KR20190072639A - 세포 치료에 사용하기 위한 면역학적으로 식별 가능한 세포 표면 변이체 - Google Patents

세포 치료에 사용하기 위한 면역학적으로 식별 가능한 세포 표면 변이체 Download PDF

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루카스 제커
마라 코르네트
로렌차 보르돌리 슈베데
토르스텐 슈베데
로살바 레포르
로미나 마테르 마론느
마이크 레셔
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유니버시타트 바셀
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Abstract

본 발명은 표면 단백질의 제1 이소폼을 발현하고, 표면 단백질의 제2 이소폼 형태를 발현하는 세포를 갖는 환자의 의학적 치료에 사용하기 위한 포유동물 세포, 구체적으로 인간 세포에 관한 것으로, 제1 이소폼은 제2 이소폼과 기능적으로 구별할 수 없지만 면역학적으로 구별할 수 있다. 본 발명은 또한 1) 항체 또는 항체-유사 분자를 포함하거나 이로 구성된 화합물, 및 2) 항체-유사 분자를 보유한 면역 효과기 세포 또는 키메릭 항원 수용체를 보유한 면역 효과기 세포로부터 선택되는 질병(medical condition)의 치료 방법에 사용하기 위한 약제에 관한 것으로, 약제는 표면 단백질의 제1 또는 제2 이소폼 중 어느 하나에 특이적으로 반응하고, 제1 이소폼은 제2 이소폼과 기능적으로 구별할 수 없지만 면역학적으로 구별할 수 있으며, 약제는 약제가 반응하는 이소폼을 보유한 세포를 제거하기 위해 투여된다.

Description

세포 치료에 사용하기 위한 면역학적으로 식별 가능한 세포 표면 변이체
본 발명은 세포 집단의 선택적 고갈 또는 농화(enrichment)가 바람직한 의학적 적용에서 돌연변이체지만 기능적인 세포 표면 단백질을 갖는 세포의 용도에 관한 것이다. 돌연변이체지만 기능적인 세포 표면 단백질은 특히 CRISPR/Cas 유전자 편집 동안 DNA 이중 가닥 절단의 상동 재조합(homology directed repair)을 포함하는 유전자 편집 방법에 의해, 또는 유전자가위(base editor)를 사용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 본 발명은 또한 인 비보에서 편집된 세포의 선택적 고갈을 위한 약제 및 방법에 관한 것이다.
세포 치료는 매우 강력한 치료법이지만, 종종 심각한 원치않은 부작용과 연관된다. 트랜스진 및/또는 이식된 세포의 유전자 조작은 악성 형질전환을 유발할 수 있다. CAR-T 세포의 이식은 심각한 표적내(on-target) 및 표적이탈(off-target) 효과(사이토카인 방출 신드롬)를 유발할 수 있고, 동종이형 T 세포의 이식은 이식편-대-숙주 질환(GvHD)을 유발할 수 있다. 종양학에서 세포 치료의 성공은 아마도 비-악성 질환을 포함하여 다른 징후에 대한 세포 치료를 향상시킬 것이다. 세포 치료의 안전성을 높이기 위해, 특히 치명적이지 않은 질환의 치료에 사용되는 경우, 이식된 세포가 이식 후 몇 년 동안 안전하게 남아있음을 보장하는 것이 중요하다. 심각한 원치않은 부작용이 발생하는 경우, "안전 또는 살해 스위치"를 통해 이식된 세포를 선택적으로 고갈시킬 수 있는 가능성은 세포 치료의 안전성을 현저히 높일 수 있다.
본 발명의 근본적인 문제는 세포를 영구적으로 표시 및 추적하고, 인 비트로 또는 인 비보에서 표시 또는 표시되지 않은 세포의 선택적 고갈을 가능케 하는 시스템을 제공하는 것이다. 이들 문제는 독립항의 요지에 의해 해결된다.
본 발명의 제1 양태는 표면 단백질의 제1 이소폼을 발현하고, 상기 표면 단백질의 상기 제1 이소폼은 상기 표면 단백질의 제2 이소폼과 기능적으로 구별할 수 없지만 면역학적으로 구별할 수 있으며, 상기 표면 단백질의 상기 제2 이소폼을 발현하는 세포를 갖는 환자의 의학적 치료에 사용하기 위한 포유동물 세포에 관한 것이다.
표현 "면역학적으로 구별할 수 있는"은 제1 또는 제2 이소폼 중 어느 하나에 특이적으로 결합하는 리간드에 의해 구별될 수 있는 표면 단백질의 제1 및 제2 이소폼을 지칭한다.
본 명세서에서, 표현 "특이 결합"은 해리 상수 KD ≤ 10E-7로 결합하는 것을 지칭한다.
본 명세서에서, 표현 "리간드"는 항체 또는 항체-유사 분자에 관한 것이다. 항체 또는 항체-유사 분자는 다른 분자와 결합하거나(예를 들어, 면역 독소로서), 세포, 특히 면역 세포의 표면에 제시될 수 있다.
본 명세서에서, 용도 "항체"는 세포 생물학 및 면역학의 종래기술에 공지된 그것의 의미로 사용된다; 그것은 이에 제한되지는 않으나 면역글로불린 타입 G(IgG), 타입 A(IgA), 타입 D(IgD), 타입 E(IgE) 또는 타입 M(IgM)을 포함한 전체 항체, 임의의 항원 결합 단편 또는 이의 단일쇄 및 관련되거나 유래된 구조물을 지칭한다. 전체 항체는 이황화 결합에 의해 상호 결합된 적어도 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함한 당단백질이다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역(CH)으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 이루어진다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(여기서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인, CL로 이루어진다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 효과기 세포) 및 고전적인 보체계의 제1 성분을 포함하여 숙주 조직 또는 인자와 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "항체-유사 분자"는 높은 친화도, KD ≤ 10E-7 mol/l, 특히 KD ≤ 10E-8 mol/l로 다른 분자 또는 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 분자를 지칭한다. 항체-유사 분자는 항체의 특이 결합과 유사하게 이의 표적에 결합한다. 용어, 항체-유사 분자는 설계된 안키린 리피트 단백질(ankyrin repeat protein)(Molecular Partners, Zurich)과 같은 리피트 단백질, 아르마딜로 리피트 단백질에서 유래된 폴리펩타이드, 류신이 풍부한 리피트 단백질에서 유래된 폴리펩타이드, 아피머(affimer), 키메릭 항원 수용체(CAR)와 같은 항체-유래 분자 및 테트라트리코펩타이드 리피트 단백질에서 유래된 폴리펩타이드를 포함한다.
용어, 항체-유사 분자는 또한 단백질 A 도메인에서 유래된 폴리펩타이드, 피브로넥틴 도메인 FN3에서 유래된 폴리펩타이드, 컨센셔스 피브로넥틴 도메인에서 유래된 폴리펩타이드, 리포칼린에서 유래된 폴리펩타이드, 징크 핑거에서 유래된 폴리펩타이드, Src 호몰로지 도메인 2(SH2)에서 유래된 폴리펩타이드, Src 호몰로지 도메인 3(SH3)에서 유래된 폴리펩타이드, PDZ 도메인에서 유래된 폴리펩타이드, 감마-크리스탈린에서 유래된 폴리펩타이드, 유비퀴틴에서 유래된 폴리펩타이드, 시스테인 노트(cysteine knot) 폴리펩타이드에서 유래된 폴리펩타이드 및 노튼(knottin)에서 유래된 폴리펩타이드를 포함한다.
이론상, 표면 단백질의 제1 및 제2 이소폼은 2개의 리간드에 의해 구별될 수 있으며, 하나의 리간드는 제1 이소폼을 특이적으로 인식할 수 있고, 다른 리간드는 제2 이소폼을 특이적으로 인식할 수 있다. 다른 말로, 각 리간드는 하나의 이소폼에 특이적으로 결합할 수 있지만, 다른 이소폼에는 그렇지 않다. 다른 말로, 리간드는 하나의 이소폼에만 특이적으로 결합하고 다른 것에는 그렇지 않음으로써 2개의 이소폼을 식별할 수 있다.
표현 "기능적으로 구별할 수 없는"은 유의한 손상 없이 세포 내에서 같은 기능을 동등하게 수행할 수 있는 제1 및 제2 이소폼을 지칭한다. 다른 말로, 제1 및 제2 이소폼은 기능적으로 크게 구별할 수 없다. 특정 구체예에서, 약간의 기능 손상은 허용될 수 있다.
본 명세서에서, 표현 "세포 표면 단백질의 제1 및/또는 제2 이소폼"은 세포 표면 단백질의 제1 및 제2 대립유전자를 지칭한다.
특정 구체예에서, 포유동물 세포는 인간 세포이다.
특정 구체예에서, 표면 단백질의 제2 이소폼은 단백질의 야생형 형태(다른 말로, 자연에서 보통 발생하는 형태)에 관한 것이고, 제1 이소폼은 제2 이소폼을 암호화하는 핵산 서열에서 돌연변이를 도입하여 얻은 이소폼에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 표면 단백질의 제2 이소폼은 천연 이소폼이고, 제1 이소폼은 천연 이소폼에서 유래된 유전자 조작된 이소폼이다.
본 명세서에서, 표현 "천연 단백질"은 세포의 게놈 내 핵산 서열에 의해 암호화되는 단백질을 지칭하며, 이 핵산 서열은 유전자 조작에 의해 삽입 또는 돌연변이되지 않는다. 다른 말로, 천연 단백질은 트랜스제닉 단백질 또는 유전자 조작된 단백질이 아닌 단백질이다.
특정 구체예에서, 표면 단백질은 세포외 폴리펩타이드 서열을 포함하고, 상기 제1 이소폼은 상기 제2 이소폼과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15 또는 20의 아미노산의 삽입, 결실 및/또는 치환을 포함한다.
특정 구체예에서, 표면 단백질은 세포외 폴리펩타이드 서열을 포함하고, 상기 제1 이소폼은 상기 제2 이소폼과 비교하여 1 내지 20, 구체적으로 1 내지 5, 보다 구체적으로 1 내지 3의 아미노산의 삽입, 결실 및/또는 치환을 포함한다.
특정 구체예에서, 표면 단백질은 세포외 폴리펩타이드 서열을 포함하고, 상기 제1 이소폼은 상기 제2 이소폼과 비교하여 1개의 아미노산의 삽입, 결실 및/또는 치환을 포함한다.
특정 구체예에서, 삽입, 결실 및/또는 치환은 상이한 포유동물 종 간의 비-보존된 부위에 위치한다.
특정 구체예에서, 삽입, 결실 및/또는 치환은 표면 단백질에서 2차 구조 변화를 초래하지 않는다.
특정 구체예에서, 삽입, 결실 및/또는 치환은 결정 구조 분석 또는 컴퓨터를 이용한 구조 예측에 따라 리간드 결합에 접근할 수 있는 부위에 위치한다.
특정 구체예에서, 삽입, 결실 및/또는 치환은 결정 구조 분석 또는 컴퓨터를 이용한 구조 예측에 따라 다른 포유동물의 단백질과 비교하여 고유의 토폴로지를 갖는 부위에 위치한다.
본 명세서에서, 표현 "고유의 토폴로지"는 1-20의 아미노산의 삽입, 결실 및/또는 치환에 의해 변형된 표면 단백질에만 존재하고, 다른 포유동물의 단백질, 특히 다른 인간 표면 단백질에서는 그렇지 않은 토폴로지를 지칭한다. 다른 단백질에서 같거나 매우 유사한 토폴로지의 존재는 상기 부위에 위치한 에피토프를 인식하는 특이 항체의 생성을 방해할 것이다.
특정 구체예에서, 삽입, 결실 및/또는 치환은 표면 단백질의 예측 또는 실험적으로 확립되거나 확인된 단백질-단백질 상호작용과 관련된 부위에 위치하지 않는다.
특정 구체예에서, 삽입, 결실 및/또는 치환은 분자 간 또는 분자 내 상호작용인 이황화 결합, 또는 소수성 스태킹의 결실 또는 도입을 초래하지 않는다. 예를 들어, 삽입, 결실 및/또는 치환으로 인해 분자 간 또는 분자 내 상호작용인 염 브릿지가 결실되는 경우, 염 브릿지 상호작용의 이러한 결실은 단백질 내 새로운 상호작용에 의해 보상된다는 것이 확인되어야 한다. 그렇지 않으면, 염 브릿지 상호작용의 결실은 피해야 한다.
특정 구체예에서, 삽입, 결실 및/또는 치환은 단백질 폴딩에 중요한 번역후 단백질 변형 부위, 특히 글리코실화 부위의 결실 또는 도입을 초래하지 않는다.
특정 구체예에서, 삽입, 결실 및/또는 치환은 단백질 폴딩과 관련이 없는 번역후 단백질 변형 부위, 특히 글리코실화 부위의 결실 또는 도입을 초래하지 않으므로 새로운 에피토프를 만들어 낸다.
특정 구체예에서, 제1 이소폼은 항체-유사 분자 결합 또는 항체 결합에 의해 제2 이소폼과 구별될 수 있다.
특정 구체예에서, 제1 이소폼은 항체를 보유한 면역 효과기 세포의 반응에 의해 제2 이소폼과 구별될 수 있다. 특정 구체예에서, 제1 이소폼은 항체-유사 분자를 보유한 면역 효과기 세포의 반응에 의해 제2 이소폼과 구별될 수 있다. 특정 구체예에서, 제1 이소폼은 항체를 보유한 면역 효과기 세포의 반응에 의해 제2 이소폼과 구별될 수 있다. 특정 구체예에서, 제1 이소폼은 항체-유사 분자를 보유한 면역 효과기 세포의 반응에 의해 제2 이소폼과 구별될 수 있다. 특정 구체예에서, T 세포, 특히 키메릭 항원 수용체(CAR)를 보유한 활성화 T 세포의 반응에 의해 제2 이소폼과 구별될 수 있다.
본 명세서에서, 키메릭 항원 수용체(CAR)는 T 세포에 대한 결합 특이성, 특히 단클론 항체의 특이성을 이식하는 조작된 수용체에 관한 것이다. CAR의 보통 형태는 설계된 결합 특이성을 갖는 단클론 항체에서 유래된 세포외 도메인, 트랜스멤브레인 도메인 및 세포내 도메인을 포함한다(Gill and June, Imm Rev, 2014). 세포외 도메인은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 포함하는 단일쇄 가변 단편을 포함한다. 그러한 CAR의 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 설계된 결합 특이성을 갖는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포에서 유래될 수 있다(Gill and June, Imm Rev, 2014; Fields, Nat Prot, 2013).
특정 구체예에서, 표면 단백질은 CD1a, CD1b, CD1c, CD1e, CD1e, CD2, CD3, CD3d, CD3e, CD3g, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8a, CD8b, CD9, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD11d, CDwl2, CD13, CD14, CD15, CD15u, CD15s, CD15su, CD16, CD16b, CD17, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD32, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, CD41, CD42a, CD42b, CD42c, CD42d, CD43, CD44, CD45, CD45RA, CD45RB, CD45RC, CD45RO, CD46, CD47, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD50, CD51, CD52, CD53, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD59, CD60a, CD60b, CD60c, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD63, CD64, CD65, CD65s, CD66a, CD66b, CD66c, CD66d, CD66e, CD66f, CD68, CD69, CD70, CD71, CD72, CD73, CD74, CD75, CD75s, CD77, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CD85a, CD85d, CD85j, CD85k, CD86, CD87, CD88, CD89, CD90, CD91, CD92, CD93, CD94, CD95, CD96, CD97, CD98, CD99, CD99R, CD100, CD101, CD102, CD103, CD104, CD105, CD106, CD107a, CD107b, CD108, CD109, CD110, CD111, CD112, CD113, CD114, CD115, CD116, CD117, CD118, CD119, CD120a, CD120b, CD121a, CD121b, CD122, CD123, CD124, CD125, CD126, CD127, CD129, CD130, CD131, CD132, CD133, CD134, CD135, CD136, CD137, CD138, CD139, CD140a, CD140b, CD141, CD142, CD143, CD144, CDw145, CD146, CD147, CD148, CDw149, CD150, CD151, CD152, CD153, CD154, CD155, CD156a, CD156b, CD156c, CD157, CD158e, CD158i, CD158k, CD159a, CD159c, CD160, CD161, CD162, CD163, CD164, CD165, CD166, CD167a, CD167b, CD168, CD169, CD170, CD171, CD172a, CD172b, CD172g, CD173, CD174, CD175, CD175s, CD176, CD177, CD178, CD179a, CD179b, CD180, CD181, CD182, CD183, CD184, CD185, CD186, CD191, CD192, CD193, CD194, CD195, CD196, CD197, CDw198, CD199, CD200, CD201, CD202b, CD203c, CD204, CD205, CD206, CD207, CD208, CD209, CD210, CDw210b, CD212, CD213a1, CD213a2, CD215, CD217a, CD218a, CD218b, CD220, CD221, CD222, CD223, CD224, CD225, CD226, CD227, CD228, CD229, CD230, CD231, CD232, CD233, CD234, CD235a, CD235b, CD236, CD236R, CD238, CD239, CD240CE, CD240DCE, CD240D, CD241, CD242, CD243, CD244, CD245, CD246, CD247, CD248, CD249, CD252, CD253, CD254, CD256, CD266, CD267, CD268, CD269 (BCMA), CD270, CD271, CD272, CD273, CD274, CD275, CD276, CD277, CD278, CD279, CD280, CD281, CD282, CD283, CD284, CD286, CD289, CD290, CD292, CDw293, CD294, CD295, CD296, CD297, CD298, CD299, CD300a, CD300c, CD300e, CD301, CD302, CD303, CD304, CD305, CD306, CD307a, CD307b, CD307c, CD307d, CD307e, CD308, CD309, CD312, CD314, CD315, CD316, CD317, CD318, CD319, CD320, CD321, CD322, CD324, CD325, CD326, CD327, CD328, CD329, CD331, CD332, CD333, CD334, CD335, CD336, CD337, CD338, CD339, CD340, CD344, CD349, CD350, CD351, CD352, CD353, CD354, CD355, CD357, CD358, CD360, CD361, CD362, CD363, CD364, CD365, CD366, CD367, CD368, CD369, CD370, CD371, 면역글로불린 경쇄(람다 또는 카파), HLA 단백질 및 β2-마이크로글로불린으로부터 선택된다.
본 명세서에서, HLA는 "인간 백혈구 항원"을 지칭하며, HLA-A, HLA.B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-DM, HLA-DO, HLA-DP, HLA-DQ 및 HLA-DR를 포함한다.
특정 구체예에서, 표면 단백질은 CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD19, CD20, CD22, CD23, CD33, CD34, CD90, CD45, CD123, CD269 (BCMA), 면역글로불린 경쇄(람다 또는 카파), HLA 단백질 및 β2-마이크로글로불린으로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 표면 단백질은 CD45, CD3, CD4, CD8a, CD8b 및 CD279로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 표면 단백질은 CD45, CD45RA 및 CD45RO로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 표면 단백질은 CD45, CD34, CD38, CD59, CD90 및 CD117로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 표면 단백질은 CD45, CD19, CD20, CD22, CD22, CD23, CD38, CD138, CD268, CD269 (BCMA) 및 CD319로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 표면 단백질은 CD5, CD19, CD20, CD33, CD123, CD38 및 CD269로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 표면 단백질은 CD45, CD19, CD4 및 CD8로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 표면 단백질은 CD45이다.
특정 구체예에서, 표면 단백질은 Thy1(CD90)이다.
특정 구체예에서, 표면 단백질은 CD19이다.
본 명세서에서, "Thy1"은 "thymus cell antigen 1", 세타; 다른 명칭: CD90; UniProt ID P04216 (human)를 지칭한다.
본 명세서에서, "CD45"는 "protein tyrosine phosphatase, receptor type, C (Ptprc)"; UniProt ID P08575 (human)를 지칭한다.
실시예 섹션의 동물 실험에서, CD45 및 CD90은 각각 인간 유전자 및 단백질의 쥐의 호몰로그를 지칭한다. 청구항 30-31 및 34-36은 특히 쥐의 호몰로그: "쥐의 CD45" 및 "쥐의 CD90/Thy1"을 지칭한다.
특정 구체예에서, 표면 단백질은 CD4이다. 특정 구체예에서, 표면 단백질은 CD2이다. 특정 구체예에서, 표면 단백질은 CD8이다. 특정 구체예에서, 표면 단백질은 HLA 단백질이다.
