)

Description

Fabry betegség a neutrális glíl ÍCTHl katabolizmusán&k áz, ami a. különböző glikoegységeit hasítja le, A stupid, a ceramíd-trihexozid és ennek az enzim szubsztmenyezi.
az X- kromoszómához kapcsolódik, a. legtöbb Fábty-betegségben szenvedd beteg férfi, Bár meggyeitek súlyosan érintett női heterozigótákat is, a női heterozigóták gyakran tünetmentesek, vagy viszonylag enyhék a tünetei (ami lehet például a. szaruhártya jellegzetes homályossága). A Pahry-betegség egy atipikus variánsa, beleértve az alacsony reziduális alfagalaktozidáz A aktivitást, és vagy a nagyon enyhe tüneteket, vagy ** « Λ * * * azt, hogy látszólag nincsenek más, a Pabry-betegségre jellemző tünetek, korrelál a bal ventrikuláris hipertrőfiával és szívbetegséggel [Naka.no és mtsai: The New England Journal of Medicine 333, 288-293 (1995)). Az alfa-galaktozidáz A csökkenése lehet az oka az Ilyen szívrendellenességeknek.
Ά humán aJfa-galaktozidáz A~t kódoló eDNS-t és gént izolálták és szekvenálták, A humán alia-galaktozídáz A 429 aminosavboi álló polipeptid formájában expresszálódik, aminek 31
N-terminális aminosava. a.
ptid. A humán enzimet expresszáljuk arany mtsai: 5,356,804 számú
sejtekben pjesmck es Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás; íoannou és mtsai; Journal of Celi Biology 119, 1.137 (1992)) valamint rovarsejtekben [Calhoun és mtsai: WO 90/11353).
Azonban a jelenleg használt alfa-galaktozidáz A~nak korlátozott a hatékonysága. A viszonylag magas tisztaságú alfa-galaktozidáz A előállítása függ az afíinitáskromatográfia használatától, amiben léktin affinitáskromaiográfia. (konkanavalin A ÍCon Aj
Sepharose) és az alfa-galaktozidáz A-nak egy Sepharose mátrixhoz kapcsolt N-6-aminohexanoil-a~D-galaktozi.la.min. szubsztráthoz való kötődésén nratooratt nációját használjuk [Bishop és mtsai: Journal of Biological Chemístry 256, 1307-1316 (1981)). A fehéijetartalmű. lektín-aífinitás gyanták és a szubsztrát analóg gyanták használata tipikus esetben együtt jár az affinitás ágensnek a szilárd hordozóról való folyamatos leválásával (Marikar és mtsai: Analytical Biochemistry 201, 306-310 (1992)), ami a tisztított terméknek vagy oldatban szabadon levő vagy az eiuáit fehérjéhez kötött affinitás-ágenssel való szennyeződését eredményezi, Az ilyen szennyezések a terméket alkalmatlanná teszik gyógyászati készítményekben való felhasználásra. A megkötött szubsztrát analógok és a lektinek szintén jelentős negatív hatással vannak a fehérjék enzimatikus, funkcionális és strukturális tulajdonságaira, Emellett, a korábbi szakirodalom szerinti módszerekkel előállított, alfa-galaktozidáz A-t a máj gyorsan kiüríti.
Tehát a szakterületen megmaradt az igény egy olyan tisztítási protokollra, amiben hagyományos kromatográfiás gyantákat használnak, amik könnyen beszerezhetők kereskedelmi mennyiségű anyag előállításához szükséges mennyiségben és minőségben, és olyan alfa-galaktozidáz A készítményt eredményeznek, amik mentesek az affinitás ágensektől. Emellett a szakterületen megmaradt az igény olyan alfa-galaktozidáz A készítményekre, amiknek megnőtt keringési felezési idejük, és megnőtt a felvételük a májtól eltérő specifikus szövetekben.
A jelen találmány tárgyát erősen tisztított alfa-galaktozidáz A készítmények., valamint az alfa-galaktozidáz A gltkoformok tisztításának különböző módszerei képezik. A találmány tárgyát képezik továbbá olyan alfa-gala amiknek megváltozott a töltésük, v;
képezik ezeknek a készítményeknek az előállítási módszerei. A töltés megváltoztatását úgy érjük él, hogy megnöveljük az alfagalaktozidáz A. szíálsav tartalmát, és/ vágj? lokozzuk az alfa-galaktozidáz A foszforílezését, A találmány tárgyát képezik továbbá az olyan alfa
amiknek megnőtt a keringési felezési idejük emlős gazdaszervezetben, valamint ezek előállítási módszerei. Végezetül, a jelen találmány tárgyát képezik az alfa-galaktozidáz A készítménynek egy alanyba való beadásához szükséges módszerek és dózisok. A jelen találmány szerinti alfa-galaktozidáz A készítmények jól használhatók lesznek Fabry-betegségben szenvedő emberek kezelésére, vagy a Fábrybetegség atípusos formáiban, azaz például a Fabry betegek főleg kardiovaszkuláris abnormaliiásban, mint például ventrikuláris· nagyobbodásban, úgymint baloldali ventrikuláris hípertrőfiában (LVH), és/vagy mátráks billentyű-elégtelenségben szenvedő specifikus populációiban, vagy azoknál a Fabry betegeknél, akiknek főleg a veséjével van probléma.
Az 1. ábrán egy alfa-g£ nuaz
-nek humán fibroblaszt cDNS könyvtárból való izolálására használt 210 bázispár méretű próba (1. számú szekvencia) látható. Ez a szekvencia az alfa-galaktozidáz A gén 7-es exonjából származik. A próbát humán genomíális DNS-ből izoláljuk polimeráz láncreakcióval (PCR). Az ábrán aláhúzott régiók megfelelnek az amplifikáeiős primerek szekvenciáinak.
A 2. ábrán annak a DNS fragm.ensn.ek a szekvenciája látható, ami kiegészíti az aífá-gala.ktozidáz A cDNS klón 5 végét (2. számú szekvencia). Ezt a fragmenst humán genomíális DNS-ből izoláljuk polimeráz láncreakcióval. Az ábrán aláhúzott régiók megfelelnek az ampiiükációs primerek szekvenciáinak. Az alábbi,
1. példában ismertetett szubklőnozáshoz használt Ncol és Sacll restrikciós endonukleáz hasítási helyek pozícióit is megmutatjuk.
* ΦΧ
A 3. ábra az tatjuk be, beleértve a számú szekvencia).
A 4, ábra a pXAG-16, konstrukció sematikus térképe, ami tartalmazza a CMV (cit.om.e-galovírus) promoterét, az l-es exont és az 1, intront, a hGH szignálpeptidet kódoló szekvenciát és az első intront, az alfa-galaktozídáz A cDNS-ét (amiből hiányzik az alfa-galaktozidáz A szignálpeptid szekvencia), és a. hGH 3“ UTS-ét. A peDNeo a peDNeo génből származó neo gén pozícióját mutatja.
Az 5. ábra. a pXAG-28, egy alfa-galaktozidáz A expresszlós konstrukció sematikus térképe, ami tartalmazza a kollagén 1α2 promofcert és az első exont, az alfa-galaktozidáz A cDHS-t (?
t ffiU5 szekvenciát is (3.
az a eptid szekvencia), és a hGH 3' UTS-ét. A peDNeo a peDNeo génből származó neo gén poA 6. ábrán a humán altá-galaktozidáz A aminosav szekvenciát mutatjuk be (4. számú szekvencia).
A 7. ábrán a humán allá-galaktozidáz A. aminosav szekvenciáját mutatjuk be (szignálpeptid nélkül) (5. számú szekvencia).
A 8. ábra az alfa-galaktozidáz A tisztítási lépésének egy kromatogramja, amihez Bnlyl Sephárosé gyantát használunk. A kiválasztott frakciók .280 nm-en mért elnyelését (folyamatos vonal) és alfa-galaktozidáz A aktivitását (pont-vonal) mutatjuk: be.
A 9. ábra a pGA213C sematikus térképe.
A 10. ábra a célzó konstrukció, a pGA213C és az endogén homológ rekombinációjának diagramalfa-galaktozidáz A matikus reprezentációja. A pGA213C-t úgy ábrázoljuk, mint a célzó szekvenciák egymáshoz. illesztését az X-kromoszóma. alfagalaktozidáz A fókusz megfelelő szekvenciái felett, A mctionin ínicíáeids ködont, az ATG-t számokkal jelezzük a lineáris térképek felett. A rágcsáló dihidrofolát-reduktázt, bakteriális neomicin rezisztenciát és citomegalovirus promoter/aldoláz intron szekvenciákat tartalmazó aktiváló egységeket a fölött a pozíció fölött (-221) ábrázoljuk, amikbe a DNS klónozással beépítjük őket. Az alfa-galaktozidáz A kódoló szekvenciát sznrkített négyszögekkel jelöljük. A nem-alfa-galaktozídáz A-t kódoló genomiálís szekvenciákat halványan szürkitett négyszögekkel jelezzük. A nagy nyilak a dihidrofolát-reduktáz és neomicin-rezisztencia expressziós kazetták transzkripciójának irányát mutatják, GA-GAL mRNS illesztését a sikeres célzás és génaktiválás után szaggatott vonallal jelezzük az aktivált alfa-galaktozidáz A (GA-GAL) lőkusz nyék, valamint ezek előállítási eljárásai képezik, valamint a Fabry-betegségben vagy az aiipusos Fabry-betegségben. szenvedő betegek kezelési eljárásai képezik, amikben ezeket a készítményeket használják. Néhány reprezentatív megvalósítási módot az alábbiakban részletesebben összefoglalunk, ismertetünk.
A jelen találmányban bármilyen sejtben (egy alfa-galaktozidáz A-t termelő sejtben) előállított alfa-galaktozidáz A-t használunk a Fabry-betegség kezelésére. Egy előnyben részesített megvalósításit mód szerint a jelen találmány standard génsebészeti technikákkal (amik azon alapulnak, hogy a klónozott alfa-galaktozidáz A gént vagy oDNS-t bejuttatjuk egy gazdasejtbe), vagy génaktiválással előállított humán alfe-galaktozidáz A~t hasznáA jelen találmány tárgyát olyan készítmények, valamint ezek előállítási eljárásai képezik, amik a. korábban ismertnél tisztább alfa-galaktozádáz A készítményt tartalmaznak . A jelen találmány szerinti tisztítási módszerek alkalmazásával a humán alfa-galaktozidáz A készítmények összetételeit előnyösen legalább 98%-os homogenitásig tisztítjuk, még előnyösebben 99%~os homogenitásig, és legelőnyösebben legalább 99,S%-os homogenitásig, 8D8-PAGE vagy fordított fázisú HPLC mérések alapján. A jelen találmány szerinti alfa-galaktozídáz A készítmények specifikus aktivitása előnyösen legalább 2,0*106 egység/fehérje, még előnyösebben legalább 3,0*10 egység/fehérje, és legelőnyösebben legalább 3,5*106 egység/fehérje.
Az egyik megvalósítási mód szerint, az alfa-galaktozídáz A készítményt úgy állítjuk elő, hogy az alfa-galaktozídáz A különböző glikoíormáit egy hidrofőb kölcsönhatást használd gyantán elválasztjuk a többi komponenstől, de nem tartozik ide a lektin kromatográfiás lépés, Egy előnyben részesített megvalósítási mód szerint a hidrofőb kölcsönhatáson alapuló gyanta funkcionális őségé tartalmaz egy butilcsoportot.
Egy alternatív megvalósítási mód szerint az alfa-galaktozidáz A készítményt úgy tisztítjuk meg, tosádáz A különböző glikoíormáit egy őszi lő gyantához kötjük, savas pH~jű ekviliferálo először az alfa-galaf
pót az ekvilibrálő pufíerrel mossuk, hogy eluáljuk a megkótetlen anyagot, majd az alfa-galaktozidáz A különböző glíkoforrnáit eluáljuk, ehhez egy eluáló oldatot használunk, ami. lehet 10-1ÖÖ mmol/1 koncentrációjú sóoldat, pH~4~5 savasságú pufíeroldat, vagy ezek kombinációja. Egy előnyben részesített megvalósítási mód szerint az ekvilibrálő pufíér pH-ja körülbelül 4,4.
Bgy másik alternatív megvalósítási mód szerint az .alfa-ga~ laktozidáz A készítményt úgy tisztítjuk meg, hogy egy mintában az alfa-galaktozidáz A különböző glíkoforrnáit elválasztjuk a minta, többi komponensétől, olyan tisztítási eljárást használva, ami legalább egy kromatofókuszálö kromatográfíát, fémkelát aífí · nitási kromatográfíát, vagy immunsffinitási kromatográfíát tartalmaz tisztítási eljárásként,
A jelen találmány tárgyát képezik továbbá az olyan alfa-gaszítményeknek az előállítási eljárásai., amiknek megváltozott a töltése. A készítmények tartalmazhatják az alfa-galaktozidáz A különböző glíkoforrnáit is. A töltés megváltoztatását úgy érhetjük el, hogy megnöveljük az alfa-galaktozidáz A készítmények száálsav-tartalmát, és/vagy megnöveljük az alfa-galaktozidáz A készítmények foszforilezettségét.
Az alfa-galakrtozidáz A készítmények szíálsav-tartalmát a következőképpen növelhetjük: i): a tisztítási eljárás során vagy után izoláljuk az erősen töltött és/vagy magas molekulatömege alfa-galaktozidáz A glikoformákat; ii) a szialil-transzferáz gén vagy cDNS expresszálása céljából genetikailag módosított sejtek (amiket vágy hagyományos génsebészeti eljárással, vagy génakti9
válással módosítottunk) használatával sziálsav csoportokat adunk a molekulához; vagy íii) az enzimet expresszáló sejteket fermentáljuk vagy szaporítjuk, alacsony ammóniám-szintű környezetben.
növeljük, hogy i) a foszforil-tran&zferáz gén vagy cDNS expresszálása céljából genetikailag módosított sejtek (amiket vagy hagyományos génsebészeti eljárással, vagy génaktiválással módosítottunk) használatával foszfátcsoportokat adunk a molekulához; -vagy ri.) a tenyésztett sejtekhez foszfatáz-inhibitorokat adunk.
A jelen találmány szerinti módszerek alkalmazásával glikozilezett. humán alfa-galaktozidáz A készítményeket kapunk,, amikben az olígoszacharidok 35-85%-a töltött. Egy előnyben részesített megvalósítási mód szerint az oligoszacharidoknak legalább 35%-a töltött. Egy még inkább előnyben részesített megva.lösításí mód szerint az oligoszacharidoknak legalább SÖ%~a töltött.
Az alternatív, előnyben részesített humán glikozílezett alfagal&ktozidáz A készítmények több alfa-galaktozidáz A glikoformáálább 50%-a, és legelőnyösebben legalább 70%-a 2-4 sziálsav csoportot tartalmazó komplex gltkán, Bgv alternatív, előnyben részesített megvalósítási mód szerint a több glikoíormáből álló humán glikozílezett alfa-galaktozidáz A készítmények oligoszacharid töltéssel rendelkeznek, amit egy 100-nál nagyobb Z számmal merünk, ami előnyösen 150-nél nagyobb, még előnyösebben * ♦
ÍO
170-nél is nagyobb. .Egy másik, előnyben részesített si mód szerint a több glíkoformából álló humán glíkozilezett alfagalaktozidáz A készítmények legalább 16-50%, előnyösen 255036, még előnyösebben legalább 30% foszforilezett glíkoformát tartalmaznak. Egy alternatív megvalósítási mód szerint a több glíkoformát tartalmazó készítményekben az őssz-glxkánnak 5075%-a, előnyösen 60%-a szializálva van.
A jelen találmány egyik megvalósítási módja szerint a megnövelt olígoszacharid töltésű glíkozilezett alfa-galaktozidáz A készítményt ügy állítjuk elő, hogy először bejuttatunk egy GlcNac transzferáz lli-at (GnT-ΙΠ) kódoló polínukieotidot egy alfa-galaktozídáz A-t termelő sejtbe, vagy homológ rekombinációval egy szabályozó-szekvenciát juttatunk be, ami szabályozza egy endogén GnT-flI gén expressziöját, Az alfa-galaktozidáz A-t termelő sejtet azután, olyan, körülmények között tenyésztjük, ami az álfa-galaktozidáz A és a. GnT-Ilí expresszi-óját eredményezi. A végső lépés azután abból áll, hogy az alfa-galaktozidáz A készítmény megnöA jelen találmány egy alternatív megvalósítási módja szerint megnövekedett olígoszacharid töltéssel rendelkező glíkozilezett alfa-galaktozidáz A készítményt úgy állítunk, elő. hogy először egy szialil-transzférázt kódoló poünukleotidot juttatónk be egy alfagalaktozidáz A-t termelő sejtbe, vagy homológ rekombinációval egy szabályozó-szekvenciát juttatunk be, ami szabályozza egy endogén sziaül-transzferáz gén expressziöját. Az alfa-galaktozidáz
A-t termelő sejtet azután olyan körülmények között tenyésztjük, ami az alía-galaktozidáz A és a szíalil-franszferáz expressziöját r»· eredményezi. A végső lépés az, hogy izoláljuk a megnövekedőit oügoszacharid töltéssel rendelkező alfa-galaktozidáz A készítményt. Az előnyben részesített sMahl-transzferáz tartalmaz egy a 2,3-szialil-trarisxferázt és egy a2,ó-sziahl-transzferázt. Egy előnyben részesített megvalósítási. mód szerint ez a lépés tartalmaz még egy további lépést, amiben a készítmény frakcíonálásáv&l vagy tisztításával megnőtt méretű vagy a. töltésű alfa-galaktozidáz A glíkoformákat szelektálunk.
Egy másik megvalósítási mód szerint egy erősebben szializálődott glikozílezett. alfa-galaktoádáz A készítményt ügy állítunk elő, hogy egy alfa-galaktozidáz A~t termelő sejtet érintkezésbe hozunk egy 10 mmol/l-nél, vagy előnyösebben 2 mmol/l-nél kisebb koncentrációjú ammöniumot tartalmazó tenyésztő táptalajjal. Egy előnyben részesített megvalósítási mód szerint az alacsony ammőnium -koncentrációjú környezetet úgy érjük el, hogy glntamín-színtetázt adunk a tenyésztő táptalajhoz. Egy alternatív, előnyben részesített megvalósítási mód szerint az alacsony ammőnium.-koncentrációt úgy érjük el, hogy az alfa-galaktozidáz A-t termelő sejtet folyamatosan vagy megszakításokkal periűndáltatjuk friss tenyésztő táptalaj, hogy az ammőnium-koncentrációt 10 mmol/l.j előnyösebben 2 mmol/1 alatt, tartsuk.
Egy további megvalósítási. mód szerint egy erősebben foszforilezett alfa-galaktozidáz A készítményt ügy állítunk elő, hogy először egy alfa-galaktozidáz A~t termelő sejtbe egy foszforil·· transzferált. kódoló polinukleofidot juttatunk be, vagy homológ rekombinációval egy szabályozó-szekvenciát juttatunk be, ami szabályozza egy endogén foszforil-transzferáz gén expresszíóját.
♦ X « * * « ±49* Φ * » »·»
Az alfa-galaktozidáz A-t elő sejtet, azután, olyan, körülmények között tenyésztjük, amik az alfa-galaktoddáz A és a foszforiltranszferáz expressziöját eredményezik. Ezután izoláljuk a polínukleotid nélküli sejtben előállított atfá-gaíaktozidáz A~hoz viszonyítva erősebben foszforilezett alfa-galaktozidáz A készítményt. Egy előnyben részesített megvalósítási mód szerint a jelen találmány szerinti eljárásokkal előállított alfa-galaktozidáz A készítmények több glikoformát tartalmaznak, és a. glikoformák 1650%-a, előnyösen 25-SG%~a> még előnyösebben legalább 3'0%-a foszfcrilezve van. Egy előnyben részesített, megvalósítási mód szerint ez a módszer magában foglal egy további lépést, amivel a készítmény frakcionáiásával vagy tisztításával ki lehet választani a megnőtt méretű vagy megnőtt töltésű alfa-galaktozidáz A glíkoEgy további megvalósítási mód szerint egy erősebben fcszforílezetL glikozilezett alfa-galaktozidáz A készítményt úgy kapunk meg, hogy egy foszfetáz-ínhíbítort, azaz például brómtetramizolt adunk a tenyésztett sejtekhez. A szarvasmarha plazma alkalikus foszfatáz alacsony szintje lehet jelen egy bogúmagzat szérumban, amit a tenyésztett sejtek szaporításához adalékanyagként, használhatunk. Ez felveti annak a lehetőségét, hogy a szekretált alfagalaktozidáz A-n levő exponált Mau-6-Ρ lehet a szérum, alkalikus
A brómtetramizolról kimutatták, hogy az alkalikus foszfatáz hatásos inhibitora; Ki~2.,8 mmol/1 fMetaye és fsai: Biocbem. Pharmacol. 15, 4263-4268 (1988)j, És a teljes gátlást 0,1 mmol/1 koncentrációnál lehet elérni íBorgers Thone: Hístochemistrv
A 9-9
44, 277-280 (1975)]. Ennek következtében az egyik megvalósítási mód szerint egy fosriatáz-inhíbítor, azaz például brőmtetr-amizol adható a tenyésztett sejtekhez, hogy maximalizáljuk a tenyésztő közegben levő high-uptake alfa-galaktozidáz A formát, megakadályozva a Man-ó-P észter csoportok hidrolízisét.
A jelen találmány tárgyát képezik továbbá az alfa-galaktozidáz· A készítmények, ezek előállítási módjai, amiknek emlős gazdaszervezetben megnőtt a keringési felezési ideje, A keringésben való felezési idő, és a sejtbe való befutás fokozható, ha í) növeljük az alfa-galaktozidáz A szíáisav- tártaim át (amit az előzőkben ismertetett módon lehet elérni); ii) növeljük az alfa-galaktozidáz A foszforilezettségét (amit az előzőkben ismertetett módon lehet elérni); iii) az alfá-galaktozidáz A pegílezése; vagy ív) a sziálsav és a terminális galaktóz-csoport szekvenciális eltávolítása, vagy a >z csoportok eltávolítása az alfa-galaktozidáz A
Az alfa-galaktozidáz A készítmények javított szíalizálása fokozza az exogén alfa-galaktozidáz A keringési felezési idejét, ett, az alfa-galaktozidáz A javított szíalizálása a hepatocítákkal összehasonlítva javítja. a sejtekbe- való bejutást a nembepatocitákba, azaz például a máj endoteliális sejtekbe vagy a szívizom-sejtekbe. A megnóvelt szíáisav tartalmú humán glíkozilezett alfa-galaktozidáz A készítmény előnyösen több glikoformot tartalmaz, amiknek legalább 20%-a komplex, 2-4 sriálsav-csoportot tartalmazó gliká.m Egy alternatív előnyben részesített humán glíkozilezett alfa-galaktozidáz A készítmény több glikofor·♦ * » * ♦♦ » « « φ * * « » X φ χ , * ♦ #*
Φ φ « ♦ * « Α * * Φ«Χ
X * Α
A X X .V Χ az osszh >-75%-a, előnyösen
ÚOVo-2
Az alfa-galaktozidáz· A késátmények foszlbrilezése is javítja az aifa-galaktosádáz Á sejtekbe való bejutási, képességét. A foszforiJezés as alfa-galaktozidáz A-t expresszáló sejtekben fordul elő. Az egyik jelen találmány szerinti humán gíikozilezett alfa-galaktozidáz A. előnyösen több glikofonnát tartalmaz, amely glikoformok átlagosan 16-x50%--ban, előnyösen 25-50%-ban, még előnyösebben legalább 30%-ha.n foszíorilezve vannak.
Egy alternatív megvalósítási mód szerint a humán alfa-galaktozidáz; A készítmény keringési felezési idejét úgy lehet fokozni, hogy az alía-galaktozídáz A~t polietilénglikolial komplexbe visszük. Egy előnyben részesített megvalósítási mód szerint az allá-galaktozidáz A készítményt trezíl-rnonom.etoxi PEG-gel (TMPEGj lehet komplexbe vinni, pegílezett alfa-galaktozidáz A képződése közben. A pegílezett alfa-galaktozidáz A-t azután tisztítjuk, izolált, pegílezett alfa-galaktozidáz A készítmény előállításával. Az alfa-galaktozidáz A pegilezése fokozza a keringési felezési időt, és a fehérje in riao hatékonyságát.
A szlalilezés befolyásolja a fehérjék keringési felezési idejét és biológiai eloszlását. A sziálsavat nem, vagy csak minimális mértékben tartalmazó fehérjéket könnyen intemalizáljá az aszíaioglikoprotein receptor (Ashwell receptor} a hepatocitákon, a fehérje exponált galaktóz csoportjai révén. A. gaiaktőzzal záródé alfa-galaktozidáz A keringési felezési ideje növelhető, ha egymás után 1} eltávolítjuk a sziálsavat, oly módon, hogy az alfa-galaktozidáz A-t neuraminidázzal (szíalídáz} hozzuk érintkezésbe, ezzel a.
:;3 terminális galaktóz egységeket exponálva hagyva, és 2) a terminális galaktozíd csoportokat eltávolítjuk, a deszíalízált alía-galaktozidáz A-t p-galaktozidázzal hozva érintkezésbe, A kapott alfa-galaktozídáz A készítményben kevesebb terminális- sziálsav és/vagy terminális galaktozídáz csoport van az oligoszacharid láncokon, azokkal az alía-gaíaktozídáz A készítményekkel összea, amiket nem hoztunk érintkezésbe szekvenciálisán neuraminidázzaí és β-galaktozidázzat Egy másik változat szerint a galaktozzal lezárt alfa-galakiozidáz A keringési felezési ideje javítható ügy is, ha csak a terminális galaktozíd egységeket távolítjuk eí a deszíalízált alfa-galaktozídáz A-t β-gaíaktozidázzal kevesebb terminális galaktozíd csoport van az oligöszaeharid láncokon, azokkal az alfa-gaíaktozidáz A készítményekkel összehasonlítva, amiket nem hoztunk érintkezésbe β-galaktozidázzal. Egy előnyben részesített megvalósítási mód szerint a neuraminidázzaí és β-galaktozidázzal egymás után való érintkeztetek után a kapott alfa-galaktozidáz A készítményeket Bhexózaminídázzal hozzuk érintkezésbe, ezzel lehasítva az oligoszacharidot a trimannoz magról.
Emellett a szialilezési szint a használt sejttípustól függően változhat. Ennek következtében egy másik előnyben részesített megvalósítási mód szerint az alfa-galaktozídáz A szialílezését fokozni lehet, ha olyan emlős sejteket, azaz például humán sejteket keresünk, amiknek viszonylag magas a szíalil-transzfeIS * * » * # X * 9 fc ♦ φ φ. £ ¢.
* *»* « »«« ráz a, es ezeket a használjuk alfa-galaktozidáz A
A jelen találmány tárgyát képezik továbbá egy alía-g&láktozidáz A készítmény olyan kiszerelési formái, amik lényegében mentesek minden nem-alfa- galaktozidáz A fehérjétől, azaz például az albumintői, a. gazdasejt által termelt nem-alfa-galakiozidáz A fehérjéktől, vagy az állati szövetből vagy folyadékból izolált fehérjéktől. Az egyik megvalósítási mód szerint a kiszerelési forma emellett tartalmaz töltőanyagot is. Az előnyben részesített töltőanyagok közé tartozik a mannit, a szórtok, a glicerin, az ammosavak, a lipidek, az EGTA, a nátríum-kiorid, a polietilénglikol, a políviníl-pírrolídon, a dextrán vagy bármelyik említett töltőanyag kombinációja, Egy másik megvalósítási mód szerint a kiszerelési fonna tartalmaz még nem-ionos detergenseket is. Az előnyben részesített nem-ionos detergensek közé tartozi a Polysorbate 20, a Polysorbate 80, a Triton X-l 00, a Triton X-l 14, a Mónidét P-4Ö, az okfil-a-glökozid, az oktil-b-glűkozíd, a Brij-35, a Pluronic, és a Tween 20, Egy előnyben részesített megvalósítási mód szerint a nem-ionos detergens a Polysorbate 20 vagy a Polysorbate SO. Egy előnyben részesített kiszerelési fonna tartalmaz még foszfáttal puffereit sóoldatot., aminek a pH-ja előnyösen 6,
A jelen találmány tárgyát alfa-galaktozidáz A készítménynek egy alanyba való beadását szolgáló módszerek képezik. Egy előnyben részesített megvalósítási mód szerint az alfa-galaktozídáz A készítmény egy megváltozott töltésű alfa-galaktozidáz A készítmény, azaz például megnőtt az olígoszacharld töltése, és/vagy megnőtt a keringési felezési ideje, az itt ismertetett módon, Ά beadott dózis endogén 0,05-5,0 mg, még előnyösebben 0,1-0,3 ag ahh-galaktozldáz A készítmény per testtömeg kg, hetente vagy kéthetente. Egy előnyben részesített megvalósítási mód szerint a. beadott dózis körülbelül 0,2 mg per testtömeg kg kéthetente. Ezekben, a módszerekben a dózist beadhatjuk Intramuszkulárisan, orálisan., rekfcálisan, szuhkután, intraarteriáiisan, intraperitoneálisan, intracerebrálisan, intratranszdermálisan, vagy' helégzés útján. Az egyik megvalósítási mód szerint az alfa-galaktozidáz A késritménynek egy alanyba való bejuttatása magában foglalja, a 0,01-10,0 mg, előnyösen 0,15,0 mg per testtömeg kg között változó dóztsű alfa-galaktozidáz A készítmény hetente vagy kéthetente való beadását szuhkután. Az alfa-galaktozidáz A készítményt beadhatjuk intravénásán is, azaz például intravénás bolus injekcióval, egy lassan benyomott intravénás injekcióval, vagy folyamatos intravénás injekcióval. Bármelyik előzőkben említett módszerben az alfa-galaktozidáz A készítmény beadható egy bejuttató rendszerrel, azaz például egy pumpával, egy kapszulázott sejt bejuttató rendszerrel, liposzómákkal, tűvel való ínjekciőzással, tűmentes injekei.ózással, nebulízáforral, aeroszalizátorraL elektroporáciőval és transzdermális tapasszal Bármelyik előzőkben említett alfa-galaktozidáz A készítmény beadható ezekkel a módszerekkel.
Egy alanyt, akiről feltételezzük, vagy tudjuk, hogy Fabrybetegséghen szenved, jelenhető az előzőkben ismertetett alfa-galaktozidáz A készítmény beadásával, az előzőkben említett beadási módszereket és dózisokat használva. A jelen találmány
IS tárgyát képezi általában F&bry-betegségben szenvedő egyedek („Fabry-betegek”), vagy a Fábry-betegség atipusos- variánsaiban szenvedd betegek, azaz a Fabry-betegek specifikus populációi, akik főleg kardiovaszkuláris rendellenességben, szenvednek, mint például ven trikaláris nagyobbodásban, úgymint baloldali ventriknlaris hipertrófiában (LVH), és/vagy mítráiís billentyűelégtelenségben, vagy azok a. Fabry betegek, akiknek főleg a veséjével van probléma.
Μ « (0«Μ ♦ ♦»»!
φ *«φ ♦ »Χ« ♦ »
Az alfa-galaktozidáz A egy homodímer glikoprotein, ami öl és glikoproteinekról hidrokzálja a terminális alfagalaktoziil egységeket.
Az érett „alfá-galaktozídáz A” és ^GA-GAV és »5, számú szekvencia” szakkifejezés (lásd 7. ábra) alfa-galaktozidáz A-t jelent, a ságnálpeptid nélkül (a szignálpeptidet tartalmazó álfa-galaktozídáz A-t lásd a 3. ábrán és a 3. számú szekvenciavázlaton). .Az. ^alfa-galaktozidáz A készítmény”' szakkifejezést és a „glikozílezett aifa-g dyett is
r, ezei »
