JP2019508037A - 標的化遺伝子編集を増強するための組成物およびその使用方法 - Google Patents

標的化遺伝子編集を増強するための組成物およびその使用方法 Download PDF

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Abstract

標的化遺伝子編集を増強するための組成物および方法ならびにその使用方法が開示される。最も好ましい実施形態では、遺伝子編集は、例えば、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮなどの遺伝子編集組成物を、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＣＨＫ１もしくはＡＴＲ阻害剤、またはその組合せなどの遺伝子改変増強剤と組み合わせて利用して実行される。特定の好ましい遺伝子編集組成物は、ＤＮＡ結合親和性の増加のためにγ位で置換されている三重鎖形成ペプチド核酸（ＰＮＡ）である。遺伝子編集組成物の細胞内送達のためのナノ粒子組成物も提供され、ｉｎ ｖｉｖｏ適用で使用するのに特に有利である。

Description

関連出願の引用
本願は、２０１６年２月１６日に出願され、その全体が参考として援用される米国出願第６２／２９５，７８９号の利益およびそれに対する優先権を主張する。
連邦政府による資金提供を受けた研究に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所により与えられたＡＩ１１２４４３の下および全米科学財団により与えられた１０１２４６７の下で政府の支援を受けて行われた。政府は本発明にある特定の権利を有する。
発明の分野
本発明の分野は一般的には、遺伝子改変増強剤と組み合わせて使用される遺伝子編集技術ならびにｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子編集のための組成物およびその使用方法に関する。
発明の背景
造血幹細胞／前駆体細胞（ＨＳＰＣ）での遺伝子編集は、鎌状赤血球貧血およびβ−サラセミアなどの遺伝性障害の処置のための魅力的な戦略を提供する。遺伝子は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）（Haendelら、Gene Ther.、１１巻：２８〜３７頁（２０１１年））およびＣＲＩＳＰＲ（Yinら、Nat. Biotechnol.、３２巻：５５１〜５５３頁（２０１４年））などの標的化ヌクレアーゼ、短い断片相同組換え（ＳＦＨＲ）（Gonczら、Oligonucleotides、１６巻：２１３〜２２４頁（２００６年））、または三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）（Vasquezら、Science、２９０巻：５３０〜５３３頁（２０００年））を含むいくつかの方法により選択的に編集することが可能である。その使用の容易さおよびたやすく得られる試薬設計のおかげで、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術に最近の関心が集中している（Doudnaら、Science、３４６巻：１２５８０９６（２０１４年））。しかし、ＺＦＮ同様、ＣＲＩＳＰＲアプローチは活性なヌクレアーゼを細胞内に導入し、これがゲノムでのオフターゲット切断をもたらすことがあり（Cradickら、Nucleic Acids Res.、４１巻：９５８４〜９５９２頁、（２０１３年））、これまで未解決の問題となっている。
１つの代案は、鎖侵入によりゲノムＤＮＡに部位特異的に結合するように設計された三重鎖形成ペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーおよびワトソンクリック結合とフーグスティーン結合の両方による置換されたＤＮＡ鎖とのＰＮＡ／ＤＮＡ／ＰＮＡ三重鎖形成である（Egholmら、Nature (London)、３６５巻：５６６〜５６８頁（１９９３年）； Nielsenら、Science (Washington、D.C.、１８８３年〜)、２５４巻：１４９７〜１５００頁（１９９１年）；Faruqiら、Proc Natl Acad Sci USA、９５巻：１３９８〜１４０３頁（１９９８年））。ＰＮＡは、電荷中性ペプチド様骨格ならびにＤＮＡおよびＲＮＡとの高親和性でのハイブリダイゼーションを可能にする核酸塩基を有する。ＰＮＡ／ＤＮＡ／ＰＮＡ三重鎖は、一本鎖「ドナーＤＮＡ」が所望の配列改変を含有する鋳型として共送達される（co-delivered）と、細胞の内因性ＤＮＡ修復系を動員してゲノムの部位特異的改変を開始する（Rogersら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、９９巻：１６６９５〜１６７００頁（２００２年））。
ＰＮＡ誘導ゲノム改変は、ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）および相同性依存修復（ＨＤＲ）経路により、一部媒介されると考えられている（Rogersら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、９９巻：１６６９５〜１６７００頁（２００２年）；Chinら、 Molecular Carcinogenesis、４８巻：３８９〜３９９頁（２００９年））。ＮＥＲとＨＤＲの両方は高忠実性経路であり、ＰＮＡはいかなる固有のヌクレアーゼ活性も欠く。まとめるとこれらの特長は、ヌクレアーゼベースのアプローチと比較して、ＰＮＡ媒介遺伝子編集で見られるオフターゲット遺伝毒性の頻度が非常に低いことを説明することができる（McNeerら、Gene Therapy、２０巻：６５８〜６６９頁（２０１３年）；Schleifmanら、Chem. Biol. (Cambridge、MA、U.S.)、１８巻：１１８９〜１１９８頁（２０１１年）；Schleifmanら、Mol. Ther.--Nucleic Acids、２巻：ｅ１３５頁（２０１３年））。伸長されたワトソンクリック結合ドメインを有するテールクランプＰＮＡ（ｔｃＰＮＡ）は、ヒト造血細胞での遺伝子編集を、高い効率性と特異性で増強することが可能であり（Schleifmanら、Chem. Biol. (Cambridge、MA、U.S.)、１８巻：１１８９〜１１９８頁（２０１１年））、ポリマーナノ粒子（ＮＰ）はヒト化マウスモデルにおいてｅｘ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｖｏでもこれらの分子をヒトＨＳＰＣ中に効果的に送達することが可能である（McNeerら、Gene Therapy、２０巻：６５８〜６６９頁（２０１３年）；Bahalら、Curr. Gene Ther.、１４巻：３３１〜３４２頁（２０１４年））。
それでもなお、改良された遺伝子編集のための組成物および方法が必要とされる。
遺伝子編集技術により誘導されるかまたは増強される遺伝子改変を増加させる増強剤を提供するのが本発明の目的である。
増強されたＤＮＡ結合を有する三重鎖形成分子を提供するのが本発明の別の目的である。
オフターゲット改変が低減された、治療上有意な標的部位改変を達成する遺伝子改変製剤を提供するのが本発明のさらなる目的である。
Haendelら、Gene Ther.、１１巻：２８〜３７頁（２０１１年） Yinら、Nat. Biotechnol.、３２巻：５５１〜５５３頁（２０１４年） Gonczら、Oligonucleotides、１６巻：２１３〜２２４頁（２００６年） Vasquezら、Science、２９０巻：５３０〜５３３頁（２０００年） Doudnaら、Science、３４６巻：１２５８０９６（２０１４年） Cradickら、Nucleic Acids Res.、４１巻：９５８４〜９５９２頁、（２０１３年） Egholmら、Nature (London)、３６５巻：５６６〜５６８頁（１９９３年） Nielsenら、Science (Washington、D.C.、１８８３年〜)、２５４巻：１４９７〜１５００頁（１９９１年） Faruqiら、Proc Natl Acad Sci USA、９５巻：１３９８〜１４０３頁（１９９８年） Rogersら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、９９巻：１６６９５〜１６７００頁（２００２年） Chinら、 Molecular Carcinogenesis、４８巻：３８９〜３９９頁（２００９年） McNeerら、Gene Therapy、２０巻：６５８〜６６９頁（２０１３年） Schleifmanら、Chem. Biol. (Cambridge、MA、U.S.)、１８巻：１１８９〜１１９８頁（２０１１年） Schleifmanら、Mol. Ther.--Nucleic Acids、２巻：ｅ１３５頁（２０１３年） McNeerら、Gene Therapy、２０巻：６５８〜６６９頁（２０１３年） Bahalら、Curr. Gene Ther.、１４巻：３３１〜３４２頁（２０１４年）
造血幹細胞／前駆体細胞における高度に上昇したレベルの遺伝子編集は、ＤＮＡ結合親和性の増加のためγ位で置換されている三重鎖形成ペプチド核酸（ＰＮＡ）を、幹細胞因子（stem cell factor）（ＳＣＦ）／ｃ−Ｋｉｔ経路の刺激と組み合わせて使用して達成される。ＳＣＦ／ｃ−Ｋｉｔ経路はＤＮＡ修復遺伝子発現をブーストすると考えられており、証拠としての相同性依存修復活性は、刺激がＤＮＡ修復の上昇と、特にＨＤＲ活性の増加ならびにＢＲＣＡ２およびＲａｄ５１を含むＨＤＲ遺伝子発現レベルの増加と相関していることを示している。ヒトβサラセミアのマウスモデルでは、ＳＣＦプラスγＰＮＡおよびドナーＤＮＡを含有するナノ粒子の注射により、臨床的に関連するβグロビン遺伝子修正頻度（骨髄では４％）および極端に低いオフターゲット効果を伴う、疾患表現型の回復をもたらした。マウスは、貧血症の軽減を示し、血液ヘモグロビンレベルは正常範囲へと持続的に上昇し、網状赤血球数が低減し、脾腫が逆転した。
標的化遺伝子編集を増強するための組成物および方法ならびにその使用方法が開示される。最も好ましい実施形態では、遺伝子編集は、例えば、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮなどの遺伝子編集組成物を、ＳＣＦ、ＣＨＫ１もしくはＡＴＲ阻害剤、ＤＮＡポリメラーゼアルファ阻害剤、熱ショックタンパク質９０阻害剤（ＨＳＰ９０ｉ）またはその組合せなどの遺伝子改変増強剤と組み合わせて利用して実行される。特に好ましい遺伝子編集組成物はＤＮＡ結合親和性の増加のためにγ位で置換されている三重鎖形成ペプチド核酸（ＰＮＡ）である。遺伝子編集組成物の細胞内送達のためのナノ粒子組成物も提供され、ｉｎ ｖｉｖｏ適用で使用するのに特に有利である。
例えば、細胞のゲノムを改変する例示的な方法は、有効量の、（ｉ）チロシンキナーゼＣ−ｋｉｔリガンド、ＡＴＲ−Ｃｈｋ１細胞周期チェックポイント経路阻害剤、ＤＮＡポリメラーゼアルファ阻害剤、および熱ショックタンパク質９０阻害剤（ＨＳＰ９０ｉ）からなる群から選択される遺伝子編集増強剤、ならびに（ｉｉ）三重鎖形成分子、偽相補的（pseudocomplementary）オリゴヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲ系、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）からなる群から選択される細胞のゲノム改変を誘導することが可能な遺伝子編集技術に細胞を接触させることを含むことが可能であり、ゲノム改変は、（ｉ）の非存在下で（ｉｉ）に接触させた同等の集団においてよりも（then in an equivalent population）、（ｉ）と（ｉｉ）の両方に接触させた細胞の集団においてより高い頻度で起こる。方法は、例えば、遺伝子編集技術により誘導または増強されるドナーの挿入または組換えにより細胞のゲノム中で変異（複数可）を修正するかまたは誘導する配列を含むドナーオリゴヌクレオチドに細胞を接触させることをさらに含むことが可能である。
好ましいＣ−ｋｉｔリガンドは、Ｃ−ｋｉｔの二量体化を引き起こしそのチロシンキナーゼ活性を活性化するのに十分な幹細胞因子タンパク質またはその断片である。一部の実施形態では、Ｃ−ｋｉｔリガンドはＣ−ｋｉｔの二量体化を引き起こしそのチロシンキナーゼ活性を活性化するのに十分な幹細胞因子タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡまたは発現ベクターなどの核酸である。
ＡＴＲ−Ｃｈｋ１細胞周期チェックポイント経路阻害剤は典型的には小分子であるが、経路中の遺伝子を標的とし、その発現を低減するｓｉＲＮＡなどの阻害性核酸でもありうる。阻害剤としては、例えば、ＡＺＤ７７６２、ＳＣＨ９００７７６／ＭＫ−８７７６、ＩＣ８３／ＬＹ２６０３６１８、ＬＹ２６０６３６８、ＧＤＣ−０４２５、ＰＦ−００４７７７３６、ＸＬ８４４、ＣＥＰ−３８９１、ＳＡＲ−０２０１０６、ＣＣＴ−２４４７４７、Ａｒｒｙ−５７５、ＳＢ２１８０７５、シサンドリンＢ、ＮＵ６０２７、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＶＥ−８２１、ＶＥ−８２２（ＶＸ−９７０）、ＡＺ２０、ＡＺＤ６７３８、ＭＩＲＩＮ、ＫＵ５５９３、ＶＥ−８２１、ＮＵ７４４１、ＬＣＡおよびＬ１８９が挙げられる。
一部の実施形態では、細胞のゲノムは、疾患または障害、例えば、血友病、グロビン異常症（globinopathy）、嚢胞性線維症、色素性乾皮症、筋ジストロフィー、およびリソソーム蓄積症などの遺伝性障害の根底にある変異を有する。グロビン異常症は鎌状赤血球貧血またはベータサラセミアでありうる。リソソーム蓄積症はゴーシェ病、ファブリー病、またはハーラー症候群でありうる。一部の実施形態では、方法は、例えば、ＨＩＶの細胞内への侵入を促進する細胞表面受容体の活性を低減することによりＨＩＶ感染を低減する変異を誘導する。
組成物を細胞に接触させることは、ｅｘ ｖｉｖｏで起こりうる。一部の実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏ処理細胞は造血幹細胞である。改変された細胞を、血友病、グロビン異常症、嚢胞性線維症、色素性乾皮症、筋ジストロフィー、リソソーム蓄積症、またはＨＩＶなどの疾患または障害の１つまたは複数の症状を処置するのに有効な量で、それを必要とする被験体に投与することが可能である。
ｉｎ ｖｉｖｏ適用も提供される。例えば、一部の実施形態では、増強剤、遺伝子編集技術および任意選択でドナーオリゴヌクレオチドがそれを必要とする被験体に投与される。前述のそれぞれが同じまたは異なる医薬組成物中に存在することが可能であり、いかなる順番で被験体に投与されてもよい。好ましい実施形態では、組成物は、被験体において、疾患または障害、例えば、血友病、グロビン異常症、色素性乾皮症、リソソーム蓄積症、またはＨＩＶの１つまたは複数の症状を低減するのに効果的な量で、ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子改変を誘導するかまたは増強する。
増強剤、遺伝子編集技術および／またはドナーオリゴヌクレオチドを含む、任意の開示されている組成物をナノ粒子に一緒にまたは別々にパッケージすることが可能である。好ましい実施形態では、ナノ粒子はポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）を単独でまたはポリ（ベータアミノ）エステル（ＰＢＡＥ）とブレンドして含む。特定の実施形態では、ナノ粒子は約１０から約２０パーセントの間のＰＢＡＥ（ｗｔ％）を有するＰＬＧＡとＰＢＡＥのブレンドを含む。好ましい実施形態では、ナノ粒子は二重エマルジョンにより調製される。一部の実施形態では、遺伝子編集技術、ドナーオリゴヌクレオチドまたはその組合せは、ナノ粒子の調製に先立ってポリカチオンと複合体化される。
標的化部分、細胞浸透性ペプチド、またはその組合せなどの機能的分子は、増強剤、遺伝子編集技術、ナノ粒子、またはその組合せと直接的にまたは間接的に、会合させる、連結させる、コンジュゲートさせる、またはその他の方法で結合させることが可能である。特定の好ましい実施形態では、配列ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳ ＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１２）（ＭＰＧ（合成キメラ：ＳＶ４０ＬｇＴ．Ａｎｔ．＋ＨＩＶ ｇｂ４１コート）を含む細胞浸透性ペプチドはナノ粒子の表面にコンジュゲートされている。
改良されたＤＮＡ結合三重鎖形成分子も提供される。三重鎖形成分子は、増強剤を用いる方法も増強剤を用いない方法も含む遺伝子改変のあらゆる様式で利用することが可能である。三重鎖形成組成物は典型的には、フーグスティーン結合ペプチド核酸（ＰＮＡ）セグメントおよびワトソンクリック結合ＰＮＡセグメントを合わせて合計約５０核酸塩基以下の長さで含み、２つのセグメントは、細胞のゲノム中のポリプリンストレッチを有する標的領域に結合またはハイブリダイズして、鎖侵入、置換、および２つのＰＮＡセグメントとポリプリンストレッチの間での三本鎖分子の形成を誘導することが可能である。フーグスティーン結合セグメントは少なくとも５核酸塩基の長さのフーグスティーン結合により標的二重鎖に結合し、ワトソンクリック結合セグメントは典型的には最小の５核酸塩基の長さのワトソンクリック結合により標的二重鎖に結合する。
好ましい実施形態では、ＰＮＡモノマーのうちの１つまたは複数はγＰＮＡである。γＰＮＡモノマー（複数可）のγ位の側鎖は、例えば、アラニン、セリン、スレオニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、アルギニン、およびその誘導体からなる群から選択されるアミノ酸の側鎖でありうる。一部の実施形態では、γＰＮＡモノマー（複数可）のγ位の側鎖は、ジエチレングリコール（「ミニＰＥＧ」）である。一部の実施形態では、フーグスティーン結合部分のみのペプチド核酸モノマーのすべて、ワトソンクリック結合部分のみのペプチド核酸モノマーのすべて、またはＰＮＡオリゴマーのペプチド核酸モノマー（peptide nucleic monomer）のすべてはγＰＮＡモノマーである。一部の実施形態では、フーグスティーン結合部分のみの、ワトソンクリック結合部分のみの、またはＰＮＡ全体にわたる交互残基はＰＮＡおよびγＰＮＡである。特異的で例示的な配列は下に提供されている。
一部の実施形態では、シトシンのうちの１つまたは複数はクランプ−Ｇ（９−（２−グアニジノエトキシ）フェノキサジン）で置き換えられている。好ましい実施形態では、フーグスティーン結合セグメントは、シュードシトシン、シュードイソシトシン、および５−メチルシトシンからなる群から選択される１つまたは複数の化学修飾されたシトシンを含む。ワトソンクリック結合セグメントは、好ましくは、三重鎖の外側でワトソンクリック結合により標的二重鎖に結合する最長１５個の核酸塩基のテール配列を含む。好ましい実施形態では、２つのセグメントは、例えば、１から１０ユニットの間の８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸のリンカーにより連結されている。
図１Ａは、三重鎖形成テールクランプＰＮＡ（ｔｃＰＮＡ）およびドナーＤＮＡを使用して、β−グロビン／ＧＦＰトランスジェニックマウス中のβ−グロビン遺伝子ＩＶＳ２−６５４（Ｃ→Ｔ）変異の標的化修正（targeted correction）のための戦略を示す模式図である。 図１Ｂは、サラセミア関連変異ＩＶＳ２−６５４（Ｃ→Ｔ）近傍のヒトβ−グロビン遺伝子のイントロン２内のホモプリン領域に結合するように設計されたｔｃＰＮＡおよびγｔｃＰＮＡオリゴマー（それぞれ配列番号３３〜３５、１６２および１５８）、ならびにスクランブル化対照配列（配列番号１５８）を示す図である。 図１Ｃは、ＤＮＡ、未修飾ＰＮＡおよびミニＰＥＧガンマＰＮＡ（ＭＰγＰＮＡ）単位の化学構造である。図１Ｄは、ブランクＮＰおよび、ドナーＤＮＡ（配列番号６５）を含有するＮＰ単独、またはｔｃＰＮＡ３（配列番号３５）、ｔｃＰＮＡ２（配列番号３４）もしくはｔｃＰＮＡ１（配列番号３３）との組合せを用いてｅｘ ｖｉｖｏで処理されたマウス骨髄細胞中の、β−グロビン／ＧＦＰ融合遺伝子内のＩＶＳ２−６５４（Ｃ→Ｔ）変異の遺伝子修正を示す棒グラフである。マウス骨髄細胞での％ＧＦＰ＋細胞は、フローサイトメトリーによって決定され、良好な遺伝子編集を示している。データは、平均±ｓ．ｅ．、ｎ＝３として示され；統計解析はスチューデントのｔ検定を用いて実施された、アスタリスク、ｐ＜０．０５。 図１Ｅは、３７℃、ＰＢＳ中でのインキュベーションの間のＰＬＧＡナノ粒子からの全核酸（ドナーＤＮＡ（配列番号６５）との組合せでのＰＮＡ：γｔｃＰＮＡ４（配列番号１６２）、ｔｃＰＮＡ１（配列番号３３）、ｔｃＰＮＡ２（配列番号３４）、ｔｃＰＮＡ３（配列番号３５）もしくはγｔｃＰＮＡ４−Ｓｃｒ（配列番号１５８）；またはＤＮＡドナー（配列番号６５）単独）の放出を示す線グラフである。６４時間で、ＮＰペレット中の残存核酸は抽出され、全核酸ロードはペレットおよび上清から得られた吸光度の合計として算出された。図１Ｆは、ｔｃＰＮＡ１（配列番号３３）、γｔｃＰＮＡ４（配列番号１６２）またはγｔｃＰＮＡ４−Ｓｃｒ（配列番号１５８）に加えてドナーＤＮＡ（配列番号６５）を含有するＰＬＧＡ ＮＰを用いたｅｘ ｖｉｖｏでの処理後のマウス骨髄細胞（β−グロビン／ＧＦＰトランスジェニックマウス由来）内でフローサイトメトリーによって決定された％ＧＦＰ＋細胞を示す棒グラフである。反復および統計は上の図１Ｄと同様。 図１Ｇは、ブランクＮＰまたはγｔｃＰＮＡ４（配列番号１６２）およびドナーＤＮＡ（配列番号６５）を含有するＮＰのいずれかを用いて処理され、顆粒球／マクロファージコロニー（ＣＦＵ−Ｇ、ＣＦＵ−ＭおよびＣＦＵ−ＧＭ）または混合コロニー（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ、顆粒球、赤血球系、単球／マクロファージ、巨核球の成長のために選択されたサイトカインを含むメチルセルロース培地でのコロニー形成細胞アッセイのために蒔かれたマウス全骨髄細胞を示す棒グラフである。蒔かれた細胞３００，０００個当たりの各種類のコロニーの数が示されている。データは、平均±ｓ．ｄ．、ｎ＝３として示されている。図１Ｈは、ＮＰ処理骨髄細胞におけるＤＮＡ切断を測定するコメットアッセイの結果を示す棒グラフである。細胞は、表示の通りｔｃＰＮＡ１／ドナーＤＮＡ（配列番号３３および６５）、γｔｃＰＮＡ４／ドナーＤＮＡ（配列番号１６２および６５）またはブレオマイシン／ドナーＤＮＡ（配列番号６５）のいずれかを含有するＮＰを用いて処理された。ＤＮＡテールモーメントは、切断の程度の測定値を提供する。データは、平均±ｓ．ｅ．、ｎ＝３として示されている。
図２Ａは、選択された造血細胞表面マーカーに基づいた、処理されたマウス骨髄細胞における％ＧＦＰ発現を示す棒グラフである。全骨髄は、ｔｃＰＮＡ１／ドナーＤＮＡ（配列番号３３および６５）またはγｔｃＰＮＡ４／ドナーＤＮＡ（配列番号１６２および６５）のいずれかを含有するＮＰを用いて処理され、次いで細胞は表示のマーカーに対して特異的な抗体を使用して染色され、フローサイトメトリーによってマーカーおよびＧＦＰ発現についてアッセイされた。データは、平均±ｓ．ｅ．、ｎ＝３として示され；統計解析はスチューデントのｔ検定を用いて実施された、アスタリスク、ｐ＜０．０５。図２Ｂは、γｔｃＰＮＡおよびドナーＤＮＡ（配列番号１６２および６５）を保有するＮＰによるｅｘ ｖｉｖｏでの処理後の、ブランクＮＰによるｅｘ ｖｉｖｏでの処理後に対する％ＧＦＰ発現ＣＤ１１７（ｃ−Ｋｉｔ＋）細胞を示す棒グラフである。データは、平均±ｓ．ｅ．、ｎ＝３として示され；統計解析はスチューデントのｔ検定を用いて実施された、アスタリスク、ｐ＜０．０５。図２Ｃは、ｃ−Ｋｉｔリガンド、ＳＣＦを用いる前処理ありまたは無しで、γｔｃＰＮＡ４／ドナーＤＮＡ（配列番号１６２および６５）を含有するＮＰを用いたｅｘ ｖｉｖｏでの処理後のβ−グロビン／ＧＦＰトランスジェニックマウス由来の％ＧＦＰ発現ＣＤ１１７＋細胞を示す棒グラフである。データは、平均±ｓ．ｅ．、ｎ＝３として示され；統計解析はスチューデントのｔ検定を用いて実施された、アスタリスク、ｐ＜０．０５。 図２Ｄは、選択されたｃ−Ｋｉｔ経路キナーゼ阻害剤：ダサチニブ（ｃ−Ｋｉｔを阻害）、ＭＥＫ１６２（マイトジェン／細胞外シグナル調節キナーゼ、ＭＥＫを阻害）およびＢＫＭ１２０（ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ、ＰＩ３Ｋを阻害）の存在または非存在下でγｔｃＰＮＡ４／ドナーＤＮＡ（配列番号１６２および６５）を含有するＮＰを用いるｅｘ ｖｉｖｏでの処理後にβ−グロビン／ＧＦＰトランスジェニックマウスから単離された％ＧＦＰ発現ＣＤ１１７＋細胞を示す棒グラフである。データは、平均±ｓ．ｅ．、ｎ＝３として示され；統計解析はスチューデントのｔ検定を用いて実施された、アスタリスク、ｐ＜０．０５。図２Ｅおよび２Ｆは、ＣＤ１１７−およびＣＤ１１７＋細胞におけるＢＲＣＡ２（２Ｅ）およびＲａｄ５１（２Ｉ）のｍＲＮＡ発現レベルのｑＰＣＲ測定を示す棒グラフである。 図２Ｇは、ＳＣＦでの処理ありまたは無しでの、ＣＤ１１７＋細胞におけるＤＮＡ修復経路に関与する上方調節された遺伝子を示すヒートマップであり；列はユークリッド距離尺度によってクラスター化されている。図２Ｈは、選択されたｃ−Ｋｉｔ経路キナーゼ阻害剤：ダサチニブ（ｃ−Ｋｉｔを阻害）、ＭＥＫ１６２（マイトジェン／細胞外シグナル調節キナーゼ、ＭＥＫを阻害）およびＢＫＭ１２０（ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ、ＰＩ３Ｋを阻害）の存在または非存在下での相同性依存修復（ＨＤＲ）活性についての遺伝子アッセイの結果を示す棒グラフである。挿入図は、相同性依存修復（ＨＤＲ）によるヌクレアーゼ誘導二重鎖切断の修復についてのルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイの図を示している。ルシフェラーゼ発現は、相同組換え後にだけ生じ、ＤＳＢ損傷プラスミドの％再活性化としてスコア化され、トランスフェクション対照に対して正規化される。 図２Ｉは、ＳＣＦの添加を伴うまたは伴わないＣＤ１１７＋細胞におけるＨＤＲアッセイの結果を示す棒グラフである。データは、平均±ｓ．ｅ．、ｎ＝３として示され；統計解析はスチューデントのｔ検定を用いて実施された、アスタリスク、ｐ＜０．０５。図２Ｊは、アッセイの検証として、相同性依存修復因子ＢＲＣＡ２の能力を有するまたは欠損しているＤＬＤ−１細胞におけるＨＤＲアッセイの結果を示す棒グラフである。データは、平均±ｓ．ｅ．、ｎ＝３として示され；統計解析はスチューデントのｔ検定を用いて実施された、アスタリスク、ｐ＜０．０５。
図３Ａおよび３Ｂは、１５．６μｇのＳＣＦ ｉ．ｐ．を注射されて、またはされずに（表示の通り）４ｍｇのＮＰの静脈内注射の単回処置が続いた、β−グロビン／ＧＦＰトランスジェニックマウス（１群当たりマウス６匹）由来の骨髄細胞（３Ａ）および脾臓細胞（３Ｂ）における遺伝子編集（ＧＦＰ発現）の頻度を示すドットプロットである。各群は、ブランクＮＰまたはγｔｃＰＮＡ４およびドナーＤＮＡ（配列番号１６２および６５）を含有するＮＰのいずれかを、ＳＣＦを伴ってまたは伴わずに受け、２日後に採取および分析された。各データ点は、１匹のマウス由来の細胞の分析を表している。統計解析はスチューデントのｔ検定を使用して実施された：アスタリスク、ｐ＜０．０５。 図３Ａおよび３Ｂは、１５．６μｇのＳＣＦ ｉ．ｐ．を注射されて、またはされずに（表示の通り）４ｍｇのＮＰの静脈内注射の単回処置が続いた、β−グロビン／ＧＦＰトランスジェニックマウス（１群当たりマウス６匹）由来の骨髄細胞（３Ａ）および脾臓細胞（３Ｂ）における遺伝子編集（ＧＦＰ発現）の頻度を示すドットプロットである。各群は、ブランクＮＰまたはγｔｃＰＮＡ４およびドナーＤＮＡ（配列番号１６２および６５）を含有するＮＰのいずれかを、ＳＣＦを伴ってまたは伴わずに受け、２日後に採取および分析された。各データ点は、１匹のマウス由来の細胞の分析を表している。統計解析はスチューデントのｔ検定を使用して実施された：アスタリスク、ｐ＜０．０５。図３Ｃは、図３Ａおよび３Ｂについて記載された通り処置されたβ−グロビン／ＧＦＰマウスの骨髄および脾臓由来のＣＤ１１７＋細胞におけるｉｎ ｖｉｖｏでの標的化遺伝子編集の頻度（％改変頻度ＩＶＳ２−６５４（Ｔ→Ｃ））を定量するためのディープシークエンシング分析の結果を示す棒グラフである。エラーバーは割合の標準誤差を示している。
図４Ａ〜４Ｃは、処置後の表示の時点で実施した、ブランクＮＰ、ＳＣＦに加えてスクランブル化γｔｃＰＮＡ４−Ｓｃｒ／ドナーＤＮＡ（配列番号１５８および６５）ＮＰを用いて、またはＳＣＦに加えてγｔｃＰＮＡ４／ドナーＤＮＡ（配列番号１６２および６５）ＮＰを用いて処置されたサラセミアマウスの血中ヘモグロビンレベル（ｇ／ｄｌ）を示す線グラフである。各線は、経時的に追跡した個々のマウスを表している。 図４Ｄは、処置後０日目および３６日目にブランクＮＰまたはγｔｃＰＮＡ４／ドナーＤＮＡ（配列番号１６２および６５）を含有するＮＰに加えてＳＣＦ、のいずれかを用いて処置されたサラセミアマウス由来の血液スメアにおいて算出された網状赤血球数（全ＲＢＣの％）を示す棒グラフである。図４Ｅは、ブランクＮＰまたはγｔｃＰＮＡ４／ドナーＤＮＡ（配列番号１６２および６５）を含有するＮＰに加えてＳＣＦ、のいずれかを用いたサラセミアマウスの処置後の骨髄細胞由来のゲノムＤＮＡのディープシークエンシング分析によって決定された％遺伝子改変（Ｔ→Ｃ）を示す棒グラフである。
図５Ａは、ＧＦＰ／ベータグロビン遺伝子修正アッセイを例示するフロー図である。 図５Ｂは、ｔｃＰＮＡ１（配列番号１９１）およびドナーＤＮＡ（配列番号６５）を含有するナノ粒子単独、または毛細血管拡張性運動失調症およびＲａｄ３関連タンパク質（ＡＴＲ）経路阻害剤（ＭＩＲＩＮ、ＫＵ５５９３、ＶＥ−８２１、ＮＵ７４４１、ＬＣＡまたはＬ１８９）との組合せを用いて処理された細胞の遺伝子修正を示す棒グラフである。図５Ｃは、ｔｃＰＮＡ１（配列番号１９１）およびドナーＤＮＡ（配列番号６５）を含有するナノ粒子単独、またはチェックポイントキナーゼ１阻害剤（Ｃｈｋ１ｉ）（ＳＢ２１８０７５）、ＤＮＡポリメラーゼアルファ阻害剤（Ａｐｈｉ）（アフィディコリン）またはポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰｉ）（ＡＺＤ−２２８１（オラパリブ））との組合せを用いて処理された細胞の遺伝子修正を示す棒グラフである。 図５Ｄは、対照（ブランク）、ならびにｔｃＰＮＡ１（配列番号１９１）およびドナーＤＮＡ（配列番号７６）を含有するナノ粒子単独、または熱ショックタンパク質９０阻害剤（ＨＳＰ９０ｉ）（ＳＴＡ−９０９０（ガネテスピブ））との組合せを用いて処理された細胞の遺伝子修正を示す棒グラフである。
図６Ａは、ＡＴＧ転写開始部位および例示的ｔｃＰＮＡと比較したヒトベータグロビン遺伝子中の鎌状赤血球症変異（ＧＡＧ→ＧＴＧ）の図である。図６Ｂは、例示的ＰＮＡの配列を示している：ｔｃＰＮＡ１：ｌｙｓ−ｌｙｓ−ｌｙｓ−ＪＪＴＪＴＴＪ−ＯＯＯ−ＣＴＴＣＴＣＣＡＡＡＧＧＡＧＴ−ｌｙｓ−ｌｙｓ−ｌｙｓ（配列番号６６）；ｔｃＰＮＡ２：ｌｙｓ−ｌｙｓ−ｌｙｓ−ＴＴＪＪＴＪＴ−ＯＯＯ−ＴＣＴＣＣＴＴＡＡＡＣＣＴＧＴ−ｌｙｓ−ｌｙｓ−ｌｙｓ（配列番号６７）；およびｔｃＰＮＡ３：ｌｙｓ−ｌｙｓ−ｌｙｓ−ＴＪＴＪＴＴＪＴ−ＯＯＯ−ＴＣＴＴＣＴＣＴＧＴＣＴＣＣＡＣ−ｌｙｓ−ｌｙｓ−ｌｙｓ（配列番号６８）。図６Ｃは、ＤＮＡドナー（配列番号６４）の配列を示している。
図７Ａは、陰性対照ＣＦＢＥ細胞；ブランクナノ粒子、ＰＮＡ２：ｌｙｓ−ｌｙｓ−ｌｙｓ−ＴＪＴＪＪＴＴＴ−ＯＯＯ−ＴＴＴＣＣＴＣＴＡＴＧＧＧＴＡＡＧ−ｌｙｓ−ｌｙｓ−ｌｙｓ（配列番号９３）ロードナノ粒子、ＭＰＧペプチドを含むＰＮＡ２（配列番号９３）ロードナノ粒子、
を用いて処理されたＣＦＢＥ細胞；ならびに未処理陽性対照野生型１６ＨＢＥ１４ｏ−細胞について塩化物フラックスを測定するＭＱＡＥ（Ｎ−（エトキシカルボニルメチル）−６−メトキシキノリニウムブロミド）アッセイ（デルタ（ＡＦＵ）／（デルタ（時間（秒））の結果を示す棒グラフである。図７Ｂは、ｉｎ ｖｉｖｏでの塩化物電位差を検出するために使用される非侵襲性アッセイを使用して測定された鼻電位差（ＮＰＤ）（処置前、γＰＮＡ２（配列番号６９）ロードナノ粒子を用いた処理後、およびブランクナノ粒子を用いた処理後）を示すドットプロットである。
図８Ａは、３つの例示的ｔｃＰＮＡと比較したＣＦＴＲ遺伝子（Ｗ１２８２Ｘ）中の変異（Ｇ→Ａ）の図である。図８ＢはｔｃＰＮＡの配列を提供している：ＣＦ−１２３６ ｌｙｓ−ｌｙｓ−ｌｙｓ−ＪＴＴＪＪＴＪＴＴＴ−ＯＯＯ−ＴＴＴＣＴＣＣＴＴＣＡＧＴＧＴＴＣＡ−ｌｙｓ−ｌｙｓ−ｌｙｓ（配列番号１６９）、ＣＦ−１３１４ ｌｙｓ−ｌｙｓ−ｌｙｓ−ＴＴＴＴＪＪＴ−ＯＯＯ−ＴＣＣＴＴＴＴＧＣＴＣＡＣＣＴＧＴＧＧＴ−ｌｙｓ−ｌｙｓ−ｌｙｓ（配列番号１７０）、およびＣＦ−１３２９：ｌｙｓ−ｌｙｓ−ｌｙｓ−ＴＪＴＴＴＴＴＴＪＪ−ＯＯＯ−ＣＣＴＴＴＴＴＴＣＴＧＧＣＴＡＡＧＴ−ｌｙｓ−ｌｙｓ−ｌｙｓ（配列番号１７１）。図８Ｃは例示的ドナーＤＮＡの配列を提供している：
。
図９Ａは、３つの例示的ｔｃＰＮＡと比較したＣＦＴＲ遺伝子（Ｇ５４２Ｘ）中の変異（Ｇ→Ｔ）の図である。図９ＢはｔｃＰＮＡの配列を提供している：ＣＦ−３０２ ｌｙｓ−ｌｙｓ−ｌｙｓ−ＴＪＴＴＴＴＴ−ＯＯＯ−ＴＴＴＴＴＣＴＧＴＡＡＴＴＴＴＴＡＡ−ｌｙｓ−ｌｙｓ−ｌｙｓ（配列番号１７２）、ＣＦ−５２９ ｌｙｓ−ｌｙｓ−ｌｙｓ−ＴＪＴＪＴＴＴＪＴ−ＯＯＯ−ＴＣＴＴＴＣＴＣＴＧＣＡＡＡＣＴＴ（配列番号１７３）、およびＣＦ−５８６ ｌｙｓ−ｌｙｓ−ｌｙｓ−ＴＴＴＪＴＴＴ−ＯＯＯ−ＴＴＴＣＴＴＴＡＡＧＡＡＣＧＡＧＣＡ（配列番号１７４）。図９Ｃは例示的ドナーＤＮＡの配列を提供している：
。
図１０Ａは、ＳＣＤ変異（Ａ→Ｔ）変異（SCD mutation (A→T) mutation）および変異近くのホモプリン領域に結合するように設計されたｔｃＰＮＡを含有するβ−グロビン遺伝子の標的化修正のための戦略の図である。図１０Ｂ〜１０Ｃは、ＰＢＳ緩衝液中で動的光散乱を使用して測定された製剤化ＰＬＧＡナノ粒子の水力学的直径（図１０Ｂ）および製剤化ＰＬＧＡナノ粒子のゼータ電位（図１０Ｃ）を示す棒グラフである。両グラフ中のデータは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝３として示されている。図１０Ｄ〜１０Ｅは、Ｂｅｒｋｌｅｙ「Ｂｅｒｋ」マウス（図１０Ｄ）およびＴｏｗｎｅｓマウス（図１０Ｅ）の骨髄細胞におけるｉｎ ｖｉｖｏでの標的化遺伝子編集の頻度を定量するためのディープシークエンシング分析の結果を示す棒グラフである。エラーバーは、割合の標準誤差を示している。 図１０Ａは、ＳＣＤ変異（Ａ→Ｔ）変異（SCD mutation (A→T) mutation）および変異近くのホモプリン領域に結合するように設計されたｔｃＰＮＡを含有するβ−グロビン遺伝子の標的化修正のための戦略の図である。図１０Ｂ〜１０Ｃは、ＰＢＳ緩衝液中で動的光散乱を使用して測定された製剤化ＰＬＧＡナノ粒子の水力学的直径（図１０Ｂ）および製剤化ＰＬＧＡナノ粒子のゼータ電位（図１０Ｃ）を示す棒グラフである。両グラフ中のデータは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝３として示されている。図１０Ｄ〜１０Ｅは、Ｂｅｒｋｌｅｙ「Ｂｅｒｋ」マウス（図１０Ｄ）およびＴｏｗｎｅｓマウス（図１０Ｅ）の骨髄細胞におけるｉｎ ｖｉｖｏでの標的化遺伝子編集の頻度を定量するためのディープシークエンシング分析の結果を示す棒グラフである。エラーバーは、割合の標準誤差を示している。
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書で使用されるように、「親和性タグ」とは、定義された結合パートナーとの高度に特異的で非共有結合的な生理化学的（physiochemical）相互作用を形成する分子種と本明細書では定義される。互いに高度に特異的で非共有結合的な生理化学的相互作用を形成する親和性タグは本明細書では「相補的」と定義される。
本明細書で使用されるように、「カップリング剤」とは、ポリマーナノ粒子と会合し、ナノ粒子における機能的エレメントのモジュラー組み立て（modular assembly）および解体（disassembly）を促進する基材（substrate）を提供する分子実体と本明細書では定義される。カップリング剤は親和性タグとコンジュゲートすることが可能である。親和性タグは、親和性タグにコンジュゲートされている機能的エレメントの柔軟な組み立ておよび解体を可能にし、このエレメントはアダプターエレメントにコンジュゲートしている親和性タグと高度に特異的で非共有結合的な生理化学的相互作用を形成する。カップリング剤は親和性タグの非存在下で機能的エレメントに共有結合によりカップリングすることも可能である。
本明細書で使用されるように、用語「単離された」は、化合物が天然に存在する環境とは異なる環境にある、例えば、ペプチドを天然には見出されない濃度にまで濃縮することによるなどのその自然環境から分離されている、目的の化合物（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのどちらか）を記述する。「単離された」は、目的の化合物について実質的に富化されているおよび／または目的の化合物が部分的にもしくは実質的に精製されている試料内にある化合物を含むことが意図されている。
核酸に関して本明細書で使用されるように、用語「単離された」は、任意の天然には存在しない核酸配列を含み、なぜならば、そのような天然には存在しない配列は天然には見出せず、天然に存在するゲノム中に直に連続する配列（contiguous sequence）を有さないからである。
本明細書で使用されるように、用語「宿主細胞」とは、核酸を導入することが可能な原核細胞および真核細胞を指す。
本明細書で使用されるように、「形質転換された」または「トランスフェクトされた」は、当技術分野で公知のいくつかの技法のうちの１つにより核酸を細胞内に導入することを包含する。
本明細書で使用されるように、分子が標的に「特異的に結合する」という語句は、他の生物製剤（biologics）の異種集団の存在下で分子の存在を決定付ける結合反応のことを指す。したがって、指定された免疫アッセイ条件下で、指定された分子は特定の標的に優先的に結合し、試料中に存在する他の生物製剤に有意な量では結合しない。そのような条件下での標的への抗体の特異的結合には、抗体が標的に対するその特異性で選択される必要がある。種々の免疫アッセイフォーマットを使用して、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応性であるモノクローナル抗体を選択するのに日常的に使用されている。例えば、HarlowおよびLane（１９８８年）Antibodies、A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Publications、New York、for a description of immunoassay formats and conditions that can be used to determine specific immunoreactivityを参照されたい。２つの実体間の特異的結合とは、少なくとも１０６、１０７、１０８、１０９、または１０１０Ｍ−１の親和性を意味する。１０８Ｍ−１より大きな親和性が好ましい。
本明細書で使用されるように、「標的化分子」は、選択された細胞または組織型上の受容体部位にナノ粒子を向けることが可能であり、結合分子の役割を果たすか、または別の分子をカップリングもしくは結合させる役目をすることが可能な物質である。本明細書で使用されるように、「向ける（direct）」とは、分子を選択された細胞または組織型に優先的に結合させることである。下で考察されるように、これは、細胞材料、分子、または薬物を向けるために使用することができる。
本明細書で使用されるように、用語「抗体」または「免疫グロブリン」は、無傷の抗体およびその結合断片を含むように使用される。典型的には、断片は、別々の重鎖、軽鎖Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、およびＦｖを含む抗原断片への特異的結合について、その断片が由来した無傷の抗体と競合する。断片は、組換えＤＮＡ技法により、または無傷の免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的分離により生成される。用語「抗体」は、他のタンパク質に化学的にコンジュゲートしているか、または他のタンパク質との融合タンパク質として発現される１つまたは複数の免疫グロブリン鎖も含む。用語「抗体」は二重特異性抗体も含む。二重特異性または二機能性抗体は、２つの異なる重／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工的ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結を含む種々の方法により生成することが可能である。例えば、SongsivilaiおよびLachmann、Clin. Exp.Immunol.、７９巻：３１５〜３２１頁（１９９０年）；Kostelnyら、J. Immunol.、１４８巻、１５４７〜１５５３頁（１９９２年）を参照されたい。
本明細書で使用されるように、用語「エピトープ」または「抗原決定基」とは、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位を指す。Ｂ細胞エピトープは、連続アミノ酸またはタンパク質の三次フォールディングにより近接される非連続アミノ酸の両方から形成することが可能である。連続アミノ酸から形成されるエピトープは典型的には変性溶媒に曝露されても保持され、三次フォールディングにより形成されるエピトープは典型的には変性溶媒を用いて処理すると失われる。エピトープは典型的には、独特の空間的高次構造に少なくとも３つ、より通常は、少なくとも５つまたは８〜１０個のアミノ酸を含む。エピトープの空間的高次構造を決定する方法は、例えば、ｘ線結晶学および二次元核磁気共鳴を含む。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology、６６巻、Glenn E. Morris編（１９９６年）を参照されたい。同じエピトープを認識する抗体は、別の抗体の標的抗原への結合を遮断する１つの抗体の能力を示す簡単な免疫アッセイにおいて同定することが可能である。Ｔ細胞は、ＣＤ８細胞では約９個のアミノ酸またはＣＤ４細胞では約１３〜１５個のアミノ酸の連続エピトープを認識する。エピトープへの応答において初回抗原刺激を受けた（primed）Ｔ細胞による３Ｈチミジン取込みにより決定した場合、抗原依存性増殖を測定するｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにより（Burkeら、J. Inf. Dis.、１７０巻：１１１０〜１９頁（１９９４年））、抗原依存性殺滅により（cytotoxic T lymphocyte assay、Tiggesら、J. Immunol.、１５６巻、３９０１〜３９１０頁）またはサイトカイン分泌によりエピトープを認識するＴ細胞を同定することが可能である。
本明細書で使用されるように、本明細書で使用される用語「小分子」とは一般に、分子量が約２０００ｇ／ｍｏｌ未満、約１５００ｇ／ｍｏｌ未満、約１０００ｇ／ｍｏｌ未満、約８００ｇ／ｍｏｌ未満、または約５００ｇ／ｍｏｌ未満である有機分子を指す。小分子は非ポリマーおよび／または非オリゴマーである。
本明細書で使用されるように、用語「キャリア」または「賦形剤」とは、製剤中の有機または無機成分、天然または合成不活性成分を指し、これと１つまたは複数の活性成分が組み合わされる。
本明細書で使用されるように、用語「薬学的に許容される」とは、活性成分の生物学的活性の有効性を妨害しない無毒性材料を意味する。
本明細書で使用されるように、用語「有効量」または「治療有効量」とは、処置されている障害、疾患、もしくは状態の１つもしくは複数の症状を軽減するか、または他の方法で所望の薬理的および／もしくは生理的効果を与えるのに十分な投薬量を意味する。正確な投薬量は、被験体依存性変数（例えば、年齢、免疫系健康状態、等）、処置されている疾患または障害、ならびに投与経路および投与されている薬剤の薬物動態などの種々の因子に従って変動する。
本明細書で使用されるように、用語「予防」または「予防する」とは、疾患または障害により引き起こされる１つまたは複数の症状のリスクがあるまたはその素因を有する被験体または系に組成物を投与し、疾患または障害の特定の症状の休止、疾患または障害の１つまたは複数の症状の低減または予防、疾患または障害の重症度の低減、疾患または障害の完全な消失、疾患または障害の発症または進行の安定化または遅延を引き起こすことを意味する。
ＩＩ．遺伝子編集増強因子
ある特定の増強因子を使用して遺伝子編集技術の効力を増加させることが可能であることが発見されている。下の実施例で考察されるＳＣＦ処理ＣＤ１１７＋細胞対非処理ＣＤ１１７＋細胞における遺伝子発現プロファイリングは、ＲＡＤ５１およびＢＲＣＡ２を含む多数のＤＮＡ修復遺伝子の追加の上方調節を示した。これらの結果および下で考察される他の結果は、ＣＤ１１７が表現型マーカーにすぎないというよりも、機能的なｃ−Ｋｉｔシグナル伝達経路がＨＤＲの増加を媒介し遺伝子編集を促進することを示している。ＣＤ１１７＋細胞がＳＣＦで処理された場合、これらのＤＮＡ修復遺伝子の発現は、遺伝子編集のさらなる増加に相関してはるかに増加した。
したがって、遺伝子編集技術の効力を増加させる組成物および方法が提供される。本明細書で使用されるように、「遺伝子編集増強因子」または「遺伝子編集増強剤」または「増強因子」または「増強剤」とは、その化合物の非存在下での遺伝子編集技術の使用と比べて遺伝子編集技術による遺伝子、ゲノム、または他の核酸の編集（例えば、挿入、欠失、置換、等を含む変異）の効力を増加させる化合物を指す。単独でまたはさらに好ましくは開示された増強因子と組み合わせて使用するのに適した好ましい遺伝子編集技術は下でさらに詳細に考察される。ある特定の好ましい実施形態では、遺伝子編集技術は、任意選択で、しかし、好ましくは、ナノ粒子組成物中での三重鎖形成γＰＮＡおよびドナーＤＮＡである。
増強因子は、例えば、ＤＮＡ損傷または修復−刺激因子もしくはＤＮＡ損傷または修復−増強因子を含む。好ましくは、因子は１つまたは複数の内因性高忠実度ＤＮＡ修復経路に関与する因子である。一部の実施形態では、因子はＲａｄ５１、ＢＲＣＡ２、またはその組合せの発現を増加させる因子である。
下でもっと詳細に考察されるように、好ましい方法は典型的には、細胞を有効量の遺伝子編集増強因子に接触させることを含む。接触させることは、ｅｘ ｖｉｖｏ、例えば、単離された細胞で、または、例えば、増強因子の被験体への投与に続いてｉｎ ｖｉｖｏで行うことが可能である。
Ａ．Ｃ−Ｋｉｔリガンド
一部の実施形態では、因子は受容体チロシンキナーゼｃ−Ｋｉｔの活性化因子である。ＣＤ１１７（マスト細胞／幹細胞成長因子受容体またはプロトオンコジーンｃ−Ｋｉｔタンパク質としても知られる）は、造血幹細胞および前駆体細胞ならびに他の細胞型の表面で発現される受容体チロシンキナーゼである。ｃ−Ｋｉｔのリガンドである幹細胞因子（ＳＣＦ）は受容体の二量体化を引き起こしそのチロシンキナーゼ活性を活性化して、生存、増殖、および分化に影響を及ぼすことが可能である下流シグナル伝達経路を始動させる。ＳＣＦおよびｃ−ＫｉｔはLennartssonおよびRoennstrand、Physiological Reviews、９２巻（４号）：１６１９〜１６４９頁（２０１２年）で概説されている。
ヒトＳＣＦ遺伝子は、２７３アミノ酸の膜貫通タンパク質をコードしており、このタンパク質には２５アミノ酸のＮ末端シグナル配列、１８９アミノ酸の細胞外ドメイン、２３アミノ酸の膜貫通ドメイン、および３６アミノ酸の細胞質ドメインを含有する。カノニカルヒトＳＣＦアミノ酸配列は：

