CN110191948A - 用于细胞疗法的免疫可识别的细胞表面变体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及表达表面蛋白的第一同种型的哺乳动物细胞，尤其是人细胞在患者的医学治疗中的用途，其中所述第一同种型与第二同种型在功能上无法区分，但在免疫学上可区分，所述患者具有表达所述表面蛋白的所述第二同种型的细胞。本发明还涉及选自1)包含抗体或抗体样分子或由其组成的化合物，和2)携带抗体或抗体样分子的免疫效应物细胞或携带嵌合抗原受体的免疫效应物细胞的试剂用于治疗医学病症的方法的用途，其中所述试剂对表面蛋白的第一或第二同种型具有特异性反应性，其中所述第一同种型与所述第二同种型在功能上无法区分，但在免疫学上可以区分，其中施用所述试剂以消融携带所述试剂对其具有反应性的同种型的细胞。

Description

用于细胞疗法的免疫可识别的细胞表面变体

技术领域

本发明涉及具有突变但功能性细胞表面蛋白的细胞在其中需要选择性消耗或富集细胞群的医学应用中的用途。可以通过基因编辑方法(包括DNA双链断裂的同源定向修复，特别是在CRISPR/Cas基因编辑期间)或通过使用碱基编辑器将突变但功能性细胞表面蛋白引入细胞。本发明进一步涉及在体内选择性消耗编辑细胞的试剂和方法。

背景技术

细胞疗法是非常有效的治疗选择，但通常伴有严重的不良副作用。转移细胞的转基因和/或基因工程可引起恶性转化。CAR-T细胞的转移可导致严重的中靶和脱靶效应(细胞因子释放综合征)，并且同种异体T细胞的转移可导致移植物抗宿主病(GvHD)。肿瘤学中细胞疗法的成功可能会促进细胞治疗用于其他适应症，包括非恶性疾病。为了提高细胞疗法的安全性，特别是如果用于治疗非致命性疾病，确保转移的细胞在转移后多年保持安全非常重要。在发生严重不良副作用的情况下，通过“安全或杀死开关”选择性消耗转移细胞的可能性将显著增加细胞疗法的安全性。

本发明所要解决的问题是提供一种系统，该系统用于永久地标记和追踪细胞，并允许在体外或在体内选择性地消耗标记或未标记的细胞。这些问题被独立权利要求的主题解决。

发明内容

本发明的第一方面涉及表达表面蛋白的第一同种型的哺乳动物细胞在患者的医学治疗中的用途，其中所述表面蛋白的所述第一同种型与所述表面蛋白的第二同种型在功能上无法区分，但在免疫学上可区分，所述患者具有表达所述表面蛋白的所述第二同种型的细胞。

表述“免疫学上可区分的”是指表面蛋白的第一和第二同种型可以通过特异性结合第一或第二同种型的配体来区分。

在本说明书的上下文中，表述“特异性结合”是指以解离常数K_D≤10E-7结合。

在本说明书的上下文中，表述“配体”涉及抗体或抗体样分子。抗体或抗体样分子可以与另一种分子偶联(例如在免疫毒素中)，或者可以存在于细胞，特别是免疫细胞表面。

在本说明书的上下文中，术语“抗体”以其在细胞生物学和免疫学领域中已知的含义使用；它是指完整抗体，包括但不限于免疫球蛋白G型(IgG)、A型(IgA)、D型(IgD)、E型(IgE)或M型(IgM)，其任何抗原结合片段或单链以及相关或衍生的构建体。完整抗体是包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应物细胞)和经典补体系统的第一组分。

在本说明书的上下文中，术语“抗体样分子”是指能够以高亲和力(K_D≤10E-7mol/l，特别是K_D≤10E-8)特异性结合或靶向另一分子的分子。与抗体的特异性结合类似，抗体样分子结合其靶标。术语抗体样分子包括重复蛋白，例如设计的锚蛋白重复蛋白(Molecular Partners，Zürich)、衍生自犰狳重复蛋白的多肽、衍生自富含亮氨酸的重复蛋白的多肽、affimer、抗体衍生分子，例如嵌合抗原受体(CAR)和衍生自三角四肽(tetratricopeptide)重复蛋白的多肽。

术语抗体样分子还包括衍生自蛋白A结构域的多肽、衍生自纤连蛋白结构域FN3的多肽、衍生自共有纤连蛋白结构域的多肽、衍生自脂质运载蛋白的多肽、衍生自锌指的多肽、衍生自Src同源结构域2(SH2)的多肽、衍生自Src同源结构域3(SH3)的多肽、衍生自PDZ结构域的多肽、衍生自γ-晶状体蛋白的多肽、衍生自泛素的多肽、衍生自半胱氨酸结多肽的多肽和衍生自knottin的多肽。

理想地，表面蛋白的第一和第二同种型可以通过两个配体区分，其中一个配体能够特异性识别第一同种型，而另一个配体能够特异性识别第二同种型。换言之，每种配体能够特异性结合一种同种型，但不能结合另一种同种型。即，配体能够通过仅特异性结合一种同种型而不是另一种同种型来区分两种同种型。

表述“功能上无法区分”是指第一和第二同种型能够同样在细胞内执行相同功能而没有显著损害。换言之，在功能上，第一和第二同种型在很大程度上难以区分。在某些实施方案中，轻微的功能损害是可接受的。

在本说明书的上下文中，表述“细胞表面蛋白的第一和/或第二同种型”是指细胞表面蛋白的第一和第二等位基因。

在某些实施方案中，哺乳动物细胞是人细胞。

在某些实施方案中，表面蛋白的第二同种型涉及蛋白质的野生型形式(换言之：通常在自然界中出现的形式)，并且第一同种型涉及通过在编码第二同种型的核酸序列中引入突变而获得的同种型。

在某些实施方案中，表面蛋白的第二同种型是天然同种型，第一同种型是衍生自天然同种型的基因工程化同种型。

在本说明书的上下文中，表述“天然蛋白质”是指由细胞基因组内的核酸序列编码的蛋白质，其中该核酸序列没有通过遗传操作插入或突变。换言之，天然蛋白质是这样的蛋白质：它不是转基因蛋白或基因工程化蛋白。

在某些实施方案中，表面蛋白包含细胞外多肽序列，并且与所述第二同种型相比，所述第一同种型包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15或20个氨基酸的插入、缺失和/或取代。

在某些实施方案中，表面蛋白包含细胞外多肽序列，并且与所述第二同种型相比，所述第一同种型包含1-20个，特别是1-5个，更特别是1-3个氨基酸的插入、缺失和/或取代。

在某些实施方案中，表面蛋白包含细胞外多肽序列，并且与所述第二同种型相比，所述第一同种型包含1个氨基酸的插入、缺失和/或取代。

在某些实施方案中，插入、缺失和/或取代位于不同哺乳动物物种之间非保守的位点。

在某些实施方案中，插入、缺失和/或取代不会导致表面蛋白的二级结构变化。

在某些实施方案中，根据晶体结构分析或计算机辅助结构预测，插入、缺失和/或取代位于配体结合可接近的位点。

在某些实施方案中，根据晶体结构分析或计算机辅助结构预测，插入、缺失和/或取代位于与其他哺乳动物蛋白相比具有独特拓扑结构的位点。

在本说明书的上下文中，表述“独特拓扑结构”是指仅存在于待通过1-20个氨基酸的插入、缺失和/或取代而修饰的表面蛋白中，而不存在于其他哺乳动物蛋白，尤其是不存在于其他人表面蛋白中的拓扑结构。在其他蛋白质中存在相同或非常相似的拓扑结构将阻碍识别位于所述位点的表位的特异性抗体的产生。

在某些实施方案中，插入、缺失和/或取代不位于表面蛋白的以下位点：涉及预测的或实验建立的或确认的蛋白质-蛋白质相互作用。

在某些实施方案中，插入、缺失和/或取代不会导致缺失或引入二硫键分子间或分子内相互作用，或疏水性堆积。在插入、缺失和/或取代导致缺失盐桥分子间或分子内相互作用的情况下，必须证实盐桥相互作用的这种缺失通过蛋白质内的新相互作用得到补偿。否则，应避免缺失盐桥相互作用。

在某些实施方案中，插入、缺失和/或取代不会导致对于蛋白质折叠而言重要的翻译后蛋白质修饰位点，特别是糖基化位点的删除或引入。

在某些实施方案中，插入、缺失和/或取代确实导致与蛋白质折叠无关的翻译后蛋白质修饰位点，特别是糖基化位点的删除或引入，从而产生新的表位。

在某些实施方案中，可以通过抗体样分子结合或抗体结合区分第一同种型和第二同种型。

在某些实施方案中，可以通过携带抗体的免疫效应物细胞的反应区分第一同种型和第二同种型。在某些实施方案中，可以通过携带抗体样分子的免疫效应物细胞的反应区分第一同种型和第二同种型。在某些实施方案中，可以通过携带抗体的免疫效应物细胞的反应区分第一同种型和第二同种型。在某些实施方案中，可以通过携带抗体样分子的免疫效应物细胞的反应区分第一同种型和第二同种型。在某些实施方案中，可以通过携带嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，特别是活化的T细胞的反应区分第一同种型和第二同种型。

在本说明书的上下文中，嵌合抗原受体(CAR)涉及工程化受体，其将结合特异性，特别是单克隆抗体的特异性移植到T细胞上。常见形式的CAR包括衍生自具有所需结合特异性的单克隆抗体的细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域(Gill和June,Imm Rev,2014)。细胞外结构域包含单链可变片段，其包含免疫球蛋白重链和轻链的可变区。编码这种CAR的细胞外结构域的核苷酸序列可以衍生自产生具有所需结合特异性的抗体的杂交瘤细胞(Gill和June,Imm Rev,2014；Fields,Nat Prot,2013)。

在某些实施方案中，表面蛋白选自：CD1a、CD1b、CD1c、CD1e、CD1e、CD2、CD3、CD3d、CD3e、CD3g、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8a、CD8b、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CDwl2、CD13、CD14、CD15、CD15u、CD15s、CD15su、CD16、CD16b、CD17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD44、CD45、CD45RA、CD45RB、CD45RC、CD45RO、CD46、CD47、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CD60a、CD60b、CD60c、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CD65、CD65s、CD66a、CD66b、CD66c、CD66d、CD66e、CD66f、CD68、CD69、CD70、CD71、CD72、CD73、CD74、CD75、CD75s、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85a、CD85d、CD85j、CD85k、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CD92、CD93、CD94、CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD99R、CD100、CD101、CD102、CD103、CD104、CD105、CD106、CD107a、CD107b、CD108、CD109、CD110、CD111、CD112、CD113、CD114、CD115、CD116、CD117、CD118、CD119、CD120a、CD120b、CD121a、CD121b、CD122、CD123、CD124、CD125、CD126、CD127、CD129、CD130、CD131、CD132、CD133、CD134、CD135、CD136、CD137、CD138、CD139、CD140a、CD140b、CD141、CD142、CD143、CD144、CDw145、CD146、CD147、CD148、CDw149、CD150、CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、CD156a、CD156b、CD156c、CD157、CD158e、CD158i、CD158k、CD159a、CD159c、CD160、CD161、CD162、CD163、CD164、CD165、CD166、CD167a、CD167b、CD168、CD169、CD170、CD171、CD172a、CD172b、CD172g、CD173、CD174、CD175、CD175s、CD176、CD177、CD178、CD179a、CD179b、CD180、CD181、CD182、CD183、CD184、CD185、CD186、CD191、CD192、CD193、CD194、CD195、CD196、CD197、CDw198、CD199、CD200、CD201、CD202b、CD203c、CD204、CD205、CD206、CD207、CD208、CD209、CD210、CDw210b、CD212、CD213a1、CD213a2、CD215、CD217a、CD218a、CD218b、CD220、CD221、CD222、CD223、CD224、CD225、CD226、CD227、CD228、CD229、CD230、CD231、CD232、CD233、CD234、CD235a、CD235b、CD236、CD236R、CD238、CD239、CD240CE、CD240DCE、CD240D、CD241、CD242、CD243、CD244、CD245、CD246、CD247、CD248、CD249、CD252、CD253、CD254、CD256、CD266、CD267、CD268、CD269(BCMA)、CD270、CD271、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD277、CD278、CD279、CD280、CD281、CD282、CD283、CD284、CD286、CD289、CD290、CD292、CDw293、CD294、CD295、CD296、CD297、CD298、CD299、CD300a、CD300c、CD300e、CD301、CD302、CD303、CD304、CD305、CD306、CD307a、CD307b、CD307c、CD307d、CD307e、CD308、CD309、CD312、CD314、CD315、CD316、CD317、CD318、CD319、CD320、CD321、CD322、CD324、CD325、CD326、CD327、CD328、CD329、CD331、CD332、CD333、CD334、CD335、CD336、CD337、CD338、CD339、CD340、CD344、CD349、CD350、CD351、CD352、CD353、CD354、CD355、CD357、CD358、CD360、CD361、CD362、CD363、CD364、CD365、CD366、CD367、CD368、CD369、CD370、CD371、免疫球蛋白轻链(λ或κ)、HLA蛋白和β2-微球蛋白。