A készítmény” szakkifejezéseket egymás sen galaktozídáz A glikoformákat tartalmaznak.
A „szh gezes jeleni s orván
A „heterológ szig.ua szekvencia, ami egy újonnan szintetizált polípeptidet, amihez a szígnálpepdd hozzá van kapcsolva, az endoplazmaíikus retikulumha irányítja további poszt-transzláeiós processzálásra és szétosztásra.
jptid” szakkifejezés jelentése a. továbbiakban az alfa-galaktozidáz A összefüggésében egy olyan szignálpeptidet jelent, ami nem a. humán alfa-galaktozidáz A szignálpeptidje, tipikus esetben valamelyik, az alfa-galaktozidáz A-tól eltérő emlős fehérje.
A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy a humán alfa-galaktozidáz A DNS szekvenciája (ami lehet C.D.NS [5, számú szekvencia) vagy genomiális DNS), vagy azok a. szekvenciák, amik a humán alfa-galaktozidáz A DNS-től vagy csendes kodonhasznosítás vagy kodoncsere miatt térnek el, amik ♦ « konzervatív aminosav helyettesítéseket generálnak,, humán sejtek genetikai módosítására használhatók, aminek hatására a sejtek tűlexpresszálják és szekretálják az enzimet. Néhány mutáció az alfa-galaktozidáz A DNS szekvenciájában olyan polipeptideket kódolhat, amik megtartják, vagy javított alia-ga.lakt.o-zidáz A enzimaktivitást mutatnak. Például azt várhatnánk, hogy a konzervatív aminosav helyettesítésnek vagy nincs, vagy csak nagyon kicsi a hatása a biológiai aktivitásra, főleg akkor, ha a fehérjében levő csoportoknak kevesebb, mint 10%-át képviseli. A. konzervatív helyettesítéseket az alábbi csoportokba tartozó aminosavak között tehetjük meg: glicin, alanin; valin, izoleucin, leucin; aszparaglnsav, glutaminsav; aszparagin, glutamin; szerin, treonin; hzin, arginin; és fenilalanin, tirozin flásd például az 5,356,804 számú Amerikai' Egyesült Államok-béli szabadalmi leírást, amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezeP&bry-betegség
A Fabry-hetegség egy olyan genetikai rendellenesség, amit az alfa-galaktozidáz A enzim tökéletlen működése okoz. Az „alfagalaktozidáz A deficiencia” szakkifejezés ennek az enzimnek az aktivitásának a csökkenését jelenti egy betegben, ami a neutrális glikölípidek (azaz például a globotriaozílceramíd) abnormális akkumulálódásához vezet a véredények falában. levő hisztíooitákban, angíokeratőmákkal a combokon, a. fenéken és a genitáliákon, és hypohidrosist, a. végtagokban paresztéxiát, a szaruhártya, veleszületett vertícillatáját és küllöszerü hátsó szubkapszuláris • » * szúrkehályogot okoz. Ennek az anyagnak, a lerakódása fáj súlyos vese és .keringési betegséget, valamint sztrókot okozhat. A glikolipid akkumulálódás súlyos tüneteket okozhat, ami ti] esetben megfigyelhető a Fabry-betegségben szenvedő- férfiaknál. Egy másik változat szerint az akkumulálódás okozhat enyhe tüneteket Is, ami például gyakran, látható a detektív gén heterozigóta nő hordozóinál. Az érintett személyek rövidebb élettartamra számíthatnak; a halál általában vese, keringési vagy cerebrokorban. Ennek a betegségnek nincs specifikus kezelése. A Fabrybetegség, amit lizoszőmális tárolási betegségként osztályoznak, a világban, több mint 1SÖÖ0 embert érint.
A Fabry-betegség,. az előző definíció szerint egy komplex 'klinikai tünetegyüttes, amit az jellemez, hogy több szervre és több rendszerre terjed ki. Azokat a betegeket, akikben manifesztálódik a szaruhártya disztróha, a. bőr léziők (angiokeratomata), a fájdalmas neuropátia, az agyi keringési betegség, a kardiomiopátia és a vese működésének rendellenessége, a „klasszikus” fenoüpusba. osztályozzák.. Vannak azonban olyan betegek, amik a klasszikus fenotípusnak csak néhány, nem az összes tünetét mutatják. Ezeket a betegeket osztályozzák „a Fabry-betegség atipikus variánsai* osztályba. Számos atípusos variáns fenotípus kapcsolódik az alfa-galaktozidáz A deficiencíához. Például néhány alfa-galaktozidáz A deficíencíáfoan szenvedő beteg a Fahry-betegségnek egy variációjában szenved, ami csak a szívet érinti, azaz például bal ventrikuláris hipertrófiát okoz (LVH). Van másik variáns fenotípus is, amiben a betegeknek csak a veséje károsodott. Bár mind'ζ'·?
két említett variáns fenotípust azonosították férfi hemk bán., a .Fabry-betegség variáns formáit, leírták nő heterozigótákbán is.
Az atipikus, a. szívet érintő variánsban szenvedő betegekben a betegség tünetei az élet későbbi szakaszában jelentkeznek, A szívet érintő variánsban szenvedő betegeknél a diagnózis átlagos kora az 52. életév, szemben a klasszikus fenotípusban szenvedők 29, életévben való diagnosztizálásával [Desnick és mtsaí: fn The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, 6. 2741-2784. oldal, szerk,: Seriver és munkatársai, McGraw(New York) (1996); Meikle és mtsaí: Journal of the American Association 281. 249-254 (1999)}. Az ebben a szindrómaszenvedő betegek gyakran a szívműködés rendellenességéenyhe tüneteit mutatják, azaz például nehézlégzést dfejtés közben, A standard echokardíográíiai elemzés általában kideríti, hogy a szívet érintő fenotípusban szenvedő betegek baloldali ventrikuláris hípertrófiában (LVH) vagy aszimmetrikus szenvednek. A betegeknek azonban lehet iájuk (Scheídt és mtsaí:
The New England Journal of Medicine 324, 395-399 (1991); Nakao és mtsaí: The New England Journal of Medicine 333, 288293 (1995)). Ezeknél a betegeknél gyakran végeznek szívizom biopsziát, és a variáns szindróma patológiája lényegében hasonlít a klasszikus Fabry-betegségre: miokardiális beszúrődés, lerakodott glikolipiddeL Ezekben a betegekben az alfa-galaktozidáz A esszével az enzimszíntek széles tartománya mérhető. Például a szívet érintő variánsban szenvedő betegekben az alfa-ga-
χ ♦·* * ♦
A ♦ X x ¢:
« A * »** laktozídáz A enzi és ezért eddig nem t terápia jelöltjeinek.
szintje eléri a normál szint 30%-át is, az alfa-galaktozidáz A pótlási
A feltalálók váratlanul felfedezték, hogy bár az atipikus szív variánsban vagy az atipikus vese variánsban szenvedő betegekben az alfa-galaktozidáz A enrimaktivitás szintje viszonylag magas lehet a klasszikus fenotípusü Fabry-betegségben szenvedő betegekével összehasonlítva, ezeknek a betegeknek is jótékony hatású lehet az alfa-galaktozidáz A enzim terápia. A betegeknek például lehet egy olyan mutációjuk, ami kinetíkailag instabil alfaA enzimet termel a sejtben, és ezekben a. az alfa-galaktozidáz A enzim, szintje szignifikánsan növelhető, ha a jelen találmány szerinti alfa-galaktozidáz A készítményeket adjuk be nekik. Emellett néhány, az atipikus, szívet érintő variánsban szenvedő betegben leírták, hogy pontmutációt hordoznak az alía-galaktozidáz A 215-ös aminosavjáná.l [Eng és mtsai; Am. d. Hűm.. Ge.net, 53, 1186-1197 (1993)). Tehát ezekben a betegekben hatékony lehet az alfa-galaktozidáz A pótlási terápia, a jelen találmány szerinti, megfelelően glíkozilezett alfa-galaktozidáz A készítményekkel.. Emellett leírtak atipikus vese variánsban szenvedő betegeket is, akiknél a Pábry-betegseg egyedüli klinikai megnyilvánulása az enyhe proteinuria, A vese biopsriából azonban kiderültek a Fafety-betegségre jellemző tipikus glíkoüpid zárványok., és az alfa-galaktozidáz A enzim esszéből pedig kiderül a normálisnál alacsonyabb alfa-galaktozidáz A szint. Mivel azonban ezeknél a betegeknél a vesében lerakodott ceramid trihexorid kimutatható a vizelet üledékében levő vese tubuláris sejtekben , a jelen találmány szerinti alla-galaktozidáz A készítmények beadása lényegesen csökkentheti ezeket a szinteket. A lizoszőmálís enzimek, azaz például az alfa-galaktozidáz Α» egy sejt lizoszőmálís .kompartmentjébe irányulnak, a mann.óz-6-F (MőF) receptorral való kölcsönhatás alapján, ami a bzoszómális kompartmentbe szánt enzimek oligoszacharid egységeiben levő- M6P egységekhez kötődik (Komfeld & Mellman: Ann. Rév. Cell Biok 5 483-525 (1989)]. A primer .kölcsönhatás a Golgi készülékben, jön létre, ahol a Golgi MPó receptorokhoz kötött enzimek szegregálódnak, a lízoszőmákba való transzporthoz. Azt gondolják, hogy egy második típusú kölcsönhatás ís fellép az extracellulárís alfa-galaktozidáz A és a sejtfelszínen levő Μ6Ρ receptorok: között. Azok az enzimek, amik megszöknek az irányító rendszerből., a konstitutív szekréció bioszintézis úton szekretálódnak, és gyakran újra befogják őket a sejtfelszíni M6P receptorok, amik az endoeitás bioszintézis úton keresztül visszaviszik az alfa-galaktozidáz A-t a lizoszőmába. A sejtek által intemalizált extracellulárís anyagok a citoplazmán keresztül az endocita vezikulumokba jutnak, amik fuzionálnak a primer lízoszómákal és tartalmukat a. lizoszőmába ürítik. Ebben a. folyamatban a sejtfelszíni M6P receptorok is beépülnek az endocita vezikulumokba és a lizoszómákba jutnak. Pontosabban, a jelen találmány szerinti alfa-galaktozidáz Azokat a készítményeket, amikben magas a szíaliíezés és/vagy a foszforilezés szintje, előnyben részesítjük a Fabry-betegség atipikus variánsában szenvedő betegek kezelésénél. Áz ilyen készítmények például minimalizálják az injekciózott alfa-galaktozidáz A-nak azt > » X « Φ Φ * * φ φ * «** W Χ*« a frakcióját, amit a hepatoeiták eltávolítanak, és lehetővé teszik, hogy az alfa-galaktozídáz A-t magas szinten vegyék fel nem-máj sejtek, azaz például vesesejtek, vaszkuláris sejtek, tubuláris sejtek, glomeruiáris sejtek, szív míocíták és szív vaszkuláris sejtek.
csoportokat hordozó eztracelluláris alfa-galaktozidáz A kötődhet a sejtfelszíni MSP receptorokhoz, és transzportólható a lizoszómális kompartmenthe. Ha mái' a lizoszómális kompartmentben van.,, akkor az alfa-galaktozídáz A képes elvégezni a megfelelő feladatokat. A lizoszómális enzim-mozgásnak ez az aspektusa, ami az alfa-galaktozidáz A enzim pótlási terápiát a Fabry-hetegségben szenvedők megfelelő terápiás kezelésévé teszi, így, még akkor is, ha egy sejt genetikailag hibás az alfa-galaktozidáz A előállításában, a sejt képes felvenni az eztracelluláiis alfagalaktozídáz A~t, ha az alfa-galaktozidáz A megfelelően glikozilezve van, és a hibás sejt MSP receptort hordoz. A Fabry-hetegségben szenvedő betegekben a vese és a szív vaszkuláris endoteliálís sejtjei, súlyos hisztopatologiai rendellenességeket mutatnak, és hozzájárulnak, a betegség klinikai patológiájához. Ezek a sejtek, amik MóP receptorokat hordoznak, az alfa-galaktozídáz A fő terápiás célpontjai. A jelen találmány tárgya továbbá olyan alfa-galaktozidáz A készítmény biztosítása, amiben az MSP lekapcsolt oligoszacharidokban van jelen.
mértéke, hogy az alfa-galaktozidáz A N-kapesolt olímilyen mértékben módosulnak a szialilezés révén.
goszac
fással van az alfa-galaktozidáz A farmakokínetíkáián megoszlására. A megfelelő szialilezés hiányában az » φ # »♦
V * * ♦ « β * »
X *♦ alfa-galaktozidáz A gyorsan kiürül a keringésből,, annak következtében, hogy kötődik a hepatikus asrialo^ikoprotein receptorokhoz (Ashwell receptorok), amit mtemalizáciő és a hepatociták által való lebontás követ [Ashwell ík Harford, Annu. Rév. Biochem, 51, 531-554 (1982)). Ez csökkenti az alfa-galaktozidáz A-nak a keringésben levő mennyiségét, ami ahhoz kell, hogy azokon a sejteken levő M6P receptorokhoz kötődjön, amik hozzájárulnak a Fabry-betegség klinikai patológiájához, ilyenek például a vese és a szív vaszkuláris endoteiiális sejtjei. A genetikailag módosított humán sejtek által szekretáit alfa-galaktozidáz A sejtek olyan glikozilezési tulajdonságokkal rendelkeznek, amik megfelelnek a Fabry-betegség kezelésének:, akár a tisztított szekretáit fehérje hagyományos gyógyszerészeti beadását alkalmazzuk, akár génterápiát, anélkül hogy további enzánatikus módosításra lenne szükség, amint azt leírták a glükoceréhrozidáz ne vő lizoszőmálís enzim esetében, aholis a tisztított glűkoeerehrozidáz enzim kiírdkailag releváns sejtek által való felvétele az enzhn komplex enzimatikus módosítását követeli meg a humán méhlepényből való izolálás után fBentler: The New England Journal of Medícine 325, 1354-1360 (1991)].
deficiencíában, azaz Fabry-betegségben szenved kezelhető tenyésztett, genetikailag módosított sejtekből, előnyösen humán sejtekből származó tisztított humán alfa-galaktozidáz A-val.
•y··?
* «· X « ♦:· ♦ »♦'·«
Κ X
Φ«χ »*
Ha a sejteket a Pabry-befegség kezelése céljából kell módosítanunk genetikailag, akkor a sejteket hagyományos génsebészeti módszerekkel, vagy génaktiválással módosíthatjuk.
A hagyományos módszerek szerint egy DNS molekula,, ami tartalmaz egy alfa-galaktozidáz A cDNS vagy genomíális szekvenciát, lehet egy expresszíós konstrukcióban, és standard módszerekkel transzíéktálhatü primer, szekunder vagy örökéletüvé tett sejtekbe, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a liposzőmák, polibrén, vagy DEAE dextrán segítségével végzett, transzfekciót, elektroporáeiöt, kalcium-íoszíátos kícsapást, mik;
ige!
mikrorészecskéket („biohsztika*) (lásd például az üSSN 08/334,797 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás, amely publikációt a továbbiakban, referenciaként kezelünk). Egy másik változat szerint egy olyan rendszert használhatunk, ami a genetikai információt egy virátis vektorral juttatja be. Azok közé a vírusok közé, amikről ismert, hogy jól használhatók géntranszferre, tartoznak az adenovirusok, az adeno-asszocíált vírusok, a herpeszvírus, a mumpszvírus·, a gyermekbénulás vírus, a retrovirusok, & Sindhis vírus, és a vakcínia vírus, azaz például a. kanárihímló vírus.
Egy másik változat szerint a sejtek génaktiválással („GA”) módosíthatók, aminek a leírása megtalálható az 5,733,761. és 5,75(3,476 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban, amely publikációkat a továbbiakban referenciaként kezelünk. A génaktiválással előállított alfa-galaktozidáz Ά-t a. továbbiakban G.A-GAL néven * » φ » *
X Φ φ ν Φ * 4· > χ * Φ ΦΦΧ * * X* * « * ♦ ♦φ 4 *?* *:* .^ν^ν,Λ a „genetikailag módosított” szakkifejezés jelentése a továbbiakban olyan sejtekre vonatkozik, amik egy adott génterméket expresszálnak a génterméket kódoló és/vagy a génterméket kódoló szekvencia expresszióját szabályozó elemeket tartalmazó DNS molekula bejuttatása után. A DNS molekulát, bejuttathatjuk gén-célzással, vagy homológ rekombinációval, azaz a DNS molekulának egy adott genomiális pontba való bejuttatásával. Homológ rekombináció használható magának a hibás génnek a helyettesítésére (a hibás alfa-galaktozidáz A. gént, vagy annak egy .részét a Fabry-betegségben szenvedő betegek saját sejtjeiben helyettesíthetjük a teljes génnel, vagy annak egy részével).
A továbbiakban a. „primer sejt szakkifejezés olyan, sejteket jelent, amik. egy gerinces szervezet szövetéből izolált, sejtszuszpenzióban vannak, (mielőtt, szelesztenénk, azaz letapadna egy szóvettenyészet hordozóhoz, azaz péld;
származó sejtek, és az előzőkben említett sejtek mindkét típusa először van szélesztve, és a sejtsxnszpenzíók ezekből a szélesztett sejtekből «um. lemezhez vagy z egy szőve
ejezés a tenyésztés összes további szármázó seiteket leient. Azaz az első alkalommal, amikor a szélesztett primer sejteket eltávolítjuk a tenyésztél hordozóból és újra szélesztjük (passzáljuk), akkor a sejtet szekunder sejtként említjük, ugyanúgy, mint a többi passzálásból származó seiteket.
A „sejt törzs olyan szekunder sejteket tartalmaz, amiket yszer vagy kétszer már passzáltak, az átlag-populáció véges számú kettózódésre képes tenyészetben; kontakt-gátlásos, rögzítés- függő növekedési tulajdon Ságokat mutatnak (azoknak a sejteknek a kivételével, amiket szuszpenziós tenyésztőiben szaporítunk!; és nem orökéletöek.
Az „örökélétüvé tett sejt* szakkifejezés egy megállapodott sejtvonalból származó sejtet jelent, ami láthatóan végtelen élettartammal rendelkezik tenyészetben.
A primer vagy szekunder sejtek lehetnek fibroblaszfcok, epiteüális sejtek, beleértve az emlő és bél epiteliális sejteket, endotelíálís sejtek, a vér alakos elemei, beleértve a limfoeitákat és a csontvelő sejteket, gliasejtek, hepatociták, keratinociták, izomsejlek, idegsejtek, vagy ezeknek a sejteknek a prekurzorak A jelen találmányban jól. használható, örőkéletűvé tett humán sejtvenal&k közé tartoznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a Bowes Melanoma sejtek (ATCC letéti szám CRL 9607), a Danái sejtek (ATCC letéti szám CCL 213), a HeLa sejtek és a HeLa. sejtek származékai (ATCC letéti számok CCL 2, CCL 2,1, és CCL2.2), a HL-60 sejtek (ATCC letéti szám CCL 240), a HT1080 sejtek (ATCC letéti szám CCL 121), a Jurkat sejtek (ATCC letéti szám T1B 152), a KB karcinőma sejtek (ATCC letéti szám CCL 17), a K--562 leukémia sejtek (ATCC letéti szám CCL 243), az MCF-7 emlőrák sejtek (ATCC letéti szám BTH 22), a MOLT-4 sejtek (ATCC letéti szám 1582), a Namalwa sejtek (ATCC letéti szám CRL 1432), a Raji sejtek (ATCC letéti szám CRL 86), az RPMI 8226 sejtek (ATCC letéti szám CCL 155), az ü-937 sejtek (ATCC letéti szám CRL 1593¼ a WI-38VA13 alvonal 2R4 sejtek (ATCC letéti szánt CLL 75,1¼ a. CCRF-CEM sejtek (ATCC letéti szám CCL 119) és a 278ÖAD petefészek karcánőma sejtek (Van dér Blick és mtsai: Cancer Rés. 48, 5927-5932 (1988)¼ valamint azok a heterohibridóma. sejtek, amiket humán sejtek és másfajok sejtjei közötti fúzióval lehet előállítani,
A humán olyan jellegű módosítása után, hogy egy olyan sejtet állítsunk elő, ami alfa-galaktozidáz A-t szekretál, előállíthatunk egy olyan klonális sejitorzsef, ami lényegében genetikailag azonos, tenyésztett primer humán sejtek sokaságából áll, vagy ha a sejteket orökéletűvé tettük, akkor egy olyan klonális sejtvonalat, ami lényegében genetikailag azonos, örökeietűvé tett humán sejtek sokaságából áll. Az egyik megvalósítási mód szerint a klonális sejt törzs vagy a klonális sejtvonalak fibrohlasztok. Egy előnyben részesített megvalósítási mód szerint a sejtek szekunder humán fibrohlasztok, azaz például BRS-11 sejtek.
A genetikám módosítás után a sejteket az alfa-galaktozidáz A szekrécióját lehetővé tevő körülmények között tenyésztjük. A fehérjét a tenyésztett sejtekből úgy izoláljuk, hogy összegyűjtjük azt. a közeget, amiben a sejtek szaporodtak, és/vagy lizáltatjuk, hogy tartalmuk kiszabaduljon, majd fehérjefisztitási technikákat alkalmazunk.
Az alfa-galaktozidáz A tisztítása stabilan trasszfektált sejtek kondicionált közegéből
A jelen találmány szerinti módszerek alapján az alfa-galaktozidáz A fehérjét a tenyésztett sejtekből („alfa-galaktozidáz- A-t
3ί »»« termelő sejtek”) ügy izoláljuk, hogy összegyűjtjük azt a közeget, amiben a sejtek szaporodtak, vagy üzáltatj'uk, hogy tartalmuk kiszabaduljon, majd fehér)«tisztítási technikákat alkalmazunk, amiben nincs lektin afhnításkromatográfia. Az előnyben részesített tisztítási eljárás az alábbi, 2. példában ismertetjük.
Alternatív, hidrofób kölcsönhatáson alapuló gyanták, azaz például a Source Iso (Pharmacia), a Macro-Prep Methyl Support (Bio-Rad), a TSK Butyl (Tosohaasí vagy a Phenyl Sepharose (Pharmacia) is használhatók az alfa-galaktozidáz A tisztítására. Az oszlopot viszonylag magas koncentrációjú sóoldattal, azaz például 1 mol/1 amm ónium-szulfáttal vagy 2 mol/1 nátrium-kloriddal hozhatjuk egyensúlyba, pfl™S,6-os pufferben. A tisztítandó mintát úgy készítjük elő, hogy a pB-t és a sókoncentrációt az .ek megfelelően állítjuk be, A mintát .feh
visszük az oszlopra, majd az oszlopot a megköteti en anyag eltávolítására az egyensúlyba hozó pufferrel mossuk. Az alfa-galaktozidáz A-t kisebb ionerősségu pufferrel, azaz például vízzel vagy vízben oldott szerves oldószerrel, azaz például 20%-os etanollal vagy 50%-os propilénglíkóllál eluáljuk. Egy másik változat szerint el lehet érni, hogy az alfa-galaktozidáz A átfolyjon az oszlopon, kisebb sókoncentráciőt használva az egyensúlyba hozó pufferben és a mintában, vagy más pH-t használva. Más fehérjék kötődhetnek az oszlophoz, ezzel az alfa-galaktozidáz A-t. tartalmazó minta tisztítását úgy érve el, hogy az nem kötődik az oszlophoz, Egy előnyben részesített első tisztítási lépés a hídrosáapatít oszlop használata.
**
A tisztítás egy alternatív tisztítására kationcserélő gyantát használhatunk, azaz SP Sepharose 6 Pasi Flow gyantát (Pharmacia), Source 3ÖS (Pharmacia), CM Sepharose Pást Flow (Pharmacia)), Macro-Prep CM hordozó (Bio-Rad) vagy Macro-Prep High S Support (Bio-Rad) gyantát. Az „első kromatográfiás lépés” azt jelenti, hogy egy mintát először viszünk kromatográfiás oszlopra (az összes, a minta előkészítéséhez használt lépést kihagyva). Az alfa-galaktozidáz A pH~4.4~en képes az oszlophoz kötődni. Az oszlop egyensúlyba hozására puffer használható, azaz például egy 10 mmol/l-es nátrium-acetát, pH=4,4 puífer, vagy 10 mmol/1 nátrium-citrát, pH~4,4 puífer, vagy más, pH:-:4,4-en megfelelő pufferkapaeítással rendelkező pufíer. A tisztítandó mintának a pH~ját és ionerősségét az egyensúlyba hozó puffer pH-jára és ionerősségére állítjuk be. A mintát felvisszük az oszlopra, majd az oszlopot a felvitel után mossuk, hogy eltávolitsuk a megkőtetlen anyagot. Só, azaz például nátrium-klorid vagy kálium-klorid használható az alfa-galaktozidáz A-nak az oszlopról való elválására. Egy másik változat .szerint az alfa-galaktozidáz A az oszlopról magas pHjú pufferrel, vagy magasabb sökoncentrácíó és magasabb pH kombinációjával elválható. Azt is megtehetjük, hogy a felvitel során az alfa-galaktozidáz A átfolyjon az oszlopon, ha növeljük a sókoncentrációt az egyensúlyba hozó pufferben és a felvitt mintában, vagy az oszlop magasabb pH-η való futtatásával, vagy a magasabb sökoncentrácíó és a. magasabb pH kombinálásával.
A tisztítás egy másik lépésében, az alfa-galaktozidáz A tisztítására Q Sepharose 6 Fást Flow-t használhatunk. A Q Sepharose egy viszonylag erős aníoncserélo gyanta, gyengébb anioncserélő, azaz· például a DEÁE Q Sepharose Fást Flow (Pharmacia)) vagy a Macro-Prep DEAB (Bio-Rad) is használható az alfa-galaktozidáz A tisztítására. .Az oszlopot egyensúlyba hozzuk egy pufferrel, azaz például lö mmol/1 nátriumfoszfáttal, pH::::6. A minta pH-ját 6-ra állítjuk, majd kis ionerosséget kapunk, a minta hígításával vagy diaszűrésével. A mintát olyan körülmények között visszük az oszlopra, hogy alfa-galaktozidáz A megkössön. Az oszlopot egyensúlyba hozó pufferrel mossuk, hogy eltávolí.tsuk a megkötetlen anyagot. Az alfa-galaktozidáz A-t sőoldattal azaz például nátrium-kloriddal vagy kálium-kloríddal, vagy alacsonyabb pH alkalmazásával, vagy a magasabb sókon centráció és az alacsonyabb pH kombinálásával eluálhatő. Azt. is megtehetjük, hogy a felvitel során az alfa-galaktozidáz A átfolyjon az oszlopon, ha növeljük a sókoncentrációt a felvitt mintában, vagy az oszlop alacsonyabb pH-η való futtatásával, vagy a magasabb sókoncentráciő és az alacsonyabb pH kombinálásávak
Egy' másik tisztítási, lépésben Superdex 200 (Pharmacia) méretkizárásos kromatográfiai használunk az alfa-galaktozidáz A tisztítására, Más méretkízárásos kromatográfiás gyanták, azaz például Sephacryl S-200 vagy Bio-Gel A-1.5 m is használható az alfa-galaktozidáz A tisztítására. A méretkizárásos kromatográfiához az előnyben részesített puffer 25 mmol/1 nátriumfoszfát, pH^öjö, ami 0,15 mol/1 nátrium-kioridot tartalmaz. Más, a kiszerelési formával kompatibilis pufferek is használható, azaz mmol/1 nátrium- vagy kálium-cifrát, A puffer pH-ja ρ·Η~5 és 7 között lehet, és tartalmaznia kell egy sót, azaz például nátrium-kloridot vagy nátrium-kloríd és kálium-klorid keverékét,
A tisztítás egy másik lépésében kromatofökuszalő gyantát, azaz például Potybuífer Exchanger PBE 94~et (Pharmacia) használunk, az alfa-galaktozidáz A tisztítására. Az oszlopot viszonylag magas pH-η (azaz pH=7~en vagy magasabb értéken) hozzuk egyensúlyba, a tisztítandó minta pH-ját ugyanarra a pH-ra állítjuk, majd a mintát felvisszük az oszlopra. A fehérjéket pH«4íg csökkenő pH gradienssel eluáljuk, egy puíferrendszer, azaz például Polybuffer 74 (Pharmacia) használatával, aminek a pHját 4-re állítottuk.
Egy másik változat szerint immunaffinitás kromatográíia használható az alfa-galaktozidáz A tisztítására. Egy megfelelő, alfa-galaktozidáz A elleni poliklonális vagy monoklonális ellenanyagot (amit alfa-galaktozidáz Á-val, vagy az alfa-galaktozidáz A szekvenciából származó pepiiddel való immunizálással állítunk elő, standard technikák alkalmazásával) egy aktíváit kapcsoló gyantára, azaz például MHS-aktivált Sepharose 4 Pást Flow (Pharmacia) vagy hrómeiánnal aktivált Sepharose 4 Pást Flow
,) gyantára ímm.ohílízálunk. A tisztítandó mintát az immobllizált ellenanyag oszlopra körülbelül pH-ő-7 között, visszük fel. Az oszlopot mossuk, hogy eltávolítsuk a megkötetlen anyagot, Az alfa-galaktozidáz A-t az oszlopról az affinitás-oszlop eluálására tipikus esetekben használt reagensekkel eluáljuk, azaz például alacsony (3-as) pH-val, denaturáló szerrel, azaz például g^anidm HCl-lel vagy tíocíanáttal vagy szerves oldószerrel, azaz például 50%-os propilénglikollal, pH=6~os pufferben. A tisz35 titási eljárásban az alfa-galaktozidáz A tisztítására használhatunk fémkel-át affinitás gyantát, azaz például Cbelating Sepharose Fást Flow (Pharmacia) gyantát, Az oszlopot -előre feltöltjük fémionokkal, azaz például Cu2+, Zn2*, Ca2% Mg2· vagy Cd2+ ionokkal. A tisztítandó mintát a megfelelő pH-, azaz például pH~6--7,5 értéken visszük fel az oszlopra, majd az oszlopot mossuk, hogy eltávolítsuk a megköteüen fehérjéket, A megkötött kompetitív elúeióval eluáljuk, hisztídint vagy imidazolt vagy kentett pH-t (amit nátrium-citráttal vagy nátrium-acetáttal lehet elérni 6-nál kisebb pH esetében), vagy kelátképzó ágensek, azaz például EDTA vagy E'GTA bevitelét alkalmazva.
Az előzőkben ismertetett protokollok alapján a jelen találmány tárgyát olyan készítmények képezik, amikben az alfa-galaktozidáz A tisztább, mint a szakterületen korábban ismert ké~ szítményekben, legalább 98%-os. homogenitásra, előnyösebben legalább 99%-os homogenitásra, és legelőnyösebben legalább 99,5%-os homogenitásra tisztítva, SDS-PAGE-val vagy fordított fázisú HPLC-vel végzett mérés alapján, A jelen találmány szerinti alfa-galaktozidáz A készítmények tartalmazhatnak számos különböző alfa-galaktozídáz A glikoformát. Ennek megfelelően a sza.
az alfa-galaktozidáz A készítményekkel menyekre vonatkozik, amik
Összefüggésben olyan készítlényegében mentesek («2% ősszfehérje) minden más nem alfa-galaktozídáz A fehérjétől, A nem-alfa-galaktozídáz A fehérjék. például az alhumin, a gazdasejt által termelt nem-alfa-galaktozidáz A fehérjék, és az állati szövetből vagy folyadékból izolált nem-alfa-galaktozidáz A fehérfc ♦ * jék. A jelen találmány szerinti a.lfa-gaJ.aktozidáz A készítmények specifikus aktivitása előnyösen, legalább .2,0^106 egység,/mg fehérje, még előnyösebben legalább 3>öx lö6 egység/mg fehérje, és
Az alfa-galaktozidáz A készítmény keringési felezési idejének javítása a glikán átalakításával, az elignszae&arid töltésének növelése érdekében