である。
ＳＣＦの分泌された可溶性形態は、膜係留前駆体のタンパク質分解プロセシングによって生じる。ヒトＳＣＦの、切断され分泌された可溶性形態は配列番号１において下線を付しており、これはＮ末端メチオニンのない配列番号２に一致する。

MEGICRNRVTNNVKDVTKLVANLPKDYMITLKYVPGMDVLPSHCWISEMVVQLSDSLTDLLDKFSNISEGLSNYSIIDKLVNIVDDLVECVKENSSKDLKKSFKSPEPRLFTPEEFFRIFNRSIDAFKDFVVASETSDCVVSSTLSPEKD SRVSVTKPFMLPPVA (配列番号２，Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ組換えヒトＳＣＦカタログ番号３００−０７）。
マウスおよびラットＳＣＦはヒト細胞において完全に活性である。カノニカルマウスＳＣＦアミノ酸配列は：

である。
マウスＳＣＦの、切断され分泌された可溶性形態は配列番号３において下線を付しており、これはＮ末端メチオニンのない配列番号４に一致する。
MKEICGNPVTDNVKDITKLVANLPNDYMITLNYVAGMDVLPSHCWLRDMVIQLSLSLTTLLDKFSNISEGLSNYSIIDKLGKIVDDLVLCMEENAPKNIKESPKRPETRSFTPEEFFSIFNRSIDAFKDFMVASDTSDCVLSSTLGPEKDSRVSVTKPFMLPPVA (配列番号４，Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ組換えマウスＳＣＦカタログ番号２５０−０３）。
カノニカルマウスＳＣＦアミノ酸配列は：