在本说明书的上下文中，HLA是指“人白细胞抗原”并且包括HLA-A、HLA.B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-DM、HLA-DO、HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR。

在某些实施方案中，表面蛋白选自CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD19、CD20、CD22、CD23、CD33、CD34、CD90、CD45、CD123、CD269(BCMA)、免疫球蛋白轻链(λ或κ)、HLA蛋白和β2-微球蛋白。

在某些实施方案中，表面蛋白选自CD45、CD3、CD4、CD8a、CD8b和CD279。

在某些实施方案中，表面蛋白选自CD45、CD45RA和CD45RO。

在某些实施方案中，表面蛋白选自CD45、CD34、CD38、CD59、CD90和CD117。

在某些实施方案中，表面蛋白选自CD45、CD19、CD20、CD22、CD22、CD23、CD38、CD138、CD268、CD269(BCMA)和CD319。

在某些实施方案中，表面蛋白选自CD5、CD19、CD20、CD33、CD123、CD38和CD269。

在某些实施方案中，表面蛋白选自CD45、CD19、CD4和CD8。

在某些实施方案中，表面蛋白是CD45。

在某些实施方案中，表面蛋白是Thy1(CD90)。

在某些实施方案中，表面蛋白是CD19。

在本说明书的上下文中，“Thy1”是指“胸腺细胞抗原1”，θ；别名：CD90；UniProt IDP04216(人)。

在本说明书的上下文中，“CD45”是指“蛋白酪氨酸磷酸酶，受体类型，C(Ptprc)”；UniProt ID P08575(人)。

在实施例部分的动物实验中，CD45和CD90分别指人基因和蛋白质的鼠同源物。权利要求30-31和34-36特别涉及鼠同源物：“鼠CD45”和“鼠CD90/Thy1”。

在某些实施方案中，表面蛋白是CD4。在某些实施方案中，表面蛋白质是CD2。在某些实施方案中，表面蛋白是CD8。在某些实施方案中，表面蛋白质是HLA蛋白。

在某些实施方案中，患者的天然基因组DNA没有编码表面蛋白的第一同种型。

在某些实施方案中，细胞是同种异体细胞。同种异体细胞是指源自在遗传上与接受细胞的人相似的供体的细胞。供体可以是相关的或不相关的人。

在某些实施方案中，细胞是自体细胞。同种异体细胞是指来自接受细胞的同一个人的细胞。

在某些实施方案中，通过改变患者天然基因组DNA中编码所述表面蛋白的序列获得第一同种型，导致诱导氨基酸的所述插入、缺失和/或取代。

在某些实施方案中，通过RNA编辑技术改变编码所述表面蛋白的mRNA来获得第一同种型(Zhang，2017)。该方法使基因组DNA保持不变，但导致在表面蛋白的氨基酸序列中氨基酸的插入、缺失和/或取代。

在某些实施方案中，通过在所述表面蛋白的所述第二同种型的氨基酸序列中诱导1、2、3、4或5(或甚至6、7、8、9、10、11、12、15或20)个氨基酸的插入、缺失和/或取代来获得第一同种型。

在某些实施方案中，通过在所述表面蛋白的所述第二同种型的氨基酸序列中诱导1-20，特别是1-5，更特别是1-3个氨基酸的插入、缺失和/或取代来获得第一同种型。

在某些实施方案中，通过在所述表面蛋白的所述第二同种型的氨基酸序列中诱导1个氨基酸的插入、缺失和/或取代来获得第一同种型。

氨基酸的插入、缺失和/或取代可以通过改变患者天然基因组DNA中编码所述表面蛋白的序列(基因编辑)，或通过改变编码所述表面蛋白的mRNA(RNA编辑)来实现。两种形式的编辑都导致蛋白质氨基酸序列的变化。

在某些实施方案中，插入、缺失和/或取代通过以下来实现：

a.比较(比对)不同哺乳动物物种的一个或几个同源序列，特别是小鼠、大鼠、灵长类动物和人同系物，并将插入、缺失和/或取代定位于非保守位点；

b.选择插入、缺失和/或取代，以便晶体结构分析或计算机辅助结构预测没有预测经受插入、缺失和/或取代的管道的二级结构变化；

c.选择插入、缺失和/或取代，以便根据晶体结构分析或计算机辅助结构预测，使其位于配体结合可接近的的位点；

d.在不涉及表面蛋白的预测的或实验建立的蛋白质-蛋白质相互作用的序列中选择插入、缺失和/或取代；

e.选择插入、缺失和/或取代而不删除或引入二硫键分子间或分子内相互作用，或疏水性堆积；或

f.选择插入、缺失和/或取代而不删除或引入对蛋白质折叠而言很重要的翻译后蛋白质修饰位点，特别是糖基化位点。

在某些实施方案中，插入、缺失和/或取代通过以下来实现：

a.比较(比对)不同哺乳动物物种的一个或几个同源序列，特别是小鼠、大鼠、灵长类动物和人同系物，并将插入、缺失和/或取代定位于非保守位点；

b.选择插入、缺失和/或取代，以便晶体结构分析或计算机辅助结构预测没有预测经受插入、缺失和/或取代的管道的二级结构变化；

c.选择插入、缺失和/或取代，以便根据晶体结构分析或计算机辅助结构预测，使其位于配体结合可接近的的位点；

d.在不涉及表面蛋白的预测的或实验建立的蛋白质-蛋白质相互作用的序列中选择插入、缺失和/或取代；

e.选择插入、缺失和/或取代而不删除或引入二硫键分子间或分子内相互作用，或疏水性堆积；和

f.选择插入、缺失和/或取代而不删除或引入对蛋白质折叠而言很重要的翻译后蛋白质修饰位点，特别是糖基化位点。

在某些实施方案中，选择插入、缺失和/或取代，使得根据晶体结构分析或计算机辅助结构预测，其位于与其他哺乳动物蛋白质相比具有独特拓扑结构的位点。

在本说明书的上下文中，非保守位点涉及在进化时间内经常发生突变的位点，如大量同源序列的多序列比对(MSA)所估计的。位点特异性的保守表明存在作用于特定位点的功能或结构限制，从而允许评估它们在保持蛋白质结构或功能方面的重要性。从可获得的实验确定的结构预测或观察到的每个位点的溶剂可及性状态可用于区分结构上重要的位点(通常是高度保守且被掩藏的)和参与配体结合、底物结合或蛋白质-蛋白质相互作用的功能上重要的位点(高度保守且暴露的)。因此，在本说明书的上下文中，非保守位点涉及显示低进化保守性和高溶剂可及性的位点。

用于搜索相似序列的方法已经很好地建立并且常规地用于推断同源性，并且这些方法包括广泛使用的BLAST工具以及更敏感的基于图谱(profile-based)或基于隐马尔可夫模型的方法，例如PSI-BLAST、HMMER、HHblits。

同源序列的多序列比对可以通过以下获得：如在T-COFFEE中所实施的局部和全局比对信息的有效组合，或者在可能的情况下，通过结合结构信息来指导MSA构建(MAFFT、PROMALS3D、3D Coffee)。

从MSA有效估计位点特异性的保守的方法基于香农熵测量、基于相似性的矩阵(即BLOSUM)，或概率进化模型，如最大似然和经验贝叶斯范例(Rate4Site)。

用于预测三维蛋白质结构的有效方法包括但不限于基于比较的方法，例如SWISS-MODEL、MODELLER、RaptorX和IntFOLD。

预测B细胞表位的方法使用氨基酸物理化学性质，即疏水性，柔性、极性和暴露表面，以提供使其成为不连续或线性表位的一部分的基于残基的概率。这些工具包括但不限于：Ellipro、SEPPA、BepiPred、ABCpred、DiscoTope、EpiSearch。

在某些实施方案中，插入、缺失和/或取代位于所述第一表面蛋白的细胞外部分中，特别是在细胞外环中。细胞外环的突变不太可能影响蛋白质功能。

在对目标表面蛋白具有反应性的抗体或抗体样分子已经存在的情况下，该抗体识别目标表面蛋白的哪一个表位这一信息可用于选择插入、缺失和/或取代的位点。然后，包含与现有抗体结合的表位的目标蛋白的同种型将对应于第二同种型，并且包含工程化表位的目标蛋白的新的工程化同种型将对应于第二同种型。

CDR建模在Messih,Bioinformatics,2014中描述。

在某些实施方案中，在表达所述表面蛋白的所述第二同种型的细胞特异性消融之前、同时或之后施用细胞。在某些实施方案中，通过向所述患者施用选自以下的试剂消融表达所述表面蛋白的所述第二同种型的细胞：抗体样分子、抗体、携带抗体或抗体样分子的免疫效应物细胞、携带嵌合抗原受体的免疫效应物细胞，特别是T细胞，其中所述试剂对所述细胞表面蛋白的所述第二同种型(但不是所述第一同种型)具有特异性反应性。

在某些实施方案中，细胞表达与所述表面蛋白的第二同种型反应的抗体或抗体样分子。

在某些实施方案中，细胞表达与所述表面蛋白的第二同种型反应的嵌合抗原受体。

在某些实施方案中，细胞表达与表面蛋白的第二同种型反应的抗体或抗体样分子，特别是嵌合抗原受体，并且表面蛋白选自CD45、CD19、CD8和CD4，特别地，表面蛋白是CD45。

在某些实施方案中，细胞表达：

a.第一表面蛋白的第一同种型，其中所述第一表面蛋白的所述第一同种型与所述第一表面蛋白的第二同种型在功能上无法区分，但在免疫学上可区分，和

b.第二表面蛋白的第一同种型，其中所述第二表面蛋白的所述第一同种型与所述第二表面蛋白的第二同种型在功能上无法区分，但在免疫学上可区分。

在某些实施方案中，第一表面蛋白是CD19，第二表面蛋白是CD45。

在某些实施方案中，哺乳动物细胞选自造血干细胞(血细胞)、CD4+T细胞、CD8+T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞(T reg)，天然杀伤细胞(NK)、先天性淋巴细胞(ILC)、树突细胞(DC)、B淋巴细胞、粘膜相关不变T细胞(MAIT)和γδT细胞(γδT)。

在某些实施方案中，哺乳动物细胞是造血细胞。在某些实施方案中，哺乳动物细胞是造血干细胞。在某些实施方案中，哺乳动物细胞是免疫细胞。在某些实施方案中，哺乳动物细胞是T细胞。在某些实施方案中，哺乳动物细胞是B细胞。

在某些实施方案中，细胞包含纠正或抵消所述患者中存在的疾病相关的基因缺陷的遗传改变。表述“纠正疾病相关的基因缺陷的遗传改变”是指包括转基因的插入、疾病相关突变的遗传纠正、基因的缺失、特别是携带疾病相关突变的基因的缺失、对基因表达而言重要的表观遗传修饰的变化，或其组合。表述“基因的缺失”是指包括基因的功能性缺失，即，阻止基因表达，例如通过插入提前终止密码子或插入调节性抑制序列。

在某些实施方案中，细胞包含转基因。在某些实施方案中，转基因是编码受疾病相关基因缺陷影响的蛋白质的功能性同种型的核酸序列。转基因不携带疾病相关的基因缺陷。

在某些实施方案中，细胞包含疾病相关突变的遗传纠正。在其中细胞包含疾病相关基因缺陷的遗传纠正的情况下，使用基因编辑技术纠正天然基因中的致病突变。

在本说明书的上下文中，基因编辑或基因工程涉及在活生物体基因组中实现核酸序列的插入、缺失或置换的技术。基因编辑涉及基因组DNA中的位点特异性双链断裂或位点特异性单链断裂(缺口)。作为非限制性实例，基因编辑可以通过以下实现：CRISPR/Cas介导的位点特异性双链断裂然后是HDR，或通过使用位点特异性碱基编辑器。

在某些实施方案中，疾病相关基因缺陷是选自以下基因中的突变：Foxp3基因、CD25基因、Stat5b基因、Stat1基因和Itch基因。

在某些实施方案中，疾病相关基因缺陷是Foxp3基因中的突变。

某些实施方案涉及向患者施用哺乳动物细胞后发生移植物抗宿主病(GvHD)的情况。在这些情况下，通过向患者施用特异性结合所述细胞表面蛋白的所述第一同种型(但不是所述第二同种型)的抗体或抗体样分子，或与所述细胞表面蛋白的所述第一同种型(但不是所述第二同种型)特异性反应的免疫效应物细胞，特别是CAR-T细胞来特异性地消融细胞。