A jelen találmány tárgyát képezi egy' glikoprotein módosítási program, amivel meg lehet növelni egv terápiás enzim bejutásának mértékét a májtól és makrofágoktól eltérő specifikus szövetekbe. A. jelen találmány szerinti eljárások használatával humán alfa-galaktozidáz A készítményeket kapunk, amikben az oligoszaeharidok 35-85%-a töltve van, az olígoszacharidoknak előnyösen legalább 50%-a töltéssel rendelkezik.
A fehérje N-gllkozílezés úgy működik, bogi? a fehérjék megfelelő aszparagín csoportjait oligoszacharid struktúrákkal módosítjuk, ezzel befolyásolva tulajdonságaikat és biológiai aktivitásukat. |Kukuruzmska & Lennem Crit. Rév, Órai. Bioi. Med. '9, 415-448 (1998)|. A jelen találmány tárgyát Izolált alfa-galaktozidáz A készítmény képezi, amiben az oligoszacharídok nagy százaléka negatív töltéssel rendelkezik, főleg egy vagy négy szíálsav csoportnak a komplex glíkánokboz való hozzáadása, vagy egy vagy két foszfát, egységnek a magas mannóztartalmű glikánokhoz való hozzáadása miatt, Illetve egy foszfát és egyetlen szíálsav csoportnak a hibrid glíkánokboz való hozzáadása miatt.. A szulfátéit komplex glikánok kisebb mennyisége .is jelen lehet. A töltött
, * « V ♦«A * * Λ « * * * « *** *.· struktúrák nag^ részaránya, két fő funkciót szolgát Először, az utolsó galaktóz csoportok 2,3- vagy 2,6-kapcsolt sziálsawal való lezárása, megakadályozza a keringésből idő előtt való .kivonását, amit a hepatoeitákon levő aszialoglikoprotein receptor végez el, mázó gUkoprotemeket. Ha megnöveljük az alfa-galaJktozádáz A keringési felezési idejét, akkor ez fontos célszerűeknek, azaz például a szívnek és a vesének lehetővé teszi», hogy az enzim infúzió után a plazmából nagyobb mennyiségű enzimet bekebelezzen. Másodszor, a. Man~6~:foszfái jelenléte a magas niannóztartalmú vagy hibrid glikánokon lehetőséget biztosít a kation-független Man-6-foszfát receptornak (CI-MPR) a receptor által közvetített felvételre. Ez a receptor is, amik a CTH Man-ő-foszfát cí nagyobb az 0 vetített felvétel számos beleértve a v&szkuláris endotéliáiis tárolási helyei a Fabry-betegségekben. A tartalmazó enzim-molekuláknak a Cl-MPR-hez, mint azoknak, amik znak. A jellegzetes g:
me?
1, Tá b láza t
Reprezentatív glikán struktúrák ±Fucal,6
SAo:2,3 / 6Galp 1 ,4GlcRAeö! ,2Mana 1,6 \ |
Manp 1,4G!eHac01,4GíeNAc~Asn
8Aa2,3/őGalü 1,4GieNAcp 1,2Mana 1,6/
Négyágú glikán
8Aa2,3/'6Gal3 154GlcNAcp 1,6\ ±Fuctx 1,6
SAa2,3/6Galp 1,4GlcNAep 1, 2Mana 1,6 \ |
Manp'l ,4GicNAcP 1,4GlcN Ac- Asn
SAa2,3/6GaIB 1,4GlcNAcp 1,2Mana 1,3/
SAa2,3/6Galp 1 ;4GleNAep 1,4/
Magas glikán
Mana 1, 2Mann 1,6 \
Mana 1,6 \
Mana 1 ,2Mana 1,3 / Manp 1,4GlcNAcp 1 ,4GleNAc~Asn
Mánál ,2Mana 1,2Mana 1,3 /
Fnsaforileaett hibrid glikán P-Manal,6\
Mana 1,6\
Mánál ,3/ Manp 1,4GIeMAc$ 1,4GlcNAc-Asn SAa2,3/6Gal.p 1. ,4GM Aep 1,2Mana 1,3/
Bifnszfnrilezett
P-Manaí,2Mana.1.,6\
Mánál ,6 \
Mana 1,3/ Manp í ,4GlcA! Acp 1,4Glc'N Ac-Asn P Mana 1,2 Mana 1,3 / * «00 * ♦ «» ♦ * < « > * X számos Ruionoozo enzim, glikoziltranszferáz és glikozídáz vesz részt. Ezeknek az enzimeknek a legnagyobb része az endoplazmatikus retikulumban (ER) és a Golgí készülékben funkcionál, rendezett, jól szervezett módon. Az N-glikozilezés komplexitását erősíti az a tény, hogy ugyanabban a polípeptidben a különböző aszparagin csoportok módosíthatók a. különböző oligoszacharid struktúrákkal, és a különböző fehérjéket a szénhidrát egységeik jellemzői különböztetik meg. A molekuláris genetika legújabb eredményei meggyorsították az N-glikozílezésí gének azonosítását, Izolálását és jellemzését. Ennek eredményeképpen kaptuk az N-glikozilezés és más eellulárís funkciók közötti kapcsolatra vonatkozó ínformáA sejtben az .N-kapcsoft glikoprotein processzálás akkor kezdődik, amikor egy GlcsMangGlcNAca-t tartalmazó olígoszacharid lánc egy egységként hozzákapcsolódik az ER lumenében levő naszeens peptid akceptor aszparaginjához. Egy tizennégy cukorból állő oligoszacharid, ami GIcsMansGicNAcz-t tartalmaz, épül fel a doheholon, egy nagyon hosszú alifás alkoholon:
Mánál ,2Manal .6 \
Mansxl,
Mánál,ZMano, 1,3/ Mí«$ 1,4GIcNAc^l,4GIcNAc-iPP-M.chöl Gkxxl ,2öka .1,3-Giea 1,3Mana 1,2Mán« 1,2Mana 1.3 /
Ez az oligoszacharid egyetlen egységként megy át egy akceptor aszparagin csoportra az ER lumenében levő naszeens péphóláncban. A gllkánnak a pepiidhez viszonyított nagy mérete vezetheti, a fehérje térszerkezetének a kialakulását. A három glí'W
X « ♦ kozid szolgál annak szignáljaként, hogy az olígoszacharid teljes, és készen áll arra, hogy az oligoszacharil transzferáz átvigye. Ez az enzim emellett átvisz nem-glíkozilezett oügoszacharidokat is, de ennek sebessége csak egy töredéke a komplett lánc átviteli se bességének, mivel ezek nem optimális szubsztrátok. A szénhidrát-deficiens glíkoprotein szindróma egy formájáról emberekben kimutatták, hogy a DolichoÍ-P-GÍc:MangGlcNAc2~.PP~Dolichol glü~ kozil-transzferáz károsodása okozza, ami a glükóz hozzáadás bioszintézis útnak az első enzime, ami a szerum-fehéxjék hipogliközílezését eredményezi |Komer és mtsai; Proceedíngs of tbc National Academy of Sciences, USA 95, 13200-13205 (1998)). A bárom glükóz-csoport eltávolítása, és a helyes konformáció kialakulása után az újonnan szintetizált glíkoprotein a Golgi készülőén, kialakulása után a Golgi mannozídázok mennyire férnek hozzá a glíkánhoz, a glikán lánc megmaradhat magas mannóztartalmű láncnak, ami 5-9 maunőzcsoportot tartalmaz. Egy másik változat szerint a glikán lánc tovább processzálódhat egy irimannozíl maggá, és más glikozil transzferálok akoeptora lehet, amik komplex láncokat képeznek több GlcNac csoportok, majd Gál,
NeuAc és Fuc csoportok hozzáadásával. Egy harmadik lehetőség az, ha a fehérjének két Hzincsoportja van, egymástól pontosan 34 AngstrÖm távolságban, és égy magas mannóztartalmű lánchoz viszonyítva helyes térállásban, akkor GlcNaco- I-PG4 adódik az egyik., vagy néha mindkét mannózesoport 6-os szénatomjához fCuozzo és mtsai: Journal of Biological Chemistry 273, 210692107* az α-kapesolt GlcNac-t egy specifikus * « » enzim eltávolította, egy terminális M6.P epítop generálódik, amit a transz Golgi hálózatban egy M6P receptor felismer, és ez ezeket az enzimeket mezenchímálís eredetű sejtekben levő lizoszőmákba iránjdtja.
>gy az alfa-galaktozidáz A-t a szövetbe eljuttassuk, számos különböző szénhidrát struktúra, (glikoforma) használható. Matsuura és munkatársai leírták, hogy a CHO sejtekben készített hunián alfa-galaktozidáz A-n a glikán struktúrák 41%-ban magas mannóztartalmű es foszforílezésí szint 24% (Matsuura és mtsai: Glyeobiology' 8, 329339 (1998)(. Azonban a szialilezett komplex glikánok szintje csak 11%. Tehát a komplex láncok 2/3-a nincs szialílezve, ami azt eredményezi, hogy az alfa-galaktozidáz A gyorsan kiürül a májon keresztül. A jelen találmány szerinti humán sejtekben termelt alfa-galaktozidáz A nagyobb százalékban tartalmaz töltött olígoszacharidof mint a szakterületen korábban CHO sejtekben előállított alfa-galaktozidáz A. Például az itt ismertetett. HT-1080 sejtekben szintetizált alfa-galaktozidáz A különösen alkalmas, mível a. HT-1080 sejtekben termelt alfa-galaktozidáz A körülbelül 15% neutrális struktúrát tartalmaz (magas mannóz-tartalmú és hibrid), körülbelül 16% foszforilezett glikánt, és körülbelül. 67% komplex glikánt tartalmaz, 2-4 szialilezett csoporttal. Tehát lényegében az Összes komplex lánc szialílezve van, ha. a. CHO sej tekben előállított, alfa-galaktozidáz A-val hasonlítjuk össze. A HT1080 sejtben termelődött alfa-galaktozidáz A-nak három N-'kapcsolt glikozilezési helye van. Két hely komplex glikánná processzálódík a Golgi apparátusban, míg a harmadik helyet egy
magas mannöztartalmű glikán foglalja el, aminek 50%-át a lizoszómálís enzim--specifikus foszforilezés módosítja, ezzel monofoszforüezett és difoszforilezett fajtákat állítva elő.
Egy N-kapcsolt glikán láncokat tartalmazó fehérjén a széna töltött, alfa- galaktozidáz A aránya növelhető, ha a tisztítási eljárás során szelektíven izoláljuk a glikoformákat. A jelen találmány tárgyát képezi a nagyobb töltésű, és magasabb molekulatömegű alfa-galaktozidáz A glikoformák arányának növelése, az alfa-galaktozídáz A fajták kromatográfiás oszlopokba töltött gyantákon való frakcionálásával, a tisztítás során és/vagy után. Minél nagyobb a töltése az alfa-galaktozidáz A fajtáknak, annál több sziálsavat és/vagy foszfátot tartalmaznak, és minél magasabb a sok eiagazast tartalmazó es erősen töltött fajtákat. A töltött fajták kiválasztása, vagy a nem-glikozilezett, gyengén glikozilezett, vagy gyengén szíalílezett és/vagy foszforílezett alfa-galaktozidáz A fajtáknak az eltávolítása olyan, alfa-galaktozídáz A glikoforma populációt eredményez, ami több sziálsavat és/vagy több foszfátot tartalmaz, ezzel egy magasabb felezési idejű és potenciális terápiás, hatással rendelkező -alfa-galaktozidáz A készítményt biztosítva.
Ez a frakcionálási eljárás lejátszódhat, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, megfelelő kromatográfiás oszlopba töltött gyantákon, amiket alfa-galaktozidáz A izolálására használnak. A frakcíonálás létrejön például, -anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, katíoncserélő gyantákon (azaz például SP43 « * < * * « » Φ » φ Φ«Κ, ♦** Φ
e~on), aníoneserélő gyantákon (Q-Sepharose), affinitásgyantákon (Heparin Sepharose), méretkizárásos és hídrofób kölcsönhatáson alapuló oszk xse), valamint más, a szakterületen ismert kromatográfiás oszlopokon,
Mivel az alfa-galaktozidáz A-t a sejtek glikoformák heterogén keverékeként termeli, amiknek eltér a molekulatömegük és a töltésük, az alfa-galaktozidáz A hajlamos arra, hogy viszonylag széles csúcsokban eluálódjon a kromatográfiás gyantákról. Ezekben az elüeiókban a glikoformák meghatározott módon oszlanak meg, a használt gyanta természetétől függően. Például a méretkizárásos kroma.tográfia esetében a legnagyobb glikoformák hajlanak arra, hogy az elúeíós profilban korábban eluálődjanak mint a kisebb glikoformák.
Az ioncserélő kromatográfiában a legnagyobb negatív töltéssel rendelkező glikoformák hajlanak arra, hogy a pozitívan öltött gyantához (azaz például a Q-8<
rose-hoz) nag\ affí rdtással kötődjenek: mint a kisebb negatív töltésű glikoformák, ennek következtében, az elúeíós profilban később eluálódnak. Ezzel szemben ezek az erős negatív töltésű glikoformák kevésbé erősen kötődnek egy negatívan töltött gyantához, azaz például az oz, mint a kisebb nega ;n egyaitaian nem kötődnek.
A kromatográfiás gyantákon a glikoforma 1-val, az k a v:
terekkel, azaz
radiens elűeiők (egyenesvonalű, lineáris gradiensek, azaz például exponenciális .gradiensek) kiválasztása, vagy egy sor révód elúciós lépés használata az alfa-galaktozidáz A szóra a kromatográfiás oszlopról, szintén az alfa-galaktozidáz A frakcionáláshoz, Mindegyik yen faktor, egyedül, vagy kombinációban, optimalizálható, hogy eleijük a glíkoformák hatékony frakeionálásáx. A frakcionálás azután, is előfordul, hogy a tisztítási eljárás befejeződött, egy olyan kromatográfiás gyantán, amit szelektíven optimalizáltunk a írakeionálásra. és a kívánt glikoforma populáció szelektálására.
A glikoform populációk szelektálása a frakciónak alfa-galaktozidáz A fajokról megtehető az elvált alfa-galaktozidáz A elemzése után. Az elúciós csúcs különböző techgunkat, SDS-PAGB-val, izoelektromos fókuszálással, kapilláris elektroforézíssel, analitikai ioncserélő HPLC-vel és/vagy analitikai méretkizárásos HPLC-vel. Kiválaszthatók azok a frakciók, amik leginkább megfelelnek a kívánt méretnek vagy töltésprofílnak. A szelekció előfordulhat az eljárás mindegyik kromatográfiás lépésében, ami lehetővé teszi a kívánt glikoforma populáció elérését, vagy egy adott lépésre vagy lépéseke korlátozható, ha a lépések frakcionálási hatásfoka magas. A frakcionálás azután is megtörténhet, hogy a tisztítási lépést befejeztük, egy olyan kromatográfiás gyantán, amit szelektíven optimalizáltunk a frakcíonálásra. és a kívánt glikoforma populáció * X ·Χ * « * * V ♦ « χ «* χ * * *Χ* χ ♦X*
ΧΧΛ
Az alfa-galaktozidáz A erősen töltött és/vagy magas ven aka-gaenetikailag
készítménnyel elvégezhet??
öl származó alfa-galaktozidáz A-val, amely gelehet hagyományos génsebészeti beavatkozás re sejtvonalakon hajtható végre, hogy az előzőkben ismertetett módon magasabb szialilezést és foszforílezést kapjunk, vagy az előzőkben ismertetett pegilezetí alfa-galaktozidáz A-val.
Például az itt ismertetett alfa-galaktozidáz A tisztítási eljárásban az alfa-galaktozidáz A glikoformák írakeionálása az eljárás különböző· lépéseiben fordulhat elő, A bidrofób gyantán (Butyl Sepharose Pást Flow) a legnagyobb töltésű alfa-galaktozídáz A glikoformák eluálódnak először, ezeket követik a kisebb töltésű fajták. A Heparin Sepharose esetében a legnagyobb töltésű, fajták szántén elsőként eluálódnak az elúciös csúcsban, ezeket követik a kisebb töltésű fajták. A Süperdex 200 méretkizárásos kromatográfia esetében először a legnagyobb molekulatömegű glikoformák eluálódnak, ezeket követik az alacsonyabb molekulatömegű, kevésbé glikozilezett alfa-galaktozidáz A fajták. Hogy lehetővé tegyük az adott alfa-galaktozidáz A glikoforma populációk hatékony frakcíonálását, több kromatográfiás lépés kombinálható,, amik mind más-más fizikai elvek alapján frakción álnak. Például ahhoz, hogy megkapjuk a legkisebb pí. értékű (azaz a. legnagyobb negatív töltésű) alfa-galaktozidáz A glikoformákaí, az egyesítést a korai eluálő butil frakciókra korlátozva növelhetjük az erősebben töltött alía-galak46 ί
* ráz sziálsavat ad egy 2,6-kötéssel tozidáz A mennyiségét, Ha ezt a szelektált pool-t Heparín oszlopra visszük, majd a pool-ozást megint csak a korai, nagyobb negatív töltésű alfa-galaktozidáz A-ra korlátozva, ez tovább növeli mony pl értékű alfa-galaktozidáz A gbkoformák arányát a an. A glikoforma populáció tovl elvégezhető a tisztítási eljárás különböze PAGE-val vagy izoelektromos fókuszálással követjük az elüciós pool-ok méret- és töltés-eloszlását.. A méret és töltés alapján végzett frákcíonálás egyik példáját az alábbi, 2.4 példában mutatjuk be.
A szénhidrogén struktúra átrendezésének a második megközelítési módja magában foglalja a tisztított alfa-galaktozidáz An levő különböző glikoformák módosítását, további terminális cukor csoport hozzáadásával, tisztított glikoztl-franszferáz és a megfelelő nukleotid-cukor donor használatával. Ez a kezelés csak azokat a glikoförmákat érinti, amik megfelelő szabad terminális cukorcsoporttal rendelkeznek, amik akceptorként hatnak a használ gliközil-transzferáz számára. Például az a2,6-sziaJíl transzfejy terminális Gal|l 1,4GlcNAcnukleotíd-cnkor donorként CMP-szíálsavat. használva. A kereskedelmi forgalomban levő enzimek és forrásuk a következő; fűhöz al,3 franszferáz 111, V és VI (ember); galaktőz α 1,3 franszferáz (sertés); galaktőz β1,4 franszferáz (szarvasmarha.); mannóz o.l,2 franszferáz (élesztő); sziálsav a‘2,3 franszferáz (patkány) és sziálsav a2,6 franszferáz (patkány). Miután a reakció teli esen lelátsz
-franszferáz eltávolítható a reakcióX Φ φ·φ* * * φ φ φ elegyből, egy olyan glíkozil-transzferáz-specifikus affinitás oszlopot használva, ami a megfelelő nukleotidot egy 6 szénatomból álló karon .keresztül egy pírofoszfáftal (GDP, UDP) vagy foszfáttal (CMP) köti a gélhez, vagy más, a szakterületen ismert kromatográfiás módszerrel. Az előzőkben felsorolt ghkozil-transzferázok közül a szialil-transzferázok különösen jól használhatók az enzimek, azaz például az alfa-galaktozídáz A módosítására, aminek az a célja, hogy emberi betegek enzím-pőtlásos kezelésében használják őket. Akármelyik szíalíi-íranszferáznak CMP-5-fiuoreszeeinil-neuraminsavval mint nukleotld cukor donorral valő használata fiuoreszcencíásan jelzett glíkoprotemt eredményez, aminek a felvétele és a szövetekben valő lokalizálása, könnyen követhető,
A szénhidrát struktúra átrendezésének harmadik megközea. sejt, azaz az alfa-galaktozidáz A-t termelő sejt glikozilezésí mechanizmusát befolyásoló gének bejuttatását, hogy módosítsuk a poszt-transzlácíős processzálást a Golgi apparátusban. Ez egy előnyben részesített megvalósítási mód.
A szénhidrát struktúra átrendezésének negyedik .megközelítési módja magában foglalja az alfa-galaktozidáz A kezelését megfelelő glikozidázokkal, hogy csökkentsük a jelenlevő különböző glikoformák számát. Ha például a komplex gfikánláncokat egymás után neuramínidázzal, β-galaktozidázzal és β~ hexózammidázzal kezeljük, akkor ez az ofigoszacharídot a trimannóz magig hasítja.
* X « e« » * »
X « » X X ♦ »'»'«· »
» *
X »« X ·♦ ♦ X ♦ ♦ « *-»* « # «.-χχ »:·
Az N-kapcsolt glikán struktúrája függ attól, hogy a fehérje térszerkezetének kialakulása után a Golgi processzálási mannozidázok mennyire fémek hozzá a glikanlánchoz, és attól, hogy a Golgi apparátusban jelen van-e a glikozí!- transzíerázok családja és a megfelelő nukleotid-cukor dnorok. Számos glikozi.1transzferáz versengő reakciókat katalizál, amik azt eredményezik, hogy a glikán lánc több különböző és kompatibilis módon hosszabbodhat, attól függően, hogy melyik enzim hat elsőként. Ez eredményezi a mikroheterogenitást és a glikoíormák komplex családjának, képződését. Néhány struktúra csak egyetlen szövetre jellemző, azaz például néhány hipofízis hormonnak a módosítása. GalNAe-4-SÖ4 hozzáadásával, vagy csak néhány szervre korlátozódnak.
Ez utóbbinak egyik formája egy úgynevezett kettéágazó GlcNAe (GlcNAe, β!,4 kötéssel a magot alkotó mannóz csoporthoz kötve) a glutamiltranszpeptidáz komplex glikánjain a vesében, de a májban nem. A y-glutamiltranszpeptidáz kettéágazó struktúráját az alábbiakban mutatjuk be:
±Fucal,ó
SAa2,3/bGaipi,4G!cNAc^l,2Manahő\ 1
GleNacp 1,4Μηηβ 1,4GlcNacp 1,4GlcNAc-Asn
SAa2,3/6Gal|) 1,4Ο1οΝΑ.οβ 1,2Mana .1,3/
Emlősökben megtalálták a felelős enzimet, a GlcNAe transzferáz HI-at (Gnt-ΙΠ), az agy és a vese bizonyos sejtjeiben, valamint a hepatokarcinómában szenvedő betegek májának bizonyos sejtjeiben. A GnT-10 katalizálja az N-acetilglükózamin β 1.-4 kötéssel
Φ Χφ · « » * Φ Φ Φ « φ 9 ΦΦΦ
Φ χ ««» Λ9 való hozzáadását az N-kapcsolt cukorláncok trimannozil magja βkapcsolt mannózához, ezzel egy kettéosztott GlcNAc csoportot állítva, elő, A GnY-ΙΠ egér, patkány és humán génjeit klónozták [Ihara és mtsai: Journal eí Biochem. (Tokyo) 113, 692-698 (1993)].
További GlcNAc Φ-III aktivitás jelenléte humán sejtekben növelheti, a. monofoszforilezett hibrid glikánok. mennyiségét a bi-, trl- és tetra-elágazásos komplex glikánok rovására. Ennek nem szabad károsan befolyásolnia a plazma felezési időt, de növelheti a. vaszkuláris endoteliális sejtekbe való irányítást. Az alábbiakban egy reprezentatív struktúrát mutatunk be:
F-Manal,6\ GtcKAcpM Manói ,6 \ I
Marnx 1,3/ Man> 1,4GlcNAcp 1,4GlcNAc-Asn SAa2,3/6Ga$ 1,4GlcN Acp 1,2Maha 1,3/
Az alfa-galaktozidáz A-böl valamennyit felvesz a vese, és ez a tárolt glikolipidek szignifikáns növekedését eredményezi. Mivel a vese képes N-glikánokat képezni a kétágú GlcNAc csoportokkal, a vese epíteliális sejtjei az ezzel a speciális epitoppal rendelkező: glikoproteíneket nagy specifitással ismerik fel.
A megnövekedett GnT-ÍIl aktivitás képes a trimannozil mag elágazása egyensúlyának megbomlását okozni, azzal, hogy szubsztrát szinten gátolja a GnT-Π, IV és V, valamint a Gaip 1,4transzferázok révén történő további elágazást, Nemrég rekombináns GnT-III túlexpresszáltatásával egy olyan aranyhörcsog petefészek (CHÖ) sejtvonalat hoztak létre, ami kétágú oligoszacha50
Φ » «Φ Α » »« » * * * * Φ 4 Φ « Λ * ·**.»:
Φχν* « «V»* * ...:♦
Φ φφφ « Φ*Φ <* vitt. a gi [Sburlatí és mtsai: Biotechnok PTogr. 14, 189-192 (1998)]. Az interferon, bétát (IFN-β) választották modellnek és potenciális terápiás szekretáit heterolög fehérjének, amin a GnT-iO-expresszÍóns.k a termék glikozílez-ésére gyakorolt hatás ki lehet értékelni. A kétágú, oligoszacharidokat tartalmazó interferon-bétát termelik a génsebészeti úton. Gn'T-ΠΙ expresszálóvá tett CBÖ sejtek, míg a módosítatlan sejtvonal nem termeli.
A glíkoprotein. terápiás szerek termeléséhez a glíkozilezés jellemzésére van szükség, sarzsról-sarzsra való konzisztenciával. A „hipotetikus N-glikán. töltés Z”-t egy paraméterként használtuk, hogy egyszerű, hatékony módon jellemezzük a fehérjék .glikozilezését. A Z meghatározását többször megismételt kísérletben, ellenőrizték, és nagyon pontosnak valamint megbízhatónak bizonyult [Hermentin. és mtsai: Glycobiology 6, 217-230 (1996)].
Egy adott g' anioncser metríás pezésí er a
rőtéin hipotetikus N-glikán t
nagynyomású
HPAEQ/pulzalö amperokombínácíöjával kapott N-glikán térkészámítjuk ki. A HPÁEC-ben az Nazaz sziálsav-csoportjaik száma válnak szét, ezzel megkülönböztethető régiókat biztosítva a neutrális struktúráknak, azaz például a mono-, di-, tri- és tetraszlalilezett N-glikánoknak. A Z definíció szerint a megfelelő területek termékeinek (A) az összege az aszialo-, mon.oszia.lo-, diszialo-, triszialo-, tetraszialo- és pentaszialo régióban, et a megfelelő töltéssel szorozva:
Z AjassaaJo; ·* Aí.ms}® 1 -*·Α$«ι*2·*· Afmsj*3+ Afr«ö-«si®4 (-*·Afpentas}·5]
Z=CAísi*(i} ahol i értéke 0 az asrialo régióban, 1 a monoszialo (MS) régióban., 2 a diszialo (DíS) régióban, 3 a tószialo (TriS) régióban, 4 a tetraszialo (TetraS) régióban és 5 a pentassiálo (Penta) régióban.
Tehát a főleg C4-4* struktúrájú glikoprotein Z értéke s400, egy főleg C2-* struktúrákat hordoz glikoproteín Z értéke a2ÖÖ, és a magas mannoxtartalmu, vagy csonkított struktúrákat hordozó glikoproteín Z értéke aö.
A jelen találmány szerinti humán glikozílezett alfa-galaktozidáz A készítmények oligoszaeharid töltése, a Z számmal mérve nagyobb mint 100, előnyösen nagyobb mint 150, és még előnyösebben nagyobb mint 170.
A szérum alfa-galaktozidáz A felezési idejének megváltoztatása fossforílezéssel
Az alfa-galaktozidáz A foszforilezése úgy változtatható meg, hogy befolyásolja az alfa-galaktozidáz A felezési idejét a keringésben és a sejtekbe belépő alfa-galaktozidáz A mennyiségét. A foszforílezést előnyösen az alfa-galaktozidáz A-t. expresszáló sejtekben lehet elérni. Specifikus- megfontolás tárgyát képezi egy olyan glikozílezett alfa-galaktozidáz· A készítmény előállítása, aminek megnőtt a foszforilezettsége, oly módon, hogy egy alfa-ga~ laktozidáz A-t termelő sejtbe foszforll-transzferázt kódoló DNS szekvenciát juttatunk be, vagy homológ rekombinációval egy endogén foszforil transzferál gén expresszíóját szabályozd szabályozó-szekvenciát juttatunk be. Az alfa-galaktozidáz A-t termelő sejtet azután olyan körülmények között szaporítjuk, ami az alfagalaktozídáz A és a foszforil-transzferáz expresszióját eredményezi. Azután a polínukleotidot nem tartalmazó· sejtben termelt alfagalaktozidáz A~hoz viszonyítva erősebben foszforilezett alfa-galaktozidáz A készítményt .izoláljuk. Az ilyen íoszforil-transzferázok jól ismertek, a szakirodalomban, lásd például az 5,804,413 és 5,789,247 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírást, amely publikációkat a továbbiakban n
Két membránhoz kötött Golgi enzim összehangolt akciójára van szükség ahhoz, hogy egy lizo&zómáhs proenzknen egy Man-ófoszfát felismerési markert generáljanak. Az első, az UBP-vY-aeetilglükőzamin: glikoprotein >aeetilglüközamm, l-foszfetranszferáz (GlcNAc foszfotranszferáz) egy fehérje felismerési determinánst igényel a lizoszómálís enzimeken, ami két, egymástól 35 Angström távolságban levő, a magas mannóztartaknn lánchoz viszonyítva helyes térállásban üzmcsoportbol áll A második, az A-aeetílglűkózamin-1 -fosziodiészter egy A-aeetíIglükozamínidáz (foszfodiészter ά-GlcNAcáz) hidrolízálja az· α-GlcNAe-foszfát kötést, ezzel hozzáférhetővé téve a Mán-6 -foszfát felismerési helyet,
A jelen, találmány szerinti módszerek szerint a jelen találmenyek több glikoformát tartalmaznak, amiknek 16--S0%~a, előnyösen .25-50%a, még előnyösebben legalább 30%-a íószfórilezve van.
Áz alulszialilezett' glikánok srialilezettségének növelését terminális galaktóz csoportokkal ügy hajthatjuk végre, hogy emlős,, előnyösen humán sejteket szialil-transzferáx génnel transzfektálunk.
A jelen találmány tárgyát megnőtt oligoszacharíd töltéssel rendelkezző glikozilezetf alía-galaktozídáz A készítmény képezi, amit úgy állítunk elő, hogy először egy alfa-galaktozidáz A-t termelő sejtbe bejuttatunk egy szialil-transzferázt kódoló polinukleotídot, vagy homológ rekombinációval bejuttatunk egy szabályozó-szekvenciát, ami egy endogén szialíl-transzferáz gén expresszióját szabályozza. Az alfa-galaktozidáz A~t termelő sejtet azután olyan tenyésztési körülmények között tenyésztjük, amik az alfa-galaktozidáz A és a szialíl-transzferáz expresszi óját eredményezi. A kővetkező lépés a megnőtt oligoszacharid töltéssel rendelkező alfa-galaktozidáz A készítmény izolálása. Az előnyben részesített szlalil-transzíerázok közé tartozik egy a2;3szialil-transzferáz és egy a2,6-száaB-transzferál Ezek jól ismert szialil-transzferázok, lásd például az 5,858,751 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírást, amely publikációt a toreiereneí&Kf részesített megvalósítási mód szerint ez a szialilezést növelő eljárás magában foglal egy további lépést, amiben a megnőtt méretű vagy megnőtt töltésű alfa-galaktozidáz A glíkoformákat izoláljuk, a tisztításával (lásd az előzőket).
* fc 9 9 «
Egy másik változat szerint a jelen találmány úgy biztosítja a lilezés növeléséi, hogy a sejteket alacsony ammőnium··tartalmú tartjuk. Fontosabban, egy erősebben.
-g&laktozidáz A készítményt úgy állíA-t termeié sejtet olyan tenyésztő közeggel hozzuk érintkezésbe, amiben az ammóniámkoncentráció 10 mmol/l alatt, előnyösebben 2 mmol/1 alatt van. A szíalüezés növelését úgy érhetjük el, hogy a termelő sejteket perfundáitatjuk, aminek az az eredménye, hogy a toxikus métabolítokat, azaz például az ammóniát, időről időre eltávolítjuk a tenyésztő közegből. Egy előnyben részesített megvalósítási mód szerint az alacsony ammönium-tartalmú környezetet ügy étjük el, hogy glutamln-sziníetáz gént vagy cDNS-t adunk, a termelő sejtekhez. Egy másik változat szerint az -alacsony ammőnium iart&lmú környezetet úgy érjük el, hogy' az alfa-galaktozidáz A-t termelő sejtet friss tenyésztő közeggel perfundáitatjuk, hogy ezzel az ammónlum-koncentrációt. lö mmol/1 alatt, előnyösen 2 folyamatosan