특정 구체예에서, 표면 단백질의 제1 이소폼은 환자 고유의 게놈 DNA에서 암호화되지 않는다.
특정 구체예에서, 세포는 동종 세포이다. 동종 세포는 세포를 받는 사람과 유전적으로 유사한 도너에서 유래된 세포를 지칭한다. 도너는 혈족 관계에 있거나 그렇지 않은 사람일 수 있다.
특정 구체예에서, 세포는 자가 세포이다. 동종 세포는 세포를 받는 동일한 사람에서 유래된 세포를 지칭한다.
특정 구체예에서, 제1 이소폼은 환자 고유의 게놈 DNA에서 아미노산의 상기 삽입, 결실 및/또는 치환을 유도함으로써 상기 표면 단백질을 암호화하는 서열을 변화시켜 얻었다.
특정 구체예에서, 제1 이소폼은 RNA 편집 기술에 의해 상기 표면 단백질을 암호화하는 mRNA를 변화시켜 얻었다(Zhang, 2017). 이 방법은 게놈 DNA를 바꾸지 않은 채로 남겨두지만, 표면 단백질의 아미노산 서열에서 아미노산의 삽입, 결실 및/또는 치환을 초래한다.
특정 구체예에서, 제1 이소폼은 상기 표면 단백질의 상기 제2 이소폼의 아미노산 서열에서 1, 2, 3, 4 또는 5 (또는 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15 또는 20)의 아미노산의 삽입, 결실 및/또는 치환을 유도하여 얻었다.
특정 구체예에서, 제1 이소폼은 상기 표면 단백질의 상기 제2 이소폼의 아미노산 서열에서 1 내지 20, 구체적으로 1 내지 5, 보다 구체적으로 1 내지 3의 아미노산의 삽입, 결실 및/또는 치환을 유도하여 얻었다.
특정 구체예에서, 제1 이소폼은 상기 표면 단백질의 상기 제2 이소폼의 아미노산 서열에서 1개의 아미노산의 삽입, 결실 및/또는 치환을 유도하여 얻었다.
아미노산의 삽입, 결실 및/또는 치환은 환자 고유의 게놈 DNA에서 상기 표면 단백질을 암호화하는 서열의 변화(유전자 편집) 또는 상기 표면 단백질을 암호화하는 mRNA의 변화(RNA 편집)에 의해 수행될 수 있다. 두 가지 형태의 편집은 단백질의 아미노산 서열에서의 변화를 초래한다.
특정 구체예에서, 삽입, 결실 및/또는 치환은
a. 상이한 포유동물 종, 특히 마우스, 랫트, 영장류 및 인간 호몰로그의 하나 이상의 상동 서열을 비교(정렬)하고, 비-보존된 부위에서 삽입, 결실 및/또는 치환을 배치;
b. 결정 구조 분석 또는 컴퓨터를 이용한 구조 예측이 삽입, 결실 및/또는 치환이 일어나는 구역의 2차 구조 변화를 예측하지 않도록 삽입, 결실 및/또는 치환을 선택;
c. 결정 구조 분석 또는 컴퓨터를 이용한 구조 예측에 따라 리간드 결합에 접근할 수 있는 부위에 그것이 위치하도록 삽입, 결실 및/또는 치환을 선택;
d. 표면 단백질의 예측 또는 실험적으로 확립된 단백질-단백질 상호작용에 관여하지 않는 서열에서 삽입, 결실 및/또는 치환을 선택;
e. 분자 간 또는 분자 내 상호작용인 이황화 결합 또는 소수성 스태킹을 결실 또는 도입하지 않고 삽입, 결실 및/또는 치환을 선택; 및
f. 단백질 폴딩에 중요한 번역후 단백질 변형 부위, 특히 글리코실화 부위를 결실 또는 도입하지 않고 삽입, 결실 및/또는 치환을 선택하여 수행된다.
특정 구체예에서, 삽입, 결실 및/또는 치환은 그것이 결정 구조 분석 또는 컴퓨터를 이용한 구조 예측에 따라 다른 포유동물의 단백질과 비교하여 고유의 토폴로지를 갖는 부위에 위치하도록 선택된다.
본 명세서에서 비-보존된 부위는 다수의 상동 서열의 다중 서열 정렬(MSA)로부터 추정된 바와 같이, 진화 시간에 걸쳐 종종 돌연변이가 일어나는 부위에 관한 것이다. 부위-특이적인 보존은 특이 부위에 작용하는 기능적 또는 구조적 제한의 존재를 나타내며, 단백질의 구조 또는 기능을 보존하는 데 있어 그들의 중요성을 평가할 수 있게 한다. 이용 가능한 실험적으로 결정된 구조로부터 예측 또는 관찰된 각 부위에서의 용매 접근성 상태는 고도로 보존되고 노출된 리간드 결합, 기질 결합 또는 단백질-단백질 상호작용에 관련된 기능적으로 중요한 부위와 종종 고도로 보존되고 묻혀있는 구조적으로 중요한 부위를 구별하는데 이용될 수 있다. 그리하여, 본 명세서에서 비-보존된 부위는 낮은 진화적 보존 및 높은 용매 접근성을 나타내는 부위에 관한 것이다.
유사한 서열을 검색하는 방법은 잘 확립되어 있고, 상동성을 추정하는데 일상적으로 사용되며, 이들은 훨씬 민감한 프로파일-기반 또는 PSI-BLAST, HMMER, HHblits과 같은 은폐 마르코프 모델(Hidden Markov Models)-기반 방법뿐만 아니라 널리 사용되는 BLAST 도구를 포함한다.
상동 서열의 다중 서열 정렬(Multiple Sequence Alignment)은 T-COFFEE에서 구현된 대로 국소 및 전역 정렬 정보를 효율적으로 조합하거나, 또는, 가능하면, 가이드 MSA 구축에 구조 정보를 통합하여(MAFFT, PROMALS3D, 3D Coffee) 얻을 수 있다.
MSA로부터 부위-특이적인 보존의 효율적인 평가 방법은 Shannon 엔트로피 측정, 유사성 기반 매트리스(즉, BLOSUM), 또는 최대 확률 및 경험적 Bayes 패러다임(Rate4Site)과 같은 확률론적 진화 모델을 기반으로 한다.
3차원 단백질 구조 예측을 위한 효율적인 방법은 SWISS-MODEL, MODELLER, RaptorX 및 IntFOLD와 같은 비교 기반 방법들을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
B-세포 에피토프를 예측하는 방법은 아미노산 물리화학적 특성들, 즉, 소수성, 유연성, 극성 및 노출된 표면을 이용하여 불연속 또는 선형의 에피토프의 일부가 되도록 잔기(residue)-기반의 확률을 제공한다. 이들 도구는 Ellipro, SEPPA, BepiPred, ABCpred, DiscoTope, EpiSearch를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
특정 구체예에서, 삽입, 결실 및/또는 치환은 상기 제1 표면 단백질의 세포외 부분, 특히 세포외 루프에 위치한다. 세포외 루프에서의 돌연변이는 단백질 기능에 거의 영향을 미치지 않는다.
목적 표면 단백질에 대해 반응하는 항체 또는 항체-유사 분자가 이미 존재하는 경우, 삽입, 결실 및/또는 치환의 부위를 선별하기 위해 목적 표면 단백질의 에피토프가 이 항체에 의해 인식된다는 정보가 사용될 수 있다. 따라서, 존재하는 항체가 결합하는 에피토프를 포함하는 목적 단백질의 이소폼은 제2 이소폼에 상응할 것이며, 조작된 에피토프를 포함하는 목적 단백질의 새롭게 조작된 이소폼은 제2 이소폼에 상응할 것이다.
CDR 모델링은 Messih, Bioinformatics, 2014에 기술된다.
특정 구체예에서, 세포는 상기 표면 단백질의 상기 제2 이소폼을 발현하는 세포의 특이적인 제거 전, 동시 또는 후에 투여된다. 특정 구체예에서, 상기 표면 단백질의 상기 제2 이소폼을 발현하는 세포의 제거는 항체-유사 분자, 항체, 항체 또는 항체-유사 분자를 보유한 면역 효과기 세포 및 키메릭 항원 수용체를 보유한 면역 효과기 세포, 특히 T 세포로부터 선택된 약제를 상기 환자에게 투여하여 수행되고, 상기 약제는 상기 세포 표면 단백질의 상기 제2 이소폼에 특이적으로 반응한다(상기 제1 이소폼에는 그렇지 않음).
특정 구체예에서, 세포는 상기 표면 단백질의 제2 이소폼에 대해 반응하는 항체 또는 항체-유사 분자를 발현한다.
특정 구체예에서, 세포는 상기 표면 단백질의 제2 이소폼에 대해 반응하는 키메릭 항원 수용체를 발현한다.
특정 구체예에서, 세포는 표면 단백질의 제2 이소폼에 대해 반응하는 항체 또는 항체-유사 분자, 특히 키메릭 항원 수용체를 발현하고, 표면 단백질은 CD45, CD19, CD8 및 CD4로부터 선택되고, 특히 표면 단백질은 CD45이다.
특정 구체예에서, 세포는
a. 제1 표면 단백질의 제1 이소폼은 상기 제1 표면 단백질의 제2 이소폼과 기능적으로 구별할 수 없지만 면역학적으로 구별할 수 있는, 제1 표면 단백질의 제1 이소폼, 및
b. 제2 표면 단백질의 제1 이소폼은 상기 제2 표면 단백질의 제2 이소폼과 기능적으로 구별할 수 없지만 면역학적으로 구별할 수 있는, 제2 표면 단백질의 제1 이소폼을 발현한다.
특정 구체예에서, 제1 표면 단백질은 CD19이고, 제2 표면 단백질은 CD45이다.
특정 구체예에서, 포유동물 세포는 조혈 줄기세포(혈구모세포), CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 기억 T 세포, 면역조절 T 세포(T reg), 자연 살해 세포(NK), 선천성 림프 세포(innate lymphoid cell, ILC), 수지상세포(DC), B-림프구, 점막과 연관된 불변성 T 세포(mucosal-associated invariant T cell, MAIT) 및 감마 델타 T 세포(γδ T)를 포함하는 군에서 선택된다.
특정 구체예에서, 포유동물 세포는 조혈 세포이다. 특정 구체예에서, 포유동물 세포는 조혈 줄기세포이다. 특정 구체예에서, 포유동물 세포는 면역 세포이다. 특정 구체예에서, 포유동물 세포는 T 세포이다. 특정 구체예에서, 포유동물 세포는 B 세포이다.
특정 구체예에서, 세포는 상기 환자에 존재하는 질환-관련 유전자 결함을 교정 또는 무효화하는 유전자 변이(genetic alteration)를 포함한다. 표현 "질환-관련 유전자 결함을 교정하는 유전자 변이"는 트랜스진의 삽입, 질환-관련 돌연변이의 유전자 교정, 유전자 특히 질환-관련 돌연변이를 탑재한 유전자의 결실, 유전자의 발현에 중요한 후성유전학적 변형에서의 변화, 또는 이들의 조합을 포함하는 것을 의미한다. 표현 "유전자의 결실"은 유전자의 기능적 결실, 다른 말로 예를 들어, 조기 종결 코돈의 삽입 또는 조절성 리프레서 서열의 삽입을 통해 유전자의 발현을 억제하는 것을 포함하는 것을 의미한다.
특정 구체예에서, 세포는 트랜스진을 포함한다. 특정 구체예에서, 트랜스진은 질환-관련 유전자 결함에 의해 영향을 받는 단백질의 기능적 이소폼을 암호화하는 핵산 서열이다. 트랜스진은 질환-관련 유전자 결함을 갖지 않는다.
특정 구체예에서, 세포는 질환-관련 돌연변이의 유전자 교정을 포함한다. 세포가 질환-관련 유전자 결함의 유전자 교정을 포함하는 경우, 천연 유전자에서의 질환-유발 돌연변이는 유전자 편집 기술을 이용하여 교정되었다.
본 명세서에서, 유전자 편집 또는 유전자 조작은 생명체의 게놈에서 핵산 서열의 삽입, 결실 또는 대체를 수행하는 기술에 관한 것이다. 유전자 편집은 게놈 DNA에서 부위-특이적인 이중 가닥 절단 또는 부위 특이적인 단일 가닥 절단(닉)을 포함한다. 비-제한적 예시로, 유전자 편집은 CRISPR/Cas-매개된 부위-특이적인 이중 가닥 절단 또는 부위-특이적인 유전자가위의 사용에 따른 HDR에 의해 수행될 수 있다.
특정 구체예에서, 질환-관련 유전자 결함은 Foxp3 유전자, CD25 유전자, Stat5b 유전자, Stat1 유전자 및 Itch 유전자로부터 선택된 유전자에서의 돌연변이이다.
특정 구체예에서, 질환-관련 유전자 결함은 Foxp3 유전자에서의 돌연변이이다.
특정 구체예는 포유동물 세포를 환자에게 투여한 후 이식편-대-숙주 질환(GvHD)이 발생하는 경우에 관한 것이다. 이들 예에서, 세포는 상기 세포 표면 단백질의 상기 제1 이소폼에 특이적으로 결합(상기 제2 이소폼에는 그렇지 않음)하는 항체 또는 항체-유사 분자 또는 상기 세포 표면 단백질의 상기 제1 이소폼에 특이적으로 반응하는(상기 제2 이소폼에는 그렇지 않음) 면역 효과기 세포, 특히 CAR-T 세포의 환자로의 투여에 의해 특이적으로 제거된다.
특정 구체예에서, 치료는 조혈 줄기세포 이식을 포함한다.
특정 구체예에서, 치료는 T 세포의 이식(다른 말로 T 세포 치료)을 포함한다.
특정 구체예에서, 치료는 장기 이식을 포함한다.
특정 구체예에서, 치료는 유전적 조혈성 질환의 치료에 관한 것이다. 유전적 조혈성 질환의 비-제한적 예시는 지중해빈혈(thalassemias)이다.
특정 구체예에서, 치료는 T 세포 매개 질환, 특히 유전적 T 세포 매개 질환, 보다 구체적으로 IPEX-유사 신드롬, CTLA-4 연관된 면역 조절 장애, 혈액탐식 신드롬(hemaphagocytic syndrome), ALPS 신드롬, 또는 이종접합 PTEN 생식세포 돌연변이에 의해 유발된 신드롬의 치료에 관한 것이다.
특정 구체예에서, T 세포 매개 질환은 IPEX 신드롬(immunodysregulation polyendocrinopathy enteropathy X-linked syndrome; OMIM http://www.omim.org/entry/304790) 또는 IPEX-유사 신드롬이고, 상기 게놈 내 위치는 Foxp3 유전자, CD25 유전자, Stat5b 유전자, Stat1 유전자 및 Itch 유전자로부터 선택된 유전자에 포함된 돌연변이이다(Verbsky and Chatila, Curr Opin Pediatr. 2013 Dec;25(6):708-14). 상기 유전자에서의 돌변변이는 유전자 산물의 발현 또는 정상적인 기능을 억제한다. 돌연변이를 제거하기 위해 이들 게놈 내 위치를 편집함으로써 유전자 및 단백질 발현을 회복한다.
특정 구체예에서, 치료는 면역결핍, 특히 SCID(severe combined immunodeficiency syndrome)의 치료에 관한 것이다.
특정 구체예에서, 질환-관련 유전자 결함은 Foxp3 유전자에서의 돌연변이이고, 상기 질환은 IPEX이다. 특정 구체예에서, 질환-관련 유전자 결함은 Foxp3에서의 돌연변이, 구체적으로 Foxp3K276X 돌연변이이다. 이 돌연변이는 유전자 산물의 정상적인 기능을 억제한다. 이 게놈 내 위치를 편집함으로써 돌연변이는 야생형 DNA 서열로 복귀하므로, Foxp3 유전자 및 Foxp3 단백질 발현을 회복한다(도 20).
IPEX는 다른 메카니즘을 가지고 있지만 매우 공격적이기 때문에 종양/암에 필적할만한 악성 질환으로 간주될 수 있다. 질환-관련 유전자 결함이 있는 병원성 조혈/면역 세포의 제거는 최소한 일시적으로 타당하다.
본 명세서 내에서, 용어 "Foxp3 유전자"는 인간의 forkhead box P3, NCBI GENE ID: 50943에 관한 것이다. 실시예 섹션에서 기술된 동물 실험에서, 쥐의 Foxp3K276X 돌연변이는 유전자 편집에 의해 수선되었다. 이 돌연변이는 임상적으로 관련이 있는 인간 Foxp3 돌연변이를 재현한다(Ramsdell et al., Nature reviews. Immunology 14, 343-349 (2014); Lin et al., The Journal of allergy and clinical immunology 116, 1106-1115 (2005)).
본 발명자들은 유전자 편집을 이용하여 쥐의 T 세포에서 Foxp3K276X 돌연변이를 교정하는 것이 가능함을 보여주었다(도 20, 21, 22, 26). 본 발명자들은 또한 수선된 T 세포가 기능적이며, 다른 면역 세포를 억제함을 입증하였다(도 24, 25). 이들 T 세포는 직접적으로 수선되거나, 수선된 HSCs 또는 iPS-유래 T 세포로부터 유래될 수 있다. 본 발명자들은 또한 입양 전달된 T 세포가 Foxp3-결핍 숙주에서 확장함을 입증하였다. T 세포의 절반이 Treg이 되어 질환을 억제한다(도 29). 이는 스컬피(scurfy)/IPEX 신드롬을 위한 T 세포 치료의 타당성을 입증한다. 본 발명자들은 CD4 고갈이 질환을 억제할 수 있음을 보여주었다(도 30-32). 따라서, CD4+ 세포는 병원성 세포이다. 그러므로 원칙적으로 치료적 접근은 CD4+ T 세포를 고갈시키고 나서 Foxp3-수선된 CD4+ T 세포를 이식하여 면역학적 균형을 회복시키는 것일 수 있다. 그러나 유전자-수선된 T 세포 및 병원성 Foxp3-결핍 T 세포 둘 다 CD4를 발현하므로, CD4+ T 세포가 지속적으로 고갈되면 병원성 세포를 죽일 뿐만 아니라 입양 전달된 유전자-수선 세포도 죽일 수 있다. 해결책은 Foxp3 유전자를 동시에 교정하고, 동시에 대립유전자를 조작하는 것이다. 본 발명자들은 Foxp3 유전자의 교정 및 CD45.2의 CD45.1로의 전환의 타당성을 입증한다(도 20). 따라서, 병원성 Foxp3-결핍 세포는 천연 CD45 에피토프(예를 들어, CD45.2)에 대한 항체를 이용하여 고갈될 수 있다. Foxp3-수선된 세포가 조작된 CD45 대립유전자(예를 들어, CD45.1)로 전환되고 나서 이식되면, 유전자-수선된 세포는 더 이상 고갈되지 않을 것이다. 이는 면역학적 균형이 회복될 때까지 병원성 세포의 고갈과 기능적으로 수선된 세포의 보충을 동시에 가능하게 한다. 이 시점에서 병원성 숙주 세포의 선택적 제거는 중단될 수 있다. 본 발명자들은 CD45 고갈이 실제로 Foxp3-결핍 마우스의 생존을 연장시킴을 보여주었다.
더욱이, Foxp3-유전자 교정된 세포는 Foxp3 단백질을 다시 발현할 뿐만 아니라 인 비트로 및 인 비보에서 높은 친화도의 인터루킨-2(IL-2) 수용체인 CD25를 상향조절한다(도 20, 21, 22, 26). 생리적으로, Foxp3는 야생형 T 세포에서 CD25 발현을 양성으로 조절하고, IL-2/CD25/Stat5 축은 면역조절 T 세포의 생존에 필요하다. 그러므로, 본 발명자들은 유전자-교정된 Foxp3-재발현 T 세포가 IL-2의 치료적 투여에 의해 인 비보에서 확장될 수 있다고 가정하였다(도 23). T 세포가 IL-2/항-IL-2mAb 복합체, 저용량의 IL-2 요법, (조작된) IL-2 변이체, 다른 Treg 확장 프로토콜을 이용하여 인 비보에서 확장될 수 있음이 잘 확립되어 있다. 도 27은 수선된 T 세포가 IL-2/항-IL-2mAb 복합체를 이용하여 인 비보에서 확장될 수 있음을 보여준다.