在某些实施方案中，治疗包括造血干细胞移植。

在某些实施方案中，治疗包括T细胞移植(即：T细胞疗法)。

在某些实施方案中，治疗包括器官移植。

在某些实施方案中，治疗涉及遗传性造血系统疾病的治疗。遗传性造血系统疾病的非限制性实例是地中海贫血。

在某些实施方案中，治疗涉及T细胞介导的疾病的治疗，特别是遗传性T细胞介导的疾病，更特别是IPEX样综合征、CTLA-4相关免疫失调、血细胞综合征、ALPS综合征，或由杂合PTEN种系突变引起的综合征。

在某些实施方案中，T细胞介导的疾病是免疫失调性多内分泌病变肠病X连锁综合征(IPEX；OMIM http://www.omim.org/entry/304790)或IPEX样综合征，并且所述基因组位置是选自以下的基因包含的突变：Foxp3基因、CD25基因、Stat5b基因、Stat1基因和Itch基因(Verbsky and Chatila,Curr Opin Pediatr.2013Dec；25(6):708-14)。所述基因中的突变阻止基因产物的表达或正常功能。编辑这些基因组位置以消除突变可恢复基因和蛋白质表达。

在某些实施方案中，治疗涉及免疫缺陷的治疗，特别是严重联合免疫缺陷综合症(SCID)。

在某些实施方案中，疾病相关基因缺陷是Foxp3基因中的突变，并且所述疾病是免疫失调性多内分泌病变肠病X连锁综合征(IPEX)。在某些实施方案中，疾病相关基因缺陷是Foxp3中的突变，特别是Foxp3^K276X突变。这种突变阻止基因产物的正常功能。编辑该基因组位置将突变恢复为突变的野生型DNA序列，从而恢复Foxp3基因和Foxp3蛋白表达(图20)。

IPEX可以被认为是与肿瘤/癌症相当的恶性疾病，因为它非常具有侵略性，尽管它具有不同的机制。消融携带疾病相关基因缺陷的致病性造血/免疫细胞是合理的，至少是短暂的。

在本说明书的上下文中，术语“Foxp3基因”涉及人叉头盒P3，NCBI基因ID：50943。在实施例部分中描述的动物实验中，通过基因编辑修复鼠Foxp3^K276X突变。该突变概括了临床相关的人Foxp3突变(Ramsdell等,Nature reviews.Immunology 14,343-349(2014)；Lin等,The Journal of allergy and clinical immunology 116,1106-1115(2005))。

发明人已经表明，可以使用基因编辑来纠正鼠T细胞中的Foxp3^K276X突变(图20、21、22、26)。发明人进一步证明，修复的T细胞是功能性的并且可以抑制其他免疫细胞(图24、25)。这些T细胞可以是直接修复的HSC，也可以衍生自修复的HSC或iPS衍生的T细胞。发明人进一步证明，过继转移的T细胞在缺乏Foxp3的宿主中扩增。多达一半的T细胞变成Treg并抑制疾病(图29)。这证明了T细胞疗法治疗scurfy/IPEX综合征的可行性。发明人已经表明，CD4消耗可以预防疾病(图30-32)。因此，CD4+细胞是致病细胞。因此，原则上治疗方法可以是消耗CD4+T细胞，然后转移Foxp3修复的CD4+T细胞以恢复免疫平衡。然而，由于基因修复的T细胞和致病性Foxp3缺陷型T细胞均表达CD4，CD4+T细胞的持续消耗不仅会杀死致病细胞，还会杀死过继转移的基因修复细胞。一种解决方案是同时纠正Foxp3基因并同时进行等位基因工程。发明人证明了纠正Foxp3基因并将CD45.2转化为CD45.1的可行性(图20)。因此，使用针对天然CD45表位(例如CD45.2)的抗体可以消耗致病性Foxp3缺陷细胞。如果Foxp3修复的细胞转化为工程化的CD45等位基因(例如CD45.1)，那么转移的基因修复的细胞将不再被消耗。这允许同时消耗致病细胞并补充功能性修复细胞直至恢复免疫平衡。此时，可以停止对致病宿主细胞的选择性消融。事实上，发明人已经表明，CD45消耗实质上增加了Foxp3缺陷型小鼠的存活。

此外，Foxp3基因纠正的细胞不仅在体外和在体内重新表达Foxp3蛋白，还上调CD25(高亲和力白细胞介素-2(IL-2)受体)(图20、21、22、26)。在生理学上，Foxp3正调节野生型T细胞中的CD25表达，并且IL-2/CD25/Stat5轴是调节性T细胞存活所必需的。因此，发明人推测，通过治疗性施用IL-2可以在体内扩增基因纠正的重新表达Foxp3的T细胞(图23)。已经确定，使用IL-2/抗IL-2mAb复合物、低剂量IL-2疗法、(工程化的)IL-2变体、其他Treg扩增方案，可以在体内扩增T细胞。图27表明使用IL-2/抗IL-2mAb复合物可以在体内扩增修复的T细胞。

在某些实施方案中，疾病相关基因缺陷是CTLA-4基因包含的突变，并且该疾病是与CTLA-4突变相关的人免疫失调综合征(Schubert等,Science Translational Medicine5,215ra174-215ra174(2013)；Kuehn等,Science(New York,N.Y.)345,1623-1627(2014))。

本发明的第二方面提供选自以下的试剂用于治疗医学病症的用途：

a.包含抗体或抗体样分子或由其组成的化合物，和

b.携带抗体样分子的免疫效应物细胞或携带嵌合抗原受体的免疫效应物细胞。

该试剂对表面蛋白的第一或第二同种型具有特异性反应性，其中表面蛋白的第一同种型与表面蛋白的第二同种型在功能上无法区分，但在免疫学上可以区分。施用试剂以消融携带试剂对其具有反应性的同种型的细胞。

在某些实施方案中，医学病症是造血系统疾病。

在某些实施方案中，医学病症是恶性造血系统疾病。

在某些实施方案中，医学病症是对用抗CD19CAR T细胞(＝CAR19细胞)治疗具有反应性的恶性造血系统疾病。

在某些实施方案中，医学病症是非恶性造血系统疾病。

在某些实施方案中，医学病症是自身免疫疾病。

在某些实施方案中，医学病症是移植物抗宿主病(GvHD)。

在本说明书的上下文中，移植物抗宿主病涉及从遗传上不同的人接收移植组织后的医学并发症。捐赠组织(移植物)中的免疫细胞将接受者(宿主)识别为外来的。

在某些实施方案中，医学病症是由造血干细胞移植引起的移植物抗宿主病。

在某些实施方案中，医学病症是由过继转移引起的移植物抗宿主病。在本说明书的上下文中，过继转移或过继细胞疗法涉及将人细胞(通常是免疫细胞)转移到患者体内。细胞可以是自体的或同种异体的。通过基因编辑技术实现的靶向修饰允许定制转移的细胞产物以修复遗传缺陷，提高转移细胞的效率或为细胞配备额外的所需特征，例如引导分子或安全开关。

在某些实施方案中，医学病症是由器官移植引起的移植物抗宿主病。

在某些实施方案中，抗体或抗体样分子与毒素偶联，从而形成免疫毒素。在某些实施方案中，抗体或抗体样分子与皂草素偶联。

在某些实施方案中，试剂是双特异性抗体或双特异性抗体样分子。换言之，试剂是可以同时结合两种不同类型抗原的抗体或抗体样分子。

在某些实施方案中，试剂是携带双特异性抗体或双特异性抗体样分子的免疫效应物细胞。

在某些实施方案中，试剂是携带以下的免疫效应物细胞：

a.第一抗体或抗体样分子，其对第一表面蛋白的第一或第二同种型具有特异性反应性，其中所述第一表面蛋白的所述第一和所述第二同种型在功能上无法区分，但在免疫学上可区分，和

b.第二抗体或抗体样分子，其对第二表面蛋白的第一或第二同种型具有特异性反应性，其中所述第二表面蛋白的所述第一和所述第二同种型在功能上无法区分，但在免疫学上可区分。

在某些实施方案中，第一表面蛋白是CD19。

在某些实施方案中，第二表面蛋白是CD45或CD34。

在某些实施方案中，第一表面蛋白是CD19，且第二表面蛋白是CD45。

在某些实施方案中，试剂是携带抗体或抗体样分子的免疫效应物细胞，或携带嵌合抗原受体的免疫效应物细胞，特别是T细胞，其用于治疗恶性造血系统疾病的方法。

在某些实施方案中，试剂是携带针对CD45的嵌合抗原受体的T细胞，其用于治疗造血系统疾病，特别是恶性造血系统疾病的方法。

CD45是治疗造血系统疾病的特别好的靶标，因为它在所有造血细胞(包括恶性细胞)上表达。CD45对细胞存活至关重要，因此细胞在产生抗性方面会有更多困难。

本发明的另一方面提供了一种组合药物，其包含：

a.根据本发明第二方面的第一试剂，其中所述试剂对第一表面蛋白具有反应性，和

b.根据本发明第二方面的第二试剂，其中所述试剂对第二表面蛋白具有反应性。

在某些实施方案中，提供组合药物用于治疗造血系统疾病。

在某些实施方案中，提供组合药物用于治疗恶性造血系统疾病。

在某些实施方案中，提供组合药物用于治疗非恶性造血系统疾病。

在某些实施方案中，第一和第二试剂是携带嵌合抗原受体的T细胞。

在某些实施方案中，第一表面蛋白是CD19，且第二表面蛋白是CD45。

在某些实施方案中，第一试剂是抗CD19CAR T细胞，且第二试剂是抗CD45CAR T细胞。

在某些实施方案中，恶性造血系统疾病对单独用抗CD19CAR T细胞(＝CAR19细胞)治疗是有反应的。

本发明的另一方面提供在体内追踪表达表面蛋白的第一同种型的细胞的方法，其中所述表面蛋白的所述第一同种型与所述表面蛋白的第二同种型在功能上无法区分，但在免疫学上可区分，所述方法包括向所述患者施用对所述第一同种型具有特异性反应性的配体。

本发明该方面的替代方案提供了一种用于在衍生自患者的组织中追踪表达表面蛋白的第一同种型的细胞的方法，其中所述表面蛋白的所述第一同种型与所述表面蛋白的第二同种型在功能上无法区分，但在免疫学上可区分，所述方法包括向衍生自所述患者的所述组织施用对所述第一同种型具有特异性反应性的配体。

在本发明该方面的某些实施方案中，衍生自患者的组织涉及血液样品。可以使用FACS分析这种血液样品。在本发明该方面的某些实施方案中，衍生自患者的组织涉及器官的组织样品，例如活组织检查，例如肝脏样品。可以使用组织学方法分析这种组织样品。

本发明的又一方面提供了一种在体内选择性消耗或富集细胞的方法，包括以下步骤：

a.提供细胞，其中所述细胞表达表面蛋白的第一同种型，其与所述表面蛋白的第二同种型在氨基酸标志物方面不同，其中所述第一同种型包含由核酸序列A编码的氨基酸标志物A，所述第二同种型包含由核酸序列B编码的氨基酸标志物B；

b.在所述细胞的基因组DNA中诱导从所述核酸序列A到所述核酸序列B的突变；

c.基于所述表面蛋白的所述第一或所述第二同种型的表达选择性富集/消耗所述细胞。

在本说明书的上下文中，术语“选择性消耗细胞”涉及选择性地降低表达某标志物/等位基因/同种型的细胞的总数或浓度。

技术人员知道，在限定体积包含表达第一同种型的细胞和表达第二同种型的细胞的情况下，选择性消耗表达第一同种型的细胞对应于富集表达第二同种型的细胞。

作为非限制性实例，选择性消耗可通过以下来实现：补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体-药物偶联物(ADC)或通过反应细胞，特别是携带天然抗原受体或嵌合抗原受体(CAR)的免疫受体细胞。选择性消耗也可以通过施用不与效应物化合物如药物或毒素偶联的抗体或抗体样分子来实现。

发明人已经证明，分别使用针对CD45.2或CD45.1的抗体可以在体内选择性地消耗(图12)。使用针对两个细胞群(例如CD45.2+和CD45.1+T细胞)共有的表位的抗体导致两个细胞群的非选择性消耗(例如抗CD4消耗)。相反，用选择性结合通常表达的表面蛋白的一个(例如CD45.2)而不是另一个(例如CD45.1)等位基因的抗体消耗仅消耗表达被特定mAb结合的等位基因的细胞。在所示的实施例中，消耗CD45.2+细胞保留了CD45.1+细胞，因此导致CD45.1+细胞的相对富集。如果毒素与mAb偶联，消耗可以更有效。

使用未与毒素偶联的抗体或抗体样分子的优点可以是使用免疫毒素的治疗导致HSC消耗，而使用未与毒素偶联的抗体或抗体样分子的治疗保留HSC。这可能是期望的，因为部分保留了造血系统。