1/1 alatt tartsuk. A termelő perfundáitatjuk friss tenyésztő közeggel, aminek az ammóniámkoncentrációja 10 mmol/1 alatt, előnyösen 2 mmol/1 alatt van. Egy másik változat szerint a termelő sejteket időközönként perfundákathatjuk friss tenyésztő .közeggel Az időközönként végzett perfúziő szakkifejezés, ahogy azt a továbbiakban használjuk, a szabályos időközönként, periodikusan véglett perfúziót jelenti, vagy azt, hogy jelenti, hogy mérjük az ammóníum-koneentrácíőt, és akkor végezzük el a perlüziőt, amikor az eléri a megcélzott koncentrációt (azaz az l.ö mmol/1-t, előnyösebben, a 2 mmol/1-t). Áz időközönként végzett perfuziót olyan- gyakorisággal kell végrehajtani, hogy az ammőnium-koncen.tráciő soha ne haladja meg a megcélzott koncentrációt. A termelő sejteket olyan időközönként perfundáltatjnk, ami ahhoz szükséges, hogy olyan alfa-galaktozidáz A készítményt kapjunk, amiben a glikánok 5070%-han, előnyösen 60%-ban szialüezve vannak.
A szérum alfa-galaktozidáz A keringési felezési idejének növelése az alfa-galaktozidáz A pegllezésével
Szintén a jelen találmány szerint egy humán glikozílezett alfa-galaktozidáz A készítmény felezési idejét a keringésben ügy növelhetjük, ha az alfa-galaktozidáz A-t polietilénglikollal komplexbe visszük. A polietíiéngiikol (PEG) egy vízoldhatő polimer, ami kovalens kötéssel a fehérjékhez kötve megváltoztatja tulajdonságaikat, oly módon, hogy megnöveli potenciális felhasználhatóságukat. A polietilénglikollal végzett módosítás („pegilezés”) egy jól kidolgozott technika, aminek megvan a kapacitása, hogy a fehérje- és peptid-gyógyszer-készítmények számos problémáját megoldja vagy enyhítse,
A pegilezett. fehérjéknek a módosítatlan fehérjékkel összehasonlítva javított gyógyászati teljesítőképessége ösztönzi az ilyen típusú konjugátumnak terápiás ágensként való- kifejlesztését. Azok az enzím-deíieíencíák, amikre a természetes enzimmel végzett terápi hatástalan volt (a .gyors kiürülés és/vagy immunológiai reakciók miatt), most. már kezelhetők az ekvivalens P.EG-enzimekkel. Például a. PEG-adenozin-dezamináz már megkapta az PDA jóváhagyást (Delgacto és mtsai: Crit, Rév. Ther. Drug Carrier Svat. 9, 249-304 (1992)1 alaktozidázhoz kőÁ PBG-nek a zöldkávéfoól származó alt ens kötéssel való hozzákapcsolása molekulán levő determináns helyek maszkolásával megváltoztatja, az enzim katalitikus tulajdonságait Ennek eredménye a Km értékének növekedése és a Vmax értékének csökkenése a p-nitrofenil sznbsztrát analógokkal szemben (Wíeder & Davis: d. Appl. Biochem. 5, 337-347 (1983)]. Az alfa-galaktozidáz még képes lehasítani a terminális galaktóz csoportokat a humán nyál vércsoport B anyagáról. Az ellenanyag- és lekiin-speeiiikus kötődés elvész a PEG-alfa-galaktozidázbóL A természetes alfa-galaktozidáz ellen készített ellenanyagok képesek blokkolni az enzimaktivitást, és ez a gátlás fokozatosan, elvesz, ha progresszíve növekvő mennyiségű PEG-et tartalmazó készítményekkel szemben teszteljük.
a PEG-alfa-galakíozidázzal immunizált állatokból származó antiszéruxnok egyik alfa-galaktozidáz vagy PEG-alfa-galaktozidáz készítményben sem gátolják az enzim aktivitását. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a PEG hajlamos a lektűr-specifikus szénhidr egységek és antigén determinánsok lefedésére, és ezek a helyek valószínűleg kriptikusak maradnak a PEGamek xn urno prooesszaiasa során.
A PEG Kovalens Kötessél leneneKhez való Kapcsolása megkívánja a polimer terminális hidroxil-csoportjának egy megfelelő lehasadó csoporttal való aktiválását, ami a lizín s-amino terminálisának és az N-terminális ά-amino csoportjának a nukleoffi támadásával helyettesíthető. Hét kémiai csoportot
alkalmaznak a FEG aktiválására. Az egyes alkalmazásokban a különböző kapcsolási módszerek különböző· előnyöket biztosítanak, A pegllezés különböző módszerei meglepő és drasztikus hatással vannak az olyan faktorokra, mint például a kapott pegilezett fehérjék és peptidek biológiai aktivitása megmaradására, stabilitására és immunogenitására (Francis és mtsai: Int, J. Hemafol. 68(1 k 1-1.8 (1998)). Egy hnker nélküli pegilezési technika például csak a FEG-et kapcsolja a megcélzott molekulához. Pontosabban, egy biológiailag optimalizált pegilezésí technika alkalmazása, amiben trezil-monometoxi FEG-et (TM.FEG) használunk, Francis és munkatársai szerint számos különböző fehérje esetében felfedi, hogy' kivételesen képes konzerválni a célpont biológiai aktivitását [Francis és mtsai: Int. J. Hematol. 68(1 b 1-18 (1998)). Ez, valamint az a jótékony hatás, hogy polietilénglikolon kívül (amiről bebizonyosodott, hogy a humán terápiában biztonságosan használható) mást nem viszünk a fehérjébe, ideálissá teszi az alfa-galaktozidáz A módosítására.
A polietilénglikolnak a fehérjékhez való kapcsolására négy lehetséges hely van: 1) aminocsoportok (N-terminális és lizin); 2) karboxicsoporíök (aszparaginsav és glutaminsav); 3) szulfhidrü csoportok (císzteín'g és 4) szénhidrát csoport (perjodát kezelés után kapott szuífhidril csoportok), A fehérjék karboxicsoportjához és a szénhidrátokon levő .aldehid-csoportokhoz való kapcsoláshoz egy nukleofíl ammocsoporttal rendelkező polietiléngiikoi reagensre van szükség. Ez a kémia megváltoztatja az alfa-galaktozidáz A pl értékét, miután a. negatív töltésű karboxícsoportot megköti a polietiléngiikoi. A pl bármilyen változása befolyásolhatja az alfa58 galaktozídáz A biológiai aktivitását. Emellett, a a szénhidrát lánchoz való kapcsolása befolyásolhatja az alfa-galaktozídáz A-nak az M6P receptor által való megkötését, ami kritikus a biológiai aktivitás szempontjából· A szulfhidril kémia érinti a molekula fizikai szerkezetét is, és ez nem íavasolf.
A pegaezes általánosan hoznak létre a fehérje amínocsoportja és a monometoxi-PEG meteedcsoportja között. Az NHS-PEC kereskedelmi forgalomban van., és amidkótést eredményez a fehérje és a polietilénglikol kozott. Azonban az amidkötés kialakulása megváltoztatja a pl értéket, mivel elvesz a -NHs· csoport pozitív töltése.
A polietilénglikol alfa-galaktozidáz A-hoz való kapcsolásának az a módszere, amiben nem. változik a pl érték., trezíiPEG-et használ. A trezil-PEG az amínocsoporton keresztül végzi a kapcsolást, és stabil szekunder amint képez. A szekunder amínnal az az előnye, hogy megtartja az aminocsoport pozitív töltését, A trezil-PEG kereskedelmi forgalomban van, és stabil liofilézett és kiszárított formában. A trezíi-PEG-et alaposan jellemezték, és a melléktermékek is jól ismertek. Ennek megfelelően, egy előnyben részesített megvalósítási szerint az a-ga-
laktozídáz A készítményt komplexbe visszük trezíl-monometoxi iénglikolla! (TMFEG), így pegilezett-alfa-galaktozidáz A-t ze. A pegilezett-alfa-galaktozidáz A-t azután tisztítjuk, így izolált, tisztított pegilezett-alfa-galaktozidáz A-t,
REAKCIŐSWA
CH3(OCH2CH2)rOSO2CH2CF:
CH3(OCH2CH2}n-H
-fehérje je-trezilezeti monometoxiAz alfa-galaktozidáz A tartalmaz 13 amínocsoportot, 17 samlnocsoportot (lizin) és egy a-amínocsoportot (N-termínális). A reakció ügy szabályozható, hogy minimális helyettesítésekkel termeljük az alfa-galaktozidáz A-t, és a molekulákat, amikben molekulánként csak egy, vagy kevesebb PBG egység van, megtisztíthatjuk a helyettesíteűen és többszörösen helyettesített formáktól. Az alfa-galaktozidáz A többszörös helyettesítése nem befolyásolhatja, szignifikánsan a biológiai aktivitást; ennék következtében a végtermék 1-1.8 kapcsolódó polietílénglikol molekulát tartalmazó heterogén elegyet eredményezhet. A helyettesítés szintje függfet a visszatartott enzimaktivitás szintjétől. Meg kell jegyeznünk, hogy az enzimaktivítás csökkenése eltolható egy fokoztt terápiás hatással, ami az alfa-galaktozidáz A keringési felezési idejének növeléséből és immun-felismerésének csökkenéséből származik, tehát a PEG-alfa-galaktozidáz A termék kifejlesztésében a polietíléxiglíkölnak az alfa-galaktozidáz A-hoz viszonyított aránya a biológiai aktivitástól függhet, és nem árőlaa az enzimaktívitástól.
szésí reakcióhoz szabályozott pH~ra., pu.fferősszetételre es lenene-Koncentrácíóra van szükség. A helyes reakcíókörül6«
Κ
φ *» is használnak a gyártási eljárásban. Közvetlenül a reakció előtt a trezil-PEG-et gyorsan, szolubilizáljuk vízben, folyamatos keverteles közben. Azután ezt az oldatot hozzáadjuk az elkészített alfagalaktozidáz A-hoz, és hagyjuk hogy szabályozott ideig és szabáC-on)·, Á pegilezés a végső tisztítási lépés előtt hajtható végre, ami elimínálja a tisztítási eljáráshoz hozzáadott lépéseket. Miután a kapcsolás teljes, a PEG-alfa-galaktozídáz A-t a többi tisztítási lépésben proet vég ?a a r va rét tisztítási lápéi eltávolítsuk a melléktermékeket. Mivel a poiietiiénglikoi nem. tartalmaz semmilyen negatív töltést, ezért ezt nem tartja vissz a Q úepnarose, es az atiolyoval murai.
A pegilezés mértékét ismert technikákkal lehet mérni, Például a üuoreszkamín fluoreszkál, ha a fehérjék α-amino és samino csoportjaihoz kötődik, A fluoreszcencia. elvesztésének százaléka a pegilezés után korrelál az alfa-galaktozidáz A-hoz 1 poiietiiénglikoi százalékával. A fehérje-koncentráció rozására a Píerce BCA esszét lehet használni, A mehlumbiferil-aD-galaktopiran.ozid (4-MUF-a-Gal) aktivitás esszét használjuk a PEG-aiía-galaktozidáz A enzim aktivitás hatásának kiértékelésére. Az alfa-galaktozidáz A tartalmaz MóP-t, ami a lizoszőmákba való bejutáshoz szükséges. Azt, hogy a poiietiiénglikoi mennyire zavarja az M6.P receptor felismerést, egy sejt-alapű esszével érté61 kelhetjük ki, ami követi a pohetiléngEkol-alfa-galaktözidáz A
Az aifa-gaíaktozídáz A készítmény beadási módszerei
A jelen találmány szerinti készítmények (azaz azok, amik különböző alfa-galaktozidáz A gUkoformákat tartalmaznak) bármilyen módon beadhatók, ami kompatibilis az alfa-galaktozidáz A készítménnyel A tisztított, alfa-galaktozidáz A készítmény azoknak az egyebeknek adható be, akik vagy hibás, vagy nem elegendő mennyiségű alfa-galaktozidáz A fehérjét termelnek, vagy akiknek az alfa-galaktozidáz A terápia jótékony hatású lehet. A jelen találmány szerinti terápiás készítményeket bármilyen megfelelő módon beadhatjuk, azaz közvetlenül (úgymint lokálisan, injekcióval, beültetve vagy egy szöveti pontba való topikális beadással) vagy szisztémásán (azaz orálisan vagy parenterálisan).
A beadás útja lehet orális vagy parenterális, beleértve az intravénás, szubkután, íntra-aríeriális, intraperitoneális, szembe történő, intramuszkuláris, szájúregbe történő, rektális. vagináiig, intraorhítális, mtracerebrális, intradermális, a koponya belsejébe történő, intraspínális, mtraventríkuláris, íntratekális, intracisztemálís, intraka.psxuláris, intrapulmonáris, íntranazálís, transzmukozális, transzdermális beadási módot, vagy a beiégzésü Az intrapulmonáris beadási módokat, berendezést és gyógyszerkészítményt például az 5,785,048, 5,780,019 és 5,775,320 számú Amerikai Egyesült Államok-belí szabadalmi leírásban ismertetik, amely publikációkat a továbbiakban referenciaként kezelünk. Az intradermális bejuttatás egy előnyben részesített módszere az szók segítségévek egy ilyen bejuttatást módot az 5,843,015 számú Amerikai Egyesült Államokszabadalmí leírásban ismertetnek, amely publikációt a tóvá biakban referenciaként kezelünk,
A beadás egy különösen előnyős módja a szubkután injekciózás, A jelen találmány szerinti alfa-galaktozidáz A készítményt úgy szereljük ki, hogy a teljes szükséges dózist beadhatjuk egyetlen, egy-két milliliteres injekcióban. Ahhoz, hogy az injekció térfogata egy-két milliliter lehessen, a jelen találmány szerinti alfa-galaktozídáz Á készítményt olyan koncentrációban szereljük ki, hogy az előnyben részesített dózist egy-két milliliter térfogatban lehessen beadni, vagy az alfa-galaktozídáz A készítményt kiszerelhetjük liöfilezett formában, amiből beadás előtt vízben vagy megfelelő, fiziológiásán kompatibilis pnfferben elkészítjük, a. megfelelő oldatot. Áz alfa-galaktozidáz A készítmények szubkután injekcióinak az az előnyük, hogy a betegek számára kényelmesek, főleg araikor önmaguknak adják be az injekciót, emellett pedig az intravénás beadáshoz viszonyítva hosszabb plazma felezési időt eredményeznek. A plazma felezési idő meghosszabbítása azzal az eredménnyel ját, hogy az alfa-galaktozidáz A hatékony plazmaszintje hosszabb ideig megmarad, aminek az a jótékony hatása, hogy a klintkaíéag érintett szövetek hosszabb ideig érintkeznek az injekciózott alfa-galaktozidáz Aval, és ennek eredményeképpen több alfa-galaktozídáz A jut be az ilyen szövetekbe. Emiatt jobb a betegekre gyakorly hatása.
vaov c azaz
χ «*Χ X dául az újratölthető injekciós tollak és tű nélküli injekciós eszközok használhatók a jelen találmány szerinti alfa-galaktozídáz A készítményekkel, amint azt az alábbiakban tárgyaljuk.
A beadás módja lehet a készítmény bolus periodikus injekciőzása, vagy beadhatjuk a készítményt intravénásán vagy intraperitoneálisan egy tartalékból, ami lehet külső (azaz egy intravénás zacskó) vagy belső (azaz egy biológiailag lebomlő ímplantátum, egy mesterséges biológiai, szerv, vagy beültetett alfa-galaktozidáz A-t termelő sejtek populációja) (4,407,957 és 5,798,113 számú Amerikai Egyesült Államok-beli -szabadalmi leírás, -amely publikációkat a továbbiakban referenciaként kezelünk). Az intrapuimonáris beadási módokat és berendezéseket például az 5,645,007, 5,780,(314 és 5,314,607 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban ismertetik, amely publikációkat a továbbiakban referenciaként kezelünk. Más használható parenterális bejuttató eszköz például az etilén-vinilacetát kopolimer részecskék, az ozmotikus pumpák, a beültethető infúziós rendszerek, a pttmpás bejuttatás, a kapszulázott sejtek bejuttatása, a iiposzómális bejuttatás, a tűvel bejuttatott injekciók, a tű nélkül bejuttatott injekció, a nebulizátor, az aeroszolizátor, az elektroporáciő és a transzdermáks tapasz. A tű nélküli injekciós eszközöket az 5,879,327, 5,520,639; 5,846,233 és 5,704,911. számú Amerikai Egyesült. Államok-beli szabadalmi leírásokban t a továbbiakban referenciaként elyik előzőkben ismertetett alfa-galaktozidáz A
<34 y * *
X * XX* *
«.«,«« « »#** *
X φφ» ♦' *X·* ♦ ♦:
ι, és a bejuttatott fehérje mennyiségét olyan módszerekkel határozhatjuk meg, amik a szakterületen jártas szakember kőtelező ismeretei közé- tartoznak, Emellett, a szakterületen. jártas szakember tudatában van annak, hogy egy terá•érie beadási módja és dózisa, a terápiás dózist.
A jelen találmány tárgyát képezik továbbá egy alfa-g zidáz A készítmény új kiszerelési formái, amik lényegében azaz az a nem- a albumíntól, a gazdasejt által termeit nem-alfa-galaktozidáz A fehérjéktől, vagy egy állati szövetből vagy folyadékból izolált fehérgiásan elfogadható folyékony szuszpenzíó vagy oldat egy részét. A hordozó vagy töltőanyag oly módon kompatibilis, hogy amellett, hogy a kívánt készítményt bejuttatja a betegbe, nem érinti károsan a beteg elektrolit rendszerét és/vagy térfogat-egyensúlyát. A parenterális beadás használható oldatait a gyógyszerészeti szakmában ismert bármelyik jól. ismert módszerrel előállíthatjuk [Remíngton’s Pharmaceuticaí Sciences, szerk.; Gennar, A., Mack Pub. (1990)}. N'em-parenterális készítmények is használhatók, azaz például kúpok vagy orális készítmények.
A készítmény előnyősén tartalmaz egy töltőanyagot. Az alfagalaktozidáz A-hoz használható, gyögyászatilag elfogadható töltőanyagok, amiket betehetünk a készítménybe, lehetnek puf65 * « w »· ♦* φ *« » * * * A « « 0 « AT » * X «
X «♦* ♦ ♦ Φ terek, azaz például citrát-puffer, foszfát-puífer, aeefát-puffer és bikarbónát-puffer, amínosavak, karbamid, alkoholok, aszkorbínsav, foszfolipidek; fehérjék, azaz például szérumalbumin, kollagén, és zselatin; sok, azaz például EDTA és EGTA, valamint nátrium-klorid;. liposzőmáfc; poliriníl-pirrolidon; cukrok, azaz például dextrá.n, ma.nn.it, szerbit és glicerin; glicin vagy más aminosavak és lipidek. Az alfa-galaktozidáz A készítményekben használható puffer-rendszerek közé tartoznak az acetát, a bikarbónát és a foszfát pufferek (mindegyik beszerezhető a SiGMA-tól. Az előnyben részesített megvalósítási módban foszfát puffért használunk. Az alfa-galaktozidáz A készítmények előnyben részesített pH-tartománya 4,5-7,4.
A készítmény emellett előnyösen tartalmaz még egy nemionos detergenst. Az előnyben részesített nem-ionos detergensek közé tartozik a Polysorhate 20, a Polysorbaye 80, a Triton X-100, a Tritob X-114, a Nonidet P-40, az oktil-a-glükozid, az oktil-βglukozid, a Brij 35, a pluro-nic és a Tween 20 (mindegyik beszerezhető a SIGMA-tól).
Egy különösen előnyben részesített készítmény Polysorhate 20 vagy Polysorbate 80 nem-ionos detergenst és foszfáttal puffereit sóoldatot tartalmaz, legelőnyösebben pH-δ értéken.
Az alfa-galaktozidáz A készítmények líofilezéséhez a fehérjekoncentráció 0,1-10 mg/ml lehet. Térkitöltő ágensek, azaz például glicin, mannít, albumin. és dextrán adhatók a liofilező elegyhez. Emellett a feltehetően kríoprotektáns tulajdonságokkal rendelkező anyagok, azaz például diszacharidok, aminosavak és
Φ* * >
X φφ * φ φ
X Φ X X * * φ φ > . φ φ Φ Μ « ♦ Φ Φ 9 # χ ΦΦΦ Φ Φ>1 adhatók a liofilezó elegyhez.. Bármelyik előzőkben felsorolt puffer, töltőanyag és detergens hozzáadható az elegyhez.
Az injekciózáshoz készített alfa-galaktozidáz A egy előnyben részesített kiszerelési formájában a fehérje-koncentráció 1 mg/ml.
A beadáshoz való kiszerelési formák tartalmazhatnak glicerint és más. magas viszkozitású komponenseket, amik abban, hogy az ágens a kívánt lökuszban maradjon, A ibilís polimerek, előnyösen a biológiailag felszívódó, biológiailag kompatibilis polimerek (beleértve például a hialuronsavat, a kollagént, a polibutírát, a laktid és a mereket, valamint a laktid/glikolid 1 tó töltőanyagok az ágensek ín. fovo lyozásában·. A parenteraiis beadáshoz szánt kiszerelési forrnák közé tartozik a glikokolát a szájöregen keresztül való beadáshoz, a. metoxíszalieilát a rektális beadáshoz vagy citromsav a vaginális beadáshoz. A rektális beadáshoz használt kúpokat úgy állíthatjuk elő, hogy a jelen találmány szerinti alfa-galaktozidáz A készítményt összekeverjük egy nem-irritáló töltőanyaggal, azaz pél
szilárd, testhőmérsékleten pedig folyékony,
Az inháláeiós beadáshoz szánt készítménvek tartalmaz».· hatnak laktőzt vagy .más töltőanyagokat, vagy lehetnek vizes oldatok, amik tartalmazhatnak poho.xietilén-9-lauril étert, glíkokoiátot vagy dezoxikolátot. Egy előnyben részesített belégzési aeroszolt az jellemez, hogy részecskéinek kisebb a sűrűsége és nagyobb a mérete. A 0,4 gramm per köbcentiméternél kisebb sú6?
** rüségú· részecskék, amiknek az átlagos átmérője meghaladja az 5 um-t, hatékonyan bejuttatják a szisztémás keringésbe a terápiás hatóanyagokat. Az ilyen részecskék mélyen hejutnak a tüdőbe, és elkerülik a tüdő természetes kiürítő mechanizmusait, ameddig a helégzett részecskkék leadják a szállított anyagot [Edwards és mtsai: Science 276, 1868 -1872 (1997)). A jelen találmány szerinti alfa-galaktozidáz A készítmények beadhatók aeroszolizáit formában, például az 5,654,007, 5,780,014 és 5,814,607 számú Amerikai Egyesült Államok-beli s^thadalmi leírásban ismertetett módszerek, készítményei és kiszerelési formák használatával, amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk. Az intranazális beadáshoz szánt készítmények tartalmazhatnak olajos oldatokat az orrcseppek formájában való· beadáshoz, vagy lehetnek gélek, az intranazális beadáshoz.
A bőr felszínére történd topikális beadáshoz készített készítményeket úgy állíthatjuk elő, hogy az alfa-galaktozidáz A készítményt egy derniatológíailag elfogadható hordozóval, azaz borogatóvízzel, krémmel, kenőccsel vagy szappannal diszpergáljuk. Különösen azok a hordozók hasznosak, amik filmet vagy réteget képeznek a bőrön, hogy lokalizálják az alkalmazott anyagot, ée meggátolják az eltávolítást. Ahhoz, hogy a belső szövetfelszínekre topikálisan tudjuk alkalmazni, az alfa-galaktozidáz A készítményt folyékony szövetragasztóban vagy más olyan anyagban diszpergálbatjuk, amiről ismert, hogy fokozza a szövet felszínéhez való adszorpciót.
számos nv za es tát írtak le a transzmukozális gyógyszer-beadáshoz, lásd például a 4,740,365, 4,764,378 és 5,780,045 számú
Amerikai Egyesű szabadalmi leírás, amely kácíót a továbbiakban referenciaként kezelünk. Hídroxípropilceb iulóz vagy fibrinogén/trombin oldatok is használhatók. Egy másik változat szerint szövet-beborító oldatok azaz a sterilitás fenntartására, az aktív adalékanyag aktivitásának eloszlás és tárolás során, és egyszerűen és hatékonyan be 1 galaktozidáz A készítmény egy megvédésére a megfelelő idní a betegnek. Az alfaíekeíozhatő kiszerelési formáját juk lezárt ampullában, aminek a tartalma tűvel és fecskendővel eltávolítható. Az ampullát, szánhatjuk egyszeri vagy többszöri felhasználásra. A készítményt kiszerelhetjük előre betöltött fecskendőben. Néhány esetben. a tartalmát biztosíthatjuk folyékony formában, míg más esetekben biztosíthatjuk száraz vagy liofílezett állapotban, ami néhány esetben megköveteli, hogy egy standard, vagy külön biztosított oldószerrel helyreállítsuk a folyékony állapotot. Ha a készítményt folyékony formában biztosítjuk az intravénás beadáshoz, akkor ebhez használhatunk steril zacskót vagy konténert, ami alkalmas arra, hogy egy intravénás beadási vonalhoz vagy katéterhez kapcsoljuk. Az előnyben részesített megvalósítási módok szerint a jelen találmány szerinti készítményeket folyékony vagy porított formában biztosítjuk, olyan berendezésekben, amik kényelmesen, bejuttatnak egy előre megbatározott dózist a készítményből; ilyen berendezés lehet például egy tű. nélküli injektor szubkután vagy ♦ X ♦ «»»
4ΧΚ intramuszkuláris injekciózáshoz, és sgy mért dőzisu bejuttató berendezés. Más esetekben a készítményt olyan formában biztosíthatjuk, ami alkalmas az ellenőrzött leadásra, azaz például egy tapaszban vagy kötszerben, amit a bőrre kell tenni a transzdermálís beadáshoz, vagy lebomlő eszközök formájában a transzmukozális beadáshoz. Azokban az esetekben, amikor a. készítményt tabletta vagy pirula formájában, orálisan adjuk be, a készítményt, kiszerelhetjük egy eltávolítható tetejű palackban. A konténereket a .megfelelő információkkal láthatjuk el, azaz például, hogy mi. a készítmény formája, a gyártó vagy a. disztribútor neve, az indikáció, a javasolt dózis, a javasolt tárolási körülmények, vagy' javaslatok a beadáshoz.
* *
ο « « «. XX * .
Χΐ X * * «
Wflí-’Í' * * *«« ♦*
A j elen találm ány tárgyát képezik továbbá a Fabry- betegségben szenvedő betegeknek, a Fabry-betegség atipikus formáiban, vagy olyan kórban szenvedd betegeknek, akikben az alfa-galaktozidáz A-nak csökkent szintje vagy mutáns formája van jelen, beadott alfa-galaktozidáz Á készítmény beadási módszerei. A beadott dózis előnyösen 0,05-5,0 mg, még előnyösebben 0,1-0,3 mg alfa-galaktozidáz A készítmény per testtömeg kg, és ezt hetente vagy kéthetente adjuk be. A fehérjét szabályos időközönként ismételt dózisait a betegnek egész életében kapnia kell. Szubkután injekciókat használhatunk hogy hosszabb ideig fenntartsuk a gyógy szerrel való szisztémás érintkezést, A szubkután dózis 0,01-10,0 mg, előnyösen 0,1-5,0 mg alfa-galaktozídáz A készítmény per testtömeg kg, hetente vagy kéthetente. Az intramuszkulárís injekciókkal beadott alfa-galaktozidáz A készítmény dózisai lehetnek azonosak, vagy lehetnek a szubkután dó zistól eltérőek: egy előnyben részesített megvalósítási mód szerint az intramuszkuláris dózisok kisebbek mint a szubkután iniekcíózott dózisok, és ritkábban adjuk be azokat. Az alfa-galaktozidáz A készítményt beadhatjuk intravénásán, azaz például intravénás bolus injekcióval, egy lassan nyomott intravénás injekcióval, vagy folyamatos intravénás injekcióval. A folyamatos (azaz például 2-6· óra hosszan tartó) intravénás infúzió lehetővé teszi, hogy specifikus szinteket tartsunk fenn a vérben.
Egy alternatív, előnyben részesített megvalósítási mód az alfa-galaktozidáz A készítmény egy betegnek való beadásához abból all, hogy az alfa-galaktozidáz A készítményből több évig, χ » »í akár három évig, hetente vagy kéthetente beadunk egy előnyben részesített dózist, .amely idő alatt a beteget klinikailag ellenőrizzük, és kiértékeljük betegségének állapotát. A például a vese vagy szív-funkciók, vagy a beteg általános állapotának (azaz például fájdalom) javulása, alapján mért klinikai javulások, valamint, a laboratóriumi értékek javulása, azaz például a CTH szintek csökkenése a vizeletben, a plazmában vagy a szövetekben, használható a beteg egészségi állapotának becslésére. Abban az esetben, ha klinikai javulás figyelhető- meg a kezelés után és az ellenőrzési periódusban, akkor az. alfa-galaktozidáz A beadás gyakoriságát csökkenthetjük, Példán! ha egy beteg hetente kap injekciókat egy alfa-galaktozidáz Á készítményből, akkor ezt kétheti injekeiózásra. változtathatjuk. Egy másik változat szerint, ha egy beteg kéthetente kap injekciókat, akkor ezt havi egyszeri injekeiózásra v;
ilyen megváltoztatása után a beteget újra évekig, azaz például három évig megfigyelés alatt kell tartani, hogy megbecsüljük a Fabry-betegségbez kapcsolódó klinikai és laboratóriumi értékeket. Egy előnyben részesített megvalősítási mód szerint a beadott dózis nagysága nem változik meg, ha. megváltoztatjuk a dózis beadásának gyakoriságát. Ez biztosítja, hogy bizonyos farmakokinetikai paraméterek (azaz például a maximális plazma koncentráció [Cma.*], a maximális plazma koncentráció eléréséhez szükséges idő (tmax], & plazma felezési idő (ti/2], és az érintkezés, amit a görbe- alatti terület. (AUC) alapján mérünk, viszonylag állandó marad minden egyes beadott dózis után. Ezeknek a íarmakokinetíkai paramétereknek a fennmaradása viszonylag állandó * 9 iííí
Οί « « ·4· * *«$ ♦ «««.« » « $*Φ « ·*« ** szinteket eredményez az alfa- galaktozidáz A- n ak. a receptor ál tal a szövetekbe közvetített felvételében, ahogy a dózis gyakorisága változik..
A Fabry-betegség egy a.típusos variánsában szenvedő beteget, azaz aki főleg kardiovaszkuláris abnorm alifásokban, vagy vese-problémákban szenved, ugyanezekkel a. dózistartományokkal kezeljük, azaz körülbelül 0,05 - 5 mg/kg hetente vagy kéthetente, A dózist az igényeknek megfelelően állítjuk be, Például annak a betegnek az esetében, aki szív-variáns fenotípnsban szenved, és alfa-galaktozidáz A. enzim-pótlási terápiával kezelnek..
a terápiát kővetően megváltozik a szív összetétele és javulnak a keringési funkciói, Ezt a változást standard echokardiográ&ai. módszerekkel mérhetjük, amivel ki lehet mutatni a bal ventriku.1 áris fal megvastagodását a Fabry-betegségben szenvedő betegeknél (Goldman és mtsai: J. Am. Colt Cardiol. 7, 11571161 (1986)}, A bal ventríkuláris fal vastagságát sorozatosan mérhetjük eehokardiográfiával, és a ventríkuláris falvastagság csökkenése a terápiás választ jelzi. Az alfa-galaktozidáz A szív mágneses megvan az