である。
ラットＳＣＦの、切断され分泌された可溶性形態は配列番号５において下線を付しており、これはＮ末端メチオニンのない配列番号６に一致する。
MQEICRNPVTDNVKDITKLVANLPNDYMITLNYVAGMDVLPSHCWLRDMVTHLSVSLTTLLDKFSNISEGLSNYSIIDKLGKIVDDLVACMEENAPKNVKESLKKPETRNFTPEEFFSIFNRSIDAFKDFMVASDTSDCVLSSTLGPEKDSRVSVTKPFMLPPVA (配列番号６，Ｓｈｅｎａｎｄｏａｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、組換えラットＳＣＦ（幹細胞因子）カタログ番号３００−３２）。
一部の実施形態では、因子は、Ｎ末端メチオニンを有するかもしくは有さない、配列番号１〜６のいずれかなどのＳＣＦ、またはその機能的断片、または配列番号１〜６のうちのいずれか１つに少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、もしくはそれよりも多い配列同一性を有するそのバリアントである。
ＳＣＦは、ＳＣＦタンパク質として、またはＳＣＦをコードする核酸（転写されたＲＮＡ、ＤＮＡ、発現ベクター中のＤＮＡ）として細胞にまたは被験体に投与することが可能であることが認識される。したがって、配列番号１〜６をコードする、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）配列およびＤＮＡ配列を含む核酸配列も、単独でならびに発現カセットおよびベクターに挿入しての両方で提供される。例えば、ＳＣＦをコードする配列は、自己複製プラスミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、またはヘルペスウイルス）に、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込むことが可能である。
ＳＣＦの観察された効果は、エリスロポエチン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＧＦ（特に上皮細胞では；嚢胞性線維症では肺上皮）、肝細胞成長因子、等を含むがこれらに限定されない他のサイトカインまたは成長因子が骨髄細胞においてまたは他の組織において遺伝子編集潜在力をブーストするのに同様に役立つ可能性があることを示している。一部の実施形態では、遺伝子編集は特異的な細胞型においてこれらの細胞型に標的化されたサイトカインを使用して増強される。
Ｂ．複製モジュレーター
一部の実施形態では、増強因子は、例えば、複製進行および／または複製フォークを操作することが可能な複製モジュレーターである。例えば、ＡＴＲ−Ｃｈｋ１細胞周期チェックポイント経路は、細胞をＤＮＡ損傷および失速複製から保護するのに多数の役割を有しており、最も顕著な役割は細胞周期の制御および有糸分裂への時期尚早な進入の防止である（ThompsonおよびEastman、Br J Clin Pharmacol.、７６巻（３号）：３５８〜３６９頁（２０１３年）、Smithら、Adv Cancer Res.、１０８巻：７３〜１１２頁（２０１０年））。しかし、Ｃｈｋ１は失速した複製フォークの安定化、複製起点発火および複製フォーク進行の制御、ならびに相同組換えにも寄与している。Ｐｏｌαとしても公知のＤＮＡポリメラーゼアルファは、真核生物に見出されＤＮＡ複製の開始に関与している酵素複合体である。Ｈｓｐ９０（熱ショックタンパク質９０）は、他のタンパク質が正しく折り畳まれるのを援助し、熱ストレスに対してタンパク質を安定化させ、タンパク質分解を支援するシャペロンタンパク質である。
実験結果は、ＤＮＡ損傷応答経路でのＣＨＫ１およびＡＴＲの阻害剤、ならびにＤＮＡポリメラーゼアルファ阻害剤およびＨＳＰ９０阻害剤が、三重鎖形成ＰＮＡおよび一本鎖ドナーＤＮＡオリゴヌクレオチドによる遺伝子編集を実質的にブーストしていることを明らかにしている。したがって、一部の実施形態では、増強因子はＣＨＫ１もしくはＡＴＲ経路阻害剤、ＤＮＡポリメラーゼアルファ阻害剤、またはＨＳＰ９０阻害剤である。阻害剤は、機能的核酸、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アプタマー、リボザイム、三重鎖形成分子、ＲＮＡｉ、またはＡＴＲ−Ｃｈｋ１細胞周期チェックポイント経路においてＣＨＫ１、ＡＴＲ、もしくは別の分子を標的とする外部ガイド配列；ＤＮＡポリメラーゼアルファ；またはＨＳＰ９０でありえ、ＡＴＲ、ＣＨＫ１、ＤＮＡポリメラーゼアルファ、またはＨＳＰ９０の発現または活性を低減する。
好ましくは、阻害剤は小分子である。例えば、増強因子はＡＴＲ−Ｃｈｋ１細胞周期チェックポイント経路阻害剤である小分子阻害剤であってよい。そのような阻害剤は当技術分野では公知であり、多くの阻害剤ががんの処置のために臨床試験で試験されてきた。例示的なＣＨＫ１阻害剤は、ＡＺＤ７７６２、ＳＣＨ９００７７６／ＭＫ−８７７６、ＩＣ８３／ＬＹ２６０３６１８、ＬＹ２６０６３６８、ＧＤＣ−０４２５、ＰＦ−００４７７７３６、ＸＬ８４４、ＣＥＰ−３８９１、ＳＡＲ−０２０１０６、ＣＣＴ−２４４７４７、Ａｒｒｙ−５７５（ThompsonおよびEastman、Br J Clin Pharmacol.、７６巻（３号）：３５８〜３６９頁（２０１３年））、およびＳＢ２１８０７５を含むがこれらに限定されない。例示的なＡＴＲ経路阻害剤は、シサンドリンＢ（Schisandrin B）、ＮＵ６０２７、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＶＥ−８２１、ＶＥ−８２２（ＶＸ−９７０）、ＡＺ２０、ＡＺＤ６７３８、ＭＩＲＩＮ、ＫＵ５５９３、ＶＥ−８２１、ＮＵ７４４１、ＬＣＡ、およびＬ１８９を含むがこれらに限定されない（WeberおよびRyan、Pharmacology & Therapeutics、１４９巻：１２４〜１３８頁（２０１５年））。
一部の実施形態では、増強因子は、アフィディコリンなどのＤＮＡポリメラーゼアルファ阻害剤である。
一部の実施形態では、増強因子は、ＳＴＡ−９０９０（ガネテスピブ（ganetespib））などの熱ショックタンパク質９０阻害剤（ＨＳＰ９０ｉ）である。他のＨＳＰ９０阻害剤は当技術分野では公知であり、ゲルダナマイシン（ＧＡ）などのベンゾキノンアンサマイシン抗生物質；１７−ＡＡＧ（１７−アリルアミノ−１７−デメトキシ−ゲルダナマイシン）；１７−ＤＭＡＧ（１７−ジメチルアミノエチルアミノ−１７−デメトキシ−ゲルダナマイシン）（アルベスピマイシン（Alvespimycin））；ＩＰＩ−５０４（レタスピマイシン）；およびＡＵＹ９２２（Tatokoroら、EXCLI J.、１４巻：４８〜５８頁（２０１５年））を含むがこれらに限定されない。
ＩＩＩ．遺伝子編集技術
遺伝子編集技術は単独でまたは好ましくは増強剤と組み合わせて使用することが可能である。例示的な遺伝子編集技術は、三重鎖形成分子（triplex-forming）、偽相補的オリゴヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、およびＴＡＬＥＮを含むがこれらに限定されず、これらのそれぞれが下でさらに詳細に考察される。下でさらに詳細に考察されるように、一部の遺伝子編集技術はドナーオリゴヌクレオチドと組み合わせて使用される。一部の実施形態では、遺伝子編集技術はドナーオリゴヌクレオチドであり、これは単独で使用して遺伝子を改変することが可能である。戦略は、小断片相同置換（例えば、ポリヌクレオチド小ＤＮＡ断片（ＳＤＦ））、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド媒介遺伝子改変（例えば、ｓｓＯＤＮ／ＳＳＯ）ならびにSargent、Oligonucleotides、２１巻（２号）：５５〜７５頁（２０１１年））、および他の文献に記載されている他の戦略を含むがこれらに限定されない。他の適切な遺伝子編集技術は、その標的特異性を変化させるように操作されるイントロンコードメガヌクレアーゼを含むがこれに限定されない。例えば、Arnouldら、Protein Eng. Des. Sel.、２４巻（１〜２号）：２７〜３１頁（２０１１年））を参照されたい。
Ａ．三重鎖形成分子
１．組成物
配列特異的様式で二重鎖ＤＮＡに結合して三本鎖構造体を形成する「三重鎖形成分子」を含有する組成物は、三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、および「テールクランプ」ＰＮＡ（ｔｃＰＮＡ）を含むがこれらに限定されない。三重鎖形成分子を使用して、ドナーＤＮＡ分子と組み合わせた場合、哺乳動物細胞において部位特異的相同組換えを誘導することが可能である。ドナーＤＮＡ分子は、標的ＤＮＡ配列に対して変異した核酸を含有することが可能である。これは、標的化二重鎖ＤＮＡによりコードされているポリペプチドまたはタンパク質の機能を活性化する、不活化する、または他の方法で変更するのに有用である。三重鎖形成分子は、三重鎖形成オリゴヌクレオチドおよびペプチド核酸を含む。三重鎖形成分子は、米国特許第５，９６２，４２６号、同第６，３０３，３７６号、同第７，０７８，３８９号、同第７，２７９，４６３号、同第８，６５８，６０８号、米国特許出願公開第２００３／０１４８３５２号、同第２０１０／０１７２８８２号、同第２０１１／０２６８８１０号、同第２０１１／０２６２４０６号、同第２０１１／０２９３５８５号、および公開されたＰＣＴ出願番号ＷＯ１９９５／００１３６４、ＷＯ１９９６／０４０８９８、ＷＯ１９９６／０３９１９５、ＷＯ２００３／０５２０７１、ＷＯ２００８／０８６５２９、ＷＯ２０１０／１２３９８３、ＷＯ２０１１／０５３９８９、ＷＯ２０１１／１３３８０２、ＷＯ２０１１／１３３８０、Rogersら、Proc Natl Acad Sci USA、９９巻：１６６９５〜１６７００頁（２００２年）、Majumdarら、Nature Genetics、２０巻：２１２〜２１４頁（１９９８年）、Chinら、Proc Natl Acad Sci USA、１０５巻：１３５１４〜１３５１９頁（２００８年）およびSchleifmanら、Chem Biol.、１８巻：１１８９〜１１９８頁（２０１１年）に記載されている。下でさらに詳細に考察されるように、三重鎖形成分子は典型的には、二本鎖核酸分子中のポリピリミジン：ポリプリン標的モチーフに結合して三本鎖核酸分子を形成する一本鎖オリゴヌクレオチドである。一本鎖オリゴヌクレオチドは典型的には、ポリピリミジン：ポリプリン標的モチーフのポリプリン鎖に実質的に相補的である配列を含む。
ａ．三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）
三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）は、第３の鎖として二重鎖ＤＮＡに配列特異的な様式で結合するオリゴヌクレオチドとして定義されている。オリゴヌクレオチドは、三本鎖構造体を形成するように、ヒト遺伝子内のまたはこれに隣接する所定の標的配列、標的領域、または標的部位に選択的に結合またはハイブリダイオズする合成のまたは単離された核酸分子である。
好ましくは、オリゴヌクレオチドは、７から４０ヌクレオチド長の間、最も好ましくはｉｎ ｖｉｔｒｏ変異誘発のためには１０から２０ヌクレオチド長、ｉｎ ｖｉｖｏ変異誘発のためには２０から３０ヌクレオチド長の一本鎖核酸分子である。塩基組成はホモプリンでもホモピリミジンでもよい。代わりに、塩基組成はポリプリンでもポリピリミジンでもよい。しかし、他の組成も有用である。
オリゴヌクレオチドは、好ましくは公知のＤＮＡ合成手順を使用して作製される。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは合成的に作製される。オリゴヌクレオチドは、当技術分野で周知である標準法を使用して化学修飾することも可能である。
オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、標的配列の配列、標的領域の主溝内のオリゴヌクレオチドの結合を達成する必要性により課せられる物理的制約、およびオリゴヌクレオチド／標的配列に対して低い解離定数（Ｋｄ）を有する必要性に基づいて選択される。オリゴヌクレオチドは、三重ヘリックス形成の助けになり、第３の鎖の結合のための公知の構造モチーフのうちの１つに基づいて作製される塩基組成を有する。最も安定した複合体は、ポリプリン：ポリピリミジンエレメントにおいて形成され、このエレメントは哺乳動物ゲノムでは比較的豊富である。ＴＦＯによる三重鎖形成は、二重鎖のプリン鎖に対して平行または逆平行のいずれかに配向した第３の鎖で生じうる。逆平行プリンモチーフでは、トリプレットはＧ．Ｇ：ＣおよびＡ．Ａ：Ｔであり、一方、平行ピリミジンモチーフでは、カノニカルトリプレットはＣ＋．Ｇ：ＣおよびＴ．Ａ：Ｔである。三重鎖構造体は、ＴＦＯ鎖中の塩基と二重鎖中のプリン鎖との間の２つのフーグスティーン水素結合により安定化している。第３鎖結合オリゴヌクレオチドのための塩基組成の概説は米国特許第５，４２２，２５１号に提供されている。
好ましくは、オリゴヌクレオチドは高ストリンジェンシーおよび特異性の条件下で標的配列に結合またはハイブリダイズする。最も好ましくは、オリゴヌクレオチドは二重鎖ＤＮＡの主溝内で、配列特異的様式で結合する。核酸配列に対するオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーのｉｎ ｖｉｔｒｏ三重ヘリックス形成のための反応条件は、オリゴヌクレオチド長、Ｇ：ＣおよびＡ：Ｔ塩基対の数、ならびにハイブリダイゼーション反応において利用される緩衝液の組成などの因子に応じて、オリゴヌクレオチドごとに変動する。第３の鎖結合コードに基づいて、二本鎖核酸分子の標的領域に実質的に相補的であるオリゴヌクレオチドが好ましい。
本明細書で使用されるように、オリゴヌクレオチドが標的領域との三重ヘリックスの形成を可能にする複素環塩基組成を有する場合、三重鎖形成分子は標的領域に実質的に相補的であると言われる。したがって、オリゴヌクレオチドは、そのオリゴヌクレオチドに非相補的塩基が存在する場合でも標的領域に実質的に相補的である。上記のように、実質的に相補的なオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するのに使用することができる種々の構造モチーフが利用可能である。
ｂ．ペプチド核酸（ＰＮＡ）
別の実施形態では、三重鎖形成分子はペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ペプチド核酸は、オリゴヌクレオチドのリン酸骨格が全体として反復Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン単位で置き換えられており、リン酸ジエステル結合がペプチド結合で置き換えられている分子である。種々の複素環塩基がメチレンカルボニル結合により骨格に連結されている。ＰＮＡは、オリゴヌクレオチドに類似している複素環塩基のスペーシングを維持しているがアキラルで中性電荷分子である。ペプチド核酸はペプチド核酸モノマーで構成されている。複素環塩基は標準塩基（ウラシル、チミン、シトシン、アデニンおよびグアニン）のうちのいずれでもまたは下記の改変された複素環塩基のうちのいずれであってもよい。
ＰＮＡはワトソンクリック水素結合を介してＤＮＡに結合することができるが、結合親和性はＤＮＡまたはＲＮＡで構成されている対応するヌクレオチドの結合親和性よりも有意に高い。ＰＮＡの中性骨格はＰＮＡと標的ＤＮＡのホスフェート間の静電反発力を低下させる。二重鎖ＤＮＡの開口を促進するｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ条件下では、ＰＮＡは二重鎖ＤＮＡの鎖侵入を媒介して、１つのＤＮＡ鎖を置き換えてＤループを形成させることが可能である。
高度に安定な三重鎖ＰＮＡ：ＤＮＡ：ＰＮＡ構造体はホモプリンＤＮＡ鎖と２つのＰＮＡ鎖から形成されうる。２本のＰＮＡ鎖は２つの別々のＰＮＡ分子、または単一のビスＰＮＡ分子を形成するのに十分な柔軟性のあるリンカーにより互いに連結された２つのＰＮＡ分子でもよい。どちらの場合でも、ＰＮＡ分子（複数可）は、標的二重鎖の鎖のうちの一方を置き換える間に、該二重鎖標的の他方の鎖と三重鎖「クランプ」を形成する。この構造では、１つの鎖が逆平行配向のＤＮＡ鎖とワトソンクリック塩基対（ワトソンクリック結合部分）を形成し、もう一方の鎖は平行配向のＤＮＡ鎖とフーグスティーン塩基対（フーグスティーン結合部分）を形成する。ホモプリン鎖は安定なＰＮＡ／ＤＮＡ／ＰＮＡ三重鎖の形成を可能にする。ＰＮＡクランプは、三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）により必要とされる配列よりも短いホモプリン配列で形成することが可能であり、より大きな安定性を有して形成することも可能である。
ビスＰＮＡ分子のリンカーにおいて使用するのに適した分子は、Ｏ−リンカーと呼ばれる８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸、および６−アミノヘキサン酸を含むがこれらに限定されない。ポリ（エチレン）グリコールモノマーもビスＰＮＡリンカーに使用することが可能である。ビスＰＮＡリンカーはいかなる組合せでも複数のリンカー分子モノマーを含有することができる。
ＰＮＡは、ＰＮＡの可溶性を増やし、二重鎖ＤＮＡに対するＰＮＡの親和性を増加させる他の正電荷部分も含むことが可能である。一般に使用されている正電荷部分はアミノ酸リジンおよびアルギニンを含むが、他の正電荷部分も有用になる場合がある。リジンおよびアルギニン残基はビスＰＮＡリンカーに付加することが可能であり、またはＰＮＡ鎖のカルボキシもしくはＮ末端に付加することが可能である。
ｃ．テールクランプペプチド核酸（ｔｃＰＮＡ）
ポリプリン：ポリピリミジンストレッチは哺乳動物ゲノムに確かに存在するが、この要件なしで三重鎖形成を目標とするのが望ましい。ＰＮＡなどの一部の実施形態では、三重鎖形成分子は、ワトソンクリック結合部分の末端に付加された「テール」を含む。「テール」または「テールクランプ」として知られる追加の核酸塩基を三重ヘリックスの外側で標的鎖に結合するワトソンクリック結合部分に付加すれば、ポリプリン：ポリピリミジンストレッチの要件をさらに低減し、潜在的な標的部位の数を増やす。テールは最も典型的には、リンカーから最も遠く離れたワトソンクリック結合配列の末端に付加される。したがって、この分子は、三重鎖形成と二重鎖形成の両方を包含するＤＮＡへの結合様式を媒介する（Kaihatsuら、Biochemistry、４２巻（４７号）：１３９９６〜４００３頁（２００３年）；Bentinら、Biochemistry、４２巻（４７号）：１３９８７〜９５頁（２００３年））。例えば、三重鎖形成分子がテールクランプＰＮＡ（ｔｃＰＮＡ）である場合、ＰＮＡ／ＤＮＡ／ＰＮＡ三重ヘリックス部分およびＰＮＡ／ＤＮＡ二重鎖部分の両方がピリミジンリッチ鎖の置換を生じ、ヌクレオチド切除修復経路を強く誘発するヘリックス構造の変更を生じさせ、ドナーＤＮＡ分子との組換えのための部位を活性化する（Rogersら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、９９巻（２６号）：１６６９５〜７００頁（２００２年））。
クランプＰＮＡ（ビスＰＮＡと呼ばれるときもある）に付加されたテールは、テールクランプＰＮＡ（ｔｃＰＮＡと呼ばれる）を形成し、このＰＮＡはKaihatsuら、Biochemistry、４２巻（４７号）：１３９９６〜４００３頁（２００３年）；Bentinら、Biochemistry、４２巻（４７号）：１３９８７〜９５頁（２００３年）により記載されている。ｔｃＰＮＡは、低い解離定数に起因してより効率的にＤＮＡに結合することが公知である。テールの付加は標的二重鎖への三重鎖形成分子の結合特異性および結合ストリンジェンシーも増加させる。クランプＰＮＡにテールを付加すると、テールのないＰＮＡと比べて標的部位でのドナーオリゴヌクレオチドの組換えの頻度が改善されることも見出されている。
ｄ．ＰＮＡ改変
ＰＮＡは、ＰＮＡの可溶性を増やし二重鎖ＤＮＡに対するＰＮＡの親和性を増加させる他の正電荷部分も含むことができる。一般に使用されている正電荷部分はアミノ酸リジンおよびアルギニンを含むが、他の正電荷部分も有用になる場合がある。リジンおよびアルギニン残基はビスＰＮＡリンカーに付加することが可能であるか、またはＰＮＡ鎖のカルボキシもしくはＮ末端に付加することが可能である。ＰＮＡへの一般的な改変はSugiyamaおよびKittaka、Molecules、１８巻：２８７〜３１０頁（２０１３年））およびSahuら、J. Org. Chem.、７６巻：５６１４〜５６２７頁（２０１１年）で考察されており、前記文献のそれぞれが参照により全体として具体的に組み込まれ、末端でのまたはオリゴマーの内側部分でのリジンなどの荷電アミノ酸残基の組込み；骨格、カルボキシメチレン橋架け（carboxymethylene bridge）での、および核酸塩基での極性基の包含；元のＮ−（２−アミノエチル）グリシン骨格上に置換基を有するキラルＰＮＡ；元のアミノエチルグリシル骨格骨組の負電荷スキャフォールドによる置き換え；末端の１つへの高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のコンジュゲーション；キメラオリゴマーを作製するためのＤＮＡへのＰＮＡの融合、骨格構造の再設計、ＤＮＡまたはＲＮＡへのＰＮＡのコンジュゲーションを含むがこれらに限定されない。これらの改変は可溶性を改善するが、結合親和性および／または配列特異性の低減を生じることが多い。一部の実施形態では、ＰＮＡモノマーの一部またはすべてが、下に図示されるように、ポリアミド骨格のガンマ位で改変されている（γＰＮＡ）（「Ｂ」は核酸塩基であり「Ｒ」はガンマ位での置換である）。
ガンマ位での置換はキラリティーを生じさせ、ＰＮＡオリゴマーにヘリックス状前組織化（helical pre-organization）をもたらし、標的ＤＮＡに対する実質的に増加した結合親和性が得られる（Rapireddyら、Biochemistry、５０巻（１９号）：３９１３〜８頁（２０１１年））。ガンマ位での特定の置換（上のキラルγＰＮＡ中の「Ｒ」基）の化学的性質に応じて他の有利な特性を与えることが可能である
１クラスのγ置換はミニＰＥＧであるが、他の残基および側鎖が考慮され得、混合置換（mixed substitution）でさえオリゴマーの特性を調整するのに使用することができる。「ミニＰＥＧ」または「ＭＰ」とは、ジエチルグリコールのことである。ミニＰＥＧ含有γＰＮＡは、元のＰＮＡデザインおよび他のキラルγＰＮＡと比べて、優れたハイブリダイゼーション特性および水溶性を示す立体構造的に前もって組織化されたＰＮＡである。Ｌ−アミノ酸から調製されたγＰＮＡは右巻きヘリックスをとり、Ｄ−アミノ酸から調製されたγＰＮＡは左巻きヘリックスをとるが、右巻きヘリックスγＰＮＡのみが高親和性および配列選択性でＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズする。最も好ましい実施形態では、ＰＮＡモノマーのうちの一部またはすべてがミニＰＥＧ含有γＰＮＡである（Sahuら、J. Org. Chem.、７６巻：５６１４〜５６２７頁（２０１１年））。その実施形態では、リンカーのワトソンクリック結合側上の１つおきのＰＮＡモノマーがミニＰＥＧ含有γＰＮＡであるｔｃＰＮＡが調製される。したがって、ＰＮＡのテールクランプ側は交互にＰＮＡモノマーとミニＰＥＧ含有γＰＮＡモノマーを有する。
一部の実施形態では、ＰＮＡ媒介遺伝子編集は、上でおよび下で導入される置換および修飾を含むがこれらに限定されない、追加のもしくは代わりのγ置換または他のＰＮＡ化学修飾により達成される。他の側鎖とのγ置換の例は、アラニン、セリン、スレオニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、アルギニン、およびその誘導体の置換を含む。本明細書の「その誘導体」とは、これらのアミノ酸側鎖に、例えば、セリン、システイン、スレオニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、リジン、およびアルギニンの側鎖に共有結合している化学的部分と定義される。
一貫して改善された遺伝子編集効力を示すγＰＮＡに加えて、ゲノム中でのオフターゲット効果のレベルは極端に低いままである。これはＰＮＡにはいかなる内在的ヌクレアーゼ活性もないことに相応しており（ＺＦＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＴＡＬＥＮとは対照的に）、三重鎖誘導遺伝子編集の機構を反映しており、この機構は内因性高忠実度ＤＮＡ修復経路に関与する標的結合部位で変更されたヘリックスを生じさせることにより作用する。上記のように、ＳＣＦ／ｃ−Ｋｉｔ経路もこれら同じ経路を刺激して、オフターゲットリスクまたは細胞傷害性を増やさずに増強された遺伝子編集を提供する。
さらに、三重鎖形成配列のいずれでも、グアニジン−Ｇ−クランプ（「Ｇ−クランプ」）ＰＮＡモノマー（複数可）を含むように改変してＰＮＡ結合を増強することが可能である。グアニンと５つのＨ結合を形成することができるシトシン類似物であるクランプ−Ｇ（９−（２−グアニジノエトキシ）フェノキサジン）によるシトシンの置換を有するγＰＮＡは、拡大したフェノキサジン環系および実質的に増加した結合親和性に起因して余分な塩基スタッキングも提供することが可能である。ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究によれば、Ｃに代えて単一クランプＧの使用は、２３ｏＣによるＰＮＡ−ＤＮＡ二重鎖の結合を実質的に増強することができることが示されている（Kuhnら、Artificial DNA、PNA & XNA、１巻（１号）：４５〜５３頁（２０１０年））。その結果、Ｇ−クランプ置換を含有するγＰＮＡはさらに増加した活性を有しうる。
クランプＧモノマーとＧの塩基対（クランプＧは「Ｘ」で示されている）の構造はＣ−Ｇ塩基対と比較して下に図示されている。
一部の研究は、ペプチド合成においてＤ−アミノ酸を使用しての改善を示している。
２．三重鎖形成標的配列の考慮事項
三重鎖形成分子は、本明細書では「標的配列」、「標的領域」、または「標的部位」と呼ばれる所定の標的領域に結合する。三重鎖形成分子のための標的配列は、例えば、ベータグロビン、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）をコードするヒト遺伝子、または下でさらに詳細に考察される他の遺伝子、または脂質、糖タンパク質、もしくはムコ多糖の代謝に必要な酵素、または修正に必要な別の遺伝子の中またはこれに隣接して存在することが可能である。標的配列は遺伝子のコードＤＮＡ配列の中またはイントロンの中に存在することが可能である。標的配列は、プロモーターもしくはエンハンサーを含む標的遺伝子の発現を調節するＤＮＡ配列またはＲＮＡスプライシングを調節する部位の中にも存在することが可能である。
三重鎖形成分子のヌクレオチド配列は、標的配列の配列、物理的制約、および三重鎖形成分子／標的配列に対して低い解離定数（Ｋｄ）を有する必要性に基づいて選択される。本明細書で使用されるように、三重鎖形成分子が、標的領域と三重ヘリックスを形成するのを可能にする複素環塩基組成を有する場合、三重鎖形成分子は標的領域に実質的に相補的であると言われる。したがって、三重鎖形成分子は、三重鎖形成分子に非相補的塩基が存在する場合でも、標的領域に実質的に相補的である。
実質的に相補的なオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するのに使用することができる種々の構造モチーフが利用可能である。好ましくは、三重鎖形成分子は、高ストリンジェンシーおよび特異性の条件下で標的配列に結合するかまたはハイブリダイズする。核酸配列に対する三重鎖形成分子プローブまたはプライマーのｉｎ ｖｉｔｒｏ三重ヘリックス形成のための反応条件は、三重鎖形成分子の長さ、Ｇ：ＣおよびＡ：Ｔ塩基対の数、ならびにハイブリダイゼーション反応において利用される緩衝液の組成に応じて、三重鎖形成分子ごとに変動する。
ａ．ＴＦＯのための標的配列の考慮事項
好ましくは、ＴＦＯは７から４０ヌクレオチドの間の長さの一本鎖核酸分子であり、最も好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ変異誘発では１０から２０ヌクレオチドの長さ、ｉｎ ｖｉｖｏ変異誘発では２０から３０ヌクレオチドの長さである。塩基組成はホモプリンまたはホモピリミジンでもよい。代わりに、塩基組成はポリプリンまたはポリピリミジンでもよい。しかし、他の組成も有用である。最も好ましくは、オリゴヌクレオチドは二重鎖ＤＮＡの主溝内に配列特異的様式で結合する。第３の鎖結合コードに基づけば二本鎖核酸分子の標的領域に実質的に相補的なオリゴヌクレオチドが好ましい。オリゴヌクレオチドは、三重ヘリックス形成の助けになる塩基組成を有し、第３の鎖結合のために公知の構造モチーフのうちの１つに基づいて作製される。最も安定な複合体は、哺乳動物ゲノムでは比較的豊富なポリプリン：ポリピリミジンエレメントにおいて形成される。ＴＦＯによる三重鎖形成は、二重鎖のプリン鎖に対して平行または逆平行のいずれかに配向した第３の鎖で生じうる。逆平行プリンモチーフでは、トリプレットはＧ．Ｇ：ＣおよびＡ．Ａ：Ｔであり、平行ピリミジンモチーフでは、カノニカルトリプレットはＣ＋．Ｇ：ＣおよびＴ．Ａ：Ｔである。三重鎖構造体は、ＴＦＯ鎖中の塩基と二重鎖中のプリン鎖との間の２つのフーグスティーン水素結合により安定化している。第３の鎖結合オリゴヌクレオチドのための塩基組成の概説は米国特許第５，４２２，２５１号で提供されている。
オリゴヌクレオチドは好ましくは、公知のＤＮＡ合成手順を使用して作製される。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは合成的に作製される。オリゴヌクレオチドは、当技術分野で周知である標準法を使用して化学修飾することもできる。
ｂ．ＰＮＡのための標的配列の考慮事項
ＰＮＡおよびｔｃＰＮＡなどの一部の三重鎖形成分子は、ポリピリミジン鎖を置換して標的二重鎖に侵入し、ワトソンクリック結合とフーグスティーン結合の両方による標的二重鎖のポリプリン鎖との三重鎖形成を誘導する。好ましくは、三重鎖形成分子のワトソンクリック結合部分とフーグスティーン結合部分の両方は標的配列に実質的に相補的である。三重鎖形成オリゴヌクレオチドの場合と同様に、ホモプリン鎖は安定なＰＮＡ／ＤＮＡ／ＰＮＡ三重鎖を形成させるのに必要であるが、ＰＮＡクランプは、三重鎖形成オリゴヌクレオチドが必要とする配列よりも短いホモプリン配列で形成することができ、より大きな安定性を有して形成することもできる。
好ましくは、ＰＮＡは６から５０ヌクレオチドの長さである。ワトソンクリック部分は、任意選択でテール配列を含む９またはそれよりも多い核酸塩基の長さであるべきである。さらに好ましくは、ワトソンクリック結合部分は、任意選択で０から約１５核酸塩基のテール配列を含む約９から３０の間の核酸塩基の長さである。さらに好ましくは、ワトソンクリック結合部分は、任意選択で０から約１０の間の核酸塩基のテール配列を含む約１０から２５の間の核酸塩基の長さである。最も好ましい実施形態では、ワトソンクリック結合部分は、任意選択で５から１０の間の核酸塩基のテール配列を含む１５から２５の間の核酸塩基の長さである。フーグスティーン結合部分は６またはそれよりも多い核酸塩基の長さであるべきである。最も好ましくは、フーグスティーン結合部分は約６および１５核酸塩基を含めて約６から１５の間の核酸塩基である。
三重鎖形成分子は、標的二重鎖ヌクレオチド中のポリプリン：ポリピリミジンストレッチのポリプリン鎖を標的とするように設計される。したがって、三重鎖形成分子の塩基組成はホモピリミジンでもよい。代わりに、塩基組成はポリピリミジンでもよい。「テール」を付加するとポリプリン：ポリピリミジン操作（run）に対する要件は低減する。三重鎖形成分子のワトソンクリック結合部分に「テール」として知られる追加の核酸塩基を付加して、ワトソンクリック結合部分が三重鎖形成のためのポリプリン配列の部位の外側で標的鎖に結合／ハイブリダイズすることが可能である。これらの追加の塩基により標的二重鎖中のポリプリン：ポリピリミジンストレッチに対する要件がさらに低減し、したがって、潜在的な標的部位の数が増える。三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）はポリプリン：ポリピリミジン配列が三重ヘリックスを形成すること（to a form）も必要とする。ＴＦＯは、少なくとも１５、好ましくは３０またはそれよりも多いヌクレオチドのストレッチを必要とし得る。ペプチド核酸は三重ヘリックスを形成するのに必要なプリンはもっと少なくて済むが少なくとも１０または好ましくはそれよりも多いプリンを必要とすることもある。テールクランプＰＮＡ、またはｔｃＰＮＡとも呼ばれるテールを含むペプチド核酸は三重ヘリックスを形成するのに必要なプリンははるかに少なくて済む。三重ヘリックスは８よりも少ないプリンを含有する標的配列で形成することができる。したがって、ＰＮＡは６から３０の間のポリプリン：ポリピリミジン、好ましくは、６から２５の間のポリプリン：ポリピリミジン、さらに好ましくは６から２０の間のポリプリン：ポリピリミジンを含有する二重鎖核酸上の部位を標的とするように設計するべきである。
ＰＮＡなどの三重鎖形成分子のワトソンクリック結合鎖に「混合配列」テールを付加すると、三重鎖形成分子の長さ、したがって、結合部位の長さも増加する。これにより標的部位で作り出される損傷（lesion）の標的特異性およびサイズが増し、ポリプリン：ポリピリミジンのストレッチに対する低い要件を維持しつつ、二重鎖核酸中のヘリックスが破壊される。標的配列の長さを増やすと標的に対する特異性が改善し、例えば、１７塩基対の標的はヒトゲノム中では統計的に特有である。小さい損傷と比べて、根底にあるＤＮＡ二重鎖がより大きく破壊されているより大きい三重鎖損傷の方が、ドナーオリゴヌクレオチドの組換えを促進する内因性ＤＮＡ修復機構によって、より迅速で効率的に検出され処理すされる可能性がある。
三重鎖形成分子は好ましくは公知の合成手順を使用して生成される。一実施形態では、三重鎖形成分子は合成的に生成される。三重鎖形成分子は、当技術分野で周知である標準法を使用して化学修飾することも可能である。
Ｂ．偽相補的オリゴヌクレオチド
遺伝子編集技術は、米国特許第８，３０９，３５６号に開示されている偽相補的オリゴヌクレオチドなどの偽相補的オリゴヌクレオチドでありうる。「ダブル二重鎖形成分子」は、二重鎖ＤＮＡに配列特異的様式で結合して四本鎖構造体を形成するオリゴヌクレオチドである。一対の偽相補的オリゴヌクレオチドなどのダブル二重鎖形成分子は、哺乳動物細胞内の染色体部位でドナーオリゴヌクレオチドとの組換えを誘導することができる。偽相補的オリゴヌクレオチドは、例えば、立体障害に起因して互いに認識もハイブリダイズもせず、しかし、それぞれが標的部位でその相補的核酸鎖を認識してハイブリダイズすることができるように、１つまたは複数の改変を含有する相補的オリゴヌクレオチドである。好ましい偽相補的オリゴヌクレオチドは、偽相補的ペプチド核酸（ｐｃＰＮＡ）を含む。偽相補的オリゴヌクレオチドは、そのオリゴヌクレオチドが標的領域とのダブル二重鎖の形成を可能にする塩基組成を有する場合は、標的領域に実質的に相補的であると言われる。したがって、オリゴヌクレオチドは、非相補的塩基がオリゴヌクレオチドに存在する場合でも標的領域に実質的に相補的である。
この戦略の方がより効率的であり得、標的二本鎖ＤＮＡ中のポリプリン配列を好む三重ヘリックスオリゴヌクレオチドおよびビスペプチド核酸などの誘導組換え（induced recombination）の他の方法よりも柔軟性の増加をもたらす。設計は、偽相補的オリゴヌクレオチドが互いに対合はしないが、代わりに、標的部位で同族核酸に結合して、ダブル二重鎖の形成を誘導することを確実にする。
ダブル二重鎖形成分子が結合する所定の領域は、「ダブル二重鎖標的配列」、「ダブル二重鎖標的領域」、または「ダブル二重鎖標的部位」と呼ぶことが可能である。ダブル二重鎖形成オリゴヌクレオチドのためのダブル二重鎖標的配列（ＤＤＴＳ）は、例えば、遺伝子修正の誘導を必要とするヒト遺伝子内部またはこれに隣接する場合がある。ＤＤＴＳは遺伝子のコードＤＮＡ配列の内部またはイントロン内部に存在する場合がある。ＤＤＴＳは、プロモーター配列またはエンハンサー配列を含む、標的遺伝子の発現を調節するＤＮＡ配列内部に存在する場合もある。
偽相補的オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列はＤＤＴＳの配列に基づいて選択される。偽相補的オリゴヌクレオチドの治療的投与は、連結されていない、またはリンカーにより連結された２つの一本鎖オリゴヌクレオチドを含む。１つの偽相補的オリゴヌクレオチド鎖はＤＤＴＳに相補的であり、もう一方の鎖は置換されたＤＮＡ鎖に相補的である。偽相補的オリゴヌクレオチド、特にｐｃＰＮＡの使用は、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、ヘリックス侵入ペプチド核酸（ビスＰＮＡ）および並列副溝結合剤のような、配列選択ならびに／または標的長および特異性への制限を受けない。偽相補的オリゴヌクレオチドは、第３の鎖のフーグスティーン結合を必要とせず、したがって、ホモプリン標的に限定されない。偽相補的オリゴヌクレオチドは、所望の標的部位の混合された一般配列認識のために設計することが可能である。好ましくは、標的部位は約４０％またはそれよりも多いＡ：Ｔ塩基対含有量を含有する。好ましくは、偽相補的オリゴヌクレオチドは約８から５０の間の核酸塩基、より好ましくは８から３０、さらにより好ましくは約８から２０の間の核酸塩基である。
偽相補的オリゴヌクレオチドは、ドナーオリゴヌクレオチドの標的部位から約１から８００の間の塩基の距離で標的部位（ＤＤＴＳ）に結合するように設計するべきである。さらに好ましくは、偽相補的オリゴヌクレオチドは、ドナーオリゴヌクレオチドから約２５から７５の間の塩基の距離で結合する。最も好ましくは、偽相補的オリゴヌクレオチドは、ドナーオリゴヌクレオチドから約５０塩基の距離で結合する。βグロビンイントロンＩＶＳ２中の変異（ＧからＡ）の標的化修復のための好ましいｐｃＰＮＡ配列は米国特許第８，３０９，３５６号に記載されている。
好ましくは、偽相補的オリゴヌクレオチドは、高ストリンジェンシーおよび特異性の条件下で標的核酸分子に結合／ハイブリダイズする。最も好ましくは、オリゴヌクレオチドは、配列特異的様式で結合してダブル二重鎖の形成を誘導する。偽相補的（pseudocomplemetary）オリゴヌクレオチドの特異性および結合親和性は、オリゴヌクレオチド長、Ｇ：ＣおよびＡ：Ｔ塩基対の数、ならびに製剤などの因子に応じて、オリゴヌクレオチドごとに変動し得る。
Ｃ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ
一部の実施形態では、遺伝子編集組成物はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系である。ＣＲＩＳＰＲ（規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列）は、塩基配列の複数の短い直列反復配列を含有するＤＮＡ遺伝子座を表す頭字語である。原核生物ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、真核生物で使用するために遺伝子編集（特定の遺伝子をサイレンシングする、増強する、または変更する）としての使用に適応させてきた（例えば、Cong、Science、１５：３３９巻（６１２１号）：８１９〜８２３頁（２０１３年）およびJinekら、Science、３３７巻（６０９６号）：８１６〜２１頁（２０１２年）参照）。細胞を、ｃａｓ遺伝子および特異的に設計されたＣＲＩＳＰＲを含む必要とされるエレメントでトランスフェクトすることにより、生物のゲノムをいかなる所望の位置でも切断し改変することが可能である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用するゲノム編集において使用するための組成物を調製する方法は、ＷＯ２０１３／１７６７７２およびＷＯ２０１４／０１８４２３に詳細に記載されており、これらは参照により全体として本明細書に具体的に組み込む。
一般に、「ＣＲＩＳＰＲ系」とは、まとめて、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性な部分的ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒメイト配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系との関連での「直列反復」およびｔｒａｃｒＲＮＡにプロセシングされる部分的直列反復を包含する）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系との関連では「スペーサー」とも呼ばれる）、またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列および転写物を含むＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現に関与するかまたはこの活性を指示する転写物および他のエレメントのことを指す。ガイド配列に作動可能に連結された１つまたは複数のｔｒａｃｒメイト配列（例えば、直列反復−スペーサー−直列反復）は、ヌクレアーゼによるプロセシング前はプレｃｒＲＮＡ（プレＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）またはプロセシング後はｃｒＲＮＡと呼ばれる場合がある。
一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡは連結されてキメラｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドを形成し、そこでは成熟ｃｒＲＮＡが合成ステムループを介して部分的ｔｒａｃｒＲＮＡに融合されて、Cong、Science、１５：３３９（６１２１）：８１９〜８２３頁（２０１３年）およびJinekら、Science、３３７（６０９６）：８１６〜２１頁（２０１２年）に記載されている天然のｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖を模倣している。単一融合ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ構築物はガイドＲＮＡまたはｇＲＮＡ（または単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ））と呼ぶことも可能である。ｓｇＲＮＡ内では、ｃｒＲＮＡ部分は「標的配列」として同定することが可能であり、ｔｒａｃｒＲＮＡは「スキャフォールド」と呼ばれることが多い。
所望のＤＮＡ標的配列が同定された後は、実行者が適切な標的部位を決定するのを助けるのに利用可能な資源が数多く存在する。例えば、ヒトエキソンの４０％超を標的とする約１９０，０００の潜在的ｓｇＲＮＡの生物情報学的に作製された一覧表を含む、数多くの公共の資源が、実行者が標的部位を選択しその部位でのニックまたは二本鎖切断に波及する関連ｓｇＲＮＡを設計するのを支援するのに利用可能である。科学者が広範囲の種でＣＲＩＳＰＲ標的化部位を見つけ適当なｃｒＲＮＡ配列を作製するのを支援するように設計されているツールである、crispr.u-psud.fr/も参照されたい。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系の１つまたは複数のエレメントの発現を駆動する１つまたは複数のベクターが、ＣＲＩＳＰＲ系のエレメントの発現が１つまたは複数の標的部位でのＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を指示するように、標的細胞内に導入される。異なる操作されたＣＲＩＳＰＲ系では詳細が異なる場合もあるが、全体的な方法論は類似している。ＤＮＡ配列（ＣＴＰＳ１などの）を標的とするＣＲＩＳＰＲ技術を使用することに関心がある実行者であれば、ガイドＲＮＡ発現プラスミド中に標的配列を含有する短いＤＮＡ断片を挿入することが可能である。ｓｇＲＮＡ発現プラスミドは、標的配列（約２０ヌクレオチド）、一種のｔｒａｃｒＲＮＡ配列（スキャフォールド）並びに適切なプロモーターおよび真核細胞における適切なプロセシングに必要なエレメントを含有する。そのようなベクターは市販されている（例えば、Ａｄｄｇｅｎｅ参照）。系の多くが、アニーリングされて二本鎖ＤＮＡを形成し次にｓｇＲＮＡ発現プラスミド中にクローニングされるカスタム相補的オリゴに依拠する。トランスフェクトされた細胞での同じまたは別々のプラスミドからのｓｇＲＮＡと適当なＣａｓ酵素の共発現により、所望の標的部位で一本鎖または二本鎖切断（Ｃａｓ酵素の活性に応じて）が生じる。
Ｄ．ジンクフィンガーヌクレアーゼ
一部の実施形態では、標的細胞のゲノムにおいて一本鎖または二本鎖切断を誘導するエレメントは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする核酸構築物（単数または複数）である。ＺＦＮは典型的には、切断ドメインに連結されたジンクフィンガータンパク質に由来するＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質である。
最も一般的な切断ドメインはＩＩＳ型酵素Ｆｏｋ１である。Ｆｏｋ１は、１つの鎖の認識部位から９ヌクレオチドおよびもう一方の鎖の認識部位から１３ヌクレオチドでＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号、同第５，４３６，１５０号、および同第５，４８７，９９４号、ならびにLiら、Proc., Natl. Acad. Sci. USA、８９巻（１９９２年）：４２７５〜４２７９頁；Liら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、９０巻：２７６４〜２７６８頁（１９９３年）；Kimら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA.９１巻：８８３〜８８７頁（１９９４年ａ）；Kimら、J. Biol. Chem.２６９巻：３１，９７８〜３１，９８２頁（１９９４年ｂ）を参照されたい。これらの酵素（または酵素的に機能的なその断片）のうちの１つまたは複数は切断ドメインの供給源として使用することが可能である。
ＤＮＡ結合ドメインは、原則的に、目的のいかなるゲノム位置でも標的とするように設計することが可能であるが、Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２ ジンクフィンガーのタンデムアレイが可能であり、そのそれぞれが一般に標的ＤＮＡ配列中の３から４ヌクレオチドを認識する。Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２ドメインは一般構造：Ｐｈｅ（時にＴｙｒ）−Ｃｙｓ−（２から４アミノ酸）−Ｃｙｓ−（３アミノ酸）−Ｐｈｅ（時にＴｙｒ）−（５アミノ酸）−Ｌｅｕ−（２アミノ酸）−Ｈｉｓ−（３アミノ酸）−Ｈｉｓを有する。複数のフィンガーを互いに連結することにより（数は変動する：公表されている研究ではモノマー当たり３から６つのフィンガーが使用されている）、ＺＦＮ対は１８〜３６ヌクレオチド長のゲノム配列に結合するように設計することが可能である。
操作方法は、合理的な設計および種々のタイプの経験的選択法を含むがこれらに限定されない。合理的な設計は、例えば、データベースであって、トリプレット（またはクワドラプレット）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むみ、ここで、それぞれのトリプレットまたはクワドラプレットヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはクワドラプレット配列に結合するジンクフィンガーの１つまたは複数のアミノ酸配列と関連しているデータベースを使用することを含む。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号、同第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、同第６，６１０，５１２号、同第６，７４６，８３８号、同第６，８６６，９９７号、同第７，０６７，６１７号；米国特許出願公開第２００２／０１６５３５６号、同第２００４／０１９７８９２号、同第２００７／０１５４９８９号、同第２００７／０２１３２６９号；ならびに国際特許出願公開第ＷＯ９８／５３０５９号およびＷＯ２００３／０１６４９６を参照されたい。
Ｅ．転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ
一部の実施形態では、標的細胞のゲノムにおいて一本鎖または二本鎖切断を誘導するエレメントは転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）をコードする核酸構築物（単数または複数）である。ＴＡＬＥＮはＺＦＮの全体構造に類似する全体構造を有し、大きな違いはＤＮＡ結合ドメインがＴＡＬエフェクタータンパク質由来であり、転写因子は植物病原菌由来であることである。ＴＡＬＥＮのＤＮＡ結合ドメインは、それぞれが約３４残基長のアミノ酸反復のタンデムアレイである。反復は互いに非常に類似しており、典型的には主に２つの位置で異なる（アミノ酸１２および１３、反復可変二残基、またはＲＶＤと呼ばれる）。それぞれのＲＶＤは４つの可能なヌクレオチドのうちの１つへの優先的な結合を指定し、それぞれのＴＡＬＥＮ反復が単一塩基対に結合することを意味するが、ＮＮ ＲＶＤはグアニンに加えてアデニンに結合することが公知である。ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合は、ジンクフィンガータンパク質の結合ほど機構的に十分に理解されていないが、その一見もっと単純なコードは操作されたヌクレアーゼ設計に非常に有益であると判明する可能性がある。ＴＡＬＥＮはダイマーとして切断し、比較的長い標的配列を有し（今まで報告されている最も短いものでモノマー当たり１３ヌクレオチドに結合する）、結合部位間のスペーサーの長さについての要件はＺＦＮほど厳密ではないようである。モノマーＴＡＬＥＮおよびダイマーＴＡＬＥＮは１０より多い、１４より多い、２０より多い、または２４より多い反復を含むことが可能である。
ＴＡＬを、特定の核酸に結合するよう操作する方法は、ＴＡＬエフェクターおよびそれを使用してＤＮＡを改変する方法を開示している、Cermakら、Nucl. Acids Res.１〜１１頁（２０１１年）、米国特許出願公開第２０１１／０１４５９４０号に記載されている。Millerら、Nature Biotechnol ２９巻：１４３頁（２０１１年）は、ＴＡＬ切り詰めバリアントをＦｏｋｌヌクレアーゼの触媒ドメインに連結することにより部位特異的ヌクレアーゼ構造のためのＴＡＬＥＮを作製することを報告した。得られるＴＡＬＥＮは不死化ヒト細胞で遺伝子改変を誘導することが示された。ＴＡＬＥ結合ドメインのための一般的設計原理は、例えば、ＷＯ２０１１／０７２２４６に見出すことが可能である。
ＩＶ．ドナーオリゴヌクレオチド
一部の実施形態では、遺伝子編集組成物は、ドナーオリゴヌクレオチドを含むまたはこれと組み合わせて投与される。一般に、遺伝子療法の場合、ドナーオリゴヌクレオチドは宿主ゲノムの変異（複数可）を修正することが可能である配列を含むが、一部の実施形態では、ドナーは、例えば、がん遺伝子またはＨＩＶ感染を促進する受容体の発現を低減することが可能な変異を導入する。所望の修正または変異を導入するように設計された配列を含有することに加えて、ドナーオリゴヌクレオチドは同義（サイレント）変異も含有することができる（例えば、７から１０）。追加のサイレント変異は、処理された細胞から単離されたゲノムＤＮＡの対立遺伝子特異的ＰＣＲを使用して修正された標的配列の検出を促進することが可能である。
Ａ．三重鎖およびダブル二重鎖ベースの技術のための好ましいドナーオリゴヌクレオチド設計
ペプチド核酸を含む三重鎖形成分子は、混合配列リンカーを介してドナーオリゴヌクレオチドと組み合わせて投与してもよく、またはドナーオリゴヌクレオチドに繋ぎ止めてもよく、または標的配列に実質的に相同な繋がれていない（non-tethered）ドナーオリゴヌクレオチドと協同して使用してもよい。三重鎖形成分子は、最大数百塩基対離れたドナーオリゴヌクレオチド配列の組換えを誘導することが可能である。ドナーオリゴヌクレオチド配列は、三重鎖形成分子の標的結合部位から、１から８００塩基の間であるのが好ましい。さらに好ましくは、ドナーオリゴヌクレオチド配列は、三重鎖形成分子の標的結合部位から、２５から７５塩基の間である。最も好ましくは、ドナーオリゴヌクレオチド配列は、三重鎖形成分子の標的結合部位から、約５０ヌクレオチドである。
ドナー配列は、組換えのために標的化された領域の配列と比べて１つまたは複数の核酸配列変更、例えば、１つまたは複数のヌクレオチドの置換、欠失、または挿入を含有することが可能である。ドナー配列の組合せが成功すると、標的領域の配列が変化する。ドナーオリゴヌクレオチドは、本明細書ではドナー断片、ドナー核酸、ドナーＤＮＡ、またはドナーＤＮＡ断片とも呼ばれる。この戦略は、三重鎖がＤＮＡ修復を誘発する能力を利用して、相同なドナーＤＮＡとの組換えの確率を潜在的に増加させる。ドナー断片内の相同な位置の数が多いほど、ドナー断片が標的配列、標的領域、または標的部位中に組み換えられる確率が増すと当技術分野では理解されている。三重鎖形成分子にドナーオリゴヌクレオチドを繋ぎ止めると、三重ヘリックス形成による標的部位認識が促進され、その一方、同時に可能な組換えおよび情報伝達のための繋ぎ止めたドナー断片の位置を定める。三重鎖形成分子は、繋がれていないドナーオリゴヌクレオチドの相同組換えも効果的に誘導する。本明細書で使用される用語「組換え的（recombinagenic）」は、ＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、または組成物を、標的部位もしくは配列に組み換えるまたは別のＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチド、もしくは組成物の組換えを誘導することができると定義するのに使用される。
繋がれていない断片または非連結断片は２０ヌクレオチドから数千ヌクレオチドまでの長さの範囲があってもよい。ドナーオリゴヌクレオチド分子は、連結されていても連結されていなくても、一本鎖または二本鎖形態で存在することが可能である。組み換えられるドナー断片は、三重鎖形成分子に連結することも連結しないことも可能である。連結ドナー断片は４ヌクレオチドから１００ヌクレオチドの長さ、好ましくは４から８０ヌクレオチド長の範囲でよい。しかし、非連結ドナー断片は、２０ヌクレオチドから数千ヌクレオチドまでのはるかに広い範囲を有する。一実施形態では、オリゴヌクレオチドドナーは２５から８０ヌクレオチドの間である。さらなる実施形態では、繋がれていないドナーヌクレオチドは約５０から６０ヌクレオチドの長さである。
ドナーオリゴヌクレオチドは、標的ＤＮＡ配列と比べて少なくとも１つの変異した、挿入されたまたは欠失したヌクレオチドを含有する。標的配列は遺伝子のコードＤＮＡ配列内またはイントロン内に存在することが可能である。標的配列は、プロモーターもしくはエンハンサー配列またはＲＮＡスプライシングを調節する配列を含む、標的遺伝子の発現を調節するＤＮＡ配列内に存在することも可能である。
ドナーオリゴヌクレオチドは、標的配列と比べて種々の変異を含有することが可能である。代表的な種類の変異は、点変異、欠失および挿入を含むがこれらに限定されない。欠失および挿入により、フレームシフト変異または欠失が生じることがある。点変異はミスセンス変異またはナンセンス変異を引き起こすことがある。これらの変異は標的遺伝子の発現を破壊する、低減する、停止する、増加する、改善する、または他の方法で変更することができる。
ｔｃＰＮＡなどの三重鎖形成分子を含む組成物は１つまたは１つよりも多いドナーオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。１つよりも多いドナーオリゴヌクレオチドは、単回トランスフェクションで、または逐次トランスフェクションで三重鎖形成分子と一緒に投与してもよい。１つよりも多いドナーオリゴヌクレオチドを使用すれば、例えば、２つの対立遺伝子が異なる改変を含有するヘテロ接合性標的遺伝子を作り出すのに有用な場合がある。
ドナーオリゴヌクレオチドは好ましくは、複素環塩基として主要な天然に存在するヌクレオチド（ウラシル、チミン、シトシン、アデニンおよびグアニン）、糖部分としてデオキシリボース、およびリン酸エステル連結で構成されている、ＤＮＡオリゴヌクレオチドである。ドナーオリゴヌクレオチドは、組換え部位での置換配列の所望の構造に応じて、またはヌクレアーゼによる分解に対するある程度の抵抗性を与えるために、上記の核酸塩基、糖部分、または骨格／連結への改変を含んでいてもよい。ドナーオリゴヌクレオチドへの改変は、ドナーオリゴヌクレオチドが、三重鎖形成分子の存在下で組換え標的配列で首尾よく組み換えるのを妨げるべきではない。
Ｂ．ヌクレアーゼベースの技術のための好ましいドナーオリゴヌクレオチド設計
本明細書に記載されるゲノム編集系のヌクレアーゼ活性は標的ＤＮＡを切断して標的ＤＮＡにおいて一本鎖または二本鎖切断を生じる。二本鎖切断は２つの方法：非相同末端結合および相同組換え修復（homology-directed repair）のうちの１つで細胞により修復されることが可能である。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）では、二本鎖切断は、切断末端の互いへの直接ライゲーションにより修復される。したがって、新しい核酸材料は部位に挿入されないが、一部の核酸材料が失われ、欠失を生じる場合がある。相同組換え修復では、切断された標的ＤＮＡ配列に相同性を有するドナーポリヌクレオチドが、切断された標的ＤＮＡ配列の修復のための鋳型として使用され、その結果ドナーポリヌクレオチドから標的ＤＮＡへ遺伝子情報が伝達される。したがって、新しい核酸材料を部位に挿入／コピーすることが可能である。
したがって、一部の実施形態では、ゲノム編集組成物は任意選択によりドナーポリヌクレオチドを含む。ＮＨＥＪおよび／または相同組換え修復による標的ＤＮＡの改変を使用して、遺伝子修正、遺伝子置換、遺伝子タグ付け、導入遺伝子挿入、ヌクレオチド欠失、遺伝子破壊、遺伝子変異、等を誘導することが可能である。