특정 구체예에서, 질환-관련 유전자 결함은 CTLA-4 유전자에 포함된 돌연변이이고, 질환은 CTLA-4 돌연변이와 연관된 인간 면역 조절장애 신드롬이다(Schubert et al., Science Translational Medicine 5, 215ra174-215ra174 (2013); Kuehn et al., Science (New York, N.Y.) 345, 1623-1627 (2014)).
본 발명의 제2 양태는
a. 항체 또는 항체-유사 분자를 포함하거나 이로 구성된 화합물; 및
b. 항체-유사 분자를 보유한 면역 효과기 세포 또는 키메릭 항원 수용체를 보유한 면역 효과기 세포로부터 선택되고, 질병(medical condition) 치료에 사용하기 위한 약제를 제공한다. 약제는 표면 단백질의 제1 또는 제2 이소폼 중 어느 하나에 특이적으로 반응하고, 표면 단백질의 제1 이소폼은 표면 단백질의 제2 이소폼과 기능적으로 구별할 수 없지만 면역학적으로 구별할 수 있다. 약제는 약제가 반응하는 이소폼을 보유한 세포를 제거하기 위해 투여된다.
특정 구체예에서, 질병(medical condition)은 조혈성 장애이다.
특정 구체예에서, 질병(medical condition)은 악성 조혈성 질환이다.
특정 구체예에서, 질병(medical condition)은 항-CD19 CAR T-세포(= CAR19 세포)로 치료할 수 있는 악성 조혈성 질환이다.
특정 구체예에서, 질병(medical condition)은 비-악성 조혈성 질환이다.
특정 구체예에서, 질병(medical condition)은 자가면역질환이다.
특정 구체예에서, 질병(medical condition)은 이식편-대-숙주 질환(GvHD)이다.
본 명세서에서, 이식편-대-숙주 질환은 유전적으로 상이한 사람으로부터 이식된 조직을 받은 후 발생하는 의학적 합병증에 관한 것이다. 기증된 조직(이식편)에서 면역 세포는 수혜자(숙주)를 외부인으로 인식한다.
특정 구체예에서, 질병(medical condition)은 조혈 줄기세포 이식에 의해 유발된 이식편-대-숙주 질환이다.
특정 구체예에서, 질병(medical condition)은 입양 전달에 의해 유발된 이식편-대-숙주 질환이다. 본 명세서에서, 입양 전달 또는 입양 세포 치료는 인간 세포, 통상 면역 세포의 환자로의 이식에 관한 것이다. 세포는 자가 또는 동종일 수 있다. 유전자 편집 기술에 의해 수행된 표적화 된 변형은 이식된 세포 산물을 특화하여 유전적 결함을 수선하고, 이식된 세포의 효율을 향상시키거나 안내 분자 또는 안전 스위치와 같은 부가적인 바람직한 특징들을 세포에 장착할 수 있다.
특정 구체예에서, 질병(medical condition)은 장기 이식에 의해 유발된 이식편-대-숙주 질환이다.
특정 구체예에서, 항체 또는 항체-유사 분자는 독소와 결합하여 면역독소를 형성한다. 특정 구체예에서, 항체 또는 항체-유사 분자는 사포린과 결합한다.
특정 구체예에서, 약제는 이중특이적인 항체 또는 이중특이적인 항체-유사 분자이다. 다른 말로, 약제는 2개의 상이한 유형의 항원과 동시에 결합할 수 있는 항체 또는 항체-유사 분자이다.
특정 구체예에서, 약제는 이중특이적인 항체 또는 이중특이적인 항체-유사 분자를 보유한 면역 효과기 세포이다.
특정 구체예에서, 약제는
a. 제1 표면 단백질의 제1 또는 제2 이소폼 중 어느 하나에 특이적으로 반응하고, 상기 제1 표면 단백질의 상기 제1 및 상기 제2 이소폼은 기능적으로 구별할 수 없지만 면역학적으로 구별할 수 있는 제1 항체 또는 항체-유사 분자; 및
b. 제2 표면 단백질의 제1 또는 제2 이소폼 중 어느 하나에 특이적으로 반응하고, 상기 제2 표면 단백질의 상기 제1 및 상기 제2 이소폼은 기능적으로 구별할 수 없지만 면역학적으로 구별할 수 있는 제2 항체 또는 항체-유사 분자를 보유한 면역 효과기 세포이다.
특정 구체예에서, 제1 표면 단백질은 CD19이다.
특정 구체예에서, 제2 표면 단백질은 CD45 또는 CD34이다.
특정 구체예에서, 제1 표면 단백질은 CD19이고, 제2 표면 단백질은 CD45이다.
특정 구체예에서, 약제는 악성 조혈성 질환의 치료 방법에 사용하기 위한 항체 또는 항체-유사 분자를 보유한 면역 효과기 세포, 또는 키메릭 항원 수용체를 보유한 면역 효과기 세포, 특히 T 세포이다.
특정 구체예에서, 약제는 조혈성 질환, 특히 악성 조혈성 질환의 치료 방법에 사용하기 위한 CD45에 대한 키메릭 항원 수용체를 보유한 T 세포이다.
CD45는 악성 세포를 포함한 모든 조혈 세포에서 발현되므로 조혈성 질환의 치료를 위한 특히 좋은 표적이다. CD45는 세포 생존에 결정적이므로 세포는 내성을 키우기가 더 어려울 것이다.
본 발명의 다른 양태는
a. 제1 표면 단백질에 반응하고, 본 발명의 제2 양태에 따른 제1 약제; 및
b. 제2 표면 단백질에 반응하고, 본 발명의 제2 양태에 따른 제2 약제를 포함하는 병용 의약품(combination medicament)을 제공한다.
특정 구체예에서, 병용 의약품은 조혈성 질환의 치료를 위해 제공된다.
특정 구체예에서, 병용 의약품은 악성 조혈성 질환의 치료를 위해 제공된다.
특정 구체예에서, 병용 의약품은 비-악성 조혈성 질환의 치료를 위해 제공된다.
특정 구체예에서, 제1 및 제2 약제는 키메릭 항원 수용체를 보유한 T 세포이다.
특정 구체예에서, 제1 표면 단백질은 CD19이고, 제2 표면 단백질은 CD45이다.
특정 구체예에서, 제1 약제는 항-CD19 CAR T-세포이고, 제2 약제는 항-CD45 CAR T-세포이다.
특정 구체예에서, 악성 조혈성 질환은 항-CD19 CAR T-세포(= CAR19 세포) 단독 치료에 굴절된다.
본 발명의 다른 양태는 표면 단백질의 제1 이소폼을 발현하는 세포의 인 비보 추적 방법을 제공하며, 상기 표면 단백질의 상기 제1 이소폼은 상기 표면 단백질의 제2 이소폼과 기능적으로 구별할 수 없지만 면역학적으로 구별할 수 있고, 상기 방법은 상기 제1 이소폼에 특이적으로 반응하는 리간드를 상기 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 이 양태는 또한 환자에서 유래한 조직에서 표면 단백질의 제1 이소폼을 발현하는 세포의 추적 방법을 제공하며, 상기 표면 단백질의 상기 제1 이소폼은 상기 표면 단백질의 제2 이소폼과 기능적으로 구별할 수 없지만, 면역학적으로 구별할 수 있고, 상기 방법은 상기 제1 이소폼에 특이적으로 반응하는 리간드를 상기 환자에서 유래한 상기 조직에 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 이 양태의 특정 구체예에서, 환자에서 유래한 조직은 혈액 샘플에 관한 것이다. 그러한 혈액 샘플은 FACS를 이용하여 분석될 수 있다. 본 발명의 이 양태의 특정 구체예에서, 환자에서 유래한 조직은 기관의 조직 샘플, 예를 들어, 생검, 예를 들어, 간 샘플에 관한 것이다. 그러한 조직 샘플은 조직학적 방법들을 이용하여 분석될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 인 비보에서 세포를 선택적으로 고갈 또는 농화(enriching)하는 방법을 제공하며, 상기 방법은,
a. 세포를 제공하는 단계로, 상기 세포는 아미노산 마커가 표면 단백질의 제2 이소폼과는 상이한 상기 표면 단백질의 제1 이소폼을 발현하고, 상기 제1 이소폼은 핵산 서열 A에 의해 암호화되는 아미노산 마커 A를 포함하며, 상기 제2 이소폼은 핵산 서열 B에 의해 암호화되는 아미노산 마커 B를 포함하며;
b. 상기 세포의 게놈 DNA에서 상기 핵산 서열 A에서 상기 핵산 서열 B까지 돌연변이를 유도하는 단계;
c. 상기 표면 단백질의 상기 제1 또는 상기 제2 이소폼의 발현에 기초하여 상기 세포를 선택적으로 농화/고갈시키는 단계를 포함한다.
본 명세서에서, 용어 "세포의 선택적 고갈"은 특정 마커/대립유전자/이소폼을 발현하는 세포의 전체 수 또는 농도를 선택적으로 감소시키는 것에 관한 것이다.
당업자는 정의된 부피가 제1 이소폼을 발현하는 세포 및 제2 이소폼을 발현하는 세포를 포함하는 경우, 제1 이소폼을 발현하는 세포의 선택적 고갈은 제2 이소폼을 발현하는 세포의 농화에 해당함을 알고 있다.
비-제한적 예시로서, 선택적 고갈은 보체-의존성 세포독성(complement-dependent cytotoxicity, CDC), 항체-의존성 세포성 세포독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC), 항체-약물 컨쥬게이트(antibody-drug conjugate, ADC)에 의해 또는 세포, 특히 천연 항원 수용체 또는 키메릭 항원 수용체(CAR)를 탑재한 면역 수용체 세포의 반응에 의해 달성될 수 있다. 선택적 고갈은 또한 약물 또는 독소와 같은 효과기 화합물과 결합하지 않는 항체 또는 항체-유사 분자의 투여에 의해 수행될 수 있다.
본 발명자들은 인 비보에서의 선택적 고갈은 CD45.2 또는 CD45.1에 대한 각각의 항체들을 이용하여 가능함을 입증하였다(도 12). 두 세포 집단(예를 들어, CD45.2+ 및 CD45.1+ T 세포)에 의해 공유되는 에피토프에 대한 항체를 이용함으로써 두 세포 집단의 비-선택적 고갈(예를 들어, 항-CD4-고갈)이 초래된다. 대조적으로, 공통으로 발현되는 표면 단백질(예를 들어, CD45)의 하나의 대립유전자(예를 들어, CD45.2)에는 선택적으로 결합하나, 다른 대립유전자(예를 들어, CD45.1)에는 그렇지 않은 항체로 고갈시키면, 특이 mAb에 의해 결합된 대립유전자를 발현하는 세포만 고갈된다. 도시된 실시예에서, CD45.2+ 세포를 고갈시키는 것은 CD45.1+ 세포를 예비하므로 CD45.1+ 세포의 상대적 농화를 초래한다. 독소가 mAb에 결합하면 고갈은 더 효율적일 수 있다.
독소에 결합하지 않는 항체 또는 항체-유사 분자를 이용하는 이점은 독소와 결합하지 않는 항체 또는 항체-유사 분자를 이용한 치료가 HSC를 예비하는 동안 면역독소를 이용한 치료는 HSC 고갈로 이어질 수 있다는 것이다. 이는 조혈 시스템이 부분적으로 유지되기 때문에 바람직할 수 있다.
EP16196860.7, EP16196858.1, PCT/EP2017/059799에서 도시된 바와 같이, 본 발명자들은 단일 아미노산 차이가 세포 내로 조작될 수 있고, 2개의 이소폼/대립유전자에 특이적으로 결합하는 2개의 상이한 리간드(천연 대 조작된)에 의해 식별될 수 있음을 입증하였다. 특이적으로 설계된 인위적인 돌연변이 또는 드물지만 단일 염기 다형성(SNP)과 같이 자연적으로 발생하는 돌연변이는 내인성 표면 발현된 유전자로 조작되어 이의 항원성을 변화시킨다. 당업자는 이 돌연변이가 HDR 및 유전자가위를 포함하여 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 도입될 수 있음을 알고 있다. 이 변경된 에피토프는 이후에 이 인공 에피토프를 특이적으로 및 선택적으로 인식하는 리간드를 사용하여 성공적으로 편집된 세포를 선택적으로 고갈시키는데 이용된다. 또는, 편집된 세포는 천연 에피토프를 인식하지만(따라서, 숙주 세포를 고갈시킬 수 있음) 변경된 에피토프를 인식하지 못하는 리간드에 의해 고갈에 내성을 나타내므로 이식된 세포를 예비한다.
"편집/조작된 세포"(세포 표면 단백질의 제1 이소폼이 제2 이소폼으로 변화된 세포)가 차후에 이식, 특히 입양 전달에 사용되는 경우, 2개의 상이한 이소폼은 이식된 세포 및 숙주 세포를 식별하는데 사용될 수 있다. 이렇게 하면 그들은 영구적으로 표시되므로 이식된 세포를 추적할 수 있다. 추적은 인 비보 또는 엑스 비보 중 어느 하나에서 표지된 리간드로 세포 또는 조직에서 예를 들어, 플로우 사이토메트리 또는 조직화학법에 의해 달성될 수 있다. 이식된 세포 또는 숙주 세포 중 어느 하나에 대해 특이적인 리간드의 인 비보에서의 적용은 이식된 조작된 세포 또는 숙주 세포에만 각각 결합하는 항체를 이용하여 이식된 세포 또는 숙주 세포 중 어느 하나를 선택적으로 고갈시키는 것이 가능하다. 선택적 세포 고갈은 또한 이식된 세포 또는 숙주 세포 중 어느 하나를 인식하는 천연 또는 키메릭 항원 수용체(CAR)를 탑재한 세포에 의해 달성될 수 있다.
조작된 세포의 선택적 고갈은 "안전 또는 살해 스위치"를 제공함으로써 중요한 안전 특징을 구성한다. 안전 스위치 및 자살 유전자의 기본 개념은 Jones et al., Front Pharmacol.; 5:254. doi: 10.3389에 기술되어 있다. 본 발명자들의 접근법은 더 간단하고, 안전하며 더욱 다양하다. 원칙적으로, 입양 전달된 임의의 세포는 인 비트로 또는 인 비보 선별, 추적, 안전 및/또는 선택적 제거 스위치와 결합되어 변경된 대립유전자/에피토프를 탑재하도록 조작될 수 있다. 비-베타적인 예로는, 조작된 대립유전자만 탑재하지만 이를 제외하고는 유전자 조작되지 않은 세포 또는 CAR 세포와 같이 추가로 조작된 특징들을 탑재한 세포를 포함한다. 예를 들어, 이식-대-백혈병 효과를 위해 사용되는 이식된 동종 세포는 이식편-대-숙주 질환(GvHD)을 유발할 수 있다. 조작된 대립유전자가 전달 전에 통합되면 GvHD를 감소/치료하기 위해 그들은 조작된 대립유전자에 의해 제거될 수 있다(도 2). 유사하게, 만약 원치 않는 부작용이 표적이탈(off-target) 효과 또는 너무 강한 표적내(on-target) 효과로 인해 일어나면 이식된 자가 종양 침윤 림프구(TILs) 또는 병원균-특이 림프구가 변경된 대립유전자를 탑재하도록 조작하여 그들을 제거할 수 있다(도 2). CARs은 mAb에서 유래되어 공지된 mAb의 특이성을 세포, 예를 들어, 살해 T 세포의 특징과 결합시킬 수 있다. CAR을 도입하여 특이 표적 항원에 주어진 (T) 세포의 살해(또는 억제) 활성을 재유도하는 원리는 원칙적으로 악성종양 외에도 자가면역 질환, 이식 또는 다른 조혈성 질환을 포함하여 다양한 질환에 적용할 수 있다. CAR19 T 세포의 성공은 치료제로서 CAR 세포의 잠재력을 입증한다. 그러나 중요한 것은, CAR19 T 세포는 일부 CD19+ 종양을 치료하는데 매우 효과적이지만, 다양한 상이한 표적 분자에 반응하는 몇몇 CAR T 세포는 때때로 사이토카인 방출 신드롬 및/또는 신경독성과 같은 치명적인 부작용을 가질 수 있다(CD19 외에도 CD123를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다른 표적들을 표적으로 하는 몇몇 CAR 구조물에서 입증됨). 따라서, 이식 후 CAR T 세포를 제어/제거하는 능력이 중요하다(도 2, 10, 19). CAR 세포의 경우 변경된 대립유전자는 안전 스위치로 제공할 수 있다. 더욱이, 이식된 조작된 세포는 또한 그들이 악성이 되거나 임의의 형태의 원치않는 강한 표적내 또는 표적이탈 손상을 유발(아마도 수년 후)하는 경우 제거될 수 있다. 또는, 질환을 유발하는 숙주 세포는 자가이지만 조작된 세포를 예비하는 한편 선택적으로 제거될 수 있다. 본 발명자들의 방법과는 대조적으로, 기존의 기술은 이식된 세포의 제거를 제한하지만 숙주 세포의 제거를 쉽게 허용하지 않는다. 변경된 이소폼은 예를 들어, 숙주 세포의 제거 동안 유전자-수선되거나 그렇지 않으면 조작된 자가 세포의 이식을 가능케 한다. 본 발명의 방법에 의해 도입된 이소폼 스위치 없이, 숙주 세포 제거는 건강한 세포가 이식될 때 멈추게 되도록 하여야한다. 이 경우, 새롭게 이식된 수선된 세포는 확장하는 한편 숙주 세포 또한 확장할 것이며, 더 이상 제거되지 않을 수 있으므로 질환-유발 숙주 세포는 수선된 세포를 능가하게될 위험이 있을 것이다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 고갈에 대해 내성이 있는 조작된 세포를 제공하는 것은 치료적 접근법으로서 매우 관련이 있다. 예시로서, 항-CD19-CAR 세포에 의해 인식된 CD19 에피토프는 자가 조혈 세포에서 돌연변이될 수 있어 항-CD19 mAb 또는 항-CD19-CAR 세포를 고갈시키는 것은 더 이상 조작된 세포와 결합하고 파괴할 수 없지만 CD19는 기능을 가진 채로 남아있을 것이다. 이것은 오늘날의 효과적인 항 CD19-CAR 세포의 주요 합병증을 제거할 것이다. 항-CD19-CAR은 CD19를 발현하는 조혈 악성 종양을 제거하는 매우 높은 성공률을 가지지만, 이들은 CD19를 발현하는 건강한 숙주 세포의 제거를 유사하게 유도한다. 이것은 저감마글로불린혈증을 유발하여 감염 위험이 증가된다. 돌연변이 된 CD19는 항-CD19-CAR 세포에 내성인 B 세포를 유발하는 건강한 자가 조혈 줄기세포(HSCs)로 숙주 면역계를 재구성할 수 있다. 따라서, CAR 19 T 세포는 편집된 내성 세포가 감염으로부터 자연적 보호를 제공하는 한편 지속적으로 재발을 예방할 수 있을 것이다. 그러므로 환자들은 더 이상 IVIG 주입에 의존하지 않을 것이다. HSC 이식은 잠재적으로 비-유전 독성(non-genotoxic) 전처리를 통해, 예를 들어, 항체들을 통해 부분 키메라 성(partial chimerism)으로서 달성될 수 있다(Nat Biotech, 2016). 또는, 보통의 인간 집단(예를 들어, CD45.2와 유사함)에서 발견되는 에피토프를 인식하는 항-CD45-CAR 세포는 악성 또는 그렇지 않으면 질환을 유발하는 조혈 세포를 포함한 모든 조혈 숙주 세포를 제거하는데 사용될 수 있다. CD45는 대부분의 악성 세포를 포함한 모든 조혈 세포에서 발현되기 때문에 좋은 표적이다. 게다가, CD45는 림프구의 생존에 중요하므로, CAR T 세포에 의해 표적화된다면, 세포는 CAR T 세포에 의한 표적화를 피하기 위해 CD45를 하향조절하거나 CD45를 돌연변이시킬 가능성이 적다. 이것은 재발의 위험을 감소시킬 것이다. CD45.2에서 CD45.1로의 스위치 실험에 의해 예시된 바와 같이 건강한 자가 조혈 줄기세포(HSC) 또는 조작된 CD45 에피토프(예를 들어, CD45.1)를 탑재한 다른 조혈 세포의 이식은 항-CD45-CAR 세포에 의해 더 이상 고갈되지 않는 건강한 조혈 시스템을 갖는 숙주를 재구성할 수 있도록 한다. 주요 이점은 모든 CD45를 발현하는 악성 종양(T 세포 및 골수 악성 종양을 포함하지만 이에 제한되지 않음)이 종양 또는 세포 유형-특이적인 항원을 필요로하지 않고 표적화 될 수 있다는 것이다. 즉, 본 발명은 조혈 악성 종양 및 다른 비-악성 조혈성 질환을 치료하는데 보편적으로 적용할 수 있는 시스템을 제공할 것이다. 가장 큰 장점은 모든 CD45를 발현하는 악성 종양일 것이다. 이것은 CAR-T 치료의 주요 장애물을 극복할 것이다: 적당한 표적 항원들을 동정하는 것(Klebanoff, Nat Med 2016). 따라서, CAR-T 요법을 적용할 수 있는 질환 징후를 실질적으로 확장시킬 수 있다. CAR-T 요법이 CD19+ 종양의 치료에 성공적이지만, 다른 조혈 악성 종양은 중요한 과제를 야기한다. 예로서, 다발성 골수종의 치료는 부분적으로 적절한 표적 항원의 부족으로 인해 중요한 과제로 남아 있다(Mikkilineni, Blood, 2017; Sadelain, Nature 2017). 또한, 조혈성 종양은 동종 세포의 필요없이 치료할 수 있으므로 주요 합병증으로서 GvHD를 없앨 수 있다. 더욱이, 재구성은 고갈 단계 동안 시작될 수 있어 회복 시간을 단축시킨다. 중요한 것은 이식된 세포를 고갈시키지 않도록 하기 위해 사용된 돌연변이가 나중에 필요할 때 다시 그 세포를 고갈시키는 데 사용될 수 있다는 것이다. HSC의 CAR 세포 의존성 고갈은 경미한, 즉 유전 독성이 없는 전제 조건을 달성하기 위한 대안 방식으로서 잠재적으로 사용될 수 있다. CAR45 세포는 또한 HSCs를 제거할 것이다. "골수" 또는 HSC 이식을 위해 사용된 현재 사용되는 "적중 및 대체" 전략은 CAR45를 사용하여 달성할 수 있다. 유독성 화학요법 및 방사선조사를 이용하는 대신, CAR45로 환자의 프리컨디셔닝이 달성될 수 있다. CAR45 세포를 사용하여 HSCs 및 조혈 시스템을 제거하고, 대립유전자-조작된 내성의 HSCs로 그것을 대체하는 것의 이점은 원치 않는 세포의 제거 동안 조혈 재구성이 시작될 수 있으므로 위험한 이식후 시간이 제거될 수 있다는 것이다. 그리하여, 환자는 골수 고갈 및 면역 억제의 연장된 단계를 겪기보다는 기능적 면역계를 항상 갖게 될 것이다. 따라서, 본 발명자의 전략은 현재의 HSC 이식의 주요 합병증인 감염을 제거할 수 있다. 표적 세포를 HSC에 특이적으로 제한하기 위해 내인성 HSC를 고갈시키는데 항원 또는 항원 조합에 대한 CAR 세포를 사용할 수 있다. 이것은 HSCs에 대해 CAR 세포를 특이적이고 배타적으로 유도하기 위해 합성 생물학 접근법(예를 들어, AND 게이트와 함께)에서 예를 들어, 항-CD45 또는 항-CD34 및 제2 항원일 수 있다.