enzimpődás terápiát kapót rezonancia rezonancia a képessége, hogy meg lehet vele becsülni egy adott szövet relatív összetételét. Például a szív MRI Fabry-betegségben szenvedő a lerakodott lípídet a szívizomban, a kontroll ez viszonyítva (Matsui és mtsai: Am. Heart J. 117, 472474 (1989)(, Bgy enzimpótlással kezelt beteg sorozatos MRI mérésevei ki lehet mutatni a 3iplci lerakódás változását egy beteg szívében. A vese variáns fenotípusban szenvedő betegek számára tt ♦ is előnyös az alfa-galaktozidáz A enzimpötiás terápia. A terápia hatása a vesefunkció standard mérésével követhető, azaz a 24órás vizelet fehérjeszint, a kreatínin kiürülés és a glomorulárís szűrés sebessége alapján. Az alábbi példákat azzal a céllal adjuk meg, hogy még jobban illusztráljuk a jelen találmány előnyben részesített megvalósítási módjait. Ezek a példák semmiképpen nem korlátozzák a. jelen találmánynak a csatolt igénypontok által definiált oltalmi körét.
Az alfa-galaktozidáz A bejuttatására és expresszálására tervezett konstrukciók készítése és használata
Két expressziós plazmidot készítettünk, a pXAG-16-ot és a pXAG-28-at. Ezek a plazmidok tartalmaznak humán alíá-galakfozidáz A cDNS-t, ami az alfa-galaktozidáz A enzim 389 aminosávját kódolja (az alfa-galaktozidáz A szignálpeptid nélkül); a humán növekedési hormon (hGHj szignálpeptid genomiális DNS szekvenciáját, amit a humán növekedési hormon gén első .infcronja szakít, meg; és a humán növekedési hormon gén 3' nemtranszlálődó szekvenciáját (UTS), ami tartalmaz poiiadenilezésí szignált. A pXAG-ló tartalmazza, a humán citomegalovírus kőzwetlen korai (CMV IB) promotert és az első infcront (amit nemkódoló exon szekvenciák határolnak), míg a pXAG~28~at a kollagén 1α2 promoter és 1-es exon hajtja meg, valamint tartalmazza a β-aktín gén 5' UTS-t, ami tartalmazza a β-aktin gén első in trónját.
* » Φ *ΐ φφ * «X * Φ ί X >>
Φ * Φ φ χ. Φ *«« * Φ X Μ Φ « Φ » « « X
Φ Λ Φ φ « ΦΛΦ Φφ
A humán, alfa-galaktozidáz A cDNS-t humán fibroblaszt cDNS könyvtárból klónoztuk, amit az alábbiak szerint állítottunk elő. A poli-A* mRNS-t ossz-RNS-ból izoláljuk, majd a cDNS szintézisét a la.tn.bda ZapK rendszerrel hajtjuk végre, a gyártó utasításai szerínt (Stratagene, Ladölla, CA). Röviden, az „első szál” cDNS-t reverz transzkripcióval állítjuk elő, ofigo-dT primer jelenlétében, ami egy belső Xhol restrikciós hasítási helyet tartalmaz, RNáz H-val való kezelés után a cDNS nick- transzlációba visszük, kétszáiú cDNS előállítása céljából. Ezt a cD.NS-t T4 DNS poiímerázzal tompavégúvé tesszük, majd EeoRI adapterokhoz ligáljuk. Ennek a ligálásnak. a termékeit T4 DNS kinázzal kezeljük, majd Xhol restrikciós enzimmel emésztjük. A cDNS-t Sephacryl400 kromatográfiával frakcionáliuk, A nagy és közepes méretű frakciókat egyesítjük, és a cDNS-t EeoRI és Xhol restrikciós enzimekkel emésztett Lambda Zapíl karokhoz ligáljuk. Ennek a ligálásnak a termékeit azután pakoljuk és literét meghatározzuk. A primer kar titere 1,2* lö7 pfu/ml, az átlagos inszert mérete 925
A. humán alfa-galaktozidáz A gén. ( L ábra, 1. számú székvencíavázlat) 7-es exonjának egy 21(5 bázíspár méretű próbáját használjuk a cDNS izolálására, A próbát magát genomiális DNSböl izoláltuk: polimeráz láncreakcióval, az alábbi oligonukleotidok
5' számú szekvencia! és
6.
> » » * * ♦ *« « ♦ * X * X + * X * «»«β * φ«χ« *
Φ ♦ X'» Φ Φ*χ
5-TCTAGCTGAAGCAAAACAGTG-3' (2-es oligonukleotid, 7, számú szekvencia),
A polimeráz láncreakció termékét használjuk: azután a fihroblaszt cDNS könyvtár átvizsgálására, a pozitív klánokat izoláljuk és tovább jellemezzük. Az egyik pozitív klőnt, a 3A fágot a lambda. ZapH rendszer excizlós protokollnak vetettük alá (Stratagene, Inc., LaJolla, CA), a gyártó utasításai szerint. Ezzel az eljárással kaptuk a pBSAGSA plazmidot, ami az így ez a plazmíd nem tartalmazza a cDNS szekvencia teljes 5' végét. Ezért az 5* véget a humán ge~ normális DNS-böl amplifikált helyre. Ennek végre egy méretű genomíális DNS fragmenst (2. ábra, 2. számú szekvenciavázlat) amplifikáljuk, az alábbi oligonukleotidok használatával: o'-ATTGGTCCGCCCCTGAGGT-S·' (3-as oligonukleotid, 8. számú szekveneíavázlatl és θ'-á UftJ ’UfWttJfVX szekv encíavázlatí.
Ezt a fragmenst szubklőnozzuk egy „TA* klónozó plazmídban (In vitrogen Corp.., San Diego, CA), hogy megkapjuk a ddot. A pBSAGSA plazmidot, ami az alfa-galakh lazza, és a
encia
-3' (4-es olígoj íd, 9, számú részét
L ami az alfa-galaktozidáz A cDNS 5' végét tartalmazza, egyaránt Sacll és Ncol restrikciós enzimmel emésztjük. Az amplifikált DNS fragmenshen levő releváns Sacll és Ncol hasítási helyeket a 2. ábrán mutatjuk be. A
0,2 kilobázls méretű SacfI-NcoI fragmenst, és az ekvivalens módon emésztett pBSAGOA plazmidba ligáljuk. Ez a plazmid, a pAGAL tartalmazza. a komplett! alfa-galaktozidáz A cDNS szekvenciát, beleértve az alfa-galaktozidáz A szignálpeptidet tartalmazó szekvenciát ís. Á cDNS~t teljesen szekvenáitu.k (lásd a 3, ábrán, beleértve az alfa-galaktozidáz A szignálpeptidet is; 3. számú szekvenciavázlatj, és ebből kiderült, hogy azonos a humán alfa-galaktozidáz A cDNS publikált szekvenciájával (Genba.uk HÜMGALA szekvencia)..
A pXAG-16 plazmidot számos intermedieren keresztül állítjuk elő, az alábbiak szerint. Először, a pAGAL plazmidot Sacíl és Xh.ol restrikciós enzimekkel emésztjük, majd tompavégűvé alakítjuk át. Másodszor, a komplett alfa-galaktozidáz A cD'NS végeit az Xbal linkerekhez ligáljuk, majd az Xbal restrikciós enzimmel emésztett pEF-BOS plazmádba (Mizushima és mtsai: Nucleic Acids Research 18, 5322 (1990)] szuhkiónozzuk, igy kapjuk a pXAG-1 plazmidot. Ez a konstrukció tartalmazza a humán granubcita telepserkentő faktor (G-CSF) 3‘ UTS-t, és a humán elongácíós faktor-la (BF- l a) promotert, ami az alfa-galaktozidáz A-t plusz az Mia-galaklozidáz A szignálpeptidet kódoló cDNS határol, oly módon, hogy az alfa-galaktozidáz A cDNS 5' vége az EF-la promoterbez van fúzlonáltatva. Egy olyan konstés az első intront, az alfa-galaktozidáz A cDNS-t és a G-CSF 3' e?
azis merem Aha cmens forrni eltávolítjuk a pXAG-1 A fragmenst lompavégúvé tesszük, 1 BamHI restrikciós enzimmel * * » V « « fc <6 « Ο φ * emésztett pCMVílpNeo plazmídba (amit az alábbiakban ismertetett módon állítunk elő) inszertáJjuk, Az orientációja olyan, hogy az alfa-galaktozidáz A cDNS 5' vége van fözionáltatva a CMV JE promoter régióhoz.
A pCMFüpNeo plazmidot az alábbiak szerint állítjuk elő, Bgy CMV 1E gén promoter fragmenst polimeráz láncreakcióval amplifikálunk, templátként a CMV genomíális DNS-t használva, és az 5'-TTTTGGATCCCTCGAGGACATTGATTATTGACTAG-3' (10, számú, szekvenciavázlat) valamint az S'-TTTTGGATCCCGTGTCAAGGA-CGGTGAC-3* (11. számú szekvencíavázlat) oligonnkleotidot használva primerként, A kapott méretű fragmens) restrikciós enzimmel emésztjük, így egy
BamHl végekkel, A neo expresszíós egységet a pMCIneopA plazmidből (Stratagene Inc,, badolla, CA) izoláljuk egy 1,1 kílobázis méretű fragmens formájában. A CMV promötert és a neo fragmenseket tartalmazó fragmenseket -egy BamHl és Xhol restrikciós enzimekkel emésztett plazmídba (pUC1.2) ligáljuk. Figyelemre méltó, hogy a pCMVílpNeo tartalmazza a CMV IE promoter régiót, ami az 546-os nukleotídnál kezdődik, és a 2105--ős nukleotidnál végződik Gerxbank HS5MIEP szekvencia), és a neomicinrezisztencia gént a herpes simplex vírus (HSV) timídin kinéz promoter (a Tkneo gén) hajtja meg, közvetlenül a 5' pozícióban a CMV IE promoter fragmenshez viszonyítva, A neo gén transzkripciójának iránya ugyanaz, mint a. CMV promoter fragmensé. Ennek az intermedier konstrukciónak a pXAG-4 jelölést adtuk.
Ahhoz, hogy a hGH 3' UTS-t hozzáadjuk, a GCSF 3' UTS-t egy Xbal-Smal íragmens formájában eltávolítjuk a a pXAG-4 plazmádból, majd a pXAG-4 plazmid végeit tompa végekké alakítjuk. A hGH 3' UTS-t egy 0,6 kilobázis méretű EcoRI-Smal fragrnens formájában távohtjuk el a pXGHS plazmádból [Beiden és mtsai; Moleeular & Cellular Bíology 6, 3173-3179 (1986). Ezt a fragmenst tompavégű fragmenssé való alakítása. után a pXAG-4 plazmádba ligáijuk, közvetlenül a pXAG-4 tompavégűvé tett Xbal hasítási helye után. Ennek az intermediernek a jelzése pXAG-7. Ebből a plazmádból egy Hindill-Clal íragmens formájában eltávolítjuk a Tkneo fragmenst, és a plazmid végeit tompa végekké alakítjuk át a DNS polímeráz I Klenow fragmen.sével „feltöltve” azokat. Az SV4Ö korai promoterret meghajtott neomicin-rezisztencia gént egy tompa végű Cl&l-BsmBI fragmensbe li~ góljuk, ami a pcDNeo emésztéséből származik (Chen és mtsai: Moleeular & Cellular Biology 7, 2745-2752 (1987)], ezzel a neo transzkripciós egységet ugyanabban az orientációban elhelyezve, mint az alfa-galaktozidáz A transzkripciós egységet. Ennek az intermediernek a jelzése: pXAG-13.
A pXAG-16 teljes elkészítéséhez, amiben van 26 aminosavból állő hGH szignálpeptidet kódoló szekvencia, és a hGH gén első íntronja, a pXAG-13 plazmidnak egy 2,0 kilobázís méretű EcoRI-BamHI fragmensét eltávolítjuk. Ez a íragmens tartalmazza az alfa-galaktozidáz A cDRS-t és a hGH 3' UTS-t. Ezt a nagy fragmenst 3 fragmenssel helyettesítjük, Az első Íragmens tartalmazza a pXGHS egy 0,3 kilobázís méretű polímeráz láncreakció termedet, ami tartalmazza a nuM. szignaipepuaet κοαοιο szén ?9 <« ♦» venctat es tartalmazza a ftuH első mtron szekvenciáját, egy szintetikus BamHI hasítási helytől, ami kőzvetlenul. a konszenzus Kozák szekvencia, előtt (upstream) helyezkedik el, a hG'H. szígnálpeptidet kódold szekvencia végéig, Az alábbi oligonukleotídokat használjuk ennek a fragmensnek (1-es fragmens) az amplífikálására: 5'CTrTGGATCCACCA:TGGCTA-3' (HGH101 oligonukleotid, 12. számú szekvenciavázlat) és S'-TTTTGCCGGCACTGCGCTCTTGÁA-3' (HGH102. oiigonukleotid, 13. számú szekvenciavázlat). A második fragmens egy 0,27 Itílobázis méretű pofiméráz . ami olyan sze az, amik a 398 aminosavból álló alfa-galaktozidáz A enzimet kódoló cDNS starthelyének (azaz hiányzik belőle az alfa-galai zidáz A szignálpeptid) az. Nhel hasítási helyig. Az alábbi oligonukleotidokat használjuk ennek a fragmensnek (2-es fragmens) az ilikálására: 5' -TTTTCACCTGCAGAáTGGAn'GGC-3' (AG10 eotid, 14. számú szekveneiavazlat) és S'-TTTTGCTAG-CTGCCGAATCC-3' (ÁGII oiigonukleotid: IS. számú szekvenciavázlat). A harmadik fragmens tartalmazza a pXAG-7 Nhel-BcoRl többi részét, valamint a hGH 3’ UTS-t (3-as fragmens).
Az 1-es fragmenst (BamHI és Náci restrikciós enzimekkel emésztve), a 2-es fragmenst (Pvull és Nhel restrikciós enzimekkel emésztve), valamint a 3-a.s fragmenst a pXAG-13 plazmid 6,5 kiiobázis méretű BamHI-EcoRI fragmensével keverjük össze, ami tartalmazza a neo gént és a CMV IE promotert, majd ezeket ligáivá kapjuk a pXAG-16 plazmidot (4. ábra).
készítése
A humán kollagén io.2 promotert az alábbiak szerűit izoláljuk a pXAG-28 alfa-galaktozidáz A expressziós konstrukcióban való felhasználáshoz. A humán genomiális DNS egy 408 bázíspár méretű polimeráz láncreakció fragmensét, ami a humán kollagén. 1α2 promoter eg yrészét tartalmazza, az alábbki oligoS'-TTFrGGATCCGTGTCCCATAGTGTTTCCAA-3' (72~es oligonukleotíd, 16- számú szekvenciavázlati; és '-TTTTGGATCCGC AGTCGTGGCCAGTACC-3' (73-as oHgon.ukleotid, 17, számú szekvenciavázlat).
Ezt a iragmenst halmaijuk egy humán leukocita könyvtár (az EMBL3-ban) átvizsgálására ((Clontech, Faló Alto, CA), Egy pozitív kiónt (7.H tág) izoláltunk, ami egy 3,8 kilobázis méretű EcoRI fragmenst tartalmaz, majd Spel restrikciós enzimmel emésztett e, ami a ρΒ»π»κ-;- poimnReroe sít, mja „lertoipuR a din» polimeráz I klenow xragmensevei, es az S-CTAGTCCTAGGA-3* okgonukleotidot (18. számú c ezt a variánsát. BamHl és
emesztiUR, maid. az exozoRöen ismertetett eredeti 4ÖS bázispár méretű kollagén lo2 promoter polimeráz láncreakció fragmensnek a 121 bázispár méretű Ba fragmenséhe lígáljuk, így kapjuk a pBS/121 COL,6
/121COL.6 nnidot Xbal restrikciós enzimmel ami a pBSiISK+ polilinker szekvenciájába ” a DNS polimeráz 1 Klenow fragmensével, és Avrll * * φ *φ restrikciós enzimmel emésztjük. A pBS/7.2 plazmid 3,8 kílobázis méretű BamHl-Avrií mérető fragmensét izoláljuk, majd a BamHI hasítási helyet Klenow enzimmel kezelve tompavégűvé tesszük, A fragmenst azután Avrh restrikciós enzimmel emésztjük, és az rehozva a pBS/121hpCOL7H.18 kollagén promoter plazmidot.
Ezután a kollagén promotert fóztonáltatjuk a humán fh aktin gén 5' UTB-ével, ami tartalmazza a humán β-aktin gén első ín trónját. Ennek a szekvenciának az izolálására egy 2 kílobázis méretű polimeráz láncreakció fragmenst izolálunk humán genomiális DNS-ből, az alábbi ohgonukleotidok használatával:
5'- TTTTGAGCACAGAGCCTCGCCT-3' (BAl oligonukleotid, 19. számú szekvencíavázlat) és ‘- TITTGGATCCGGTGAGCTGCGAGAÁTAGeC~3' (BA2 ohgonukleotid, 20, számú szekvenciavázlat).
Ezt a fragmenst BamHI és BsiHKAI restrikciós enzimekkel emésztjük, hogy felszabadítsuk a β-aktín 5' ÜTS-t és íntront tartalmazó 0,8 kílobázis méretű fragmenst. Ezután egy 3,6 kílobázis méretű Sall-Srfí fragmenst izolálunk a pBS/ 121bpCOLH. 18 kolaz alábbiak szerint: a
pBS/121hpC01H,.18 plazmidot részlegesen emésztjük BamHI restrikciós enzimmel (a BamHI hasítási hely a kollagén Ia2 promoter fragmens 5' végén található), majd Klenow fragmenssel kezelve tompavcgüvé tesszük, és a Sáli linkedhez {5'~GGTCG~ ACC-3') ligáljük, ezzel egy Sáli hasítási helyet helyezve el a. kollagén kx2 promoter elé (upstream). Ezt a plazmidot azután Sáli és
Srfí restrikciós enzimekkel emésztjük (az Srfí hasítási hely 110 bázispárral a kollagén I«2 promoter GAP helye előtt), majd izoláljuk a 3,6 kilobázis méretű fragmenst. Á 0,8 és 3,6 kilobázis méretű fragmenseket Sáli és BamHl restrikciós enzimekkel emésztett pBSIlSK plazmiddal (Stratagene Inc,, Ladolla, CA) kombináljuk, valamint egy olyan fragmenssel, amit az alábbi négy, egymáshoz illesztett, oligonnkleotidból állítunk össze (ezzel egy tompa és egy BsIHKAI végű fragmenst hozva létre):
5' - GGGCCGCCAGCCCCAGCCCTCCCATTGGTGGAGGCCCITTTGGAGGCACCCTAGGGCCAGGAAACTrTTGCCGT A.T-3' (COL-1 oligonukieotld, 21. számú szekvencia),
5- AAATAGGGCAGATCCGGGCT'ITATTATTTTAGC.ACCACGGCCGCCGAGACCGCGTCCGCCCCGCGAGCA-3' (COL-2 oligOHukleetid, 22. számú szekvencia),
S’~ TGCCCTATTTATACGGCA/hfo\GTTTCCTGGCCCTAGGGTGCCTCCAAAAGGGCCTCCACCAATGGGAGGGCTGGGGCTGGGGGCC C-3' (COL-3 oligonukieotld, 23. számú szekvencia) és 5'-- CGCGGGGCGGACGCGGTCTCGGCGGCCGTGGTGCTAAAATAATAAAGCCCGGATC-3' )COL-4 olígonukleotid, 24. számú szekvencia).
Ez a négy oligonukieotld egymáshoz illesztve megfelel a kollagén promoter Srfl hasítási helyénél kezdődő régiónak, és tovább folytatódik a β-aktin promoter BsiHKAI. hasítási helyén keresztük A kapott, plazmid jelölése pCOL/β-aktin.
Ahhoz, hogy teljessé tegyük. a pXAG-28 készítését, izoi a pCOL/β-aktin SalI-BamHI fragmensét, ami a kollagér motert és a β-aktín 5' UTS-t tartalmazza. Ezt a fragmenst a. pXAG 16-ból származó két fragmenshez ligáljuk (lásd az 1.1 pontot és a 4. ábrát); 1) a 6,0 kilobázis méretű BamHI fragmens (ami tartalmazza a neo gént, a plazmid-gerineet, a 398 aminosavból álló alfa-galaktozidáz A enzimet, kódoló eDNS-t és a hGH 3' UTS-t); és 2) a 0,3 kilobázis méretű BamHÍ-XhoI íragmens (ami tartalmazza a pcDneo-ból. származó SV4Ö poli A szekvenciát), A pXAG28 tartalmazza, a kollagén Ía2 promotert a humán β -aktin 5' BTS-hez fúzíonáltatva, a hGH szignálpeptidet (amit megszakít a hGH első intronja), az alfa-galaktozidáz A enzimet kódoló cDNS-t és a hGH 3' UTS-t. A teljes pXAG-29 expresszíós konstrukció térképét az 5. ábrán mutatjuk be.
Ahhoz, hogy az .alfa-galaktozidáz A- t íihrohiasztokban expresszáltassuk, szekunder fibrohlasztokat tenyésztünk és transzfektálunk a publikált eljárásoknak megfelelően (Selden és munkatársai, WO 93/09222).
A pXAG~13, pXAG-16 és pXAG-28 plazmidokat elektroporácíóval transzferáljuk humán fityma fibroblasztokba, hogy stabilan transzfektált klonális sejt törzseket generáljunk, majd a kapott alfa-galaktozidáz A expresszíós szintet az 1.4 pontban ismertetett módon követjük. Az alfa-galaktozidáz A normál fityma fibrobl&sztokban való expressziója 2-10 egység/106 sejt/24 óra tartományban van. Ezzel szemben, a transzfektált fibroblasztok átlagos expressziős szintjét a 2. táblázatban mutatjuk be.
X χ » «* * «♦ # « ♦ ♦ ί ♦ * :« ♦· ♦ * ·«·♦♦:
♦ ♦ ♦ » X X ♦ ♦ X » ♦ **> χ *»
2. Táblázat
Átlagos áz A expressziös szintek
p.XAG-13: 420 ± 344 E/ IÖ6 sejt/nap N::::26 klonális törzs (tartomány 3-1133 E/1ÖS sejt/nap)
pXAG-16 2051 ± 1253 E/106 sejt/nap N-24 klonális törzs (tartomány 422-5200 E/ löö sejt/nap)
pXAG-28 141 ± 131 E/10ö sejt/nap N™38 klonális törzs (tartomány 20-616 E/106 sejt/nap)
Ezek az adatok azt. mutatják, hogy mindhárom expressziös konstrukció képes többszörösére növelni az alfa-galaktozidáz A expresszíőját a nem-transzfektált fibrofelaszt törzsekkel összehasonlítva, A pXAG-13 plazmiddai, ami az alfa-galaktozidáz A-t az alfa-galaktozidáz A szignálpeptldhez kapcsolva kódolja, stabilan expresszált fibroblasztokhan az expresszíő szintje szignifikánsan alacsonyabb, mint a pXAG- Ió-tal transzfektált fibroblasztokban, ami csak abban tér el az előzőtől, hogy a szignálpeptid a hGH szignálpeptid, aminek a kődolő szekvenciáját megszakítja a hGH gén első intronja..
Valahányszor a transzfektált sejteket ámítjuk, a kiválasztott alfa-galaktozidáz A aktivitást meghatározzuk, a sejteket
megszámláljuk, és kiszámítjuk a. sejtsűrűséget. A sejtek száma és az alfa-galaktozidáz A .szekretálására adott idő alapján meghatározzuk a specifikus expressziös rátát, és a 3. valamint a 4, táblázatban szekretáit alfa-galaktozidáz A egységek per 106 sejt per 24 őrás periódus formájában adjuk meg. Azoknak a sejt törzseknek, amik a génterápiához, vagy az alfagalaktozidáz· A tisztítására használt anyag előállításához megfelelnek, több átoltás után is stabil növekedést és expressziót kell mutatniuk. A 3, és 4. táblázatban bemutatott sejt törzsekből származó adatok, amely törzsek stabilan transzfektálva vannak a pXAG-16 expressziős konstrukcióval, illusztrálják azt a tényt, hogy az alfa-galaktozidáz A expresszio stabilan fennmarad több átoltás után is.
Α pXA.G~.16 alfa-galaktozidáz A expressziós konstrukciót tartalmazó BRS- 1.1 sejtek növekedése és ex «ψ»
2601
Is
..s ·<.
esszio ígység/KA sejt/24 óra'
4. Táblázat
3-16 alfa-galaktozidáz A expressziős konstrukciót
ro&asH
Az alfa-galaktozidáz A aktivitást a vizoldhatö 4-metilumbellíferil-a-D-galaktopíranoziddal szubsztráttal mérjük (4-MBF-gal; Research Products, Inc.) az Ioannou és munkatársai által publikált protokoll módosításával (loannou és mtsai; Journal of Cell Bíology 1.19, 1137-1150 (1992)/ A szubsztrátot sznbsztrát pufferben oldjuk (0,1 mol/1 citrát-foszfát, pH:;::4,6), 1,69 mg/ml (5 * * *·Μ ♦ mmol/1) koncentrációban. Általában 10 ml tenyészet felülüszőt adunk 75 ml szubsztrát oldathoz. A csöveket lezárjuk és 60 percig 37 °C-on tartjuk. Az inkubációs periódus végén 2 mmol/1 gliein-karbonát puffért (130 mmol/1 glicín, 83 mmol/1 nátriumkarbonát, pH~10,6| használunk a reakció leállítására. Az egyes minták relatív fluoreszcenciáját TKÖ1ÖÜ fluorométerrel (Hoefer Scientific Instruments) mérjük, aminek rögzített, 365 nm-es gerjesztési hullámhossza van, és rögzített, 460 nm-es emissziós hullámhosszon mér. A mintákban mért értékeket 1 mm.ol/1 metilumbelliferon (Sigma Chemical Co.) törzsoldatból készített standardokkal hasonlítjuk össze, és kiszámítjuk a bidrolizált szubsztrát mennyiségét. Az álfa-galaktozidáz A aktivitást egységekben fejezzük ki; egy egység alfa-galaktozidáz A aktivitás ekvivalens egy nanomól szubsztrát óránként való hidrolízisével 37 °C-on. A sejt-expresszíós adatokat általában szekretált alfagalaktozidáz A aktivitás/ l ö6 sejt/24 óra egységekben fejezzük ki. A sejtlizátumokban és a különböző alfa-galaktozidáz A tisztítási lépésekből (lásd az alábbiakban) vett. mintákban az alfa-galaktozidáz A aktivitásának mérésére szintén ezt a módszert használjuk.
1.5 Génaktíváit alfaádáz A (GA.-GAL) készítése
A génaktivált alfa-galaktozidáz A (GA-GAL). előállításához szabályozó és strukturális DNS szekvenciákat építünk be a humán alfa-galaktozidáz A kódoló szekvencia elé, a GA technológiát, 8a, amit lényegében az 5,733,761 számú Amerikai Államok-beli szabadalmi leírásban ismertetnek, amely
ψ φ * ♦ φ φ
Φ« 4 φφ -φ·φ
Φ Φ κ φ φφφ φ φ
Φφ φφ publikációt a továbbiakban, referenciaként kezelünk. A génakíiválő szekvencia pontos beszúrása homológ .rekombináció eredménye, ami a transzfektált DNS ír&gmensen levő DNS és a humán sejtben az alfa-galaktozidáz A. lókusz előtt levő genomlális DNS szekvencia kozott játszódik le, A génaktiválő szekvencia maga is tartalmaz egy alfa-galaktozidáz A-t kódoló szekvenciát, egészen a szignálpeptid szekvenciáig, de azt már nem tartalmazza. Aktivált alfa-galaktozidáz A lőkuszt tartalmazó sejteket izoláltunk, és gyógyszer hatóanyag szelekciónak vetettük alá, zidáz A-t termelő sej teket ízol
Egy céizo DNb szekvenciát, ami egy megfelelő szekvenciát tartalmaz, elektroporáeíóval juttatunk be humán gazdasejt vonalakba. Az egyik ilyen sejtvonal a HT-1080, egy hitelesített sejtvonal, ami az ATCC-tol szerezhető be (Rockvílle, Maryland). A pGA213C génaktiválő plazmídot, ami ilyen DNS fragmenst tartalmaz, a 9. ábrán mutatjuk be. Ez a plazrnid olyan szekvenciákat tartalmaz, antikét arra terveztünk, hogy aktiválják az endogén alfa-galaktozidáz A lőkuszt a gazdasejt vonalban, és tartalmaz szignálpeptidet kódoló szekvenciákat, de nem tartalmaz humán alfa-galaktozidáz A-t kódoló szekvenciákat. A célzó konstrukciók tartalmaznak expressziős kazettákat a bakteriális neo és egér dhfr génekhez. Ez lehetővé teszi a stabilan integrálódó célzó fragmensek szelektálását (a neo gén használatával) és metotrexa.t (MTX) szelekciós módszert használva..
Emellett a pGA213C tartalmaz olyan szekvenciákat is, amiket arra terveztünk, hogy az endogén alfa-galaktozidáz A *' * »♦ * * * * ♦ * X χ * « «««« »
X «»» · ♦ »:·« lőkusz előtt levő kromoszómális szekvenciákat célozzák meg homológ rekombinációval. Az endogén alfa-galaktozidáz A fókusz és a pGA21.3C 9,6 kifóbázis méretű fragmense közötti homológ rekombinációt a lö. ábrán mutatjuk be.
A pGA213C plazmídot abból a célból állítjuk elő, hogy az alfa-galaktozidáz A Iniciálé metionín kodonjához viszonyított 1183-as pozíciótól a -222-es pozícióig terjedő 962 bázispár méretű genomiális szekvenciát kivágjuk, amikor a pGA213C fragmens homológ rekomhinálődik az X kromoszóma alfa-ga.la.ktozldáz A fókuszával. Az alfa-galaktozidáz A fókusz transzkripciós aktiválása a külső szabályozó-szekvenciáknak az alfa-galaktozidáz A kódoló régióba való pontos becélzásával játszódik le. A kapott GA-GAL fókusz okozza az íniciácíönak CMV promoterről való transzkripcióját, ami a CMV l-es exonon, az aldoláz intronon és az alfa-galaktozidáz A kódoló szekvencia hét exonján és hat intronján keresztül hit, A GA-GAL mRNS transzlációja pre GA-GAL-t eredményez, harmincegy' ammosavból álló szignálpeptíddel. A gazdasejtből való szekréció során a szignálpeptid lebasad. A pontosan becélzott sejtvonalakat először polimeráz láncreakcióval azonosítjuk, amivel az GA-GAL mJRNS-t keressük. A GA-GAL mRNS-t termeié kiónokról az ís kiderül, hogy enzim etikusan aktív alfa-galaktozidáz A-t szekretálnak a tenyésztő közegbe. A célzási eseményt ezután a genomiális DNS restrikciós enzimes emésztésével és Southern biot hibridizációjával igazoljuk.
A sejteket lépésenként növekvő metotrexát („MTX’j szelekciónak vetjük alá. A 0,05 pmol/I MTX-ben végzett szelekció után ♦ ·χ « χ sejtek egy klőxiját izoláljuk:, majd 0,1 grnol/I MTX szelekciónak vetjük alá. Ebből az eljárásból 0,1 pmol/l MTX-re rezísztens sejtek pool-ját kapjuk (RA.GÖ01), amit tenyészetben szaporítunk
uZ A tisztítás iakban ismertetett fa~galaktozi:dáz A
tisztítására és teszteegy előnyben részesített lésére. A tisztítási eljárás az alfa-galaktozidáz A-t oldható, aktív; természetes formában tartja a tisztítás során. A féhéqét nem hozzuk: érintkezésbe szélsőséges pH-val, szerves oldószerekkel vagy detergensekkei, nem szenved proteolítikus hasadást a tisztítás eljárás során, és nem képez aggregátumokat A tisztítási eljárást úgy terveztük meg, hogy ne változtassa meg az alfa-galaktozidáz A glikoformák eloszlását.
2.1 Az alfa-galaktozidáz A tisztítása
A 2.1 fejezetben azt illusztráljuk, hogy az alfa-galaktozidáz A közel homogenitásig tisztítható a tenyésztett humán sejt törzsek (amiket stabilan transzíektáltnnk az enzim előállításához) kondicionált közegéből, amiben egymás után öt kromatográfiás lépést használunk. Az öt lépésben különbőzé elválasztási elveket használunk, amik az enzim, eltérő fizikai tulajdonságait használják ki, hogy az alfa-galaktozidáz A-t elválasszák a. szennyező anyagoktól. Ide tartozik a hídrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfia buti! Sepharose-on, az ionos kölcsönhatáson « ΦΧ* «Λ * Φ Φ « * *».♦ * :« «»» «» alapuló kromatográfia hidroxi apatiton, az anioneserélö kromatográfia Q Sepharose-on, és a méretkizárásos kromatográfia Superdex 2öö~on.. Amellett, hogy a tisztítási eljárás utolsó lépése, a méretkizárásos kromatográfia hatásos eszközt biztosít a tisztított fehérje kiszereléssel kompatibilis pufferbe való juttatására.
lépésként az alfa-galaktozidáz A tisztítása során
1,34 liter hideg, kondicionált táptalajt centrifngálással tisztítunk, majd átszűrünk egy ö:,45 gm-es cellulóz-acélát puíferen, üvegszál előszűrők alkalmazásával, Kevertetés közben a hideg, megszűrt közeg pH-ját 5,6-ra állítjuk, 1 mol/1 sósav cseppenként történő hozzáadásával, majd amménium-szulfátot adunk hozzá 0,66 mol/1 végkoneentrációhan, 3,9 mol/1 ultratiszta förzsoldat. (szobahőmérséklet) cseppenként történő hozzáadásával. A közeget további 5 percig 4 °C~on kevertetjük, az előzőkben ismertetett módon megszűrjük, majd Butyl Sepbarose 4 Fást Flow oszlopra visszük (81 ml az oszloptérfogat, 2,5*16,5 cm; Pharmacia, Uppsala, Svédország), amit 10 mmol/l ME8-TRJSZ oldattal (A puffer, pH~5,6, 0,6 mol/i ammönium-szulfátot tartalmaz) hozunk egyensúlyba. A kromatográfiai 4 °C-on hajtjuk végre egy Gradi-Frac™ System -en (Pharmacia, Uppsala, Svédország), amit in-líne ÜV detektorral (280 nm) és vezetőképesség monitorokkal szereltünk fel, hogy megbecsüljük az ossz fehérjét és a sökoncentrációt. Miután a mintát lö ml/perc sebességgel felvittük az oszlopra, az oszlopot 10 oszloptérfogat A pufferrel mossuk. Az alfa-galaktozidáz- A-t a Butyl Sepbarose oszlopról 14 oszlóptérfo92 * * V · fc fcfc fc * fc fc « £ fc í fcfc * «fcfc fcfcfcfc fc fcfc fcfc fc fc fc fcfcfc 8 fcfcfc fc« gatmd A puffertől (ami ammóníum-szulfátot tartalmaz) 10 mmol/1 MES-TRISZ, pH~5,6~ig (nincs benne ammóniwa-szulfát) terjedő lineáris gradienssel eluáljuk. A frakcióknak 4-MVF-gal esszével vizsgáljuk az alfa-galaktozidáz A aktivitását, majd a megfelelő enzimaktivitást mutató frakciókat egyesítjük. Amint az a 8, ábrán és a tisztítási összefoglalóban (5. táblázat) látható, ez a lépés a szennyező fehérjének körülbelül 99%-át eltávolítja (oszlopozás előtti mínta~8}14 g óssz-fehétje; oszlopozás utáni minta~Ö,0638 g őssz-febérje).