したがって、ゲノム編集組成物によるＤＮＡの切断を使用して、標的ＤＮＡ配列を切断し、外因的に提供されるドナーポリヌクレオチドの非存在下で細胞に配列を修復させることにより、標的ＤＮＡ配列から核酸材料を欠失させることが可能である。代わりに、ゲノム編集組成物が、少なくとも標的ＤＮＡ配列に相同性を有するセグメントを含むドナーポリヌクレオチド配列を含む場合、この方法を使用して、標的ＤＮＡ配列に核酸材料を付加すること、すなわち、挿入または置換すること（例えば、タンパク質、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、等をコードする核酸を「ノックイン」する）、タグを付加すること（例えば、６×Ｈｉｓ、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、等）、赤血球凝集素（ＨＡ）、ＦＬＡＧ、等）、遺伝子に調節配列を付加すること（例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）、２Ａペプチド、開始コドン、停止コドン、スプライスシグナル、局在化シグナル、等）、核酸配列を改変すること（例えば、変異を導入する）などが可能である。したがって、組成物を使用して、例えば、遺伝子療法において使用されるように、部位特異的、すなわち、「標的化された」様式でＤＮＡを改変する、例えば、遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックイン、遺伝子編集、遺伝子タグ付けすること等が可能である。
ポリヌクレオチド配列を標的ＤＮＡ配列に挿入するのが望ましい適用では、挿入されるドナー配列を含むポリヌクレオチドも細胞に与えられる。「ドナー配列」、または「ドナーポリヌクレオチド」または「ドナーオリゴヌクレオチド」とは、切断部位に挿入される核酸配列のことである。ドナーポリヌクレオチドは典型的には、そのドナーポリヌクレオチドとそれが相同性を有するゲノム配列の間での相同組換え修復を支持するために、ゲノム配列に対してその切断部位において十分な相同性を、例えば、切断部位に隣接した、例えば、切断部位から約５０またはそれよりも少ない塩基内の、例えば、約３０塩基内の、約１５塩基内の、約１０塩基内の、約５塩基内の、または切断部位に直に隣接した、ヌクレオチド配列に７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の相同性を含有する。ドナー配列は典型的には、それが取って代わるゲノム配列とは同一ではない。むしろ、ドナー配列は、相同組換え修復を支持するのに十分な相同性が存在する限り、ゲノム配列に関して少なくとも１つまたは複数の単一塩基変化、挿入、欠失、反転または再配列を含有することができる。一部の実施形態では、ドナー配列は、標的ＤＮＡ領域と２つの隣接する配列の間での相同組換え修復により標的領域に非相同性配列が挿入されるように、相同性の２つの領域が隣接する非相同配列を含む。
Ｖ．オリゴヌクレオチド組成物
本明細書に開示される遺伝子編集技術、その成分、ドナーオリゴヌクレオチド、または他の核酸のいずれでも、核酸塩基または連結に１つまたは複数の改変または置換を含むことが可能である。改変は、三重鎖形成技術を用いて使用するためには特に好ましく、典型的にはそれに関連して下で考察されるが、改変のいずれでも開示されている遺伝子編集組成物、ドナー、ヌクレオチド、等のいずれの構築においても利用することが可能である。改変は遺伝子編集技術の活性、持続性、または機能を妨げるのではなく、好ましくはこれを増強するべきである。例えば、三重鎖形成分子（triplex-forming）として使用するためのオリゴヌクレオチドへの改変は、二重鎖侵入、鎖置換を妨げるのではなく、好ましくはこれを増強するおよび／または標的部位に対する三重鎖形成分子の特異性もしくは結合親和性を増加させることにより上記の三重鎖形成を安定化するべきである。改変された塩基および塩基類似物、改変された糖および糖類似物ならびに／または当技術分野で公知の種々の適切な連結も、本明細書で開示される分子において使用するのに適している。ＰＮＡを含むいくつかの好ましいオリゴヌクレオチド組成物、およびＰＮＡ骨格におけるγ位にミニＰＥＧを含むその改変は上で考察されている。追加の改変は下でさらに詳細に考察される。
Ａ．複素環塩基
主要な天然に存在するヌクレオチドは、複素環塩基としてウラシル、チミン、シトシン、アデニンおよびグアニンを含む。遺伝子編集分子はそのヌクレオチド構成要素への化学修飾を含む場合がある。例えば、近接するシトシンを有する標的配列は問題になることがある。三重鎖安定性は一続きのシトシンにより大幅に損なわれ、これはＮ３プロトン化から生じる正電荷間の反発力に起因してまたはおそらく近接するシトシンによるプロトンを巡る競合に起因すると考えられる。ＰＮＡなどの三重鎖形成分子を含むヌクレオチドの化学修飾は、生理的条件下で三重鎖形成分子の結合親和性および／または三重鎖安定性を増加させるのに有用であり得る。
複素環塩基または複素環塩基類似物の化学修飾は、ヌクレオチドの結合親和性または三重鎖でのその安定性を増加させるのに効果的であり得る。化学修飾複素環塩基は、イノシン、５−（１−プロピニル）ウラシル（ｐＵ）、５−（１−プロピニル）シトシン（ｐＣ）、５−メチルシトシン、８−オキソ−アデニン、シュードシトシン（pseudocytosine）、シュードイソシトシン（pseudoisocytosine）、５および２−アミノ−５−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピリジン（２−アミノピリジン）、ならびに種々のピロロ−およびピラゾロピリミジン誘導体を含むがこれらに限定されない。ＰＮＡなどの三重鎖形成分子でのシトシンの５−メチルシトシンまたはシュードイソシトシンへの置換は、特に、分離したシトシン（isolated cytosines）を有する三重鎖形成分子では、中性および／または生理的ｐＨでの三重鎖形成を安定化するのに役立つ。これは正電荷が三重鎖形成分子と標的二重鎖の間の負電荷反発力を部分的に低減し、フーグスティーン結合を可能にするからである。
Ｂ．骨格
ＰＮＡなどの三重鎖形成分子のヌクレオチドサブユニットは、２つのヌクレオシド部分間の化学連結のことであるヌクレオチド間結合により接続される。ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、オリゴヌクレオチドのリン酸骨格がそのすべてを反復Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシンユニットで置き換えられ、リン酸ジエステル結合が典型的にペプチド結合で置き換えられている合成ＤＮＡ模倣物である。種々の複素環塩基がメチレンカルボニル結合により骨格に連結され、それに起因して複素環塩基はワトソンクリック塩基対合を介して高親和性および配列特異性でＰＮＡ−ＤＮＡまたはＰＮＡ−ＲＮＡ二重鎖を形成することができる。ＰＮＡは、従来のＤＮＡオリゴヌクレオチドに類似している複素環塩基のスペーシングを維持しているが、アキラルで中性電荷分子である。ペプチド核酸はペプチド核酸モノマーで構成されている。
他の骨格改変、特にＰＮＡに関係する改変は、ペプチドおよびアミノ酸変動および改変を含む。したがって、ＰＮＡの骨格構成要素はペプチド連結でもよく、または代わりにＰＮＡの骨格構成要素は非ペプチド連結でもよい。例は、アセチルキャップ、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸などのアミノスペーサー（本明細書ではＯリンカーと呼ばれる）を含み、ＰＮＡなど正電荷が望ましい場合にはリジンなどのアミノ酸が特に有用である。ＰＮＡの化学的組立のための方法は周知である。例えば、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，５２７，６７５号、同第５，６２３，０４９号、同第５，７１４，３３１号、同第５，７３６，３３６号、同第５，７７３，５７１号、および同第５，７８６，５７１号を参照されたい。
三重鎖形成分子を作製するのに使用される骨格改変は、分子が標的部位に高特異性で結合し、標的二重鎖の１つの鎖を置き換え、標的二重鎖のもう一方の鎖の周辺にクランプを形成することにより標的二重鎖核酸と三重鎖を作り出すのを妨げるべきではない。
Ｃ．改変核酸
ペプチド核酸に加えて改変核酸も三重鎖形成分子として有用である。オリゴヌクレオチドは互いに連結されているヌクレオチドの鎖で構成されている。カノニカルヌクレオチドは典型的には、複素環塩基（核酸塩基）、複素環塩基に結合している糖部分、および糖部分のヒドロキシル官能基をエステル化するリン酸部分を含む。主要な天然に存在するヌクレオチドは、複素環塩基としてウラシル、チミン、シトシン、アデニンおよびグアニン、ならびにリン酸ジエステル結合により連結されているリボースまたはデオキシリボース糖を含む。本明細書で使用するように、「改変ヌクレオチド」または「化学修飾ヌクレオチド」は、複素環塩基、糖部分またはリン酸部分構成要素のうちの１つまたは複数の化学修飾を有するヌクレオチドを定義する。好ましくは、改変ヌクレオチドの電荷は同じ核酸塩基配列のＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドと比べて低減されている。最も好ましくは、三重鎖形成分子は、標的部位でのヌクレオチド二重鎖との静電反発力が対応する核酸塩基配列を有するＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドと比べて低減されるように、低い負電荷、電荷なしまたは正電荷を有する。
電荷が低減されている改変ヌクレオチドの例は、アキラルで無電荷サブユニット間連結を有するリン酸類似物（例えば、Sterchak、E. P.ら、Organic Chem.、５２巻：４２０２頁（１９８７年））およびアキラルなサブユニット間連結を有する無電荷モルフォリノベースのポリマー（例えば、米国特許第５，０３４，５０６号参照）などの改変ヌクレオチド間連結を含む。一部のヌクレオチド間連結類似物は、モルフォリデート（morpholidate）、アセタール、およびポリアミド連結複素環を含む。ロックド核酸（ＬＮＡ）は改変ＲＮＡヌクレオチドである（例えば、Braaschら、Chem. Biol.、８巻（１号）：１〜７頁（２００１年）参照）。ＬＮＡはＤＮＡとのハイブリッドを形成し、それはＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドよりも安定しており、特性はペプチド核酸（ＰＮＡ）／ＤＮＡハイブリッドの特性に類似している。したがって、ＬＮＡは、ＰＮＡ分子を使用した場合と同じように使用することが可能である。ＬＮＡ結合効率は、一部の実施形態では、それに正電荷を付加することにより増加させることが可能である。市販の核酸合成機および標準ホスホルアミダイト化学を使用してＬＮＡを作製する。
分子は、改変されている複素環塩基、糖部分または糖部分類似物を有するヌクレオチドも含むことができる。改変されたヌクレオチドは、ペプチド核酸に関して上記の改変されている複素環塩基または塩基類似物を含むことができる。糖部分の改変は、２’−Ｏ−アミノエトキシ、２’−Ｏ−アミノエチル（amonioethyl）（２’−ＯＡＥ）、２’−Ｏ−メトキシ、２’−Ｏ−メチル、２−グアニドエチル（guanidoethyl）（２’−ＯＧＥ）、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン（ＬＮＡ）、２’−Ｏ−（メトキシエチル）（２’−ＯＭＥ）および２’−Ｏ−（Ｎ−（メチル）アセトアミド）（２’−ＯＭＡ）を含むがこれらに限定されない。２’−Ｏ−アミノエチル糖部分置換は、中性ｐＨではプロトン化されており、したがって三重鎖形成分子と標的二重鎖との間の電荷反発力を抑制するので、特に好ましい。この改変はリボースまたはデオキシリボースのＣ３’−末端立体構造を安定化し、二重鎖のプリン鎖においてｉ−ｌホスフェートとの橋架けも形成する。
ＶＩ．ナノ粒子送達ビヒクル
増強因子、遺伝子編集分子、ドナーオリゴヌクレオチド、等を含むがこれらに限定されない開示されている組成物はいずれもナノ粒子送達ビヒクルを使用して標的細胞に送達することができる。一部の実施形態では、組成物の一部はナノ粒子にパッケージされ、一部はされない。例えば、一部の実施形態では、遺伝子編集技術および／またはドナーオリゴヌクレオチドはナノ粒子内に取り込まれ、増強因子は取り込まれない。一部の実施形態では、遺伝子編集技術および／またはドナーオリゴヌクレオチド、ならびに増強因子はナノ粒子にパッケージされる。異なる組成物は同じナノ粒子または異なるナノ粒子にパッケージすることができる。例えば、組成物は混合して一緒にパッケージすることができる。一部の実施形態では、異なる組成物は別々のナノ粒子に個別にパッケージされ、ナノ粒子は類似してまたは同一に構成および／または製造される。一部の実施形態では、異なる組成物は別々のナノ粒子に個別にパッケージされ、ナノ粒子は区別して構成（differentially composed）および／または製造される。
ナノ粒子とは一般に、５００ｎｍから０．５ｎｍ未満の間の範囲であり、好ましくは、５０から５００ｎｍの間である直径を有する、さらに好ましくは、５０から３００ｎｍの間である直径を有する粒子を指す。ポリマー粒子の細胞内部移行はそのサイズに高度に依存しており、ナノ粒子状ポリマー粒子はマイクロ粒子状（micoparticulate）ポリマー粒子よりもはるかに高い効率で細胞により内部移行される。例えば、Desaiらは、１μＭの直径を有するマイクロ粒子と比べて直径が１００ｎｍであるナノ粒子は培養Ｃａｃｏ−２細胞により約２．５倍取り入れられることを実証している（Desaiら、Pharm. Res.、１４巻：１５６８〜７３頁（１９９７年））。ナノ粒子の方がｉｎ ｖｉｖｏで組織中により深く拡散する能力も大きい。
Ａ．ポリマー
ナノ粒子のコアを形成するポリマーは、いかなる生分解性または非生分解性の合成または天然ポリマーでもよい。好ましい実施形態では、ポリマーは生分解性ポリマーである。ナノ粒子は遺伝子編集送達ビヒクルの製造には理想的な材料である：１）生物学的障壁を通過するための重要な特長である、１００ｎｍまたはそれよりも小さいサイズに至るまでの製造のサイズ範囲に関する制御；２）酵素や補因子の添加なしでの再現性のある生分解性；３）モノマー比またはポリマーサイズ、例えば、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）におけるラクチド対グリコリドモノマーユニットの比などの因子を変えることによる、封入され（encapsulated）保護された核酸の数日から数か月までの範囲の期間にわたる徐放の能力；４）ポリマー材料、溶媒、安定化剤、および生産規模の選択を含む製造のために使用することが可能なパラメータの範囲にわたって柔軟性を付与する十分理解されている製造方法論；ならびに５）表面へのモジュラー機能の導入を促進する表面特性に関する制御。
好ましい生分解性ポリマーの例は、乳酸およびグリコール酸のポリマーおよびコポリマーなどのポリ（ヒドロキシ酸）などの加水分解により分解する合成ポリマー、他の分解性ポリエステル、ポリ酸無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリエステル、ポリウレタン、ポリ（ブチック酸 (butic acid））、ポリ（吉草酸）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ヒドロキシアルカノエート）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）およびポリ（アミノ−ｃｏ−エステル）ポリマー、例えば、Zhouら、Nature Materials、１１巻：８２〜９０頁（２０１２年）ならびにＷＯ２０１３／０８２５２９、米国特許出願公開第２０１４／０３４２００３号、およびＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６１３７５に記載されているポリマーを含む。
好ましい天然のポリマーは、アルギネートおよび他の多糖、コラーゲン、アルブミンおよび他の親水性タンパク質、ゼイン、および他のプロラミンならびに疎水性タンパク質、そのコポリマーおよび混合物を含む。一般に、これらの材料は酵素加水分解またはｉｎ ｖｉｖｏでの水への曝露により、表面侵食またはバルク侵食により分解する。
一部の実施形態では、非生分解性ポリマー、特に疎水性ポリマーを使用することができる。好ましい非生分解性ポリマーの例は、エチレン酢酸ビニル、ポリ（メタ）アクリル酸、無水マレイン酸と他の不飽和重合性モノマーのコポリマー、ポリ（ブタジエン無水マレイン酸）、ポリアミド、そのコポリマーおよび混合物、ならびにデキストラン、セルロース、およびその誘導体を含む。
他の適切な生分解性および非生分解性ポリマーは、ポリ酸無水物、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレンオキサイド、ポリ（エチレンテレフタレート）などのポリアルキレンテレフタレート（terepthalate）、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（酢酸ビニル）、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリビニルハライド、ポリビニルピロリドン、アクリル酸エステルおよびメタクリル酸エステルのポリマー、ポリシロキサン、ポリウレタンおよびそのコポリマー、変性セルロース、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、酢酸セルロース、セルロースプロピオネート、酢酸酪酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、カルボキシルエチルセルロース、三酢酸セルロース、セルロース硫酸ナトリウム、およびポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（メタクリル酸エチル）、ポリ（メタクリル酸ブチル）、ポリ（メタクリル酸イソブチル）、ポリ（メタクリル酸ヘキシル）、ポリ（メタクリル酸イソデシル）、ポリ（メタクリル酸ラウリル）、ポリ（メタクリル酸フェニル）、ポリ（アクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸イソプロピル）、ポリ（アクリル酸イソブチル）、ポリ（アクリル酸オクタデシル）などのポリアクリレートを含むがこれらに限定されない。これらの材料は単独で、物理的混合物（ブレンド）として、またはコポリマーとして使用してもよい。
ポリマーは、親水性または疎水性である生体接着性ポリマーでもよい。親水性ポリマーはＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）（ＮＯＶＥＯＮ（商標）が製造している高分子量、架橋、アクリル酸ベースのポリマー）、ポリカルボフィル、セルロースエステル、およびデキストランを含む。
放出速度制御ポリマーはポリマーマトリックスにまたは製剤におけるコーティングに含まれてもよい。使用してもよい速度制御ポリマーの例は、５、５０、１００または４０００ｃｐｓの粘度を有するヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、または異なる粘度のブレンド、エチルセルロース、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＲＳ１００、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＲＬ１００、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＮＥ ３０Ｄ（Ｒｏｈｍ Ａｍｅｒｉｃａにより供給される）などのメタクリル酸メチルである。ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｅ１００などの胃溶性ポリマーまたはＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｌ１００−５５Ｄ、Ｌ１００およびＳ１００などの腸溶性ポリマーは、速度制御ポリマーとブレンドしてｐＨ依存性放出動態を達成してもよい。アルギネート、ポリエチレンオキサイド、カルボキシメチルセルロース、およびヒドロキシエチルセルロースなどの他の親水性ポリマーを速度制御ポリマーとして使用してもよい。
これらのポリマーは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｒｒｅｎｔｏｎ、ＰＡ；Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ；Ｆｌｕｋａ、Ｒｏｎｋｏｎｋｏｍａ、ＮＹ；およびＢｉｏＲａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡなどの供給源から入手することが可能であり、または標準技法を使用して、これらのもしくは他の供給者から入手されるモノマーから合成することが可能である。
好ましい実施形態では、ナノ粒子はポリラクチド（ＰＬＡ）およびラクチドとグルコリドのコポリマー（ＰＬＧＡ）から製造されるポリマーで形成される。これらはヒトでの商業用途を確立させており長期にわたる安全性記録がある（Jiangら、Adv. Drug Deliv. Rev.、５７巻（３号）：３９１〜４１０頁)；AguadoおよびLambert、Immunobiology、１８４巻（２〜３号）：１１３〜２５頁（１９９２年）；Bramwellら、Adv. Drug Deliv. Rev.、５７巻（９号）：１２４７〜６５頁（２００５年））。これらのポリマーはｓｉＲＮＡを封入するのに使用されてきた（Yuanら、Jour. Nanosocience and Nanotechnology、６巻：２８２１〜８頁（２００６年）；Bradenら、Jour. Biomed. Nanotechnology、３巻：１４８〜５９頁（２００７年）；Khanら、Jour. Drug Target、１２巻：３９３〜４０４頁（２００４年）；Woodrowら、Nature Materials、８巻：５２６〜５３３頁（２００９年））。Murataら、J. Control. Release、１２６巻（３号）：２４６〜５４頁（２００８年）は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に対して標的化されたｓｉＲＮＡを封入したＰＬＧＡマイクロスフィアを腫瘍内に注射後腫瘍成長が阻害されたことを示した。しかし、これらのマイクロスフィアは飲食運動するには大きすぎて（３５〜４５μｍ）（ConnerおよびSchmid、Nature、４２２（６９２７）：３７〜４４頁（２００３年））、細胞により内部移行することが可能になる前に、ポリアルギニンまたはＰＥＩを有するポリプレックスとして抗ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡを細胞外に放出する必要があった。これらのマイクロ粒子はポリカチオンの毒性と粒子のサイズに起因して用途が限られることがある。ＰＬＧＡのナノ粒子（１００〜３００ｎｍ）は組織内に深く浸透することが可能であり、多くの細胞により容易に内部移行される（ConnerおよびSchmid、Nature、４２２（６９２７）：３７〜４４頁（２００３年））。
ナノ粒子は、数日から数週間の期間にわたり封入された核酸を放出するように設計することが可能である。放出の持続期間に影響を及ぼす因子は、周囲媒体のｐＨ（ＰＬＧＡの酸触媒加水分解に起因してｐＨ５でおよびそれより下でより大きな放出速度）およびポリマー組成を含む。脂肪族ポリエステルは疎水性が異なり、分解速度に影響を及ぼす。具体的には、疎水性ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、さらに疎水性のポリ（グリコール酸）ＰＧＡおよびそのコポリマー、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）は様々な放出速度を有する。これらのポリマーの分解速度、および多くの場合、対応する薬物放出速度は数日（ＰＧＡ）から数か月（ＰＬＡ）まで変動し得、ＰＬＡ対ＰＧＡの比を変えることにより容易に操作される。
例示的なナノ粒子は、米国特許第４，８８３，６６６号、同第５，１１４，７１９号、同第５，６０１，８３５号、同第７，５３４，４４８号、同第７，５３４，４４９号、同第７，５５０，１５４号、および同第８，８８９，１１７号、ならびに米国特許出願公開第２００９／０２６９３９７号、同第２００９／０２３９７８９号、同第２０１０／０１５１４３６号、同第２０１１／０００８４５１号、同第２０１１／０２６８８１０号、同第２０１４／０３４２００３号、同第２０１５／０１１８３１１号、同第２０１５／０１２５３８４号、同第２０１５／００７３０４１号、Hubbellら、Science、３３７巻：３０３〜３０５頁（２０１２年）、Chengら、Biomaterials、３２巻：６１９４〜６２０３頁（２０１１年）、Rodriguezら、Science、３３９巻：９７１〜９７５頁（２０１３年）、Hrkachら、Sci Transl Med.、４巻：１２８ｒａ１３９（２０１２年）、McNeerら、Mol Ther.、１９巻：１７２〜１８０頁（２０１１年）、McNeerら、Gene Ther.、２０巻：６５８〜６５９頁（２０１３年）、Babarら、Proc Natl Acad Sci USA、１０９巻：Ｅ１６９５〜Ｅ１７０４頁（２０１２年）、Fieldsら、J Control Release １６４巻：４１〜４８頁（２０１２年）、およびFieldsら、Advanced Healthcare Materials、３６１〜３６６頁（２０１５年）に記載されている。
Ｂ．ポリカチオン
好ましい実施形態では、核酸は、ナノ粒子中への核酸の封入効率を増加させるためにポリカチオンに複合体化される。用語「ポリカチオン」とは、選択されたｐＨ、好ましくは生理的ｐＨで、正電荷、好ましくは少なくとも２つの正電荷を有する化合物を指す。ポリカチオン部分は、選択されたｐＨ値で、約２から約１５の間の正電荷、好ましくは、約２から約１２の間の正電荷、さらに好ましくは、約２から約８の間の正電荷を有する。
当技術分野では多くのポリカチオンが知られている。ポリカチオンの適切な構成要素は、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、リジンおよびヒスチジンなどの塩基性アミノ酸およびその誘導体；カチオン性デンドリマー；ならびにアミノ多糖類を含む。適切なポリカチオンは、構造が線形テトラリジンなどの線形、枝分かれまたは樹枝状でも可能である。
例示的なポリカチオンは、アクリルアミドおよび２−アクリルアミド−２−メチルプロパントリメチルアミンに基づく合成ポリカチオン、ポリ（Ｎ−エチル−４−ビニルピリジン）または類似する四級化（quartemized）ポリピリジン、ジエチルアミノエチルポリマーとデキストランコンジュゲート、ポリミキシンＢ硫酸塩、リポポリアミン、強いポリカチオンであるポリ（ジメチルジアリルアンモニウムクロリド）などのポリ（アリルアミン）、ポリエチレンイミン、ポリブレン、ならびにプロタミンなどのポリペプチド、ヒストンポリペプチド、ポリリジン、ポリアルギニンおよびポリオルニチンを含むがこれらに限定されない。
一実施形態では、ポリカチオンはポリアミンである。ポリアミンは２つまたはそれよりも多い第一級アミン基を有する化合物である。好ましい実施形態では、ポリアミンは、原核細胞または真核細胞で産生される天然に存在するポリアミンである。天然に存在するポリアミンは、規則的に離間した間隔で見出され、したがって、核酸との複合体化に特に適しているカチオンを有する化合物を表す。ポリアミンは、ＤＮＡ合成および遺伝子発現などの極めて基礎的な遺伝的過程で重要な役割を果たす。ポリアミンは、植物および動物における細胞遊走、増殖および分化にとり不可欠である。ポリアミンおよびアミノ酸前駆体の代謝レベルは極めて重要であり、したがって、生合成および分解は緊密に調節されている。適切な天然に存在するポリアミンは、スペルミン、スペルミジン、カダベリンおよびプトレシンを含むがこれらに限定されない。好ましい実施形態では、ポリアミンはスペルミジンである。
別の実施形態では、ポリカチオンは環状ポリアミンである。環状ポリアミンは当技術分野では公知であり、例えば、米国特許第５，６９８，５４６号、ＷＯ１９９３／０１２０９６、およびＷＯ２００２／０１０１４２に記載されている。例示的な環状ポリアミンはサイクレンを含むがこれに限定されない。
スペルミンおよびスペルミジンは、ＯＤＣ（オルニチン脱炭酸酵素）の作用によりＬ−オルニチンから生成されるプトレシン（１，４−ジアミノブタン）の誘導体である。Ｌ−オルニチンは、アルギナーゼによるＬ−アルギニン分解の生成物である。スペルミジンは、脱炭酸Ｓアデノシルメチオニン（ｄｃＡｄｏＭｅｔ）３−アミノプロピルドナーを用いたプトレシン（１，４−ジアミノブタン）のモノアルキル化を触媒するスペルミジンシンターゼ（ＳｐｄＳ）により生成されるトリアミン構造物である。３−アミノプロピルドナーを用いたプトレシンの両アミノ基のフォーマルアルキル化により対称性のテトラアミンスペルミンが得られる。スペルミンの生合成は、ｄｃＡｄｏＭｅｔの存在下でスペルミンシンターゼ（ＳｐｍＳ）の効果によりスペルミジンまで進む。３−アミノプロピルドナー（ｄｃＡｄｏＭｅｔ）は、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼによるＬ−メチオニンの逐次変換、続いてＡｄｏＭｅｔＤＣ（Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素）による脱炭酸によりＳ−アデノシルメチオニンから生じる。したがって、プトレシン、スペルミジンおよびスペルミンは、アミノ酸Ｌ−アルギニン（Ｌ−オルニチン、プトレシン）およびＬ−メチオニン（ｄｃＡｄｏＭｅｔ、アミノプロピルドナー）に由来する代謝物である。
一部の実施形態では、粒子それ自体はポリカチオン（例えば、ＰＬＧＡとポリ（ベータアミノエステル）のブレンド）である。
Ｃ．カップリング剤またはリガンド
ポリマーナノ粒子の外表面は、ナノ粒子の表面にカップリング剤またはリガンドをコンジュゲートする、または組み込むことにより改変してもよい。
好ましい実施形態では、カップリング剤はナノ粒子の表面に高密度で存在している。本明細書で使用されるように、「高密度」とは、好ましくは、１平方ミクロンのナノ粒子表面積当たり１，０００から１０，０００，０００、さらに好ましくは、１０，０００から１，０００，０００のリガンドの範囲で、高密度のリガンドまたはカップリング剤を有するポリマーナノ粒子のことである。これは、溶解した粒子の蛍光染色およびこの蛍光を溶液中の既知量の遊離の蛍光分子に較正することにより測定することが可能である。
カップリング剤はポリマーナノ粒子と会合し、ナノ粒子に機能的エレメントのモジュラー組み立ておよび解体を促進する基材を提供する。カップリング剤またはリガンドは、疎水性相互作用、静電相互作用および共有結合カップリングを含むがこれらに限定されない種々の相互作用によりナノ粒子と会合することができる。
好ましい実施形態では、カップリング剤は、ポリマー相親水性−親油性バランスに適合する分子である。親水性−親油性バランスは１から１５の範囲である。低親水性−親油性バランスを有する分子の方がより親油性（lipid loving）であり、したがって油中水型エマルジョンを作製する傾向があり、高親水性−親油性バランスを有する分子の方がより親水性であり、水中油型エマルジョンを作製する傾向がある。脂肪酸および脂質は１０未満の低親水性−親油性バランスを有する。
範囲１〜１０、さらに好ましくは１から６の間、最も好ましくは１から５までの間の親水性−親油性バランスを有するいかなる両親媒性ポリマーでもカップリング剤として使用することができる。疎水性相互作用を介してポリマーナノ粒子に会合することができるカップリング剤の例は、脂肪酸、疎水性または両親媒性ペプチドまたはタンパク質、およびポリマーを含むがこれらに限定されない。このクラスのカップリング剤はいかなる組合せでもまたは比率でも使用することができる。好ましい実施形態では、アダプターエレメントとナノ粒子との会合により、数週間持続することが可能な機能的エレメントの長期の提示が促進される。
カップリング剤は、種々の官能基を通じて共有結合相互作用によりポリマーナノ粒子に結合することも可能である。官能性とは、粒子の表面に存在するおよび結合する分子上に存在する機能的化学基（カルボン酸、アルデヒド、アミン、スルフヒドリルおよびヒドロキシル）を介して粒子の表面に分子がコンジュゲートすることを言う。
官能性は２つの方法で粒子内に導入することができる。第１は、ナノ粒子の調製中、例えば、機能的化学基を有する安定化剤を組み込むことによるナノ粒子のエマルジョンの調製中である。適切な安定化剤は、ナノ粒子の外表面に会合する疎水性または両親媒性分子を含む。
第２は、ホモ二官能性架橋剤またはヘテロ二官能性架橋剤で粒子とリガンドとを直接架橋することによる粒子調製後（post-particle preparation）である。この第２の手順は、適切な化学および１クラスの架橋剤（ＣＤＩ、ＥＤＡＣ、グルタルアルデヒド類、等、下でさらに詳細に考察される）または調製後粒子表面の化学修飾により粒子表面へリガンドをカップリングさせる他のいかなる架橋剤でも使用することができる。この第２のクラスは、脂肪酸、脂質または機能的安定化剤などの両親媒性分子を粒子表面に受動的に吸着または接着させ、それによってリガンドに繋ぎ止めるための機能的末端基を導入することができるプロセスも含む。
１つの有用なプロトコールは、ＤＭＳＯ、アセトン、またはＴＨＦなどの非プロトン溶媒中の作用物質（agent）カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）を用いたポリマー鎖上のヒドロキシル基の「活性化」を含む。ＣＤＩは、タンパク質などの分子の遊離アミノ基を結合させることにより置き換えてもよいヒドロキシル基とカルバミン酸イミダゾリル複合体を形成する。その反応はＮ−求核置換であり、ポリマーへの分子の安定なＮ−アルキルカルバメート連結を生じる。「活性化された」ポリマーマトリックスへの分子の「カップリング」は９〜１０の範囲のｐＨで最大であり、通常は少なくとも２４時間かかる。得られた分子−ポリマー複合体は安定であり長期間加水分解に耐える。
別のカップリング法は、Ｎ−ヒドロキシルスルホスクシンイミド（スルホＮＨＳ）と併せて１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）または「水溶性ＣＤＩ」を使用して、７．０の生理的ｐＨで全くの水性環境においてポリマーの露出したカルボキシル基を分子の遊離アミノ基にカップリングさせることを含む。手短に言えば、ＥＤＡＣとスルホＮＨＳは、ポリマーのカルボン酸基と活性化されたエステルを形成し、このカルボン酸基は分子のアミン末端と反応してペプチド結合を形成する。得られたペプチド結合は加水分解に耐性である。反応においてスルホＮＨＳを使用すると１０倍の因数でＥＤＡＣカップリングの効率を増加させ、分子−ポリマー複合体の存続（viability）を保証する例外的に穏やかな条件を提供する。
これらのプロトコールのどちらかを使用することにより、ポリマーマトリックスを溶解しない適切な溶媒系においてヒドロキシル基またはカルボキシル基を含有するほとんどすべてのポリマーを「活性化する」ことが可能である。
遊離のヒドロキシル基およびカルボキシル基を有する分子をポリマーに結合させるのに有用なカップリング手順は、架橋剤、ジビニルスルホンの使用を含む。この方法は、糖または生体接着性特性を有する他のヒドロキシル化合物（hydroxylic compound）をヒドロキシルマトリックスに結合させるのに有用なはずである。手短に言えば、活性化は、ジビニルスルホンをポリマーのヒドロキシル基に反応させて、ポリマーのビニルスルホニルエチルエーテルを形成させることを含む。ビニル基はアルコール、フェノールおよびアミンにもカップリングする。活性化とカップリングはｐＨ１１で起こる。連結は１〜８の範囲のｐＨで安定であり、腸中の通過に適している。
ＵＶ架橋の使用を含む、分子と二重結合にあるポリマーをカップリングするための当業者には公知であるいかなる適切なカップリング法でも分子のポリマーへの結合に使用してよい。
一実施形態では、カップリング剤は親和性タグにコンジュゲートすることが可能である。親和性タグは限定された結合パートナーと高度に特異的な非共有結合性の生理化学的相互作用を形成する任意の分子種である。互いに高度に特異的な非共有結合性の生理化学的相互作用を形成する親和性タグは本明細書では「相補的である」と定義される。適切な親和性タグ対は当技術分野では周知であり、エピトープ／抗体、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、ビオチン／ニュートラアビジン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、マルトース結合タンパク質／アミラーゼおよびマルトース結合タンパク質／マルトースを含む。エピトープ／抗体結合対に使用することができる適切なエピトープの例は、ＨＡ、ＦＬＡＧ、ｃ−Ｍｙｃ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、Ｈｉｓ６、ＧＦＰ、ＤＩＧ、ビオチンおよびアビジンを含むがこれらに限定されない。これらのエピトープに結合する抗体（モノクローナルとポリクローナルの両方およびその抗原結合断片）は当技術分野では周知である。
カップリング剤にコンジュゲートされる親和性タグは、カップリング剤にコンジュゲートされる相補的親和性タグと高度に特異的な非共有結合性の生理化学的相互作用を形成する親和性タグにコンジュゲートされている機能的エレメントの高度に柔軟性のあるモジュラー組み立ておよび解体を可能にする。アダプターエレメントは単一種の親和性タグでまたはいかなる比での親和性タグ種のいかなる組合せでもコンジュゲートすることができる。アダプターエレメントにコンジュゲートされた親和性タグの種の数およびその比を変化させる能力は、ナノ粒子に結合することができる機能的エレメントの数およびその比に対する精巧な制御を可能にする。
別の実施形態では、カップリング剤は、直接的な共有結合相互作用によるなどの親和性タグの非存在下で機能的エレメントに直接結合する。カップリング剤は少なくとも１種の機能的エレメントに共有結合によりカップリングさせることが可能である。カップリング剤は、単一種の機能的エレメントにまたはいかなる比での機能的エレメントの種のいかなる組合せでも共有結合によりカップリングさせることが可能である。
好ましい実施形態では、カップリング剤は、相補的親和性タグにコンジュゲートされるモジュラー機能的エレメントの組み立ておよび解体を提供する少なくとも１つの親和性タグにコンジュゲートされる。さらに好ましい実施形態では、カップリング剤は少なくとも１つの親和性タグにコンジュゲートしている脂肪酸である。特に好ましい実施形態では、カップリング剤はアビジンまたはストレプトアビジンにコンジュゲートされる脂肪酸である。アビジン／ストレプトアビジンにコンジュゲートした脂肪酸は、多種多様な、ビオチンにコンジュゲートした機能的エレメントの結合を可能にする。
カップリング剤は好ましくは、ナノ粒子上に、またはナノ粒子の表面に高密度で提供される。この高密度のカップリング剤は、種々の種の機能的エレメントへのポリマーナノ粒子のカップリングを可能にし、それでも効果的であるのに十分な多数で機能的エレメントが存在することを可能にする。
１．脂肪酸
カップリング剤は脂肪酸を含んでいてもよい。脂肪酸はいかなるアシル鎖長でもよく、飽和でも不飽和でもよい。特に好ましい実施形態では、脂肪酸はパルミチン酸である。他の適切な脂肪酸は、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸およびベヘン酸などの飽和脂肪酸を含むがこれらに限定されない。さらに他の適切な脂肪酸は、オレイン酸、リノール酸、アルファリノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸およびエルカ酸などの不飽和脂肪酸を含むがこれらに限定されない。
２．疎水性または両親媒性ペプチド
カップリング剤は疎水性または両親媒性ペプチドを含んでいてもよい。好ましいペプチドは水性環境全体でポリマーナノ粒子に優先的に会合するのに十分疎水性であるべきである。アダプターエレメントとして有用である両親媒性ポリペプチドは、一末端では大部分が疎水性でありもう一方の末端では大部分が親水性であることができる。そのような両親媒性ペプチドはペプチドの疎水性末端を通じてポリマーナノ粒子と会合し、親水性末端で官能基にコンジュゲートすることができる。
３．疎水性ポリマー
カップリング剤は疎水性ポリマーを含んでいてもよい。疎水性ポリマーの例は、ポリ酸無水物、ポリ（オルト）エステル、およびポリカプロラクトンなどのポリエステルを含むがこれらに限定されない。
ＶＩＩ．機能的分子
機能的分子は、遺伝子編集技術、増強剤、またはその送達に利用されるナノ粒子に直接的にまたは間接的に会合する、連結する、コンジュゲートする、または他の方法で結合することができる。
Ａ．標的化分子
１クラスの機能的エレメントは標的化分子である。標的化分子は、遺伝子編集分子に、またはナノ粒子もしくは他のその送達ビヒクルに直接的にまたは間接的に会合する、連結する、コンジュゲートする、または他の方法で結合することができる。
標的化分子は、標的細胞の表面で受容体または他の分子に結合するタンパク質、ペプチド、核酸分子、糖または多糖でありうる。移植片への結合の特異性の程度およびアビディティは、標的化分子の選択を通じてモジュレートすることができる。例えば、抗体は極めて特異的である。これらは、ポリクローナル、モノクローナル、断片、組換え体、または一本鎖でありえ、その多くが市販されているかまたは標準技法を使用して容易に入手される。
部分の例は、例えば、特定の細胞への分子、例えば、造血幹細胞、ＣＤ３４＋細胞、Ｔ細胞または他のいかなる好ましい細胞型でも、ならびに、好ましい細胞型において発現される受容体およびリガンドへの抗体の送達を提供する標的化部分を含む。好ましくは、部分は造血幹細胞を標的とする。
細胞外マトリックス（「ＥＣＭ」）を標的化する分子の例は、グリコサミノグリカン（「ＧＡＧ」）およびコラーゲンを含む。一実施形態では、ポリマー粒子の外表面は、選択された細胞または組織と相互作用する粒子の能力を増強するように改変することができる。標的化分子にコンジュゲートされたアダプターエレメントが粒子内に挿入される上記方法が好ましい。しかし、別の実施形態では、カルボキシ末端を有するポリマーマイクロ粒子またはナノ粒子の外表面を遊離のアミン末端を有する標的化分子に連結させてもよい。
ポリマーマイクロ粒子およびナノ粒子に結合する他の有用なリガンドは、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を含む。ＰＡＭＰは細胞もしくは組織の表面のトール様受容体（ＴＬＲ）を標的とする、または細胞もしくは組織に内部にシグナルを送り、それによって取込みを潜在的に増やす。粒子表面にコンジュゲートされたまたは共封入されたＰＡＭＰは、非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡ（細菌）、二本鎖ＲＮＡ（ウイルス）、リポ多糖（細菌）、ペプチドグリカン（細菌）、リポアラビノマンナン（lipoarabinomannin）（細菌）、ザイモサン（酵母）、ＭＡＬＰ−２などのマイコプラズマリポタンパク質（細菌）、フラジェリン（細菌）、ポリ（イノシン−シチジル）酸（poly(inosinic-cytidylic) acid）（細菌）、リポテイコ酸（細菌）またはイミダゾキノリン（合成）を含むことができる。
別の実施形態では、粒子の外表面はマンノースアミンを使用して処理し、それによって粒子の外表面をマンノシル化することができる。この処理により、粒子は抗原提示細胞表面のマンノース受容体で標的細胞または組織に結合することができる。代わりに、Ｆｃ部分（Ｆｃ受容体を標的とする）を含有する免疫グロブリン分子（Ｆｃ受容体を標的とする）、熱ショックタンパク質部分（ＨＳＰ受容体）、ホスファチジルセリン（スカベンジャー受容体）、およびリポ多糖（ＬＰＳ）との表面コンジュゲーションは細胞または組織上の追加の受容体標的である。
マイクロ粒子およびナノ粒子に共有結合して粒子をムチンおよび粘膜細胞層に対して標的特異的にすることが可能なレクチンは、Abrus precatroius、Agaricus bisporus、Anguilla anguilla、Arachis hypogaea、Pandeiraea simplicifolia、Bauhinia purpurea、Caragan arobrescens、Cicer arietinum、Codium fragile、Datura stramonium、Dolichos biflorus、Erythrina corallodendron、Erythrina cristagalli、Euonymus europaeus、Glycine max、Helix aspersa、Helix pomatia、Lathyrus odoratus、Lens culinaris、Limulus polyphemus、Lysopersicon esculentum、Maclura pomifera、Momordica charantia、Mycoplasma gallisepticum、Naja mocambiqueから単離されるレクチン、ならびにレクチンであるコンカナバリンＡ、スクシニル−コンカナバリンＡ、Triticum vulgaris、Ulex europaeus I、IIおよびIII、Sambucus nigra、Maackia amurensis、Limax fluvus、Homarus americanus、Cancer antennarius、ならびにLotus tetragonolobusから単離されるレクチンを含む。
標的化分子の選択は、ナノ粒子組成物の投与方法および標的とする細胞または組織に依存する。標的化分子は一般的に、細胞または組織に対する粒子の結合親和性を増加させることができるかまたは、ナノ粒子を器官中の特定の組織もしくは組織中の特定の細胞型に向かわせることができる。アビジンはポリマーナノ粒子が組織に結合する能力を増加する。組織へのアビジン被覆粒子の増強された結合の正確な機構は解明されていないが、この結合は正電荷アビジンから組織の負電荷細胞外マトリックスへの静電引力により引き起こされると仮定されている。静電相互作用に起因するアビジンの非特異的結合は以前に記述されており、アビジン被覆ＰＬＧＡ粒子のゼータ電位測定により、非被覆ＰＬＧＡ粒子と比べた場合、正電荷表面であることが明らかにされた。
ポリエチレンイミンまたはポリリジンなどのいかなる正電荷リガンドのいかなるポリマー粒子への結合も、ビーズを被覆するカチオン基の、粘液の正味負電荷への静電引力に起因する生物接着性を改善することができる。ムチン層のムコ多糖およびムコタンパク質、特にシアル酸残基は負電荷コーティングに関与する。ムチンに対して高結合親和性を有するいかなるリガンドも、適当な化学を用いて大半の粒子に共有結合で連結させ、腸への粒子の結合に影響を及ぼすと予想することも可能である。例えば、ムチンまたは代わりに無傷のムチンの成分に対して産生されるポリクローナル抗体は、粒子に共有結合によりカップリングされる場合、生物接着性の増加を提供することになる。同様に、腸管の管腔表面に露出した特定の細胞表面受容体に対して向けられた抗体は、適当な化学を使用して粒子にカップリングさせた場合、ビーズの滞留時間を増やすことになる。リガンド親和性は静電荷のみに基づく必要はないが、ムチン中の可溶性または代わりに炭水化物基への特異的親和性などの他の有用な物理的パラメータに基づく必要がある。
純粋なまたは部分的に精製された形態のいずれかのムチンの天然成分のいずれかの粒子への共有結合は、ビーズ−腸界面の表面張力を減らしムチン層中でのビーズの可溶性を増やすことになる。有用なリガンドの一覧表は、以下：シアル酸、ノイラミン酸、ｎ−アセチルノイラミン酸、ｎ−グリコリルノイラミン酸、４−アセチル−ｎ−アセチルノイラミン酸、ジアセチル−ｎ−アセチルノイラミン酸、グルクロン酸、イズロン酸、ガラクトース、グルコース、マンノース、フコース、天然に存在するムチンの化学的処理により調製される部分的に精製された画分のいずれか、例えば、ムコタンパク質、ムコ多糖およびムコ多糖−タンパク質複合体、ならびに粘膜表面のタンパク質または糖構造体に対して免疫反応性の抗体を含むがこれらに限定されない。
余分なペンダントカルボン酸側基を含有するポリアミノ酸、例えば、ポリアスパラギン酸およびポリグルタミン酸の結合も生体接着性を増加させる有用な手段を提供するはずである。１５，０００から５０，０００ｋＤａ分子量範囲のポリアミノ酸を使用すると、粒子表面に結合している１２０から４２５アミノ酸残基の鎖が得られる。ポリアミノ鎖はムチン鎖での鎖の絡み合い（entanglement）によりならびにカルボン酸電荷の増加により生体接着性を増加させる。
ナノ粒子の効力は、一部、身体へのその投与経路により決定される。経口的におよび局所的に投与されるナノ粒子では、上皮細胞が生物の内部を外部世界と切り離す主要な障壁を構成する。消化管を裏打ちする上皮細胞などの上皮細胞は、細胞外体液区画および体外空間に同時に直面する連続する単層を形成する。
細胞への粘着はこれらの機構のいずれかにより上皮障壁を通過する際の不可欠な第１段階である。したがって、一実施形態では、本明細書で開示されるナノ粒子は、上皮細胞標的化分子をさらに含む。上皮細胞標的化分子は、上皮細胞の表面に表示されるエピトープを認識してそれに結合するモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体またはその生体活性な断片を含む。上皮細胞標的化分子は、上皮細胞上の細胞表面受容体に結合するリガンドも含む。リガンドは、ポリペプチド、ヌクレオチドおよび多糖などの分子を含むがこれらに限定されない。
上皮細胞上の種々の受容体は上皮細胞標的化分子によって標的とすることができる。標的とされる適切な受容体の例は、ＩｇＥ Ｆｃ受容体、ＥｐＣＡＭ、選択された炭水化物特異体（carbohydrate specificites）、ジペプチジルペプチダーゼ、およびＥ−カドヘリンを含むがこれらに限定されない。
Ｂ．タンパク質形質導入ドメインおよび融合性ペプチド
遺伝子編集分子、増強剤に、またはナノ粒子もしくは他のその送達ビヒクルに直接的にまたは間接的に会合する、連結する、コンジュゲートする、または他の方法で結合することができる他の機能的エレメントは、タンパク質形質導入ドメインおよび融合性ペプチドを含む。
例えば、ナノ粒子送達システムの効率も、ＮＰ表面への機能的リガンドの結合により改善することができる。潜在的リガンドは、小分子、細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）、標的化ペプチド、抗体またはアプタマーを含むがこれらに限定されない（Yuら、PLoS One.、６巻：ｅ２４０７７頁（２０１１年）、Cuら、J Control Release、１５６巻：２５８〜２６４頁（２０１１年）、Nieら、J Control Release、１３８巻：６４〜７０頁（２００９年）、Cruzら、J Control Release、１４４巻：１１８〜１２６頁（２０１０年））。これらの部分の結合は、細胞内取り込みの誘導、エンドソーム破壊、および核へのプラスミドペイロードの送達などの種々の異なる機能を果たす。リガンドを粒子表面に繋ぎ止める数多くの方法が用いられてきた。１つのアプローチは、ＰＬＧＡ ＮＰ上の官能基への直接的な共有結合である（Bertram、Acta Biomater.５巻：２８６０〜２８７１頁（２００９年））。別のアプローチは、ビオチン化リガンドをＮＰ表面に固定するアビジンパルミテートのような両親媒性コンジュゲートを利用する（Fahmyら、Biomaterials、２６巻：５７２７〜５７３６頁（２００５年）、Cuら、Nanomedicine、６巻：３３４〜３４３頁（２０１０年））。このアプローチは、細胞中への取込みが増強されているがｐＤＮＡ放出および遺伝子トランスフェクションが低減している粒子を産出し、これはおそらくｐＤＮＡ放出を妨げる表面改変に起因する。類似するアプローチでは、脂質コンジュゲートポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、ペネトラチン、ＣＰＰ、またはフォレートの多価リンカーとして使用される（Chengら、Biomaterials、３２巻：６１９４〜６２０３頁（２０１１年））。
これらの方法、ならびに本明細書で考察される他の方法、および当技術分野で公知の他の方法を組み合わせて粒子機能および効力を調整することが可能である。一部の好ましい実施形態では、ＰＥＧは機能的分子をナノ粒子に連結するためのリンカーとして使用される。例えば、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）−マレイミドは市販されており、ＣＰＰなどの機能的分子を共有結合させるために使用することができる。
「タンパク質形質導入ドメイン」またはＰＴＤとは、脂質二重層、ミセル、細胞膜、オルガネラ膜、または小胞膜の通過を促進するポリペプチド、ポリヌクレオチド、または有機もしくは無機化合物のことである。別の分子に結合されたＰＴＤは、分子が膜を通過する、例えば、細胞外空間から細胞内空間へ、またはサイトゾルからオルガネラ内へ進むことを促進する。ＰＴＡは、多くの細胞タンパク質およびウイルスタンパク質に存在するペプチド配列などの短い塩基性ペプチド配列であり得る。当技術分野で周知の例示的なタンパク質形質導入ドメインは、アンテナペディアＰＴＤおよびＴＡＴ（転写のトランス活性化因子）ＰＴＤ、ポリアルギニン、ポリリジンもしくはアルギンとリジンの混合物、ＨＩＶ ＴＡＴ（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号７）またはＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号８））、１１アルギニン残基、ＶＰ２２ペプチド、およびＡＮＴｐペプチド（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号９））または８〜１５残基、好ましくは９〜１１残基を有する正電荷ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドを含むがこれらに限定されない。アミンまたはグアニジウム基が豊富な短い非ペプチドポリマーも生体膜を通過して分子を運ぶことができる。ペネトラチンおよびアンテナペディア由来のペプチドの他の誘導体（Chengら、Biomaterials、３２巻（２６号）：６１９４〜２０３頁（２０１１年））も使用することができる。結果によれば、追加のＡｒｇが付加されているペネトラチンが取込みおよびエンドソーム脱出をさらに増強し、かつ、浸透のためのアンテナペディアドメインおよびＮＦｋＢの活性化を遮断するドメインを有するＩＫＫ ＮＢＤが、肺において他の目的で安全に使用されたことが示されている（von Bismarckら、Pulmonary Pharmacology & Therapeutics、２５巻（３号）：２２８〜３５頁（２０１２年）、Kameiら、Journal Of Pharmaceutical Sciences、１０２巻（１１号）：３９９８〜４００８頁（２０１３年））。
「融合性ペプチド」は、膜不安定化能力のある任意のペプチドである。一般に、融合性ペプチドは、膜などの疎水性表面の存在下では両親媒性アルファヘリックス構造体を形成する傾向がある。融合性ペプチドが存在すると、膜リン脂質の秩序立ったパッキングを破壊することにより細胞膜にポアの形成を誘導する。一部の融合性ペプチドは脂質障害を促進するように作用し、このようにして、様々な性質の２つの膜で覆われた（enveloped）粒子（例えば、細胞、エンベロープ型ウイルス、リポソーム）の近位置の膜が合体するかまたは融合する機会を増強する。他の融合性ペプチドは２つの膜に同時に結合し得、膜の合体を引き起こして膜が融合して１つになることを促進する。融合性ペプチドの例は、ウイルスエンベロープタンパク質外部ドメイン由来の融合ペプチド、細胞質尾部由来のウイルスエンベロープタンパク質膜−近位ドメインの膜不安定化ペプチドを含む。
他の融合性ペプチドは多くの場合、両親媒性領域も含有する。両親媒性領域含有ペプチドの例は、メリチン、マガイニン、ＨＩＶ１ ｇｐ４１の細胞質尾部、ボンボリチン１（bomolitin 1）、パルダキシン、マストパラン、クラブロリン（crabrolin）、セクロピン、エントアメーバ、およびブドウ球菌性アルファ毒素などの微生物および爬虫類細胞傷害性ペプチド；（１）ウイルスエンベロープタンパク質の膜貫通（ＴＭ）ドメインのＮ末端の領域、例えば、ＨＩＶ−１、ＳＩＶ、インフルエンザ、ポリオ、ライノウイルス、およびコクサッキーウイルス；（２）ＴＭ外部ドメインの内部領域、例えば、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルスおよび精子タンパク質ＰＨ−３０由来の融合ペプチド：（３）例えば、トリ白血症ウイルス（ＡＬＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、および脾壊死ウイルス（ＳＮＶ）におけるウイルスエンベロープタンパク質の細胞質側の膜近位領域を含む。
特定の実施形態では、ＣＰＰなどの機能的分子は、Fieldsら、J Control Release、１６４巻（１号）：４１〜４８頁（２０１２年）に記載される方法などの公知の方法を使用して、ＰＢＡＥ／ＰＬＧＡブレンド粒子などのＤＳＰＥ−ＰＥＧ−マレイミド官能化ナノ粒子に共有結合で連結される。例えば、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ機能分子は、第２のエマルジョンの形成中に５．０％ ＰＶＡ溶液に添加することが可能である。一部の実施形態では、ローディング比は約５ｎｍｏｌ／ｍｇリガンド対ポリマー比である。
一部の実施形態では、機能的分子は上の分子などのＣＰＰ、またはｍＴＡＴ（ＨＩＶ−１（ヒスチジン修飾を有する）ＨＨＨＨＲＫＫＲＲＱＲＲＲＲＨＨＨＨＨ（配列番号１０）（Yamanoら、J Control Release、１５２巻：２７８〜２８５頁（２０１１年））；またはｂＰｒＰｐ（ウシプリオン）ＭＶＫＳＫＩＧＳＷＩＬＶＬＦＶＡＭＷＳ ＤＶＧＬＣＫＫＲＰＫＰ（配列番号１１）（Magzoubら、Biochem Biophys Res Commun.、３４８巻：３７９〜３８５頁（２００６年））；またはＭＰＧ（合成キメラ：ＳＶ４０ Ｌｇ Ｔ．Ａｎｔ．＋ＨＩＶ ｇｂ４１コート）ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳ ＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１２）（Endohら、Adv Drug Deliv Rev.６１巻：７０４〜７０９頁（２００９年））である。
ＶＩＩＩ．製造方法
Ａ．ナノ粒子を作製する方法
本明細書に記載されるナノ粒子組成物は種々の方法により調製することができる。
１．ポリカチオン
一部の実施形態では、核酸は最初にポリカチオンに複合体化される。複合体形成は、核酸とポリカチオンを適当なモル比で混合することにより達成することが可能である。ポリアミンがポリカチオン種として使用される場合、ポリアミン窒素対ポリヌクレオチドリン酸のモル比（Ｎ／Ｐ比）を決定することは有用である。好ましい実施形態では、核酸とポリアミンは一緒に混合され、おおよそ８対１から１５対１の間のＮ／Ｐ比で複合体を形成する。特定のモル比を達成するのに必要なポリアミン溶液の体積は以下の式：