如EP16196860.7、EP16196858.1、PCT/EP2017/059799中所示，发明人已经证明，可以在细胞中工程化入单个氨基酸差异，并且可以通过特异性结合两种同种型/等位基因(天然vs工程化)的两种不同配体来区分。在内源表面表达的基因中工程化入特别设计的人工突变或罕见但天然存在的突变(例如单核苷酸多态性(SNP)以改变其抗原性。技术人员知道，可以通过本领域已知的任何方法引入该突变，包括HDR和碱基编辑。随后利用这种改变的表位用配体选择性地消耗成功编辑的细胞，所述配体特异性地和选择性地识别该人工表位。或者，通过识别天然表位(因此可以消耗宿主细胞)但不识别改变表位的配体使编辑的细胞抵抗消耗，从而保留转移的细胞。

在“编辑/工程化细胞”(其中细胞表面蛋白的第一同种型已经变为第二同种型的细胞)随后用于移植，特别是过继转移的情况下，两种不同的同种型可用于区分转移细胞和宿主细胞。这使得能够追踪转移细胞，因为它们被永久标记。可以用标记的配体在体内或离体实现追踪，例如，通过细胞或组织的流式细胞术或组织化学。体内应用对转移细胞或宿主细胞具有特异性的配体能够使用分别只与转移的工程化细胞或宿主细胞结合的抗体选择性地消除转移细胞或宿主细胞。选择性细胞消耗也可以通过携带识别转移细胞或宿主细胞的天然或嵌合抗原受体(CAR)的细胞来实现。

工程化细胞的选择性消耗通过提供“安全或杀死开关”构成了重要的安全特征。Jones等,Front Pharmacol.；5:254.doi:10.3389中描述了安全开关和自杀基因的基本概念。发明人的方法更简单，更安全且更通用。原则上，任何过继转移的细胞均可以被工程化以携带改变的等位基因/表位作为组合的在体外或体内的选择、追踪、安全和/或选择性消融开关。非排他性实例包括仅携带工程化等位基因但不进行基因工程改造的细胞或携带额外工程化特征的细胞，例如CAR细胞。例如，使用其移植物抗白血病作用的同种异体细胞的转移可引起移植物抗宿主病(GvHD)。如果在转移之前掺入工程化的等位基因，则可以通过工程化的等位基因消除它们以减少/治疗GvHD(图2)。类似地，如果由于脱靶效应或过于激烈的中靶效应发生不良副作用，可以将转移的自体肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)或病原体特异性淋巴细胞工程化以携带改变的等位基因来消除它们(图2)。CAR可以衍生自mAb，以将已知mAb的特异性与细胞(例如，杀伤T细胞)的特征相结合。通过引入CAR将给定(T)细胞的杀伤(或抑制)活性重定向到特定的目标抗原这一原理在原则上适用于一系列广泛的疾病，包括恶性肿瘤、自身免疫性疾病、移植或其它造血系统疾病。CAR19T细胞的成功证明了CAR细胞作为治疗剂的潜力。然而，重要的是，虽然CAR19T细胞对治疗某些CD19+肿瘤非常有效，但对各种不同靶分子具有反应性的几种CAR T细胞可能具有严重的，有时是致命的副作用，例如细胞因子释放综合征和/或神经毒性(在几种靶向CD19，但也靶向其他靶标，包括但不限于CD123的CAR构建体中证实)。因此，转移后控制/消除CAR T细胞的能力很重要(图2、10、19)。在CAR细胞的情况下，改变的等位基因可以用作安全开关。此外，转移的工程化细胞也可以被消除，以防它们变成恶性或引起任何类型的不希望的中靶或脱靶损伤(可能在数年之后)。或者，可以选择性地消融引起疾病的宿主细胞，同时保留自体的工程化细胞。与发明人的方法相反，现有技术局限于消融转移细胞，但不容易消融宿主细胞。改变的同种型允许在消融宿主细胞期间转移例如基因修复的或工程化的自体细胞。在没有通过本发明方法引入的同种型开关的情况下，当转移健康细胞时，需要停止宿主细胞消融。在这种情况下，当新转移的修复细胞扩增时，宿主细胞也将扩增并且不再能够被消融，从而产生引起疾病的宿主细胞将胜过修复细胞的风险。因此，通过本发明的方法使工程化细胞抵抗消耗作为治疗方法是高度相关的。例如，可以在自体造血细胞中突变抗CD19-CAR细胞识别的CD19表位，使得耗尽的抗CD19mAb或抗CD19-CAR细胞不再能够结合并破坏工程化细胞，但CD19将保留功能。这将消除当今有效的抗CD19-CAR细胞的主要并发症。虽然抗CD19-CAR消除表达CD19的造血系统恶性肿瘤具有非常高的成功率，但它们总是导致消除表达CD19的健康宿主细胞。这会导致低丙种球蛋白血症，从而增加感染风险。突变的CD19将允许用健康的自体造血干细胞(HSC)重新构建宿主免疫系统，这将产生对抗CD19-CAR细胞具有抗性的B细胞。因此，CAR 19T细胞可以持续预防复发，而编辑的抗性细胞将提供免于感染的天然保护。因此，患者将不再依赖IVIG输注。可能通过非基因毒性预处理(例如，通过抗体)实现部分嵌合的HSC移植(Nat Biotech，2016)。或者，可以使用识别在普通人群中发现的表位(例如类似于CD45.2)的抗CD45-CAR细胞消除所有造血宿主细胞，包括恶性或其它引起疾病的造血细胞。CD45是一个很好的靶标，因为它在所有造血细胞(包括大多数恶性细胞)上表达。此外，CD45对淋巴细胞的存活至关重要，因此如果被CAR T细胞靶向，则细胞不太可能下调CD45或突变CD45以逃避CAR T细胞的靶向。这样可以降低复发的风险。如CD45.2至CD45.1转换实验所证实，移植健康的自体造血干细胞(HSC)或携带工程化CD45表位(例如CD45.1)的其他造血细胞将允许重新构建具有健康造血系统的宿主，所述健康造血系统将不再被抗CD45-CAR细胞消耗。一个主要的优点是可以靶向所有表达CD45的恶性肿瘤(包括但不限于T细胞和骨髓恶性肿瘤)，而不需要肿瘤或细胞类型特异性抗原，即，本发明将提供一种普遍适用的治疗造血系统恶性肿瘤和其他非恶性血液疾病的系统。这将克服CAR-T疗法的主要障碍：鉴定合适的靶标抗原(Klebanoff，Nat Med2016)。因此，它可以实质上扩展适合CAR-T疗法的疾病适应症。尽管CAR-T疗法在治疗CD19+肿瘤方面非常成功，但其他造血系统恶性肿瘤也是一项重大挑战。例如，治疗多发性骨髓瘤仍然是一项重大挑战，部分原因是缺乏合适的靶标抗原(Mikkilineni，Blood，2017；Sadelain，Nature 2017)。此外，可以在不需要同种异体细胞的情况下治疗造血系统肿瘤，因此消除作为主要并发症的GvHD。此外，重新构建可以在消耗阶段开始，这将缩短恢复时间。重要的是，用于使转移的细胞抵抗消耗的突变随后也可用于在必要时再次消耗那些细胞。CAR细胞依赖性的HSC消耗可以潜在地用作实现温和的(即非遗传毒性)预处理的替代方式。CAR45细胞也会消除HSC。可以使用CAR45实现目前用于“骨髓”或HSC移植的“命中和替换”策略。可以使用CAR45，而不是使用毒性的化疗和辐射实现患者的预处理。使用CAR45细胞去除HSC和造血系统并用等位基因工程化的抗性HSC替换它的优点是可以消除危险的移植后时间，因为可以在消融不需要的细胞期间开始造血系统重新构建。因此，患者总是具有功能性免疫系统，而不是经历延长阶段的骨髓耗竭和免疫抑制。因此，发明人的策略可以消除作为当前HSC移植的主要并发症的感染。针对抗原或抗原组合以将靶细胞特异性限制于HSC的CAR细胞可用于消耗内源性HSC。这可以是例如抗-CD45或抗-CD34加在合成生物学方法中的第二抗原(例如，具有AND门控)以特异性且专门性地将CAR细胞导向HSC。

CAR45治疗与用等位基因工程改造的HSC替代造血系统的组合可以用作CAR19疗法的替代(因为所有CD19+细胞也表达CD45)，或者它可以用作CAR19加CAR45的组合疗法。CAR45疗法也可用于在CAR19治疗后复发的CD19阴性或CD19突变的恶性肿瘤。

本发明的这个方面代表了替换细胞的通用策略。细胞可以是自体或同种异体的造血细胞。如果替换细胞是HSC，则所述方法可用于治疗任何造血系统恶性肿瘤或其他造血系统疾病。

与现有的“安全开关”方法相比，本发明人的方法的其他优点包括以下内容。发明人的方法使用内源蛋白质。不必在细胞中引入转基因或标签。这两个表位在功能上是相同的，但可以通过特异性结合配体来区分。取决于使用哪种配体，该方法能够消耗转移细胞或宿主细胞两者。由于在基因组中引入设计的突变，安全特征永久地保留在细胞中并且不会沉默，所述沉默可发生在病毒引入的转基因安全开关上。此外，工程化表位的抗原性低于人工大型安全开关/自杀基因构建体，因此不太可能被宿主细胞排斥。此外，工程化同种型的使用依赖于靶向突变，因此可能比通常通过病毒递送随机整合到基因组中从而可导致插入突变的其他安全开关/自杀基因更安全(Cornu，Nat Med，2017)。

技术人员知道，为了将细胞表面蛋白从第一同种型变为第二同种型，可以应用代替HDR的其他方法。作为非限制性实例，可以使用在以下出版物中所述的碱基编辑器来实现同种型转换：Komor et al.,Nature 533,420–424,doi:10.1038/nature17946。通过允许编辑所需的氨基酸而不需要dsDNA断裂，该方法可以进一步提高安全性。碱基编辑器或相关技术可以作为质粒或小环(dsDNA)、mRNA或RNP递送。

在细胞表面蛋白的第一同种型转换为第二同种型与修复致病基因(例如Foxp3基因)相结合的情况下，可以通过消耗表达第一同种型的细胞在体内消耗未修复的细胞(即，在转移到宿主中之后)。本发明人已经证明，在同种型转换和基因缺陷修复均通过HDR实现的情况下，在已发生同种型转换的细胞中成功修复基因的可能性增加(图20)。将第一基因的同种型转换与第二基因的遗传修饰组合允许在遗传工程化细胞中包括安全特征。

同种型转换也可用作标志物以追踪宿主中经编辑的转移细胞。

根据另一方面，提供了一种用于在未编辑和编辑细胞的组合物中选择性消耗或富集细胞的方法，其中该方法包括以下步骤：

a.提供细胞，其中所述细胞表达表面蛋白的第一同种型，其与所述表面蛋白的第二同种型在氨基酸标志物方面不同，其中所述第一同种型包含由核酸序列A编码的氨基酸标志物A，所述第二同种型包含由核酸序列B编码的氨基酸标志物B；

b.在所述细胞中通过位点特异性遗传操作诱导核酸序列A变为核酸序列B，从而在所述细胞中将表达第一同种型变为表达第二同种型；

c.基于所述表面蛋白的所述第一或所述第二同种型的表达选择性富集/消耗所述细胞。

在某些实施方案中，导致所述氨基酸的插入、缺失和/或取代的遗传操作通过以下实现：由CRISPR相关核酸内切酶(Cas9)和向导RNA诱导双链断裂后进行同源定向修复，其中所述向导RNA能够与所述第一基因组位置退火。

在本说明书的上下文中，“CRISPR相关核酸内切酶”是指本领域已知的Cas9核酸内切酶，其促进CRISPR样序列引导的DNA链的切割。CRISPR相关核酸内切酶的非限制性实例是化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9核酸内切酶(SpyCas9)、弗朗西斯菌(Francisella)(FnCpf1)、氨基酸球菌(Acidaminococcus)(AsCpf1)和毛螺菌科(Lachnospiraceae)细菌(LbCpf1)的Cpf1核酸内切酶，以及SpyCas9、FnCpf1、AsCpf1的任何工程化蛋白变体或它们的直系同源物。技术人员知道，本发明还包括新发现或工程化的CRISPR/Cas变体。

在本说明书的上下文中，术语“直系同源物”是指通过垂直下降从单个祖先基因进化而来的基因及其相应的多肽。换言之，直系同源基因/多肽具有共同的祖先，并且当一个物种分成两个独立的物种时被分开。然后将两个所得物种中单个基因的拷贝称为直系同源物。为了确定两个基因是直系同源物，本领域技术人员可以通过比较对齐的基因或多肽的核苷酸或氨基酸序列来进行基因谱系的系统发育分析。