« Φ *
5. Táblázat
·* * áfia használata az alfa-ga-
*** * ***
laktozidáz A tisztítási lépé ; oszlopról lejövő csúcsok frakcióit 4 C-on 4 liter 10 mmol/l MES-TR1SZ (pfí^S.ö) pufíerrel szemben dializáljuk (egyszer cserélve). A diallzátwn vezetőképességét víz vagy nátríum-klorid (ahogy szükséges) hozzáadásával 1,0 mM.HÖ~ra állítjuk 4 °C-on> Ezután a mintát Heparín Sepharose 6 Fást Flow oszlopra. (Pharmacia, üppsala, Svédország; 29 ml oszloptérfogat, 2,5^6 cm) visszük, amit 10 mmol/1 MBS-TRl'SZ-szel (pH~5,6, ami 9 mol/1 nátrium-klöridot tartalmaz., ez a .8 puffer) hoztunk egyensúlyba. Ezt 4 C-on hajtjuk végre 10 ml/perc sebességgel. In-line ÜV detektorral (280 nm) és vezetőképesség monitorokkal mérjük az őssz-fehérjét és a. sókoncentrációi. Miután a mintát felvittük, az oszlopot 10 oszloptérfogatnyi B pufferrel mossuk, majd 3 oszloptérfogatnyi lineáris gradienssel, arai 8% C puffer/92% B puffer (ahol a C puffer összetétele 10 mmol/l MES-TRISZ, pH=5,6, 250 mmol/1 nátrium-kloridot tartalmaz), majd 10 oszloptérfogatnyi 8%-os € pufferrel mossuk. Ezt követi az alfa-galaktozidáz A elúcíója. 1,5 oszloptérfogatnyi .lineáris gradienssel, ami 29% C pufferig ferjed, majd 10 oszloptérfogatnyi lineáris gradienssel, ami 35% C pufferig terjed. A frakcióknak vizsgáljuk az alfa-galaktozidáz A aktivitását, majd az elfogadható aktivitást mutató frakciókat egyesítjük.
tiszti* A
A heparin pool-t megszűrjük, majd közvetlenül Ceramic Hydroxyapafcite HC oszlopra. (4 pm; American International Chemical, Hatiek, MA; 1.2 ml oszloptérfogat, 1,5*6,8 cm) visszük, amit 1 mmol/1 nátriumfoszfáttal (pH-6,0, D pufier) hoztunk egyensúlyba. A kromatográfiát szobahőmérsékleten hajtjuk végre hibrid Gradi-Frac™/FPLC System (Pharmacia, Uppsala, Svédország) hajtjuk vé^re, amit in-line UV detektorral (280 nm) és vezetőképesség monitorral szereltünk: fel. Miután a mintát felvittük (5 ml /perc sebességgel), az oszlopot 10 oszloptérfogatnyi D pufferrel mossuk. Az alfa-galaktozidáz A-t 7 oszloptérfogatnyi lineáris gradienssel eluáljuk, ami. 42% E puffer/58% D puffer között változik (az E puffer 250 mmol/1 nátriumfoszfát, pH-6,.0), majd 10 oszloptérfogatnyi, 52% E pufferig terjedő gradienssel eluáljuk. A frakcióknak vizsgáljuk az alfa-galaktozidáz A aktivitását, és az elfogadható aktivitással rendelkező frakciókat egyesítjük.
£>, Q Sepharose anioncserélö kromatográfia használata az alfa-galaktozídáz A tisztítási lépéseként A hídroxiapatit pool-t vízzel körülbelül 1,5-szeresre hígítottuk, ezzel szobahőmérsékleten a végső vezetőképessége 3,4-3,6 mMHO. Szűrés után a mintát Q Sepharose HP oszlopra (Pharmacia, Uppsala, Svédország; 5,1 ml oszlopiérfögat, 1,5*2,9 cm) visszük, amit 10% G puffer/90% F pufferrel huztunk egyensúlyba, ahol az F puffer 25 mol/'l nátriumfoszfát, pH~6,G> a G puffer pedig 25 mmol/1 nátriumfószfát, ρΗ™6,0, 250 mmol/1
Xa<aCXXLíAaX^XSJ.íJX XCX< 2 \ JxX OXXX^tOgi sxí.i.<xl. Γα£α]Τ.|14.Κ. vcgfc
Gradi-Frac™/.FPLC hibrid rendszerrel (Pharmacia, Uppsala, Svédország), majd az össz-fehérjét és a sókoncentrációt az in-line monitorral követjük, A mintát 5 ml/ porc sebességgel visszük fel, majd az alábbi lépéseket hajtjuk végre: 1) 5 oszloptérfogatnyi mosás 10% G pufferrel , 2) 7 oszloptérfogatnyi mosás 12% G pufferrel, 3) 3 oszloptérfogatnyi lineáris gradiens, ami 50% G pufféiig teq'ed, 4) 10 oszloptérfogatnyi lineáris gradiens 53% G pufféiig, 5) 3 oszloptérfogatnyi gradiens 100% G pufféiig, és 6) lö oszloptérfogatnyi mosás 100%. G pufferrel. Az alfa-galaktozidáz A főleg a. 3, és 4. lépésben eluálódik. Az elfogadható .aktivitást tartalmazó frakciókat egyesítjük (a „Q ροοΓ).
E. Superdex-200 gélsznrés kromatográha az alfa-galaktoziA Q pool-t körülbelül ötszörösre töményítjük, Centriprep-lÖ centrifugális koncentrátor egységekkel (Amicon, Beverly, MA), majd Superdex 200 oszlopra visszük (Pharmacia, Uppsala, Svédország; 189 ml oszloptérfogat, 1,6*94 cm), Az oszlopot 25 mmol/1 nátriumfoszfáttal, pHMTÖ, és 150 mmol/1 nátrium -klóridot tartalmaz hozzuk egyensúlyba és ezzel eluáljuk. A kromatopsala, Svédországi hajtbr' rendszerrel (rh&rmacia, juk végre szobahőmérsékleten, egy in-line UV monitor (280 nm) használatával, hogy kövessük a fehérje eluciöját. Az oszlopra vitt minta térfogata < 2 .ml, az áramlási sebesség 0,5 ml/perc, és a frakció mérete 2. mk Többször futtatjuk az oszlopot, majd a frakcióknak vizsgáljuk az alfa-galaktozidáz A aktivitását, és az elfogadható aktivitást mutató frakciókat egyesítjük.
A Superdez 200 oszlopról származó egyesített frakciókat Centriprep 10 egységekkel koncentráljuk, alikvot részekre osztjuk, hirtelen, lefagyasztjuk, majd rövid ideig -80 °C-on tároljuk. Az alfa-galaktozidáz A tisztításnak ezt a példáját az 5. táblázatban mutatjuk be. Az alfa-galaktozidáz A végső hozama a kiindulási anyag aktivitására, számítva 59% volt, és a tisztított termék mennyisége 2,92* lö6 egység/mg fehérje. A kapott termék nagyon tisztának bizonyult, 4-15% SDS-políakrilamid gélen redukáló körülmények között végzett elektroforézissel, ami után
A tisztítási eljárással erősen tisztított alfa-galaktozidáz A-t A tisztítás az eljárásnak főleg az első két játszódik le, míg az utolsó bárom lépés csak az anyag sát” szolgálja, a megmaradt minor szennyeződések eltávolításával. Az utolsó lépés, a méretkízárásos kromatográfia Superdex 2GÖ-on szintén azt a célt szolgálja, hogy az· alfa~gaiaktozidáz A-t ey kiszereléssel kompatibilis pufferbe juttassa.
termelt alfa-galaktozidáz A mérete
A tisztított humán alfa-galaktozidáz A strukturális és funkcionális tulajdonságait vizsgáltuk. A kapott termék tisztasága nagyon magasnak bizonyult 4-1.5%-os SDS-políakrilamid gélen, redukáló körülmények között, ezüstfestés után.
Az alfa-galaktozidáz A molekulatömegét MALDi-TOFF tömegspektroszkópíával becsültük meg. Ezek az eredmények azt demonstrálják, hogy a dimer molekulatömege 102,353 Da, míg a monomer molekulatömege 51,002 Ba. A monomer várt molekulatömege az amínosav összetétel alapján 45000 Da. Tehát az enzim szénhidrát tartalma 5600 Da..
A stabilan tn
A jelen találmány szerinti eljárással előállított alfa-galaktozidáz A glikozilezésí mintázatát is kiértékeltük. A helyes glikozilezettség fontos az alfa-galaktozidáz A optimális ín vivő aktivitásához; a. ne.m.-glikozilezo rendszerekben expresszált alfa-galáktozidáz A inaktív vagy instabil jHantzopolous és mtsai: Gene 57, 159 (1987|j. A glikozilezés az alfa-galaktozidáz A-nak a kiválasztott célsejtekbe való bejutásához is fontos, és érinti az enzim in lét'O keringési felezési idejét. Az alíá-galaktozidáz Á mindegyik alegységén négy hely található az aszparaginhoz kötött szénhidrát láncok hozzáadásához, amik közül csak három foglalt (Desníek és mtsai: Ihe Metabolic And Moiecular Bases Of inberited Disease, 2741-2780, oldal, McGraw Híll, New York (1995)].
A stabilan transzfektált sejtek által termelt, alfa-galaktozidáz A mintát neurammidázzal kezeljük, amit A. uro/heiens-böl ((Boehringer Ma.nn.heim, Indianapoüs, IN) izoláltak, a szíálsav eltávolítására.. Ezt a reakciót úgy hajtjuk végre, hogy 5 mg alfa99 *
galaktozidáz A-t éjszakán át 10 mE neuraminidázzal kezelünk szobahőmérsékleten, 10 ml acetáttal mmol/1 nátrium-acélát, pH-5,2, ISO mmol/1 nátríum-klorid).
A stabilan transzfektált sejtek által termelt tisztított alfa-galaktozidáz A-t defoszforilezzük is, alkaíikus foszfatáz használatával (borjúbél alkaíikus foszfatáz, Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), oly módon, hogy 5 mg alfa-galaktozidáz A-t éjszakán át szobahőmérséklet kezelünk 15 E alkaíikus foszfatázzal ABS-ben (a pH-t 1 mol/l TRISZ-szel 7,5-re emeljük).
A mintákat SD8-poliakrilamíd gélelektroforézissei és/vagy izoelektromos fókuszálással elemezzük, majd. Western biottot hajtunk végre eg anti-alfa-galaktozidáz A-specifíkus ellenanyaggal. A használt ellenanyag nyúl políklonális antí-peptid ellenanyag, amit immunogénként az alfa-galaktozidáz A 68-81-es amínosavait reprezentáló pepiiddel állítunk elő. A fehérje PVDPre való átvitele után (Miliipore, Bedford, MA)· a membránt 1:2000 higítású an.tiszérummal elemezzük, 2,5% hlotto-ban (zsírmentes tejpor 20 mmol/1 TRlS-HCl-ben, pH-7,5, 0,005% Tween-20). Ezt követi tormaperoxidázhoz konjugáM kecske anti-nyű.1 IgG-vel (Organo Techníque/Cappella, Durham, NC; .1:5000 hígítás) és az ECL kemílum.íneszeencía kittel. (Amersham, Arhngton Heights, IN) való kimutatás.
Az alfa-galaktozidáz A SDS-gélelektroforézissel való elemzés után neuraminidázzal való kezelése a molekulatömeg eltolódását eredményezi (körülbelül 1500-2000 Da, vagy 4-6 sziálsav/monomer), azt sugallva, hogy az alfa-galaktozidáz A alaposan, módosítva van sziálsavval Referenciaként megemlítjük, hogy az alfa100 gaíaktozidáz A plazma-formája monomerenként 5-6 sziálsav csoportot tartalmaz, és a placentális forma 0,5-1 sMálsavat tartalmas monomerenként (Bishop és mtsai: Journal of Biological Chemistry 256, 1307 (1981)].
Az alfa-galaktorídáz A sziálsav és M6.F modifikációja vizsgálatának egy másik módszere az izoelektromos fókuszálás (IEF), aholis a. mintákat izoelektromos pontjuk (pl), vagy nettó töltésük alapján választják szét. Tehát a töltött csoportok, azaz például a sziálsav vagy a foszfát eltávolítása az alfa-galaktozidáz A-ról várhatóan, megváltoztatja a fehérje mobilitását az IEF rendszerben.
Az IEF kísérlet végrehajtásához a jelen találmány szerint előállított alfa-galaktozidáz A mintákat neuraminidázzal és/vagy alkalíkus foszfátázzal kezeljük, 1:1 arányban összekeverve 2X Novex xnintafelvivó pufferrel (8 mol/1 karbamid, pH-3,0-7,0), majd Pharmalyte-tal (Pharmacia, Uppsala, Svédország; ρΗ«3,0·· 3,5; Pharmalyte 4-6,5 és 2,5-5,5, gélenként 0,25 ml) készített 6 mol/T karbamid IEF gélre (5,5% poliakrilamid) visszük. Az izoelektromos pont standardokat is használjuk (Sió-Rád). Az elektroforézist követően a gélt PVDF-re visszük át, és Western biot elemzést, hajtunk végre az előzőkben ismertetett módon.
Az enzim neuramínidáz kezelése növelte mindhárom izoíorma pl értékét, jelezve, hogy bizonyos mértékben mindegyik sziálsavval van módosítva. Ezek az adatok azt sugallják, hogy az itt ismertetett módon előállított alfa-galaktozidáz A készítmények a. kívánt plazma felezési idővel rendelkeznek, ami azt mutatja, hegyez az anyag megfelel a farmakológiai felhasználáshoz. Emel··
ΙΟΙ
* * lett, a neuram.inidázztd kezelt alfa-galaktozidáz- A alkalikus főszfalazza! való kezelése tovább növelte a. fehétje egy részének pl értékét, körülbelül 5,0-5,1 -re, ami azt mutatja, hogy az enzim egy vagy több MőP csoporttal rendelkezik. Erre a módosításra azért van szükség, hogy az alfa-galaktozidáz A-t hatékonyan internalízálják a célsejtek.
Az alfa-galaktozidáz A N-kapcsolt szénhidrát láncait ioncserélő HPLC- vel (Glyco-Sep C) elemezzük, és a nem-redukáló véget fluoreszcens 2-amíno henzamiddal (AB) jelöljük. A három különböző alfa-galaktozidáz A készítményből kapott AB~glikánok elemzésének eredményeit a 5, táblázatban foglaljuk össze. Míndhátom. készítmény Z értéke nagyobb 170-nél, Emellett a glikánoknak több mint 67%-a. szíalílezve van, és a glikánoknak több mint 16%-a foszforilezve van, és kevesebb mint 16%-a semleges. Ezek az eredmények a korábban közölt eredményekhez viszonyítva nagyon kedvezőek. Például Desnick és munkatársai (5,356,804 számú Amerikai Egyesült Államokbeli szabadalmi leírás) leírták, hogy a glikánoknak több mint 60%-a semleges, es csak 11%-a szíalílezett.
6, Táblázat
GÁ-GAL~ből származó· AB-glíkánok elemzésének erednie nyel semmi semmi semmi Átlag (N::::3)
Z szám %
semleges
170,04 16,83
”Ϊ77,7Ϊ l4>22
171,68 15,81
Mono % Di H/oTri I % ΐ Tetra.
15,34 í 5,58 :73,14 | 15,62
Í5O931 2X38
22,8 20,63
2ÖJ3 j 43,2 | 14,33 | 5
24,47 j 34,28 j 13,58^4/29
1................
Az összes száza- A jelen találmány Desnick és mtsai:
léka szerinti GA-GAL készítmények 5,356,804 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás
Ossz P~glíkán 16,62 _____
Őssz- szialilezett 65,57 11
Őssz- semleges (magas mamióz és hibrid) 15,62 62,9
103
A tisztított GA-GAL készítmények további részletes jellemzését a 7. táblázatban adjuk meg.
tisztított
Amint az az előzőkben tárgyaltuk, az alfa-galaktozidáz A glikoformák frakdonálása az itt ismertetett tisztítás eljárás különböző lépéseiben lép fel. Ebben, a példában az alfa-galaktozidáz A. glíkoformákat méret és töltés alapján frakcionáljuk. Az is lehet, hogy az alfa-galaktozidáz A-t ezeknek és más kromatográfiás lépéseknek a kombinálásával frakcionáljuk, az. előzőkben ismertetett módon.
méret alapján va frakeionálásához a méretkizárásos kromatográfiát Superdex. 2(
104
oszlopon hajtjuk végre (Pharmacia, 1,6 cm* 94,1 cm), foszfáttal puffereit sooldattal hozva egyensúlyba pH-ó-on. 1 ml térfogatban 2,6· mg alfa-galaktozidáz A-t viszünk az oszlopra, majd az oszlopot 0,35 ml/perc sebességgel eluáljuk. A teljes elúcios
-galaktozídáz A széles elüciós csúcsát SDS-PAGE-val elemezzük, majd ezüstfestéssel tesszük láthatóvá. A csúcs eleien levő frakciók tártain frakciók folytatódtak látszólagos
A kapjuk a kívánt A a csúcsban, az alfa-galaktozidáz A ge fokozatosan lecsökkent. Az alfa-gaazután szelektáljuk és egyesítjük, így tartományba tartozó alfa-galakAz alfa-galaktozidáz A glikoformák töltés alapján való frakcionálásához az alía-gal&ktozídáz A-t Q-Sepharose kromatográfiával frakciónál)uk, A Q-Sepharose oszlopot (1,5 cm χ 9,4 cm) 20 mmol/1 nátriumfoszfát 30 mmol/1 nátnum-klorid ősszeml/ perc értéken tartjuk. 166 milliliter térfogatban levő 130 mg alfa-galaktozidáz A-t viszünk az oszlopra, mossuk az ekvilibrálő pufferrel, majd 20 mmol/1 nátriumfoszfáttal (pH:::6,Ö) eluáljuk, ami 130 mmol/1 nátrium-kloridot tartalmaz. Egy extenzívebb frakcionáláshoz gradiens elúciót alkalmazunk (10 oszloptérfogatoyi), ami az ekvilíbrációs puffertől az elüciós pufferíg terjedhet, A teljes elúeiós profilban szedünk frakciókat, majd az alfa-galaktozidáz A elüciós csúcsát SDS-PAGE-val. elemezzük, majd ezüstfestéssel tesszük láthatóvá. A gélen megfigyelhető
105 alacsonyabb molekulatomegö. fajták a mosófolyadékkal és a csúcs elején eluálódnak, a magasabb molekulatőmegű glíkofor mák a csúcs vége felé eluálódnak. Az alacsonyabb molekulatömegű fajták az alfa-galaktozidáz A kevésbé töltött glikoformáinak felelnek meg, amik kevésbé erősen kötődnek a töltött Q-Sepharose oszlophoz (ami kvaterner aminnal helyettesített gyantát tartalmaz/ A legmagasabb negatív töltésű alfa-galaktozidáz A fajták, később eluálódnak az elúciös profilban, és SDS-PAGE alapján molekulatömegük is nagyobb. A töltés alapján való frakcionálási az eluált frakciók vagy a kiválasztott pool-ok izoelektromos fókuszálása alapján lehet igazolni.
Tehát, mind a méret alapján történő frakcionálás, mind a töltés alapján történő frakcionálás lehetővé teszi az alfa-galaktozidáz A erősen töltött glikoformáinak a szelektálását.
1ŐÓ
2.5 Az alfa-galaktozidáz A mannóz vagy mannóz-S-foszfát révén való internalizaciója
Ahhoz, hogy a stabilan transzfektalt sejtek által termelt alfa-galaktozidáz A az .alfa-galaktozidáz A deficienciák hatékony terápiás ágense legyen az enzimet az érintett sejteknek internaíízálnittk kell. Az alfa-galaktozidáz A minimálisan aktív fiziológiás pH szintekenj például a vérben vagy az ínterstidálís folyadékban. Az alfa-galaktozidáz A csak akkor metaholizálja optimálisan a lipid szubsztrátokat, ha a lizoszóma savas környezetébeÍnternalizálödík. Ezt az internalizálódást befolyásolja .az alfa-galaktozidáz A-nak az M6F receptorokhoz való kötődése., amik a sejt felszínén expresszálódnak, és az enzimet az andoeítás bioszintézis úton keresztül juttatják a lizoszómáha. Az M6P receptor mindenütt expresszálődik; a legtöbb szomatikus sejt bizonyos mértékben expresszálja az M6P-1. A mannóz receptor, ami a glíkoproteineken levő mannóz csoportokra, specifikus, kevésbé elterjedt. A mannóz receptorok általában csak a makrofágokon és a makrofág-szerö sejteken találhatók meg, és további lehetőséget bizosítanak ahhoz, hogy az alfa-galaktozidáz A bejusson ezekbe a sejttípusokba.
Ahhoz, hogy demonstráljuk az· alfa-galaktozidáz A MőP által befolyásolt íntemalizáclőjá.t, Fabry-betegségben szenvedd betegből származó bőr fibroblasztokat (Ni GM Humán Genetic Mntant Cell Reposítory) tenyésztőn éjszakán át növekvő koncentrációjú, jelen találmány szerinti, tisztított alfa-galaktozidáz A jelenlétében. Néhány minta 5 mmol/1 oldható MóP-t tartalmaz, ami kompét!tíve gátolja az MóP receptorhoz való kötődést, és az általuk való ;0~ internalizációt. Más minták 30 mg/liter mannánt tartalmaznak, ami gátolja a mannóz receptor által történő kötődést és internalízáníót. Az ínkubálás után a sejteket mossuk, majd lekaparással lízís pufferbe gyűjtjük (.10 mm.ol/1 ÍRISZ, pBn'7,2, 100 mmol/1 nátríum-kiorid, 5 mmol/1 EDTA, 2 mm.ol/1 Pefabloc™ {(Boehringer Mannheim. Indiánapolis, IN) és 1% NP-40). A lizált. mintáknak azután vizsgáljuk a fehérje-koneentráelójá.t és alfa-galaktozidáz A aktivitását.. Az eredményeket alfa-salakfozidáz A aktivitás/mg sejtfehérje formájában fejezzük kí. A Fabry sejtek az alfa-galaktozidáz A-t dózísfüggő mádon intemalizáljak. Ezt. az internalizációt gátolja az M6P, de a mannán nem gátolja, tehát az alfa-galaktozidáz A internalizációjáf a Pabry fibroblasztokba. az M6P receptor befolyásolja, ed a mannóz receptor nem befolyásolja.
Az alfa-galaktozidáz A-t in nitro az endoteliális sejtek is ín~ iernalizálják, amik a Fabry-betegség kezelésének, fontos célsejtjei. Humán köldökvéna endoteliális sejteket (HÜVEC-ek) tenyésztünk éjszakán át 7500 egység alfa-galaktozidáz A jelenlétében; a lukak közül néhány M6P-t tartalmaz. Az inkubálási periódus után a sejteket összegyűjtjük, és az előzőkben ismertetett módon vizsgáljuk az alfa-galaktozidáz A szempontjából. Az alfa-galaktozidáz A-val inkubált sejtekben az enzim szintek, majdnem tízszer magasabbak mint a kontroll (amit. nem inkubáltunk alfa-galaktozidáz A-val) sejtekben. Az M6P gátolja az alfa-galaktozidáz A intraeelluláris akkumulálódását az alfa-galaktozidáz A-ban, jelezve ezzel, hogy az alfa-galaktozidáz A HWEC által való internalizációját az MőP receptor befolyásolja. Tehát a
Í08
V <
♦ * jelen találmány szerinti alfa-galaktozidáz A-t klinikailag releváns sejtek internalizálják.
Kevés tenyésztett humán sejtvonalról ismert, hogy expresszálja a mannőz· receptort. Azonban egy egér makrofág-szerü sejtvonal (J774.B), -ami hordoz mannőz receptorokat, de nem, vagy csak nagyon csekély számban tartalmaz MőP receptorokat, használható annak meghatározására, hogy a jelen találmány szerinti tisztított alfa-galaktozidáz A-t a rnannoz receptorokon keresztül internalizálják [Diment és mtsaí: J, Leukocyte Bioi. 42, ri9S7)j, A J774.E sejteket éjszakán át tenyésztjük 10000 egység/ml alfa-galaktozidáz A jelenlétében, A kiválasztott minták tartalmaznak 2 mmol/1 MóP-1,míg mások löö mg/m.1 mannánt tartalmaznak. A sejteket mossuk, majd az előzőkben ismertetett módon összegyűjtjük, majd meghatározzuk, hogy az egyes mintákban mennyi az őssz-fehérje és az alfa-galaktozidáz A 5. Az M6P nem gátolja azt, hogy ezek a sejtek felvegyék az A-t, mig a mannán körülbelül 75%-kal csök-
kenti az: akkumulált alfa-galaktozidáz A szinteket. Tehát a jelen találmány szerinti alfa-galaktozidáz A a mannőz receptoron keresztül interaalizálódhai azokban a sejttípusokban, amik ezt a bizonyos sejtfelszíni receptort expresszálják.
109 »·:·' *·♦· * Φ Φ * ΦΦΦ
3. Példa
Gyógyászati készítmény
A tisztított búik alfa-galaktozidáz A-t alfa-galaktozidáz A hi gítószerrel végső koncentrációra hígítjuk. A kiszerelendő tisztított búik. térfogata alapján meghatározzuk ííz alfa-galaktozidáz A koncentrációját (mg/mi), és az alfa-galaktozidáz A kívánt végkoneentráeiőját a végső kiszerelési formában, valamint a szükséges alfa-galaktozidáz A higítószer mennyiségét. Az alfa-galaktozidáz A higítoszert a felhasználás előtt maximum 24 órával készítjük el, megfelelő mennyiségű WFl-t nátrium-kloridot és egybázású náfriumfoszfátot összekeverve, p'Hját 6,ö~ra állítva nátrium-hid.roxid. oldattal. Az alfa-galaktozidáz A higítószer összetételét a 8. táblameg.
alfa-gálakíozidáz A higítószer összetétele (per liter)
Komponens Neve Mennyisége
nátrium-klorid (USP) 100-1916 8,8 g
nátrium-hidroxid, 5 mol/1 200-1903 amennyi a pld 6,0- ra állításához kell
nátriumfoszfát, egybázisos (U8P) 100-1913 3,5 g
víz ínjekcíózáshoz (USP( 100-2301 1 literre tölteni
φ φ
2G χ ♦ * « *# ♦ φφφφ * *·*'♦♦ * χ ΦΦΦ X *ΦΦ
Az alfa-galaktozidáz & higítószer egy literét, vagy kisebb mennyiségét vákuumszűréssel szűrjük, steril 0,2 mm-es nylon szűrők alkalmazásával (Nalgene Hűbe International, Rochester, NY). A nagyobb térfogatokat pozitív nyomással szűrjük, perisztaltikus pumpát és 0,3 mm Supor kapszula szűrőket használva (Pali, Port Washington, NY), A szűrés után mindegyik szűrőt buborékpont. integráitás tesztnek vetjük alá. A keverést, és szűrési lépéseket tanúsítvánnyal ellátott Class 100 lamináris
CU dUUdbi UUAUaI.J. vcgt C. fU M xiigxtvoZfCrt a tisztított alfa-galaktozidáz A búikhoz adjuk egy keverő edényben, így kapunk egy 1 mg/ml koncentrációjú végső oldatot.
hozzá.
hogy
Deszíalílezett zott alfa-galaktozidáz A >z, hogy megvizsgáljuk a gt szes at az laktozídáz A biológiai eloszlására, az alfa-galaktozidáz A tisztított készítményét fokozatosan deglikozilezzük, és mindegyik formáját egereknek injekciózzuk be. Az egerek szerveit az injekciőzás után négy órával kivesszük, és a szóveteken immunhisztokemiaí vizsgálatnak vetjük alá, hogy láthatóvá tegyük a fehérje biológiai dósában esetleg fennálló változásokat.
Az alfa-galaktozídáz A~t először neuramtmdázzal (szialidáz) kezeljük, hogy eltávolitsuk a szíálsav csoportokat, aminek a.z az eredménye, hogy a galaktóz csoportok exponálodnak, Ennek a szialídázzal kezelt anyagnak egy részét tovább reagáltatjuk βm
-Sr ♦ F
-X ** ♦ ♦ *. χ » > ♦
Φ«* »♦<» * χ «ΦΧ * ♦ «•X »
X « « galaktozidázzal, hogy eltávolitsuk a galaktoz-csopörtokat; ez az N'-acetilglükózammt (GleNAcj exponálja, A GlcNAc-ket azután Afaeetílglükőzaminldázzal távolítjuk el, ezzel a fehérjén levő, a magot képező mannóz csoportokat exponáljuk. A kezeletlen alfagalaktozidáz A-t (kontroll), vagy a fehérje egyik kezelt formáját a farki vénán keresztül injekciózzuk egerekbe. Négy árával az iníkeiőzás után az egerekből a. májat, a lépet, a szivet, a vesét, és a
Ha a kezeletlen fehérjét kapó kontroll állatokkal hasonlítjuk össze, akkor a szialidázzal kezelt enzimet (amiben a galaktőz cso:akj kapó egerekben több alfa-galaktozidáz A a majoan, és ennek megfelelően kevesebb enzim más vizsgált szervekben. Emellett a májban a
festési mintázat.
coan az
lokalizálódík, csak festéssel A szialidázzal íz A-t 1 az enzim csak a foepatocitákba lokalizálódík, ami összhangban van az aszialoglikoprotein receptor ismert biológiai eloszlásával. A deglikozílezésnek ez a biológiai eloszlásra gyakorolt hatása visszafordítható, ha a galaktőz csoportokat β-galakíozidázzal eltávolítjuk. Az ezt a galaktőz egység nélküli fehérje kapó egerek májában megfigyelt festési mintázat hasonló a kontroll állatokban kapott festési mintázathoz; a festés többsége a.
en és az endoteliális sejtekben van, minimális hepatocita festéssel. Az alfa-galaktozidáz A .Af-acetílglükozX fe
X fefe’ * fe χ Λ <
» fe * χ » X fe ·«·*♦ 9
X fe. fe fe X fefe* * ♦ x fefe * x aminidázzal való kezelése nem változtatja meg a mintázatot azzal összehasonlítva, amit a β-galaktozídázzal ,k< fehérjével figyelhetünk meg; azaz, úgy tűnik, hogy az A-aeetüglükózaraín csoportok eltávolításának kicsi a hatása az alfa-galaktozidáz A biológiai eloszlására.
humán fihrohlasztokkal
A génterápiához alfa-galaktozidáz A-t termelő autológ sejtek implantáttimának az enzimet módosított formában kell termelnie, ami «kijavítja* az alfa-galaktozidáz A deficíenciát a megcélzott sejtekben. Ahhoz, hogy megbecsüljük a transzfektált humán fibrohlasztok áétal termeit alfa-galaktozidáz A hatását, a. Fabry sejtekre, a Fabry-betegségben szenvedőkből vett fibroblasztokat (NiGSM' Humán Genetics Mutant Cell Repository) Transwells-ben (Costar, Cambridge, MA) együtt tenyésztjük egy alfa-galaktozidáz A-t termelő sejt törzsével (BR8-11). A Fabry' sejteket 12-lukas szövettenyésztő lemezeken tenyésztjük, araik közül néhány inszerteket tartalmaz (Transwefis, 0.4 mm pőrusméret), amiknek a felszínén szaporodhatnak a sejtek. Az inszert növesztő mátrixa porózus, és lehetővé teszi, hogy a makromolekulák fentről eljussanak az alsó részbe. Az inszertek egy csoportja normális humán fityma (HF) iibrohlasztokat tartalmaz, amik minimális szinten expresszálódnak alfa-galaktozidáz A-t, míg más csoportok tartalmazzák a stabilan transzfektált humán fíbroblaszt törzset, a BRS~ll~et, ami nagy mennyiségben székre313
a. Inkákban:, amikben a sejtekkel együtt tea Fabry sejteket a Fabry sejtekbe, k azt mutatlak, hogy a
Λ 0 *♦
X * X «»00 $
Μ 00
00 #
0 .. » * 0 Λ « « ♦ «* <«»« S · « «0« »0 tál alfa-galaktozidáz A-t. ι sejteket alfa-galaktozidáz A-t nyésztjük, az alfa-galaktozidáz A körülvevő- közegbe, és potenciálisan.
A 9.
Fabry sejtek internalizálják a szekretált alfa-galaktozidáz A-t. Az alfa-galaktozidáz A intracelluláris szintjét 3 napig követjük. Azokban a. sejtekben, amiket önmagukban tenyésztünk (nincs inszert), vagy nem- transzfektált fityma fibroblasztok jelenlétében tenyésztünk (HF ínszert), nagyon kiesi az alfa-galaktozidáz A aktivitás intracelluláris szintje. Azonban, az alfa-galaktozidáz A-t. termelő (BRS-11 inszert) együtt tenyésztett Fabry sejtekben az enzim szintje a 2. nap végén hasonló a normál sejtekben levő enzimszinthez (a normális fibroblasztok 25-80 egység, alfa-galaktozidáz A-t tartalmaznak egy mg fehérjére számítva). Azt, hogy a koiTekciŐ az M6P receptor által felvett alfa-galaktozidáz A-nak tulajdonítható, az M6P-vel való mhihíciő (BRS-11 ínszert + M6P) demonstrálja.
114 .<
*
ΦΦ
Φ
Φ * Φ
ΦΛ·» ♦ *
A fenti leírást kizárólag illusztrálás céljából adjuk meg, és szándékaink szerint a találmány oltalmi körét nem a leírt precíz formára korlátozza, hanem, a leíráshoz csatolt igénypontokra. A csatolt igénypontok specifikációjában az egyesszám. jelenthet többesszámú referenciát is, hacsak a szövegösszefüggés nem en.
összes publikációt a továbbiakban referenciaként kezeljük.
Az alábbiakban részletesen Ismertetjük a leírásban említett szekvenciákat.