조혈 시스템을 대립유전자 조작된 HSCs로 대체한 CAR45 치료는 CAR19 치료의 대안으로 사용될 수 있으며(모든 CD19+ 세포 역시 CD45를 발현하기 때문에), 또는 CAR19 및 CAR45의 병용 요법으로 사용될 수 있다. CAR19 요법 후에 재발성 CD19 음성 또는 CD19 돌연변이된 종양에 CAR45 요법을 사용할 수도 있다.
본 발명의 이 양태는 세포를 대체하기 위한 보편적인 전략을 나타낸다. 세포는 자가 또는 동종의 조혈 세포일 수 있다. 만약 대체 세포가 HSCs이면, 기술된 방법은 임의의 조혈성 악성 종양 또는 다른 조혈성 장애를 치료하는데 사용될 수 있다.
현존하는 "안전 스위치" 접근법과 비교하여 본 발명자들의 접근법의 다른 이점은 다음을 포함한다. 본 발명자들의 접근법은 내인성 단백질을 이용한다. 세포에 도입되는 트랜스진 또는 태그를 가지지 않는다. 2개의 에피토프는 기능적으로 동일하지만 특이적으로 결합하는 리간드에 의해 구별될 수 있다. 접근법은 사용된 리간드에 의존하여 이식된 세포 또는 숙주 세포 둘 다를 고갈시킬 수 있다. 설계된 돌연변이는 게놈에 도입되므로, 안전 특징은 세포 내에 영구적으로 남아 있으며, 바이러스가 도입된 트랜스진 안전 스위치에 발생할 수 있도록 침묵하지는 않을 것이다. 게다가, 조작된 에피토프는 인위적인 큰 안전 스위치/자살 유전자 구조물보다 더 적은 항원성을 가질 것이므로 숙주 세포에 의해 거부될 가능성은 적다. 더욱이, 조작된 이소폼의 사용은 표적화 된 돌연변이에 달렸으므로 보통 바이러스 전달에 의해 게놈에 무작위로 통합되어 삽입성 돌연변이 유발을 유도할 수 있는 다른 안전 스위치/자살 유전자들보다 더 안전할 것이다(Cornu, Nat Med, 2017).
당업자는 제1 이소폼에서 제2 이소폼으로 세포 표면 단백질을 변화하기 위해 HDR 대신에 대안 방법들을 적용할 수 있음을 알고 있다. 비-제한적 예시로서, 이소폼 스위치는 다음의 간행물에서 기술된 바와 같이 유전자가위를 이용하여 수행될 수 있다: Komor et al., Nature 533, 420-424, doi:10.1038/nature17946. 이 접근법은 dsDNA 절단을 요구하지 않고 원하는 아미노산을 편집함으로써 안전성을 더욱 증가시킬 수 있다. 유전자가위 또는 관련된 기술들은 플라스미드 또는 미니서클(dsDNA), mRNA 또는 RNP로서 전달될 수 있다.
세포 표면 단백질의 제1 이소폼의 제2 이소폼으로의 스위칭이 질환-유발 유전자(예를 들어, Foxp3 유전자)의 수선과 조합되는 경우, 제1 이소폼을 발현하는 세포를 고갈시킴으로써 인 비보에서 수선되지 않은 세포를 고갈시키는 것이 가능하다(즉, 숙주로의 전달 후). 본 발명자들은 이소폼 스위치 및 유전자 결함 수선 둘 다 HDR에 의해 수행되는 경우, 성공적으로 수선된 유전자의 가능성은 이소폼 스위치가 발생하 세포에서 증가함을 입증하였다(도 20). 제2 유전자에서 유전자 변형과 제1 유전자에서 이소폼 스위치의 조합은 유전자 조작된 세포가 안전 특징을 포함하도록 한다.
이소폼 스위치는 또한 숙주에서 편집된 이식된 세포를 추적하기 위한 마커로 사용될 수 있다.
다른 양태에 따르면, 편집되지 않은 및 편집된 세포의 조성물에서 세포를 선택적으로 고갈 또는 농화하는 방법이 제공되며, 상기 방법은
a. 세포를 제공하는 단계로, 세포는 아미노산 마커가 표면 단백질의 제2 이소폼과는 상이한 표면 단백질의 제1 이소폼을 발현하고, 제1 이소폼은 핵산 서열 A에 의해 암호화되는 아미노산 마커 A를 포함하며, 제2 이소폼은 핵산 서열 B에 의해 암호화되는 아미노산 마커 B를 포함하며;
b. 상기 세포에 부위 특이적인 유전자 조작에 의해 핵산 서열 A의 핵산 서열 B로의 교환을 유도하여 상기 세포에서 제1 이소폼의 발현을 제2 이소폼의 발현으로 변화시키는 단계;
c. 표면 단백질의 제1 또는 제2 이소폼의 발현에 기초하여 세포를 선택적으로 농화/고갈시키는 단계를 포함한다.
특정 구체예에서, 아미노산의 상기 삽입, 결실 및/또는 치환을 초래하는 유전자 조작은 CRISPR-관련 엔도뉴클레아제(Cas9) 및 가이드 RNA에 의해 유도된 이중가닥 절단 후 상동 재조합에 의해 수행되며, 상기 가이드 RNA는 상기 제1 게놈 위치에 어닐링할 수 있다.
본 명세서에서, "CRISPR-관련 엔도뉴클레아제"는 DNA 가닥의 CRISPR-유사 서열-유도 절단을 촉진하는 당업계에 공지된 Cas9 엔도뉴클레아제를 지칭한다. CRISPR-관련 엔도뉴클레아제의 비-제한적 예시는 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes )의 Cas9 엔도뉴클레아제(SpyCas9), 프란시셀라(Francisella)(FnCpf1), 애시드아미노코커스(Acidaminococcus)(AsCpf1) 및 라크노스피라새 박테리움(Lachnospiraceae bacterium)(LbCpf1)의 Cpf1 엔도뉴클레아제, SpyCas9, FnCpf1, AsCpf1 또는 LbCpf1의 임의의 오쏠로그(orthologue), 또는 SpyCas9, FnCpf1, AsCpf1 또는 LbCpf1의 임의의 조작된 단백질 변이체들 또는 그들의 오쏠로그이다. 당업자는 본 발명이 새롭게 발견 또는 조작된 CRISPR/Cas 변이체들 또한 포함함을 알고 있다.
본 명세서에서, 용어 "오쏠로그(orthologue)"는 단일 조상 유전자로부터 수직적 후손에 의해 진화된 유전자 및 이의 해당 폴리펩타이드를 지칭한다. 다른 말로, 오쏠로그 유전자/폴리펩타이드는 공통의 조상을 공유하고, 한 종이 두 개의 별개의 종으로 나뉠 때 나뉘었다. 그리고 나서, 2개의 생성된 종에서 단일 유전자의 카피는 오쏠로그로 지칭된다. 2개의 유전자가 오쏠로그임을 확인하기 위해, 당업자는 유전자 또는 폴리펩타이드의 정렬된 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열을 비교하여 유전자 계통의 계통발생학적 분석을 수행할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "가이드 RNA"는 목적 게놈 위치로 CRISPR-관련 엔도뉴클레아제를 안내할 수 있는 합성 RNA를 지칭한다(엔도뉴클레아제는 게놈 DNA 내 포스포디에스테르 결합을 절단할 것이다). 당업자는 Cas9 엔도뉴클레아제가 사용된다면, 표현 "가이드 RNA"는 Cas9-결합에 필요한 서열 및 사용자-정의된 "표적 서열" 둘 다를 포함하는 단일 가이드 RNA(sgRNA) 또는 하나는 Cas9-결합에 필요한 서열(tracrRNA) 및 다른 하나는 사용자-정의된 "표적 서열"(crRNA)을 포함하는 2개의 RNA 분자의 조합을 지칭한다. Cpf1 엔도뉴클레아제가 사용된다면, 표현 "가이드 RNA"는 Cpf1-결합에 필요한 서열 및 사용자-정의된 "표적 서열" 둘 다 또는 단일 crRNA 어레이로서 전사된 몇몇 가이드 RNA를 포함하는 단일 RNA 분자를 지칭한다(Zetsche, Nat Biotech, 2016). "표적 서열"은 목적 게놈 위치에 어닐링할 수 있으므로 게놈 표적이 변형되는 것으로 정의하고 보통 대략 20개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
Cas9에 의한 DNA 절단은 표적 DNA 내 짧은 PAM(protospacer adjacent motif)의 존재에 의존하며, 표적 서열의 선택을 제한한다. 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9(SpyCas9)는 PAM 서열 5'-NGG-3'에 해당한다. 특정 구체예에서, DNA 수선 구조물은 돌연변이 된 PAM 서열을 포함한다. 돌연변이는 PAM 서열의 기능을 없게 만들지만 단백질 발현, 안정성 또는 기능에 영향을 주지는 않는다. 돌연변이 된 PAM 서열을 포함하는 DNA 수선 구조물의 사용은 HDR 효율을 향상시킨다.
당업자는 CRISPR 시스템 외에, 부위 특이적인 DNA 편집을 위한 대안의 수단들, 이름하여 징크 핑커 엔도뉴클레아제, transcription activator-like effector nucleases(TALEN), 메가뉴클레아제 또는 아르고노트-기반 시스템(argonaute-based system)(Nat Biotechnol. 2016 Jul;34(7):768-73) 또는 유전자가위(Komor et al., Nature 533, 420-424, doi:10.1038/nature17946)가 존재함을 알고 있다. 본 발명은 또한 부위 특이적인 DNA 편집을 위한 대안의 수단들의 사용을 포함한다.
특정 구체예에서, 일차 DNA 수선 구조물은 PAM 서열을 포함하지 않으므로, 상기 방법의 제1단계(게놈 DNA에 가닥 절단을 도입하는 것)에서 사용된 CRISPR 시스템을 위한 기질이 아니다. 이로써, 삽입된 서열은 이차 엔도뉴클레아제 사건에 의한 삽입 후 더 이상 절단될 수 없다.
특정 구체예에서, 아미노산의 상기 삽입, 결실 및/또는 치환을 초래하는 유전자 조작은 특히 아미노산 마커 A를 암호화하는 핵산 서열 A를 아미노산 마커 B를 암호화하는 핵산 서열 B로 변화시킬 수 있는 유전자가위 및 아미노산 마커 A를 암호화하는 핵산 서열 A에 상기 유전자가위를 안내할 수 있는 가이드 RNA로 상기 세포를 형질주입/전기천공하는 것을 제공하여 수행된다(Komor et al., Nature 533, 420-424, doi:10.1038/nature17946 및/또는 Gaudelli, Nature 2017에 기술된 바와 같이). 쥐의 CD45.1를 CD45.2로 변화시킬 수 있는 유전자가위의 설계는 실시예 섹션에서 설명하고 있다(도 9). 이것은 입증된 HDR 접근법에 대한 대안으로서 대립유전자 조작을 위한 유전자가위를 사용할 가능성을 예시한다. 그러나 게놈 내의 어느 뉴클레오타이드가 염기 편집을 쉽게 받아들일 수 있는지에 대한 한계로 인해, 본 발명자들은 CD90.2를 CD90.1로 또는 CD90.1을 CD90.2로 전환하는 유전자가위를 설계할 수 없었다. 게다가, NGG PAM을 기반으로 하는 원래의 유전자가위 설계를 기초로 하여(Komor et al., Nature 2016에 기술된 바와 같이), CD45.1을 CD45.2로 또는 CD45.2를 CD45.1로 전환하기 위한 유전자가위를 설계할 수 없었다. 대조적으로, 변경된 PAM 부위 특이성을 인식하는 조작된 Cas9 변이체의 생성은 유전자가위에 의해 표적화 될 수 있는 뉴클레오타이드의 수를 확장하였다(Kim, Nat Biotech 2017). 본 발명자들은 A로 돌연변이 될 때 CD45.2 대립유전자를 초래하는 CD45.1 서열 내에 존재하는 G의 근방에서 스타필로코커스 아루레우스(Staphylococcus aureus(SaKKH-BE3))에 대한 PAM 부위를 동정하였다. 그들은 SaKKH-BE3가 편집창에서 다른 위치보다 위치 5의 G를 가장 효과적으로 편집하기 때문에 편집창에서 위치 5의 G가 A로 전환하는 sgRNA를 설계하였다. 다음으로, 본 발명자들은 CD45.2를 CD45.1로 전환하는 가이드 RNA/유전자가위 쌍을 설계하였다(도 9b). 새롭게 조작된 A/T 아데닌 유전자가위(ABE)는 G/C를 전환할 수 있다. 이 새로운 ABE를 가지고, CD45.2 대립유전자에서 필수적인 A를 CD45.1 대립유전자에서 G로 전환하는 것이 원칙적으로 가능하다. 그러나 현재 이용할 수 있는 ABE는 원하는 돌연변이 부근에서 NGG PAM을 필요로 하나 ABE를 정확하게 위치시키는 그러한 PAM은 없다. 그러므로 본 발명자들은 시티딘 디아미나아제(cytidine deaminase) 유전자가위에 적용할 수 있는 규칙에 기초한 가상의 ABE를 설계하였다. 공지의 시티딘 디아미나아제 유전자가위 및 새로운 ABE는 유사한 편집창에서 편집하므로, 이 전략이 효과가 있을 것으로 가정하는 것이 합리적이다. 본 발명자들은 하나는 가상의 Cas9 SaKKH-ABE 융합에 기초하고, 하나는 가상의 Cas9 VQR-ABE 융합에 기초한 2가지 옵션을 확인하였다(도 9b). 그것은 또한 플랭킹 As가 에피토프를 변화시킬 수 있도록 전환된다는 것을 배제할 수 없다. 그리하여, 유전자가위로 CD45.2를 CD45.1로 전환하는 것은 좁은 편집창을 갖는 매우 특이적인 유전자가위를 요구할 것이다. 최근에 보고된 유전자가위는 1-2개의 뉴클레오타이드의 편집창을 가지므로 적당하다(Kim, Nat Biotech, 2017). 종합적으로, 이들 실시예는 대립유전자 편집을 위해 염기를 전환하는 원리는 플랫폼 독립적이며, HDR-매개 접근법 또는 염기 편집과 같은 대안들에 의해 달성될 수 있음을 예시한다. 원하는 돌연변이의 세포 유형 및 게놈 문맥에 따라 하나 또는 다른 것이 선택될 수 있다.
본 명세서에서, "DNA 수선 구조물"은 HDR에 의해 게놈 DNA 내에서 DNA 가닥 손상, 특히 이중 가닥 절단(DSB)을 수선하기 위한 주형으로 사용되는 DNA 구조물을 지칭한다. DNA 수선 구조물은 호몰로지 암(homology arm) 및 목적 서열의 트랜스제닉 서열을 포함한다. 호몰로지 암은 DSB의 게놈 DNA 서열 5' 및 3'에 상동이다. 목적 트랜스제닉 서열은 호몰로지 암 사이에 위치한다. 게놈 DNA가 HDR에 의해 수선되는 동안, 목적 트랜스제닉 서열은 게놈 DNA에 삽입된다. 당업자는 DNA 수선 구조물이 선형(단일 가닥 또는 이중 가닥) 또는 원형(예를 들어, 플라스미드, 미니서클 플라스미드)일 수 있음을 알고 있다.
당업자는 "가이드 RNA는 목적 게놈 위치에 어닐링할 수 있다"라는 표현이 가이드 RNA의 일부(사용자-정의된 "표적 서열")가 매우 엄격한 조건하에서 목적 게놈 위치에 어닐링할 수 있다는 사실을 지칭함을 알고 있다. 가이드 RNA는 목적 게놈 위치에 어닐링할 수 없는 다른 일부를 포함한다. 목적 게놈 위치에 (부분적으로) 어닐닝함으로써, 가이드 RNA는 CRISPR-관련 엔도뉴클레아제를 목적 게놈 위치로 안내하여 목적 게놈 위치에서 DSB를 수행한다.
특정 구체예에서, HDR 향상 시약, 특히 바닐린(vanillin) 또는 루카파립(rucaparib)이 유전자 편집 프로토콜 동안 사용된다. 본 명세서에서, 바닐린은 4-하이드록시-3-메톡시벤즈알데히드(4-Hydroxy-3-methoxybenzaldehyde), CAS No. 121-33-5를 지칭한다. 본 명세서에서 루카파립은 8-플루오로-2-{4-[(메틸아미노)메틸]페닐}-1,3,4,5-테트라하이드로-6H-아제피노[5,4,3-cd]인돌-6-온(8-Fluoro-2-{4-[(methylamino)methyl]phenyl}-1,3,4,5-tetrahydro-6H-azepino[5,4,3-cd]indol-6-one), CAS No. 283173-50-2를 지칭한다.
하나의 개별적인 특징들에 대한 대안이 여기에서 "구체예"로서 제시되는 경우, 그러한 대안은 여기에 개시된 본 발명의 개별적인 구체예를 형성하도록 자유롭게 조합될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
출원 EP16196860.7, EP16196858.1, PCT/EP2017/059799 및 EP17197820.8은 참조로 여기에 포함된다.