ここで、ＭＷ．ｎｕｃａｃｉｄ＝核酸の分子量、ＭＷ．Ｐ＝核酸のリン酸基の分子量、ΦＮ：Ｐ＝Ｎ：Ｐ比（ポリアミン由来の窒素対核酸由来のリン酸の比のモル比）、ＣＮＨ２，ｓｔｏｃｋ＝ポリアミン保存液の濃度、およびＭＷ，ＮＨ２＝ポリアミンの窒素当たりの分子量

に従って決定することが可能である。
核酸とのポリカチオン複合体形成は、ポリカチオンを含有する溶液と核酸を含有する溶液を混合することにより達成することができる。混合は任意の適当な温度で行うことができる。一実施形態では、混合は室温で行う。混合は、回転式振盪機の使用を介して達成することが可能であるような穏やかな撹拌で行うことができる。
２．例示的な好ましい製造方法
好ましい実施形態では、ナノ粒子は、米国特許出願公開第２０１１／０００８４５１号または米国特許出願公開第２０１１／０２６８８１０号（これらはそれぞれ参照により全体として具体的に取り込む）、またはFahmyら、Biomaterials、２６巻：５７２７〜５７３６頁（２００５年）、もしくはMcNeerら、Mol. Ther.１９巻、１７２〜１８０頁（２０１１年）に開示されているような二重エマルジョン溶媒蒸発技法により形成される。この技法では、核酸または核酸／ポリカチオン複合体は水溶液中で再構成される。核酸およびポリカチオン量は下でさらに詳細に考察され、例えば、米国特許出願公開第２０１１／０００８４５１号もしくは米国特許出願公開第２０１１／０２６８８１０号で開示され、またはMcNeerらにより（McNeerら、Mol. Ther.１９巻、１７２〜１８０頁（２０１１年））、もしくはWoodrowらにより低分子干渉ＲＮＡ封入（Woodrowら、Nat Mater、８巻：５２６〜５３３頁（２００９年））のために使用された量および比に基づいて選択することが可能である。次に、この水溶液は有機溶媒に溶解された所望のポリマーのポリマー溶液に滴下添加され、第１のエマルジョンを形成する。
次に、この混合物はポリビニルアルコール（ＰＶＡ）などの界面活性剤を含有する溶液に滴下添加され、超音波処理されて、二重エマルジョンを形成する。次に、最終エマルジョンは、水溶液中に界面活性剤を含有する溶液に注ぎ込み、一定時間撹拌してジクロロメタンを蒸発させ粒子を硬化させる。エマルジョンを形成するのに使用される界面活性剤の濃度、ならびに超音波処理時間および振幅は、所望の直径を有する粒子を調合するために当技術分野で公知の原理に従って最適化することが可能である。粒子は遠心分離により収集することが可能である。ナノ粒子を後に使用するために保存しておくのが望ましい場合は、ナノ粒子を急速冷凍して凍結乾燥することが可能である。
好ましい実施形態では、ナノ粒子はＰＬＧＡナノ粒子である。特定の例示的なプロトコールでは、ポリカチオン（スペルミジンなどの）含むかまたは含まない核酸（ＰＮＡ、ＤＮＡ、またはＰＮＡ−ＤＮＡなどの）はＤＮＡｓｅ／ＲＮＡｓｅを含まないＨ２Ｏに溶解する。Ｈ２Ｏ中の封入剤は、ジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶解した５０対５０エステル末端ＰＬＧＡのポリマー溶液に滴下添加し、次に超音波処理して第１のエマルジョンを形成することが可能である。次に、このエマルジョンは５％のポリビニルアルコールに滴下添加し、次に超音波処理して第２のエマルジョンを形成することが可能である。この混合物は０．３％のポリビニルアルコール中に注ぎ、室温で撹拌してナノ粒子を形成することが可能である。次に、ナノ粒子を収集し、例えば、Ｈ２Ｏで洗浄し、遠心分離により収集し、その後Ｈ２Ｏに再懸濁して、−８０℃で凍結させて凍結乾燥することが可能である。粒子は凍結乾燥に続いて−２０℃で保存することが可能である。
核酸とポリカチオン複合体をポリマーナノ粒子内に封入するための追加の技法は下に記載されている。
３．溶媒蒸発
この方法では、ポリマーは、塩化メチレンなどの揮発性有機溶媒に溶解される。薬物（可溶性または微粒子として分散型）は溶液に添加され、混合物はポリ（ビニルアルコール）などの界面活性剤を含有する水溶液に懸濁される。得られたエマルジョンは有機溶媒の大半が蒸発して、固体粒子が残るまで撹拌される。得られた粒子は水で洗浄されて凍結乾燥機で一晩乾燥される。サイズ（０．５〜１０００ミクロン）および形態が異なる粒子がこの方法により得られる。この方法はポリエステルおよびポリスチレンのような比較的安定なポリマーに有用である。
しかし、ポリ酸無水物などの不安定なポリマーは、水が存在するために製造プロセス中分解することがある。これらのポリマーでは、以下の２つの方法は、完全に無水の有機溶媒中で実施され、より有用である。
４．界面重縮合
界面重縮合を使用して、以下の様式でコア材料をマイクロカプセル封入する。１つのモノマーおよびコア材料を溶媒に溶解させる。第２のモノマーは、第１の溶媒と非混和性である第２の溶媒（典型的には水性）に溶解させる。エマルジョンは、第２の溶液中に第１の溶液を懸濁させ撹拌することにより形成される。エマルジョンが安定化した後は、イニシエータを水相に添加し、エマルジョンのそれぞれの液滴の界面で界面重縮合を生じさせる。
５．溶媒蒸発マイクロカプセル封入
溶媒蒸発マイクロカプセル封入では、ポリマーは典型的には水非混和性有機溶媒に溶解され、封入される材料は有機溶媒中の懸濁液または溶液としてポリマー溶液に添加される。エマルジョンは、この懸濁液または溶液を、勢いよく撹拌する水（エマルジョンを安定化させる、界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコールまたはポリビニルアルコールを含有することが多い）のビーカーに添加することにより形成される。有機溶媒は撹拌し続けながら蒸発させる。蒸発により、ポリマーが沈殿し、コア材料を含有する固体マイクロカプセルを形成する。
溶媒蒸発プロセスを使用して、ＰＬＡ、ＰＬＡ／ＰＧＡコポリマーなどのポリマー、またはＰＬＡ／ＰＣＬコポリマーマイクロカプセルに液体コア材料を取り込むことが可能である。ポリマーまたはコポリマーは、相分離（すなわち、曇り点）を生じることになる濃度のすぐ下の非溶媒濃度で、溶媒および非溶媒の混和性混合物に溶解する。液体コア材料を撹拌しながら溶液に添加して、エマルジョンを形成させ、材料を液滴として分散させる。溶媒および非溶媒を気化させ、溶媒の方がより速い速度で気化し、ポリマーまたはコポリマーが相分離してコア材料の液滴の表面の方に移動する。次に、この相分離溶液を撹拌した体積の非溶媒に移し、いずれの残っている溶解したポリマーまたはコポリマーを沈殿させ、形成された膜からいかなる残留溶媒も抽出する。その結果、液体材料のコアを有するポリマーまたはコポリマーシェルで構成されるマイクロカプセルが得られる。
溶媒蒸発マイクロカプセル封入は、０．５時間から数か月までの範囲の期間、ポリマー溶液中で不溶性活性剤粒子を安定化させることが可能である。分散相（典型的には揮発性有機溶媒）内で不溶性色素およびポリマーを安定化させることは、フィルムキャスティング（film casting）、溶媒蒸発、溶媒除去、噴霧乾燥、転相、他多数を含む、分散相に依存しているマイクロカプセル封入の大半の方法にとって有用でありうる。
ポリマー溶液内での不溶性活性剤粒子の安定化はスケールアップ中極めて重要になる可能性がある。分散相内で懸濁活性剤粒子を安定化することにより、粒子は、ポリマー溶液およびマイクロカプセル封入のプロセス中形成される、結果として得られるポリマーマトリックス全体で均一に分散したままでありうる。
溶媒蒸発マイクロカプセル封入（ＳＥＭ）はいくつかの利点がある。ＳＥＭは、粒子を封入するのに使用することができる均一な懸濁液の形成を支援する最も優れたポリマー−溶媒−不溶性粒子混合物の決定を可能にする。ＳＥＭはポリマー溶液内の不溶性粒子または色素を安定化し、それがスケールアップ中に役に立つ。なぜならば、不溶性粒子または色素の懸濁液を長時間そのままにしておくことができ、プロセスがさほど時間依存的、労働集約的なものにならなくなるからである。ＳＥＭは、封入された材料がさらに最適化されて放出されるナノ粒子の作出を可能にする。
６．ホットメルトマイクロカプセル封入
この方法では、ポリマーは最初に融解され、次に固体粒子と混合される。混合物は非混和性溶媒（シリコンオイルのような）に懸濁され、連続撹拌しながら、ポリマーの融点の５℃上まで加熱する。エマルジョンが安定化した後、ポリマー粒子が凝固するまでエマルジョンを冷却する。得られた粒子は石油エーテルを用いてデカンテーションにより洗浄し、流動性粉末を得る。０．５から１０００ミクロンの間のサイズを有する粒子がこの方法で得られる。この技法で調製される球の外表面は通常滑らかであり高密度である。この手順を使用して、ポリエステルおよびポリ酸無水物でできている粒子を調製する。しかし、この方法は１，０００〜５０，０００の間の分子量を有するポリマーに制限される。
７．溶媒除去マイクロカプセル封入
溶媒除去マイクロカプセル封入では、ポリマーは典型的には、油混和性有機溶媒に溶解され封入される材料は有機溶媒中の懸濁液または溶液としてポリマー溶液に添加される。界面活性剤を添加して封入される材料の分散を改善することが可能である。エマルジョンは、この懸濁液または溶液を勢いよく撹拌する油に添加することにより形成され、油はポリマー用の非溶媒であり、ポリマー／溶媒溶液は油中では非混和性である。有機溶媒は撹拌し続けながら油相に分散させることにより取り除かれる。溶媒の除去によりポリマーが沈殿し、コア材料を含有する固体マイクロカプセルが形成される。
８．相分離マイクロカプセル封入
相分離マイクロカプセル封入では、封入される材料は撹拌しながらポリマー溶液中に分散される。絶えず撹拌しながら材料を均一に懸濁する間に、ポリマー用の非溶媒は溶液にゆっくりと添加されポリマーの可溶性を減じていく。溶媒および非溶媒中のポリマーの可溶性に応じて、ポリマーは沈殿するかまたは相分離してポリマー豊富な相とポリマーの少ない相になる。適切な条件下では、ポリマーが豊富な相中のポリマーは連続相を有する界面に移動し、コア材料を外部ポリマーシェルのある液滴中に封入する。
９．自然乳化
自然乳化は、温度を変化させる、溶媒を蒸発させる、または化学架橋剤を添加することにより乳化液体ポリマー液滴を凝固することを含む。封入剤の物理的および化学的特性ならびに封入される材料により適切な封入法が指示される。疎水性、分子量、化学的安定性、および熱安定性などの因子が封入に影響を及ぼす。
１０．コアセルベーション
コアセルベーション技法を使用する種々の物質についての封入手順は、先行技術に、例えば、ＧＢ−Ｂ−９２９ ４０６；ＧＢ−Ｂ−９２９ ４０１；米国特許第３，２６６，９８７号、同第４，７９４，０００号、および同第４，４６０，５６３号に記載されている。コアセルベーションは、コロイド溶液を２つまたはそれよりも多い非混和性液体層に分離することを含むプロセスである（Ref. Dowben、R. General Physiology、Harper & Row、New York、１９６９年、１４２〜１４３頁）。コアセルベーションのプロセスを通じて、２つまたはそれよりも多い相で構成されコアセルベートとして公知の組成物を生成することができる。２相コアソルベート系を含む成分が両方の相に存在しているが、コロイドが豊富な相はコロイドが少ない相よりも高い濃度の構成成分を有する。
１１．溶媒除去
この技法は主にポリ酸無水物のために設計されている。この方法では、薬物は、塩化メチレンのような揮発性有機溶媒中の選択されたポリマーの溶液に分散または溶解される。この混合物は有機性油（シリコンオイルなどの）に撹拌により懸濁されてエマルジョンを形成する。溶媒蒸発とは違って、この方法を使用すれば、高融点および異なる分子量を有するポリマー由来の粒子を作製することができる。１〜３００ミクロンの間の範囲の粒子がこの手順により得られる。この技法を用いて生成される球の外部形態は使用されるポリマーの種類に大いに依存する。
１２．噴霧乾燥
この方法では、ポリマーは有機溶媒に溶解される。既知量の活性薬物がポリマー溶液に懸濁される（不溶性薬物）かまたは共溶解される（可溶性薬物）。次に、溶液または分散液は噴霧乾燥される。ミニ噴霧乾燥器（Ｂｕｃｈｉ）についての典型的なプロセスパラメータは以下の通りである。ポリマー濃度＝０．０４ｇ／ｍＬ、入口温度＝−２４℃、出口温度＝１３〜１５℃、アスピレーター設定＝１５、ポンプ設定＝１０ｍＬ／分、噴霧流＝６００Ｎｌ／時間、およびノズル径＝０．５ｍｍ。１〜１０ミクロンの間の範囲の粒子が得られ、その形態は使用されるポリマーの種類に依存する。
１３．ナノ沈殿
ナノ沈殿では、ポリマーおよび核酸は、選択された水混和性溶媒、例えば、ＤＭＳＯ、アセトン、エタノール、アセトン、等に共溶解される。好ましい実施形態では、核酸およびポリマーはＤＭＳＯに溶解される。ポリマーおよび核酸を含有する溶媒は、安定化剤（例えば、ポロクサマー、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）、および当技術分野で公知の他の安定化剤）を含有する過剰な容積の撹拌している水相に滴下添加される。粒子は溶媒蒸発中に形成され沈殿する。ポリマーの喪失を抑えるため、水相の粘度は、もっと高濃度の安定化剤またはグリセロールなどの他の粘稠化剤および当技術分野で公知の他のものを使用することにより増加させることが可能である。最後に、全分散系は遠心分離され、核酸負荷ポリマーナノ粒子を収集して、任意選択で濾過される。ナノ沈殿ベースの技法は、例えば、米国特許第５，１１８，５２８号で考察されている。
ナノ沈殿の利点は、この方法が単一エマルジョン法または二重エマルジョン法と比べて、極性であるが水不溶性の薬物の封入効率を有意に増加することが可能であることを含む（Alshamsan、Saudi Pharmaceutical Journal、２２巻（３号）：２１９〜２２２頁（２０１４年））。乳化または高剪断力ステップ（例えば、超音波処理または高速均質化）はナノ沈殿に関与しておらず、したがって、核酸の立体構造は保存される。ナノ沈殿は剪断応力よりもむしろ溶媒と非溶媒との間の界面張力の差に依拠してナノ粒子を生成する。薬物の疎水性は即座に沈殿するナノ粒子に薬物を保持し、平衡に起因する非沈殿ポリマーは「失われ」、沈殿ナノ粒子の形態ではない。
Ｂ．封入されるかまたは粒子の表面に結合する分子
直接にもしくはカップリング分子を介するかのいずれかでポリマーに封入されるかまたは結合される分子には２つの主要なグループがあり、標的化分子、接着分子および治療剤、栄養剤、診断剤または予防剤である。これらの分子は標準技法を使用してカップリングさせることが可能である。送達される標的化分子または治療分子はポリマーにまたはポリマー中に取り込まれる脂肪酸などの材料に直接カップリングさせることが可能である。
官能性とは、粒子の表面に存在し結合されるリガンド上に存在する機能的化学基（カルボン酸、アルデヒド、アミン、スルフヒドリルおよびヒドロキシル）を介して粒子の表面にリガンドがコンジュゲートすることを指す。官能性は２つの方法で粒子内に導入することができる。第１は粒子の調製中、例えば、機能的化学基を有する安定化剤を組み込むことによる粒子のエマルジョン調製中である。実施例１は、機能的両親媒性分子をエマルジョン調製中に粒子内に挿入するこの種のプロセスを示している。
第２は、ホモ二機能性架橋剤またはヘテロ二機能性架橋剤と粒子およびリガンドを直接架橋することによる粒子調製後である。この第２の手順は、適切な化学およびあるクラスの架橋剤（下でさらに詳しく考察される、ＣＤＩ、ＥＤＡＣ、グルタルアルデヒド、等）または調製後粒子表面の化学修飾を介して粒子表面にリガンドをカップリングさせる他の任意の架橋剤を使用してもよい。この第２のクラスは、脂肪酸、脂質または機能的安定化剤などの両親媒性分子が粒子表面に受動的に吸着され接着され、それによってリガンドに繋ぎ止めるための機能的末端基を導入することができるプロセスも含む。
好ましい実施形態では、以下の実施例で示されるように、表面はポリマー相ＨＬＢまたは親水性−親油性バランスに適合する両親媒性ポリマーまたは界面活性剤を挿入するように改変される。ＨＬＢは１から１５の範囲である。低いＨＬＢを有する界面活性剤の方がより親油性であり、したがって、油中水型エマルジョンを作製する傾向があり、高いＨＬＢを有する界面活性剤の方がより親水性であり、水中油型エマルジョンを作製する傾向がある。脂肪酸および脂質は１０未満の低いＨＬＢを有する。標的基（親水性アビジンなどの）とのコンジュゲーション後、ＨＬＢは１０よりも上に上昇する。このコンジュゲートはエマルジョン調製に使用される。１〜１０、さらに好ましくは１から６の間、最も好ましくは１から５までの間の範囲のＨＬＢを有する任意の両親媒性ポリマーを使用することができる。これには、すべての脂質、脂肪酸および洗浄剤が含まれる。
１つの有用なプロトコールは、ＤＭＳＯ、アセトン、またはＴＨＦなどの非プロトン性溶媒中での剤（agent）、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）を用いたポリマー鎖上のヒドロキシル基の「活性化」を含む。ＣＤＩは、タンパク質などのリガンドの遊離のアミノ基を結合させることにより置き換えることができるヒドロキシル基を有するカルバミン酸イミダゾリル複合体を形成する。反応は、Ｎ−求核置換であり、ポリマーへのリガンドの安定なＮ−アルキルカルバメート連結を生じる。「活性化された」ポリマーマトリックスへのリガンドの「カップリング」は９〜１０のｐＨ範囲で最大であり、通常は、少なくとも２４時間かかる。得られたリガンド−ポリマー複合体は安定であり、長時間加水分解に耐える。
別のカップリング法は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）または「水溶性ＣＤＩ」をＮ−ヒドロキシルスルホスクシンイミド（スルホＮＨＳ）と併せて使用して、全くの水性環境において７．０の生理的ｐＨでポリマーの露出したカルボキシル基をリガンドの遊離のアミノ基にカップリングさせることを含む。手短に言えば、ＥＤＡＣとスルホＮＨＳはポリマーのカルボン酸基と活性化されたエステルを形成し、このカルボン酸基はリガンドのアミノ末端と反応してペプチド結合を形成する。得られたペプチド結合は加水分解に抵抗性である。反応でスルホＮＨＳを使用すると１０倍の因数でＥＤＡＣカップリングの効率を増やし、リガンド−ポリマー複合体の生存能を保証する並はずれて穏やかな条件を提供する。
これらのプロトコールのいずれかを使用することにより、ポリマーマトリックスを溶解しない適切な溶媒系でヒドロキシル基またはカルボキシル基のいずれかを含有するほとんどすべてのポリマーを「活性化する」ことが可能である。
遊離のヒドロキシル基およびカルボキシル基を有するリガンドをポリマーに結合させるための有用なカップリング手順は架橋剤、ジビニルスルホンの使用を含む。この方法は、生物接着特性を有する糖または他のヒドロキシル（hydroxylic）化合物をヒドロキシルマトリックスに結合させるのに有用であるはずである。手短に言えば、活性化は、ジビニルスルホンとポリマーのヒドロキシル基が反応し、ポリマーのビニルスルホニルエチルエーテルを形成することを含む。ビニル基はアルコール、フェノールおよびアミンとさえ結合する。活性化およびカップリングはｐＨ１１で起こる。連結は１〜８のｐＨ範囲で安定であり、腸の通過に適している。
ＵＶ架橋の使用を含む、リガンドと二重結合を有するポリマーのカップリングについて当業者に公知のいかなる適切なカップリング法も、分子のポリマーへの結合に使用することができる。
カップリングは好ましくは共有結合によるが、カップリングは間接的である、例えば、ポリマーに結合しているリンカーを通じてまたはストレプトアビジンおよびビオチンなどの２つの分子間の相互作用を通じてでもよい。カップリングは、浸漬コーティングによる静電引力によるものでもよい。
送達される分子は、Luoら、Controlled DNA delivery system、Phar. Res.、１６巻：１３００〜１３０８頁（１９９９年）により記載されている技法などの二重エマルジョン溶媒蒸発技法を使用してポリマー中に封入することも可能である。
Ｃ．特に好ましいナノ粒子製剤
ナノ粒子製剤は、標的組織または細胞を含む検討項目に基づいて選択することが可能である。例えば、ベータサラセミアを処置または修正する処置に向けられる実施形態では（例えば、標的細胞が、例えば、造血幹細胞である場合）、好ましいナノ粒子製剤はＰＬＧＡである。
特に嚢胞性線維症を処置するのに好ましい、他の好ましいナノ粒子製剤は、McNeerら、Nature Commun.、６巻：６９５２、doi: 10.1038/ncomms7952（２０１５年）、およびFieldsら、Adv Healthc Mater.、４巻（３号）：３６１〜６頁（２０１５年）.doi: 10.1002/adhm.201400355（２０１５年）Epub 2014に記載されている。そのようなナノ粒子はポリ（ベータアミノ）エステル（ＰＢＡＥ）とポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）のブレンドで構成されている。ポリ（ベータアミノ）エステル（ＰＢＡＥ）はジアクリレートエステルへの二機能性アミンのコンジュゲート（マイケル様）付加により合成される、分解性のカチオンポリマーである（Lynn、Langer R、editor. J Am Chem Soc.２０００年、１０７６１〜１０７６８頁）。ＰＢＡＥは、遺伝子送達のための効率的ベクターになる特性を有するようである。これらのカチオンポリマーは、負電荷ｐＤＮＡを凝縮し、細胞取り込みを誘導し、ＤＮＡ脱出をもたらすエンドソームの低いｐＨ環境を緩衝することができる（Lynn、Langer R、editor. J Am Chem Soc.２０００年、１０７６１〜１０７６８頁およびGreen、Acc Chem Res.、４１巻（６号）：７４９〜７５９頁（２００８年））。ＰＢＡＥは他のポリマーとハイブリッド粒子を形成する能力があり、このおかげで、固体で、安定で貯蔵の利く粒子の製造が可能である。例えば、カチオンＰＢＡＥとＰＬＧＡをブレンドすると高充填ｐＤＮＡ粒子が製造された。ＰＬＧＡへのＰＢＡＥを付加すると、マウスモデルにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏでの遺伝子トランスフェクションが増加し、抗原特異的腫瘍拒絶が誘導された（Littleら、Proc Natl Acad Sci U S A.、１０１巻：９５３４〜９５３９頁（２００４年）、Littleら、J Control Release、１０７巻：４４９〜４６２頁（２００５年））。
したがって、一部の実施形態では、開示された組成物を送達するのに利用されるナノ粒子はＰＢＡＥと、上で考察されたポリマーのうちの１つである第２のポリマーとのブレンドで構成されている。一部の実施形態では、ナノ粒子はＰＢＡＥとＰＬＧＡのブレンドで構成されている。
遺伝子編集技術が充填されているＰＬＧＡおよびＰＢＡＥ／ＰＬＧＡブレンドナノ粒子は、上に、ならびにMcNeerら、Nature Commun.、６巻：６９５２、doi: 10.1038/ncomms7952（２０１５年）、およびFieldsら、Adv Healthc Mater.、４巻（３号）：３６１〜６頁（２０１５年）.doi: 10.1002/adhm.201400355（２０１５年）Epub 2014に詳細に記載されている技法などの二重エマルジョン溶媒蒸発技法を使用して製剤化することが可能である。ポリ（ベータアミノエステル）（ＰＢＡＥ）は、Akincら、Bioconjug Chem.、１４巻：９７９〜９８８頁（２００３年）に記載されている１，４−ブタンジオールジアクリレートと４，４’−トリメチレンジピペリジンのマイケル付加反応により合成することが可能である。一部の実施形態では、ＰＬＧＡ／ＰＢＡＥブレンド粒子などのＰＢＡＥブレンド粒子は、約１から９９の間、または約１から５０の間、または約５から２５の間、または約５から２０の間、または約１０から２０の間、または約１５パーセントのＰＢＡＥ（ｗｔ％）を含有する。特定の実施形態では、ＰＬＧＡ／ＰＢＡＥブレンド粒子などのＰＢＡＥブレンド粒子は、約５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、または５％ＰＢＡＥ（ｗｔ％）を含有する。上で考察の、および一部の場合でのＰＶＡ中のこれらの粒子由来の溶媒は一晩続いてもよい。ＰＬＧＡ／ＰＢＡＥ／ＭＰＧナノ粒子は、ＰＬＧＡナノ粒子よりも気道上皮細胞との有意により大きなナノ粒子会合を生じることが明らかにされた（Fieldsら、Advanced Healthcare Materials、４巻：３６１〜３６６頁（２０１５年））。
ＩＸ．使用方法
Ａ．処置方法
開示されている組成物はｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子編集に使用することができる。方法は典型的には、細胞のゲノムを改変するために、好ましくは増強剤と組み合わせて、細胞を有効量の遺伝子編集組成物に接触させることを含む。下でさらに詳細に考察されるように、接触させることはｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで行うことができる。好ましい実施形態では、方法は、治療結果を達成するのに十分な数の細胞のゲノムを改変するために、好ましくは増強剤と組み合わせて、標的細胞の集団を有効量の遺伝子編集組成物に接触させることを含む。
例えば、有効量または治療有効量は、疾患もしくは障害の１つもしくは複数の症状を処置する、阻害する、もしくは軽減する、または他の方法で所望の薬理的および／もしくは生理的効果を提供する、例えば、疾患もしくは障害の根底にある基礎病態生理学的機序のうちの１つもしくは複数を低減する、阻害する、もしくは逆転するのに十分な投薬量であり得る。
一部の実施形態では、遺伝子編集技術が三重鎖形成分子である場合、分子は標的部位で三重ヘリックスの形成を誘導するのに有効な量で投与することが可能である。三重鎖形成分子などの遺伝子編集技術の有効量は、遺伝子編集技術の非存在下でドナー断片の投与と比べてドナー断片の組換え速度を増加するのに有効な量でもよい。製剤は投与様式に適するように作製される。薬学的に許容されるキャリアは一部、投与されている特定の組成物により、ならびに組成物を投与するのに使用される特定の方法により決定される。したがって、核酸を含有する医薬組成物には多種多様な適切な製剤がある。正確な投薬量は、被験体依存性変数（例えば、年齢、免疫系健康状態、臨床症状、等）などの種々の因子に従って変動する。例示的な症状、薬理的効果、および生理的効果は下でさらに詳細に考察される。
開示された組成物は、１日１回、２回、または３回；週１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、月１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回または８回投与するかまたは他の方法で標的細胞に接触させることが可能である。例えば、一部の実施形態では、組成物は２日もしくは３日ごとに、または平均で約１週間に約２回から約４回投与される。
一部の実施形態では、増強剤は被験体への遺伝子編集技術の投与に先立って被験体に投与される。増強剤は、例えば、被験体への遺伝子編集技術の投与の１、２、３、４、５、６、８、１０、１２、１８、もしくは２４時間前、または１、２、３、４、５、６、もしくは７日、またはその任意の組合せ前に被験体に投与することが可能である。
一部の実施形態では、遺伝子編集技術は被験体への増強剤の投与に先立って被験体に投与される。遺伝子編集技術は、例えば、被験体への増強剤の投与の１、２、３、４、５、６、８、１０、１２、１８、もしくは２４時間前、または１、２、３、４、５、６、もしくは７日前、またはその任意の組合せ前に被験体に投与することが可能である。
好ましい実施形態では、組成物は、少なくとも１つの標的対立遺伝子での遺伝子改変が、標的細胞のうちの少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５％の頻度で起こるように誘導するのに有効な量で投与される。一部の実施形態では、特にｅｘ ｖｉｖｏ適用では、遺伝子改変は少なくとも１つの標的対立遺伝子において約０．１〜２５％、または０．５〜２５％、または１〜２５％ ２〜２５％、または３〜２５％、または４〜２５％または５〜２５％または６〜２５％、または７〜２５％、または８〜２５％、または９〜２５％、または１０〜２５％、１１〜２５％、または１２〜２５％、または１３％〜２５％または１４％〜２５％または１５〜２５％、または２〜２０％、または３〜２０％、または４〜２０％または５〜２０％または６〜２０％、または７〜２０％、または８〜２０％、または９〜２０％、または１０〜２０％、１１〜２０％、または１２〜２０％、または１３％〜２０％または１４％〜２０％または１５〜２０％、２〜１５％、または３〜１５％、または４〜１５％または５〜１５％または６〜１５％、または７〜１５％、または８〜１５％、または９〜１５％、または１０〜１５％、１１〜１５％、または１２〜１５％、または１３％〜１５％または１４％〜１５％の頻度で起こる。
一部の実施形態では、特にｉｎ ｖｉｖｏ適用では、遺伝子改変は少なくとも１つの標的対立遺伝子において約０．１％〜約１０％、または約０．２％〜約１０％、または約０．３％〜約１０％、または約０．４％〜約１０％、または約０．５％〜約１０％、または約０．６％〜約１０％、または約０．７％〜約１０％、または約０．８％〜約１０％、または約０．９％〜約１０％、または約１．０％〜約１０％、または約１．１％〜約１０％、または約１．１％〜約１０％、１．２％〜約１０％、または約１．３％〜約１０％、または約１．４％〜約１０％、または約１．５％〜約１０％、または約１．６％〜約１０％、または約１．７％〜約１０％、または約１．８％〜約１０％、または約１．９％〜約１０％、または約２．０％〜約１０％、または約２．５％〜約１０％、または約３．０％〜約１０％、または約３．５％〜約１０％、または約４．０％〜約１０％、または約４．５％〜約１０％、または約５．０％〜約１０％の頻度で起こる。
一部の実施形態では、遺伝子改変は低いオフターゲット効果で起こる。一部の実施形態では、オフターゲット改変は下の実施例に記載される分析などの通常の分析を使用して検出することはできない。一部の実施形態では、オフターゲットインシデントは０〜１％、または０〜０．１％、または０〜０．０１％、または０〜０．００１％、または０〜０．０００１％、または０〜００００．１％、または０〜０．０００００１％の頻度で起こる。一部の実施形態では、オフターゲット改変は、標的部位での改変の約１０２分の１、１０３分の１、１０４分の１、または１０５分の１の頻度で起こる。
遺伝子編集技術
一般に、ただ例として、開示されている方法で有用な剤形は、用量当たり約１０２から約１０５０、または約１０５から約１０４０、または約１０１０から約１０３０、または約１０１２から約１０２０コピーの遺伝子編集技術の範囲での用量を含むことが可能である。特定の実施形態では、約１０１３、１０１４、１０１５、１０１６、または１０１７コピーの遺伝子編集技術がそれを必要とする被験体に投与される。
他の実施形態では、投薬量はモルで表される。例えば、一部の実施形態では、遺伝子編集技術の用量は約０．１ｎｍｏｌから約１００ｎｍｏｌ、または約０．２５ｎｍｏｌから約５０ｎｍｏｌ、または約０．５ｎｍｏｌから約２５ｎｍｏｌ、または約０．７５ｎｍｏｌから約７．５ｎｍｏｌである。
他の実施形態では、投薬量は標的細胞当たりの分子で表される。例えば、一部の実施形態では、遺伝子編集技術の用量は、標的細胞当たり約１０２から約１０５０、または約１０５から約１０１５、または約１０７から約１０１２、または約１０８から約１０１１コピーの遺伝子編集技術である。
他の実施形態では、特に機能的分子を含むかまたは含まないナノ粒子にパッケージされた遺伝子編集組成物のｉｎ ｖｉｖｏ投薬量として表される場合、投薬量はｍｇ／ｋｇで表される。投薬量は、例えば、用量当たり、０．１ｍｇ／ｋｇから約１，０００ｍｇ／ｋｇ、または０．５ｍｇ／ｋｇから約１，０００ｍｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇから約１，０００ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇ、または約２０ｍｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇ、または用量当たり２０ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、または用量当たり２５ｍｇ／ｋｇから約７５ｍｇ／ｋｇ、または用量当たり約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、または７５ｍｇ／ｋｇであり得る。
他の実施形態では、特に機能的分子を含むかまたは含まないナノ粒子にパッケージされた遺伝子編集組成物のｅｘ ｖｉｖｏ投薬量として表される場合、投薬量はｍｇ／ｍｌで表される。投薬量は、例えば、１０６細胞の細胞集団に対して用量当たり０．０１ｍｇ／ｍｌから約１００ｍｇ／ｍｌ、または約０．５ｍｇ／ｍｌから約５０ｍｇ／ｍｌ、または約１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌであり得る。
上で考察したように、遺伝子編集技術はドナーオリゴヌクレオチドなしで投与することが可能であるが、好ましくは少なくとも１つのドナーオリゴヌクレオチドと一緒に投与される。そのようなドナーは遺伝子編集技術と類似する投薬量で投与することが可能である。組成物は、三重鎖形成分子などの遺伝子編集技術の存在下、標的部位で組み換えるのに有効なドナー断片の量を含むべきである。
増強剤
方法は細胞を有効量の増強剤に接触させることを含みうる。好ましくは、増強剤の量は、増強剤の非存在下で遺伝子改変技術を使用することと比べて、遺伝子改変技術と組み合わせて使用した場合、遺伝子改変を増加させるのに有効である。
ＳＣＦの例示的な投薬量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約２５０ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、または約０．５ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇ、または約０．７５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇを含む。
ＣＨＫ１阻害剤についての投薬量は当技術分野では公知であり、これらの多くが臨床試験においてである。したがって、投薬量は、公知の好ましいヒト投薬量に基づいて実践者が選択することが可能である。好ましい実施形態では、投薬量は最小毒性量（ＬＯＡＥＬ）より下であり、好ましくは無有害作用量（ＮＯＡＥＬ）の投薬量である。
１．ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子療法
一部の実施形態では、細胞のｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子療法は被験体の遺伝性障害の処置のために使用される。ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子療法では、細胞は被験体から単離され、ｅｘ ｖｉｖｏで組成物に接触させて、遺伝子中にまたは遺伝子に隣接して変異を含有する細胞を生成する。好ましい実施形態では、細胞は処置される被験体からまたは同系宿主（syngenic host）から単離される。標的細胞は、遺伝子編集組成物および好ましくは増強因子に接触させるのに先立って被験体から取り除かれる。細胞は造血前駆体細胞または造血幹細胞でありうる。好ましい実施形態では、標的細胞はＣＤ３４＋造血幹細胞である。ＣＤ３４＋細胞などの造血幹細胞（ＨＳＣ）は、赤血球を含むあらゆる血液細胞型を生じる複能性幹細胞である。したがって、ＣＤ３４＋細胞は、例えば、サラセミア、鎌状赤血球症、またはリソソーム蓄積症、開示されている組成物および方法を使用してｅｘ−ｖｉｖｏで変更または修復された変異体遺伝子、ならびに処置または治癒として患者に再導入されて戻された細胞を有する患者から単離することが可能である。
幹細胞は当業者であれば単離し富化することができる。ＣＤ３４＋および他の細胞のそのような単離および富化のための方法は当技術分野では公知であり、例えば、米国特許第４，９６５，２０４号、同第４，７１４，６８０号、同第５，０６１，６２０号、同第５，６４３，７４１号、同第５，６７７，１３６号、同第５，７１６，８２７号、同第５，７５０，３９７号および同第５，７５９，７９３号に開示されている。本明細書で使用されるように、造血前駆体細胞および造血幹細胞において富化されている組成物との関連では、「富化された」は細胞の天然の供給源において見出されるよりも望ましい要素（例えば、造血前駆体細胞および造血幹細胞）の高い割合を示している。細胞の組成物は細胞の天然の供給源よりも少なくとも１桁、好ましくは２または３桁、さらに好ましくは１０、１００、２００または１０００桁富化することができる。
ヒトでは、ＣＤ３４＋細胞は、臍帯血、骨髄からまたは顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）などの造血成長因子を造血幹細胞の骨髄腔から末梢循環への移動を引き起こすのに十分な量でドナーの皮下にもしくは静脈内に注射することによりもたらされるサイトカイン動員後の血液から回収することができる。最初は、骨髄細胞は、骨髄の任意の適切な供給源、例えば、脛骨、大腿骨、脊椎、および他の骨腔から得ることができる。骨髄の単離では、骨を洗い流すのに適切な溶液を使用してもよく、この溶液は、一般に約５〜２５ｍＭの低濃度で許容できる緩衝液と併せて、ウシ胎仔血清または他の天然に存在する因子を都合よく補充された平衡塩類溶液である。便利な緩衝液はヘペス、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液、等を含む。
細胞はポジティブおよびネガティブ選択技法により選択することが可能である。細胞は、当業者に公知の方法を使用して、造血前駆体細胞または造血幹細胞表面抗原、例えば、ＣＤ３４に結合する市販の抗体を使用して選択することができる。例えば、抗体は磁気ビーズにコンジュゲートすることができ、所望の細胞型を回収するのに免疫原性手順が利用される。他の技法は、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）の使用を含む。ＣＤ３４抗原は、非白血病個体の造血系内の前駆体細胞上に見出されるが、モノクローナル抗体Ｍｙ−１０により認識される細胞（すなわち、ＣＤ３４抗原を発現する）の集団において発現され、骨髄移植のための幹細胞を単離するのに使用することができる。アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．）にＨＢ−８４８３として寄託されているＭｙ−１０は抗ＨＰＣＡ１として市販されている。さらに、ヒト骨髄由来の分化した「専用の」細胞のネガティブ選択を利用すれば、実質的にいかなる所望の細胞マーカーに対しても選択することができる。例えば、前駆体細胞または幹細胞は、最も好ましくは、ＣＤ３４＋細胞であるが、ＣＤ３−、ＣＤ７−、ＣＤ８−、ＣＤ１０−、ＣＤ１４−、ＣＤ１５−、ＣＤ１９−、ＣＤ２０−、ＣＤ３３−、クラスＩＩ ＨＬＡ＋およびＴｈｙ−１＋のうちのいずれとも特徴付けることが可能である。
前駆体細胞または幹細胞が単離された後は、任意の適切な培地で成長させることにより増殖させることができる。例えば、前駆体細胞または幹細胞は、因子の分泌と関連する骨髄もしくは肝臓から得ることが可能な細胞などの間質細胞由来の馴化培地において、または幹細胞の増殖を支持する細胞表面因子を含む培地において成長させることができる。間質細胞は、望ましくない細胞の除去のために適当なモノクローナル抗体を用いて造血細胞から取り除いてもよい。
単離された細胞は、修復または変更を必要とする遺伝子、例えば、ヒトベータグロビン遺伝子もしくはα−Ｌ−イズロニダーゼ遺伝子中でまたはこれに隣接して所望の変異を引き起こすのに有効な量で、三重鎖形成分子とドナーオリゴヌクレオチドの組合せにｅｘ ｖｉｖｏで接触させる。これらの細胞は本明細書では改変細胞と呼ばれる。細胞をオリゴヌクレオチドおよびペプチド核酸でトランスフェクトするための方法は当技術分野では周知である（Koppelhusら、Adv. Drug Deliv. Rev.、５５巻（２号）：２６７〜２８０頁（２００３年））。遺伝子修正の頻度をさらに増やすために細胞をＳ期に同調させるのが望ましいことがある。例えば、二重チミジンブロックにより培養細胞を同調させるための方法は当技術分野では公知である（Zielkeら、Methods Cell Biol.、８巻：１０７〜１２１頁（１９７４年））。
改変細胞は被験体への投与に先立って培養で維持または増やすことが可能である。培養条件は一般に、細胞型に応じて当技術分野では公知である。特にＣＤ３４＋の維持のための条件はよく研究されてきており、いくつかの適切な方法が利用可能である。ｅｘ ｖｉｖｏ複能性造血細胞拡大への一般的アプローチは、インターロイキン−３などの初期作用サイトカインの存在下で精製された前駆体細胞または幹細胞を培養することである。造血前駆体細胞をｅｘ ｖｉｖｏで維持するための栄養培地で、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、およびｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ；すなわち、ｆｌｔ３遺伝子産物のリガンド）の組合せを含むことは、原始的（すなわち、比較的分化していない）ヒト造血前駆体細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで増やすのに有用であり、その細胞はＳＣＩＤ−ｈｕマウスにおいて生着することができたことも明らかにされている（Luensら、１９９８年、Blood ９１巻：１２０６〜１２１５頁）。他の公知の方法では、細胞はマウスプロラクチン様タンパク質Ｅ（ｍＰＬＰ−Ｅ）またはマウスプロラクチン様タンパク質Ｆ（ｍＰＩＰ−Ｆ；合わせてｍＰＬＰ−Ｅ／ＩＦ）を含む栄養培地においてｅｘ ｖｉｖｏで維持することが可能である（例えば、数分、数時間、または３、６、９、１３、もしくはそれよりも多い日数の間）（米国特許第６，２６１，８４１号）。他の適切な細胞培養および拡大法も本発明に従って同様に使用することが可能であることは認識される。米国特許第５，９４５，３３７号に記載されるように、細胞は、無血清培地でも成長することができる。
別の実施形態では、改変造血幹細胞は、当技術分野で周知の方法を使用して被験体に投与するのに先立ってインターロイキンと成長因子の特定の組合せを使用してｅｘ ｖｉｖｏでＣＤ４＋細胞培養物に分化される。細胞は、単離された造血幹細胞の元の集団と比べて、好ましくは少なくとも５倍、さらに好ましくは少なくとも１０倍、さらに好ましくは少なくとも２０倍の細胞の拡大でｅｘ ｖｉｖｏにおいて多数増やすことができる。
別の実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子療法のための細胞、使用される細胞は、脱分化体細胞でありうる。体細胞は、造血前駆体細胞になるように誘導することが可能である多能性幹様細胞になるように再プログラムすることができる。次に、造血前駆体細胞は、ＣＤ３４＋細胞に関して上記の通りに三重鎖形成分子およびドナーオリゴヌクレオチドで処理して、１つまたは複数の改変遺伝子を有する組換え細胞を生成することが可能である。再プログラムが可能である代表的な体細胞は、線維芽細胞、脂肪細胞、および筋肉細胞を含むがこれらに限定されない。誘導幹様細胞由来の造血前駆体細胞はマウスにおいて開発され成功を収めてきた（Hanna、J.ら、Science、３１８巻：１９２０〜１９２３頁（２００７年））。
誘導幹様細胞から造血前駆体細胞を生成するために、宿主から体細胞が採取される。好ましい実施形態では、体細胞は自己の線維芽細胞である。細胞は培養され、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃ転写因子をコードするベクターで形質導入される。形質導入された細胞は培養され、胚性幹細胞（ＥＳ）形態ならびにＡＰ、ＳＳＥＡ１、およびＮａｎｏｇを含むがこれらに限定されないＥＳ細胞マーカーについてスクリーニングされる。形質導入されたＥＳ細胞は培養され、誘導幹様細胞を生成するように誘導される。次に、細胞はＣＤ４１およびｃ−ｋｉｔマーカー（初期造血前駆体マーカー）ならびにミエロイドおよび赤血球系分化のマーカーについてスクリーニングされる。
次に、改変造血幹細胞または改変誘導造血前駆体細胞が被験体に導入される。細胞の送達は種々の方法を使用してもたらすことができ、最も好ましくは、注入による静脈内投与、ならびに、骨膜、骨髄および／または皮下部位への直接デポー注射を含む。
改変細胞を受ける被験体は、骨髄コンディショニングの処置を受けて細胞の生着を増強することができる。レシピエントは、細胞の投与に先立って、放射線照射または化学療法処置を使用する処置を受けて生着を増強してもよい。投与すると、細胞は一般に生着するのに一定の期間がかかる。造血幹細胞または前駆体細胞の有意な生着を達成するには典型的には数週間から数ヶ月かかる。
改変造血幹細胞の高率の生着は有意な予防効果または治療効果を達成するのに必要だとは想定されていない。移植された細胞は生着に続いて時間をかけて増えて改変細胞の割合を増やすと予想される。一部の実施形態では、改変細胞は修正されたα−Ｌ−イズロニダーゼ遺伝子を有する。したがって、ハーラー症候群を有する被験体では、改変細胞は状態を改善または治癒すると予想される。予防効果または治療効果を提供するには、ごく少数または低い割合の改変造血幹細胞の生着が必要であると予想される。
好ましい実施形態では、被験体に投与される細胞は自己由来であり、例えば、被験体に由来する、または同系である。
２．ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子療法
開示される組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子療法のために被験体に直接投与されうる。
ａ．医薬製剤
開示される組成物は、適切な医薬キャリアと組み合わせて治療的使用のために好ましくは用いられる。このような組成物は、有効量の組成物、および薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤を含む。
当業者には、ｉｎ ｖｉｖｏで投与されたヌクレオチドが細胞および組織に取り込まれ、分配されることが理解される（Huangら、FEBS Lett.、５５８巻（１〜３号）：６９〜７３頁（２００４年））。例えば、Ｎｙｃｅらは、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）が、吸入されると、内因性サーファクタント（肺細胞によって産生される脂質）に結合し、さらなるキャリア脂質を要することなく肺細胞によって取り込まれることを示している（Nyceら、Nature、３８５巻：７２１〜７２５頁（１９９７年））。低分子核酸は、Ｔ２４膀胱癌組織培養細胞内に容易に取り込まれる（Maら、Antisense Nucleic Acid Drug Dev.、８巻：４１５〜４２６頁（１９９８年））。
ＴＦＯおよびＰＮＡなどの三重鎖形成分子ならびにドナー断片を含む、開示される組成物は、適切な医薬キャリアにおいて、局部に、局所に、または全身に投与するための製剤内にありうる。E. W. MartinによるRemington's Pharmaceutical Sciences、第１５版（Mark Publishing Company、１９７５年）は、典型的なキャリアおよび調製方法を開示している。化合物はまた、細胞を標的化するために、生分解性のまたは非生分解性のポリマーまたはタンパク質またはリポソームで形成された、適切な生体適合性のマイクロカプセル、微粒子、ナノ粒子、またはミクロスフェア内に封入されうる。このような系は当業者に周知であり、適当な核酸との使用に最適化されうる。
核酸送達のための様々な方法が、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、New York（１９８９年）、およびAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、New York（１９９４年）において記載されている。このような核酸送達系は、所望の核酸を、例として、かつ限定はしないが、「裸の」核酸として「裸の」形態で、または、送達に適したビヒクル内に製剤化されて、例えば、陽イオン性分子もしくはリポソーム形成脂質との複合体で、またはベクターの構成成分として、または医薬組成物の構成成分として含む。核酸送達系は、直接的に、例えば細胞と核酸送達系を接触させることによって、または間接的に、例えば任意の生物学的プロセスの作用を介することによって、細胞に提供されうる。核酸送達系は、エンドサイトーシス、受容体標的化、天然または合成細胞膜断片とのカップリング、エレクトロポレーションなどの物理的手段、ベクターを使用する、核酸送達系と制御放出フィルムもしくはナノ粒子もしくは微粒子などのポリマーキャリアとの組み合わせ、細胞周辺の組織もしくは流体への核酸送達系の注射、細胞膜を経る核酸送達系の単純な拡散によって、または細胞膜を経るあらゆる能動もしくは受動輸送メカニズムによって、細胞に提供されうる。さらに、核酸送達系は、ウイルスベクターの、抗体が関連する標的化および抗体を媒介する固定などの技法を使用して細胞に提供されうる。
局部投与のための製剤は、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、坐剤、スプレー剤、液剤、および粉剤・散剤（powder）を含みうる。従来の医薬キャリア、水性の粉末もしくは油性基剤、または増粘剤が、必要に応じて使用されうる。
例えば関節内（関節の内部）経路、静脈内経路、筋肉内経路、皮内経路、腹腔内経路、および皮下経路によるなどの非経口投与に適切な製剤は、水性および非水性の等張無菌注射液剤を含み、これは、抗酸化剤、バッファ、静菌剤、および製剤を目的のレシピエントの血液と等張にする溶質、ならびに、懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、分散剤、安定剤、および防腐剤を含みうる水性および非水性の無菌の懸濁剤、液剤、またはエマルジョンを含有しうる。注射のための製剤は、単位剤形で、例えば、防腐剤が任意選択で添加されたアンプルでまたは複数回用量容器にで提示することができる。組成物は、ある特定の実施形態では、被験体の血液と等張でありうる無菌の水性または非水性の液剤、懸濁剤、およびエマルジョンのような形態を取りうる。非水性溶媒の例は、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブオイル、ごま油、ココナッツ油、落花生油、ピーナッツ油、鉱油、注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチル、または合成のモノグリセリドもしくはジグリセリドを含む固定油である。水性キャリアには、食塩水および緩衝媒体を含む、水、アルコール性／水性溶液、エマルジョン、または懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、１，３−ブタンジオール、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または固定油が含まれる。静脈内ビヒクルには、流体、および栄養補給剤、および電解質補給剤（リンゲルデキストロースに基づくものなど）が含まれる。防腐剤および他の添加物、例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性気体などもまた存在しうる。さらに、無菌の固定油は、溶媒または懸濁媒体として従来から利用されている。この目的では、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含むあらゆる無刺激固定油が利用されうる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は、注射剤の調製において使用されうる。キャリア製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Co.、Easton、Paで見出すことができる。当業者であれば、過度の試験に頼ることなく、組成物を調製および製剤化するための様々なパラメータを容易に決定することができる。
単独のまたは他の適切な構成成分と組み合わせた、開示された組成物はまた、吸入を介して投与されるエアロゾル製剤にも作製されうる（すなわち、これらは「噴霧」されうる）。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素、および空気などの、加圧された許容される噴霧剤（propellant）に入れることができる。吸入による投与では、化合物は、適切な噴霧剤を使用して、加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー状の形態で送達される。
一部の実施形態では、組成物は、薬学的に許容されるキャリアと、塩、キャリア、緩衝剤、乳化剤、希釈剤、賦形剤、キレート剤、充填剤、乾燥剤、抗酸化剤、抗微生物剤、防腐剤、結合剤、増量剤、シリカ、可溶化剤、または安定剤などの製剤成分とを含む。一実施形態では、三重鎖形成分子および／またはドナーオリゴヌクレオチドは、細胞の取り込みを改善するために、コレステロールおよびＣ３２機能性を有するラウリン酸誘導体およびリトコール酸誘導体などの親油基にコンジュゲートされる。例えば、コレステロールは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（Lorenzら、Bioorg. Med. Chem. Lett.、１４巻（１９号）：４９７５〜４９７７頁（２００４年））およびｉｎ ｖｉｖｏ（Soutschekら、Nature、４３２巻（７０１４号）：１７３〜１７８頁（２００４年））でのｓｉＲＮＡの取り込みおよび血清安定性を増強させることが実証されている。さらに、ステロイドがコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドの、ＬＤＬなどの血流内の異なるリポタンパク質への結合が、完全性を保護し、生体分布を容易にすることが示されている（Rumpら、Biochem. Pharmacol.、５９巻（１１号）：１４０７〜１４１６頁（２０００年））。細胞の取り込みを増加させるために上記の化合物に結合またはコンジュゲートされうる他の群には、アクリジン誘導体；架橋剤、例えばソラレン誘導体、アジドフェナシル、プロフラビン、およびアジドプロフラビン；人工エンドヌクレアーゼ；金属錯体、例えばＥＤＴＡ−Ｆｅ（ＩＩ）およびポルフィリン−Ｆｅ（ＩＩ）；アルキル化部分；ヌクレアーゼ、例えばアルカリホスファターゼ；ターミナルトランスフェラーゼ；アブザイム；コレステリル部分；親油性キャリア；ペプチドコンジュゲート；長鎖アルコール；リン酸エステル；放射性マーカー；非放射性マーカー；炭水化物；およびポリリジンまたは他のポリアミンが含まれる。Levyらに対する米国特許第６，９１９，２０８号もまた、増強された送達のための方法を記載している。これらの医薬製剤は、それ自体が公知の様式で、例えば、従来の混合、溶解、顆粒化、粉末化、乳化、封入（encapsulating）、取り込み（entrapping）、または凍結乾燥プロセスの手段によって製造されうる。
ｂ．投与方法
全体として、オリゴヌクレオチドおよび関連する分子を含む化合物を投与する方法は、当技術分野において周知である。特に、核酸治療剤に既に使用されている投与経路と、現在使用されている製剤とは、上記の三重鎖形成分子のための好ましい投与経路および製剤を提供する。好ましくは、組成物は、遺伝子療法を必要とする動物などの、遺伝子操作を受けている生物に注射される。
開示される組成物は、限定はしないが、経口手段、静脈内手段、腹腔内手段、筋肉内手段、経皮手段、皮下手段、局部手段、舌下手段、直腸手段、鼻腔内手段、肺手段、および他の適切な手段を含む多くの経路によって投与されうる。組成物はまた、リポソームを介して投与されうる。このような投与経路および適切な製剤は一般に、当業者に公知である。
製剤の投与は、遺伝子編集組成物がその標的に達するのを可能にするあらゆる許容される方法によって達成されうる。
当業者に公知のあらゆる許容される方法を使用して、製剤を被験体に投与することができる。投与は、処置される状態に応じて、局所化されうる（すなわち、特定の領域、生理学的な系、組織、器官、または細胞型に対して）か、または全身的でありうる。
注射は、例えば、静脈内注射、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、または腹腔内注射でありうる。一部の実施形態では、注射は、複数の位置に与えられ得る。移植は、移植可能な薬物送達系、例えば、ミクロスフェア、ヒドロゲル、ポリマーリザーバー、コレステロールマトリックス、ポリマー系、例えば、マトリックス侵食系および／もしくは拡散系、ならびに非ポリマー系、例えば、圧縮された、融合した、または部分的に融合したペレットを挿入することを含む。吸入は、吸入器内の組成物とエアロゾルとを、単独の、または吸収されうるキャリアに結合させて投与することを含む。全身投与では、組成物がリポソーム内に封入されていることが好ましい場合がある。
組成物は、薬剤（agent）および／またはヌクレオチド送達系の組織特異的な取り込みを可能にする様式で送達されうる。技法には、創傷包帯または経皮送達系などの、組織または器官局在化デバイス（localizing device）の使用、血管または尿カテーテルなどの侵襲性デバイスの使用、および薬物送達能力を有し、拡張デバイスまたはステントグラフトとして構成されるステントなどの、介入デバイスの使用が含まれる。
製剤は、拡散による、またはポリマーマトリックスの分解による、生体分解可能な埋込物（implant）を使用して送達されうる。ある特定の実施形態では、製剤の投与は、一定期間にわたる、例えば、数時間、数日間、週週間、数か月間、または数年間にわたる、組成物への引き続く曝露をもたらすように設計されうる。これは、例えば、製剤の反復投与によって、または反復投与を行わずに長期にわたって組成物が送達される持続放出もしくは制御放出送達系によって、達成されうる。このような送達系を使用する製剤の投与は、例えば、経口剤形、ボーラス注射、経皮パッチ、または皮下埋込物によるものでありうる。実質的に一定の組成物濃度を維持することが、一部のケースでは好ましい場合がある。
適切な他の送達系には、徐放、遅延放出、持続放出、または制御放出送達系が含まれる。このような系は、多くのケースにおいて反復投与を避けて、被験体および医師にとっての利便性を増大させうる。多くのタイプの放出送達系が利用可能であり、当業者に公知である。これらには、例えば、ポリマーに基づく系、例えば、ポリ乳酸および／またはポリグリコール酸、ポリ酸無水物、ポリカプロラクトン、コポリオキサレート、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、および／またはこれらの組み合わせが含まれる。核酸を含有する前述のポリマーのマイクロカプセルは、例えば、米国特許第５，０７５，１０９号において記載されている。他の例には、ステロール、例えばコレステロール、コレステロールエステル、および脂肪酸もしくは中性脂肪、例えば、モノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリドを含む脂質に基づく非ポリマー系；ヒドロゲル放出系；リポソームに基づく系；リン脂質に基づく系；シラスティック系；ペプチドに基づく系；ワックス被覆剤；従来の結合剤および賦形剤を使用する圧縮錠剤；または部分的に融合した埋込物が含まれる。具体的な例には、オリゴヌクレオチドがマトリックス内の製剤に含有されている侵食系（例えば、米国特許第４，４５２，７７５号、同第４，６７５，１８９号、同第５，７３６，１５２号、同第４，６６７，０１３号、同第４，７４８，０３４号、および同第５，２３９，６６０号において記載されているような）、または活性成分が放出速度を制御する拡散系（例えば、米国特許第３，８３２，２５３号、同第３，８５４，４８０号、同第５，１３３，９７４号、および同第５，４０７，６８６号において記載されているような）が含まれる。製剤は、例えば、ミクロスフェア、ヒドロゲル、ポリマーリザーバー、コレステロールマトリックス、またはポリマー系のようであってよい。一部の実施形態では、系は、例えば、三重鎖形成分子およびドナーオリゴヌクレオチドを含有する製剤の拡散または侵食／分解速度の制御を介して、組成物の持続放出または制御放出が生じることを可能にしうる。さらに、ポンプに基づくハードウェア送達系を使用して、１つまたは複数の実施形態を送達することができる。
放出が急激に生じる系の例には、組成物がリポソーム内に取り込まれており、リポソームが、ポリマーマトリックスに封入され、特異的刺激、例えば、温度、ｐＨ、光、または分解酵素に感受性である、系、および、組成物が、マイクロカプセルコア分解酵素と共に、イオン被覆されたマイクロカプセルによって封入されている系が含まれる。阻害剤の放出が段階的かつ連続的な系の例には、例えば、組成物がマトリックス内の形態で含有される侵食系、および、組成物が、例えばポリマーを介して、制御された速度で浸透する、滲出系が含まれる。このような持続放出系は、ペレットまたはカプセルの形態でありうる。
長期放出埋込物の使用は、一部の実施形態では特に適切でありうる。「長期放出」は、本明細書で使用されるように、組成物を含有する埋込物が、治療上有効なレベルの組成物を少なくとも３０または４５日、好ましくは少なくとも６０または９０日、または一部のケースではさらに長く送達するように構築および配置されていることを意味する。長期放出埋込物は当業者に周知であり、上記の放出系の一部を含む。
ｃ．粘膜投与および肺投与のための好ましい製剤
活性剤（複数可）およびその組成物は、肺投与または粘膜投与のために製剤化することができる。投与は、肺、鼻、口腔（舌下、頬側）、膣、または直腸の粘膜への組成物の送達を含みうる。
一実施形態では、化合物は、肺送達、例えば鼻腔内投与または経口吸入のために製剤化される。気道は、大気と血流との間の気体の交換に関与する構造物である。肺は、肺胞で最終的に終結する分岐構造物であり、肺胞で気体の交換が行われる。肺胞の表面積は呼吸器系で最も広く、薬物の吸収が行われる場所である。肺胞は、繊毛または粘液層を有さずに薄い上皮で覆われており、サーファクタントであるリン脂質を分泌する。気道は中咽頭および喉頭を含む上気道を包含し、その下に下気道が続き、下気道は気管を含み、その下で気管支および細気管支に分岐する。上気道および下気道は、誘導気道と呼ばれる。末端の細気管支は次いで、呼吸細気管支に分かれ、これは次いで、最終の呼吸領域である肺胞または肺深部に至る。肺深部または肺胞は、全身薬物送達のための吸入された治療用エアロゾルの主要な標的である。
低分子量薬物で構成される治療用組成物、例えば、喘息を処置するためのベータ−アンドロゲン性アンタゴニストの肺投与は観察されている。肺において活性な他の治療剤は、全身的に投与されており、肺での吸収を介して標的化されている。鼻送達は、以下の理由から、治療薬の投与のための有望な技法であると考えられる：鼻は、多くの微絨毛によって上皮表面が覆われているために、薬物吸収に利用可能な広い表面積を有し、上皮下層は非常に血管化されており、鼻からの静脈血は全身循環に直接進み、したがって、肝臓での初回通過代謝による薬物の喪失が避けられ、鼻送達により、より低い用量、治療血中レベルへのより迅速な到達、薬理学的活性のより迅速な開始、より少ない副作用、多孔質内皮基底膜１ｃｍ３当たりの多くの総血流量がもたらされ、また、鼻送達は利用しやすい。
本明細書で使用されるように、エアロゾルという用語は、粒子の細かいミストのあらゆる調製物を指し、これは、噴霧剤を使用して作製されていてもいなくても、溶液または懸濁液でありうる。エアロゾルは、超音波処理または高圧処理などの標準的な技法を使用して作製されうる。
肺製剤のためのキャリアは、乾燥粉末製剤のためのもの、および溶液として投与するためのものに分けることができる。治療剤を気道に送達するためのエアロゾルは、当技術分野において公知である。上気道を介する投与では、製剤は、液剤、例えば緩衝されたもしくは緩衝されていない水または等張食塩水に、あるいは懸濁剤として、鼻腔内投与では滴剤としてまたはスプレー剤として、製剤化されうる。好ましくは、このような液剤または懸濁剤は鼻分泌物に対して等張であり、また、ほぼ同じｐＨであり、例えば、約ｐＨ４.０から約ｐＨ７.４、またはｐＨ６.０からｐＨ７.０の範囲である。緩衝液は生理学的に適合するものでなくてはならず、単に例として、リン酸緩衝液を含む。例えば、代表的な鼻うっ血除去薬は、ｐＨ約６.２に緩衝されていると記載されている。当業者であれば、鼻および／または上気道への投与のための、無害の水性溶液として適切な食塩水含有量およびｐＨを容易に決定することができる。
好ましくは、水性溶液は、水、塩および／もしくはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）などの緩衝液を含有する生理学的に許容される水性溶液、または動物もしくはヒトへの投与に許容されるあらゆる他の水性溶液である。このような溶液は当業者に周知であり、限定はしないが、蒸留水、脱イオン水、純水、または超純水、食塩水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む。他の適切な水性ビヒクルには、限定はしないが、リンゲル液および等張塩化ナトリウムが含まれる。水性懸濁液には、セルロース誘導体、アルギン酸ナトリウム、ポリビニル−ピロリドン、およびトラガカントゴムなどの懸濁化剤、ならびにレシチンなどの湿潤剤が含まれうる。水性懸濁液のための適切な防腐剤には、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルおよびｐ−ヒドロキシ安息香酸ｎ−プロピルが含まれる。
別の実施形態では、低毒性の有機の（すなわち、非水性の）クラス３残留溶媒、例えば、エタノール、アセトン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、エチルエーテル、およびプロパノールが、製剤に使用されうる。溶媒は、製剤を容易にエアロゾル化するその能力に基づいて選択される。溶媒は、化合物と有害に反応するべきではない。化合物を溶解するまたは化合物の懸濁液を形成する適切な溶媒が使用されるべきである。溶媒は、溶液または懸濁液のエアロゾルの形成を可能にするために十分に揮発性でなくてはならない。さらなる溶媒またはエアロゾル化剤、例えばフレオンを、溶液または懸濁液の揮発性を増加させるために必要に応じて添加することができる。
一実施形態では、組成物は、微量のポリマー、界面活性剤、または当業者に周知の他の賦形剤を含有しうる。この意味において、「微量」は、肺における化合物の取り込みに影響しうるまたは取り込みを仲介しうる賦形剤が存在しないこと、および、存在する賦形剤が、肺における化合物の取り込みに有害に影響しない量で存在することを意味する。
乾燥脂質粉末は、その疎水性の特徴のため、エタノール内に直接分散させることができる。クロロホルムなどの有機溶媒で保存された脂質では、所望の量の溶液がバイアル内に入れられ、クロロホルムは窒素流下で蒸発させられて、ガラスバイアルの表面上に乾燥した薄いフィルムが形成される。フィルムは、エタノールで再構成されると容易に膨張する。脂質分子を有機溶媒中で完全に分散させるために、懸濁液は超音波処理される。非水性の脂質懸濁液はまた、再利用可能なＰＡＲＩ ＬＣ Ｊｅｔ＋ネブライザー（ＰＡＲＩ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ、Ｍｏｎｔｅｒｅｙ、ＣＡ）を使用して、無水エタノール中で調製されうる。
Ｃ．処置される疾患
遺伝子療法は、ヒトの遺伝子疾患、例えば、嚢胞性線維症、血友病、グロビン異常症、例えば鎌状赤血球貧血およびベータ−サラセミア、色素性乾皮症、ならびにリソソーム蓄積症との関連において研究される場合に明らかであるが、この戦略はまた、ｅｘ ｖｉｖｏに基づく細胞改変の背景におけるＨＩＶなどの非遺伝子疾患の処置にも、またｉｎ ｖｉｖｏでの細胞改変にも有用である。開示される組成物は、単一遺伝子における変異によって生じる遺伝子欠損症、障害、および疾患の処置に、例えば、点変異によって生じる遺伝子欠損症、障害、および疾患を修正するために、特に有用である。標的遺伝子が、遺伝子障害の原因である変異を含有する場合、開示される組成物は、標的遺伝子のＤＮＡ配列を正常に回復させうる変異誘発性の修復に使用されうる。標的配列は、遺伝子のコードＤＮＡ配列内またはイントロン内にありうる。標的配列はまた、プロモーター配列またはエンハンサー配列を含む、標的遺伝子の発現を調節するＤＮＡ配列内にもありうる。
標的遺伝子が、がん細胞におけるなどの未調節の増殖を生じさせるがん遺伝子である場合、オリゴヌクレオチドは、遺伝子を不活化し未調節の細胞増殖を終結または低減させる変異を生じさせるために有用である。オリゴヌクレオチドはまた、増殖を抑制する能力を失ったリプレッサー遺伝子を活性化するための有用な抗がん剤である。標的遺伝子はまた、がんに対する宿主の免疫応答を増強するための、ＰＤ−１などの免疫調節因子をコードする遺伝子でありうる。
ＰＤ−１およびＣＤ２７９（分化抗原群２７９）としても公知のプログラム細胞死タンパク質１は、ＰＤＣＤ１遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＰＤ−１は、２つのリガンド、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２を有する。ＰＤ−１は、一部の胸腺細胞において発現し、活性化後に、Ｔ細胞、Ｂ細胞、および骨髄系細胞において上方調節される（Agataら、Int. Immunol.、８巻：７６５〜７７２頁（１９９６年））。ＰＤ−１は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）によって提示されたペプチド抗原を結合した後にＴＣＲの下流でシグナル伝達に拮抗するように作用する。これは、Ｔ細胞の活性化を防止することによって免疫チェックポイントとして機能し得、それによって自己免疫を低減させ、自己寛容を促進するが、がんと戦う身体の能力も低減させうる。リンパ節内の抗原特異的Ｔ細胞におけるアポトーシス（プログラム細胞死）を促進する一方で、調節性Ｔ細胞（サプレッサーＴ細胞）におけるアポトーシスは同時に低減させる、二重のメカニズム（twofold mechanism）を介して作用するＰＤ−１の阻害効果。ＰＤ−１を遮断する組成物であるＰＤ−１阻害剤は、腫瘍を攻撃するように免疫系を活性化し、したがって、様々な成功を収めて一部のタイプのがんを処置するために使用されている。
したがって、一部の実施形態では、組成物は、がんを処置するために使用される。遺伝子改変技術は、ＰＤ−１の発現を低減または防止するように設計され、低減または防止するための有効量で投与されうる。
組成物は、例えば、ウイルスの適当な増殖または機能に必要なウイルスゲノムの特異的部分を改変するように設計される場合、抗ウイルス剤として使用されうる。
バリアント、置換および例示的ＰＮＡ
例示的標的部位の好ましい疾患および配列、三重鎖形成分子ならびにドナーオリゴヌクレオチドは、下でさらに詳細に考察される。いずれの配列も本明細書に開示されるまたは当技術分野において別段公知の通り改変することができる。例えば一部の実施形態では、本明細書のいずれの三重鎖形成配列も、三重鎖形成分子がそれでも標的配列に結合するように、１つまたは複数の変異（例えば置換、欠失または挿入）を有することができる。
本明細書のいずれの三重鎖形成配列も、本明細書またはＷＯ１９９６／０４０２７１、ＷＯ／２０１０／１２３９８３および米国特許第８，６５８，６０８号において考察される塩基、糖または骨格修飾を含まずに、またはいずれも含まずに、本明細書に開示されるもの（例えば、ＰＮＡ）を含むカノニカル核酸または他の適切な代用物を使用して製造することができる。
本明細書のいずれの三重鎖形成配列も、ペプチド核酸であってよい。一部の実施形態では、本明細書の三重鎖形成配列のいずれかの１つまたは複数のシトシンは、シュードイソシトシンを用いて置換される。一部の実施形態では、三重鎖形成分子のフーグスティーン結合部分中のすべてのシトシンは、シュードイソシトシンを用いて置換される。一部の実施形態では、本明細書のいずれの三重鎖形成配列もγＰＮＡを用いて置換された１つまたは複数のペプチド核酸モノマーを含む。一部の実施形態では、フーグスティーン結合部分のみにおいて、ワトソンクリック結合部分のみにおいて、またはＰＮＡ全体にわたってすべてのペプチド核酸モノマーは、γＰＮＡモノマーを用いて置換される。特定の実施形態では、交互残基はＰＮＡであり、フーグスティーン結合部分のみにおいて、ワトソンクリック結合部分のみにおいて、またはＰＮＡ全体にわたってγＰＮＡは、置換される。一部の実施形態では、γＰＮＡは、ミニＰＥＧ γＰＮＡ、メチルγＰＮＡ、上で考察の別のγ置換である。一部の実施形態では、ＰＮＡオリゴマーは２つまたはそれより多くの異なるγＰＮＡを含む。
例えば一部の実施形態では、（１）ワトソンクリック結合部分における一部もしくはすべての残基は、γＰＮＡ（例えば、ミニＰＥＧ含有γＰＮＡ）であり；（２）フーグスティーン結合部分における一部もしくはすべての残基は、γＰＮＡ（例えば、ミニＰＥＧ含有γＰＮＡ）であり；または（３）一部もしくはすべての残基（ワトソンクリック結合部分および／またはフーグスティーン結合部分における）は、γＰＮＡ（例えば、ミニＰＥＧ含有γＰＮＡ）である。したがって一部の実施形態では、本明細書のいずれの三重鎖形成核酸配列も、ペプチド核酸であり、ここで、（１）ワトソンクリック結合部分におけるすべての残基は、γＰＮＡ（例えば、ミニＰＥＧ含有γＰＮＡ）であり、フーグスティーン結合部分において、γＰＮＡ（例えば、ミニＰＥＧ含有γＰＮＡ）である残基はなく；（２）フーグスティーン結合部分におけるすべての残基は、γＰＮＡ（例えば、ミニＰＥＧ含有γＰＮＡ）であり、ワトソンクリック結合部分においてγＰＮＡ（例えば、ミニＰＥＧ含有γＰＮＡ）である残基はなく；または（３）すべての残基（ワトソンクリック結合部分およびフーグスティーン結合部分における）は、γＰＮＡ（例えば、ミニＰＥＧ含有γＰＮＡ）である。
好ましい三重鎖分子は、１つまたは複数のシトシンに代えて、特にフーグスティーン結合部分においてシュードイソシトシンを有するビスペプチド核酸であって、ここで、一部またはすべてのＰＮＡはγＰＮＡである。
本明細書のいずれの三重鎖形成配列も、１つまたは複数のＧクランプモノマーを有する場合がある。例えば、本明細書のいずれの三重鎖形成配列における１つもしくは複数のシトシンまたはシュードイソシトシンなどのそのバリアントも、置換されるまたは、他の方法でクランプ−Ｇ（９−（２−グアニジノエトキシ）フェノキサジン）に改変される場合がある。
本明細書のいずれの三重鎖形成配列も、例えば、ビスＰＮＡを形成するようにフーグスティーン結合ドメインとワトソンクリック結合ドメインとを連結する、柔軟なリンカーを含むことができる。配列は、柔軟なリンカーを用いて連結されてよい。例えば、一部の実施形態では柔軟なリンカーは、８−アミノ−２，６，１０−トリオキサオクタン酸酸残基などの約１〜１０、より好ましくは２〜５、最も好ましくは約３単位を含む。一部の分子は、好ましくは正に荷電している、Ｎ末端またはＣ末端非結合残基を含む。例えば一部の分子は、１〜１０、好ましくは２〜５、最も好ましくは約３個のリシンをＰＮＡのＮ末端、Ｃ末端、またはこれらの組合せに含む。
本開示の配列について、「Ｊ」はシュードイソシトシン、「Ｏ」は柔軟な８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸、６−アミノヘキサン酸モノマーであり、「Ｋ」および「ｌｙｓ」は、リシンである。ＰＮＡ配列は、一般にＨ−「核酸配列」−ＮＨ２配向で表される。ビスＰＮＡについてフーグスティーン結合部分は、典型的にはリンカーの上流（例えば、「Ｈ」末端）に配向している一方で、ワトソンクリック結合部分は、典型的にはリンカーの下流（例えば、ＮＨ２末端）に配向している。いずれのドナーも、ホスホロチオエート（phosphorothiate）ヌクレオシド間連結を、特に５’末端の３または４ヌクレオチドと３’末端の３または４ヌクレオチドとの間に含んでよい。したがって、本明細書に開示される各ドナーオリゴヌクレオチド配列は、いかなるホスホロチオエートヌクレオシド間連結も含まずに、およびホスホロチオエートヌクレオシド間連結を、好ましくは５’末端の３または４ヌクレオチドと３’末端の３または４ヌクレオチドの間に有して明確に開示される。
１．グロビン異常症
世界的にグロビン異常症は、重大な罹患率および死亡率の原因となっている。１，２００を超えるさまざまな公知の遺伝子変異がヒトアルファ様（ＨＢＺ、ＨＢＡ２、ＨＢＡ１およびＨＢＱ１）およびベータ様（ＨＢＥ１、ＨＢＧ１、ＨＢＤおよびＨＢＢ）グロビン遺伝子のＤＮＡ配列に影響を与えている。２つのさらに一般的および十分に研究されたグロビン異常症は、鎌状赤血球貧血およびβ−サラセミアである。鎌状赤血球貧血を有する患者におけるβ−グロビン鎖の６位でのバリンのグルタミン酸に代えての置換は、ヘモグロビン重合を起こしやすくし、組織および器官損傷を生じる鎌状赤血球の剛性および血管閉塞をもたらす。β−サラセミアを有する患者では、種々の変異機序が、β−グロビンの合成の低減を生じ、無効な赤血球生成、赤血球（red cell）破壊の加速および重度の貧血の原因となる対合しない、不溶性α鎖の凝集物の蓄積をもたらす。
合わせて、グロビン異常症は、ヒトにおいて最もよく見られる単一遺伝子障害である。三重鎖形成オリゴヌクレオチドは、それらが点変異によって生じる単一遺伝子障害であることから、グロビン異常症を処置するために特によく適している。本明細書において開示される三重鎖形成分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび生細胞の両方、動物でのｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方においてヒトβ−グロビンに結合することに有効である。実験結果は、ＰＮＡおよびＤＮＡを含有するナノ粒子の全身投与後に、全骨髄細胞の４％における変異の修正、正常範囲への持続的な上昇を示す血中ヘモグロビンレベルを有する貧血の治癒、髄外造血の逆転および脾腫の逆転、ならびに網状赤血球数における低減を伴って、ＩＶＳ２−６５４サラセミア変異を含むヒトベータグロビン遺伝子を（内在性マウスベータグロビンの代わりに）保有しているトランスジェニックマウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏでのサラセミア関連変異の修正も実証している。
β−サラセミアは、ＲＢＣ内のα−ヘモグロビンの沈殿をもたらし、重度の溶血性貧血を生じる不安定ヘモグロビン異常症である。患者は、繰り返し輸血を要する血中ヘモグロビン濃度の実質的な減少を伴う黄疸および脾腫を経験し、典型的には経時的に重度の鉄過剰を生じる。心筋鉄沈着症による心不全は、２０歳代の終わりまでのβ−サラセミアによる死亡の主な原因である。したがって、これらの患者での繰り返す輸血の低減は、患者転帰を改善することが第一に重要である。
ａ．例示的β−グロビン遺伝子標的部位
β−グロビン遺伝子配列には、特にイントロンには、本明細書に開示される方法において利用可能である多数の優れた第三鎖結合部位がある。第１１染色体、ヒト天然ヘモグロビン−遺伝子クラスター（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ０１３１７．１−第１１染色体上のヒトベータグロビン領域−ＬＯＣＵＳ ＨＵＭＨＢＢ、７３３０８ｂｐ ｄｓ−ＤＮＡ）のＧｅｎＢａｎｋ配列の一部分、塩基６０００１から塩基６６０６０は、下に示されている。６２１８７〜６２１８９位（または配列番号１３の２１８７〜２１８９位）の遺伝子コード配列の開始部は、波下線によって示されている。ＧｅｎＢａｎｋ配列のこの部分は、天然βグロビン遺伝子配列を含有している。鎌状赤血球ヘモグロビンでは、６２２０６位（または配列番号１３に列挙される２２０６位、太字および太い下線によって示されている）のアデニン塩基はチミンに変異されている。イントロン２（ＩＶＳ２）に生じる他の共通の点変異は、下の配列において斜字体（配列番号１４）によって強調され、配列番号１３のヌクレオチド２，６３２〜３，４８１に対応している。変異は、同様に太字および太い下線によって示されているＩＶＳ２−１、ＩＶＳ２−５６６、ＩＶＳ２−６５４、ＩＶＳ２−７０５およびＩＶＳ２−７４５を含む；番号付けはイントロン２の開始部に対して。
例示的三重鎖形成分子結合部位は、例えばＷＯ１９９６／０４０２７１、ＷＯ／２０１０／１２３９８３および米国特許第８，６５８，６０８号ならびに下記の実施例において提供されている。標的領域は、ゲノムＤＮＡのコード鎖、またはその相補的非コード配列（例えば、ワトソンまたはクリック鎖（stand））に基づいて言及される場合がある。例示的標的領域は、下記の配列中のβグロビン遺伝子配列のコード配列を、二重下線および下線と二重下線との組合せ（ここで下線は任意選択の追加的結合配列である）によって参照して同定される。追加的に、同定された各標的化配列について、逆非コード鎖上の相補的標的配列も三重鎖形成分子結合配列として明確に開示される。
したがって、三重鎖形成分子は、コード鎖または非コード鎖のいずれか上の標的領域に結合するように設計されてよい。しかし、上に考察した通りＰＮＡおよびｔｃＰＮＡなどの三重鎖形成分子は、好ましくは標的二重鎖に侵入し、ポリピリミジンの置換、および置換されたポリプリンを用いる三重鎖形成を誘導する。





。
ｂ．例示的三重鎖形成配列
ｉ．ベータサラセミア
遺伝子編集分子は、本明細書で提供されるガイダンスおよび当技術分野において公知の他の方法に基づいて設計することができる。例示的三重鎖形成分子およびドナー配列は、例えば、ＷＯ１９９６／０４０２７１、ＷＯ／２０１０／１２３９８３および米国特許第８，６５８，６０８号ならびに下記の実施例において提供され、本明細書に開示される１つまたは複数の改変を含んで変更されてよい。
三重鎖形成分子は、ポリピリミジン：ポリプリン標的モチーフのポリプリン鎖に実質的に相補的な配列を含んでよい。一部の実施形態では、三重鎖形成分子は、配列番号１４のヌクレオチド５６６〜５７７、任意選択で５６６〜５８３もしくはそれより長くに対応する領域；配列番号１４のヌクレオチド８０７〜８１３、任意選択で８０７〜８２４もしくはそれより長くに対応する領域；または配列番号１４のヌクレオチド６０５〜６１１、任意選択で６０５〜６２１に対応する領域を標的とする。したがって一部の実施形態では、三重鎖形成分子は、ＧＡＡＡＧＡＡＡＧＡＧＡ（配列番号１５）またはＴＧＣＣＣＴＧＡＡＡＧＡＡＡＧＡＧＡ（配列番号１６）またはＧＧＡＧＡＡＡ（配列番号１７）またはＡＧＡＡＴＧＧＴＧＣＡＡＡＧＡＧＧ（配列番号１８）またはＡＡＡＡＧＧＧ（配列番号１９）またはＡＣＡＴＧＡＴＴＡＧＣＡＡＡＡＧＧＧ（配列番号２０）を含む配列と三本鎖分子を形成できる。
したがって一部の実施形態では、三重鎖形成分子は、核酸配列ＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＣＴ（配列番号２１）を含み、好ましくは配列ＴＣＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣ（配列番号２２）に連結された配列ＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＣＴ（配列番号２１）を含み、またはさらに好ましくは配列ＴＣＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＡＧＧＧＣＡ（配列番号２３）に連結された配列ＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＣＴ（配列番号２１）を含む。
一部の実施形態では、三重鎖形成分子は、核酸配列ＴＴＴＣＣＣ（配列番号２４）を含み、好ましくは配列ＣＣＣＴＴＴＴ（配列番号２５）に連結された配列ＴＴＴＣＣＣ（配列番号２４）を含み、またはさらに好ましくは配列ＣＣＣＴＴＴＴＧＣＴＡＡＴＣＡＴＧＴ（配列番号２６）に連結された配列ＴＴＴＣＣＣ（配列番号２４）を含む。
一部の実施形態では、三重鎖形成分子は、核酸配列ＴＴＴＣＴＣＣ（配列番号２７）を含み、好ましくは配列ＣＣＴＣＴＴＴ（配列番号２８）に連結された配列ＴＴＴＣＴＣＣ（配列番号２７）を含み、またはさらに好ましくは配列ＣＣＴＣＴＴＴＧＣＡＣＣＡＴＴＣＴ（配列番号２９）に連結された配列ＴＴＴＣＴＣＣ（配列番号２７）を含む。
一部の好ましい実施形態では、三重鎖形成核酸は、配列ＴＣＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣ（配列番号２２）またはＴＣＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＡＧＧＧＣＡ（配列番号２３）に連結された配列ＪＴＴＴＪＴＴＴＪＴＪＴ（配列番号３０）を含むペプチド核酸；または
配列ＣＣＣＴＴＴＴ（配列番号２５）またはＣＣＣＴＴＴＴＧＣＴＡＡＴＣＡＴＧＴ（配列番号２６）に連結された配列ＴＴＴＴＪＪＪ（配列番号３１）を含むペプチド核酸；または
配列ＣＣＴＣＴＴＴ（配列番号２８）またはＣＣＴＣＴＴＴＧＣＡＣＣＡＴＴＣＴ（配列番号２９）に連結された配列ＴＴＴＪＴＪＪ（配列番号３２）を含むペプチド核酸であり、
任意選択で、しかし好ましくは１つまたは複数のＰＮＡモノマーは、γＰＮＡである。
具体的な実施形態では、三重鎖形成分子は、配列

を含むペプチド核酸であり、
任意選択で、しかし好ましくは１つまたは複数のＰＮＡモノマーは、γＰＮＡである。なおさらに具体的な実施形態では、太字および下線付き残基はミニＰＥＧ含有γＰＮＡである。
他の実施形態では、三重鎖形成核酸は、配列ＣＴＴＣＴＴＴＴＣＴ（配列番号３７）に連結された配列ＴＪＴＴＴＴＪＴＴＪ（配列番号３６）；もしくは
配列ＣＴＴＴＣＴＴＣＴＴ（配列番号３９）に連結されたＴＴＪＴＴＪＴＴＴＪ（配列番号３８）；もしくは
配列ＴＣＴＴＣＣＴＣＣＣ（配列番号４１）に連結されたＪＪＪＴＪＪＴＴＪＴ（配列番号４０）を含むペプチド核酸であり；または
任意選択で、しかし好ましくは１つもしくは複数のＰＮＡモノマーはγＰＮＡである。
具体的な実施形態では、三重鎖形成核酸は、配列