Claims (48)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Humán alfa-galaktozidáz A készítmény, amiben az említett készítmény össz-glikánjának több· mint 50%-a komplextípusú glikán.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti humán alfa-galaktozidáz A glikoprotein, amely készítményt SDS-FAGE-val vagy fordított fázisú HPLC-vel mérve legalább 98%-os homogenitásig tisztítunk.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti humán alfa-galaktozidáz A
    2,vx lln egyseg/mg xenerje.
  4. 4.
    Az 1. igénypont szerinti humán alfe-aalaktozídáz glikoprotein készítmény, amely készítményt SDS-PAGE-val vagy fordított fázisú HPLC-vel mérve legalább 98’%-os homogenitásig tisztítunk, és specifikus aktivitása legalább 2.ÖX1Ö6 egység/mg
  5. 5. Az 1. igénypont szerinti humán alfa-galaktozidáz A glikoprotein készítmény, amely említett készítményben az összglikántartalomnak legalább 67%-a.komplex típusú glikán.
  6. 6. Az 1. igénypont szerinti humán alfa-galaktozidáz A glikoprotein. készítmény, amely említett készítmény átlagosan két komplex típusú glíkánt tartalmaz egy alfa-galaktozidáz A monomerre számítva.
  7. 7. Az 1. igénypont szerinti humán alfa-galaktozidáz A glikoprotein készítmény, amely említett, készítményben az alfagalaktozidáz A glikoformák őssz-gkfcántartalmának több mint y»~a ze van.
    528 ♦ Xf Φ 4 * * « « φ * < *
    4 < φ * **
    Φ ♦φ χ
    ΦΦΧ ♦ ΦΦΦ ν*
  8. 8. Az 1. igénypont szerinti humán alfa-galaktozidáz A glikoprotein. készítmény, afoolis az alfa-galaktozidáz A-t alfa-galaktozldáz A/emlos expressziós vektor konstrukcióval transzfektált humán sejtekből izoláljuk,
  9. 9, A 8. igénypont szerinti humán alfa-galaktozidáz A glikoprotein készítmény, amiben a. transzfektálf. humán sejtek
  10. 10. Az 1, igénypont szerinti készítmény, amiben az alfagalaktozidáz A glikoformák körülbelül 50-70%-ban 2-4 sziálsav csoportot tartalmazó komplex glikánokat tartalmaznak.
  11. 11. Egy humán alfa-galaktozidáz A glikoproteín készítménvt tartalmazó kiszerelési forma, amelv készítményt SDS· ν’ *»’
    PAGE-val vagy fordított fázisú HFLC-vel mérve legalább 98%-os homogenitásig tisztítunk, és specifikus aktivitása legalább 2,0106 egység/mg fehérje, és az említett készítmény a. poszttranszlációsán módosított, érett humán alfa-galaktozidáz A fehérje egy vagy több glikoformáját tartalmazza, és az alfa-galaktozidáz A-t alfa-gala.ktozid.áz A/emlős expressziós vektor konstrukcióval transzfektálf humán sejtekből izoláljuk.
  12. 12. A 11, igénypont szerinti' készítmény, amiben a transzfektéit humán sejtek szekunder fibroblaszfok.
  13. 13. Készítmény, ami egy vagy több érett, poszt-transzláclösan módosított humán alfa-galaktozidáz A glikoformát máz, legalább 98%-os homogenitásig tisztítva, specifik aktivitása legalább 2,0*104 egység/mg fehérje, és hogy az alfa-galaktozidáz A glíkoformákat hidrofőb köles gyantán elválasztjuk a többi komponenstől, és a készítmény több » « tartalmaz egy alfa-galaktozidáz A
    Í29 mint 50%-ban kom glíkoformára számítva.
  14. 14. Készítmény, ami egy vagy több érett, poszt-transz osan módosított humán, alfa-galaktozidáz A glikoformát tartalmaz, legalább 98%-os homogenitásig tisztítva, specifikus aktivitása legalább 2,öxl öö egység/mg fehérje, és a készítmény több mint 50% komplex glikánt tartalmaz egy alfa-galaktozidáz A glíkoformára számítva, amit úgy állítunk elő, hogy egy mintában az alfa-galaktozidáz A gükoíormáfcat a többi komponenstől a következő csoportba tartozó tisztítási eljárással választjuk eb kromatofökuszáló kromatográfia, fémkelát affinitás kromatográfia és immunaffinitás kromatográfia.
    1.5. Készítmény, ami egy vagy több érett, poszt-transzIáciosan módosított humán allh-galakfozídáz A glikoformát tartalmaz, legalább 98%-os homogenitásig tisztítva., specifikus aktivitása legalább 2,0^106 egység/mg fehérje, és a készítmény több mint 50%· komplex glikánt tartalmaz egy alfa-galaktozidáz A számítva, amit az alábbi lépések alkalmazásával áfái az ana-gat likoformákat savas pH-n ben katíoncseréiö gyantára
    b) a gyantát az egye:
    pufferrel mossuk, hogy eiuáljuk, amit az alábbi esc ki: 10« » ♦ ΑΧ Ü9 V * * * * # w «. » V * ♦ ♦·♦ «*»9 9 9X9 9 9 9
    9 ** * 9 9 99 9 X
    100 mmol/1 sóoldat, pH~4~S~re puffereit sóoldat és ezek kombinációja,
  15. 16, Készítmény, ami egy vagy több érett, poszt-transzlációsán módosított humán alfa-galaktozidáz A gllkoformát tartalmaz, megnövekedett oligoszacbarid töltéssel, legalább 98%-os homogenitásig tisztítva és specifikus aktivitása legalább 2,0x1 ö6 egység/mg fehérje, és az említett készítmény legalább 50% komplex glíkánt tartalmaz egy alfa-galaktozidáz A glíkoformára számítva, és az említett készítményt az alábbi lépések alkalmazásával állítjuk elő:
    a) egy alfa-galaktozidáz A-t termelő sejtbe egy szíalíltranszferázt kódoló polinukleotidot juttatunk be, vagy homológ rekombinációval egy szabályozó-szekvenciát juttatunk be, ami egy endogén szíalíl transzferáz expressziőját szabályozza;
    b) az alfa-galaktozidáz A-t termelő sejtet olyan körülmények között tenyésztjük, ami az alfa-galaktozidáz A és a szialil-transzferáz expressziójáf eredményezik; és
    c) izoláljuk az alfa-galaktozidáz A fehérjét, amely alfa-galaktozidáz A fehérjének a polinukleotidot nem tartalmazó sejtben előállított alfa-galaktozidáz A-val összebasonlitva megnőtt az oligoszacharíd töltése.
  16. 17, A 16. igénypont szerinti készítmény, aminek előállításához azt a lépést, is alkalmazzuk, amiben a megnőtt molekulatömegű, töltésű, az alfa-galaktozidáz A glíköformákat a c) lépésben kapott, alfa-gala tisztításával szelektáljuk.
    ktozídáz A fehérje frakciónál ásóval vagy
    331 «
    fe fe fe fe »
  17. 18. Készítmény, ami egy vagy több érett, poszt-transzlációsán módosított, humán alfa-galaktozidáz A glíkoformát tartalmaz, megnőtt foszforilezettséggel, legalább 98%-os homogenitásig tisztítva, specifikus aktivitása legalább 2,0106 egy ség/ mg fehérje, és a készítmény több mint 50% komplex glikánt tartalmaz egy alfa-galaktozidáz A glikoformára számítva és az említett készítményt az alábbi lépések alkalmazásával állítjuk elő:
    a.) egy alfa-galaktozidáz A-t termelő- sejtbe egy foszforiltranszferázt kódoló polinukleotidot juttatunk be, vagy homológ rekombinációval egy szabályozó-szekvenciát juttatunk be, ami egy endogén foszforil transzferáz expresszióját szabályozza;
    b) az alfa-galaktozidáz A-t termelő sejtet olyan körülmények kozott tenyésztjük, ami az alfa-galaktozidáz A és a foszforil-transzferáz expresszíóját eredményezik; és
    c) izoláljuk az alfa-galaktozidáz A fehérjét, amely alfa-galaktozidáz A fehérjének a polinukleotidot nem. tartalmazó sejtben előállított alfa-galaktozidáz A-val összehasonlítva megnőtt a foszforilezettsége.
  18. 19. Készítmény, ami egy vagy több érett, poszt-transzlációsán módosított humán alfa-galaktozidáz A glíkoformát tartalmaz, az oligoszacband láncokon csökkent számú terminális szíálsav és gaiaktőz egységgel, legalább 98%-os homogenitásig tisztítva, specifikus aktivitása legalább 2?ö><106 egység/ m.g fehérje, a készítmény több mint 50% komplex glikánt tartalmaz egy *· * φ φ * φ * χ χ χ. φ * * > Φ % φ φ φ φ * »♦» »»φφ φ «τΦΦ» * * < Φ Φ * Φ ΦΦΦ »* alfa-galaktozidáz A glikoformára számítva és az említett készítményt az alábbi lépések alkalmazásával állítjuk elő:
    zuk érintkezésbe, hogy eltávolítsuk a sziálsav csoportokat, ami a terminális galaktóz egységek exponálódását eredményezi, bj az a) lépésben kapott, deszialilezett alfa-galaktozidáz
    A. fehérjét β-galaktozidázzal kezeljük, hogy eltávolítsuk az exponálodott, terminális galaktóz egységeket; és aholis a b) lépésben kapott, deszialilezett, degalaktozilezett alfa-galaktozidáz A fehérje csökkent számú terminális sziálsav vagy galaktóz egységet tartalmaz az oligoszaeharid láncon, egy olyan alfa-galaktozidáz. A fehérjével összehasonlítva, amit nem hoztunk érintkezésbe neuraminidázzal és β-gaiaktozidázzah .20. Készítmény, ami egy vagy több érett, poszt-transzlációsán módosított humán alfa-galaktozidáz A glíkoformát tartalmaz, az oligoszaeharid láncokon csökkent számú terminális galaktóz egységgel, legalább 98%-os homogenitásig tisztítva, specifikus aktivitása legalább 2,0* lö6 egység/mg fehérje, a készítmény több mint 50% komplex glikánt tartalmaz egy alfa-galaktozidáz Á glikoformára. számítva és az említett készítményt úgy állítjuk elő, hogy az alfa-galaktozidáz A fehérjét β-galaktozidázzal hozzuk érintkezésbe, hogy· eltávolítsuk a terminális galaktóz egységeket, és a degalaktozilezett alfa-galaktozidáz A fehérje kisebb számú terminális galaktóz egységet tartalmaz az oligoszaeharid láncokon, egy olyan alfa-galaktozidáz A fehérjével összehasonlítva, amit nem hoztunk érintkezésbe β-galaktozídázzak φ φ V Φ« ·»♦ ♦ «♦ 9 * * X ♦ * φ * * φ * * · * *«♦♦ « Χ-ΦΦΧ X X » «ΦΧ * ♦#* ** '71 .}. .
    aun egy vagy érett.
    osan módosított, humán alfa-galaktozidáz A glíkoformát tartalmaz, legalább 98%-os homogenitásig tisztítva, specifikus aktivitása legalább 2,0* lö6 egység/mg fehérje, és a készítmény több mint OÖ% lex glikoformára számítva, kovalens kötéssel polietilénglikolhoz (PEG) kapcsolva, aholis a PEG kovalens kötéssel van konjűgálva az alfa-galaktozidáz A glikoformák egy vagy több pontjához, amiket az alábbi csoportból választhatunk ki: aminocsoportok, karboxilcsoportok, sznifíiidriicsoporíok és szénhidrát csoportok.
  19. 22. Humán alfa-galaktozidáz A gjikoprotein készítmény, amit az alábbi eljárással állítunk elő:
    al módosítottunk, hogy e:
    sejtet, amit genetikaija alfa-galaktozidáz A polipén
    b) a humán sejtből vagy a humán sejt tenyésztő közegéből tisztítjuk az inéi
  20. 23. A 22, igénypont szerinti humán alfa-galaktozidáz A s?t SDS-ry ~'K~yal va fordított fázisú HPLC-vel mérve legalább 98%-os homogenitásig tisztítunk.
  21. 24. A 22. igénypont szerinti humán alfa-galaktozidáz A glikoprote.ín készítmény, amely készítménynek a specifikus aktivitása legalább 2,0*10 egység/mg fehérje.
  22. 25. A 22. igénypont szerinti humán alfa-galaktozidáz Á ein készítmény, amely készítményt SDS-PAGE-val vagy
    534
    Φ* fordított fázisú tisztítunk, és 6= mérve legalább 98%-os homogenitásig 2,0* 106 egység/ mg
  23. 26, A 22. igény ; szerinti humán alfa-galaktozidáz A s
    67%-a 1
  24. 27, A 22, igény tartalmaz egy alfs
  25. 28. A 22. igény glíkoprotein készítmény mák össz-glikánjánák t€
  26. 29. A 22. ígényp protein készítmény, sejtet egy alfa-galaktozidáz m az összes gltkánna tan.
    ;.t szerinti humán alfa-gí ami átlagosan két komplex gl : A monomerre számítva, szerinti humán alfa-galaktozidáz A amiben az alfa-galaktozidáz A glikoforb xnint 50%-a szialílezve van. nt szerinti humán alfa-galaktozidáz A a genetikailag módosított humán A/emlős expresszíós vektor konsíruk-
  27. 30. A 22. igénypont szerinti humán alfa-galaktozidáz A glíkoprotein készítmény, aholis a genetikailag módosított humán sejtet egy olyan szabályozó elemet kódoló nukleinsawal transzfektálnnk, ami az alfa-galaktozidáz A egy kódoló szekvenciájának szabályozza,
  28. 31. A 22. igénypont szerinti humán alfa-galaktozidáz A dn készítmény, amiben a genetikailag módosított humán sejtek szekunder fíbroblasztok,
  29. 32. A 22, igénypont szerinti humán alfa-galaktozidáz A glíkoprotein. készítmény, amely alfa-galaktozidáz A polípeptid tisztítása legalább egy tisztítási eljárást foglal magában, amit az
    135 * t ♦ Φ9 Q# « ♦« 9 * * ♦ * fc K fc X * * fcfcfc φ ♦ Φ
    Φ »«« X «* alábbiak közül választhatunk ki: hidrofób kölcsönhatáson alapuló kmmatográfia, ionos kölcsönhatáson, alapuló kromatográfia., méretkizárásos kromatográfia, kromaföíókuszálö kromatográfia, Fémkelát kromatogx'áfia és aiTinításkromatográfia.
  30. 33. A 32, igénypont szerinti humán aiía-galaktözídáz A gliköproteín készítmény, amely alfa-galaktozidáz A polípeptid tisztítása magában foglalja még az alfa-galaktozidáz A glíkoforma frakoionálásának lépését ís.
  31. 34. A 22. igénypont szerinti humán alfa-galaktozidáz A glikoproteín készátmény, aholis az eljárás magában foglalja a szíalil transzferál humán sejtben való expressziójának lépését ís,
  32. 35. A 18. igénypont szerinti készítmény, amiben a készítmény össz-glikánta.rtal.m.á.nak legalább 67%-a komplex típusú
  33. 36. A 18. igénypont szerinti készítmény, amiben átlagosan két komplex glikán jut egy alfa-galaktozidáz A monomerre.
  34. 37. A 19, igénypont szerinti készítmény, amiben a készítmény össz-glíkán tartalmának legalább 67%-a komplex típusú
  35. 38, A 19. igénypont szerinti készítmény, amiben átlagosan két komplex glikán jut egy alfa-galaktozidáz A mono merre.
  36. 39. A 20. igénypont szerinti készítmény, amiben a készítmény össz-glíkán tartalmának legalább 67%-a komplex típusú
    136 «
    « Jt X
    X φ«
    Φ > * X ♦ φ φ * *·Χ X ♦»«» X X
    Φ Λ«* ΦΦ
  37. 40, Α 20, igénypont szerinti készítmény, amiben átlagosan két komplex glíkán jut egy alfa-galaktozidáz A monomerre.
  38. 41, A 21. igénypont szerinti készítmény, amiben a készítmény össz-glikán tartalmának legalább 67%-a komplex típusú
  39. 42, A 21. igénypont szerinti készítmény, amiben átlagosan két komplex glikán jut egy alfa-galaktozidáz A monomerre.
  40. 43, .s alfa-galaktozidáz A készítmény előállítására, án tartalomnak több mint 50%-a komplex tí~ jellemezve, hogy az alá amiben, az ossz-g pusű glikán, azzal mázzuk;
    a) biztosítunk egy humán sejtet, amit g<
    tenyésztő a humán sejtből vagy a humán sej közegéből tisztítjuk az alfa-galaktozídáz
  41. 44, A 43, igénypont, szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a genetikailag módosított humán sejteket egy alfa-galaktozídáz A/emlős expresszíós vektor konstrukcióval transzfektáljuk.
  42. 45, A 43, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a genetikailag módosított humán sejtet egy olyan nukleínsavval transzfektáljuk, ami. az alfa-galaktozidáz A-t kódoló szekvencia expressziőját szabályozó elemet kódol « * ** ♦ * ♦ * » * 0 *
    137
  43. 46, Α 43. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a genetikailag módosított humán sejtek szekunder fibroblasztok.
  44. 47, A 43. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alfa-galaktozidáz A polipeptid tisztítási eljárása legalább egyet tartalmaz az alábbi csoportba tartozó tisztítási lépésekből: hídrofob kölcsönhatáson alapuló kromatográfia, ioncserés kromatográfia, méretkizárásos kromatográfia., kromatofökuszálási kromatográfia, fémkelát kromatográfia és aífeitáskromatográfia.
  45. 48, A 47. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alfa-galaktozidáz A polipeptid tisztítása magában foglalja még egy alfa-galaktozidáz A glikoforma frakcionálási lépését is.
  46. 49, Gyógyászati készítmény, ami olyan alfa-galaktozidáz A készítményt tartalmaz, amiben az össz-glíkán tartalomnak több mint 50%-a komplex-típusú glikán,
  47. 50, Az 1. igénypont, szerinti készítmény, amiben az osszglikán tartalomnak legalább 67%~a komplex típusú glikán,
  48. 51, Az 1. igénypont szerinti készítmény, amiben az alfagalaktozidáz A készítmény átlagosan két komplex glikánt tartalmaz egy alfa-galaktozidáz A monomerre számítva.
HU0200467A 1999-03-11 2000-03-09 Treatment of alpha-galactosidase a deficiency HU228743B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/266,014 US6458574B1 (en) 1996-09-12 1999-03-11 Treatment of a α-galactosidase a deficiency
PCT/US2000/006118 WO2000053730A2 (en) 1999-03-11 2000-03-09 Medical preparations for the treatment of alpha-galactosidase a deficiency