在本说明书的上下文中，术语“向导RNA”是指能够将CRISPR相关核酸内切酶引导至目标基因组位置的合成RNA(其中核酸内切酶将切割基因组DNA中的磷酸二酯键)。技术人员知道，如果使用Cas9核酸内切酶，则表述“向导RNA”可以指单个向导RNA(sgRNA)，其包含Cas9结合所必需的序列和用户定义的“靶向序列”，或者指两种RNA分子的组合，其中一种包含Cas9结合所必需的序列(tracrRNA)，另一种包含用户定义的“靶向序列”(crRNA)。如果使用Cpf1核酸内切酶，则表述“向导RNA”是指单个RNA分子，其包含Cpf1结合所必需的序列和用户定义的“靶向序列”或转录为单个crRNA阵列的几个向导RNA(Zetsche,Nat Biotech,2016)。“靶向序列”能够与目标基因组位置退火，从而定义待修饰的基因组靶标，通常包含约20个核苷酸。

Cas9的DNA切割依赖于靶DNA中的短原间隔区相邻基序(PAM)的存在，限制了可靶向序列的选择。例如，来自化脓性链球菌的CAS9(SpyCas9)对应于PAM序列5'-NGG-3'。在某些实施方案中，DNA修复构建体包含突变的PAM序列。突变使PAM序列无功能但不影响蛋白质的表达、稳定性或功能。使用包含突变PAM序列的DNA修复构建体增强了HDR效率。

技术人员知道，除了CRISPR系统之外，存在用于位点特异性DNA编辑的替代手段，即使用锌指核酸内切酶、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶(meganucleases)或基于argonaute的系统(Nat Biotechnol.2016Jul；34(7):768-73)或碱基编辑器(Komor等,Nature 533,420–424,doi:10.1038/nature17946)。本发明还包括使用位点特异性DNA编辑的那些替代方法。

在某些实施方案中，第一DNA修复构建体不是在该方法的第一步中使用的CRISPR系统的底物(在基因组DNA中引入链断裂)，因为它不包含PAM序列。因此，在通过第二核酸内切酶事件插入后，插入的序列不再能够被切割。

在某些实施方案中，导致所述氨基酸的插入、缺失和/或取代的遗传操作通过向所述细胞提供，特别是转染/电穿孔碱基编辑器和向导RNA来实现(如Komor等,Nature 533,420–424,doi:10.1038/nature17946and/or Gaudelli,Nature 2017所述)，所述碱基编辑器能够将编码氨基酸标志物A的核酸序列A改变为编码氨基酸标志物B的核酸序列B，所述向导RNA能够将所述碱基编辑器引导至编码氨基酸标志物A的核酸序列A。在实施例部分中说明了能够将鼠CD45.1改变为CD45.2的碱基编辑器的设计(图9)。这说明了使用碱基编辑器进行等位基因工程作为经过验证的HDR方法的替代方案的可行性。然而，由于基因组中哪些核苷酸可以进行碱基编辑的限制，本发明人无法设计碱基编辑器以将CD90.2转化为CD90.1或将CD90.1转化为CD90.2。此外，基于依赖于NGG PAM的原始碱基编辑器设计(如Komor等，Nature 2016所述)，不可能设计碱基编辑器来将CD45.1转化为CD45.2或将CD45.2转化为CD45.1。相比之下，特异性识别改变的PAM位点的工程化Cas9变体的产生扩展了碱基编辑可以靶向的核苷酸的数量(Kim,Nat Biotech 2017)。发明人在CD45.1序列中存在的G(当突变为A时，产生CD45.2等位基因)附近鉴定了金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(SaKKH-BE3)的PAM位点。他们设计了一个sgRNA，它在编辑窗口中位置5处将G转换为A，因为与编辑窗口中的其他位置相比，SaKKH-BE3最有效地编辑位置5处的G。接下来，发明人设计了向导RNA/碱基编辑器对以将CD45.2转换成CD45.1(图9b)。新工程化的A/T腺嘌呤碱基编辑器(ABE)可以转换G/C。利用这种新的ABE，原则上可以将CD45.2等位基因中必需的A转换为CD45.1等位基因中的G。然而，目前可用的ABE需要在所需突变附近的NGG PAM，但没有这样的PAM来正确定位ABE。因此，基于适用于胞苷脱氨酶碱基编辑器的规则，发明人设计了假设的ABE。由于已知的胞苷脱氨酶碱基编辑器和新ABE在类似的编辑窗口中编辑，因此可以合理地假设该策略起作用。发明人确定了两种选择，一种基于假设的Cas9SaKKH-ABE融合，一种基于假设的Cas9VQR-ABE融合(图9b)。不能排除侧翼A也将被转化，这可能改变表位。因此，使用碱基编辑器将CD45.2转换为CD45.1将需要具有窄编辑窗口的高度特异性的碱基编辑器。最近报道的碱基编辑器具有1-2个核苷酸的编辑窗口，因此是合适的(Kim,NatBiotech,2017)。总而言之，这些例子说明改变碱基用于等位基因编辑的原理是与平台无关的，并且可以通过HDR介导的方法或其替代方法(例如碱基编辑)来实现。根据所需突变的细胞类型和基因组背景，可以选择一种或另一种。

在本说明书的上下文中，“DNA修复构建体”是指用作模板以通过HDR修复基因组DNA内的DNA链损伤，特别是双链断裂(DSB)的DNA构建体。DNA修复构建体包含同源臂和目标转基因序列。同源臂与DSB的5'和3'基因组DNA序列同源。目标转基因序列位于同源臂之间。在通过HDR修复基因组DNA期间，目标转基因序列插入基因组DNA中。技术人员知道，DNA修复构建体可以是线性的(单链或双链)或环状的(例如质粒、小环质粒)。

技术人员知道，表述“向导RNA能够与目标基因组位置退火”是指以下事实：向导RNA的一部分(用户定义的“靶向序列”)能够在高严格条件下与基因组位置退火。向导RNA包含不能与目标基因组位置退火的其他部分。通过与目标基因组位置(部分)退火，向导RNA将CRISPR相关核酸内切酶引导至目标基因组位置，从而在目标基因组位置产生DSB。

在某些实施方案中，在基因编辑方案期间使用HDR增强试剂，特别是香草醛或瑞卡帕布(rucaparib)。在本说明书的上下文中，香草醛是指4-羟基-3-甲氧基苯甲醛，CAS号121-33-5。在本说明书的上下文中，瑞卡帕布是指8-氟-2-{4-[(甲氨基)甲基]苯基}-1,3,4,5-四氢-6H-氮杂[5,4,3-cd]]吲哚-6-酮，CAS号283173-50-2。

无论何处将单个可分离特征的替代物作为“实施方案”列出，应理解这些替代物可以自由组合以形成本文公开的本发明的分别的实施方案。

申请EP16196860.7、EP16196858.1、PCT/EP2017/059799和EP17197820.8通过引用并入本文。

通过以下可以从中得出进一步的实施方案和优点实施例和附图进一步说明本发明。这些实施例旨在说明本发明，但不限制其范围。

附图说明

图1说明工程化免疫可识别的细胞表面蛋白变体的原理。同种型A和B能够执行相同的功能(功能相当)。在该实施例中，同种型A代表天然存在的表面蛋白，其被工程化为变体同种型B。

图2说明免疫可识别的细胞表面变体如何增加人细胞疗法的安全性。

图3表明表面蛋白的两种同种型可以通过单克隆抗体(mAb)区分。序列：上排：SEQID NO 020，下排：SEQ ID NO 021。

图4显示概念验证实验：在原代细胞中将CD90.2(等位基因A)转化为CD90.1(等位基因B)。左侧流式细胞仪图显示纯的CD90.2+原代T细胞的起始群。然后在体外将细胞工程化，以将CD90.2转化为CD90.1。可以区分编辑后4个不同的群体：CD90.2+纯合细胞(未编辑的起始群，左上)，CD90.1+/CD90.2+杂合细胞(右上)，CD90.1+纯合细胞(右下)和丧失CD90的细胞(左下)。右下方的等位基因工程化细胞不再表达起始/原始内源等位基因(CD90.2)。纯的CD90.1+CD90.2-细胞群可用于在转移至患者之前在体外分离正确编辑的细胞。

图5显示第二个概念验证实验：在原代细胞中将CD45.2(等位基因A)转化为CD45.1(等位基因B)。序列：上排：SEQ ID NO 022，下排：SEQ ID NO 023。如CD90.2至CD90.1的等位基因转换所示(图4)，右下方的等位基因工程化细胞不再表达起始/原始内源性等位基因(CD45.2)。这可用于在转移至患者之前分离纯的正确编辑的细胞群。

图6显示在EL4细胞中使用Cas9核糖核蛋白颗粒(RNP)的基因编辑。除了电穿孔条件(在方法部分中描述)之外，用与基于质粒的方法相同的方式，用crRNA：tracrRNA/Cas9复合物和+/-HDR 2kb模板转染EL4细胞。这表明等位基因编辑可以通过不同的方法(例如，基于质粒或RNP)实现，即，与平台无关。

图7显示在原代小鼠T细胞中使用Cas9核糖核蛋白颗粒(RNP)的基因编辑。用与基于质粒的方法相同的方式，用crRNA：tracrRNA/Cas9复合物和+/-HDR 2kb模板转染原代小鼠T细胞。与图6类似，这表明将等位基因A转换为等位基因B的等位基因编辑与平台无关。

图8显示等位基因工程化细胞的高纯离体选择。左图：在将CD45.2细胞工程化为CD45.1细胞后，出现4个群体(与图4相当)。然后使用流式细胞术将所有4个群体纯化至非常高的纯度。右图显示4个群体中每一个的分选后纯度。结论：基于工程化的等位基因，可以将所有4种可能的细胞群离体纯化至高纯度。通过Sanger DNA测序验证了正确的基因编辑(未显示)。

图9显示将CD45.1转换为CD45.2(A)和将CD45.2转换为CD45.1(B)的碱基编辑器的设计。序列(A)：上排：SEQ ID NO 024，下排：SEQ ID NO 025，(B)：上排(选择1和2)：SEQ IDNO 026，下排(选择1和2)：SEQ ID NO 027。A)设计向导RNA与限于NNNRRT PAM的SaKKH-BE3碱基编辑器一起使用。所选择的PAM序列用黑色点线(ATTTGT)突出显示。向导RNA用灰线突出显示，突出显示了向导RNA核苷酸4-7的碱基编辑窗口。使用此碱基编辑器，位置5处的G将转换为A。因此，CD45.1等位基因将转化为CD45.2等位基因。B)工程化的腺嘌呤碱基编辑器可以将A转换为G。为了将CD45.2转换为CD45.1，鉴定了两种选择：选择1：设计sgRNA(灰线)与Cas9SaKKH(用黑色点线突出显示PAM)一起使用。这将把碱基编辑窗口的位置5处的A转换为G。选择2：sgRNA(灰线)与Cas9VQR一起使用。黑色虚线突出显示PAM。这将把碱基编辑窗口位置6处的A转换为G。选择1和2将CD45.2等位基因转换为CD45.1等位基因。

图10显示任选的消融转移细胞背后的概念。从患者取出细胞，然后进行编辑(离体)以将一个等位基因转换为另一个等位基因。选择成功编辑的细胞以注入携带选择性消耗所必需的表位的纯细胞群。因此，等位基因工程增加了根据需要消融转移细胞的选择。

图11显示体内选择性消耗转移细胞或宿主细胞的应用。

图12显示体内选择性消融的概念验证实验。用于体内消融的模型：1)用纯化的CD45.2+和CD45.1+T细胞(同类系细胞，未编辑的细胞)的1：1混合物重新构建缺乏所有T细胞的免疫缺陷小鼠(Rag KO)。2)抗体介导的消耗(非选择性(抗CD4)与选择性(抗CD45.2)相比)。不含毒素或与毒素(皂草素)偶联的抗CD45.2。3)1周后分析。

图13显示体内CD45.2+细胞的选择性消耗：定量血液中的T细胞。

图14显示体内CD45.2+细胞的选择性消耗：定量淋巴器官中T细胞的相对数量。与图12的设置相同，但分析淋巴结(LN)和肠系膜淋巴结(mesLN)。

图15显示体内CD45.2+细胞的选择性消耗：定量淋巴器官中T细胞的相对数量。与图12的设置相同，但分析脾脏(SP)。

图16显示体内CD45.2+细胞的选择性消耗：定量淋巴器官中T细胞的绝对数量。与图12的设置相同，但分析淋巴结(LN)和肠系膜淋巴结(mesLN)。

图17显示体内CD45.2+细胞的选择性消耗：定量淋巴器官中T细胞的绝对数量。与图12的设置相同，但分析脾脏(SP)。

图18显示选择性体内消融等位基因编辑细胞的第二个概念验证实验。实验设置：1)离体CD45.2T细胞电穿孔以工程化为CD45.1；2)过继转移至T细胞缺陷小鼠(Rag KO)；(转移前没有纯度选择)；3)数周后质量控制以证明等位基因编辑；4)抗体介导的CD45.2细胞消耗，仅留下编辑的细胞。结论：PoC证明CD45.2+宿主和未编辑细胞的体内消耗，同时保留等位基因工程化的CD45.1+细胞。