본 발명은 하기 실시예 및 도면에 의해 추가로 예시되며, 추가 실시예 및 이점들이 얻어질 수 있다. 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 이의 범위를 제한하는 것은 아니다.
도 1은 세포 표면 단백질의 면역학적으로 식별 가능한 변이체들의 조작 원리를 예시한다. 이소폼 A 및 B는 같은 기능을 수행할 수 있다(기능적으로 비교할 수 있다). 이 예시에서, 이소폼 A는 변이체 이소폼 B로 조작되는 자연적으로 발생하는 표면 단백질을 나타낸다.
도 2는 면역학적으로 식별 가능한 세포 표면 변이체들이 어떻게 인간 세포 치료의 안전성을 증가시키는지를 예시한다.
도 3은 단클론 항체(mAb)에 의해 구별될 수 있는 표면 단백질의 2개의 이소폼을 나타낸다. 서열: 상단 열: SEQ ID NO: 020, 하단 열: SEQ ID NO: 021.
도 4는 개념 증명 실험을 나타낸다: 프라이머리 세포에서 CD90.2(대립유전자 A)의 CD90.1(대립유전자 B)로의 전환. 좌측의 플로우 사이토메트리 패널은 CD90.2+ 프라이머리 T 세포의 순수 개시 집단을 나타낸다. 그리고 나서, 세포는 인 비트로에서 CD90.2를 CD90.1로 전환하기 위해 조작된다. 편집 후 4개의 다른 집단들이 식별될 수 있다: CD90.2+ 동형접합 세포(편집되지 않은 개시 집단, 상단 좌측), CD90.1+/CD90.2+ 이형접합 세포(상단 우측), CD90.1+ 동형접합 세포(하단 우측) 및 CD90을 상실한 세포(하단 좌측). 우측 아래 사각형에 있는 대립유전자 조작된 세포는 개시/원래의 내인성 대립유전자(CD90.2)를 더는 발현하지 않는다. CD90.1+CD90.2-세포의 순수 집단은 환자에게 이식하기 전에 인 비트로에서 올바르게 편집된 세포를 분리하는데 이용될 수 있다.
도 5는 개념 증명 실험을 나타낸다: 프라이머리 세포에서 CD45.2(대립유전자 A)의 CD45.1(대립유전자 B)로의 전환. 서열: 상단 열: SEQ ID NO 022, 하단 열: SEQ ID NO 023. CD90.2의 CD90.1로의 대립유전자 전환에서 도시된 바와 같이(도 4), 우측 아래 사각형에 있는 대립유전자 조작된 세포는 개시/원래의 내인성 대립유전자(CD45.2)를 더는 발현하지 않는다. 이것은 환자에게 이식하기 전에 올바르게 편집된 세포의 순수 집단을 분리하는데 이용될 수 있다.
도 6은 Cas9 리보뉴클레오프로테인 파티클(RNPs)을 이용한 EL4 세포에서의 유전자 편집을 나타낸다. 전기천공 조건을 제외하고(방법 섹션에서 설명됨), EL4 세포는 플라스미드 기반 접근법과 같은 방식으로 crRNA:tracrRNA/Cas9 복합체 및 +/- HDR 2kb 주형으로 형질주입되었다. 이것은 대립유전자 편집이 즉, 플랫폼 독립적인 다른 접근법, 예를 들어, 플라스미드-기반 또는 RNPs에 의해 달성될 수 있음을 입증한다.
도 7은 Cas9 리보뉴클레오프로테인 파티클(RNPs)를 이용한 프라이머리 마우스 T 세포에서의 유전자 편집을 나타낸다. 프라이머리 마우스 T 세포는 플라스미드 기반 접근법과 동일한 방식으로 crRNA:tracrRNA/Cas9 복합체 및 +/- HDR 2kb 주형으로 형질주입되었다. 도 6에서와 같이, 이것은 대립유전자 A를 대립유전자 B로 전환시키기 위한 대립유전자 편집이 플랫폼 독립적임을 입증한다.
도 8은 대립유전자 조작된 세포의 고도의 순수한 엑스 비보 선별을 나타낸다: CD45.2 세포를 CD45.1 세포로 조작한 후, 4개의 집단이 생긴다(도 4와 비교할 수 있음). 그리고 나서, 4개 모든 집단을 매우 높은 순도로 정제하는데 플로우 사이토메트리가 이용되었다. 우측 패널은 4개의 집단 각각에 대한 정렬 후 순도를 표시한다. 올바른 유전자 편집은 생거 DNA 시퀀싱에 의해 검증되었다(미도시됨).
도 9는 CD45.1의 CD45.2로의 전환(A) 및 CD45.2의 CD45.1로의 전환(B)을 위한 유전자가위의 설계를 나타낸다. 서열(A): 상단 열: SEQ ID NO 024, 하단 열: SEQ ID NO: 025(B): 상단 열(옵션 1 및 2): SEQ ID NO: 026, 하단 열(옵션 1 및 2): SEQ ID NO: 027. A) 가이드 RNA는 NNNRRT PAM 제한 SaKKH-BE3 유전자가위와 함께 사용되도록 설계되었다. 선택된 PAM 서열은 검은 점선으로 강조된다(ATTTGT). 가이드 RNA는 회색선으로 강조되며, 가이드 RNA 뉴클레오타이드 4-7의 염기 편집창이 강조된다. 위치 5의 G는 이 유전자가위에 의해 A로 전환될 것이다. 그리하여, CD45.1 대립유전자는 CD45.2 대립유전자로 전환될 것이다. B) 조작된 아데닌 유전자가위는 A를 G로 전환할 수 있다. CD45.2를 CD45.1로 전환하기 위해, 2가지 옵션이 확인되었다: 옵션 1: sgRNA(회색선)는 Cas9 SaKKH(PAM은 검은 점선으로 강조함)과 함께 사용되도록 설계되었다. 이것은 염기 편집창의 위치 5의 A는 G로 전환할 것이다. 옵션 2: sgRNA(회색선)는 Cas9 VQR과 함께 사용된다. PAM은 검은 대시선으로 강조하였다. 이것은 염기 편집창의 위치 6의 A를 G로 전환할 수 있다. 옵션 1 및 2는 CD45.2 대립유전자를 CD45.1 대립유전자로 전환할 것이다.
도 10은 이식된 세포의 선택적 제거의 원인이 되는 개념을 나타낸다. 세포를 환자에서 채취한 다음 하나의 대립유전자를 다른 것으로 전환하기 위해 (엑스 비보) 편집한다. 선택적 고갈에 필요한 에피토프를 탑재한 세포의 순수 집단을 주입하기 위해 성공적으로 편집된 세포를 선별한다. 그러므로 대립유전자 조작에 만약 필요하다면 이식된 세포를 제거하기 위한 옵션을 추가하였다.
도 11은 인 비보에서 이식된 세포 또는 숙주 세포의 선택적 고갈을 위한 적용을 나타낸다.
도 12는 인 비보에서 선택적 제거를 위한 개념 증명 실험을 나타낸다. 인 비보 제거를 위한 모델:
1) 정제된 CD45.2+ 및 CD45.1+ T 세포의 1:1 믹스로 모든 T 세포가 결핍된 면역결핍 마우스의 재구성(컨제닉 세포(congenic cells), 편집되지 않은 세포).
2) 항체-매개 고갈(선택적 (항-CD45.2)와 비교하여 비-선택적 (항-CD4)). 독소가 없거나 독소(사포린)가 결합된 항-CD45.2.
3) 1주 후 분석.
도 13은 인 비보에서 CD45.2+ 세포의 선택적 고갈을 나타낸다: 혈액에서 T 세포의 정량화.
도 14는 인 비보에서 CD45.2+ 세포의 선택적 고갈을 나타낸다: 림프 기관에서 T 세포의 상대적인 수의 정량화. 도 12와 동일한 설정이지만 림프절(LN) 및 장간막 림프절(mesLN)의 분석.
도 15는 인 비보에서 CD45.2+ 세포의 선택적 고갈을 나타낸다: 림프 기관에서 T 세포의 상대적인 수의 정량화. 도 12와 동일한 설정이지만 비장(SP)의 분석.
도 16은 인 비보에서 CD45.2+ 세포의 선택적 고갈을 나타낸다: 림프 기관에서 T 세포의 절대 수의 정량화. 도 12와 동일한 설정이지만 림프절(LN) 및 장간막 림프절(mesLN)의 분석.
도 17은 인 비보에서 CD45.2+ 세포의 선택적 고갈을 나타낸다: 림프 기관에서 T 세포의 절대 수의 정량화. 도 12와 동일한 설정이지만 비장(SP)의 분석.
도 18은 대립유전자 편집된 세포의 인 비보에서의 선택적 제거를 위한 두 번째 개념 증명 실험을 나타낸다. 실험 설정: 1) CD45.1를 조작하기 위한 CD45.2 T 세포의 엑스 비보 전기천공, 2) T 세포 결핍 마우스(Rag KO)로의 입양 전달; (전달 전 순도 선별 없음), 3) 대립유전자 편집을 입증하기 위한 몇 주 후 품질 관리, 4) 편집된 세포에서만 남아있는 CD45.2 세포의 항체-매개 고갈. 결론: 대립유전자 조작된 CD45.1+ 세포를 예비하는 한편 CD45.2+ 숙주 및 편집되지 않은 세포의 인 비보에서의 고갈을 입증하는 PoC.
도 19는 본 발명의 적용을 나타낸다: 대립유전자 조작은 예를 들어, CAR-T 세포 치료를 위한 안전성을 증가시킨다. 조작된 세포는 표면 단백질(예를 들어, CD45)의 제1 이소폼 및 목적하는 표적에 반응하는 키메릭 항원 수용체, 예를 들어, CD19(CAR-19)를 발현한다. CAR19가 T 세포에 조작(유전자도입)되는 동안 제2 CD45 대립유전자는 조작되지 않은 숙주 세포와 이식된 CAR T 세포를 식별할 수 있는 제1 CD45 대립유전자로 전환된다. 치료와 연관된 독성의 경우, 병원성 CAR-T 세포는 CAR-T 연관된 독성을 중단하기 위해 선택적으로 제거될 수 있다.
도 20은 이소폼-전환된(isoform-switched) 대리 표면 마커상에서 게이팅할 때 유전자-수선된 세포의 상대 빈도의 농화뿐만 아니라, 스컬피(scurfy) 세포 및 인간 Foxp3K276X 돌연변이를 보유한 세포의 유전자 교정을 나타낸다.
A) 야생형 foxp3(C57BL/6)의 게놈 DNA 서열(SEQ ID NO: 028), 조기 종결 코돈을 도입한 표적 돌연변이 Foxp3K276X(SEQ ID NO: 029)를 갖는 Foxp3 유전자좌 및 프레임-쉬프트(SEQ ID NO: 030)를 유도하는 자발적인 2bp 삽입을 포함한 스컬피 마우스(B6.Cg-Foxp3sf/J)의 Foxp3 유전자좌의 정렬. sgRNA 결합 부위(녹색선) 및 PAM 서열(검은선). B) Foxp3K276X C57BL/6 마우스 유래의 총 CD4+ T 세포의 유전자 편집을 위한 프로토콜. Foxp3K276X 돌연변이를 표적으로 하는 sgRNA를 암호화하는 플라스미드 및 1kb 야생형(wt) Foxp3 수선 주형을 포함하는 원형 플라스미드의 인 비트로 활성화 및 전기천공(제1단계). 성공적으로 이식된 세포는 GFP 발현에 기초하여 분리된다(제2단계). rhIL-2, TGF-β 단독 또는 레티노산(RA) 및 사이토카인 중화 항체(7일 동안 항-IL-4 및 항-IFNγ)의 조합하에서 유전자 편집을 위한 인 비트로에서 세포 확장(제3단계). C) 대조군 마우스(WT) 또는 Foxp3K276X 마우스 유래의 전체 CD4+ T 세포로 B에서와 같은 실험 설정. CD25 및 Foxp3 발현의 플로우 사이토메트리(살아있는 CD4+ T 세포에서의 게이팅). 빈 px458 플라스미드로 전기천공된 야생형 세포는 CD4+Foxp3+CD25+ T 세포로 분화되며(좌측 패널), sgRNA Foxp3K276X 단독으로 전기천공된 Foxp3K276X 세포에서 Foxp3 분화 부재(중간 패널) 및 sgRNA Foxp3K276X와 1kb Foxp3 dsDNA 수선 주형이 전기천공된 Foxp3K276X 세포에서 Foxp3 단백질 발현의 회복(우측 패널). 상단 열: TGF-β 단독 도입된 Foxp3, 하단 열: TGF-β와 RA의 조합이 도입된 Foxp3. TGF-β 단독과 비교하여 TGF-β와 RA의 조합은 원래의 Foxp3 유전자좌를 갖는 세포(즉, 야생형 및 수선된 세포)에서 더 높은 빈도의 Foxp3 발현 세포를 유도한다. Foxp3K276X 세포로 2회 실험 및 Foxp3 sf /J 세포로 1회 실험의 대표 데이터. D) 대리 마커로서 다중 CD45 이소폼 스위칭을 이용한 유전자-수선된 Foxp3 발현 세포의 농화. b와 같은 실험 설정이지만 2 sgRNAs(sgRNA Foxp3K276X 및 sgRNACD45.2_R1) 및 2개의 1kb dsDNA 주형(Foxp3 야생형 및 CD45.1)를 암호화하는 플라스미드의 동시 전기천공이 있다. 7일 후 CD45.2, CD45.1, CD25 및 Foxp3의 플로우 사이토메트리(살아있는 CD4+ 세포에서의 게이팅). 상단 패널: CD45.1-세포에서(녹색선) 및 CD45.1+ 세포(적색선)의 사전-게이팅. 하단 패널: 이소폼 전환된 CD45.1+ 세포에서 CD25+Foxp3+ 세포의 농화. Foxp3K276X 세포를 이용한 2회 실험 및 Foxp3 sf /J 세포를 이용한 1회 실험의 대표 데이터.
도 21은 플라스미드 기반 접근법 및 RNP 기반 접근법을 이용한 Foxp3 유전자의 수선을 나타낸다. A: Foxp3 KO 마우스 유래의 CD4 T 세포는 sgRNA 플라스미드 단독 또는 Foxp3 야생형 HDR 주형과 함께 형질주입되었다. GFP+ 및 GFP- 세포를 형질주입(플라스미드 형질주입) 24시간 후 소팅하고, 세포 소팅 직후 Foxp3 분화 칵테일의 존재에서 실험의 끝까지 확장하였다. B: Foxp3 KO 마우스 유래의 CD4 T 세포는 crRNA:tracrRNA/Cas9 RNP 복합체 단독 또는 +/- HDR 주형(180bp ssDNA 또는 2kb plasmid)으로 형질주입되었다. RNPs 형질주입된 세포의 전체 풀은 Foxp3 분화 칵테일의 존재에서 실험의 끝까지 확장되었다.
도 22는 인 비트로에서 T 세포에서의 성공적인 Foxp3 유전자 수선을 나타낸다. 상단 열: wt Foxp3(C57BL/6) SEQ ID NO: 031의 게놈 DNA 서열 및 조기 종결 코돈이 도입된 표적 돌연변이 Foxp3K276X SEQ ID NO: 032를 갖는 Foxp3 유전자좌의 정렬. sgRNA 결합 부위(녹색선) 및 PAM 서열(검은선). wt 대조군 또는 Foxp3K276X 마우스 유래의 총 CD4+ T 세포는 형질주입되었다. CD25 및 Foxp3 발현의 플로우 사이토메트리(살아있는 CD4+ T 세포에서의 게이팅). 빈 px458 플라스미드로 전기천공된 wt 세포의 CD4+Foxp3+CD25+ T 세포로의 분화(상단 패널), sgRNAFoxp3K276X 단독으로 전기천공된 Foxp3K276X 세포에서의 Foxp3 분화의 부재(중간 패널) 및 sgRNAFoxp3K276X 및 1kb Foxp3 dsDNA 수선 주형으로 전기천공된 Foxp3K276X 세포에서의 Foxp3 단백질 발현의 회복(하단 패널). TGFbeta와 RA를 이용한 Foxp3 유도.
도 23은 Foxp3K276X C57BL/6 마우스 유래의 총 CD4+ T 세포의 유전자 편집을 위한 프로토콜을 나타낸다. Foxp3K276X 돌연변이를 표적으로 하는 sgRNA를 암호화하는 플라스미드 및 1kb wt Foxp3 수선 주형을 포함하는 원형 플라스미드를 이용한 인 비트로 활성화 및 전기천공. 성공적으로 형질주입된 세포는 GFP 발현에 기초하여 분리된다. 세포는 Foxp3 분화에 이은 IL-2 요법을 위해 인 비보로 이식된다.
도 24는 세포의 AT 후 14주에 마우스의 임상 표현형을 나타낸다. WT 및 수선 마우스는 무병 상태이고, KO 세포의 이식은 피부 염증 및 탈모증을 유발한다. 도 23에서와 같은 실험 설정.
도 25는 귀 및 꼬리 피부에서 CD4/CD3+ T 세포의 침윤과 관련된 KO 세포를 받은 마우스에서 임상 표현형(T 세포 침윤)을 나타낸다. WT 또는 수선된 T 세포를 받은 마우스의 귀 및 피부에서 발견되는 CD4/CD3+ T 세포는 없거나 매우 적다. 데이터는 % 및 절대 숫자로 표시된다.
도 26은 WT 및 수선된 세포를 받은 마우스에서 CD25/Foxp3+ Treg 세포의 존재를 나타낸다. 데이터는 % 및 Foxp3의 MFI로 표시된다. 도 23에서와 같은 실험 설정.
도 27은 수선된 Treg이 IL-2에 반응함을 나타낸다. 실험의 마지막 주 동안 IL-2의 추가 처리는 WT 및 수선된 세포를 받은 마우스에서 증가된 CD25/Foxp3+ Treg 세포의 존재를 유발한다. CD25/Foxp3+ T 세포는 KO 세포를 받은 마우스에서는 발견되지 않는다. 이들 데이터는 WT 및 수선된 Treg 세포가 유사한 정도로 IL-2에 반응함을 입증한다.
도 28은 WT 및 수선된 CD25/Foxp3 Treg 세포는 상이한 세포 표면 마커들(GITR, ICOS, TIGIT, PD1 및 KLRG1)를 유사한 수준으로 발현함을 나타낸다. CD25 및 추가 마커(예를 들어, GITR)의 조합은 이들 집단을 농화하는데 사용될 수 있다. Foxp3-결핍 T 세포는 표현형적으로 상이하며, 예를 들어, 그들은 GITR 및 KLRG1의 발현이 부족하다.
도 29는 CD45.1+ WT 세포의 AT는 Foxp3 결핍 마우스를 구제하고 수명을 8주까지 연장함을 나타낸다(검사된 최신 시점, 질환의 징후 없음). Foxp3 KO 마우스에서 발견된 높은 비율의 WT Treg 세포(50%)는 숙주 T 세포 활성화를 억제한다(CD44high 세포보다 더 낮은 %). 이것은 WT T 세포가 면역 조절을 완전히 회복시키고 스컬피 질환을 조절하는 능력이 있음을 입증한다. 또한, Foxp3-결핍 미세환경은 Foxp3-충분 T 세포가 대량으로 확장되도록 증진한다.
도 30은 Foxp3 KO 마우스(림프절, LN)에서 CD4 고갈 실험을 나타낸다. 선택적 항체 고갈 및 T 세포에서 유전자 수선의 조합: 병원성 세포를 고갈시키고 나서, 유전자-교정된 T 세포를 이식한다. CD4 고갈은 크게 스컬피 질환을 억제하고, 수명 기대를 유의적으로 확장한다. 이 관찰은 낮거나 존재하지 않은 CD4 T 세포를 나타내는 FACS 데이터에 의해 지지된다(무처리의 KO 또는 WT 마우스와 비교하여 고갈된 KO).
도 31은 Foxp3 KO 마우스에서 CD4 고갈 실험을 나타낸다(비장, SP). 선택적 항체 고갈 및 T 세포에서의 유전자 수선의 조합: 병원성 세포를 고갈시키고 나서, 유전자-교정된 T 세포를 이식한다. CD4 고갈은 크게 스컬피 질환을 억제하고, 수명 기대를 유의적으로 확장한다. 이 관찰은 낮거나 존재하지 않은 CD4 T 세포를 나타내는 FACS 데이터에 의해 지지된다(무처리의 KO 또는 WT 마우스와 비교하여 고갈된 KO).