を含むペプチド核酸であり、
任意選択で、しかし好ましくは１つまたは複数のＰＮＡモノマーはγＰＮＡである。なおさらに具体的な実施形態では、太字および下線付き残基はミニＰＥＧ含有γＰＮＡである。
ｉｉ．鎌状赤血球症
ベータグロビン遺伝子中の鎌状赤血球症変異（２０）を標的とする好ましい配列も提供される（例えば、図６を参照）。一部の実施形態では、三重鎖形成分子は、核酸配列ＣＣＴＣＴＴＣ（配列番号４５）を含み、好ましくは配列ＣＴＴＣＴＣＣ（配列番号４６）に連結された配列ＣＣＴＣＴＴＣ（配列番号４５）を含み、またはさらに好ましくは配列ＣＴＴＣＴＣＣＡＡＡＧＧＡＧＴ（配列番号４７）またはＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧＡＧＴＣＡＧ（配列番号４８）またはＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧＡＧＴＣＡＧＧＴＧＣ（配列番号２０５）に連結された配列ＣＣＴＣＴＴＣ（配列番号４５）を含む。
一部の実施形態では、三重鎖形成分子は、核酸配列ＴＴＣＣＴＣＴ（配列番号４９）を含み、好ましくは配列ＴＣＴＣＣＴＴ（配列番号５０）に連結された配列ＴＴＣＣＴＣＴ（配列番号４９）を含み、またはさらに好ましくは配列ＴＣＴＣＣＴＴＡＡＡＣＣＴＧＴ（配列番号５１）またはＴＣＴＣＣＴＴＡＡＡＣＣＴＧＴＣＴＴ（配列番号２１２）に連結された配列ＴＴＣＣＴＣＴ（配列番号４９）を含む。
一部の実施形態では、三重鎖形成分子は、核酸配列ＴＣＴＣＴＴＣＴ（配列番号５２）を含み、好ましくは配列ＴＣＴＴＣＴＣＴ（配列番号５３）に連結された配列ＴＣＴＣＴＴＣＴ（配列番号５２）を含み、またはさらに好ましくは配列ＴＣＴＴＣＴＣＴＧＴＣＴＣＣＡＣ（配列番号５４）またはＴＣＴＴＣＴＣＴＧＴＣＴＣＣＡＣＡＴ（配列番号５５）に連結された配列ＴＣＴＣＴＴＣＴ（配列番号５２）を含む。
鎌状赤血球症変異の修正についての一部の好ましい実施形態では（例えば図６）、三重鎖形成核酸は、配列ＣＴＴＣＴＣＣ（配列番号４６）またはＣＴＴＣＴＣＣＡＡＡＧＧＡＧＴ（配列番号４７）またはＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧＡＧＴＣＡＧ（配列番号４８）またはＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧＡＧＴＣＡＧＧＴＧＣ（配列番号２０５）に連結された配列ＪＪＴＪＴＴＪ（配列番号５６）を含むペプチド核酸；
または、配列ＴＣＴＣＣＴＴ（配列番号５０）またはＴＣＴＣＣＴＴＡＡＡＣＣＴＧＴ（配列番号５１）またはＴＣＴＣＣＴＴＡＡＡＣＣＴＧＴＣＴＴ（配列番号２１２）に連結された配列ＴＴＪＪＴＪＴ（配列番号４９）を含むペプチド核酸；
または、配列ＴＣＴＴＣＴＣＴ（配列番号５３）またはＴＣＴＴＣＴＣＴＧＴＣＴＣＣＡＣ（配列番号５４）またはＴＣＴＴＣＴＣＴＧＴＣＴＣＣＡＣＡＴ（配列番号５５）に連結された配列ＴＪＴＪＴＴＪＴ（配列番号５２）を含むペプチド核酸であり、
任意選択で、しかし好ましくは１つまたは複数のＰＮＡモノマーはγＰＮＡである。
鎌状赤血球症変異の修正についての具体的な実施形態では（例えば図６）、三重鎖形成核酸は、配列


を含むペプチド核酸であり、
任意選択で、しかし好ましくは１つまたは複数のＰＮＡモノマーは、γＰＮＡである。なおさらに具体的な実施形態では、太字および下線付き残基はミニＰＥＧ含有γＰＮＡである。
ｃ．例示的ドナー
一部の実施形態では、三重鎖形成分子は、修正ＩＶＳ２−６５４ヌクレオチドに下線を付けた、配列５’ＡＡＡＧＡＡＴＡＡＣＡＧＴＧＡＴＡＡＴＴＴＣＴＧＧＧＴＴＡＡＧＧＣＡＡＴＡＧＣＡＡＴＡＴＣＴＣＴＧＣＡＴＡＴＡＡＡＴＡＴ ３’（配列番号６５）、またはＩＶＳ２−６５４変異を修正するために適切かつ十分であるその機能性断片を含む、ＩＶＳ２−６５４変異の修正のためのドナーオリゴヌクレオチドとの組合せで使用される。
他の例示的ドナー配列として、これだけに限らないが、ドナーＧＦＰ−ＩＶＳ２−１（センス）５’−ＧＴＴＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＴＧＡＧＴＣＴＡＴＧＧＧＡＣＣＣ ＴＴＧＡＴＧＴＴＴ−３’（配列番号６１）、ドナーＧＦＰ−ＩＶＳ２−１（アンチセンス）５’−ＡＡＡＣＡＴＣＡＡＧＧＧＴＣＣＣＡＴＡＧＡＣＴＣＡＣＣＴＣＧＣＣＣＴＣＧＣＣＧＧＡＣＡＣＧＣＴＧＡＡＣ−３’（配列番号６２）、および、または変異を修正するために適切かつ十分であるその機能性断片が挙げられる。
一部の実施形態では、鎌状赤血球症変異は、配列

、または変異を修正するために適切かつ十分であるその機能性断片（式中、３個の囲まれたヌクレオチドは変異体バリン（ヒト鎌状赤血球症と関連する）を野生型グルタミン酸に戻す修正されたコドン６を表しており、太字のヌクレオチド（下線なし）は、ゲノムＤＮＡにだがコードされるアミノ酸にではない変化を表している）；または

、もしくは、変異を修正するために適切かつ十分であるその機能性断片（式中、太字および下線付き残基は、修正である）（例えば、図６を参照）、または

もしくは、変異を修正するために適切かつ十分であるその機能性断片（式中、太字および下線付き残基は修正であり、「（ｓ）」は任意選択のホスホロチオエートヌクレオシド間連結を示している）
を有するドナーを使用して修正することができる。
２．嚢胞性線維症
本開示の組成物および方法は、嚢胞性線維症を処置するために使用できる。嚢胞性線維症（ＣＦ）は、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）、Ｃｌ輸送を媒介するイオンチャネルの欠損によって生じる致死性常染色体劣性疾患である。ＣＦＴＲ機能の欠如は、慢性閉塞性肺疾患および呼吸不全による若年死亡、腸閉塞症候群、外分泌および内分泌膵臓機能障害ならびに不妊症を生じる（Davisら、Pediatr Rev.、２２巻（８号）：２５７〜６４頁（２００１年））。ＣＦにおいて最もよく見られる変異は、３塩基対欠失（Ｆ５０８ｄｅｌ）であり、フェニルアラニン残基の喪失をもたらし、ＣＦＴＲタンパク質の細胞内分解および細胞表面発現の欠如をもたらす（Davisら、Am J Respir Crit Care Med.、１７３巻（５号）：４７５〜８２頁（２００６年））。このよく見られる変異に加えて、未成熟終止コドンによる種類の変異、ナンセンス変異を含む、生じて、疾患をもたらす多数の他の変異がある。実際にナンセンス変異は、疾患の原因となる変異のおよそ１０％を構成する。ナンセンス変異のうちＧ５４２ＸおよびＷ１２８２Ｘは、それぞれ（respectfully）２．６％および１．６％の頻度を有して最も多く見られる。
ＣＦは、最も綿密に特徴付けられた遺伝性疾患の１つであるが、ＣＦを有する患者の現在の処置は、遺伝子欠損症の本質的な修正よりむしろ対症的管理を中心にしている。遺伝子療法は、肺および他の器官系へのｉｎ ｖｉｖｏ送達の課題のために、ＣＦにおいては捉えどころがない標的のままである（Armstrongら、Archives of disease in childhood （２０１４年） doi: 10.1136/archdischild-2012-302158. PubMed PMID: 24464978）。近年、自己移植のための細胞の採取およびｅｘ ｖｉｖｏでの操作が可能である、血液リンパ系が関与する疾患の処置のための遺伝子療法において多くの前進があった：いくつかの例として、ＨＩＶ−１耐性細胞を産生するためにＣＣＲ５を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼの使用（Holtら、Nature biotechnology、２８巻（８号）：８３９〜４７頁（２０１０年））、副腎白質ジストロフィーの処置のためのレンチウイルスベクターによるＡＢＣＤ１遺伝子の修正（Cartierら、Science、３２６巻（５９５４号）：８１８〜２３頁（２００９年））およびレトロウイルス遺伝子移入を使用する、ＡＤＡ欠損によるＳＣＩＤの修正（Aiutiら、The New England Journal Of Medicine、３６０巻（５号）：４４７〜５８頁（２００９年）が挙げられる。
不運なことに、採取および自己移植は、肺および他の内部器官の関与のために、ＣＦにおいては選択肢でない。１つのアプローチとして、ＵＫ Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍは、ＣＦＴＲをコードするｃＤＮＡを含有するプラスミドを肺に送達するためのリポソームを試験し（Altonら、Thorax、６８巻（１１号）：１０７５〜７頁（２０１３年））、Altonら、The Lancet Respiratory Medicine、（２０１５年）doi: 10.1016/S2213-2600(15)00245-3. PubMed PMID: 26149841.）、他の臨床試験は、ポリエチレングリコール置換リシン３０マーペプチドによってコンパクトにされたＣＦＴＲ遺伝子またはＣＦＴＲ発現プラスミドの送達のために、ウイルスベクターを使用して限られた成功を収めた（Konstanら、Human Gene Therapy、１５巻（１２号）：１２５５〜６９頁（２００４年））。さらに、標的化挿入を伴わない遺伝子付加のためのプラスミドＤＮＡの送達は、内在性遺伝子の修正を生じず、正常なＣＦＴＲ遺伝子調節に供されず、ＣＦＴＲ ｃＤＮＡのウイルス媒介組み込みは、重要なゲノム部位への非特異的組み込みのリスクをもたらす可能性がある。
しかし、三重鎖形成ＰＮＡ分子およびドナーＤＮＡを、嚢胞性線維症をもたらす変異を修正するために使用できることが発見された。好ましい実施形態では、組成物は、鼻腔内または肺への送達によって投与される。組成物は、嚢胞性線維症の１つまたは複数の症状を低減するために有効な量での、遺伝子修正を誘導するまたは増強するための有効量で投与されてよい。例えば、一部の実施形態では、遺伝子修正は、サイクリックＡＭＰ刺激への応答不良を改善する、フォルスコリンへの応答における過分極を改善する、大腔陰性鼻電位（large lumen negative nasal potential）の低減、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）での炎症性細胞の低減、肺組織構造を改善する、またはこれらの組合せのために有効な量で行う。一部の実施形態では、標的細胞は、皮膚で汗腺を構成している、肺、肝臓、膵臓または消化器系もしくは生殖器系内での通路を覆っている細胞、特に上皮細胞である。特定の実施形態では、標的細胞は、気管支上皮細胞である。ＰＮＡ／ＤＮＡを使用する永久的なゲノム変化がプラスミドに基づくアプローチよりも一過性でなく、変化が娘細胞に伝えられる一方で、一部の改変細胞は、呼吸器上皮の通常の代謝回転と共に経時的に失われる場合がある。一部の実施形態では、標的細胞は、肺上皮前駆体細胞である。肺上皮前駆体の改変は、表現型のさらに長期的な修正を誘導できる。
ヒト嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）に関する配列は、当技術分野において公知であり、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＨ００６０３４．１を参照されたい、ＣＦＴＲの標的化修正の組成物および方法はMcNeerら、Nature Communications、６巻：６９５２、（DOI 10.1038/ncomms7952）、全１１頁に記載されている。
ａ．例示的Ｆ５０８ｄｅｌ標的部位
一部の実施形態では、三重鎖形成分子は、ＣＦＴＲ遺伝子を受託番号ＡＨ００６０３４．１のヌクレオチド９，１５２〜９，１５９（ＴＴＴＣＣＴＣＴ（配列番号７０））もしくは９，１５９〜９，１６８（ＴＴＴＣＣＴＣＴＡＴＧＧＧＴＡＡＧ（配列番号７１）で、またはヌクレオチド９，１５２〜９，１５９もしくは９，１５２〜９，１６８（例えば、５’−ＡＧＡＧＧＡＡＡ−３’（配列番号７２）、もしくは５’−ＣＴＴＡＣＣＣＡＴＡＧＡＧＧＡＡＡ−３’（配列番号７３））に対応する非コード鎖（例えば、３’−５’相補的配列）で標的とするように設計される。
一部の実施形態では、三重鎖形成分子は、ＣＦＴＲ遺伝子を受託番号ＡＨ００６０３４．１のヌクレオチド９，０３９〜９，０４６（５’−ＡＧＡＡＧＡＧＧ−３’（配列番号７４）、もしくは９，０３０〜９，０４６（５’−ＡＴＧＣＣＡＡＣＴＡＧＡＡＧＡＧＧ−３’（配列番号７５））、またはヌクレオチド（５’ ＣＣＴＣＴＴＣＴ ３’（配列番号７６））もしくは（５’ ＣＣＴＣＴＴＣＴＡＧＴＴＧＧＣＡＴ ３’（配列番号７７）に対応する非コード鎖（例えば、３’−５’相補的配列）で標的とするように設計される。
一部の実施形態では、三重鎖形成分子は、ＣＦＴＲ遺伝子を受託番号ＡＨ００６０３４．１のヌクレオチド８，６６５〜８，６８３（ＣＴＴＴＣＣＣＴＴ（配列番号７８））もしくは８，６６５〜８，６８２（ＣＴＴＴＣＣＣＴＴＧＴＡＴＣＴＴＴＴ（配列番号７９）、またはヌクレオチド８，６６５〜８，６８３もしくは８，６６５〜８，６８２（例えば、５’−ＡＡＧＧＧＡＡＡＧ−３’（配列番号８０）もしくは５’−ＡＡＡＡＧＡＴＡＣ ＡＡＧＧＧＡＡＡＧ−３’（配列番号８１））に対応する非コード鎖（例えば、３’−５’相補的配列）で標的とするように設計される。
一部の実施形態では、三重鎖形成分子は、ＣＦＴＲ遺伝子中のＷ１２８２Ｘ変異を配列ＧＡＡＧＧＡＧＡＡＡ（配列番号１６３）、ＡＡＡＡＧＧＡＡ（配列番号１６４）もしくはＡＧＡＡＡＡＡＡＧＧ（配列番号１６５）、またはそれらの逆相補体で標的とするように設計される。図８Ｃを参照。
一部の実施形態では、三重鎖形成分子は、ＣＦＴＲ遺伝子中のＧ５４２Ｘ変異を配列ＡＧＡＡＡＡＡ（配列番号１６６）、ＡＧＡＧＡＡＡＧＡ（配列番号１６７）もしくはＡＡＡＧＡＡＡ（配列番号１６８）、またはそれらの逆相補体で標的とするように設計される。図９Ｃを参照。
ｂ．例示的三重鎖形成配列およびドナー
ｉ．Ｆ５０８ｄｅｌ
一部の実施形態では、三重鎖形成分子は、ＴＣＴＣＣＴＴＴ（配列番号８２）を、好ましくは配列ＴＴＴＣＣＴＣＴ（配列番号８３）に連結されて含む、もしくはより好ましくは配列ＴＴＴＣＣＴＣＴＡＴＧＧＧＴＡＡＧ（配列番号８４）に連結されたＴＣＴＣＣＴＴＴ（配列番号８２）を含む；または
ＴＣＴＴＣＴＣＣ（配列番号８５）を、好ましくは配列ＣＣＴＣＴＴＣＴ（配列番号８６）に連結されて含む、もしくはより好ましくはＣＣＴＣＴＴＣＴＡＧＴＴＧＧＣＡＴ（配列番号８７）に連結されたＴＣＴＴＣＴＣＣ（配列番号８５）を含む；または
ＴＴＣＣＣＴＴＴＣ（配列番号８８）を含む、好ましくは配列ＣＴＴＴＣＣＣＴＴ（配列番号８９）に連結された配列ＴＴＣＣＣＴＴＴＣ（配列番号８８）を含む、もしくはより好ましくは配列ＣＴＴＴＣＣＣＴＴＧＴＡＴＣＴＴＴＴ（配列番号９０）に連結された配列ＴＴＣＣＣＴＴＴＣ（配列番号８９）を含む、核酸配列を含む。
一部の好ましい実施形態では、三重鎖形成核酸は、
配列ＴＴＴＣＣＴＣＴ（配列番号８３）もしくはＴＴＴＣＣＴＣＴＡＴＧＧＧＴＡＡＧ（配列番号８４）に連結された、配列ＴＪＴＪＪＴＴＴ（配列番号９１）；または
配列ＣＣＴＣＴＴＣＴ（配列番号８６）もしくはＣＣＴＣＴＴＣＴＡＧＴＴＧＧＣＡＴ（配列番号８７）に連結されたＴＪＴＴＪＴＪＪ（配列番号９１）；または
配列ＣＴＴＴＣＣＣＴＴ（配列番号８９）もしくはＣＴＴＴＣＣＣＴＴＧＴＡＴＣＴＴＴＴ（配列番号９０）に連結されたＴＴＪＪＪＴＴＴＪ（配列番号９２）
を含むペプチド核酸であり、
任意選択で、しかし好ましくは１つまたは複数のＰＮＡモノマーはγＰＮＡである。
具体的な実施形態では、三重鎖形成核酸は、配列

を含むペプチド核酸であり、
任意選択で、しかし好ましくは１つまたは複数のＰＮＡモノマーはγＰＮＡである。なおさらに具体的な実施形態では、太字および下線付き残基はミニＰＥＧ含有γＰＮＡである。
一部の実施形態では、ＣＦＴＲ遺伝子修正のために、特に前述の三重鎖形成分子との組合せで、使用することができるドナーは、配列５’ＴＴＣＴＧＴＡＴＣＴＡＴＡＴＴＣＡＴＣＡＴＡＧＧＡＡＡＣＡＣＣＡＡＡＧＡＴＡＡＴＧＴＴＣＴＣＣＴＴＡＡＴＧＧＴＧＣＣＡＧＧ３’（配列番号９６）、または嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）遺伝子中のＦ５０８ｄｅｌ変異を修正するために適切かつ十分であるその機能性断片を含む。
ｉｉ．Ｗ１２８２変異部位
一部の実施形態では、三重鎖形成分子は、核酸配列ＣＴＴＣＣＴＣＴＴＴ（配列番号９７）を含み、好ましくは配列ＴＴＴＣＴＣＣＴＴＣ（配列番号９８）に連結された配列ＣＴＴＣＣＴＣＴＴＴ（配列番号９７）を含み、もしくはさらに好ましくは配列ＴＴＴＣＴＣＣＴＴＣＡＧＴＧＴＴＣＡ（配列番号９９）に連結された配列ＣＴＴＣＣＴＣＴＴＴ（配列番号９７）を含み；または
三重鎖形成分子は、核酸配列ＴＴＴＴＣＣＴ（配列番号１００）を含み、好ましくは配列ＴＣＣＴＴＴＴ（配列番号１０１）に連結された配列ＴＴＴＴＣＣＴ（配列番号１００）を含み、もしくはさらに好ましくは配列ＴＣＣＴＴＴＴＧＣＴＣＡＣＣＴＧＴＧＧＴ（配列番号１０２）に連結された配列ＴＴＴＴＣＣＴ（配列番号１００）を含み；または
三重鎖形成分子は、核酸配列ＴＣＴＴＴＴＴＴＣＣ（配列番号１０３）を含み、好ましくは配列ＣＣＴＴＴＴＴＴＣＴ（配列番号１０４）に連結された配列ＴＣＴＴＴＴＴＴＣＣ（配列番号１０３）を含み、もしくはさらに好ましくは配列ＣＣＴＴＴＴＴＴＣＴＧＧＣＴＡＡＧＴ（配列番号１０５）に連結された配列ＴＣＴＴＴＴＴＴＣＣ（配列番号１０３）を含む。
好ましい実施形態では、三重形成核酸は、
配列ＴＴＴＣＴＣＣＴＴＣ（配列番号９８）もしくはＴＴＴＣＴＣＣＴＴＣＡＧＴＧＴＴＣＡ（配列番号９９）に連結された配列ＪＴＴＪＪＴＪＴＴＴ（配列番号１０６）を含むペプチド核酸；または
配列ＴＣＣＴＴＴＴ（配列番号１０１）に連結されたもしくは配列ＴＣＣＴＴＴＴＧＣＴＣＡＣＣＴＧＴＧＧＴ（配列番号１０２）に連結された配列ＴＴＴＴＪＪＴ（配列番号１０７）を含むペプチド核酸；または
配列ＣＣＴＴＴＴＴＴＣＴ（配列番号１０４）に連結されたもしくは配列ＣＣＴＴＴＴＴＴＣＴＧＧＣＴＡＡＧＴ（配列番号１０５）に連結された配列ＴＪＴＴＴＴＴＴＪＪ（配列番号１０８）を含むペプチド核酸
であり、
任意選択で、しかし好ましくは１つまたは複数のＰＮＡモノマーはγＰＮＡである。
具体的な実施形態では、三重鎖形成核酸は、配列

を含むペプチド核酸であり、
任意選択で、しかし好ましくは１つまたは複数のＰＮＡモノマーはγＰＮＡである。なおさらに具体的な実施形態では、太字および下線付き残基はミニＰＥＧ含有γＰＮＡである。
一部の実施形態では、ＣＦＴＲ遺伝子修正のために、特に前述の三重鎖形成分子との組合せで、使用することができるドナーは、配列

または、ＣＦＴＲ中の変異を修正するために適切かつ十分であるその機能性断片を含み、式中、太字および下線付きヌクレオチドは、遺伝子修正のために挿入された変異であり、「（ｓ）」は任意選択のホスホロチオエートヌクレオシド間連結を示している。図８Ａ〜８Ｃ、Ｗ１２８２Ｘも参照。
ｉｉｉ．Ｇ５４２Ｘ変異部位
一部の実施形態では、三重鎖形成分子は、核酸配列ＴＣＴＴＴＴＴ（配列番号１１０）を含み、好ましくは配列ＴＴＴＴＴＣＴ（配列番号１１１）に連結された配列ＴＣＴＴＴＴＴ（配列番号１１０）を含み、もしくはさらに好ましくは配列ＴＴＴＴＴＣＴＧＴＡＡＴＴＴＴＴＡＡ（配列番号１１２）に連結された配列ＴＣＴＴＴＴＴ（配列番号１１０）を含み；または
三重鎖形成分子は、核酸配列ＴＣＴＣＴＴＴＣＴ（配列番号１１３）を含み、好ましくは配列ＴＣＴＴＴＣＴＣＴ（配列番号１１４）に連結された配列ＴＣＴＣＴＴＴＣＴ（配列番号１１３）を含み、もしくはさらに好ましくは配列ＴＣＴＴＴＣＴＣＴＧＣＡＡＡＣＴＴ（配列番号１１５）に連結された配列ＴＣＴＣＴＴＴＣＴ（配列番号１１３）を含み；または
三重鎖形成分子は、核酸配列ＴＴＴＣＴＴＴ（配列番号１１６）を含み、好ましくは配列ＴＴＴＣＴＴＴ（配列番号１１６）に連結された配列ＴＴＴＣＴＴＴ（配列番号１１６）を含み、もしくはさらに好ましくは配列ＴＴＴＣＴＴＴＡＡＧＡＡＣＧＡＧＣＡ（配列番号１１７）に連結された配列ＴＴＴＣＴＴＴ（配列番号１１６）を含む。
好ましい実施形態では、三重形成核酸は、配列ＴＴＴＴＴＣＴ（配列番号１１１）もしくはＴＴＴＴＴＣＴＧＴＡＡＴＴＴＴＴＡＡ（配列番号１１２）に連結された配列ＴＪＴＴＴＴＴ（配列番号１１８）を含むペプチド核酸；または
配列ＴＣＴＴＴＣＴＣＴ（配列番号１１４）に連結されたもしくは配列ＴＣＴＴＴＣＴＣＴＧＣＡＡＡＣＴＴ（配列番号１１５）に連結された配列ＴＪＴＪＴＴＴＪＴ（配列番号１１９）を含むペプチド核酸；または
配列ＴＴＴＣＴＴＴ（配列番号１１６）に連結されたもしくは配列ＴＴＴＣＴＴＴＡＡＧＡＡＣＧＡＧＣＡ（配列番号１１７）に連結された配列ＴＴＴＪＴＴＴ（配列番号１２０）を含むペプチド核酸であり；
任意選択で、しかし好ましくは１つまたは複数のＰＮＡモノマーはγＰＮＡである。
具体的な実施形態では、三重鎖形成核酸は、配列

を含むペプチド核酸であり、
任意選択で、しかし好ましくは１つまたは複数のＰＮＡモノマーはγＰＮＡである。なおさらに具体的な実施形態では、太字および下線付き残基はミニＰＥＧ含有γＰＮＡである。
一部の実施形態では、ＣＦＴＲ遺伝子修正のために、特に前述の三重鎖形成分子との組合せで、使用することができるドナーは、配列

、または、ＣＦＴＲ中の変異を修正するために適切かつ十分であるその機能性断片を含み、式中、太字および下線付きヌクレオチドは、遺伝子修正のために挿入された変異であり、「（ｓ）」は任意選択のホスホロチオエートヌクレオシド間連結を示している。図９Ａ〜９Ｃ、Ｇ５４２Ｘも参照。
３．ＨＩＶ
遺伝子編集組成物は、感染症、例えばＨＩＶによって生じる感染症を処置するために使用することができる。
ａ．例示的標的部位
三重鎖形成分子のための標的配列は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する細胞表面受容体をコードするヒト遺伝子内にあるまたはそれに隣接している。好ましくは、三重鎖形成分子の標的配列は、受容体の効率的な発現、細胞表面への受容体の輸送、受容体の安定性、受容体によるウイルス結合、または受容体のエンドサイトーシスに関与する配列など、細胞へのＨＩＶ侵入におけるその機能のために重要なＨＩＶ受容体遺伝子の部分内にあるまたはそれに隣接している。標的配列は、遺伝子のコードＤＮＡ配列内、またはイントロン内であってよい。標的配列はまた、プロモーター配列またはエンハンサー配列を含む標的遺伝子の発現を調節するＤＮＡ配列内であってもよい。
標的配列は、細胞へのＨＩＶの侵入を促進する細胞表面受容体をコードする任意の遺伝子内にあってよいまたはそれに隣接していてよい。細胞へのＨＩＶ侵入の分子機序は、ウイルス外被糖タンパク質（ｅｎｖ）と２つの標的細胞タンパク質、ＣＤ４およびケモカイン受容体との間の特異的相互作用を含む。ＨＩＶ細胞トロピズムは、特定のケモカイン受容体、７回膜貫通型Ｇタンパク質共役受容体に対するｅｎｖの特異性によって決定される（Steinbergerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA.９７巻：８０５〜１０頁（２０００年））。ケモカイン受容体の２つの主なファミリーは、ＣＸＣケモカイン受容体およびＣＣケモカイン受容体（ＣＣＲ）であり、それぞれＣＸＣケモカインおよびＣＣケモカインとのそれらの結合に関して名付けられている。ＣＸＣケモカイン受容体が、従来より急性炎症性応答と関連している一方で、ＣＣＲは慢性炎症およびＴ細胞媒介炎症性反応との関係が見出されている細胞型：好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、樹状細胞およびＴ細胞において主に発現される（Nansenら、２００２年、Blood、９９巻：４頁）。一実施形態では、標的配列は、これだけに限らないが、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ２ｂ、ＣＣＲ３およびＣＣＲ１が挙げられるケモカイン受容体をコードするヒト遺伝子内にあるまたはそれに隣接している。
好ましい実施形態では、標的配列は、ヒトＣＣＲ５遺伝子内にあるまたはそれに隣接している。ＣＣＲ５ケモカイン受容体は初期の、急性ＨＩＶ感染の大部分の場合の原因であるＲ５向性ＨＩＶ株に対する主な共受容体である。ＣＣＲ５遺伝子中にΔ３２変異と称される、ホモ接合性不活性化変異を保有する個体は、Ｒ５向性ＨＩＶ−１株による感染にほとんど完全に耐性である。Δ３２変異は、ＣＣＲ５コード領域中に３２塩基対欠失を生じる。
ＣＣＲ５遺伝子中の別の天然に存在する変異は、ケモカイン受容体タンパク質のの第１の細胞外ループ中のアミノ酸１０１におけるシステインから終止コドンへの変化（Ｃ１０１Ｘ）を示す、ヌクレオチド３０３でのオープンリーディングフレームの単一のＴからＡ塩基対への塩基転換によって特徴付けられる、ｍ３０３変異である（Carringtonら、１９９７年）。変異誘発アッセイは、感染アッセイにおいてＨＩＶ−１ Ｒ５分離株に非感受性であることが見出されたＣＣＲ５ヌルトランスフェクト細胞の表面上にｍ３０３共受容体の発現を検出しなかった（Blanpainら、（２０００年）。
ＨＩＶなどの感染性疾患を処置するために三重鎖形成オリゴヌクレオチドおよびペプチド核酸を使用する標的化遺伝子療法のための組成物および方法は、米国特許出願第２００８／０５０９２０号およびＷＯ２０１１／１３３８０３に記載されている。それぞれ、本明細書で提供される組成物および方法において利用できる三重鎖形成分子の配列、標的配列およびドナーオリゴヌクレオチドを提供している。
例えば、ＣＣＲ５遺伝子中にホモ接合性Δ３２不活性化変異を有する個体は、有意な有害表現型を示さず、この遺伝子が正常なヒトの健康にほとんど重要でないことを示唆している。このことは、ＣＣＲ５遺伝子を本明細書で開示される三重鎖形成分子を使用する標的化変異誘発のための特に魅力的な標的にしている。ヒトＣＣＲ５についての遺伝子は、当技術分野において公知であり、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＭ＿０００５７９で提供されている。ヒトＣＣＲ５遺伝子のコード領域はＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＭ＿０００５７９のヌクレオチド３５８から１４１６によって提供されている。
一部の実施形態では、標的領域は、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ２ｂ、ＣＣＲ３およびＣＣＲ１を含むケモカイン受容体をコードする遺伝子内にあるまたはそれに隣接したポリプリン部位である。好ましい実施形態では、標的領域は、ヒトＣＣＲ５遺伝子のコード領域内のポリプリンまたはホモプリン部位である。三重鎖形成分子のための標的部位として特に有用であるＣＣＲ５遺伝子のコード領域中の３個のホモプリン部位は、ＡＴＧ開始コドンに対して５０９〜５１８、６７９〜６９０および９００〜９０８位である。６７９〜６９０のホモプリン部位は、Δ３２変異によって作り出されるナンセンス変異の部位を部分的に包含している。この標的部位に結合する三重鎖形成分子は、特に有用である。
ｂ．例示的三重鎖形成配列
一部の実施形態では、三重鎖形成分子は、核酸配列ＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴ（配列番号１２５）を含み、好ましくは配列ＴＣＴＴＣＴＴＣＴＣ（配列番号１２６）に連結された配列ＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴ（配列番号１２５）を含み、またはさらに好ましくは配列ＴＣＴＴＣＴＴＣＴＣＡＴＴＴＣ（配列番号１２７）に連結された配列ＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴ（配列番号１２５）を含む。
一部の実施形態では、三重鎖形成分子は、核酸配列ＣＴＴＣＴ（配列番号１２８）を含み、好ましくは配列ＴＣＴＴＣ（配列番号１２９）もしくはＴＣＴＴＣＴＴＣＴＣ（配列番号１３０）に連結された配列ＣＴＴＣＴ（配列番号１２８）を含み、またはさらに好ましくは配列ＴＣＴＴＣＴＴＣＴＣＡＴＴＴＣ（配列番号１３１）に連結された配列ＣＴＴＣＴ（配列番号１２８）を含む。
好ましい実施形態では、三重鎖形成核酸は、配列ＴＣＴＴＣＴＴＣＴＣ（配列番号１２６）またはＴＣＴＴＣＴＴＣＴＣＡＴＴＴＣ（配列番号１２７）に連結された配列ＪＴＪＴＴＪＴＴＪＴ（配列番号１３２）；
あるいは、配列ＴＣＴＴＣ（配列番号１２９）もしくはＴＣＴＴＣＴＴＣＴＣ（配列番号１３０）またはより好ましくはＴＣＴＴＣＴＴＣＴＣＡＴＴＴＣ（配列番号１３１）に連結されたＪＴＴＪＴ（配列番号１３３）を含むペプチド核酸であり、
任意選択で、しかし好ましくは１つまたは複数のＰＮＡモノマーはγＰＮＡである。
具体的な実施形態では、三重鎖形成核酸は、配列

を含むペプチド核酸であり、任意選択で、しかし好ましくは１つまたは複数のＰＮＡモノマーは、γＰＮＡである。なおさらに具体的な実施形態では、太字および下線付き残基はミニＰＥＧ含有γＰＮＡである。
ｃ．例示的ドナー配列
一部の実施形態では、三重鎖形成分子は、ＣＣＲ５遺伝子の各対立遺伝子に１つ、Δ３２欠失（変異部位は太字にされている）の近傍に２つの異なるナンセンス変異を誘導するために組み合わせて使用することができる、配列：

を有するドナー５９１、もしくは配列

を有するドナー５９７などの１つもしくは複数のドナーオリゴヌクレオチド；または、ＣＣＲ５遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子中にナンセンス変異を導入するために適切かつ十分であるその機能性断片と組み合わせて使用される。
別の好ましい実施形態では、ドナーオリゴヌクレオチドは、Δ３２欠失部位（例えば、ＷＯ２０１１／１３３８０３の図１を参照）にわたるように設計され、野生型ＣＣＲ５対立遺伝子にΔ３２欠失を模倣する変化を誘導する。Δ３２欠失部位を標的とするように設計されたドナー配列は、ヘテロ接合性細胞において単一野生型ＣＣＲ５対立遺伝子のノックアウトを促進するために特に有用であり得る。
Δ３２欠失部位を標的とするように設計された好ましいドナー配列として、これだけに限らないが、
ドナーＤＥＬＴＡ３２ＪＤＣ：
5’GATGACTATCTTTAATGTCTGGAAATTCTTCCAGAATTAATTAAGACTGTATGGAAAATGAGAGC 3’ (配列番号138);
ドナーＤＥＬＴＡＪＤＣ２：
5’CCCCAAGATGACTATCTTTAATGTCTGGAACGATCATCAGAATTGATACTGACTGTATGGAAAATG 3’ (配列番号139);および
ドナーＤＥＬＴＡ３２ＲＳＢ：
5’GATGACTATCTTTAATGTCTGGAAATTCTACTAGAATTGATACTGACTGTATGGAAAATGAGAGC 3’ (配列番号140)
またはＣＣＲ５遺伝子に変異を導入するために適切かつ十分である配列番号１３８、１３９もしくは１４０の機能性断片が挙げられる。
４．リソソーム蓄積症
本開示の組成物および方法組成物は、リソソーム蓄積症を処置するためにも使用できる。リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）は、５０を超えて臨床的に認識される、リソソーム機能の欠損から生じるまれな遺伝性代謝障害の群である（Walkley, J.、Inherit. Metab. Dis.、３２巻（２号）：１８１〜９頁（２００９年））。リソソーム蓄積障害は、大きなエンドソーム／リソソーム系の一部である細胞のリソソームオルガネラ（orangelle）の機能障害によって生じる。ユビキチン−プロテアソ−ム（proteosomal）系およびオートファゴソーム系と共に、リソソームは基質分解および再利用、恒常性制御ならびに細胞内シグナル伝達のために必要不可欠である。リソソームの機能障害は、通常、分解または再利用が運命付けられた脂質、糖タンパク質（糖含有タンパク質）またはムコ多糖（二糖単位の繰り返しからなる長い非分枝多糖；グリコサミノグリカンまたはＧＡＧとしても公知）の代謝のために必要な、単一酵素の欠損の結果である。酵素欠損は、望ましくない脂質、糖タンパク質およびＧＡＧの分解または再利用を低減するまたは妨げ、これらの物質の細胞内の集積または「蓄積」を生じる。大部分のリソソーム疾患は、脳、内臓、骨および結合組織がしばしば冒されて、広範な組織および器官の合併症を示す。リソソーム疾患の３分の２より多くは脳を冒す。ニューロンは、リソソームの機能障害に特に脆弱であるようであり、特定の軸索および樹状突起の異常からニューロン死までの一連の欠損症を呈する。
それぞれでは、ＬＳＤは１：１００，０００未満の発生率で生じ、しかし群としての発生率は、出生数１，５００から７，０００に１例に達する（Staretz-Chachamら、Pediatrics、１２３巻（４号）：１１９１〜２０７頁（２００９年））。ＬＳＤは、典型的には先天的な遺伝子エラーの結果である。これらの障害の大部分は、常染色体劣性遺伝であるが、ファブリー病およびハンター症候群（ＭＰＳ ＩＩ）などのいくつかはＸ連鎖劣性遺伝である。罹患した個体は、一般に出生時は正常に見え、しかし疾患は進行性である。臨床疾患の出現は、数年または数十年後まで生じない場合があるが、典型的には致死性である。リソソーム蓄積症は、主に小児を冒し、彼らはしばしば若年で、予測外の年齢で、多くは出生の数ヶ月または数年以内に死亡する。多くの他の小児は、特定の障害の種々の症状を数年患った後にこの疾患で死亡する。臨床疾患は、精神遅滞および／または認知症、失明または聴覚喪失を含む感覚消失、運動系機能障害、発作、睡眠および行動障害などとして明らかになる場合がある。リソソーム蓄積症を有する一部の人々は、肥大した肝臓（肝腫）および肥大した脾臓（脾腫）、肺および心臓の問題、ならびに異常成長した骨を有する。
多数のＬＳＤのための処置は、酵素補充療法（ＥＲＴ）および／または基質合成抑制療法（substrate reduction therapy）（ＳＲＴ）、ならびに症状の処置または管理である。アメリカ合衆国におけるＥＲＴの平均年間費用は、＄９０，０００から＄５６５，０００の範囲である。ＥＲＴは、種々のＬＳＤに対して有意な全身性の臨床効力を有する一方で、組換えタンパク質が血液脳関門を通過できないことから、中枢神経系（ＣＮＳ）疾患症状にはほとんどまたは全く効果が見られない。同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）は、選択されたＬＳＤに対して高度に有効な処置をあらわす。それは、現在、付随する神経学的続発症の進行を防止する唯一の手段である。しかしＨＳＣＴは、高価で、ＨＬＡ適合ドナーを必要とし、重大な罹患率および死亡率を伴っている。近年の遺伝子療法研究は、ＬＳＤがこの種類の処置に関する良好な標的であることを示唆している。
リソソーム蓄積症を処置するために三重鎖形成オリゴヌクレオチドおよびペプチド核酸を使用する標的化遺伝子療法のための組成物および方法は、本明細書で提供される組成物および方法において利用することができる三重鎖形成分子の配列、標的配列および、ドナーオリゴヌクレオチドを提供しているＷＯ２０１１／１３３８０２に記載されている。
例えば、本開示の組成物および方法は、ゴーシェ病（ＧＤ）を処置するために使用することができる。ゴーシェ病は、ゴーシェ症候群としても公知であり、最もよく見られるリソソーム蓄積症である。ゴーシェ病は、リソソームにおける酵素グルコセレブロシダーゼ（酸性β−グルコシダーゼとしても公知）の欠損のために細胞およびある特定の器官で脂質が蓄積する遺伝性遺伝子疾患である。グルコセレブロシダーゼ酵素は、ｂ−グリコシドをｂ−グルコースおよびセラミドサブユニットに切断することによって脂肪性物質グルコセレブロシド（グルコシルセラミドとしても公知）の分解に寄与している（Scriver CR、Beaudet AL、Valle D、Sly WS.、The metabolic and molecular basis of inherited disease、第８版、New York: McGraw-Hill Pub、２００１年：３６３５〜３６６８頁）。酵素が欠損すると、その物質が特に、単核細胞系列、ならびに脾臓、肝臓、腎臓、肺、脳および骨髄を含む器官および組織において蓄積する。
２つの主な形態：非神経障害性（１型、成人期において最もよく観察されるタイプ）および神経障害性（２および３型）がある。ＧＢＡ（ＧＢＡグルコシダーゼ、ベータ、酸性）、グルコシダーゼ媒介ＧＤの原因となる唯一の公知のヒト遺伝子は、第１染色体、１ｑ２１の位置に位置決定されている。２００個を超える変異がこの単一の遺伝子の公知のゲノム配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿００９７８３．１）内に確定されている。最もよく観察される変異は、Ｎ３７０Ｓ、Ｌ４４４Ｐ、ＲｅｃＮｃｉＩ、８４ＧＧ、Ｒ４６３Ｃ、ｒｅｃＴＬであり、８４ＧＧは酵素を合成する能力がないヌル変異である。しかし、Ｎ３７０Ｓ変異は、ほとんどの場合１型疾患および疾患の軽度の形態に関連している。ごくまれには、スフィンゴ脂質活性化因子タンパク質（ゴーシェ因子、ＳＡＰ−２、サポシンＣ）の欠損がＧＤをもたらす場合がある。一部の実施形態では、三重鎖形成分子は、ＧＢＡ中の変異を修正するために設計されたドナーオリゴヌクレオチドの組換えを誘導するために使用される。
別の実施形態では、本明細書で開示される組成物および方法は、酵素アルファガラクトシダーゼＡ（ａ−ＧＡＬ Ａ、ＧＬＡによってコードされる）の欠損から生じる、まれなＸ連鎖劣性障害であるファブリー病（ファブリー病、アンダーソン・ファブリー病、びまん性体幹被角血管腫およびアルファ−ガラクトシダーゼＡ欠損症としても公知）を処置するために使用される。ＧＬＡをコードするヒト遺伝子は、公知のゲノム配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿００７１１９．１）を有し、Ｘ染色体のＸｐ２２に位置決定されている。ＧＬＡ中の変異は、血管、他の組織および器官内に糖脂質グロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３、ＧＬ−３と省略される、またはセラミドトリヘキソシド）の蓄積を生じ、その適切な機能の機能障害を生じる（Karenら、Dermatol. Online J.、１１巻（４号）：８頁（２００５年））。状態は、ヘミ接合性の男性（すなわちすべての男性）、ならびにホモ接合性、および潜在的にヘテロ接合性（キャリア）の女性に影響を与える。典型的には男性は重度の症状を経験する一方で、女性は無症候性から重度の症状に及ぶ場合がある。この変動性は、女性の胚発生の際のＸ不活性化パターンによると考えられている。一部の実施形態では、三重鎖形成分子は、ＧＬＡ中の変異を修正するために設計されたドナーオリゴヌクレオチドの組換えを誘導するために使用される。
好ましい実施形態では、本開示の組成物および方法は、ハーラー症候群（ＨＳ）を処置するために使用される。ハーラー症候群は、ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ Ｉ）、α−Ｌ−イズロニダーゼ欠損症、およびハーラー病としても公知であり、リソソームにおいてムコ多糖の分解に関与する酵素α−Ｌイズロニダーゼの欠損によるムコ多糖の集積を生じる遺伝性障害である（DibおよびPastories、Genet. Mol. Res.、６巻（３号）：６６７〜７４頁（２００７年））。ＭＰＳ Ｉは、症状の重症度に基づいて３つのサブタイプに分けられる。３つすべてのタイプは、酵素α−Ｌ−イズロニダーゼの非存在または不十分なレベルから生じる。ＭＰＳ Ｉ Ｈまたはハーラー症候群は、ＭＰＳ Ｉサブタイプのうち最も重症である。他の２つのタイプは、ＭＰＳ Ｉ Ｓまたはシャイエ症候群およびＭＰＳ Ｉ Ｈ−Ｓまたはハーラー・シャイエ症候群である。α−Ｌ−イズロニダーゼがないと、結合組織の主要構成成分であるヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸が身体に集積する。過剰量のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）は、血液循環に入って身体全体に貯蔵され、一部は尿に排出される。症状は小児期に出現し、早くも最初の年齢で発育遅滞を有する場合がある。通常患者は、２歳から４歳の間で発達が定常に達し、進行性の精神的退化および身体的スキルの喪失が続く（Scottら、Hum. Mutat.６巻：２８８〜３０２頁（１９９５年））。難聴および舌肥大により言語は限定的で、最終的に部位機能障害が角膜の混濁および網膜変性から生じる場合がある。手根管症候群（または身体他所での神経の同様の圧迫）および関節運動の制限もよく見られる。
ａ．例示的標的部位
アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ（α−Ｌ−イズロニダーゼ；ＩＤＵＡ）をコードするヒト遺伝子は、第４染色体、４ｐ１６．３の位置に見出されており、公知のゲノム配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿００８１０３．１）を有する。ハーラー症候群に寄与するＩＤＵＡ中の最もよく見られる変異の２つは、それぞれＩＤＵＡのエクソン２（開始コドンの最初のヌクレオチドに対してゲノムＤＮＡのヌクレオチド７７４）およびエクソン９（開始コドンの最初のヌクレオチドに対してゲノムＤＮＡのヌクレオチド１５６６３）に見出される、ナンセンス点変異であるＱ７０ＸおよびＷ４２０Ｘである。これらの変異は、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ酵素に機能障害をもたらす。ポリプリン：ポリピリミジンストレッチを含む２つの三重鎖形成分子標的配列は、ＩＤＵＡ遺伝子内に同定されている。ポリプリン配列５’ ＣＴＧＣＴＣＧＧＡＡＧＡ ３’（配列番号１４１）および相補的ポリピリミジン配列５’ ＴＣＴＴＣＣＧＡＧＣＡＧ ３’（配列番号１４２）を含む１つの標的部位は、Ｑ７０Ｘ変異の１７０塩基対下流に位置決定されている。ポリプリン配列５’ ＣＣＴＴＣＡＣＣＡＡＧＧＧＧＡ ３’（配列番号１４３）および相補的ポリピリミジン配列５’ ＴＣＣＣＣＴＴＧＧＴＧＡＡＧＧ ３’（配列番号１４４）を含む第２の標的部位は、Ｗ４０２Ｘ変異の１００塩基対上流に位置けられている。好ましい実施形態では、三重鎖形成分子は、これらの標的位置にまたはその近くに結合／ハイブリダイズするように設計されている。
ｂ．例示的三重鎖形成配列およびドナー
ｉ．Ｗ４０２Ｘ変異
一部の実施形態では、Ｗ４０２Ｘ変異の上流の標的配列に結合する三重鎖形成分子は、核酸配列ＴＴＣＣＣＣＴ（配列番号１４５）を含み、好ましくは配列ＴＣＣＣＣＴＴ（配列番号１４６）に連結された配列ＴＴＣＣＣＣＴ（配列番号１４５）を含み、またはさらに好ましくは配列ＴＣＣＣＣＴＴＧＧＴＧＡＡＧＧ（配列番号１４７）に連結された配列ＴＴＣＣＣＣＴ（配列番号１４５）を含む。
一部の好ましい実施形態では、三重鎖形成核酸は、配列ＴＣＣＣＣＴＴ（配列番号１４６）またはＴＣＣＣＣＴＴＧＧＴＧＡＡＧＧ（配列番号１４７）に連結された配列ＴＴＪＪＪＪＴ（配列番号１４８）を含むＷ４０２Ｘ変異の上流の標的配列に結合するペプチド核酸であり、任意選択で、しかし好ましくは１つまたは複数のＰＮＡモノマーはγＰＮＡである。
具体的な実施形態では、三重鎖形成核酸は、配列

を有するペプチド核酸であり、任意選択で、しかし好ましくは１つまたは複数のＰＮＡモノマーはγＰＮＡである。なおさらに具体的な実施形態では、太字および下線付き残基はミニＰＥＧ含有γＰＮＡである。
最も好ましい実施形態では、三重鎖形成分子は、Ｑ７０ＸまたはＷ４０２Ｘ変異部位（複数）における点変異（複数）を修正するために設計された１つまたは複数のドナーオリゴヌクレオチドとの組合せで、本開示の方法に従って投与される。一部の実施形態では、Ｑ７０ＸまたはＷ４０２Ｘ変異における点変異を修正するために設計された配列を含有することに加えて、ドナーオリゴヌクレオチドは、７から１０個の追加的な同義（サイレント）変異も含有する場合がある。追加的サイレント変異は、処置された細胞から単離されたゲノムＤＮＡの対立遺伝子特異的ＰＣＲを使用する修正された標的配列の検出を促進できる。
一部の実施形態では、配列５’ＡＧＧＡＣＧＧＴＣＣＣＧＧＣＣＴＧＣＧＡＣＡＣＴＴＣＣＧＣＣＣＡＴＡＡＴＴＧＴＴＣＴＴＣＡＴＣＴＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧ ３’（配列番号１４９）を有するドナーオリゴヌクレオチドまたはＷ４０２Ｘ変異を修正するために適切かつ十分であるその機能性断片は、細胞においてＷ４０２Ｘ変異を修正するためにＷ４０２Ｘの上流の結合部位を標的とするように設計された三重鎖形成分子と共に投与される。
ｉｉ．Ｑ７０Ｘ変異
一部の実施形態では、Ｑ７０Ｘ変異の下流の標的配列に結合する三重鎖形成分子は、核酸配列ＣＣＴＴＣＴ（配列番号１５０）を含み、好ましくは配列ＴＣＴＴＣＣ（配列番号１５１）に連結された配列ＣＣＴＴＣＴ（配列番号１５０）を含み、またはさらに好ましくは配列ＴＣＴＴＣＣＧＡＧＣＡＧ（配列番号１５２）に連結された配列ＣＣＴＴＣＴ（配列番号１５０）を含む。
好ましい実施形態では、三重鎖形成核酸は、配列ＴＣＴＴＣＣ（配列番号１５１）またはＴＣＴＴＣＣＧＡＧＣＡＧ（配列番号１５２）に連結された配列ＪＪＴＴＪＴ（配列番号１５３）を含むＱ７０Ｘ変異の下流の標的配列に結合するペプチド核酸であり、任意選択で、しかし好ましくは１つまたは複数のＰＮＡモノマーはγＰＮＡである。
具体的な実施形態では、