图19显示本发明的应用：等位基因工程化增加了例如CAR-T细胞疗法的安全性。工程化细胞表达细胞表面蛋白(例如CD45)的第一同种型和对目标靶标具有反应性的嵌合抗原受体，例如CD19(CAR-19)。当将CAR19工程化到T细胞中时，第二CD45等位基因被转化为第一CD45等位基因，使得能够区分转移的CAR T细胞和非工程化的宿主细胞。在治疗相关毒性的情况下，可以选择性消融致病性CAR-T细胞以停止CAR-T相关毒性。

图20显示scurfy细胞和携带人Foxp3K276X突变的细胞的基因纠正，以及当在同种型转换的替代表面标志物上进行门控时，富集基因修复细胞的相对频率。

A)以下序列的比对：野生型foxp3的基因组DNA序列(C57BL/6)(SEQ ID NO 028)；具有靶向突变Foxp3K276X的Foxp3基因座(SEQ ID NO 029)，其引入提前终止密码子；和scurfy小鼠(B6.Cg-Foxp3sf/J)的Foxp3基因座(SEQ ID NO：030)，其具有导致移码的自发2bp插入。sgRNA结合位点(绿线)和PAM序列(黑线)。B)来自Foxp3K276X C57BL/6小鼠的总CD4+T细胞的基因编辑方案。用编码靶向Foxp3K276X突变的sgRNA的质粒和含有1kb野生型(wt)Foxp3修复模板的环状质粒进行体外活化和电穿孔(步骤1)。基于GFP表达分离成功转染的细胞(步骤2)。在rhIL-2、单独的TGF-β或与视黄酸(RA)组合和细胞因子中和抗体(抗IL-4和抗IFNγ)存在下，体外扩增细胞7天用于基因编辑(步骤3)。C)如B的实验设置，其中总CD4+T细胞来自对照小鼠(WT)或Foxp3K276X小鼠。CD25和Foxp3表达的流式细胞术(在活CD4+T细胞上门控)。用空px458质粒电穿孔的野生型细胞分化成CD4+Foxp3+CD25+T细胞(左图)，用单独的sgRNA Foxp3K276X电穿孔的Foxp3K276X细胞没有Foxp3分化(中图)，以及用sgRNA Foxp3K276X和1kb Foxp3dsDNA修复模板电穿孔的Foxp3K276X细胞中Foxp3蛋白表达的恢复(右图)。顶行：用单独的TGF-β诱导Foxp3，底行：用TGF-β与RA组合诱导Foxp3。与单独的TGF-β相比，TGF-β和RA的组合导致在具有完整Foxp3基因座的那些细胞(即野生型和修复细胞)中表达Foxp3的细胞频率更高。代表性数据来自Foxp3^K276X细胞的2次实验和Foxp3^sf/J细胞的一次实验。D)使用多重CD45同种型转换作为替代标志物富集基因修复的表达Foxp3的细胞。如b的实验设置，但同时电穿孔编码2个sgRNA(sgRNA Foxp3K276X和sgRNA CD45.2_R1)和两个1kb dsDNA模板(Foxp3野生型和CD45.1)的质粒。七天后，对CD45.2、CD45.1、CD25和Foxp3进行流式细胞术(在活CD4+细胞上门控)。上图：CD45.1-细胞(绿线)和CD45.1+细胞(红线)的预门控。下图：在同种型转换的CD45.1+细胞中富集CD25+Foxp3+细胞。代表性数据来自Foxp3^K276X细胞的2次实验和Foxp3^sf/J细胞的一次实验。

图21显示使用基于质粒的方法和基于RNP的方法修复Foxp3基因。A：用单独的sgRNA质粒或与Foxp3野生型HDR模板一起转染来自Foxp3KO小鼠的CD4T细胞。转染后24小时(质粒转染)分选GFP+和GFP-细胞，并在细胞分选后，立即在Foxp3分化鸡尾酒存在下扩增，直至实验结束。B：用单独的crRNA：tracrRNA/Cas9RNP复合物或+/-HDR模板(180bp ssDNA或2kb质粒)转染来自Foxp3KO小鼠的CD4T细胞。在Foxp3分化鸡尾酒存在下，将RNP转染细胞的总库扩增至实验结束。

图22显示体外T细胞中成功的Foxp3基因修复。上排：wt Foxp3(C57BL/6)的基因组DNA序列SEQ ID NO 031和具有引入提前终止密码子的靶向突变Foxp3K276X的Foxp3基因座SEQ ID NO 032的比对。sgRNA结合位点(绿线)和PAM序列(黑线)。转染来自wt对照或Foxp3K276X小鼠的总CD4+T细胞。对CD25和Foxp3表达进行流式细胞术(在活CD4+T细胞上门控)。用空px458质粒电穿孔的wt细胞分化为CD4+Foxp3+CD25+T细胞(上图)，用单独的sgRNAFoxp3K276X电穿孔的Foxp3K276X细胞没有Foxp3分化(中图)，用sgRNA Foxp3K276X和1kbFoxp3dsDNA修复模板电穿孔的Foxp3K276X细胞恢复Foxp3蛋白表达(下图)。用TGFβ与RA组合诱导Foxp3。

图23显示来自Foxp3K276X C57BL/6小鼠的总CD4+T细胞的基因编辑方案。用编码靶向Foxp3K276X突变的sgRNA的质粒和含有1kb wt Foxp3修复模板的环状质粒进行体外活化和电穿孔。基于GFP表达分离成功转染的细胞。在体内转移细胞用于Foxp3分化，然后进行IL-2方案。

图24显示细胞AT 14周后的小鼠临床表型。WT和修复小鼠无疾病，KO细胞的转移导致皮肤炎症和脱发。实验设置如图23所示。

图25显示接受KO细胞的小鼠中的临床表型(T细胞浸润)与耳朵和尾部皮肤中CD4/CD3+T细胞的浸润相关。在接受WT或修复T细胞的小鼠的耳朵和尾部皮肤中没有或具有非常低数量的CD4/CD3+T细胞。数据描述为％和绝对数字。

图26显示接受WT和修复细胞的小鼠中CD25/Foxp3+Treg细胞的存在。在接受KO细胞的小鼠中未发现CD25/Foxp3+T细胞。数据显示为Foxp3的％和MFI。实验设置如图23所示。

图27显示修复的Treg响应IL-2。在实验的最后一周期间的额外IL-2处理导致接受WT和修复细胞的小鼠中CD25/Foxp3+Treg细胞的存在增加。在接受KO细胞的小鼠中未发现CD25/Foxp3+T细胞。这些数据表明WT和修复的Treg细胞对IL-2的反应程度相似。

图28显示WT和修复的CD25/Foxp3Treg细胞表达相似水平的不同细胞表面标志物(GITR、ICOS、TIGIT、PD1和KLRG1)。CD25和其他标记物(例如GITR)的组合可用于富集这些群体。缺乏Foxp3的T细胞在表型上不同，例如，它们缺乏GITR和KLRG1表达。

图29显示CD45.1+WT细胞的AT拯救了Foxp3缺陷型小鼠并将其寿命延长高达8周(最新的检查时间点，无疾病适应症)。在Foxp3KO小鼠中发现的高比例WT Treg细胞(50％)抑制宿主T细胞活化(CD44高细胞的％较低)。这表明WT T细胞能够完全恢复免疫调节并控制皮屑病。此外，Foxp3缺陷的微环境促使Foxp3充足的T细胞大量扩增。

图30显示Foxp3KO小鼠中的CD4消耗实验(淋巴结，LN)。将T细胞中的基因修复与选择性抗体消耗组合：消耗致病细胞，然后转移基因纠正的T细胞。CD4消耗在很大程度上预防了皮屑病并显著延长了预期寿命。显示CD4T细胞低或不存在的FACS数据支持该观察结果(与未处理的KO或WT小鼠相比，KO消耗)。

图31显示Foxp3KO小鼠中的CD4消耗实验(脾脏，SP)。将T细胞中的基因修复与选择性抗体消耗组合：消耗致病细胞，然后转移基因纠正的T细胞。CD4消耗在很大程度上预防了皮屑病并显著延长了预期寿命。显示CD4T细胞低或不存在的FACS数据支持该观察结果(与未处理的KO或WT小鼠相比，KO消耗)。

图32A显示CD4消耗预防了Foxp3缺陷小鼠发生皮屑病。

图32B显示CD4消耗很大程度上预防了Foxp3缺陷小鼠的尾部皮肤发生皮炎。

具体实施方式

以下描述可以在EP16196860.7、EP16196858.1和PCT/EP2017/059799中找到：在原发性T细胞中有效的基于质粒的基因消融，在原发性T细胞中靶向地引入点突变，通过监测替代细胞表面标志物的同种型转换来富集HDR编辑的细胞，以及对小鼠scurfy细胞的基因纠正。

设计工程化突变的总体考虑(等位基因工程化)：

通过引入定位小突变(可能是单核苷酸或单个氨基酸突变)将基因的等位基因工程化，目的是改变配体的特异性结合并允许第二个特异性配体的结合可用作一般原则用于治疗用途。设计突变的方式是尽可能地保留工程化蛋白的功能。需要改变免疫原性以能够产生特异性结合配体，例如单克隆抗体(mAb)或抗体样分子，例如affimer、DARPINS、纳米抗体等。需要筛选这些配体的特异性结合，并且需要精心设计免疫原的性质。同时，突变构成轻微的抗原变化，因此不太可能在体内引起强烈的免疫反应。小鼠中的同类系标志物完全符合这些标准。CD90.1和CD90.2之间以及CD45.1和CD45.2之间的差异是单个核苷酸，导致单个氨基酸差异。在两种情况下，这种差异可以通过特异性mAb检测，从而每个基因产生一对mAb。虽然当同类系细胞转移到匹配的同类系宿主小鼠中(即，将CD90.1+细胞转移到CD90.2+宿主小鼠中，反之亦然，以及将CD45.1+细胞转移到CD45.2+宿主中，反之亦然)时，可以产生针对这些差异的mAb，细胞没有被免疫排斥。这意味着体内免疫系统可以耐受这种轻微的抗原差异。总之，这些特性使得同类系标记的细胞成为免疫学研究的一种非常有用的工具，已经使用了数十年。免疫学上，这些细胞用作自体转移的替代细胞(因为除了这一个突变，细胞在遗传上是相同的)，但同类系的微小差异允许区分转移细胞和宿主细胞。

选择待工程化的蛋白

为了设计用于人类治疗用途的类似系统，需要考虑几个因素。原则上可以将突变引入编码蛋白质的任何基因中。目标蛋白质的表达模式将是相关的，即，普遍存在或细胞或组织特异性表达(如果需要)。表面上表达的蛋白可以被最直接地靶向，因此在大多数情况下是所选择的蛋白质。实例包括但不限于以分化系统簇CD1至CD371为特征的蛋白质(Engel,J Immunol November 15,2015,195(10)4555-4563and http://www.hcdm.org/)。其他目标蛋白可以是遍在表达的蛋白质，例如β-2-微球蛋白或在所有细胞(包括非免疫细胞)上表达的HLA-I类的恒定部分。或者，在特定细胞类型中表达的蛋白质可能是令人感兴趣的，例如，用于造血细胞的人CD45，用于T细胞的人CD3，人T细胞受体组分的恒定区，B细胞免疫球蛋白(例如κ和λ轻链)的恒定区，或重链的恒定区，人CD4或CD8共同受体或B细胞标志物如CD19、CD20、CD21、CD22、CD23，共刺激分子如CD28或CD40，造血干细胞上的CD34或甚至在细胞亚群上表达的特异性同种型，如CD45RA或CD45RO。在后一种情况下，将突变设计到CD45RA和CD45RO之间不同的可变区(选择性剪接的外显子)中。将突变工程化到遍在表达的分子，例如β-2-微球蛋白或HLA-I中，可以作为一种独特的系统，其可以用于几乎任何哺乳动物细胞，更具体地任何人细胞。这可以用于追踪和消融工程化细胞，同时保留未工程化的宿主细胞。这种特征可以例如用作细胞治疗的杀伤开关，包括各种类型的干细胞(例如肌肉干细胞)、肝细胞或衍生自诱导多能干细胞(iPS)的细胞。将突变工程化到细胞类型特异性的蛋白质如CD45中可用于靶向来自该特定组织的所有细胞。在造血系统的情况下，将人CD45工程化可用于标记用于替代内源性造血系统的造血干细胞(HSC)。这些HSC的所有后代将携带工程化到原始HSC的基因组中的相同突变。如果先前的宿主造血系统通过任何方式被去除(例如辐射、化疗、消耗配体如mAb或抗体样分子、mAb与毒素偶联、细胞介导的消融，例如CAR-T细胞介导的消融等)，则可以通过工程化的突变来区分替代造血系统(即使是自体的)。或者，它可以允许消融宿主细胞，同时保留工程化细胞。