도 32A는 CD4 고갈이 Foxp3-결핍 마우스에서 스컬피 질환의 발병을 억제함을 나타낸다. 도 32B는 CD4 고갈이 Foxp3-결핍 마우스의 꼬리 피부에서 피부염의 발병을 크게 억제함을 나타낸다.
<실시예>
프라이머리 T 세포에서 효율적인 플라스미드-기반 유전자 제거, 프라이머리 T 세포에서 점 돌연변이의 표적 도입, 대리 세포 표면 마커의 이소폼 전환을 모니터링하여 HDR-편집된 세포의 농화 및 마우스 스컬피 세포의 유전자 교정에 관한 설명은 EP16196860.7, EP16196858.1 및 PCT/EP2017/059799에서 발견될 수 있다.
조작된 돌연변이 설계를 위한 일반적인 고려 사항(대립유전자 조작):
리간드의 특이 결합을 변화시키고, 제2의 특이적인 리간드의 결합을 허용할 목적으로, 표적화 된 작은 돌연변이, 가능하다면 단일 뉴클레오타이드 또는 단일 아미노산 돌연변이를 도입하여 유전자의 대립유전자를 조작하는 것은 치료 용도를 위한 일반적인 원리로 유용할 수 있다. 돌연변이는 가능한 한 많이 조작된 단백질의 기능을 보존하는 방식으로 설계된다. 면역원성은 단클론 항체(mAb) 또는 아피머, DARPINS, 나노바디 등과 같은 항체-유사 분자와 같은 특이적인 결합 리간드를 생성할 수 있도록 변경할 필요가 있다. 그러한 리간드는 특이 결합을 위해 스크리닝이 필요하고, 면역원의 성질은 신중한 설계가 요구된다. 동시에, 돌연변이는 사소한 항원 변화를 구성하므로 인 비보에서 강한 면역 반응을 일으키지 않을 것이다. 마우스에서 컨제닉(congenic) 마커는 정확히 이들 기준을 충족시킨다. CD45.1 및 CD45.2 간뿐만 아니라 CD90.1 및 CD90.2 간의 차이는 단일 아미노산 차이를 유도하는 단일 뉴클레오타이드이다. 두 경우에서, 이 차이는 특이 mAbs에 의해 검출될 수 있어 각 유전자에 대해 한 쌍의 mAbs를 생성한다. 컨제닉 세포가 일치하는 컨제닉 숙주 마우스로, 즉, CD90.1+ 세포가 CD90.2+ 숙주 마우스로 또는 그 역으로, 및 CD45.1+ 세포가 CD45.2+ 숙주로 및 그 역으로 이식될 때의 이들 차이에 대해 mAbs가 증가하더라도, 세포는 면역학적으로 거부되지 않는다. 이것은 이 사소한 항원 차이가 인 비보에서 면역계에 의해 용인됨을 의미한다. 종합적으로, 이들 특징들은 선천적으로 표지된 세포를 수십 년 동안 사용되어 온 면역학적 연구를 위한 매우 유용한 도구로 만들었다. 면역학적으로 이들 세포는 자가 이식을 위한 대리 세포로 사용되지만(왜냐하면, 세포는 이 단일 돌연변이를 제외하고 유전적으로 동일하므로), 컨제닉의 사소한 차이는 숙주 세포로부터 전달된 것을 식별할 수 있게 한다.
조작되는 단백질의 선택
인간에서 치료 용도를 위한 유사한 시스템을 설계하기 위해서는, 몇 가지 고려 사항을 고려할 필요가 있다. 돌연변이는 원칙적으로 단백질을 암호화하는 임의의 유전자에 도입될 수 있다. 목적 단백질의 발현 패턴은 원한다면 즉, 보편적인 또는 세포- 또는 조직-특이적인 발현과 관련될 것이다. 표면에서 발현된 단백질은 가장 직접적으로 표적화 될 수 있으므로, 대부분의 경우에 선택 단백질이 될 것이다. 실시예는 분화 시스템 CD1에서 CD371의 클러스터를 특징으로 하는 단백질을 포함하나 이에 제한되지 않는다(Engel, J Immunol November 15, 2015, 195 (10) 4555-4563 and http://www.hcdm.org/). 다른 목적 단백질들은 베타-2-마이크로글로불린과 같은 보편적으로 발현되는 단백질 또는 비-면역 세포를 포함하여 모든 세포에서 발현되는 HLA-클래스 I의 불변 부분일 수 있다. 대안으로, 특정 세포 유형에서 발현되는 단백질이 목적 대상이 될 수 있다. 예를 들어, 조혈 세포의 인간 CD45, T 세포의 인간 CD3, T 세포 수용체 성분의 불변 영역, 카파 및 람다 경쇄와 같은 B 세포 면역글로불린의 불변 영역 또는 중쇄의 불변 영역, 인간 CD4 또는 CD8 보조수용체(coreceptor) 또는 CD19, CD20, CD21, CD22, CD23과 같은 B 세포 마커, CD28 또는 CD40과 같은 보조자극분자, 조혈 줄기세포 상의 CD34, 또는 CD45RA 또는 심지어 CD45RO와 같은 세포의 서브세트에서 발현되는 특정 이소폼. 후자의 경우, 돌연변이는 CD45RA 및 CD45RO 간에 상이한 가변 영역(택일적으로 스플라이스드 엑손)에 설계될 것이다. 베타-2-마이크로글로불린 또는 HLA-I와 같은 보편적으로 발현되는 분자에 돌연변이를 조작하는 것은 거의 모든 포유동물 세포, 보다 구체적으로 임의의 인간 세포에 사용될 수 있는 독특한 시스템으로서 제공할 수 있다. 이것은 조작되지 않은 숙주 세포를 예비하는 한편 조작된 세포를 추적하고 제거하는데 이용될 수 있다. 그러한 특징은 예를 들어, 다양한 유형의 줄기세포(예를 들어, 근육 줄기세포), 간세포 또는 유도된 다능성 줄기세포(iPS)에서 유래된 세포를 포함하여 세포 치료를 위한 살해 스위치로서 유용할 수 있다. CD45와 같은 세포 유형-특이적인 단백질에 돌연변이를 조작하는 것은 그 특이 조직으로부터 모든 세포를 표적으로 하는데 유용할 수 있다. 조혈 시스템의 경우, 인간 CD45를 조작하는 것은 내인성 조혈 시스템을 대체하는데 이용되는 조혈 줄기세포(HSC)를 표시하는데 제공할 수 있다. 이들 HSCs의 모든 자손은 원래의 HSCs의 게놈에 조작된 같은 돌연변이를 탑재할 것이다. 이전의 숙주 조혈 시스템이 임의의 수단들(예를 들어, 방사선조사, 화학요법, mAb 또는 항체-유사 분자, 독소와 결합된 mAb와 같은 리간드의 고갈)에 의해 제거되면, 자가일지라도 조혈 시스템을 대체하는 것은 조작된 돌연변이에 의해 식별될 수 있다. 또는, 조작된 세포를 예비하는 한편 숙주 세포의 제거를 허용할 수 있다.
설계 고려사항:
- 단백질 발현 패턴(보편적인 대 세포- 또는 조직 특이적인)
- 세포외 단백질: 대부분의 경우 돌연변이는 특이 리간드에 접근할 수 있는 목적 단백질의 세포외 부분으로 조작될 것이다. 돌연변이는 서브세트 특이적인 발현이 고려되는 경우 일정하게 발현되는 엑손 또는 대안으로 스플라이스드 엑손으로 조작될 수 있다.
- 종간의 보존: 보존된 아미노산(aa) 또는 구조들은 기능적으로 더 연관되어 있으므로, 오히려 변함이 없는 상태로 있어야한다. 돌연변이는 오히려 덜 보존된 영역에 통합되어야 한다.
- 아미노산의 화학적 특징들, 예를 들어, 극성, 전기적 전하, 소수성.
- 아미노산의 유사성: 기능을 보존하기 위해 돌연변이는 주어진 aa를 관련된 aa로 전환해야하지만, 그 변화는 여전히 특이 리간드에 의해 검출될 필요가 있다.
- 자연적으로 발생하는 변이: 단백질 패밀리의 구성원의 복합적인 서열(다른 생물체의 상동 서열) 정렬에서 주어진 위치에서 관찰된 아미노산 변이에 해당하는 돌연변이는 단백질의 기능 및 구조에 영향을 주지 않으므로 돌연변이를 설계하는데 선택될 수 있다.
- 구조적 고려사항: 구조 데이터는 잠재적 돌연변이의 이론적 설계를 도울 수 있다. 조작될 아미노산은 리간드 결합에 접근할 수 있어야 한다. 루프 내 돌연변이는 기능적으로 상대적으로 잘 견디므로 목적 대상이다.
- 공지된 질환-유발 돌연변이를 피할 것.
- 공지된 인간 유전자 변이를 고려할 것: 기능적으로 허용되는 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)은 좋은 후보 돌연변이이다.
- 글리코실화와 같은 2차 변형에 중요한 부위는 돌연변이되어서는 안된다.
- 이황화 결합에 중요한 부위는 돌연변이되어서는 안된다.
- 보고된 상호작용(예를 들어, 수소결합, 염 브릿지, 소수성 스태킹 상호작용)에 중요한 부위는 내부적으로 둘 다 단백질일뿐만 아니라 다중단백질 복합체 또는 수용체-리간드 상호 작용을 위한 단백질-단백질 상호 작용이므로 돌연변이되어서는 안된다.
- 쥐의 CD90.1/CD90.2(Q에서 R)와 같이 이전의 성공적인 시스템을 고려할 것.
- mAbs 및 상보성 결정 영역(CDRs)의 컴퓨터 모델링과 같은 공지의 결합 리간드의 결합 부위를 고려할 것.
- 공지의 "활성 부위", 예를 들어, 효소의 촉매 부위는 제외할 것.
- 다른 인간 단백질에 존재하는 구조적으로 매우 유사한 도메인은 피할 것. 왜냐하면 그들은 교차-특이적인 리간드에 대한 위험을 증가시킬 것이기 때문이다.
- 면역원성을 고려할 것: 적당한 펩타이드 면역원을 생성할 수 있는 부위를 선택할 것.
일반적으로 적용할 수 있는, 플랫폼-독립적인 원리로서의 대립유전자 조작:
EP16196860.7, EP16196858.1 및 PCT/EP2017/059799에서, 본 발명자들은 CRISPR/Cas 플랫폼이 대립유전자 조작을 위한 표적화된 점 돌연변이 조작 후 선택적 제거에 이용될 수 있는지를 입증하고 특성규명을 수행하였다. 본 발명자들은 2개의 별개의 유전자에 2개의 각각의 점 돌연변이를 조작하고, 조작된 돌연변이가 인 비보에서 조작된 세포를 추적 및/또는 선택적으로 제거하는데 사용될 수 있음을 입증하였다. 본 발명자들은 CRISPR/Cas9 시스템 및 dsDNA 주형에 의존하여 상동 재조합(HDR)을 달성하였다. 그러나 사용된 예시는 돌연변이를 도입하는 한 가지 방법 일뿐이다. 징크 핑거 단백질과 같은 뉴클레아제, Cas9와 같은 TALENs 또는 다른 자연적으로 발생하거나 조작된 CRISPR/Cas 시스템, Cpf-1, 고충실도 뉴클레아제 또는 조작된 PAM 의존성 뉴클레아제의 상이한 유형들을 대안으로 포함한다(Komor, Cell, 2017). 더욱이, 기술된 원리는 뉴클레아제의 전달 형태와는 독립적이다. 그들은 플라스미드, mRNA, 재조합 단백질, 가이드 RNA와 복합체 형태의 재조합 단백질(즉, 리보뉴클리어 복합체, RNP), 스플릿 재조합효소로, 또는 통합 또는 비-통합 바이러스, 예를 들어, 리트로바이러스, 렌티바이러스, 배큐올로바이러스 또는 다른 바이러스 전달 플랫폼으로서 전달될 수 있다. 전달 방식은 전기천공 또는 리포펙션(lipofection), 나노입자 전달, 세포 압착 또는 물리적 관통과 같은 다른 형태를 포함할 수 있다. 또한, HDR 주형은 짧은 ssDNA, 긴 ssDNA 또는 원형 또는 선형의 미니서클 DNA, 플라스미드 DNA 또는 바이러스 DNA 주형, 예를 들어, 아데노-관련 바이러스(AAV) 형태의 ssDNA 또는 dsDNA일 수 있다. 표적 세포에 따라, 특이 AAV 세로타입은 세포로의 카고를 전달하는데 사용된다. 인간 T 세포 및 인간 조혈 시스템 세포의 경우 HDR 주형은 종종 AAV6로 제공되지만 짧은 ssDNA HDR 주형과 함께 엔도뉴클레아제 RNP가 또한 성공적으로 사용될 수 있다. 그러므로, 돌연변이가 도입되는 방식은 유연할 수 있다.
대안의 접근법, 예를 들어 염기 컨버터 또는 유전자가위를 사용한 대립유전자의 조작
본 발명자들은 표적 dsDNA가 절단된 이후 HDR이 대립유전자 조작을 위해 작고, 표적화 된, 즉, 정확한 돌연변이를 도입하기 위해 어떻게 활용될 수 있는지를 입증하였다. 또한, 설계된 점 돌연변이가 살아있는 세포의 게놈에 어떻게 조작될 수 있는지에 대한 대안의 접근법들이 있다. 예로써, 새롭게 설계된 키메릭 융합 단백질은 표적 DNA를 다른 것으로의 직접 전환을 허용한다Komor , Nature 2016; Nishida , Science 2016; Yang, Nat Comm , 2016; Ma, Nat Meth 2016). 디아미나아제와 같은 효소가 징크 핑거 단백질, TALENS 또는 CRISPR/Cas 시스템과 같은 DNA 결합 분자에 융합될 수 있다(이에 제한되지는 않음). 자연적으로 발생하는 시티딘 디아미나아제(APOBEC1, APOBEC3F, APOBEC3G) 및 활성화 유도된 디아미나아제(activation induced deaminase(AID)) 또는 AID 오쏠로그 PmCDA1(바다 칠성장어 유래)는 DNA에서 시티딘(C)을 우라실(U)로 전환할 수 있다. DNA 복제 기계는 DNA 복제가 U 수선 전에 일어난다면 U를 T로 다룰 것이다. 이것은 C:G를 T:A 염기쌍으로의 전환을 유도한다(Yang, Nat Comm , 2016; Komor , Nature 2016). 그러므로, 몇몇 그룹은 특이 게놈 유전자좌에 디아미나아제를 가져오는데 이용되는 DNA 결합 분자에 디아미나아제를 융합시킨 조작된 키메릭 단백질을 개발하였다. 예를 들어, CRISPR/Cas 시스템은 Cas9 뉴클레아제의 조작되고, 촉매적으로 죽은 (dCas9) 버전 이용될 때 전달 시스템으로 이용될 수 있다. 이 접근법은 특정 게놈 유전자좌에 융합된 효과기 분자를 표적으로 하고자 할 때 사용되었다. 출원들은 특정 유전자 발현을 조절하기 위해 특정 유전자좌로 형광 단백질을 표적화하거나, 특정 게놈 유전자좌로 전사 트랜스액티베이터 또는 리프레서를 가져오는 것을 포함한다(Wang, Ann Rev Biochem, 2016). 염기 편집 효율을 개선하기 위해 니카아제 Cas9에 시티딘 디아미나아제 또는 AID를 융합하고 추가 조작함으로써 직접 표적화 된 염기 전환이 가능하다(Komor, Nature 2016; Nishida , Science 2016). 특정 환경하에서 이것은 염기 편집이 dsDNA 절단을 유도하거나 DNA HDR 주형의 전달을 요구하지 않으므로 HDR 접근법에 비해 이점을 가질 수 있다. 그러므로 이 대안의 접근법은 인델(indels)을 더 적게 만들 수 있으므로, HDR 기반의 게놈 조작에 대한 안전하고 심지어 더 안전한 대안이 될 수 있다. 또한, mRNA 또는 RNP와 같은 유전자가위의 전달이 충분할 수 있고, 특정 세포 유형들에 대해 덜 독성이 있을 수 있다. 인간 T 세포의 경우, Cas9 RNP가 성공적인 게놈 편집 접근법을 제공하므로(Schumann, PNAS, 2015), RNP 형태의 염기 컨버터가 조혈 줄기세포(HSCs) 및 T 세포를 포함하는 조혈 세포에 특히 잘 적합하지만 원칙적으로 염기 전환은 포유동물 세포를 포함하여 임의의 세포에 적용할 수 있는 대립유전자 조작을 위한 적당한 접근법이 될 것으로 예상할 수 있다. 그리하여 도입된 설계된 점 돌연변이는 세포 표시화, 세포 추적 및 선택적 제거와 같은 후속 적용에 이용될 수 있다. RNPs로 전달된 유전자가위는 포유동물 세포, 마우스 및 제브라피쉬 배아 및 살아있는 마우스의 내이에서 표적 뉴클레오타이드를 성공적으로 편집하였다(Rees, Nat Comm , 2017; Kim, Nat Biotech, 2017 doi:10 .1038/ nbt .3816). 그리하여, 이들 연구는 특정 DNA 자유 염기 편집의 타당성을 입증한다. 그러나 염기 전환에 따르는 (인간) 게놈에서 뉴클레오타이드의 수는 HDR 접근법보다 더 제한되는데, 이는 PAM 서열(CRISPR/Cas-기반 염기 컨버터의 경우)에 의존할 뿐만 아니라 추가의 제한을 받기 때문이다. 비록 시티딘 디아미나아제 유전자가위가 C를 T로(또는 G를 A로)만 전환할 수 있을지라도, 새롭게 조작된 아데닌 유전자가위는 A를 G로(또는 T를 C로) 전환할 수 있다(Gaudelli, Nature 2017). 그러나, PAM 요건에 덧붙여, 염기 전환은 융합 단백질의 특정 설계 및/또는 조작에 의해 특화된 특정 창 내에서만 일어난다. 그리하여, 점 돌연변이의 HDR-매개된 도입과 비교하여 편집할 수 있는 뉴클레오타이드의 수는 유전자가위가 사용되는 경우 훨씬 더 제한된다(Komor, Nature 2016). 또한, 염기 전환의 창은 몇 개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 예를 들어, 소위 스트렙토코커스 피오게네스(S. pyogenes) Cas9를 사용하는 유전자가위 3(base editor 3(BE3))(SpBE3, Komor et al., Nature 2016를 볼 것)는 이 창에서 약 5개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 그리하여, 다수의 근접한 C 뉴클레오타이드의 스트레치 내에서 단일 C를 T로 편집하는 것은 가능하지 않을 것이며, 생성된 단백질의 아미노산을 변화시킬 수 있는 추가의 원치 않는 돌연변이가 유도될 것이다. 유사한 편집 창을 아데닌 유전자가위에 적용한다. 더욱이, 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus) Cas9에 기초한 상이한 BE3, SaBE3는 표준 BE3 편집 창 외부에서 표적 Cs에 검출 가능한 염기 편집을 초래할 수 있다. 이들 제한을 해결하기 위해, 최신 염기 컨버터 버전은 NGG 보다 더 좁은 편집 창과 상이한 PAM 특이성을 갖도록 조작되었으나(예를 들어, NGA, NGAG, NGCG, NNGRRT 및 NNNRRT), 주어진 단일 뉴클레오타이드 전환을 위한 특이 유전자가위의 설계는 어려움을 겪고 있다(Kim, Nat Biotech 2017, doi:10.1038/nbt.3803). 새로운 염기 컨버터가 포유동물 게놈에서 표적 가능한 뉴클레오타이드의 범위를 확장한다고 하더라도, 모든 뉴클레오타이드가 자유롭게 편집될 수 있는 것은 아니다. 그럼에도, 염기 컨버터의 이점 중 일부를 이용하기 위해, 본 발명자들은 CD90.1을 CD90.2로, CD90.2를 CD90.1로, CD45.1을 CD45.2로 또는 CD 45.2를 CD45.1로의 대립유전자 조작을 위한 유전자가위를 설계하고자 시도하였다. 그러나 원래의 NGG 제한된 유전자가위를 사용하면 이용 가능한 유전자가위를 사용하여 이들 전환을 달성할 수 없다. 이것은 두 유전자 CD90 및 CD45의 경우 대립유전자 차이는 원칙적으로 디아미나아제 전환을 기꺼이 따라야 하는 G의 A로의 치환에 의해 암호화된다는 사실에도 불구하고 존재한다. 유일한 해결책은 이 Cas9 변이체의 PAM 요구를 NNNRRT로 약하게 하는 3개의 돌연변이를 포함하는 SaCas9에 기초한 BE3 버전을 이용하는 것이다(Kleinstiver , Nature 2015; Kim, Nat Biotech, 2016 (doi:10.1038/nbt.3803). 이 유전자가위를 선택하면 CD45.1 대립유전자를 CD45.2 대립유전자로 전환할 일치하는 sgRNA와 함께 유전자가위를 설계하는 것이 가능할 수 있다(도 9A). 그러나 이 유전자가위는 CD45.1을 CD45.2로 전환하는데만 일할 뿐 CD45.2를 CD45.1로의 전환에는 그렇지 않도록 우리는 가상의 아데닌 유전자가위를 설계하였다(Cas9 SaKKH 또는 Cas9 VQR과의 아데닌 유전자가위의 융합)(도 9B). 대조적으로, 현재 존재하는 유전자가위 버전에서도 CD90 대립유전자 전환은 가능하지 않다.