の配列を有するｔｃＰＮＡ、任意選択で、しかし好ましくは１つまたは複数のＰＮＡモノマーはγＰＮＡである。なおさらに具体的な実施形態では、太字および下線付き残基はミニＰＥＧ含有γＰＮＡである。
ドナーオリゴヌクレオチドは、配列５’ＧＧＧＡＣＧＧＣＧＣＣＣＡＣＡＴＡＧＧＣＣＡＡＡＴＴＣＡＡＴＴＧＣＴＧＡＴＣＣＣＡＧＣＴＴＡＡＧＡＣＧＴＡＣＴＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＧＣ ３’（配列番号１５４）を有してよく、または、Ｑ７０Ｘ変異を修正するために適切かつ十分であるその機能性断片は、細胞においてＱ７０Ｘ変異を修正するためにＱ７０Ｘの下流の結合部位を標的とするように設計された三重鎖形成分子と共に投与される。
Ｘ．組合せ療法
ここで開示される遺伝子編集および増強のためのさまざまな構成成分それぞれは、単独でまたは任意の組合せでおよびさらに１つまたは複数の追加的活性剤との組合せで投与されてよい。すべての場合において薬剤の組合せは、同じ混合物の一部であってよく、または別々の組成物として投与されてよい。一部の実施形態では、別々の組成物は同じ投与経路を介して投与される。他の実施形態では、別々の組成物は異なる投与経路を介して投与される。
Ａ．従来の治療剤
好ましい追加的活性剤の例として、所望の疾患または状態を処置するために当技術分野において公知の他の従来の治療が挙げられる。例えば、鎌状赤血球症の処置では、追加的治療はヒドロキシ尿素（hydroxurea）であってよい。
嚢胞性線維症の処置において、追加的治療として、粘液溶解剤、抗生物質、栄養剤などを挙げることができる。具体的な薬物は、Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ薬物パイプラインに概説されており、これだけに限らないが、ＫＡＬＹＤＥＣＯ（登録商標）（インバスカフトール（invascaftor））、ＯＲＫＡＭＢＩ（商標）（ルマカフトール＋アイバカフトール）、アタルレン（ＰＴＣ１２４）、ＶＸ−６６１＋インバカフトール（invacaftor）、リオシグアト、ＱＢＷ２５１、Ｎ９１１１５およびＱＲ−０１０などのＣＦＴＲ調節剤；高張食塩水、ブロンチトールおよびＰ−１０３７などの気道表面液を改善する薬剤；ＰＵＬＭＯＺＹＭＥ（登録商標）（ドルナーゼアルファ）などの粘液改変剤（mucus alteration agent）；イブプロフェン、アルファ１抗トリプシン、ＣＴＸ−４４３０およびＪＢＴ−１０１などの抗炎症薬；吸入トブラマイシン、アジスロマイシン、ＣＡＹＳＴＯＮ（登録商標）（吸入液用アズトレオナム）、ＴＯＢＩ吸入散剤、レボフロキサシン、ＡＲＩＫＡＣＥ（登録商標）（噴霧リポソーム化アミカシン）、ＡＥＲＯＶＡＮＣ（登録商標）（バンコマイシン塩酸塩吸入散剤）およびガリウムなどの抗感染剤；ならびにａｑｕＡＤＥＫ、パンクレリパーゼ酵素製品、リプロタマーゼおよびブールリパーゼなどの栄養補給剤が挙げられる。
ＨＩＶの処置において追加的治療は、これだけに限らないが、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）、プロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）、融合阻害剤、ＣＣＲ５アンタゴニスト（ＣＣＲ５）（侵入阻害剤とも称される）、インテグラーゼ鎖転移阻害剤（ＩＮＳＴＩ）またはこれらの組合せが挙げられる、抗レトロウイルス剤であってよい。
リソソーム蓄積症の処置において、追加的治療として、例えば酵素補充療法、骨髄移植またはこれらの組合せが挙げられ得る。
Ｂ．追加的変異誘発剤
組成物は、他の変異誘発剤との組合せで使用することができる。好ましい実施形態では、追加的変異誘発剤は、遺伝子編集技術またはその送達ビヒクル（ナノ粒子など）とコンジュゲートまたは連結される。遺伝子編集技術、特に三重鎖形成分子との組合せで使用することができる追加的変異誘発剤として、変異誘発を方向付けることができる薬剤、核酸架橋剤、放射性薬剤もしくはアルキル化基またはＤＮＡ損傷細胞性酵素を動員できる分子が挙げられる。他の適切な変異誘発剤として、これだけに限らないが、アルキル化剤、バイアルキル化剤または挿入剤などの化学的変異誘発剤が挙げられる。共投与のための好ましい薬剤は、Ｙａｌｅ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙによるＰＣＴ／ＵＳ／９４／０７２３４において記載されているソラレン連結分子である。
細胞における遺伝子改変の頻度をさらに増強する薬剤との組合せで遺伝子編集組成物を投与することも望ましい場合がある。例えば、本開示の組成物は、非同調細胞において遺伝子標的化のレベルの増加を促進することが見出されているスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）などの、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤との組合せで投与することができる。
ヌクレオチド除去修復経路は、三重鎖形成分子媒介組換えを促進することも公知である。したがって、本開示の組成物は、ヌクレオチド除去修復経路を増強または増加させる薬剤、例えば内在性損傷認識因子ＸＰＡの発現または活性または標的部位への局在化を増大させる薬剤との組合せで投与することができる。
組成物は、遺伝子編集技術の取込または送達を増強する第２の活性剤との組合せで投与することもできる。例えば、リソソーム向性剤（lysosomotropic agent）クロロキンは、細胞へのＰＮＡの送達を増強することが示された（Abesら、J. Controll. Rel.、１１０巻：５９５〜６０４頁（２００６年）。遺伝子改変の頻度を改善する薬剤は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｅｘ ｖｉｖｏ適用、例えば治療用使用のための造血幹細胞のｅｘ ｖｉｖｏ改変のために特に有用である。
ＸＩ．三重鎖形成および遺伝子改変を決定するための方法
Ａ．三重鎖形成を決定するための方法
三重ヘリックス形成の有用な基準は、三重鎖形成が最大半量である三重鎖形成分子の濃度として推定できる、三重鎖の平衡解離定数、Ｋｄである。好ましくは、その分子は、生理学的相互作用の範囲で標的配列に対して結合親和性を有する。好ましい三重鎖形成分子は、およそ１０−７Ｍに等しいまたはそれより小さいＫｄを有する。最も好ましくは、Ｋｄは有意な分子内相互作用を達成するために２×１０−８Ｍに等しいまたはそれより小さい。種々の方法が三重鎖形成分子の標的二重鎖とのＫｄを決定するために利用可能である。以下の実施例では、Ｋｄはゲル移動度シフトアッセイを使用して推定された（R.H. Durlandら、Biochemistry、３０巻、９２４６頁（１９９１年））。解離定数（Ｋｄ）は、半量が標的配列に結合し、半量が未結合である三重鎖形成分子の濃度として決定することができる。
Ｂ．遺伝子改変を決定するための方法
配列決定および対立遺伝子特異的ＰＣＲは、遺伝子改変が起きたかどうかを決定するための好ましい方法である。ＰＣＲプライマーは、元の対立遺伝子と、組換え後に新規の予測される配列とを識別するように設計される。組換え事象が起きたかどうかを決定する他の方法は、当技術分野において公知であり、行われた改変の種類に基づいて選択することができる。方法として、これだけに限らないが、例えば配列決定、対立遺伝子特異的ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ選択的ＰＣＲ（ＲＥＭＳ−ＰＣＲ）によるゲノムＤＮＡの分析；例えばノーザンブロット、インサイツハイブリダイゼーション、リアルタイムまたは定量的逆転写酵素（ＲＴ）ＰＣＴによる標的遺伝子から転写されたｍＲＮＡの分析；および例えば、免疫染色、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳによる、標的遺伝子によってコードされるポリペプチドの分析が挙げられる。一部の場合では、改変細胞は親対照と比較される。他の方法は、標的遺伝子によって転写されるＲＮＡ、または標的遺伝子によってコードされるポリペプチドの機能における変化を検査することを含むことができる。例えば標的遺伝子が酵素をコードしている場合、酵素機能を検査するように設計されたアッセイを使用することができる。
ＸＩＩ．キット
医療用キットも開示される。医療用キットとして、例えば、遺伝子編集技術もしくはその増強剤またはこれらの組合せの、別々にまたは同じ混合物中に合わせての投薬量の供給が挙げられる。活性剤は、単独で（例えば、凍結乾燥されて）、または医薬組成物中で供給されてよい。活性剤は、単位投薬量であってよく、または投与に先立って希釈されるストックであってよい。一部の実施形態では、キットは薬学的に許容されるキャリアの供給を含む。キットは、活性剤または組成物の投与のためのデバイス、例えばシリンジを含むことができる。キットは、上に記載の使用において化合物を投与するための印刷された指示を含むことができる。
（実施例１）
β−グロビン変異の遺伝子編集のための三重鎖形成ＰＮＡ設計およびナノ粒子製剤
材料および方法
オリゴヌクレオチド
ＭＰγＰＮＡモノマーを報告された通り調製した（Sahuら、J. Org. Chem.、７６巻：５６１４〜５６２７頁（２０１１年））。ＰＮＡオリゴマーを記載の通り（Bahalら、ChemBioChem、１３巻：５６〜６０頁（２０１２年））、Ｂｏｃ化学を使用して固体支持体上で合成した。この研究で使用したＰＮＡの配列は：

である。
β−グロビン／ＧＦＰ融合遺伝子内およびサラセミアマウスモデルのヒトβ−グロビン遺伝子内のβ−グロビンイントロン２中の５７７から５９５位（ｔｃＰＮＡ１およびγｔｃＰＮＡ４）、６１１から６２９位（ｔｃＰＮＡ２）および８０７から８２５位（ｔｃＰＮＡ３）に結合させるために、この研究で使用したｔｃＰＮＡおよびγｔｃＰＮＡの配列。γｔｃＰＮＡ４−Ｓｃｒは同じ塩基組成を有するγｔｃＰＮＡ４のスクランブル化バージョンである。太字および下線は、γＰＮＡ残基を示している。すべてのＰＮＡは、各末端にコンジュゲートした３個のリシン残基を有する。「Ｊ」は、ｐＨ非依存性三重鎖形成を可能にするためのＣを置換したシュードイソシトシンを示している。「Ｏ」は、ｔｃＰＮＡのフーグスティーンおよびワトソンクリック結合ドメインを繋ぐ柔軟なリンカーを形成するために使用される８−アミノ−２，６，１０−トリオキサオクタン酸残基を表している。
ヌクレアーゼ分解から保護するための各末端での３つのホスホロチオエートヌクレオシド間連結の含有を除いて、一本鎖ドナーＤＮＡオリゴマーを標準的ＤＮＡ合成によって調製した。ドナーＤＮＡの配列は、β−グロビンイントロン２中の６２４から６８４位に適合し、下線を付したＩＶＳ２−６５４ヌクレオチドの修正を含んで以下の通り：

である。
ＰＬＧＡナノ粒子合成および特徴付け
ＰＮＡおよびＤＮＡを含有するＰＬＧＡナノ粒子を、二重エマルジョン溶媒蒸発方法を使用して製剤化し、先に記載の通り特徴付けた（McNeerら、Molecular Therapy、１９巻（１号）：１７２〜１８０頁（２０１１年）および）。放出プロファイルを先に記載の通り分析した（McNeerら、Mol. Ther.、１９巻：１７２〜１８０頁（２０１１年））。
ＤＮＡ結合ゲルシフトアッセイ
ゲル電気泳動のために、合成１２０ｂｐ ｄｓＤＮＡ標的を表示のオリゴマーと３７Ｃ、低イオン強度緩衝液（１０ｍＭ ＮａＰｉ、ｐＨ７．４）中でインキュベートした。試料を１０％非変性ポリアクリルアミドゲル上、１Ｘ ＴＢＥ緩衝液中で分離した。ゲルを１００Ｖ／ｃｍ、１．５時間泳動した。電気泳動後、ゲルを１ｘ ＳＹＢＲ−Ｇｏｌｄ（カタログ＃Ｓ１１４９４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて１０分間染色し、１ｘ ＴＢＥ緩衝液を用いて２回洗浄し、次いでｇｅｌ ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＤｏｃ−Ｉｔ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用して画像化した。次いで画像をＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ６．０を使用して反転させた。
結果
ロバストで定量的な様式で遺伝子編集についてアッセイするために、トランスジェニックマウスモデルであって、ＧＦＰコード配列内に埋め込まれたサラセミア関連ＩＶＳ２−６５４（Ｃ→Ｔ）変異を保有するヒトβ−グロビンイントロン２のβ−グロビン／ＧＦＰ融合導入遺伝子を有し、β−グロビン／ＧＦＰ ｍＲＮＡの不正確なスプライシングおよびＧＦＰ発現の欠如を生じる、トランスジェニックマウスモデルを利用した（Sazaniら、Nat. Biotechnol.、２０巻：１２２８〜１２３３頁（２００２年））。ＰＮＡ媒介三重鎖形成は、ＩＶＳ２−６５４位に野生型ヌクレオチドを有することを除いてβ−グロビンイントロン２配列の部分に対して相同性である、６０ヌクレオチドセンスドナーＤＮＡを含むゲノム部位のＤＮＡ修復および組換えを誘導する。組換えを介して、スプライス部位変異は修正され、機能性ＧＦＰの発現が起こる（図１Ａ）（McNeerら、Gene Therapy、２０巻：６５８〜６６９頁（２０１３年）；Bahalら、Curr. Gene Ther.、１４巻：３３１〜３４２頁（２０１４年））。したがってＧＦＰ発現は、フローサイトメトリーによって定量できるゲノム編集頻度の直接の表現型評価を提供する。
一連のｔｃＰＮＡをＩＶＳ２−６５４変異の近傍のβ−グロビンイントロン中の選択されたポリプリンストレッチに結合するように設計した（図１Ｂ）。２つのｔｃＰＮＡをγ位にミニポリエチレングリコール（ミニＰＥＧ）基を用いた部分置換を含有するように合成した（ＭＰγＰＮＡ）（図１Ｃ、および上記配列）。ＰＮＡ中のガンマ置換は、改変によって強化されるヘリックスの事前構築のために、ワトソンクリック結合様式での鎖侵入およびＤＮＡ結合親和性を増強することが示された（Bahalら、ChemBioChem、１３巻：５６〜６０頁（２０１２年））。γｔｃＰＮＡ４は、ワトソンクリックドメインで１つおきの位置にγユニットを含有していることを除いて、ｔｃＰＮＡ１の配列に合致している（上記配列を参照）。スクランブル化γｔｃＰＮＡ（γｔｃＰＮＡ４−Ｓｃｒ）は、γｔｃＰＮＡ４と同じ塩基組成を有するがスクランブル化された配列であった。すべてのｔｃＰＮＡオリゴマーは、溶解度を改善し、ゲノムＤＮＡへの結合親和性を増加させるために両末端に３個のリシンを含めて合成した（上記配列を参照）。
それぞれの標的配列を含有する１２０ｂｐ ＤＮＡ二重鎖へのｔｃＰＮＡの結合を評価するためのゲルシフトアッセイは、すべてのｔｃＰＮＡが生理的条件下で二重鎖ＤＮＡ中のそれらの標的部位に特異的に結合することを示した。スクランブル化配列γｔｃＰＮＡ４−Ｓｃｒオリゴマーの場合は、結合は見られなかった。
ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ＮＰは、ＰＮＡ／ドナーＤＮＡ組合せを初代ヒトおよびマウス造血細胞に、本質的に毒性を伴わずに効果的に送達できる（McNeerら、Gene Therapy、２０巻：６５８〜６６９頁（２０１３年）；Schleifmanら、Mol. Ther.--Nucleic Acids、２巻：ｅ１３５頁（２０１３年）；McNeerら、Mol. Ther.、１９巻：１７２〜１８０頁（２０１１年））。ここで、モル比２：１のｔｃＰＮＡおよびドナーＤＮＡを、ＰＬＧＡ ＮＰに組み込んだ。ＮＰ製剤を走査電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）および動的光散乱（ＤＬＳ）によって評価した。すべてのＮＰは、予測された範囲内のサイズを示し、それらのゼータ電位から算出される通り均一な電荷分布を示した。
水溶液中の核酸放出プロファイルは、先の研究と一致して、ＮＰからの放出に対するγ改変の有害な影響がないことを示した（図１Ｅ）。
（実施例２）
ｅｘ ｖｉｖｏでγｔｃＰＮＡは骨髄細胞ゲノムを編集する
材料および方法
ｅｘ ｖｉｖｏでの実験
骨髄細胞は、β−グロビン／ＧＦＰトランスジェニックマウス由来の大腿骨および脛骨をＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）／１０％ＦＢＳ培地を用いてフラッシングすることによって採取した。２ｍｇ／ｍｌのナノ粒子を使用して、３つ組の試料において、グルタミンを含有するＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳ培地中、およそ３００，０００〜５００，０００個の細胞を、４８時間処理した。４８時間後、細胞を、４％パラホルムアルデヒドを使用して固定し、フローサイトメトリー分析を実施した。ブランクナノ粒子を用いて処理した細胞を対照として含めた。
ＣＤ１１７＋細胞実験について、インスリン（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＣＳ（１０％）およびエリスロポエチン（１Ｕ／ｍｌ）を含有するイスコフ変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）培地を使用して、ＣＤ１１７＋細胞を、磁気分離を使用して単離した後に、培養した。表示の場合、３μｇ／ｍｌのＳＣＦ（組換えマウスＳＣＦ、カタログ＃２５０−０３、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、ＮＪ；）をナノ粒子処理に先立って加えた。２ｍｇ／ｍｌのＮＰを４８時間、上記の培地中、３つ組でＣＤ１１７＋細胞５０，０００〜１００，０００個を処理するために使用し、その後、上記のフローサイトメトリー分析を行った。阻害剤を２００ｎＭ（ダサチニブ）、１．０μＭ（ＭＥＫ１６２）および３．０μＭ（ＢＫＭ１２０）の濃度で使用した。ダサチニブ（Dasatanib）はＣａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ；アイテム＃１１４９８）から得て、製造者のプロトコールに従って溶解した。ＭＥＫ１６２およびＢＫＭ１２０は、Ｄｒ．Ｈａｒｒｉｅｔ Ｋｌｕｇｅｒ、Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから得た。
コメットアッセイ
骨髄細胞４００，０００個／ウエルを培地１ｍＬ中で６ウエルプレートに蒔き、次いでＰＮＡおよびドナーＤＮＡを含むまたは含まない２ｍｇ／ｍＬのＰＬＧＡナノ粒子を用いて処理した。４８時間後、細胞をかき取り、採取し、製造者のプロトコールによりＴｒｅｖｉｇｅｎ Ｃｏｍｅｔ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用して調製した。簡潔には、細胞をアガロースに懸濁し、コメットスライドに加え、セットし、１時間、溶解溶液中でインキュベートし、電気泳動溶液中に３０分間置き、次に２１Ｖ、４５分間泳動し、酢酸溶液中に３０分間置き、７０％エタノール溶液に３０分間移し、乾燥させ、Ｓｙｂｒ Ｇｒｅｅｎを用いて３０分間染色し、次いでＥＶＯＳ顕微鏡を使用して可視化した。ＴｒｉＴｅｋ Ｃｏｍｅｔ Ｓｃｏｒｅフリーウェアを、画像を解析するために使用した。
結果
β−グロビン／ＧＦＰトランスジェニックマウスから採取した骨髄細胞をｅｘ ｖｉｖｏでｔｃＰＮＡ１／ドナーＤＮＡ、ｔｃＰＮＡ２／ドナーＤＮＡおよびｔｃＰＮＡ３／ドナーＤＮＡ組合せを含有するＰＬＧＡ ＮＰを用いて処理した。４８時間後、ＧＦＰ＋（修正された）細胞の百分率を、フローサイトメトリーを介して定量し、ｔｃＰＮＡ１／ドナーＤＮＡ、ｔｃＰＮＡ２／ドナーおよびｔｃＰＮＡ３／ドナーＤＮＡ含有ＮＰが、ゲノム改変を約１．０％、０．５１％および０．１％の頻度でそれぞれ誘導したことを明らかにした（図１Ｄ）。ｔｃＰＮＡ１のより高い遺伝子編集活性は、先に観察された通りそのより長いフーグスティーン結合ドメインのためであると考えられている（Schleifmanら、Chem. Biol.（Cambridge、MA、U.S.）、１８巻：１１８９〜１１９８頁（２０１１年）））。γ置換ｔｃＰＮＡ（γｔｃＰＮＡ４）およびドナーＤＮＡを含有するＮＰは、有意に高い遺伝子改変（１．６２％）をもたらしたが（図１Ｆ）、これは、ＭＰγ置換が、結合特性の改善に相関する生物学的活性の増加を付与することを示している。γ置換されたがスクランブル化配列γｔｃＰＮＡ４−Ｓｃｒを含むＮＰは、改変をもたらさなかった（図１Ｆ）。
ブランクＮＰまたはγｔｃＰＮＡ４／ドナーＤＮＡを含有するＮＰのいずれかを用いて処理した骨髄細胞を、顆粒球／マクロファージコロニー（ＣＦＵ−Ｇ、ＣＦＵ−ＭおよびＣＦＵ−ＧＭ）または混合コロニー（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ、顆粒球、赤血球系、単球／マクロファージ、巨核球）の成長のために選択されたサイトカインを補充したメチルセルロース培地に蒔いた。２セットの処理細胞は、骨髄性および赤血球系のコロニーを同様の頻度で形成し、このことは、γｔｃＰＮＡ４およびドナーＤＮＡを用いた処理が、増殖し、分化する前駆体細胞の能力を損なわないことを示している（図１Ｇ）。選択されたＧＦＰ陽性メチルセルロースコロニー由来のゲノムＤＮＡの配列決定分析から、β−グロビン／ＧＦＰ導入遺伝子中のＩＶＳ２−６５４塩基対での標的遺伝子改変の存在が確認された。毒性についての他のアッセイでは、単一細胞ゲル電気泳動アッセイ（コメットアッセイ）に基づいて、ブランクＮＰと比較して、γｔｃＰＮＡ４／ドナーＤＮＡ含有ＮＰを用いて処理された細胞においてＤＮＡ二重鎖切断（ＤＳＢ）における増加はなく（図１Ｈ）、処理された骨髄細胞において炎症性サイトカイン、ＴＮＦ−アルファまたはインターロイキン−６（ＩＬ−６）の誘導はなく、標準的ＰＮＡを含有するＮＰを用いた先の研究と一致していた（McNeerら、Gene Therapy、２０巻：６５８〜６６９頁（２０１３年）；Schleifmanら、Mol. Ther.--Nucleic Acids、２巻：ｅ１３５頁（２０１３年）；McNeerら、Mol. Ther.、１９巻：１７２〜１８０頁（２０１１年））。
（実施例３）
遺伝子改変は、ＣＤ１１７＋造血細胞においてγｔｃＰＮＡによって上昇する。
材料および方法
細胞選別およびフローサイトメトリー
ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ｋｉｔカタログ＃５５８４５１（ＢＤＩｍａｇＴｍ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｓｅｔ−ＤＭ）を、ＣＤ１１７細胞を単離するために使用した。ＣＤ１１７の富化は、フローサイトメトリーによって確認した。ＣＤ１１７＋富化細胞をＣＤ１１７−ＡＰＣ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（商標）カタログ＃５５８４５１）抗体を用いて標識した。ゲーティング目的のために細胞を対照ＩｇＧ抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（商標）カタログ＃５５５７４６）を用いて共標識した。ＧＦＰ発現を定量するために、ＣＤ１１７共標識（co-labelling）後、緑色蛍光細胞がＦｌ１チャネルで、およびＡＰＣ染色細胞がＦｌ４チャネルで測定されるＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒＳを使用して、フローサイトメトリーをＰＢＳ／１％ＦＢＳ中に細胞を再懸濁して実施した。他のマーカーに対する抗体は、Ｔｅｒ１１９（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（商標）カタログ＃５６１０３３）およびＣＤ４５ ＡＰＣ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（商標）カタログ＃５６１０１８）であった。
結果
先の研究は、ある特定のコロニー形成前駆体においてＰＮＡ媒介ＤＮＡ修復の活性化が増加する可能性があることを示した（McNeerら、Gene Therapy、２０巻：６５８〜６６９頁（２０１３年））。これを検査するために、全骨髄細胞をブランクＮＰ、ｔｃＰＮＡ１／ドナーＤＮＡを含有するＮＰ、またはγｔｃＰＮＡ４／ドナーＤＮＡを含有するＮＰのいずれかを用いて処理した。２日後、フローサイトメトリーを選択された亜集団中でのＧＦＰ＋細胞の頻度を評価するために実施した。実質的に上昇した遺伝子編集が全ＣＤ４５＋細胞集団と比較してＣＤ１１７＋細胞において、γｔｃＰＮＡ４／ドナーＤＮＡ ＮＰを用いた１回処理後のＣＤ１１７＋細胞において８．６％の頻度を有して観察された（図２Ａ）。あまり強力でないｔｃＰＮＡ１／ドナーＤＮＡ ＮＰもＣＤ１１７＋細胞において２．１％の上昇した修正頻度をもたらした。赤血球系細胞系列に関与するさらに成熟した細胞を含むＴｅｒ１１９＋集団は、いずれかのＰＮＡを用いる遺伝子編集に最小の感受性を示した。
次に、遺伝子編集の増加へのＣＤ１１７＋細胞の素因を、ＮＰを用いる処理に先立ってＣＤ１１７＋細胞を最初に選別することによって検査した（図２Ｂ）。改変の百分率の上昇（７．２％）が１回処理後にＣＤ１１７＋細胞において再度見られた（図２Ｂ）。
（実施例４）
ｃ−Ｋｉｔ経路は、ＣＤ１１７＋細胞における遺伝子改変の増加を媒介する。
ＣＤ１１７（マスト／幹細胞成長因子受容体または癌原遺伝子ｃ−Ｋｉｔタンパク質としても公知）は、造血幹細胞および前駆体細胞ならびに他の細胞型の表面上に発現される受容体チロシンキナーゼである。幹細胞因子（ＳＣＦ）、ｃ−Ｋｉｔに対するリガンドは、受容体の二量体化を生じ、そのチロシンキナーゼ活性を活性化し、生存、増殖および分化に影響を与えることができる下流シグナル伝達経路を作動させる。
ＣＤ１１７＋細胞における遺伝子編集の増加の機構を調査するために、遺伝子修正の上昇のためのｃ−Ｋｉｔ依存性シグナル伝達の必要条件または、ＣＤ１１７が遺伝子編集の感受性の増加についてのマーカーとして単に役立つかどうかを見分けた。これを行うために、γｔｃＰＮＡ４／ドナーＤＮＡ ＮＰ媒介遺伝子編集を予め選別したＣＤ１１７＋細胞において、選択されたキナーゼ阻害剤の存在または非存在下でアッセイした（図２Ｄ）。ＢＣＲ／ＡｂｌおよびＳｒｃキナーゼに加えてｃ−Ｋｉｔキナーゼを阻害するダサチニブは、遺伝子編集を７％から２．０％に低減した。マイトジェン／細胞外シグナル調節キナーゼ（ＭＥＫ）（ビニメチニブ；ＭＥＫ１６２）およびホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）（ＢＫＭ１２０）を含む、ｃ−Ｋｉｔの下流のシグナル伝達因子の阻害剤もＣＤ１１７＋細胞において遺伝子編集頻度をそれぞれ２．６％および４．１％に減少させた（図２Ｄ）。
他方、ＣＤ１１７＋細胞をｃ−Ｋｉｔリガンド、ＳＣＦを用いて処理した場合、γｔｃＰＮＡ４／ドナーＤＮＡ媒介遺伝子編集における有意な増加（ほぼ１５％まで）が観察された（図２Ｃ）。これらの結果は、ＳＣＦ／ｃ−Ｋｉｔシグナル伝達が、遺伝子編集を増強でき、ＰＮＡ媒介遺伝子編集を刺激する潜在的薬剤（potential agent）としてＳＣＦを同定できることを示している。
（実施例５）
ＤＮＡ修復遺伝子の発現は、ｃ−Ｋｉｔ＋経路の活性化で増加する。
材料および方法
マイクロアレイ分析
マイクロアレイ分析をＹａｌｅ ｗｅｓｔ ｃａｍｐｕｓのＹａｌｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓで３匹の別々のβ−グロビン／ＧＦＰマウスの骨髄から得たＣＤ１１７＋細胞およびＣＤ１１７−細胞において実施した。それぞれの反復細胞試料は別々のマウスから得た。ＲＮＡをＱｉａｇｅｎからのＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｐｌｕｓ ｋｉｔを製造者のプロトコールにより使用して各試料について２ｘ１０６個から抽出した。ＤＮａｓｅ処理に続いて、Ｙａｌｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓで全ＲＮＡを配列決定し、分析した。全平均分散へのパラメータフィットに基づいて計数データの分散安定化変換を使用してヒートマップを作製した。
ＲＴ−ＰＣＲ分析
細胞を採取し、ペレットにし、ＲＮＡ安定化試薬（Ｑｉａｇｅｎ）中で、ＲＮＡ抽出のための準備が整うまで冷凍保存した。ＲＮＡをＱｉａｇｅｎからのＲＮＡｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｐｌｕｓ ｋｉｔを製造者のプロトコールにより使用して細胞ペレットから抽出した。ＲＮＡからｃＤＮＡを生成するために反応１回当たり５００ｎｇのＲＮＡを使用してＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ｋｉｔを製造者のプロトコールにより使用した。ＰＣＲ反応物は、ｃＤＮＡ、２０％ベタイン、０．２ｍＭ ｄＮＴＰＳ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ、０．２μＭの各プライマー、２％Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＴａｑおよびＢｒｉｌｌｉａｎｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを含有した。プライマーおよびＲＯＸ参照色素をＳｔｒａｔａｇｅｎｅから得て、分析はＭｘ３０００ｐリアルタイムサイクラーを使用して実行した。サイクラー条件は、９４℃で２分間、９４℃、３０秒間／５０℃、３０秒間／７２℃、１分間を４０サイクル、次いで９５℃で１分間であった。相対的発現を、２ΔΔＣｔ方法（Ｃｔ＜３６）を使用して算出し、次いで正規化した。マウスＢＲＣＡ２プライマーをプライマー３データベース：ＢＲＣＡ２−３Ｆ：５’ＧＴＴＣＡＴＡＡＣＣＧＴＧＧＧＧＣＴＴＡ（配列番号２０３）およびＢＲＣＡ２−３Ｒ：５’ＴＴＧＧＧＡＡＡＴＴＴＴＴＡＡＧＧＣＧＡ（配列番号１７６）を使用して設計した。ＢＲＣＡ２データ分析のためにＧＡＰＤＨを、次のプライマー：５’−ＴＧＡＴＧＡＣＡＴＣ ＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧ−３’（配列番号１７７）および５’−ＴＣＣＴＴＧＧＡＧＧ ＣＣＡＴＧＴＧＧＧＣＣＡＴ−３’（配列番号１７８）を使用する対照として使用した。ＲＡＤ５１分析のために、Ｒａｄ５１ ｍＲＮＡをＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍｍ００４８７９０５＿ｍ１）キットを使用し、対照として遺伝子１８Ｓ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍｍ０３９２８９９０＿ｇ１）を使用して定量した。
ウエスタンブロット分析
ＣＤ１１７＋細胞およびＣＤ１１７−細胞をβ−グロビン／ＧＦＰマウスから単離し、タンパク質を放射免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）溶解緩衝液を用いて抽出した。５０〜１００μｇの全タンパク質をＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルで泳動し、ニトロセルロース膜に移した。使用した抗体は：抗ＢＲＣＡ２（Ａｂ−１）マウスｍＡｂ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＯＰ９５−１００ｕｇ）抗ＲＡＤ５１抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＳＣ ８３４９））であった。
結果
ｃ−Ｋｉｔ＋（ＣＤ１１７）細胞における遺伝子編集の増加は、数個の骨髄細胞亜集団全体にわたって取込において検出可能な差異がないことから、ＮＰの取込の差異では説明されなかった。ｃ−Ｋｉｔ＋細胞における遺伝子発現パターンをＤＮＡ修復遺伝子発現の増加について評価した。遺伝子発現分析をβ−グロビン／ＧＦＰマウス由来全骨髄から選別されたＣＤ１１７＋細胞およびＣＤ１１７−細胞においてＩｌｌｕｍｉｎａ ａｒｒａｙを使用して実施した。
ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、Ｒａｄ５１、ＥＲＣＣ２、ＸＲＣＣ２、ＸＲＣＣ３を含むＤＮＡ修復に関与している多数の遺伝子は、ＣＤ１１７＋細胞においてより高いレベルの発現を示した。ＰＮＡ誘導組換えにおいて役割を演じることが予測される２つの重要なＨＤＲ遺伝子、ＢＲＣＡ２およびＲａｄ５１は、アレイによって検出された、上方調節された遺伝子に含まれていた。これらの遺伝子の発現の増加は、ＣＤ１１７＋細胞において、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（図２Ｅおよび２Ｆ）によってｍＲＮＡレベルで、およびウエスタンブロットによってタンパク質レベルで確認された。
これらの所見に基づいて、ＤＮＡ修復遺伝子発現をさらに増加させるためのＳＣＦ処理によるｃ−Ｋｉｔ経路の活性化を調べた。ＳＣＦ処理ＣＤ１１７＋細胞対未処理ＣＤ１１７＋細胞での遺伝子発現プロファイリングは、Ｒａｄ５１およびＢＲＣＡ２を再度含む多数のＤＮＡ修復遺伝子の追加的上方調節を示した（図２Ｇ）。
（実施例６）
ｃ−Ｋｉｔ経路はＤＮＡ修復の機能的上昇を誘導する
材料および方法
相同性依存修復についてのレポーター遺伝子アッセイ
不活性化Ｉ−Ｓｃｅ１部位は、ＣＭＶプロモーターの制御下のホタルルシフェラーゼオープンリーディングフレームに５６アミノ酸をクローニングした。レポーター構築物も相同組換のための鋳型として使用されるプロモーターを有さないルシフェラーゼ遺伝子を含有している。ルシフェラーゼレポーター内の二重鎖切断をＩ−Ｓｃｅ Ｉ制限酵素（ＮＥＢ ＃ Ｒ０６９４Ｌ）を用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ消化によって生じさせる。プラスミドＤＮＡをＩ−Ｓｃｅ １を用いて１時間、３７℃、酵素１０単位対ＤＮＡ １μｇの比で消化し、次いで酵素を６５℃、２０分間不活性化させた。プラスミドの線状化を各消化物についてゲル電気泳動を介して確認し、線状プラスミドをＱｉａｇｅｎ Ｑｉａｑｕｉｃｋ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎを使用して精製した。β−グロビン／ＧＦＰトランスジェニックマウスの骨髄由来のＣＤ１１７＋細胞およびＣＤ１１７−細胞の分離後、細胞をＬｏｎｚａ ２ｂ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｄｅｖｉｃｅを使用してトランスフェクトした。細胞５ｘ１０５個に１μｇのルシフェラーゼレポーターベクターまたは陽性対照ホタルルシフェラーゼ発現ベクターのいずれかを、トランスフェクション効率対照としての５０ｎｇのウミシイタケルシフェラーゼ発現プラスミドと共に用いてトランスフェクトした。すべてのトランスフェクションを３つ組で実施した。トランスフェクション後、細胞を細胞５×１０５個／ｍｌの密度で１２ウエルプレートに蒔いた。トランスフェクション後の２４時間インキュベーション後、ルシフェラーゼ活性をＰｒｏｍｅｇａ Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを使用して測定した。各試料においてホタルルシフェラーゼ活性をウミシイタケルシフェラーゼトランスフェクション対照に対して正規化した。レポーター再活性化を、レポータープラスミドをトランスフェクトした細胞における正規化ホタルルシフェラーゼ活性の陽性対照に対する比として算出した。
結果
ＤＮＡ修復遺伝子発現における上記増加がＤＮＡ修復における機能的差異と相関し得るかどうかを検査するために、ルシフェラーゼベースアッセイをＨＤＲによるＤＮＡ二重鎖切断（ＤＳＢ）の修復を定量するために使用した。このアッセイでは、分子内相同組換えを介するレポータープラスミド中のＤＳＢの修復は、機能性ルシフェラーゼ遺伝子を生じさせ（「再活性化し」）（図２Ｈ）、それによりアッセイはＨＤＲ能力の尺度を提供する（図２Ｊ）。結果は、ＣＤ１１７−細胞と比較してＣＤ１１７＋細胞におけるルシフェラーゼ再活性化の増加を示している（図２Ｈ）。ＣＤ１１７＋細胞における修復活性は、キナーゼ阻害剤ＭＥＫ１６２、ＢＫＭ１２０およびダサチニブ（dasatnib）を用いる処理によって減退し（図２Ｈ）；逆に、ＳＣＦ処理によってさらにブーストされた（図２Ｉ）。これらの結果は、機能性ｃ−Ｋｉｔシグナル伝達経路がＨＤＲの増加を媒介することを示している。
（実施例７）
ＰＮＡ／ＤＮＡ ＮＰの静脈内注射によるｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子編集はＳＣＦ処置によって増強される
材料および方法
マウスモデルおよびｉｎ ｖｉｖｏ処置
すべての動物使用は、Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙのガイドラインに従い、Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１９９６年）における勧告に従った。
β−グロビン／ＧＦＰトランスジェニックマウスをＲｙｓｚａｒｄ Ｋｏｌｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａから得た（Sazaniら、Nat. Biotechnol.、２０巻：１２２８〜１２３３頁（２００２年））。マウスの処置のために、示されたＳＣＦ（マウス１匹当たり１５．６ｕｇ、組換えマウスＳＣＦ、キャリア不含有、Ｒ＆Ｄカタログ＃４５５−ｍｃ−０５０／ＣＦ）を、後眼窩静脈内注射を介して送達される１５０μｌ ＰＢＳ中４ｍｇのＮＰを用いる処置の３時間前に、腹腔内注射した。一部の場合では、マウスをＮＰ注射の４８時間後に屠殺し、骨髄および脾臓細胞をさらなる分析のために採取した。骨髄および脾臓細胞（各５００，０００個）を上に記載の通りＡＰＣコンジュゲート抗体を用いて共標識し、フローサイトメトリーを上記の通り実施した。ディープシークエンシング分析のために、ＣＤ１１７＋細胞をＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌ（ＢＤＩｍａｇＴｍ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｓｅｔ−ＤＭ）に従った磁気分離方法に基づいて単離し、マウス３匹からのゲノムＤＮＡをプールし、続いて、記載の配列分析を行った（McNeerら、Gene Therapy、２０巻：６５８〜６６９頁（２０１３年））。
ＩＶＳ２−６５４ β−サラセミアマウスもＲｙｓｚａｒｄ Ｋｏｌｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａから得た（Svastiら、Proc Natl Acad Sci USA、１０６巻：１２０５〜１２１０頁（２００９年））。マウスの処置のために、示されたＳＣＦ（マウス１匹当たり１５．６ｕｇ、組換えマウスＳＣＦ、キャリア不含有、Ｒ＆Ｄカタログ＃４５５−ｍｃ−０５０／ＣＦ）を、後眼窩静脈内注射を介して送達される１５０μｌ ＰＢＳ中４ｍｇのＮＰを用いる処置の３時間前に、腹腔内注射した。各マウスは、４８時間間隔で４回の処置を受けた。イソフルランを用いてマウスを麻酔し、続いて、エチレンジアミン四酢酸酸処理ガラスキャピラリーチューブを使用する後眼窩放血を行った（約１００μＬ）。血液をヘパリン化被覆チューブ中の５μＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡ酸を含むチューブ中に出した。全血球計算を製造者のプロトコールに従ってＨｅｍａｖｅｔ ９５０ＦＳ（Ｄｒｅｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＣＴ）を使用して実施した。血液スメアを含有するスライドをＷｒｉｇｈｔおよびＧｉｅｍｓａ染色を用いて顕微鏡検査のために染色した。メチレンブルー染色を網状赤血球計数のために使用した。脾臓の画像および重量は、選択したマウスを最後の処置後３６日目に屠殺した後に取った。採取した脾臓を１０％中性緩衝ホルマリン中で固定し、Ｈ＆Ｅ、ＣＤ６１およびＥカドヘリン染色のためにＹａｌｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｓｅｒｖｉｃｅｓによって処理した。
上に列挙する処置群に動物を割り当てるために、同腹仔の動物を遺伝子型同定し、次に必要とされる遺伝子型を保有する仔（β−グロビン／ＧＦＰトランスジェニックマウスまたはＩＶＳ２−６５４ β−サラセミアマウスのいずれか）を、表示の通り３から６匹のコホートの数個の処置群に無作為化した。本調査者らは、処置群について盲検ではなかった。
ゲノムＤＮＡ抽出およびディープシークエンス分析
表示の通りｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで処置したマウス細胞由来のゲノムＤＮＡを、Ｗｉｚａｒｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して採取し、次いで残存している可能性があるＰＮＡおよび／またはＤＮＡオリゴヌクレオチドからゲノムＤＮＡを分離するためにＴＡＥ中の１％低融点アガロースゲルで電気泳動した。ゲノムＤＮＡを示す高分子量種を、アガロースゲルから切り出し、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造者の指示に従って使用して抽出した。処置細胞またはマウス組織からゲノムＤＮＡを単離した後、高忠実度ＴＡＱポリメラーゼを用いてＰＣＲ反応を実施した。各ＰＣＲチューブは、２８．２μＬ ｄＨ２Ｏ、５μＬ １０ｘ ＨｉＦｉ緩衝液、３μＬ ５０ｍＭ ＭｇＣｌ−２、１μＬ ＤＮＴＰ、フォワードプライマーおよびリバースプライマーそれぞれ１μＬ、０．８μＬ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）および１０μＬ ＤＮＡ鋳型からなった。ＰＣＲ産物をＩｌｌｕｍｉｎａ ｐｒｏｔｏｃｏｌ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に従って末端修復およびアダプター（adapter）ライゲーションによって調製し、試料をＹａｌｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓで７５ペアードエンドリードを用いてＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑによって配列決定した。試料を先に記載の通り分析した（McNeerら、Gene Therapy、２０巻：６５８〜６６９頁（２０１３年））。ディープシークエンシングのためのプライマーを、プライマー３データベースを使用して設計した。β−グロビンイントロン２のために使用したプライマーは、次の通りであった：フォワードプライマー：５’ ＴＡＴＣＡＴＧＣＣＴＣＴＴＴＧＣＡＣＣＡ（配列番号１７９）；リバースプライマー：５’ ＡＧＣＡＡＴＡＴＧＡＡＡＣＣＴＣＴＴＡＣＡＴＣＡ（配列番号１８０）。部分的相同性のオフターゲット部位のためのプライマーは、次の通りであった；フォワードプライマーを先に列挙する：血管細胞接着タンパク質前駆体１（５’ ＡＧＡＴＡＡＴＴＡＴＴＧＣＣＴＣＣＣＡＣＴＧＣ（配列番号１８１）および５’ ＡＡＴＧＧＡＡＧＧＧＣＡＴＧＣＡＧＴＣＡ（配列番号１８２））；ポリピリミジントラクト結合タンパク質（５’ ＣＣＣＡＡＴＣＣＴＧＡＡＴＣＣＴＧＧＣＴ（配列番号１８３）および５’ ＣＡＴＡＣＴＧＡＴＧＴＣＴＧＴＧＧＣＴＴＧＡ（配列番号１８４））；プロトカドヘリンｆａｔ４前駆体（５’ ＡＡＧＣＴＣＡＡＡＣＣＴＡＣＣＡＧＡＣＣＡ（配列番号１８５）および５’ ＡＧＣＴＧＧＡＡＧＣＴＴＣＴＴＣＡＧＴＣＡ（配列番号１８６））；嗅覚受容体２６６（５’ ＣＣＣＴＣＴＧＴＧＧＡＣＴＧＡＧＧＡＡＧ（配列番号１８７）および５’ ＴＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＧＧＧＴＡＴＧＴＧＡ（配列番号１８８））；シンタキシン結合タンパク質（５’ ＣＡＡＡＡＡＧＣＣＴＴＡＡＧＣＡＡＡＣＡＣＴＣ（配列番号１８９）および５’ ＴＣＴＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＴＣＴＡＴＴＣＣ（配列番号１９０））；マッスルブラインド様タンパク質（５’ ＴＧＴＧＴＴＴＧＴＴＴＡＴＧＧＡＴＡＣＴＴＧＡＧＣ（配列番号１９１）および５’ ＧＣＡＴＧＣＡＣＡＡＴＡＡＡＧＧＣＡＣＴ（配列番号１９２））；セルロプラスミンアイソフォーム（５’ ＣＡＴＧＧＧＡＡＡＣＡＧＴＣＡＡＡＡＧＡＡＡ（配列番号１９３）および５’ ＴＧＴＡＧＧＴＴＴＣＣＣＣＡＣＡＧＣＴＴ（配列番号１９４））。
結果
β−グロビン／ＧＦＰトランスジェニックマウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子編集の潜在性をγｔｃＰＮＡ４およびドナーＤＮＡを含有するＮＰの静脈内注射によって調査した。ｉｎ ｖｉｖｏで遺伝子編集を増強するＳＣＦ処置の能力も検査した。マウスを１５０μｌ ＰＢＳ中４ｍｇ ＮＰの単回静脈内用量を用いて処置し、２日後に骨髄および脾臓由来の細胞における遺伝子編集の分析のためにマウスを屠殺した。一部のマウスは、表示の通りＮＰ注射の３時間前に腹腔内注射によってマウスＳＣＦ（１５．６μｇ）も受けた。ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子編集を骨髄および脾臓由来のマーカー選別細胞集団におけるＧＦＰ発現によってスコア化した（図３ＡおよびＢ）。最も高いレベルの遺伝子編集は、ＳＣＦ処置マウスの骨髄および脾臓由来のＣＤ１１７＋細胞において、数匹のマウスで１％の範囲の頻度、および平均頻度０．４％から０．５％の範囲で見られた。
これらの結果を、処置マウスの骨髄および脾臓から単離されたＣＤ１１７＋細胞由来のゲノムＤＮＡに、ディープシークエンシング分析を実施することによって確認し（図３Ｃ）、これにより、遺伝子編集頻度がＮＰのみを用いて処置したマウスの骨髄において０．２％の範囲、ＮＰと共にＳＣＦを受けたマウスにおいて０．６％の範囲にあり、ＧＦＰ発現によって定量された遺伝子修正の頻度と一致していることを明らかにした。ディープシークエンシングを使用して、ＳＣＦならびにγｔｃＰＮＡ４およびドナーＤＮＡ ＮＰを用いて処置したマウスの骨髄細胞におけるオフターゲット効果を評価した（表４）。ＢＬＡＳＴ分析によって、β−グロビンイントロン２中のγｔｃＰＮＡ４の標的部位に部分的相同性を有する７つのオフターゲット部位を同定した。これらの部位での変異頻度を、ディープシークエンシングを介して定量した。６つの部位が数百万の読み取りから検出可能な配列変化がないことをし、標的化β−グロビン部位での０．５６％と比較して２つの部位が０．００７４％および０．０００１８％だけの改変頻度を示す、非常に低い頻度のオフターゲット効果がγｔｃＰＮＡ４／ドナーＤＮＡ処置マウスにおいて見出された（表４）。７つすべての部位を合わせた全体のオフターゲット改変頻度は、０．０００３４％であり、標的化遺伝子編集の頻度の１，６４７分の１であった。
表示の配列を有する、β−グロビンイントロン２中の１８ｂｐ γｔｃＰＮＡ４標的部位に部分的相同性を有する上位７つの遺伝子の遺伝子座を同定した。β−グロビン／ＧＦＰマウスを、ＳＣＦを用いて処置し、続いて、γｔｃＰＮＡ４／ドナーＤＮＡを含有するＮＰの静脈内注入を行い、ｃ−Ｋｉｔ＋骨髄細胞由来ゲノムＤＮＡをこれらの遺伝子座でのディープシークエンシング分析に供した。各部位周辺で配列決定した領域のサイズを、配列決定した対立遺伝子の数および改変された配列を含む対立遺伝子の数と共に列挙する。
（実施例８）
ＳＣＦおよびＰＮＡ ＮＰ処置は、β−サラセミア疾患マウスモデルにおけるゲノム変異を修正できる
ＳＣＦとＰＮＡ ＮＰとを組み合わせたｉｎ ｖｉｖｏでの処置が疾患マウスモデルにおいてヒトβ−サラセミア変異をどの程度修正できるかを検査するために、２つの（ｃｉｓ）マウス成体ベータグロビン遺伝子を、サラセミア関連ＩＶＳ２−６５４変異を含むヒトβ−グロビン遺伝子の単一コピーを用いて置き換えたトランスジェニックマウス株を利用した（Svastiら、Proc Natl Acad Sci USA、１０６巻：１２０５〜１２１０頁（２００９年））。ホモ接合性マウスは生存せず、ヘテロ接合体は中程度の形態のβ−サラセミアを有し、マウスβ−グロビンの量の低減およびヒトβ−グロビンの非存在を反映する顕著な溶血性貧血、小赤血球症ならびにＭＣＨＣおよび赤血球（ｒｅｄ ｃｅｌｌ）分布幅の増加を有する（Lewisら、Blood、９１巻：２１５２〜２１５６頁（１９９８年）；Svastiら、Proc Natl Acad Sci USA、１０６巻：１２０５〜１２１０頁（２００９年））。これらのマウスからの血液スメアは、β−サラセミアと一致する赤血球形態を示している。この実験についての処置群は、（１）ブランクＮＰ；（２）ＳＣＦ処置のみ（ＮＰ非存在）；（３）ＳＣＦに加えてγｔｃＰＮＡ４／ドナーＤＮＡ ＮＰ；および（４）ＳＣＦに加えてγｔｃＰＮＡ４−Ｓｃｒ／ドナーＤＮＡを含んだ。ＳＣＦ注射はｉ．ｐ．で与え、ＮＰは後眼窩注射を介してｉ．ｖ．で与えた。各処置群は、マウス６匹からなり、各マウスは２日間隔で４回処置を受けた。血液スメアを０日目（処置前）および最後の処置後の３６日目に調べ、γｔｃＰＮＡ４／ドナーＤＮＡ処置マウスにおいて３６日目にＲＢＣ形態の顕著な改善を示したが、ブランクＮＰ、ＳＣＦのみまたは、ＳＣＦに加えてγｔｃＰＮＡ４−Ｓｃｒ／ドナーＤＮＡのいずれかを用いて処置したマウスでは示さなかった。野生型と比較して、未処置群（および対応する対照動物）は、β−サラセミアに典型的である極度の変形赤血球症ならびに多数の標的細胞、カボット環、色調不同症および楕円赤血球症、β−サラセミアに特徴的な変化の存在を示している。γｔｃＰＮＡ４／ドナーＤＮＡおよびＳＣＦを用いる処置は、変形赤血球症を回復させ、赤血球大小不同症、楕円赤血球症およびＲＢＣにおけるアルファ−グロビン沈殿の低減を示す標的細胞の低減をもたらす。
各群のマウスから処置の３０、４５、６０および７５日後に採取された血液試料に実施したＣＢＣ分析は、ＳＣＦに加えてγｔｃＰＮＡ４／ドナーＤＮＡ ＮＰを用いて処置したマウスにおいて、血中ヘモグロビンレベルの正常範囲への上昇を伴う、貧血の持続的な是正を示した（図４Ａ〜４Ｃ）。ＳＣＦに加えてγｔｃＰＮＡ４／ドナーＤＮＡ処置したマウスだけが実験の期間中に正常範囲内のヘモグロビンレベルを達成および維持し、これは、遺伝子編集によって付与されたヘモグロビン安定性の増加を反映していた。
貧血は、いずれの対照においても改善しなかった。網状赤血球数はＳＣＦに加えてγｔｃＰＮＡ４／ドナーＤＮＡ ＮＰを用いて処置したマウスにおいて観察されたが、ブランクＮＰを用いて処置したマウスにおいては観察されなかった（図４Ｄ）。ディープシークエンシング分析を処置後３６日目に屠殺した各群由来のマウス３匹の骨髄細胞から抽出したゲノムＤＮＡに実施した。標的化変異の修正が、γｔｃＰＮＡ４／ドナーＤＮＡ処置群ではおよそ４％の頻度で見られた（図４Ｅ）一方で、ブランクＮＰを用いて処置したマウスにおいて修正は見られなかった。加えて、貧血の是正および網状赤血球増加症の抑制と一致して、γｔｃＰＮＡ４／ドナーＤＮＡ処置マウスは、処置後３６日に脾腫の低減も示した。
脾腫の低減と一致して３６日目に屠殺したマウスの脾臓の組織学的検査は、γｔｃＰＮＡ４／ドナーＤＮＡ処置マウスにおいて脾臓構築の実質的な改善を特異的に示した。野生型脾臓において見られる通り、赤脾髄の周縁部に囲まれている白脾髄（リンパ濾胞）の通常の脾臓の組織学的パターンは、β−サラセミア動物（ブランクＮＰ、ＳＣＦのみ、ＳＣＦに加えてスクランブル化γｔｃＰＮＡ４−Ｓｃｒ／ドナーＤＮＡ ＮＰ）においては髄外造血のために破壊されており、赤脾髄の拡大（脾腫を生じる）および白脾髄の破壊を生じている。ＣＤ６１およびＥｃａｄ免疫組織化学染色は、髄外造血に特徴的な細胞充実性の増加を明らかにし、β−サラセミア動物における赤脾髄の拡大が巨核球および赤血球前駆体のそれぞれの数の上昇を含むことを実証している。この細胞充実性の増加は、γｔｃＰＮＡ４／ドナーＤＮＡ処置マウスにおいて実質的に回復している。
ディープシークエンシングをｉｎ ｖｉｖｏで処置したサラセミアマウスの骨髄でのオフターゲット効果を評価するためにも使用した。上記の通り、β−グロビン遺伝子中のγｔｃＰＮＡ４の結合部位に部分的相同性を有する７つのオフターゲット部位を分析した。β−グロビン／ＧＦＰトランスジェニックマウスにおける結果（表４）と同様の、非常に低い頻度のオフターゲット効果だけがγｔｃＰＮＡ４／ドナーＤＮＡ処置サラセミアマウスにおいて見出された（表５）。この場合に全体のオフターゲット改変頻度は、０．００３２％であり、β−グロビン遺伝子編集の頻度の１，２１８分の１であった。
表示の配列を有する、β−グロビンイントロン２中の１８ｂｐ γｔｃＰＮＡ４標的部位に部分的相同性を有する上位７つの遺伝子の遺伝子座を同定した。サラセミアマウスを、ＳＣＦを用いて処置し、続いて、γｔｃＰＮＡ４／ドナーＤＮＡを含有するＮＰの静脈内注入を行い、ｃ−Ｋｉｔ＋骨髄細胞由来ゲノムＤＮＡをこれらの遺伝子座でのディープシークエンシング分析に供した。各部位周辺で配列決定した領域のサイズを、配列決定した対立遺伝子の数および改変された配列を含む対立遺伝子の数と共に列挙する。
総じて上記の結果は、ＳＣＦ処置との組合せで与えられる、ポリマーＮＰを介して静脈内に送達された化学修飾されたγＰＮＡおよびドナーＤＮＡが、サラセミアマウスにおいて疾患表現型を回復させるために十分なレベルでｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子編集を媒介できることを実証している。貧血の持続的な逆転が、血清ヘモグロビン濃度の正常化および網状赤血球増加症の抑制と共に誘導された。ＲＢＣ安定性の改善を示す、ＲＢＣ細胞学における形態学的改善は、髄外造血の低減および脾腫の低減と共に観察された。この一群の所見は、本開示の治療的アプローチが、β−サラセミアに関連する罹患率および死亡率を緩和する実質的な臨床応答をもたらす潜在性を有することを示している。
この研究において遺伝子編集について少なくとも２つの重要な進歩がある。進歩の１つは、標準的ＰＮＡと比較して遺伝子編集頻度の増加を一貫してもたらすためのポリアミド骨格内のガンマ位置での置換による次世代ＰＮＡ化学の組み込みである。この有効性の増加は、ミニＰＥＧγ置換によって強化されるヘリックスコンホメーションの事前構築を担う、γＰＮＡのＤＮＡ結合特性の増強と相関している。
別の進歩は、ＳＣＦ／ｃ−Ｋｉｔ経路が三重鎖形成ＰＮＡおよびドナーＤＮＡによる遺伝子編集の増加を促進するという所見である。γＰＮＡを用いる骨髄細胞のｅｘ ｖｉｖｏ処置で、ｃ−Ｋｉｔ＋細胞における遺伝子編集頻度は８％程高かった。γＰＮＡとのＳＣＦ処置の組合せは、ｃ−Ｋｉｔ＋細胞において、わずか１回の処置で１５％を超えるさらにより高い頻度をもたらした。ｉｎ ｖｉｖｏでは、β−グロビン／ＧＦＰレポーター導入遺伝子を保有するトランスジェニックマウスの、ＳＣＦのｉ．ｐ．注射に続くγＰＮＡおよびドナーＤＮＡを含有するＮＰの静脈内投与による処置は、骨髄および脾臓中のＣＤ１１７＋細胞における遺伝子編集を１回の処置で１％までの頻度でもたらした。レポーターマウスでのこれらの結果によって促されて、サラセミアマウスモデルにおいて遺伝子編集を、ＳＣＦとγＰＮＡ／ドナーＤＮＡ ＮＰとの最適化された組合せを２日間隔で４回与える静脈内注射だけを介して検査した。このレジメンは、遺伝子編集を全骨髄細胞においておよそ４％の頻度でもたらし、疾患表現型の持続性の回復を生じさせ、幹細胞採取または移植の必要なくわずかに侵襲性の様式で達成した。
重要なことに、造血コロニー形成、炎症性サイトカインの誘導のための、鎖切断の生成のための、およびディープシークエンシングによるオフターゲット変異誘発のための一連のｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏアッセイにおいて、測定可能な細胞毒性は本質的になく、非常に低いオフターゲットゲノム効果がγＰＮＡ含有ＮＰからあり、他の遺伝子編集アプローチと比較して有望な安全性の有利点を提供している（Cradickら、Nucleic Acids Res.、４１巻：９５８４〜９５９２頁（２０１３年））。
ＣＤ１１７は、ｃ−Ｋｉｔ遺伝子の産物であり、複数の細胞経路への下流シグナル伝達を媒介する受容体チロシンキナーゼである。上で考察された結果は、ＣＤ１１７が表現型についての単なるマーカーであるよりむしろ、この経路の活性化が遺伝子編集を促進することを示している。ダサチニブを用いるｃ−Ｋｉｔキナーゼの阻害は、頻度をおよそ１／４に低減する一方で、ＳＣＦを用いる処理は頻度をおよそ２倍にする。ＣＤ１１７−細胞と比較して、機構的に、ＣＤ１１７＋骨髄細胞では、先行する研究が三重鎖誘導遺伝子編集のために必要であることを示したＨＤＲ経路中の因子を含む多数のＤＮＡ修復遺伝子の発現レベルが上昇している（Vasquezら、Science、２９０巻：５３０〜５３３頁（２０００年）；Rogersら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、９９巻：１６６９５〜１６７００頁（２００２年）；Dattaら、J Biol Chem、２７６巻：１８０１８〜１８０２３頁（２００１年）；Vasquezら、Proc Natl Acad Sci USA、９９巻：５８４８〜５８５３頁（２００２年））。ＣＤ１１７＋細胞を、ＳＣＦを用いて処理する場合、これらのＤＮＡ修復遺伝子の発現はさらにより増加し、遺伝子編集のさらなる増加と相関している。
加えて、結果は、レポーター遺伝子構築物間の組換えについてのアッセイを使用して、ＣＤ１１７＋細胞におけるＤＮＡ修復遺伝子の発現の上昇がＨＤＲ活性の機能的な増加と関連していることを示している。ＳＣＦを用いるＣＤ１１７＋細胞の処理がＨＤＲにおけるさらに２倍の増加を生じた一方で、ダサチニブおよび他の阻害剤はＨＤＲ活性の低減をもたらした。これらの結果は、ＨＤＲの促進におけるｃ−Ｋｉｔ経路の機能的重要性を示しており、遺伝子編集経路についての推定機構をさらに提供している。
サラセミアマウスにおいて達成された頻度４％の骨髄遺伝子編集は、正常範囲への血中ヘモグロビンレベルの上昇、網状赤血球増加症の抑制、および他に髄外造血と関連する脾腫の低減を伴った、表現型における明確な改善を達成するために十分であった。頻度４％での遺伝子修正が表現型に影響を与えることができるという観察は、骨髄での野生型ドナー対サラセミアレシピエント細胞のある比での混合キメラ現象が、末梢においてさらに高い割合でドナーＲＢＣを産生するサラセミアマウスにおけるおよび患者における移植研究と一致している（Andreaniら、Bone Marrow Transplant、７巻（追補２）：７５頁（１９９１年）；Felflyら、Mol Ther、１５巻：１７０１〜１７０９頁（２００７年））。この効果は、サラセミアのＲＢＣと比較して、赤血球生成の際の遺伝的に修正された赤芽球の生存率の増加および富化、無効な赤血球生成の減少、ならびに修正された赤血球の循環中の生存率の増加に寄与している（Miccioら、Proc Natl Acad Sci USA、１０５巻：１０５４７〜１０５５２頁（２００８年））。
全体として、これらの結果は、ヒト遺伝性障害の処置のためにｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子編集を達成するための治療戦略として、γＰＮＡおよびドナーＤＮＡのＮＰ媒介送達の実現可能性を支持している。上に記載の結果は、骨髄における有効なＮＰ媒介遺伝子編集を実証しているが、近年の他の研究は、肺気道上皮へのＮＰ送達も嚢胞性線維症と関連するＣＦＴＲ遺伝子変異の修正を達成するための潜在的な手段となり得ることを示した（Fieldsら、Adv Healthc Mater（２０１４年）；McNeerら、Nature Communications in press（２０１５年））。
ＳＣＦが遺伝子編集を刺激するという発見は、ＳＣＦを、遺伝子編集をブーストするための可能な薬理学的手段、ここに示されるＰＮＡ媒介遺伝子編集だけでなく、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＳＦＨＲまたはＺＦＮなどの他の方法による編集にも適用できる可能性がある戦略として同定している。さらに、γＰＮＡは遺伝子編集効力の改善を一貫して示しているが、ゲノム中のオフターゲット効果のレベルは非常に低いままである。これは、（ＺＦＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９とは対照的に）ＰＮＡにおける任意の内在性ヌクレアーゼ活性の欠如と一致しており、内在性の高忠実度ＤＮＡ修復経路に関与する標的結合部位において変更されたヘリックスを作製することによって作用する、三重鎖誘導遺伝子編集の機構を反映している。ＳＣＦ／ｃ−Ｋｉｔ経路もこれらの同じ経路を刺激し、オフターゲットリスクまたは細胞毒性を増加させることなく遺伝子編集の増強を提供する。
（実施例９）
修復タンパク質は、三重鎖形成ＰＮＡ媒介遺伝子編集をモジュレートする
材料および方法
皮膚線維芽細胞をβ−グロビン／ＧＦＰマウス（ＧＦＰコード領域内に挿入されたヒトβ−グロビンのイントロン２）から単離し、１０％ＦＣＳを加えたＤＭＥＭ培地中での培養で成長させた。イントロンは、ＩＶＳ２−６５４（Ｃ→Ｔ）変異を含有する。遺伝子修正アッセイは、図５Ａに例示されている。
線維芽細胞をｅｘ ｖｉｖｏでｔｃＰＮＡ１＋ドナーＤＮＡを含有するナノ粒子を用いて処理し、７２時間後、フローサイトメトリー分析を実施して、ＧＦＰ陽性細胞の頻度に基づいて％遺伝子修正を定量した。一部の場合では、ＤＮＡ修復阻害剤または他の小分子阻害剤がナノ粒子処理の４８時間前に与えられた。
tcPNA1:
H-KKK- TTTJTJJ-OOO-CCTCTTTGCACCATTCT-KKK-NH2 (配列番号35)
ドナーＤＮＡ：
5’A(s)A(s)A(s)GAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAATATCTCTGCATATAAA(s)T(s)A(s)T 3’ (配列番号175)
結果
ＡＴＲの阻害はマウス線維芽細胞におけるＧＦＰ／ベータグロビン遺伝子修正アッセイにおいて遺伝子編集をブーストする。結果を図５Ｂに示す。
ＣＨＫ１の阻害は、ＧＦＰ／ベータグロビン遺伝子修正アッセイにおける遺伝子編集を実質的にブーストする。ＤＮＡポリメラーゼアルファ（アフィディコリンによる）の阻害またはＡＺＤ−２２８１（オラパリブ）によるポリＡＤＰリボースポリメラーゼの阻害も遺伝子編集をブーストする。結果を図５Ｃに示す。
ＳＴＡ−９０９０／Ｇａｎｅｔｅｓｐｉｂによる熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）の阻害は、ＧＦＰ／ベータグロビン遺伝子修正アッセイにおける遺伝子編集を増強する。結果を図５Ｄに示す。
（実施例１０）
フーグスティーンドメインにおける部分的γ置換は、遺伝子修正効率を増加させる
材料および方法
結果
部分的γ置換だけを有するγｔｃＰＮＡを使用するＦ５０８ｄｅｌ ＣＦＴＲにおける、およびＣＦ ＰＮＡ２のフーグスティーンドメインのみにおける遺伝子編集での実質的増加。図７Ａおよび７Ｂに示す通り、フーグスティーンドメイン中の４個のみのγ残基を用いて、ＣＦＴＲ遺伝子修正に対する活性の５０％を超える増加が、ＭＱＡＥアッセイによって判定された通り、ＣＦＢＥ細胞において達成された（γｔｃＰＮＡを含有するＮＰを介して）（図７Ａ）。γｔｃＰＮＡ含有ＮＰを用いた、活性における実質的な増加は、ＮＰＤ測定によって決定された通り、鼻腔内送達後にＣＦマウスにおいてｉｎ ｖｉｖｏでも達成された（図７Ｂ）。
（実施例１１）
ナノ粒子送達ｔｃＰＮＡおよびドナーオリゴヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｖｏで鎌状赤血球変異を修正する
材料および方法
ＰＮＡ
SCD-tcPNA 1:
H-KKK-JJTJTTJ-OOO-CTTCTCCACAGGAGTCAG-KKK-NH2
(配列番号59)
SCD-tcPNA 2:
H-KKK-TTJJTJT-OOO-TCTCCTTAAACCTGTCTT-KKK-NH2
(配列番号213)
SCD-tcPNA 3:
H-KKK-TJTJTTJT-OOO-TCTTCTCTGTCTCCACAT-KKK-NH2 (配列番号60)。Ｋはリシンを示し；Ｊ、ｐＨ非依存性三重鎖形成のためのシュードイソシトシン（Ｃに対して）。Ｏ、ｔｃＰＮＡのフーグスティーンドメインとワトソンクリックドメインとを繋いでいる８−アミノ−２，６，１０−トリオキサオクタン酸リンカー。
ドナー