设计考虑

-蛋白质的表达模式(普遍存在与细胞或组织特异性)。

-细胞外蛋白：在大多数情况下，突变将被工程化到可被特定配体接近的目标蛋白的细胞外部分中。可将突变工程化到恒定表达的外显子中，或如果需要亚组特异性表达，工程化到选择性剪接的外显子中。

-跨物种保守性：保守氨基酸(aa)或结构更可能与功能相关，因此应保持不变。突变应该被整合入较不保守的区域。

-氨基酸的化学性质，例如，极性、电荷、疏水性。

-氨基酸的相似性：为了保留功能，突变应该将给定的aa转换成相关的aa，但是变化仍然需要可以通过特定配体检测。

-自然发生的变异：与在蛋白质家族成员的多序列比对(不同生物的同源序列)中的给定位置观察到的氨基酸变异对应的突变可能不会影响蛋白质的功能和结构，可以选择来设计突变。

-结构考虑：结构数据可以帮助合理设计潜在的突变。待工程化的氨基酸必须能够与配体结合。环中的突变在功能上相对良好地耐受，因此是令人感兴趣的。

-避免已知的致病突变。

-考虑已知的人类遗传变异：功能耐受的单核苷酸多态性(SNP)是良好的候选突变。

-不应突变对二级修饰(例如糖基化)重要的位点。

-不应突变对二硫键重要的位点。

-不应突变对于报道的相互作用重要的位点(例如氢键、盐桥、疏水性堆积相互作用)，蛋白质内部以及多蛋白复合物中的蛋白质-蛋白质相互作用，或受体-配体相互作用。

-考虑以前成功的系统，如小鼠CD90.1/CD90.2(Q至R)。

-考虑已知结合配体(例如已知的mAb)的结合位点和互补决定区(CDR)的计算建模。

-排除已知的“活性位点”，例如酶的催化位点。

-避免在其他人蛋白质中存在的结构上非常相似的结构域，因为它们可能增加交叉特异性配体的风险。

-考虑免疫原性：选择可能产生合适的肽免疫原的位点。

等位基因工程作为普遍适用的与平台无关的原则：

在EP16196860.7、EP16196858.1和PCT/EP2017/059799中，发明人证明并表征了CRISPR/Cas平台如何用于工程化等位基因工程的靶向点突变，然后进行选择性消融。发明人将两个单独的点突变工程化到两个不同的基因，并证明工程化的突变可用于在体内追踪和/或选择性地消融工程化细胞。发明人依赖于CRISPR/Cas9系统和dsDNA模板来实现同源定向修复(HDR)。但是，使用的示例只是引入突变的一种方式。替代物包括不同类型的核酸酶，例如锌指蛋白、TALEN或其他天然存在的或工程化的CRISPR/Cas系统，例如Cas9、Cpf-1、高保真核酸酶或具有工程化PAM依赖性的核酸酶(Komor，Cell，2017)。而且，所述原理与核酸酶的递送形式无关。它们可以作为以下递送：质粒、mRNA、重组蛋白、与向导RNA复合的重组蛋白(即核糖核复合物，RNP)、分裂重组酶，或整合或非整合病毒，例如逆转录病毒、慢病毒、杆状病毒或其他病毒递送平台。递送方式可以包括电穿孔或其他形式，例如脂质转染、纳米颗粒递送、细胞挤压或物理刺穿。另外，HDR模板可以是以下形式的ssDNA或dsDNA：短ssDNA、长ssDNA或环状或线性小环DNA、质粒DNA或病毒DNA模板，例如腺相关病毒(AAV)。取决于靶细胞，特定的AAV血清型用于将货物递送至细胞。对于人T细胞和人造血干细胞，通常以AAV6提供HDR模板，但也可成功使用核酸内切酶RNP以及短ssDNA HDR模板。因此，引入突变的模式可以是灵活的。

使用可选方法例如碱基转换器或碱基编辑器进行等位基因工程

发明人证明了如何利用HDR后的靶向dsDNA断裂来引入等位基因工程的小的靶向的(即精确的)突变。此外，还有可选方法可以将设计的点突变工程化到活细胞的基因组中。例如，新设计的嵌合融合蛋白允许将靶DNA碱基直接转化为另一种(Komor,Nature 2016；Nishida,Science 2016；Yang,Nat Comm,2016；Ma,Nat Meth 2016)。诸如脱氨酶的酶可以与DNA结合模块(例如(但不限于)锌指蛋白、TALENS或CRISPR/Cas系统)融合。天然存在的胞苷脱氨酶(APOBEC1、APOBEC3F、APOBEC3G)和活化诱导的脱氨酶(AID)或AID直系同源物PmCDA1(来自海鳗)可以将DNA中的胞苷(C)转化为尿嘧啶(U)。如果在U修复之前发生DNA复制，则DNA复制机器将U作为T处理。这导致C：G转化为T：A碱基对(Yang,Nat Comm,2016；Komor,Nature 2016)。因此，几个小组开发了工程化的嵌合蛋白，其中脱氨酶与DNA结合模块融合，用于将脱氨酶带到特定的基因组位点。例如，当使用Cas9核酸酶的工程化的催化死亡(dCas9)版本时，CRISPR/Cas系统可用作递送系统。该方法已成功用于将融合效应物分子靶向特定基因组位点。应用包括将荧光蛋白靶向特定位点或将转录反式激活因子或阻遏物引入特定基因组位点以控制特定基因表达(Wang,Ann Rev Biochem,2016)。将胞苷脱氨酶或AID与切口酶Cas9融合并进行额外工程化以提高碱基编辑效率允许直接的靶向碱基转化(Komo,Nature 2016；Nishida,Science 2016)。在某些情况下，这可能比HDR方法具有优势，因为碱基编辑既不诱导dsDNA断裂也不需要递送DNA HDR模板。因此，这种替代方法可以减少插入缺失，因此可能是安全的或甚至比基于HDR的基因组工程更安全。此外，递送作为mRNA或RNP的碱基编辑器可能是足够的，并且对于某些细胞类型可能毒性较小。对于人T细胞，Cas9RNP提供了成功的基因组编辑方法(Schumann,PNAS,2015)，因此可以预期RNP形式的碱基转换器可能特别适用于造血细胞(包括造血干细胞(HSC))和T细胞，但原则上碱基转化可能是适用于任何细胞(包括哺乳动物细胞)的等位基因工程的方法。然后，引入的设计的点突变可用于下游应用，例如细胞标记、细胞追踪和选择性消融。作为RNP递送的碱基编辑器成功编辑了哺乳动物细胞、小鼠和斑马鱼胚胎以及活小鼠内耳中的靶核苷酸(Rees,Nat Comm,2017；Kim,Nat Biotech,2017doi:10.1038/nbt.3816)。因此，这些研究证明了特定的无DNA碱基编辑的可行性。然而，(人)基因组中适合碱基转化的核苷酸数量比HDR方法更受限制，因为它不仅取决于PAM序列(对于基于CRISPR/Cas的碱基转换器)，而且还是其他限制的基础。尽管胞苷脱氨酶碱基编辑器只能将C转换为T(或将G转换为A)，但新工程化的腺嘌呤碱基编辑器可将A转换为G(或将T转换为C(Gaudelli,Nature 2017))。然而，除了PAM要求之外，碱基转化仅发生在由融合蛋白的特定设计和/或工程改造的某些窗口内。因此，与HDR介导的点突变的引入相比，如果使用碱基编辑器，则可编辑核苷酸的数量受到多得多的限制(Komor,Nature 2016)。此外，碱基转化的窗口包含几个核苷酸。例如，对于使用化脓性链球菌Cas9的所谓碱基编辑器3(BE3)(SpBE3，参见Komor等，Nature 2016)，该窗口包含约5个核苷酸。因此，在一段多个相邻C核苷酸内编辑单个C至T将是不可能的，并且将导致额外的不需要的突变，这可能改变所得蛋白质的氨基酸。类似的编辑窗口适用于腺嘌呤碱基编辑器。此外，基于金黄色葡萄球菌Cas9的不同BE3(SaBE3)，可以在标准BE3编辑窗口之外的目标C处产生可检测的碱基编辑。为了解决这些限制，较新的碱基转化器版本被工程化为具有更窄的编辑窗口和与NGG不同的PAM特异性(例如NGA、NGAG、NGCG、NNGRRT和NNNRRT)，但设计针对给定单核苷酸转化的特定碱基编辑器仍然具有挑战性(Kim,Nat Biotech 2017,doi:10.1038/nbt.3803)。尽管新的碱基转化器扩展了哺乳动物基因组中可靶向核苷酸的范围，但并非每个核苷酸都可以随意编辑。然而，为了利用碱基转化器的一些益处，发明人试图设计碱基编辑器用于以下等位基因工程：CD90.1至CD90.2、CD90.2至CD90.1、CD45.1至CD45.2，或CD 45.2至CD45.1。但是，对于最初的NGG限制性的碱基编辑器，这些转化都不能通过可用的碱基编辑器实现。尽管事实上对于两个基因CD90和CD45，等位基因差异由G至A的取代编码，其原则上应该适合脱氨酶转化。唯一的解决方案是使用基于SaCas9的BE3版本，其中包含3个突变，将这种Cas9变体的PAM需求放宽至NNNRRT(Kleinstiver，Nature2015；Kim，Nat Biotech，2016(doi：10.1038/nbt.3803)。选择此碱基编辑器使得有可能设计一个具有匹配sgRNA的碱基编辑器，将CD45.1等位基因转化为CD45.2等位基因(图9A)。但是，这个碱基编辑器只能将CD45.1转化为CD45.2，但不能将CD45.2转化为CD45.1。我们设计了假设的腺嘌呤碱基编辑器(腺嘌呤碱基编辑器与Cas9SaKKH或Cas9VQR融合(图9B)。相比之下，CD90等位基因的转化都不可能，即使用现有的碱基编辑器版本。

方法

在EP16196860.7、EP16196858.1和PCT/EP2017/059799中可以找到描述原代鼠CD4+T细胞中的基因编辑，EL-4细胞中的基因编辑的详细方法和Foxp3修复的方案。

人T细胞分离和抗体

使用Lymphoprep^TM(Stemcell Technologies)密度梯度从健康供体的血沉棕黄层(Blutspendezentrum，Basel)分离人原代T细胞。根据制造商的方案，用Easysep Human初始CD4⁺T细胞富集试剂盒(Stemcell Technologies)预富集初始CD4⁺T细胞。或者，考虑到初始T细胞的高频率，用脐带血作为PBMC的来源，而不使用初始T细胞分离步骤。为了评估纯度，用以下抗体染色富集前后的初始CD4⁺T细胞样品：αCD4-FITC(OKT-4)、αCD25-APC(BC96)、αCD45RA-BV711(HI100)、αCD45RO-BV450(UCHL1)、αCD62L-BV605(DREG-56)、αCD3-PerCP(HIT3a)和Zombie-UV活力染料，均购自Biolegend。

简言之，对于50ml的1个血沉棕黄层：准备具有过滤器的2×50ml Falcon管，并向每个管中加入16ml Lymphoprep，以300g旋转1分钟。将血液均匀地分配到50ml过滤管中，并用PBS加至50ml。以2000rpm旋转(acc 4，decc 1)15分钟。取出一些血清并弃掉。小心地将白色血沉棕黄层合并到新的50ml Falcon管。向富集的PBMC级分中加入无菌PBS至约50ml，并以300g旋转5分钟。弃去上清液，用10ml PBS重悬沉淀并加至50ml，以300g旋转5分钟。在纯化步骤之前，如果需要，用红细胞裂解缓冲液裂解红细胞。

人T细胞转染方案

将来自血液或脐带血的初始CD4⁺T细胞或总PBMC用于转染。对于T细胞活化，在37℃和5％CO₂下，在50IU/ml重组人白细胞介素-2(rhIL-2)(RD System)存在下，在涂有以下单克隆抗体(mAb)的24孔板(Corning)中铺板2x10⁶个细胞24h：CD3(杂交瘤克隆OKT3，5(高)、2.5(中等)、1(低)μg/ml)和CD28(杂交瘤克隆CD28，2.5(高)、1(中)、0.5(低)μg/ml，均来自Biolegend)。24小时后收获T细胞并用PBS洗涤。用Amaxa转染系统，T-020程序(用于质粒)或使用转染系统(ThermoFisher)在以下条件下将2x10⁶个活化的T细胞电穿孔：电压(1600V)，宽度(10ms)，脉冲(3)100μl尖端，缓冲液R(对于RNP)。用6.5μg空质粒px458(Addgene质粒编号：48138)或crRNA：tracerRNA-Atto 550(IDT)和Cas9(Berkeley)复合物转染细胞。电穿孔后，在板结合的mAb(浓度为初始活化的一半，即抗CD3(2.5、1.25、0.5μg/ml)和抗CD28(1.25、0.5、0.25μg/ml))存在下，将细胞铺板到含有50IU rhIL-2/ml的650μl完全培养基的24孔板中。24小时后，用Fortessa分析仪(BD Biosciences)评估GFP⁺或Atto550⁺细胞的表达。