방법
쥐의 프라이머리 CD4+ T 세포에서의 유전자 편집, EL-4 세포에서의 유전자 편집 및 Foxp4 수선을 위한 프로토콜을 기술하는 상세한 방법은 EP16196860.7, EP16196858.1 및 PCT/EP2017/059799에서 찾을 수 있다.
인간 T-세포 분리 및 항체
인간 프라이머리 T 세포는 Lymphoprep™(Stemcell Technologies) 밀도 구배를 이용하여 건강한 도너의 버피 코트(Blutspendezentrum, Basel)로부터 분리하였다. 나이브 CD4+ T 세포는 Easysep 인간 나이브 CD4+ T-세포 농화 키트(Stemcell Technologies)로 제조업체의 프로토콜에 따라 미리-농화되었다. 대안으로, 나이브 T 세포의 높은 빈도를 고려할 때, 나이브 T 세포 분리 단계를 이용하지 않고, PBMCs를 위한 공급원으로 제대혈을 이용하였다. 나이브 CD4+ T 세포 농화 전과 후에, 순도를 평가하기 위해 샘플을 다음의 항체로 염색하였다: αCD4-FITC(OKT-4), αCD25-APC(BC96), αCD45RA-BV711(HI100), αCD45RO-BV450(UCHL1), αCD62L-BV605(DREG-56), αCD3-PerCP(HIT3a) 및 좀비-UV 생존력 염료(Zombie-UV viability dye). 모두 Biolegend에서 구입하였다.
간단히 말해, 50mL의 1 버피 코트의 경우: 필터가 있는 50mL 팔콘 튜브 2개를 준비하고, 16mL의 림포프렙을 각 튜브에 첨가하고, @ 300g로 1분 동안 회전시킨다. 50mL의 필터 튜브 둘 다에 동량의 혈액을 분배하고, PBS로 50mL 끝까지 채운다. @ 2000 rpm(acc 4, decc 1)으로 15분간 회전시킨다. 혈청 일부를 제거하고 그것을 버린다. 새로운 50mL 팔콘 튜브에 백색의 버피 코트를 조심스럽게 채운다. 농화된 PBMC에 멸균 PBS를 첨가하여 대략 50mL이 되게 하고, @ 300g으로 5분간 회전시킨다. 상등액을 버리고 펠렛은 10mL의 PBS로 재현탁하고, 50mL 끝까지 채우고, @ 300g로 5분간 회전시킨다. 필요하다면 정제 단계 전에 적혈구 세포 라이시스 버퍼로 적혈구 세포를 용해시킨다.
인간 T-세포 형질주입( transfection ) 프로토콜
나이브 CD4+ T 세포 또는 혈액 또는 제대혈 유래의 전체 PBMCs를 형질주입에 사용하였다. T 세포 활성화를 위해, 2×106 세포를 단클론 항체(mAbs) a-CD3(hybridoma clone OKT3, 5(high), 2.5(medium), 1(low) ㎍/mL) 및 a-CD28(hybridoma clone CD28. 2.5(high), 1(medium), 0.5(low) ㎍/mL, 둘 다 Biolegend 사에서 구입함)이 코팅된 24-웰 플레이트(Corning)에 50IU/mL의 재조합 인간 IL-2(rhIL-2)(RD systems) 하에서 5% CO2로 37℃에서 24시간 동안 도말하였다. 24시간 후 T 세포를 수확하고 PBS로 세척하였다. 2×106의 활성화된 T 세포를 다음의 조건에서 Amaxa Transfection System, T-020 program(플라스미드의 경우) 또는 Neon® Transfection System(ThermoFisher)(RNPs의 경우: 전압(1600V), 너비(10ms), 펄스(3) 100㎕ 팁, 버퍼 R)를 사용하여 전기천공하였다. 6.5㎍의 빈 플라스미드 px458(Addgene plasmid number: 48138) 또는 crRNA:tracerRNA-Atto 550(IDT) 및 Cas9(Berkeley) 복합체를 세포에 형질주입하였다. 전기천공 후 세포를 초기 활성화를 위해 사용된 농도의 절반 정도, 즉, 항-CD3(2.5, 1.25, 0.5 ㎍/mL) 및 항-CD28(1.25, 0.5, 0.25 ㎍/mL)의 플레이트-결합된 mAbs의 존재에서 50IU rhIL-2/mL이 첨가된 650㎕의 주형 배지에서 24-웰 플레이트에 도말하였다. GFP+ 또는 Atto550+ 세포의 발현은 Fortessa analyzer(BD Biosciences)를 사용하여 24시간 후에 평가하였다.
CD45.2 고갈 실험
CD4+ T 세포는 C57BL6(CD45.2) 마우스 및 C57BL6 컨제닉(CD45.1) 마우스에서 EasySep 마우스 CD4+ T 세포 분리 키트(Stem cell Technologies)를 사용하여 분리하였다. RAG KO 마우스는 10x106 CD45.2 및 CD45.1 도너 CD4+ T 세포의 1:1 비율로 재구성하였다. T 세포 이식과 같은 날, 마우스는 또한 3일 연속 PBS(미처리군)의 복강내 주사 또는 a-CD4 Ab(clone GK1.5, 250㎍)의 고갈을 받았다. CD45.2-ZAP 면역독소는 초기 간행물에 기술된 바와 동일하게(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5179034/), 스트렙타비딘-SAP 컨쥬게이트(스트렙타비딘 당 2.8 사포린 분자, 135 kDa MW, Advanced Targeting Systems)와 CD45.2 바이티닐화 항체(160 kDa MW, Biolegend)를 1:1의 몰 비율로 결합하여 제조하고, 이어서 사용 전에 PBS에서 즉시 희석하였다. 면역독소 또는 컨쥬게이트되지 않은 CD45.2 항체를 갖는 대조군의 인 비보 투여는 정맥내 주사에 의해 수행되었다. 1주 후에, 혈액, 말초 림프절(LN), 장간막 LN(mesLN) 및 비장(SP)을 채취하고, 세포는 다음의 형광 색소-컨쥬게이트 된 mAbs로 염색하였다: 항-CD45.2(104), 항-CD45.1(A20), 항-CD4(RM4-5), 항-CD3(145-2C11), 모두 Biolegend에서 구입하였다. 샘플은 BD Fortessa(BD Biosciences)에서 수집하고, FlowJo software(Tree Star)로 분석하였다.
항목
1. 진핵세포 내 제1 게놈 위치에서 제1 상동 재조합(HDR) 사건의 측정 방법으로,
- 상기 세포는 아미노산 마커가 제1 표면 단백질의 제2 이소폼과는 상이한 제1 표면 단백질의 제1 이소폼을 발현하고, 상기 제1 이소폼은 핵산 서열 A에 의해 암호화된 아미노산 마커 A를 포함하고, 상기 제2 이소폼은 핵산 서열 B에 의해 암호화된 아미노산 마커 B를 포함하며;
- 상기 제1 게놈 위치는 상기 핵산 서열 A를 포함하며; 및
상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
a. 상기 제1 게놈 위치에서 제1 DNA 이중 가닥 절단을 유도하는 단계;
b. 상기 핵산 서열 B 및 상기 제1 게놈 위치의 DNA 서열 5' 및 3'에 상동인 호몰로지 암의 제1쌍을 포함하는 제1 DNA 수선 구조물을 제공하는 단계;
c. 상기 세포에서 상기 제1 표면 단백질의 상기 제1 및/또는 상기 제2 이소폼의 발현을 측정하고, 선택적으로 상기 표면 단백질의 상기 제1 및/또는 상기 제2 이소폼의 발현에 기초하여 상기 세포를 정제하는 단계; 및
d. 상기 제1 HDR 사건의 발생을 측정하는 단계로, 상기 세포에서 상기 제1 표면 단백질의 상기 제2 이소폼의 발현은 상기 제1 HDR 사건의 발생과 동일하다.
2. 항목 1에 따른 방법에 있어서, 상기 제1 HDR 사건의 발생은 적어도 2개의 다른 실험 조건에서 측정되며, 제1 실험 조건에서 제2 실험 조건과 비교하여 상기 제2 이소폼 대 상기 제1 이소폼의 발현의 증가된 비율은 상기 제1 실험 조건에서 증가된 HDR 효율을 나타낸다.
3. 상기 항목들 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 단계 a 및 b는 바닐린 및/또는 루카파립을 구체적으로 50　μM 내지 500 μM의 바닐린 및/또는 0.5 μM 내지 2.5 μM의 루카파립, 보다 구체적으로 약 300 μM의 바닐린 및/또는 약 1 μM의 루카파립을 포함하는 세포 배양 배지에서 수행된다.
4. 상기 항목들 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 제1 표면 단백질의 상기 제1 및 상기 제2 이소폼은 리간드, 구체적으로 항체에 의해 서로 구별될 수 있고, 상기 리간드는 상기 아미노산 마커 A(및 B에는 아님) 또는 상기 아미노산 마커 B(및 A에는 아님)에 각각 식별 가능하게 결합할 수 있다.
5. 상기 항목들 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 제1 표면 단백질은 천연 단백질이다.
6. 상기 항목들 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 제1 표면 단백질은 트랜스제닉 단백질이다.
7. 상기 항목들 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 정제는 fluorescent activated cell sorting(FACS)에 의해 수행된다.
8. 항목 1 내지 6중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 정제는 상기 제1 표면 단백질의 상기 제1 또는 상기 제2 이소폼을 발현하는 세포의 자성-비드 기반의 농화를 포함한다.
9. 상기 항목들 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 제1 표면 단백질은 Thy1 또는 CD45이다.
10. 상기 항목들 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 제1 이중 가닥 절단은 CRISPR-관련 엔도뉴클레아제(Cas9)를 암호화하는 DNA 발현 구조물 및 가이드 RNA를 상기 세포에 형질주입시켜 상기 제1 게놈 위치에서 유도되며, 상기 가이드 RNA는 상기 제1 게놈 위치에 어닐링될 수 있다.
11. 상기 항목들 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 호몰로지 암은 각각 대략 2000개의 염기쌍(bp)을 포함한다.
12. 편집되지 않은 세포 및 편집된 세포의 조성물에서 편집된 세포를 선택적으로 고갈 또는 농화하는 방법으로,
a. 상기 편집되지 않은 세포는 표면 단백질의 제1 이소폼을 발현하고, 상기 편집된 세포는 아미노산 마커가 상기 제1 이소폼과는 상이한 상기 표면 단백질의 제2 이소폼을 발현하기 위해 항목 1 내지 11중 어느 하나에 따른 방법에 의해 편집되며, 상기 제1 이소폼은 핵산 서열 A에 의해 암호화된 아미노산 마커 A를 포함하고, 상기 제2 이소폼은 핵산 서열 B에 의해 암호화된 아미노산 마커 B를 포함한다; 및
b. 상기 편집된 세포는 상기 표면 단백질의 상기 제1 또는 상기 제2 이소폼의 발현에 기초하여 선택적으로 농화 또는 고갈된다.
13. 세포의 조성물에서 세포를 선택적으로 고갈 또는 농화하는 방법으로 다음의 단계를 포함한다,
c. 세포를 제공하는 단계로, 상기 세포는 아미노산 마커가 표면 단백질의 제2 이소폼과는 상이한 상기 표면 단백질의 제1 이소폼을 발현하고, 상기 제1 이소폼은 핵산 서열 A에 의해 암호화된 아미노산 마커 A를 포함하고, 상기 제2 이소폼은 핵산 서열 B에 의해 암호화된 아미노산 마커 B를 포함한다;
d. 상기 핵산 서열 A를 포함하는 게놈 위치에서 DNA 이중 가닥 절단을 유도하는 단계;
e. 상기 핵산 서열 B 및 상기 게놈 위치의 DNA 서열 5' 및 3'과 상동의 호몰로지 암의 한 쌍을 포함하는 DNA 수선 구조물을 제공하는 단계;
f. 상기 표면 단백질의 상기 제1 또는 상기 제2 이소폼의 발현에 기초하여 상기 세포를 선택적으로 농화/고갈시키는 단계.
SEQUENCE LISTING <110> Universit? Basel <120> Immunologically Discernible Cell Surface Variants for Use in Cell Therapy <130> uz331 <160> 32 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 gttttgtgag cttcaagtct 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 2 gtttgtgagc ttcgagtctc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 3 ggctaatact tcaatttgtt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 4 ttggagtgga aaacagaaaa 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 5 aacaaaaaac cttgatttca 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 6 aaacaaaaaa ccttgatttc 20 <210> 7 <211> 180 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 7 cgtcaccctc tccaaccagc cctatatcaa ggtccttacc ctagccaact tcaccaccaa 60 ggatgagggc gactactttt gtgagcttcg agtctcgggc gcgaatccca tgagctccaa 120 taaaagtatc agtgtgtata gaggtgagac tggttcccag aaagataaaa tgtccaggtt 180 <210> 8 <211> 180 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 8 cgtcaccctc tccaaccagc cctatatcaa ggtccttacc ctagccaact tcaccaccaa 60 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ttgaaaaaac catttaaaaa 480 caaaaacaaa agcaacacac tcctcttgat ctcctgttct tgaaacacat tgttgggacc 540 cagaacttca gtagattgat ggaagttgga gtctgcaagt ggtggaacat cccaccaata 600 cctcaagggc gagtgcaaac cccacatccc cccagctcaa gtctactttt cctgcaggtg 660 ggaggccccg ggtctgtgtc tccccaaatt cagagaaggc actgctgtgc cagtcttgca 720 ggtgtcccga gggcagaagg tgaccagcct gacagcctgc ctggtgaacc aaaaccttcg 780 cctggactgc cgccatgaga ataacaccaa ggataactcc atccagcatg agttcagcct 840 gacccgagag aagaggaagc acgtgctctc aggcaccctt gggatacccg agcacacgta 900 ccgctcccgc gtcaccctct ccaaccagcc ctatatcaag gtccttaccc tagccaactt 960 caccaccaag gatgagggcg actacttttg tgagcttcga gtctcaggcg cgaatcccat 1020 gagctccaat aaaagtatca gtgtgtatag aggtgagact ggttcccaga aagataaaat 1080 gtccaggtta gccaggctgg ggtagccaat aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaac 1140 aggcacctcc attacccttc ccctaactgc tggtctcctg ggaaactgct gctgtctatg 1200 tgagtggggc aagattaggg gccagaaagg gggagcttgt agtaaaagca cagttgagga 1260 aactaaatgg gaaaggcagt acagtggtga ttcttgtggt gtggaggttc 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acaaaatgca ttagaagaaa tacattcata 1980 cctgaaagat gtcag 1995 <210> 19 <211> 4000 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 19 ttaattcacc aagtattatt gaattgttga taacagacag atatatcata aacccgagtt 60 aatgataatg aacaaaatag actagttatg gttctcatgg acttttcaat ttagttggaa 120 agatagatac caaaccaata attatcatag tataaactgg gatcttttat aggagaaagg 180 atttcaaaat aatgatgtag gggtacatga tacagttctt ctatttttca tattcctgga 240 gatactgtgc tacaacctac aatctgcttt ggtgatattt tggtatatta cctctgctat 300 atgctaatta ttcttttact tctgcttgct gagtactgaa tttgaaaccc aaaatacact 360 tatttcatca gatcattctc tgtacaaaag aatatgttaa gacatttgta tccaatgtag 420 tatcattcat tctcgatgat gattgtacta atttcctttt tttttttttc cagctgccat 480 gtttgggaac attactgtga attacaccta tgaatctagt aatcagactt ttaaggcaga 540 cctcaaagat gtccaaaatg ctaagtgtgg aaatgaggat tgtgaaaacg tgttaaataa 600 tctagaagaa tgctcacaga taaaaaacat cagtgtgtct aatgactcat gtgctccagc 660 tacaactata gatttatatg taccaccagg tgaatgtcaa tttctctcta tctgggtatt 720 tagagcaaca gaaggatttc atgtatgtgt tcctgtgctt 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aatgaatggc 1620 aaatatctga gttgataaac aaactgccag caagtggtgt ctacacatat agatatatca 1680 aaacactaat aatgtgcaca tatttgtata attgtgcatc agctgaaatg gagataaatt 1740 aaaaattagg aatgtgacta gatcatgaag aagcatcaga ccttgggaga gcttagatgt 1800 cccctagcga aatctcctgc ttgcaagact gtactccatg agtcttattt cagagttgag 1860 agggttcaca tctccacacc aggaaccatc acctaagagc acctctccgt ttcctccaca 1920 gggactgaca agttttcgct acatgactgc acaccaaaag aaaaggctaa tacttcaatt 1980 tgtttagagt ggaaaacaga aaaccttgat ttcagaaaat gcaacagtga caatatttca 2040 tatgtactcc actgtgagcc aggtacgatg ctgggcagag aagttctatt atcagaaatt 2100 attccagacg tggcttaaat gttctttctg tagccttgtc ctcctcaccc accctcagtg 2160 atccgccata aattagaata aaataaccct agtatctctg gcactgaaac aaattcacaa 2220 cgtagataaa tgaaaagagc aacccatgga tgataaatat tatgaaaaat taattaaaag 2280 aattttcttg agtactgtta tataccagac attgttgaaa gggtgatgag atgcaggcat 2340 tataaaagaa agatggtatc catagtctgt agaaaggaag catagtatta tccacaccgg 2400 aggttgcttt ctcagacttt catacatgaa aatcattgga aagttcaaga atctgcaggt 2460 agcaaggaaa acaagtgctt ctaggaggga acatgggttt ctctagaggt tggatctttt 2520 aaaacatata tttgaattca gtgaggtgga ctctttctcc tctaggcata cagctatgtg 2580 ccaggacaca cttgacaaga cagagggagg tacatacacc cagaggcgga agaggaaatt 2640 tcactctgat tgtaaacatt gtgctaacag gaaattgctg ggctaagata caaataggat 2700 gttcacagct ggaacaaata tatgttgagt taacattttt ttaaaaaatt ttaaataagt 2760 cacaatactg atttctcaac aaaattgagt atagcaatgt tatctgcagg atcttggttt 2820 attatttcac cattttcaga gacttgacct taacatgaag tcttaaacac atggtgccat 2880 aaaagaagcc catttactat gtggcatttc atatactcat gtgcaatact tacttctttc 2940 agaaaataat acaaaatgca ttagaagaaa tacattcata cctgaaagat gtcagttgga 3000 caaccttcgt gcccaaacaa attacacatg tgtagcagaa atcttatatc gcggtgtaaa 3060 actcgtcaaa aatgttataa atgtgcagac agatttgggg agtaagtata tcgtttatgt 3120 ttataaaata aataaaattt ctttttcttt tatgggttta cttttatttt tggagagtca 3180 tagaaaataa tggtatagaa ttacagaaag catatcagtg aagaaaaaag tttaaatgca 3240 ctttaaggtc aattttaaaa actaggttat acaaacctaa ctaaagttct ttttctgttg 3300 ttcaaattgt gtctgccgta agtctggtag aaacacttga aatggtttac atagattatt 3360 cccattttat tcattttctc ctcccttctt tttataacac catttgttct gtattctaac 3420 acttctttca caattatgct ctgcttctaa tagaaataaa ataagcaaag aaactaataa 3480 aactcaagca aatctacatg tttaaacata aaatacggag tatagttatc aaattttggc 3540 aatagaatta ataaccggat aaaccttatt aaatagaaag gggttctact tgggaagtca 3600 gatgtgaaat tttcaaatta aatgtaacat ttgatggtaa atgctaattt tttaaaatgg 3660 tgattaatga ataatcaacc ataaagaaga caaaagatgt cattgctcac aagcagtaaa 3720 gacattttta gaaggaagag aagagaagca gtaggaaagg aggaagggag agatagatga 3780 tagatagata atagatagat agatagatag atagatagat agatagagac agacagacag 3840 acagaaagaa agagagagac agaaacagag agacacaaaa aaagaggaaa gagaagactg 3900 ggagaaaggg aaagtaaggg atggagaaaa aagggagaga gataaaaaga agacaaaaac 3960 ataaatgaaa gcaaggaatg atgatatata tctgttatgt 4000 <210> 20 <211> 57 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 20 ttttgtgagc ttcgagtctc ggtcgcgaat cccatgagct ccaataaaag tatcagt 57 <210> 21 <211> 57 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 21 ttttgtgagc ttcaagtctc ggtcgcgaat cccatgagct ccaataaaag tatcagt 57 <210> 22 <211> 63 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 22 aaaaggctaa tacttcaatt tgtttggagt ggaaaacaaa aaaccttgat ttcagaaaat 60 gca 63 <210> 23 <211> 63 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 23 aaaaggctaa tacttcaatt tgtttagagt ggaaaacaga aaaccttgat ttcagaaaat 60 gca 63 <210> 24 <211> 48 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 24 ggctaatact tcaatttgtt tggagtggaa aacagaaaac cttgattt 48 <210> 25 <211> 48 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 25 ggctaatact tcaatttgtt tggagtggaa aacaaaaaac cttgattt 48 <210> 26 <211> 64 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 26 ggctaatact tcaatttgtt tggagtggaa aacaaaaaac cttgatttca gaaaatgcaa 60 cagt 64 <210> 27 <211> 64 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 27 ggctaatact tcaatttgtt tagagtggaa aacagaaaac cttgatttca gaaaatgcaa 60 cagt 64 <210> 28 <211> 63 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 28 gcctcaatgg acaagagctc ttgctgcatc gtagccacca gtactcaggg cagtgtgctc 60 ccg 63 <210> 29 <211> 63 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 29 gcctcaatgg actagatatc ttgctgcatc gtagccacca gtactcaggg cagtgtgctc 60 ccg 63 <210> 30 <211> 63 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 30 gcctcaatgg acaaaagagc tcttgctgca tcgtagccac cagtactcag ggcagtgtgc 60 tcc 63 <210> 31 <211> 34 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 31 gcctcaatgg acaagagctc ttgctgcatc gtag 34 <210> 32 <211> 34 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 32 gcctcaatgg actagatatc ttgctgcatc gtag 34

Claims (37)

  1. 표면 단백질의 제1 이소폼(isoform)을 발현하고, 상기 표면 단백질의 상기 제1 이소폼은 상기 표면 단백질의 제2 이소폼과 기능적으로 구별할 수 없지만 면역학적으로 구별할 수 있으며, 상기 표면 단백질의 상기 제2 이소폼을 발현하는 세포를 갖는 환자의 의학적 치료에 사용하기 위한 포유동물 세포, 구체적으로 인간 세포.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 표면 단백질은 세포외 폴리펩타이드 서열을 포함하고, 상기 제1 이소폼은 상기 제2 이소폼과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5의 아미노산의 삽입, 결실 및/또는 치환을 포함하는 의학적 치료에 사용하기 위한 포유동물 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 제1 이소폼은 항체-유사 분자 결합, 항체 결합에 의해, 또는 항체 또는 항체-유사 분자를 보유한 면역 효과기 세포 또는 키메릭 항원 수용체(CAR)를 보유한 면역 효과기 세포, 특히 T 세포의 반응에 의해 상기 제2 이소폼과 구별될 수 있는 의학적 치료에 사용하기 위한 포유동물 세포.