式中、太字および下線を付した残基は修正であり、「（ｓ）」はホスホロチオエートヌクレオシド間連結を示している。
鎌状赤血球症のためのマウスモデル
鎌状赤血球症（ＳＣＤ）では、コドン６での変異（ＧＡＧ→ＧＴＧ）がグルタミン酸からバリンへの変化を生じる。このＳＣＤ変異部位のｉｎ ｖｉｖｏでの修正のために、ｉｎ ｖｉｖｏでの研究を２つのマウスモデルにおいて実施した：
（１）Ｂｅｒｋｅｌｅｙマウスモデルとしても公知の、Paszty C、Brion CM、Manci E、Witkowska HE、Stevens ME、Mohandas N、Rubin EM.、「Transgenic knockout mice with exclusively human sickle hemoglobin and sickle cell disease.」Science.、１９９７年１０月３１日；２７８巻（５３３９号）：８７６〜８頁、PMID: 9346488によって導入された鎌状赤血球遺伝子ノックインマウスモデル、および
（２）Ryan TM、Ciavatta DJ、Townes TM.、「Knockout-transgenic mouse model of sickle cell disease.」Science.、１９９７年１０月３１日；２７８巻（５３３９号）：８７３〜６頁、PMID: 9346487によって開発されたＴｏｗｎｅｓマウスモデル。
これら両方のマウスモデルは、全くヒト鎌状ヘモグロビン（ＨｂＳ）のみを発現する。それらは、ヒトα−、γ−およびβｓ−グロビンを発現するトランスジェニックマウスを生成し、次にマウスα−およびβ−グロビン遺伝子を欠失しているノックアウトマウスと交配することによって産生された。それにより得られた後代は、もはやマウスα−およびβ−グロビンを発現しない。代わりにそれらは、全くヒトα−およびβｓ−グロビンのみを発現する。したがってマウスは、ヒト鎌状ヘモグロビンを発現し、ＳＣＤを有する個体の主な血液学的および病理組織学的特性の多くを保有している。
ナノ粒子
ｔｃＰＮＡおよびドナーＤＮＡを２：１のモル比でＰＬＧＡ ＮＰに組み入れた。ＮＰ製剤を走査電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）および動的光散乱（ＤＬＳ）によって評価した。
処置プロトコール
それぞれ３匹（すなわち、ｎ＝３）のＢｅｒｋｌｅｙマウスおよびＴｏｗｎｅｓマウスを（１）ブランクＰＬＧＡナノ粒子、（２）ＰＬＧＡナノ粒子中のｓｃ−ｔｃＰＮＡ１／ドナーＤＮＡでの４回処置、（３）ＰＬＧＡナノ粒子中のｓｃ−ｔｃＰＮＡ２／ドナーＤＮＡでの４回処置、（４）ＰＬＧＡナノ粒子中でのｓｃ−ｔｃＰＮＡ３／ドナーＤＮＡの４回処置を用いて処置した。マウスにＰＮＡおよびドナーＤＮＡを含有するＮＰ ２ｍｇを２日ごとに合計４回静脈内注射した。最後の処置後、骨髄および脾臓を組織学的検査、ディープシークエンシングおよび制限酵素消化のために採取した。
結果
ＳＣＤコドン近傍のβ−グロビン遺伝子中の３個のポリプリン部位。三重鎖形成物（triplex formation）は、数百塩基対まで離れた部位での組換えを触媒できる。一連のｔｃＰＮＡをＳＣＤ変異の近傍のβ−グロビン遺伝子中の選択されたポリプリンストレッチに結合するように設計し、合成した（図１０Ａ）。センスドナーＤＮＡ（β−グロビン遺伝子中の一本鎖６０マー適合ヌクレオチド、および３末端ホスホロチオエートヌクレオシド間連結によって分解から末端保護されている）も設計した。
さらに具体的には、ゲル移動度シフトアッセイは、β−グロビン配列を含有する１２０ｂｐ二本鎖ＤＮＡ断片へのＳＣＤｔｃＰＮＡ１、ＳＣＤｔｃＰＮＡ２、ＳＣＤｔｃＰＮＡ３の結合を実証した。各１２０ｂｐ ｄｓＤＮＡは、それぞれのｔｃＰＮＡに対する結合部位を含有していた。結合アッセイは、合成したすべてのＳＣＤ ｔｃＰＮＡが生理的条件下で二本鎖ゲノムＤＮＡに特異的に結合することを明らかにした。
ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ＮＰは、ＰＮＡ／ドナーＤＮＡ組合せを初代ヒトおよびマウス造血細胞に、本質的に毒性を伴わずに効果的に送達できる。ここで、モル比２：１のｔｃＰＮＡおよびドナーＤＮＡを、ＰＬＧＡ ＮＰに組み込んだ。ＮＰ製剤を走査電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）および動的光散乱（ＤＬＳ）によって評価した。すべてのＮＰは、予測された範囲のサイズを示し、均一な電荷分布を示した（図１０Ｂ〜１０Ｃ）。
次に、２つの疾患マウスモデルにおけるＳＣＤ変異の修正を上に記載の通り実行した。処置群は（１）ブランクＮＰ；（２）ＳＣＤ ｔｃＰＮＡ１／ドナーＤＮＡ；（３）ＳＣＤ ｔｃＰＮＡ２／ドナーＤＮＡ；および（４）ＳＣＤ ｔｃＰＮＡ３／ドナーＤＮＡを含んだ。マウスにＰＮＡおよびＤＮＡを含有するＮＰ ２ｍｇを２日ごとに合計４回静脈内注射した。
ヒトベータグロビン対立遺伝子のディープシークエンシング分析を処置後３６日目のマウスの全骨髄細胞から採取したゲノムＤＮＡに実施した。ＳＣＤ変異の修正がＴｏｗｎｅｓマウスのＳＣＤ ｔｃＰＮＡ１／ドナーＤＮＡ処置群においておよそ１．５％の頻度で（図１０Ｄ）、およびＢｅｒｋｌｅｙマウスにおいて１．２％遺伝子修正（図１０Ｅ）が見られた一方で、ブランクＮＰを用いて処置したマウスにおいて修正は見られなかった。結果は、コドン６で配列がＳＣＤ変異から野生型配列に編集された場合にのみ切断する制限酵素（Ｂｓｕ３６１）消化を使用して確認した。
上記ＳＣＤ ＰＮＡに基づくγＰＮＡ置換を有する配列は、設計でき、設計され、例えばワトソンクリックドメイン中の部分的もしくは完全γＰＮＡ置換、フーグスティーンドメイン中の部分的もしくは完全置換、またはこれらの組合せを含む。例示的配列として、これだけに限らないが、

が挙げられる。
下線付き残基は、ガンマ修飾、例えばミニＰＥＧγＰＮＡ置換を含む。Ｋはリシンを示し；Ｊ、ｐＨ非依存性三重鎖形成のためのシュードイソシトシン（Ｃに対して）。Ｏ、ｔｃＰＮＡのフーグスティーンドメインとワトソンクリックドメインとを繋いでいる８−アミノ−２，６，１０−トリオキサオクタン酸リンカー。

Claims (67)

  1. フーグスティーン結合ペプチド核酸（ＰＮＡ）セグメントおよびワトソンクリック結合ＰＮＡセグメントを合わせて合計５０核酸塩基以下の長さで含む三重鎖形成組成物であって、該２つのセグメントは、細胞のゲノム中のポリプリンストレッチを含む標的領域に結合またはハイブリダイズして、鎖侵入、置換、および該２つのＰＮＡセグメントと該細胞のゲノムの該ポリプリンストレッチの間での三本鎖分子の形成を誘導することが可能であり、
    該フーグスティーン結合セグメントが、最小の５核酸塩基の長さのフーグスティーン結合により標的二重鎖に結合し、
    該ワトソンクリック結合セグメントが、最小の５核酸塩基の長さのワトソンクリック結合により標的二重鎖に結合し、
    ＰＮＡモノマーのうちの１つまたは複数がγＰＮＡモノマーである、
    三重鎖形成組成物。
  2. 前記フーグスティーン結合セグメントが、シュードシトシン、シュードイソシトシン、および５−メチルシトシンからなる群から選択される１つまたは複数の化学修飾されたシトシンを含む、請求項１に記載の三重鎖形成組成物。
  3. 前記ワトソンクリック結合セグメントが、前記三重鎖の外側でワトソンクリック結合により前記標的二重鎖に結合する最長１５核酸塩基のテール配列を含む、請求項１または２に記載の三重鎖形成組成物。
  4. 前記２つのセグメントがリンカーにより連結されている、請求項１から３のうちのいずれか一項に記載の三重鎖形成組成物。
  5. 前記リンカーが、１から１０ユニットの間の８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸である、請求項４に記載の三重鎖形成組成物。
  6. 前記セグメントが、配列ＧＡＡＡＧＡＡＡＧＡＧＡ（配列番号１５）またはＴＧＣＣＣＴＧＡＡＡＧＡＡＡＧＡＧＡ（配列番号１６）またはＧＧＡＧＡＡＡ（配列番号１７）またはＡＧＡＡＴＧＧＴＧＣＡＡＡＧＡＧＧ（配列番号１８）またはＡＡＡＡＧＧＧ（配列番号１９）またはＡＣＡＴＧＡＴＴＡＧＣＡＡＡＡＧＧＧ（配列番号２０）を含むベータグロビン遺伝子の領域と三本鎖分子を形成することが可能である、請求項１から５のうちのいずれか一項に記載の三重鎖形成組成物。
  7. （ｉ）前記フーグスティーン結合セグメントが配列ＪＴＴＴＪＴＴＴＪＴＪＴ（配列番号３０）を含み、前記ワトソンクリック結合セグメントが配列ＴＣＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣ（配列番号２２）またはＴＣＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＡＧＧＧＣＡ（配列番号２３）を含み、
    （ｉｉ）前記フーグスティーン結合セグメントが配列ＴＴＴＴＪＪＪ（配列番号３１）を含み、前記ワトソンクリック結合セグメントが配列ＣＣＣＴＴＴＴ（配列番号２５）またはＣＣＣＴＴＴＴＧＣＴＡＡＴＣＡＴＧＴ（配列番号２６）を含み、
    （ｉｉｉ）前記フーグスティーン結合セグメントが配列ＴＴＴＪＴＪＪ（配列番号３２）を含み、前記ワトソンクリック結合セグメントが配列ＣＣＴＣＴＴＴ（配列番号２８）またはＣＣＴＣＴＴＴＧＣＡＣＣＡＴＴＣＴ（配列番号２９）を含み、
    （ｉｖ）前記フーグスティーン結合セグメントが配列ＴＪＴＴＴＴＪＴＴＪ（配列番号３６）を含み、前記ワトソンクリック結合セグメントが配列ＣＴＴＣＴＴＴＴＣＴ（配列番号３７）を含み、
    （ｖ）前記フーグスティーン結合セグメントが配列ＴＴＪＴＴＪＴＴＴＪ（配列番号３８）を含み、前記ワトソンクリック結合セグメントが配列ＣＴＴＴＣＴＴＣＴＴ（配列番号３９）を含み、
    （ｖｉ）前記フーグスティーン結合セグメントが配列ＪＪＪＴＪＪＴＴＪＴ（配列番号４０）を含み、前記ワトソンクリック結合セグメントが配列ＴＣＴＴＣＣＴＣＣＣ（配列番号４１）を含み、
    （ｖｉｉ）前記フーグスティーン結合セグメントが配列ＪＪＴＪＴＴＪ（配列番号５６）を含み、前記ワトソンクリック結合セグメントが配列ＣＴＴＣＴＣＣ（配列番号４６）またはＣＴＴＣＴＣＣＡＡＡＧＧＡＧＴ（配列番号４７）またはＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧＡＧＴＣＡＧ（配列番号４８）またはＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧＡＧＴＣＡＧＧＴＧＣ（配列番号２０５）を含み、
    （ｖｉｉｉ）前記フーグスティーン結合セグメントが配列ＴＴＪＪＴＪＴ（配列番号４９）を含み、前記ワトソンクリック結合セグメントが配列ＴＣＴＣＣＴＴ（配列番号５０）またはＴＣＴＣＣＴＴＡＡＡＣＣＴＧＴ（配列番号５１）またはＴＣＴＣＣＴＴＡＡＡＣＣＴＧＴＣＴＴ（配列番号２１２）を含み、または
    （ｉｘ）前記フーグスティーン結合セグメントが配列ＴＪＴＪＴＴＪＴ（配列番号５２）を含み、前記ワトソンクリック結合セグメントが配列ＴＣＴＴＣＴＣＴ（配列番号５３）またはＴＣＴＴＣＴＣＴＧＴＣＴＣＣＡＣ（配列番号５４）またはＴＣＴＴＣＴＣＴＧＴＣＴＣＣＡＣＡＴ（配列番号５５）を含み、
    「Ｊ」がシュードイソシトシンである、
    請求項１から５のうちのいずれか一項に記載の三重鎖形成組成物。
  8. 前記セグメントが連結されて配列：


    を有する分子を形成し、
    「Ｊ」がシュードイソシトシンであり、Ｏ＝柔軟な８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸、６−アミノヘキサン酸モノマーである、
    請求項７に記載の三重鎖形成組成物。
  9. （ｉ）前記フーグスティーン結合セグメントが配列ＴＪＴＪＪＴＴＴ（配列番号９１）を含み、前記ワトソンクリック結合セグメントが配列ＴＴＴＣＣＴＣＴ（配列番号８３）またはＴＴＴＣＣＴＣＴＡＴＧＧＧＴＡＡＧ（配列番号８４）を含み、
    （ｉｉ）前記フーグスティーン結合セグメントが配列ＴＪＴＴＪＴＪＪ（配列番号９１）を含み、前記ワトソンクリック結合セグメントが配列ＣＣＴＣＴＴＣＴ（配列番号８６）、またはＣＣＴＣＴＴＣＴＡＧＴＴＧＧＣＡＴ（配列番号８７）を含み、
    （ｉｉｉ）前記フーグスティーン結合セグメントが配列ＴＴＪＪＪＴＴＴＪ（配列番号９２）を含み、前記ワトソンクリック結合セグメントが配列ＣＴＴＴＣＣＣＴＴ（配列番号８９）、またはＣＴＴＴＣＣＣＴＴＧＴＡＴＣＴＴＴＴ（配列番号９０）を含み、
    （ｉｖ）前記フーグスティーン結合セグメントが配列ＪＴＴＪＪＴＪＴＴＴ（配列番号１０６）を含み、前記ワトソンクリック結合セグメントが配列ＴＴＴＣＴＣＣＴＴＣ（配列番号９８）またはＴＴＴＣＴＣＣＴＴＣＡＧＴＧＴＴＣＡ（配列番号９９）を含み、
    （ｖ）前記フーグスティーン結合セグメントが配列ＴＴＴＴＪＪＴ（配列番号１０７）を含み、前記ワトソンクリック結合セグメントが配列ＴＣＣＴＴＴＴ（配列番号１０１）またはＴＣＣＴＴＴＴＧＣＴＣＡＣＣＴＧＴＧＧＴ（配列番号１０２）を含み、
    （ｖｉ）前記フーグスティーン結合セグメントが配列ＴＪＴＴＴＴＴＴＪＪ（配列番号１０８）を含み、前記ワトソンクリック結合セグメントが配列ＣＣＴＴＴＴＴＴＣＴ（配列番号１０４）またはＣＣＴＴＴＴＴＴＣＴＧＧＣＴＡＡＧＴ（配列番号１０５）を含み、
    （ｖｉｉ）前記フーグスティーン結合セグメントが配列ＴＪＴＴＴＴＴ（配列番号１１８）を含み、前記ワトソンクリック結合セグメントが配列ＴＴＴＴＴＣＴ（配列番号１１１）またはＴＴＴＴＴＣＴＧＴＡＡＴＴＴＴＴＡＡ（配列番号１１２）を含み、
    （ｖｉｉｉ）前記フーグスティーン結合セグメントが配列ＴＪＴＪＴＴＴＪＴ（配列番号１１９）を含み、前記ワトソンクリック結合セグメントが配列ＴＣＴＴＴＣＴＣＴ（配列番号１１４）またはＴＣＴＴＴＣＴＣＴＧＣＡＡＡＣＴＴ（配列番号１１５）を含み、または
    （ｉｘ）前記フーグスティーン結合セグメントが配列ＴＴＴＪＴＴＴ（配列番号１２０）を含み、前記ワトソンクリック結合セグメントが配列ＴＴＴＣＴＴＴ（配列番号１１６）またはＴＴＴＣＴＴＴＡＡＧＡＡＣＧＡＧＣＡ（配列番号１１７）を含み、
    「Ｊ」がシュードイソシトシンである、
    請求項１から５のうちのいずれか一項に記載の三重鎖形成組成物。
  10. 前記セグメントが連結されて配列：


    を有する分子を形成し、
    「Ｊ」がシュードイソシトシンであり、Ｏ＝柔軟な８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸、６−アミノヘキサン酸モノマーである、
    請求項９に記載の三重鎖形成組成物。
  11. （ｉ）前記フーグスティーン結合セグメントが配列ＪＴＪＴＴＪＴＴＪＴ（配列番号１３２）を含み、前記ワトソンクリック結合セグメントが配列ＴＣＴＴＣＴＴＣＴＣ（配列番号１２６）またはＴＣＴＴＣＴＴＣＴＣＡＴＴＴＣ（配列番号１２７）を含み、
    （ｉｉ）前記フーグスティーン結合セグメントが配列ＪＴＴＪＴ（配列番号１３３）を含み、前記ワトソンクリック結合セグメントが配列ＴＣＴＴＣ（配列番号１２９）、ＴＣＴＴＣＴＴＣＴＣ（配列番号１３０）、またはＴＣＴＴＣＴＴＣＴＣＡＴＴＴＣ（配列番号１３１）を含み、
    「Ｊ」がシュードイソシトシンである、
    請求項１から５のうちのいずれか一項に記載の三重鎖形成組成物。
  12. 前記セグメントが連結されて配列：

    を有する分子を形成し、
    「Ｊ」がシュードイソシトシンであり、Ｏ＝柔軟な８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸、６−アミノヘキサン酸モノマーである、
    請求項５に記載の三重鎖形成組成物。
  13. （ｉ）前記フーグスティーン結合セグメントが配列ＴＴＪＪＪＪＴ（配列番号１４８）を含み、前記ワトソンクリック結合セグメントが配列ＴＣＣＣＣＴＴ（配列番号１４６）またはＴＣＣＣＣＴＴＧＧＴＧＡＡＧＧ（配列番号１４７）を含み、
    （ｉｉ）前記フーグスティーン結合セグメントが配列ＪＪＴＴＪＴ（配列番号１５３）を含み、前記ワトソンクリック結合セグメントが配列ＴＣＴＴＣＣ（配列番号１５１）またはＴＣＴＴＣＣＧＡＧＣＡＧ（配列番号１５２）を含み、
    「Ｊ」がシュードイソシトシンである、
    請求項１から５のうちのいずれか一項に記載の三重鎖形成組成物。
  14. 前記セグメントが連結されて配列：

    を有する分子を形成し、
    「Ｊ」がシュードイソシトシンであり、Ｏ＝柔軟な８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸、６−アミノヘキサン酸モノマーである、
    請求項５に記載の三重鎖形成組成物。
  15. 前記フーグスティーン結合セグメントのみの、前記ワトソンクリック結合セグメントのみの、またはＰＮＡオリゴマー全体にわたる前記ペプチド核酸モノマーのすべてがγＰＮＡモノマーである、請求項１から１４のうちのいずれか一項に記載の三重鎖形成組成物。
  16. 前記ＰＮＡオリゴマーのうちの前記フーグスティーン結合セグメントのみの、または前記ワトソンクリック結合セグメントのみの、前記ペプチド核酸モノマーのうちの１つまたは複数がＰＮＡおよびγＰＮＡである、請求項１５に記載の三重鎖形成組成物。
  17. 前記フーグスティーン結合部分のみの、前記ワトソンクリック結合部分のみの、または前記ＰＮＡオリゴマー全体にわたる交互残基がＰＮＡおよびγＰＮＡである、請求項１から１４のうちのいずれか一項に記載の三重鎖形成組成物。
  18. 太字で下線を付した残基がγＰＮＡモノマーである、請求項８、１０、１２、または１４のうちのいずれか一項に記載の三重鎖形成組成物。
  19. 前記γＰＮＡモノマー（複数可）のγの側鎖が、アラニン、セリン、スレオニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、アルギニン、およびその誘導体からなる群から選択されるアミノ酸の側鎖を含む、請求項１から１８のうちのいずれか一項に記載の三重鎖形成組成物。
  20. 前記γＰＮＡモノマー（複数可）のγの側鎖が、ジエチレングリコール（「ミニＰＥＧ」）である、請求項１から１８のうちのいずれか一項に記載の三重鎖形成組成物。
  21. 前記シトシンのうちの１つまたは複数が、クランプ−Ｇ（９−（２−グアニジノエトキシ）フェノキサジン）で置き換えられている、請求項１から１９のうちのいずれか一項に記載の三重鎖形成組成物。
  22. 三重鎖形成分子によって誘導または増強される組換えにより前記細胞のゲノムにおいて変異（複数可）を修正することが可能な配列を含むドナーオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１から２１のうちのいずれか一項に記載の三重鎖形成組成物。
  23. ナノ粒子をさらに含み、前記ＰＮＡセグメント、ドナーオリゴヌクレオチド、またはその組合せが同じまたは別々のナノ粒子にパッケージされている、請求項１から２２のうちのいずれか一項に記載の三重鎖形成組成物。
  24. 前記ナノ粒子がポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）を含む、請求項２３に記載の三重鎖形成組成物。
  25. 前記ナノ粒子がポリ（ベータアミノ）エステル（ＰＢＡＥ）を含む、請求項２４に記載の三重鎖形成組成物。
  26. 前記ナノ粒子が、約５から約２５パーセントの間のＰＢＡＥ（ｗｔ％）を含む、ＰＬＧＡとＰＢＡＥのブレンドを含む、請求項２５に記載の三重鎖形成組成物。
  27. 前記ナノ粒子が二重エマルジョンまたはナノ沈殿により調製される、請求項２３から２６のうちのいずれか一項に記載の三重鎖形成組成物。
  28. 前記ＰＮＡセグメントまたは前記ナノ粒子に直接的または間接的に会合する、連結する、コンジュゲートする、またはその他の方法で結合する、標的化部分、細胞浸透性ペプチド、またはその組合せをさらに含む、請求項１から２７のうちのいずれか一項に記載の三重鎖形成組成物。
  29. 前記細胞浸透性ペプチドが、配列ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳ ＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１２）（ＭＰＧ（合成キメラ：ＳＶ４０ＬｇＴ．Ａｎｔ．＋ＨＩＶ ｇｂ４１コート）を含む、請求項２８に記載の三重鎖形成組成物。
  30. 受容体チロシンキナーゼＣ−ｋｉｔリガンド、ＡＴＲ−Ｃｈｋ１細胞周期チェックポイント経路阻害剤、ＤＮＡポリメラーゼアルファ阻害剤、および熱ショックタンパク質９０阻害剤（ＨＳＰ９０ｉ）からなる群から選択される遺伝子編集増強剤をさらに含む、請求項１から２９のうちのいずれか一項に記載の三重鎖形成組成物。
  31. 前記Ｃ−ｋｉｔリガンドが、Ｃ−ｋｉｔの二量体化を引き起こしそのチロシンキナーゼ活性を活性化するのに十分な幹細胞因子タンパク質（stem factor protein）またはその断片である、請求項３０に記載の三重鎖形成組成物。
  32. 前記Ｃ−ｋｉｔリガンドが、Ｃ−ｋｉｔの二量体化を引き起こしそのチロシンキナーゼ活性を活性化するのに十分な幹細胞因子タンパク質またはその断片をコードする核酸である、請求項３１に記載の三重鎖形成組成物。
  33. 前記核酸がｍＲＮＡまたは発現ベクターである、請求項３２に記載の三重鎖形成組成物。
  34. 前記ＡＴＲ−Ｃｈｋ１細胞周期チェックポイント経路阻害剤が、ＡＺＤ７７６２、ＳＣＨ９００７７６／ＭＫ−８７７６、ＩＣ８３／ＬＹ２６０３６１８、ＬＹ２６０６３６８、ＧＤＣ−０４２５、ＰＦ−００４７７７３６、ＸＬ８４４、ＣＥＰ−３８９１、ＳＡＲ−０２０１０６、ＣＣＴ−２４４７４７、Ａｒｒｙ−５７５、ＳＢ２１８０７５、シサンドリンＢ、ＮＵ６０２７、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＶＥ−８２１、ＶＥ−８２２（ＶＸ−９７０）、ＡＺ２０、ＡＺＤ６７３８、ＭＩＲＩＮ、ＫＵ５５９３、ＶＥ−８２１、ＮＵ７４４１、ＬＣＡ、およびＬ１８９からなる群から選択される、請求項３０に記載の三重鎖形成組成物。
  35. 前記ＤＮＡポリメラーゼアルファ阻害剤がアフィディコリンである、請求項３０に記載の三重鎖形成組成物。
  36. 前記熱ショックタンパク質９０阻害剤が、（ＨＳＰ９０ｉ）ＳＴＡ−９０９０（ガネテスピブ）、ゲルダナマイシン（ＧＡ）、１７−ＡＡＧ（１７−アリルアミノ−１７−デメトキシ−ゲルダナマイシン）、１７−ＤＭＡＧ（１７−ジメチルアミノエチルアミノ−１７−デメトキシ−ゲルダナマイシン）、（アルベスピマイシン）ＩＰＩ−５０４（レタスピマイシン）、およびＡＵＹ９２２からなる群から選択される、請求項３０に記載の三重鎖形成組成物。
  37. 細胞のゲノムを改変する方法であって、有効量の、
    （ｉ）受容体チロシンキナーゼＣ−ｋｉｔリガンド、ＡＴＲ−Ｃｈｋ１細胞周期チェックポイント経路阻害剤、ＤＮＡポリメラーゼアルファ阻害剤、および熱ショックタンパク質９０阻害剤（ＨＳＰ９０ｉ）からなる群から選択される遺伝子編集増強剤、ならびに
    （ｉｉ）三重鎖形成分子、偽相補的オリゴヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲ系、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、小断片相同置換、およびイントロンにコードされたメガヌクレアーゼからなる群から選択される該細胞のゲノム改変を誘導することが可能な遺伝子編集技術
    に該細胞を接触させることを含み、
    ゲノム改変が（ｉ）の非存在下で（ｉｉ）に接触させた同等の集団においてよりも（ｉ）と（ｉｉ）の両方に接触させた細胞の集団においてより高い頻度で起こる方法。
  38. 前記遺伝子編集技術によって誘導または増強される挿入または組換えにより前記細胞のゲノムにおいて変異（複数可）を修正する配列を含むドナーオリゴヌクレオチドに該細胞を接触させることをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記細胞のゲノムが、血友病、グロビン異常症、嚢胞性線維症、色素性乾皮症、およびリソソーム蓄積症からなる群から選択される疾患または障害の根底にある変異を有する、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記グロビン異常症が鎌状赤血球貧血またはベータサラセミアである、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記リソソーム蓄積症はゴーシェ病、ファブリー病、ハーラー症候群である、請求項３９に記載の方法。
  42. 前記遺伝子編集技術によって誘導または増強される挿入または組換えにより前記細胞のゲノムにおいて変異（複数可）を誘導する配列を含むドナーオリゴヌクレオチドに該細胞を接触させることをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
  43. 前記変異が、前記細胞へのＨＩＶの侵入を促進する細胞表面受容体の活性を低減することによりＨＩＶ感染を低減する、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記接触させることがｅｘ ｖｉｖｏで起こる、請求項３７から４３のうちのいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記細胞が造血幹細胞である、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記細胞を、それを投与すること必要とする被験体に投与することをさらに含む、請求項４３から４５のうちのいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記細胞が、疾患または障害の１つまたは複数の症状を処置するのに有効な量で前記被験体に投与される、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記接触させることが、（ｉ）、（ｉｉ）、および任意選択で前記ドナーオリゴヌクレオチドの投与であって、それを必要とする被験体への投与に続いてｉｎ ｖｉｖｏで起こる、請求項３７から４３のうちのいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記被験体が、血友病、グロビン異常症、嚢胞性線維症、色素性乾皮症、およびリソソーム蓄積症からなる群から選択される疾患または障害を有する、請求項４８に記載の方法。
  50. 遺伝子改変が、前記被験体において前記疾患または障害の１つまたは複数の症状を低減するのに有効な量で起こる、請求項４９に記載の方法。
  51. （ｉ）、（ｉｉ）、前記ドナーオリゴヌクレオチドまたはその組合せがナノ粒子に一緒にまたは別々にパッケージされる、請求項３７から５０のうちのいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記ナノ粒子がポリヒドロキシ酸を含む、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記ナノ粒子がポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）を含む、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記ナノ粒子が、約５から約２５パーセントの間のポリ（ベータアミノ）エステル（ＰＢＡＥ）（ｗｔ％）を含む、ＰＬＧＡとＰＢＡＥのブレンドを含む、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記ナノ粒子が二重エマルジョンまたはナノ沈殿により調製される、請求項４３から４６のうちのいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記増強剤、前記遺伝子編集技術、または前記ナノ粒子に直接的にまたは間接的に会合する、連結する、コンジュゲートする、またはその他の方法で結合する、標的化部分、細胞浸透性ペプチド、またはその組合せをさらに含む、請求項３７から５５のうちのいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記細胞浸透性ペプチドが、配列ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳ ＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１２）（ＭＰＧ（合成キメラ：ＳＶ４０ＬｇＴ．Ａｎｔ．＋ＨＩＶ ｇｂ４１コート）を含む、請求項５６に記載の方法。
  58. （ｉ）を（ｉｉ）に先立って前記細胞に接触させる、請求項３７から５７のうちのいずれか一項に記載の方法。
  59. （ｉｉ）を（ｉ）に先立ってまたは（ｉ）と同時に前記細胞に接触させる、請求項３７から５７のうちのいずれか一項に記載の方法。
  60. 前記Ｃ−ｋｉｔリガンドが、Ｃ−ｋｉｔの二量体化を引き起こしそのチロシンキナーゼ活性を活性化するのに十分な幹細胞因子タンパク質またはその断片である、請求項３７から５９のうちのいずれか一項に記載の方法。
  61. 前記Ｃ−ｋｉｔリガンドが、Ｃ−ｋｉｔの二量体化を引き起こしそのチロシンキナーゼ活性を活性化するのに十分な幹細胞因子タンパク質またはその断片をコードする核酸である、請求項３７から５９のうちのいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記核酸がｍＲＮＡまたは発現ベクターである、請求項６１に記載の方法。
  63. 前記ＡＴＲ−Ｃｈｋ１細胞周期チェックポイント経路阻害剤が、ＡＺＤ７７６２、ＳＣＨ９００７７６／ＭＫ−８７７６、ＩＣ８３／ＬＹ２６０３６１８、ＬＹ２６０６３６８、ＧＤＣ−０４２５、ＰＦ−００４７７７３６、ＸＬ８４４、ＣＥＰ−３８９１、ＳＡＲ−０２０１０６、ＣＣＴ−２４４７４７、Ａｒｒｙ−５７５、ＳＢ２１８０７５、シサンドリンＢ、ＮＵ６０２７、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＶＥ−８２１、ＶＥ−８２２（ＶＸ−９７０）、ＡＺ２０、ＡＺＤ６７３８、ＭＩＲＩＮ、ＫＵ５５９３、ＶＥ−８２１、ＮＵ７４４１、ＬＣＡ、およびＬ１８９からなる群から選択される、請求項３７から５１のうちのいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記ＤＮＡポリメラーゼアルファ阻害剤がアフィディコリンである、請求項３７から５１のうちのいずれか一項に記載の方法。
  65. 前記熱ショックタンパク質９０阻害剤が、（ＨＳＰ９０ｉ）ＳＴＡ−９０９０（ガネテスピブ）、ゲルダナマイシン（ＧＡ）、１７−ＡＡＧ（１７−アリルアミノ−１７−デメトキシ−ゲルダナマイシン）、１７−ＤＭＡＧ（１７−ジメチルアミノエチルアミノ−１７−デメトキシ−ゲルダナマイシン）、（アルベスピマイシン）ＩＰＩ−５０４（レタスピマイシン）、およびＡＵＹ９２２からなる群から選択される、請求項３７から５１のうちのいずれか一項に記載の方法。
  66. 細胞のゲノムを改変する方法であって、有効量の、
    （ｉ）受容体チロシンキナーゼＣ−ｋｉｔリガンドおよびＡＴＲ−Ｃｈｋ１細胞周期チェックポイント経路阻害剤からなる群から選択される遺伝子編集増強剤、ならびに
    （ｉｉ）請求項１から３６のうちのいずれか一項に記載の三重鎖形成組成物
    に該細胞を接触させることを含み、
    ゲノム改変が（ｉ）の非存在下で（ｉｉ）に接触させた同等の集団においてよりも（ｉ）と（ｉｉ）の両方に接触させた細胞の集団においてより高い頻度で起こる方法。
  67. 請求項３７から６６のうちのいずれかに記載の方法に従って遺伝的に改変される単離された細胞。
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