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0200467A2 HUP0200467A2 (en) 2002-06-29
HUP0200467A3 HUP0200467A3 (en) 2006-06-28
HU228743B1 true HU228743B1 (en) 2013-05-28

Family

ID=23012821

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0200467A HU228743B1 (en) 1999-03-11 2000-03-09 Treatment of alpha-galactosidase a deficiency

Country Status (22)

Country Link
US (4) US6458574B1 (hu)
EP (6) EP3231871A1 (hu)
JP (6) JP2002538183A (hu)
KR (2) KR100892334B1 (hu)
CN (4) CN106110309A (hu)
AT (1) ATE386808T1 (hu)
AU (1) AU3519400A (hu)
CA (3) CA3012663A1 (hu)
CY (3) CY1107951T1 (hu)
DE (1) DE60038104T2 (hu)
DK (3) DK2314699T3 (hu)
ES (3) ES2391221T3 (hu)
HK (3) HK1043386B (hu)
HU (1) HU228743B1 (hu)
IL (2) IL145381A0 (hu)
MX (1) MXPA01009222A (hu)
NO (2) NO329689B1 (hu)
NZ (1) NZ514077A (hu)
PL (1) PL210833B1 (hu)
PT (3) PT2314699T (hu)
RU (1) RU2248213C2 (hu)
WO (1) WO2000053730A2 (hu)

Families Citing this family (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6458574B1 (en) * 1996-09-12 2002-10-01 Transkaryotic Therapies, Inc. Treatment of a α-galactosidase a deficiency
US6083725A (en) * 1996-09-13 2000-07-04 Transkaryotic Therapies, Inc. Tranfected human cells expressing human α-galactosidase A protein
IL155588A0 (en) * 2003-04-27 2003-11-23 Metabogal Ltd Methods for expression of enzymatically active recombinant lysosomal enzymes in transgenic plant root cells and vectors used thereby
US20050032211A1 (en) * 1996-09-26 2005-02-10 Metabogal Ltd. Cell/tissue culturing device, system and method
JP4641705B2 (ja) * 2001-04-30 2011-03-02 ザイストール セラピューティクス， インコーポレイテッド 治療的タンパク質の亜細胞標的化
US7629309B2 (en) 2002-05-29 2009-12-08 Zystor Therapeutics, Inc. Targeted therapeutic proteins
US20040005309A1 (en) * 2002-05-29 2004-01-08 Symbiontics, Inc. Targeted therapeutic proteins
US7560424B2 (en) 2001-04-30 2009-07-14 Zystor Therapeutics, Inc. Targeted therapeutic proteins
US20030072761A1 (en) 2001-10-16 2003-04-17 Lebowitz Jonathan Methods and compositions for targeting proteins across the blood brain barrier
EP2361631A1 (en) * 2002-04-25 2011-08-31 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Treatment of alpha-galactosidase a deficiency
EP2857036B1 (en) 2003-01-31 2016-12-21 Mount Sinai School of Medicine of New York University Combination therapy for treating protein deficiency disorders
US7422310B2 (en) * 2003-04-25 2008-09-09 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Methods and apparatus for selecting image enhancement techniques
US7951557B2 (en) * 2003-04-27 2011-05-31 Protalix Ltd. Human lysosomal proteins from plant cell culture
US20100196345A1 (en) * 2003-04-27 2010-08-05 Protalix Production of high mannose proteins in plant culture
US7442372B2 (en) † 2003-08-29 2008-10-28 Biomarin Pharmaceutical Inc. Delivery of therapeutic compounds to the brain and other tissues
JP4914224B2 (ja) 2004-02-10 2012-04-11 バイオマリン ファーマシューティカル インコーポレイテッド 酸性αグルコシダーゼおよびそのフラグメント
US20050208090A1 (en) * 2004-03-18 2005-09-22 Medtronic, Inc. Methods and systems for treatment of neurological diseases of the central nervous system
EP1773401B1 (en) * 2004-06-21 2013-01-02 Medtronic, Inc. Medical systems and methods for delivering compositions to cells
CN1308444C (zh) * 2005-04-15 2007-04-04 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 基因重组α－半乳糖苷酶大批量发酵液的纯化方法
BRPI0612928A2 (pt) 2005-05-17 2010-12-07 Amicus Therapeutics Inc Método para aumentar a atividade de uma enzima de (alfa)-glucosidade em uma célula e método para tratar doença de pompe
ES2547726T3 (es) 2005-11-18 2015-10-08 Tokyo Metropolitan Institute Of Medical Science Nueva enzima altamente funcional que tiene especificidad de sustrato modificada
WO2007086067A1 (en) * 2006-01-30 2007-08-02 Diagnostic Technologies Ltd. Method for monitoring tocolytic treatment
CA2669347A1 (en) * 2006-11-13 2008-05-29 Zystor Therapeutics, Inc. Methods for treating pompe disease
AU2008246928B2 (en) * 2007-05-07 2014-04-17 Protalix Ltd. Large scale disposable bioreactor
WO2009032171A1 (en) * 2007-08-29 2009-03-12 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Subcutaneous administration of alpha-galatosidase a
EP3778652A1 (en) * 2008-05-07 2021-02-17 BioMarin Pharmaceutical Inc. Lysosomal targeting peptides and uses thereof
US9050276B2 (en) 2009-06-16 2015-06-09 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Autism-associated biomarkers and uses thereof
EP3075386B1 (en) 2009-06-17 2019-10-16 BioMarin Pharmaceutical Inc. Formulations for lysosomal enzymes
US9194011B2 (en) 2009-11-17 2015-11-24 Protalix Ltd. Stabilized alpha-galactosidase and uses thereof
ES2606532T3 (es) * 2010-03-02 2017-03-24 Protalix Ltd. Alfa-galactosidasa estabilizada y usos de la misma
WO2011133802A1 (en) * 2010-04-21 2011-10-27 Helix Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treatment of lysosomal storage disorders
ES2761692T5 (es) * 2010-07-08 2023-07-05 Takeda Pharmaceuticals Co Método de producción de vWF recombinante de alto peso molecular en cultivo celular
ES2564358T3 (es) 2010-10-15 2016-03-22 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Genes relacionados con la obesidad y sus proteínas y usos de los mismos
DK2635299T3 (da) 2010-11-02 2019-10-21 Univ Columbia Fremgangsmåder til behandling af hårtabsforstyrrelser
WO2012121041A1 (ja) 2011-03-04 2012-09-13 株式会社糖鎖工学研究所 シアル酸含有糖鎖の製造方法
CN103906527B (zh) 2011-06-08 2020-07-10 川斯勒佰尔公司 Mrna递送的脂质纳米颗粒组合物和方法
KR20230066482A (ko) 2012-03-07 2023-05-15 아미쿠스 세라퓨틱스, 인코포레이티드 폼페병의 치료를 위한 고농도 알파-글루코시다제 조성물
WO2013139861A1 (en) 2012-03-20 2013-09-26 Luc Montagnier Methods and pharmaceutical compositions of the treatment of autistic syndrome disorders
SI2830662T1 (sl) 2012-03-29 2019-01-31 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Postopki zdravljenja motenj izgube las
EP2874648A4 (en) 2012-07-17 2015-12-30 Amicus Therapeutics Inc CO-FORMULATION OF ALPHA-GALACTOSIDASE A AND 1-DEOXYGALACTONOJIRIMYCIN
US10155027B2 (en) 2012-07-17 2018-12-18 Amicus Therapeutics, Inc. Alpha-galactosidase A and 1-deoxygalactonojirimycin co-formulation for the treatment of fabry disease
WO2014016873A1 (en) 2012-07-26 2014-01-30 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Method for production of recombinant human alpha-galactosidase a
JP6226435B2 (ja) * 2012-07-26 2017-11-08 Ｊｃｒファーマ株式会社 組換えヒトα−ガラクトシダーゼＡの製造方法
WO2014120900A1 (en) * 2013-01-31 2014-08-07 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Enhanced therapeutic regimens for treating fabry disease
AU2014239264A1 (en) 2013-03-14 2015-08-27 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Quantitative assessment for cap efficiency of messenger RNA
CN105051213A (zh) 2013-03-14 2015-11-11 夏尔人类遗传性治疗公司 信使rna加帽效率的定量评估
TWI793159B (zh) 2013-10-23 2023-02-21 美商健臻公司 重組醣蛋白及其用途
US9682123B2 (en) 2013-12-20 2017-06-20 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods of treating metabolic disease
WO2015134696A1 (en) 2014-03-05 2015-09-11 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Sialylated glycoprotein compositions and uses thereof
KR102455814B1 (ko) 2014-09-30 2022-10-18 아미쿠스 세라퓨틱스, 인코포레이티드 개선된 탄수화물을 가지는 고도로 강력한 산성 알파-글루코시다제
EP3237604A2 (en) * 2014-12-22 2017-11-01 Genzyme Corporation Methods of culturing a mammalian cell
PT3237621T (pt) 2014-12-22 2023-07-20 Codexis Inc Variantes da alfa-galactosidase humana
WO2016116966A1 (en) * 2015-01-22 2016-07-28 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Method for purification of recombinant human alpha-galactosidase a from material containing contaminant host cell proteins
US9981021B1 (en) 2015-04-09 2018-05-29 Kinetiq, Inc. Subcutaneous therapeutic enzyme formulations, uses, and methods for generating thereof
GB201508025D0 (en) 2015-05-11 2015-06-24 Ucl Business Plc Fabry disease gene therapy
WO2017044807A2 (en) 2015-09-09 2017-03-16 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Reduction of er-mam-localized app-c99 and methods of treating alzheimer's disease
MX2018008185A (es) 2015-12-30 2018-08-28 Amicus Therapeutics Inc Alfa-glucosidasa con mayor cantidad de acido para el tratamiento de la enfermedad de pompe.
JP2019508037A (ja) 2016-02-16 2019-03-28 イェール ユニバーシティーＹａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ 標的化遺伝子編集を増強するための組成物およびその使用方法
WO2017173059A1 (en) 2016-03-30 2017-10-05 Amicus Therapeutics, Inc. Method for selection of high m6p recombinant proteins
AU2017239641A1 (en) 2016-03-30 2018-10-18 Amicus Therapeutics, Inc. Formulations comprising recombinant acid alpha-glucosidase
NL2017294B1 (en) 2016-08-05 2018-02-14 Univ Erasmus Med Ct Rotterdam Natural cryptic exon removal by pairs of antisense oligonucleotides.
WO2018071814A1 (en) 2016-10-14 2018-04-19 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods of treating alcohol abuse disorder
CN110022904B (zh) * 2016-10-20 2024-04-19 桑格摩生物治疗股份有限公司 用于治疗法布里病的方法和组合物
JP2020503900A (ja) * 2017-01-10 2020-02-06 アミカス セラピューティックス インコーポレイテッド ファブリー病の処置のための組換えアルファ−ガラクトシダーゼａ
EA202290114A1 (ru) * 2017-03-30 2022-03-29 Амикус Терапьютикс, Инк. Способ отбора рекомбинантных белков с высоким содержанием m6p
WO2020047282A1 (en) * 2018-08-29 2020-03-05 University Of Copenhagen Lysosomal enzymes modified by cell based glycoengineering
BR112021011750A2 (pt) 2018-12-20 2021-08-31 Codexis, Inc. Alfa-galactosidase a recombinante e/ou fragmento de alfa-galactosidase a recombinante, composição, sequência de polinucleotídeo recombinante, vetor de expressão, célula hospedeira, métodos para produzir uma variante de alfa-galactosidase a e para tratar e/ou prevenir os sintomas da doença de fabry, composição farmacêutica, e, uso das composições
WO2021005176A1 (en) 2019-07-09 2021-01-14 Genethon Treatment of glycogen storage disease (gsd)

Family Cites Families (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5322158B2 (hu) * 1974-05-02 1978-07-06
US4407957A (en) 1981-03-13 1983-10-04 Damon Corporation Reversible microencapsulation of a core material
DE3580384D1 (de) 1984-04-09 1990-12-13 Toyo Boseki Praeparat mit verzoegerter freigabe zum aufbringen auf die schleimhaeute der mundhoehle.
US4764376A (en) 1984-06-18 1988-08-16 Eli Lilly And Company Method of inhibiting aromatase
GB8530631D0 (en) * 1985-12-12 1986-01-22 Ciba Geigy Ag Thrombin inhibitors
US4764378A (en) 1986-02-10 1988-08-16 Zetachron, Inc. Buccal drug dosage form
US5272066A (en) * 1986-03-07 1993-12-21 Massachusetts Institute Of Technology Synthetic method for enhancing glycoprotein stability
EP0463109A4 (en) 1989-03-24 1992-11-19 Research Corporation Technologies, Inc. Recombinant alpha-galactosidase, a therapy for fabry disease
US5179023A (en) * 1989-03-24 1993-01-12 Research Corporation Technologies, Inc. Recombinant α-galactosidase a therapy for Fabry disease
KR0159107B1 (ko) * 1989-07-13 1998-11-16 쟝 르쌍드뢰 우레이트 산화효소 활성 단백질, 이 단백질을 암호화하는 재조합 유전자, 발현 벡터, 미생물 및 형질전환세포
JPH04502108A (ja) * 1989-09-05 1992-04-16 バイオテクノロジー　オーストラリア　ピーティーワイ　リミテッド 組替え生産物
US5697901A (en) * 1989-12-14 1997-12-16 Elof Eriksson Gene delivery by microneedle injection
US5661132A (en) * 1989-12-14 1997-08-26 Auragen, Inc. Wound healing
US5401650A (en) * 1990-10-24 1995-03-28 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Cloning and expression of biologically active α-galactosidase A
US5356804A (en) 1990-10-24 1994-10-18 Mount Sinai School Of Medicine Of The City Of New York Cloning and expression of biologically active human α-galactosidase A
ES2107537T3 (es) 1991-04-25 1997-12-01 Univ Brown Res Found Vehiculo inmunoaislante biocompatible implantable para suministrar productos terapeuticos seleccionados.
EP0592540B1 (en) 1991-07-02 2000-01-26 Inhale, Inc. Method and device for delivering aerosolized medicaments
US5750376A (en) 1991-07-08 1998-05-12 Neurospheres Holdings Ltd. In vitro growth and proliferation of genetically modified multipotent neural stem cells and their progeny
PT101031B (pt) 1991-11-05 2002-07-31 Transkaryotic Therapies Inc Processo para o fornecimento de proteinas por terapia genetica
US5968502A (en) 1991-11-05 1999-10-19 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US5858751A (en) 1992-03-09 1999-01-12 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for producing sialyltransferases
DE69312487T2 (de) 1992-05-18 1997-11-27 Minnesota Mining & Mfg Einrichtung zur transmucosalen wirkstoffabgabe
US5785049A (en) 1994-09-21 1998-07-28 Inhale Therapeutic Systems Method and apparatus for dispersion of dry powder medicaments
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5804413A (en) 1992-07-31 1998-09-08 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Herpes simplex virus strains for gene transfer
US5569189A (en) 1992-09-28 1996-10-29 Equidyne Systems, Inc. hypodermic jet injector
NZ257212A (en) 1992-09-29 1996-11-26 Inhale Therapeutic Syst Parathyroid hormone formulations comprising a biologically active n-terminal fragment of the hormone
US5389539A (en) 1992-11-30 1995-02-14 Massachusetts Institute Of Technology Purification of heparinase I, II, and III from Flavobacterium heparinum
US6329191B1 (en) 1993-08-30 2001-12-11 Hawaii Biotechnology Group, Inc. DNA encoding recombinant coffee bean alpha-galactosidase
EP0726964A4 (en) * 1993-09-23 1999-01-13 New England Biolabs Inc INSULATION AND COMPOSITION OF NEW GLYCOSIDASES
DE4339605A1 (de) 1993-11-20 1995-05-24 Beiersdorf Ag Desodorierende Wirkstoffkombinationen auf der Basis von alpha, omega-Alkandicarbonsäuren und Fettsäurepartialglyceriden
US5843015A (en) 1993-12-28 1998-12-01 Becton Dickinson And Company Molecules for iontophoretic delivery
US5789247A (en) 1994-04-01 1998-08-04 Ballay; Annick Expression in non-tumoral human lymphoblastoid lines with an integrative vector
FR2718357B1 (fr) 1994-04-06 1997-10-03 Defarges Alain Moreau Perfectionnements apportés à un dispositif d'injection par jet sans aiguille.
US5834251A (en) * 1994-12-30 1998-11-10 Alko Group Ltd. Methods of modifying carbohydrate moieties
US5599302A (en) 1995-01-09 1997-02-04 Medi-Ject Corporation Medical injection system and method, gas spring thereof and launching device using gas spring
WO1996023869A1 (en) * 1995-01-30 1996-08-08 New York Blood Center, Inc. RECOMBINANT α-GALACTOSIDASE ENZYME
US5780014A (en) 1995-04-14 1998-07-14 Inhale Therapeutic Systems Method and apparatus for pulmonary administration of dry powder alpha 1-antitrypsin
US5654007A (en) 1995-06-07 1997-08-05 Inhale Therapeutic Systems Methods and system for processing dispersible fine powders
US6566089B1 (en) * 1996-09-04 2003-05-20 Tularik Inc. Cell-based drug screens for regulators of gene expression
US6458574B1 (en) * 1996-09-12 2002-10-01 Transkaryotic Therapies, Inc. Treatment of a α-galactosidase a deficiency
US6083725A (en) * 1996-09-13 2000-07-04 Transkaryotic Therapies, Inc. Tranfected human cells expressing human α-galactosidase A protein
CN1268741C (zh) 1996-09-13 2006-08-09 超卡里奥迪克治疗学股份有限公司 半乳糖苷酶a缺乏症的治疗
IL125423A (en) * 1998-07-20 2004-08-31 Israel State Alkaline alpha-galactosidase having broad substrate specificity
US6749851B2 (en) * 2001-08-31 2004-06-15 Clearant, Inc. Methods for sterilizing preparations of digestive enzymes

Also Published As

Publication number Publication date
ATE386808T1 (de) 2008-03-15
CN101219213A (zh) 2008-07-16
HK1245320A1 (zh) 2018-08-24
JP2017014279A (ja) 2017-01-19
DE60038104D1 (de) 2008-04-03
JP2002538183A (ja) 2002-11-12
CN103585621A (zh) 2014-02-19
DE60038104T2 (de) 2009-02-12
ES2634317T3 (es) 2017-09-27
HK1043386A1 (en) 2002-09-13
EP2314699A1 (en) 2011-04-27
CA3012663A1 (en) 2000-09-14
JP6346236B2 (ja) 2018-06-20
CA2365923A1 (en) 2000-09-14
KR100892334B1 (ko) 2009-04-08
JP2011037867A (ja) 2011-02-24
PL210833B1 (pl) 2012-03-30
DK2186902T3 (da) 2012-09-03
NO329689B1 (no) 2010-11-29
PT2314699T (pt) 2017-08-01
NZ514077A (en) 2004-02-27
US20030077806A1 (en) 2003-04-24
US20030113894A1 (en) 2003-06-19
PT2186902E (pt) 2012-08-28
PT1163349E (pt) 2008-05-19
WO2000053730A2 (en) 2000-09-14
ES2300256T3 (es) 2008-06-16
PL350658A1 (en) 2003-01-27
MXPA01009222A (es) 2002-06-04
EP3231871A1 (en) 2017-10-18
CY1107951T1 (el) 2013-09-04
JP5899169B2 (ja) 2016-04-06
CN106110309A (zh) 2016-11-16
WO2000053730A3 (en) 2001-03-15
IL145381A0 (en) 2002-06-30
CA2833396C (en) 2018-08-28
CY1113051T1 (el) 2016-04-13
JP5615648B2 (ja) 2014-10-29
KR20070090277A (ko) 2007-09-05
EP2186902B1 (en) 2012-05-23
NO20101493L (no) 2001-11-12
EP2186902A2 (en) 2010-05-19
CN103585621B (zh) 2016-08-10
EP2186902A3 (en) 2010-09-01
HUP0200467A2 (en) 2002-06-29
JP6081980B2 (ja) 2017-02-15
CN1354796A (zh) 2002-06-19
JP6626071B2 (ja) 2019-12-25
DK1163349T3 (da) 2008-06-23
ES2391221T3 (es) 2012-11-22
CA2833396A1 (en) 2000-09-14
JP2013241466A (ja) 2013-12-05
CY1119369T1 (el) 2018-02-14
HK1043386B (zh) 2008-06-13
US20110280856A1 (en) 2011-11-17
NO20014415L (no) 2001-11-12
RU2248213C2 (ru) 2005-03-20
EP1820862A3 (en) 2007-10-31
CN100417727C (zh) 2008-09-10
WO2000053730A9 (en) 2001-10-11
HK1143833A1 (en) 2011-01-14
EP2314699B1 (en) 2017-05-31
NO20014415D0 (no) 2001-09-11
EP1163349A2 (en) 2001-12-19
HUP0200467A3 (en) 2006-06-28
US6458574B1 (en) 2002-10-01
KR20020021371A (ko) 2002-03-20
JP2015091834A (ja) 2015-05-14
EP2287319A1 (en) 2011-02-23
KR100961740B1 (ko) 2010-06-07
JP2018038423A (ja) 2018-03-15
IL145381A (en) 2009-12-24
EP1820862A2 (en) 2007-08-22
AU3519400A (en) 2000-09-28
DK2314699T3 (en) 2017-08-07
EP1163349B1 (en) 2008-02-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU228743B1 (en) Treatment of alpha-galactosidase a deficiency
AU2016250357B2 (en) Treatment of alpha-Galactosidase A deficiency
AU2004242550B2 (en) Treatment of alpha-Galactosidase A deficiency
AU2012241170B2 (en) Treatment of alpha-Galactosidase A deficiency
AU2008202567A1 (en) Treatment of alpha-Galactosidase A deficiency

Legal Events

Date Code Title Description
HC9A Change of name, address

Owner name: SHIRE HUMAN GENETIC THERAPIES, INC., US

Free format text: FORMER OWNER(S): TRANSKARYOTIC THERAPIES, INC., US