  4. 전항들 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표면 단백질은 CD1a, CD1b, CD1c, CD1e, CD1e, CD2, CD3, CD3d, CD3e, CD3g, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8a, CD8b, CD9, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD11d, CDwl2, CD13, CD14, CD15, CD15u, CD15s, CD15su, CD16, CD16b, CD17, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD32, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, CD41, CD42a, CD42b, CD42c, CD42d, CD43, CD44, CD45, CD45RA, CD45RB, CD45RC, CD45RO, CD46, CD47, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD50, CD51, CD52, CD53, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD59, CD60a, CD60b, CD60c, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD63, CD64, CD65, CD65s, CD66a, CD66b, CD66c, CD66d, CD66e, CD66f, CD68, CD69, CD70, CD71, CD72, CD73, CD74, CD75, CD75s, CD77, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CD85a, CD85d, CD85j, CD85k, CD86, CD87, CD88, CD89, CD90, CD91, CD92, CD93, CD94, CD95, CD96, CD97, CD98, CD99, CD99R, CD100, CD101, CD102, CD103, CD104, CD105, CD106, CD107a, CD107b, CD108, CD109, CD110, CD111, CD112, CD113, CD114, CD115, CD116, CD117, CD118, CD119, CD120a, CD120b, CD121a, CD121b, CD122, CD123, CD124, CD125, CD126, CD127, CD129, CD130, CD131, CD132, CD133, CD134, CD135, CD136, CD137, CD138, CD139, CD140a, CD140b, CD141, CD142, CD143, CD144, CDw145, CD146, CD147, CD148, CDw149, CD150, CD151, CD152, CD153, CD154, CD155, CD156a, CD156b, CD156c, CD157, CD158e, CD158i, CD158k, CD159a, CD159c, CD160, CD161, CD162, CD163, CD164, CD165, CD166, CD167a, CD167b, CD168, CD169, CD170, CD171, CD172a, CD172b, CD172g, CD173, CD174, CD175, CD175s, CD176, CD177, CD178, CD179a, CD179b, CD180, CD181, CD182, CD183, CD184, CD185, CD186, CD191, CD192, CD193, CD194, CD195, CD196, CD197, CDw198, CD199, CD200, CD201, CD202b, CD203c, CD204, CD205, CD206, CD207, CD208, CD209, CD210, CDw210b, CD212, CD213a1, CD213a2, CD215, CD217a, CD218a, CD218b, CD220, CD221, CD222, CD223, CD224, CD225, CD226, CD227, CD228, CD229, CD230, CD231, CD232, CD233, CD234, CD235a, CD235b, CD236, CD236R, CD238, CD239, CD240CE, CD240DCE, CD240D, CD241, CD242, CD243, CD244, CD245, CD246, CD247, CD248, CD249, CD252, CD253, CD254, CD256, CD266, CD267, CD268, CD269, CD270, CD271, CD272, CD273, CD274, CD275, CD276, CD277, CD278, CD279, CD280, CD281, CD282, CD283, CD284, CD286, CD289, CD290, CD292, CDw293, CD294, CD295, CD296, CD297, CD298, CD299, CD300a, CD300c, CD300e, CD301, CD302, CD303, CD304, CD305, CD306, CD307a, CD307b, CD307c, CD307d, CD307e, CD308, CD309, CD312, CD314, CD315, CD316, CD317, CD318, CD319, CD320, CD321, CD322, CD324, CD325, CD326, CD327, CD328, CD329, CD331, CD332, CD333, CD334, CD335, CD336, CD337, CD338, CD339, CD340, CD344, CD349, CD350, CD351, CD352, CD353, CD354, CD355, CD357, CD358, CD360, CD361, CD362, CD363, CD364, CD365, CD366, CD367, CD368, CD369, CD370, CD371, BCMA, 면역글로불린 경쇄(람다 또는 카파), HLA 단백질 및 β2-마이크로글로불린으로부터 선택되고, 특히, 상기 표면 단백질은 CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD19, CD20, CD22, CD23, CD33, CD34, CD90, CD45, CD123, BCMA, 면역글로불린 경쇄(람다 또는 카파), HLA 단백질 및 β2-마이크로글로불린으로부터 선택되는 의학적 치료에 사용하기 위한 포유동물 세포.
  5. 전항들 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 이소폼은 환자 고유의 게놈 DNA에서 암호화되지 않는 의학적 치료에 사용하기 위한 포유동물 세포.
  6. 전항들 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 이소폼은 환자 고유의 게놈 DNA에서 상기 표면 단백질 유전자를 암호화하는 서열을 변화시켜 얻는 의학적 치료에 사용하기 위한 포유동물 세포.
  7. 전항들 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 이소폼은 상기 표면 단백질의 상기 제2 이소폼의 아미노산 서열 중 1, 2, 3, 4 또는 5(또는 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15 또는 20)의 아미노산의 삽입, 결실 및/또는 치환에 의해 얻는 의학적 치료에 사용하기 위한 포유동물 세포.
  8. 전항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 삽입, 결실 및/또는 치환은
    a. 상이한 포유동물 종, 구체적으로 마우스, 랫트, 영장류 및 인간 호몰로그의 하나 이상의 상동 서열을 비교하고, 비-보존된 부위에서 삽입, 결실 및/또는 치환을 배치;
    b. 컴퓨터를 이용한 구조 예측이 삽입, 결실 및/또는 치환이 일어나는 구역의 2차 구조 변화를 예측하지 않도록 삽입, 결실 및/또는 치환을 선택;
    c. 컴퓨터를 이용한 구조 예측에 따라 리간드 결합에 접근할 수 있는 부위에 그것이 위치하도록 삽입, 결실 및/또는 치환을 선택;
    d. 표면 단백질의 예측 또는 실험적으로 확립된 단백질-단백질 상호작용에 관여하지 않는 서열에서 삽입, 결실 및/또는 치환을 선택;
    e. 분자 간 또는 분자 내 상호작용인 이황화 결합 또는 소수성 스태킹을 결실 또는 도입하지 않고 삽입, 결실 및/또는 치환을 선택; 및
    f. 단백질 폴딩에 중요한 번역후 단백질 변형 부위를 결실 또는 도입하지 않고 삽입, 결실 및/또는 치환을 선택하여 수행되는 의학적 치료에 사용하기 위한 포유동물 세포.
  9. 전항들 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 삽입, 결실 및/또는 치환은 상기 제1 표면 단백질의 세포외 부분, 구체적으로 세포외 루프에 위치되는 의학적 치료에 사용하기 위한 포유동물 세포.
  10. 전항들 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 상기 표면 단백질의 상기 제2 이소폼을 발현하는 세포의 특이적인 제거 전, 동시 또는 후에 투여되고,
    구체적으로 상기 표면 단백질의 상기 제2 이소폼을 발현하는 세포의 제거는 항체-유사 분자, 항체, 항체 또는 항체-유사 분자를 보유한 면역 효과기 세포 및 키메릭 항원 수용체를 보유한 면역 효과기 세포, 특히 T 세포로부터 선택되는 약제를 상기 환자에게 투여하여 수행되며,
    상기 약제는 상기 세포 표면 단백질의 상기 제2 이소폼(상기 제1 이소폼은 아님)에 특이적으로 반응하는 의학적 치료에 사용하기 위한 포유동물 세포.
  11. 전항들 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 항체 또는 항체-유사 분자, 구체적으로 상기 표면 단백질의 제2 이소폼에 대해 반응하는 키메릭 항원 수용체를 발현하는 의학적 치료에 사용하기 위한 포유동물 세포.
  12. 전항들 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표면 단백질은 CD45, CD19, CD8 및 CD4로부터 선택되고, 특히 상기 표면 단백질은 CD45인 의학적 치료에 사용하기 위한 포유동물 세포.
  13. 전항들 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 포유동물 세포는 조혈 세포(hematopoietic cell), 특히 조혈 줄기세포(hematopoietic stem cell) 또는 T 세포인 의학적 치료에 사용하기 위한 포유동물 세포.
  14. 전항들 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 상기 환자에 존재하는 질환-관련 유전자 결함을 정정하는 유전자 변이(genetic alteration)를 포함하는 의학적 치료에 사용하기 위한 포유동물 세포.
  15. 전항들 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 질환-관련 유전자 결함은 Foxp3에서의 돌연변이인 의학적 치료에 사용하기 위한 포유동물 세포.
  16. 전항들 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 치료는 T 세포 매개 질환, 특히 IPEX-유사 신드롬, CTLA-4 연관된 면역 조절 장애, 혈액탐식 신드롬(hemaphagocytic syndrome), ALPS 신드롬, 또는 이종접합 PTEN 생식세포 돌연변이에 의해 유발된 신드롬의 치료인 의학적 치료에 사용하기 위한 포유동물 세포.
  17. a. 항체 또는 항체-유사 분자를 포함하거나 이로 구성된 화합물; 및
    b. 항체 또는 항체-유사 분자를 보유한 면역 효과기 세포 또는 키메릭 항원 수용체를 보유한 면역 효과기 세포로부터 선택되고,
    약제는 표면 단백질의 제1 또는 제2 이소폼 중 어느 하나에 특이적으로 반응하며,
    상기 표면 단백질의 상기 제1 이소폼은 상기 표면 단백질의 상기 제2 이소폼과 기능적으로 구별할 수 없지만 면역학적으로 구별할 수 있고,
    약제가 반응하는 이소폼을 보유한 세포를 제거하기 위해 약제가 투여되는 질병(medical condition) 치료에 사용하기 위한 약제.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 항체 또는 항체-유사 분자는 독소, 특히 사포린과 결합되는 약제.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서,
    상기 약제는 이중특이적인 항체 또는 이중특이적인 항체-유사 분자인 약제.
  20. 제17항에 있어서,
    상기 약제는 이중특이적인 항체 또는 이중특이적인 항체-유사 분자를 보유한 면역 효과기 세포인 약제.
  21. 제17항에 있어서, 상기 약제는
    a. 제1 표면 단백질의 제1 또는 제2 이소폼 중 어느 하나에 특이적으로 반응하고, 상기 제1 표면 단백질의 상기 제1 및 상기 제2 이소폼은 기능적으로 구별할 수 없지만 면역학적으로 구별할 수 있는 제1 항체 또는 항체-유사 분자; 및
    b. 제2 표면 단백질의 제1 또는 제2 이소폼 중 어느 하나에 특이적으로 반응하고, 상기 제2 표면 단백질의 상기 제1 및 상기 제2 이소폼은 기능적으로 구별할 수 없지만 면역학적으로 구별할 수 있는 제2 항체 또는 항체-유사 분자를 보유한 면역 효과기 세포인 약제.
  22. 제17항, 제20항 또는 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제는 항체-유사 분자, 특히 키메릭 항원 수용체를 보유한 면역 효과기 세포, 특히 T 세포이고, 상기 질병은 조혈성 질환, 구체적으로 악성 조혈성 질환인 약제.
  23. 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    이식편-대-숙주 질환의 치료에 사용하기 위한 약제.
  24. a. 제1 표면 단백질에 반응하는 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 제1 약제; 및
    b. 제2 표면 단백질에 반응하는 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 제2 약제를 포함하고,
    구체적으로 조혈성 질환, 보다 구체적으로 악성 조혈성 질환의 치료를 위한 병용 의약품(combination medicament).
  25. 제24항에 있어서,
    상기 제1 및 상기 제2 약제는 키메릭 항원 수용체를 보유한 T 세포인 병용 의약품.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서,
    상기 제1 표면 단백질은 CD19이고, 상기 제2 표면 단백질은 CD45인 병용 의약품.
  27. 표면 단백질의 제1 이소폼은 상기 표면 단백질의 제2 이소폼과 기능적으로 구별할 수 없지만 면역학적으로 구별할 수 있고, 상기 제1 이소폼에 특이적으로 반응하는 리간드를 환자에게 투여하는 것을 포함하는 환자에서 표면 단백질의 제1 이소폼을 발현하는 세포의 인 비보 추적 방법.
  28. a. 세포를 제공하는 단계로, 상기 세포는 아미노산 마커가 표면 단백질의 제2 이소폼과는 상이한 상기 표면 단백질의 제1 이소폼을 발현하고, 상기 제1 이소폼은 핵산 서열 A에 의해 암호화되는 아미노산 마커 A를 포함하며, 상기 제2 이소폼은 핵산 서열 B에 의해 암호화되는 아미노산 마커 B를 포함하며;
    b. 상기 세포의 게놈 DNA에서 상기 핵산 서열 A에서 상기 핵산 서열 B까지 돌연변이를 유도하는 단계;
    c. 상기 표면 단백질의 상기 제1 또는 상기 제2 이소폼의 발현에 기초하여 상기 세포를 선택적으로 농화/고갈시키는 단계를 포함하는, 인 비보에서 세포를 선택적으로 고갈 또는 농화(enriching)하는 방법.
  29. 하기 성분들을 포함하는 키트:
    a. 세포 표면 단백질을 암호화하는 유전자의 게놈 내 위치를 표적으로 하는 유전자가위 가이드 RNA로,
    i. 상기 유전자는 핵산 마커 서열이 상이한 두 개의 이소폼으로 존재하고, 이소폼 1은 제1 마커 서열을 포함하며, 이소폼 2는 제2 마커 서열을 포함하고; 및
    ii. 상기 게놈 내 위치는 유전자가위 PAM 서열 및 상기 제1 또는 제2 마커 서열을 포함하며; 및
    b. 선택적으로, 이소폼 1 및 이소폼 2의 각각의 유전자 산물에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 항체.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 세포 표면 단백질은 쥐의 Thy1 또는 쥐의 CD45인 키트.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 세포 표면 단백질은 쥐의 CD45이고, 상기 유전자가위 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 004, SEQ ID NO: 005 및 SEQ ID NO: 006으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 키트.
  32. 하기 성분들을 포함하는 키트:
    a. 세포 표면 단백질을 암호화하는 유전자의 게놈 내 위치를 표적으로 하는 가이드 RNA로,
    i. 상기 유전자는 핵산 마커 서열이 상이한 두 개의 이소폼으로 존재하고, 이소폼 1은 제1 마커 서열을 포함하며, 이소폼 2는 제2 마커 서열을 포함하고; 및
    ii. 상기 게놈 내 위치는 PAM 서열 및 상기 제1 또는 제2 마커 서열을 포함하며; 및
    b. 다음을 포함하는 DNA 구조물,
    i. 상기 제1 마커 서열 또는 상기 제2 마커 서열;
    ii. 상기 PAM 서열로, 특히 상기 PAM 서열은 돌연변이되고 기능이 없으며,
    iii. 상기 세포 표면 단백질을 암호화하는 유전자의 상기 게놈 내 위치의 게놈 DNA 서열 5' 및 3'에 상동인 한 쌍의 호몰로지 암(homology arm); 및
    c. 선택적으로, 이소폼 1 및 이소폼 2의 각각의 유전자 산물에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 항체.
  33. 제32항에 있어서,
    상기 호몰로지 암은 각각 적어도 85 염기쌍(bp), 보다 구체적으로 각각 적어도 450 bp, 훨씬 더 구체적으로 각각 대략 2000 bp를 포함하는 키트.
  34. 제32항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포 표면 단백질은 쥐의 Thy1 또는 쥐의 CD45인 키트.
  35. 제32항에 있어서, 상기 세포 표면 단백질은 쥐의 Thy1이고,
    a. 상기 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 001이고, 상기 DNA 구조물은 SEQ ID NO: 007(돌연변이 없음), SEQ ID NO: 008(mut), SEQ ID NO: 009(4x mut), SEQ ID NO: 010(2 kb), SEQ ID NO: 011(4 kb), SEQ ID NO: 012(1 kb) 및 SEQ ID NO: 013(160 bp)으로부터 선택되고, 또는
    b. 상기 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 002이고, 상기 DNA 구조물은 SEQ ID NO: 014(120 bp) 및 SEQ ID NO: 015(180 bp)로부터 선택되는 키트.
  36. 제32항에 있어서,
    상기 세포 표면 단백질은 쥐의 CD45이고, 상기 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 003이며, 상기 DNA 구조물은 SEQ ID NO: 016, SEQ ID NO: 017(1 kb), SEQ ID NO: 018(2 kb) 및 SEQ ID NO: 019(4 kb)로부터 선택되는 키트.
  37. 제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    안정한 Cas9 발현을 위해 유전자 조작된 쥐의 T 세포를 포함하는 키트.
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