CD45.2消耗实验

使用EasySep小鼠CD4⁺T细胞分离试剂盒(Stem cell Technologies)从C57BL6(CD45.2)小鼠和C57BL6同类系(CD45.1)小鼠中分离CD4⁺T细胞。用1：1比例的10×10⁶个CD45.2和CD45.1供体CD4⁺T细胞重新构建RAG KO小鼠。在T细胞转移的同一天，小鼠也连续3天接受腹膜内注射PBS(未处理组)或消耗CD4Ab(克隆GK1.5，250μg)。通过以下制备CD45.2-ZAP免疫毒素：将CD45.2生物素化抗体(160kDa MW，Biolegend)与链霉亲和素-SAP偶联物(每个链霉亲和素2.8个皂草素分子，135kDa MW，Advanced Targeting Systems)以1：1摩尔比结合，随后在使用前立即用PBS稀释，这与初始出版物中描述的相同：(https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5179034/)。通过静脉内注射在体内施用免疫毒素或对照和未偶联的CD45.2抗体。一周后，收集血液、外周淋巴结(LN)、肠系膜LN(mesLN)和脾脏(SP)，并用以下荧光染料偶联的mAb染色细胞：抗CD45.2(104)、抗CD45.1(A20)、抗CD4(RM4-5)、抗CD3(145-2C11)，均来自Biolegend。在BD Fortessa(BD Biosciences)上获得样品并用FlowJo软件(Tree Star)分析。

项目

1.用于在真核细胞中确定在第一基因组位置的第一同源定向修复(HDR)事件的方法，其中

-所述细胞表达第一表面蛋白的第一同种型，其与所述第一表面蛋白的第二同种型在氨基酸标志物方面不同，其中所述第一同种型包含由核酸序列A编码的氨基酸标志物A，所述第二同种型包含由核酸序列B编码的氨基酸标志物B；

-所述第一基因组位置包含所述核酸序列A；

且所述方法包括以下步骤：

a.在所述第一基因组位置诱导第一DNA双链断裂；

b.提供第一DNA修复构建体，其包含所述核酸序列B和第一对同源臂，所述同源臂与所述第一基因组位置的5’和3’DNA序列同源；

c.测定所述细胞上所述第一表面蛋白的所述第一和/或所述第二同种型的表达，和任选地基于所述表面蛋白的所述第一和/或所述第二同种型的表达纯化所述细胞；和

d.确定所述第一HDR事件的发生，其中所述细胞上所述第一表面蛋白的所述第二同种型的表达等于所述第一HDR事件的发生。

2.根据第1项的方法，其中在至少两种不同的实验条件下确定所述第一HDR事件的发生，并且与第二实验条件相比，在第一实验条件下所述第二同种型与所述第一同种型的表达比率增加表明在所述第一实验条件下的HDR效率增加。

3.根据上述任一项的方法，其中步骤a和b在包含香草醛和/或瑞卡帕布的细胞培养基中进行，特别是浓度为50μM至500μM的香草醛和/或0.5μM至2.5μM的瑞卡帕布，更特别是约300μM的香草醛和/或约1μM的瑞卡帕布。

4.根据上述任一项的方法，其中所述第一表面蛋白的所述第一和第二同种型可通过配体，特别是抗体彼此区分，其中所述配体能够分别区别性地结合所述氨基酸标志物A(而不是B)或所述氨基酸标志物B(而不是A)。

5.根据上述任一项的方法，其中所述第一表面蛋白是天然蛋白。

6.根据上述任一项的方法，其中所述第一表面蛋白是转基因蛋白。

7.根据上述任一项的方法，其中所述纯化通过荧光激活细胞分选(FACS)实现。

8.根据第1至6任一项的方法，其中所述纯化包括基于磁珠富集表达所述第一表面蛋白的所述第一或所述第二同种型的细胞。

9.根据上述任一项的方法，其中所述第一表面蛋白是Thy1或CD45。

10.根据上述任一项的方法，其中通过用编码CRISPR相关核酸内切酶(Cas9)的DNA表达构建体和向导RNA转染所述细胞从而在所述第一基因组位置诱导所述第一双链断裂，其中所述向导RNA能够与所述第一基因组位置退火。

11.根据上述任一项的方法，其中所述同源臂各自包含约2000个碱基对(bp)。

12.一种用于在未编辑细胞和编辑细胞的组合物中选择性消耗或富集编辑细胞的方法，其中

a.所述未编辑细胞表达表面蛋白的第一同种型，并且所述编辑细胞已经通过第1至11任一项的方法编辑以表达所述表面蛋白的第二同种型，所述第二同种型与所述第一种同种型在氨基酸标志物方面不同，其中所述第一同种型包含由核酸序列A编码的氨基酸标志物A，所述第二同种型包含由核酸序列B编码的氨基酸标志物B；和

b.基于所述表面蛋白的所述第一或所述第二同种型的表达选择性富集或消耗所述编辑细胞。

13.一种用于在细胞组合物中选择性消耗或富集细胞的方法，包括以下步骤：

c.提供细胞，其中所述细胞表达表面蛋白的第一同种型，其与所述表面蛋白的第二同种型在氨基酸标志物方面不同，其中所述第一同种型包含由核酸序列A编码的氨基酸标志物A，所述第二同种型包含由核酸序列B编码的氨基酸标志物B；

d.在包含所述核酸序列A的基因组位置处诱导DNA双链断裂；

e.提供DNA修复构建体，其包含所述核酸序列B和一对同源臂，所述同源臂与所述基因组位置的5’和3’DNA序列同源；

f.基于所述表面蛋白的所述第一或所述第二同种型的表达选择性富集或消耗所述细胞。

Claims (37)

1.表达表面蛋白的第一同种型的哺乳动物细胞，尤其是人细胞在患者的医学治疗中的用途，其中所述表面蛋白的所述第一同种型与所述表面蛋白的第二同种型在功能上无法区分，但在免疫学上可区分，所述患者具有表达所述表面蛋白的所述第二同种型的细胞。

2.根据权利要求1所述的哺乳动物细胞在医学治疗中的用途，其中所述表面蛋白包含细胞外多肽序列，并且与所述第二同种型相比，所述第一同种型包含1、2、3、4或5个氨基酸的插入、缺失和/或取代。

3.根据权利要求1或2所述的哺乳动物细胞在医学治疗中的用途，其中所述第一同种型和所述第二同种型可以通过抗体样分子结合、抗体结合或通过携带抗体或抗体样分子的免疫效应物细胞，或携带嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应物细胞，特别是T细胞的反应来区分。

4.根据前述任一项权利要求所述的哺乳动物细胞在医学治疗中的用途，其中所述表面蛋白选自：CD1a、CD1b、CD1c、CD1e、CD1e、CD2、CD3、CD3d、CD3e、CD3g、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8a、CD8b、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CDwl2、CD13、CD14、CD15、CD15u、CD15s、CD15su、CD16、CD16b、CD17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD44、CD45、CD45RA、CD45RB、CD45RC、CD45RO、CD46、CD47、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CD60a、CD60b、CD60c、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CD65、CD65s、CD66a、CD66b、CD66c、CD66d、CD66e、CD66f、CD68、CD69、CD70、CD71、CD72、CD73、CD74、CD75、CD75s、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85a、CD85d、CD85j、CD85k、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CD92、CD93、CD94、CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD99R、CD100、CD101、CD102、CD103、CD104、CD105、CD106、CD107a、CD107b、CD108、CD109、CD110、CD111、CD112、CD113、CD114、CD115、CD116、CD117、CD118、CD119、CD120a、CD120b、CD121a、CD121b、CD122、CD123、CD124、CD125、CD126、CD127、CD129、CD130、CD131、CD132、CD133、CD134、CD135、CD136、CD137、CD138、CD139、CD140a、CD140b、CD141、CD142、CD143、CD144、CDw145、CD146、CD147、CD148、CDw149、CD150、CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、CD156a、CD156b、CD156c、CD157、CD158e、CD158i、CD158k、CD159a、CD159c、CD160、CD161、CD162、CD163、CD164、CD165、CD166、CD167a、CD167b、CD168、CD169、CD170、CD171、CD172a、CD172b、CD172g、CD173、CD174、CD175、CD175s、CD176、CD177、CD178、CD179a、CD179b、CD180、CD181、CD182、CD183、CD184、CD185、CD186、CD191、CD192、CD193、CD194、CD195、CD196、CD197、CDw198、CD199、CD200、CD201、CD202b、CD203c、CD204、CD205、CD206、CD207、CD208、CD209、CD210、CDw210b、CD212、CD213a1、CD213a2、CD215、CD217a、CD218a、CD218b、CD220、CD221、CD222、CD223、CD224、CD225、CD226、CD227、CD228、CD229、CD230、CD231、CD232、CD233、CD234、CD235a、CD235b、CD236、CD236R、CD238、CD239、CD240CE、CD240DCE、CD240D、CD241、CD242、CD243、CD244、CD245、CD246、CD247、CD248、CD249、CD252、CD253、CD254、CD256、CD266、CD267、CD268、CD269(BCMA)、CD270、CD271、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD277、CD278、CD279、CD280、CD281、CD282、CD283、CD284、CD286、CD289、CD290、CD292、CDw293、CD294、CD295、CD296、CD297、CD298、CD299、CD300a、CD300c、CD300e、CD301、CD302、CD303、CD304、CD305、CD306、CD307a、CD307b、CD307c、CD307d、CD307e、CD308、CD309、CD312、CD314、CD315、CD316、CD317、CD318、CD319、CD320、CD321、CD322、CD324、CD325、CD326、CD327、CD328、CD329、CD331、CD332、CD333、CD334、CD335、CD336、CD337、CD338、CD339、CD340、CD344、CD349、CD350、CD351、CD352、CD353、CD354、CD355、CD357、CD358、CD360、CD361、CD362、CD363、CD364、CD365、CD366、CD367、CD368、CD369、CD370、CD371、BCMA、免疫球蛋白轻链(λ或κ)、HLA蛋白和β2-微球蛋白，尤其是所述表面蛋白选自CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD19、CD20、CD22、CD23、CD33、CD34、CD90、CD45、CD123、BCMA、免疫球蛋白轻链(λ或κ)、HLA蛋白和β2-微球蛋白。

5.根据前述任一项权利要求所述的哺乳动物细胞在医学治疗中的用途，其中患者的天然基因组DNA不编码所述第一同种型。

6.根据前述任一项权利要求所述的哺乳动物细胞在医学治疗中的用途，其中所述第一同种型通过改变患者天然基因组DNA中编码所述表面蛋白基因的序列获得。

7.根据前述任一项权利要求所述的哺乳动物细胞在医学治疗中的用途，其中所述第一同种型通过在所述表面蛋白的所述第二同种型的氨基酸序列中插入、缺失和/或取代1、2、3、4或5个(或甚至6、7、8、9、10、11、12、15或20个)氨基酸获得。

8.根据前述任一项权利要求所述的哺乳动物细胞在医学治疗中的用途，其中所述插入、缺失和/或取代通过以下实现：

a.比较不同哺乳动物物种的一个或几个同源序列，所述哺乳动物物种特别是小鼠、大鼠、灵长类动物和人同系物，并将插入、缺失和/或取代定位于非保守位点；

b.选择插入、缺失和/或取代，以便计算机辅助结构预测没有预测经受插入、缺失和/或取代的管道的二级结构变化；

c.选择插入、缺失和/或取代，以便根据计算机辅助结构预测，使其位于配体结合可接近的位点；

d.在不涉及表面蛋白的预测的或实验建立的蛋白质-蛋白质相互作用的序列中选择插入、缺失和/或取代；

e.选择插入、缺失和/或取代而不删除或引入二硫键分子间或分子内相互作用，或疏水性堆积；或

f.选择插入、缺失和/或取代而不删除或引入对蛋白质折叠很重要的翻译后蛋白质修饰位点。

9.根据前述任一项权利要求所述的哺乳动物细胞在医学治疗中的用途，其中所述插入、缺失和/或取代位于所述第一表面蛋白的细胞外部分，特别是细胞外环中。

10.根据前述任一项权利要求所述的哺乳动物细胞在医学治疗中的用途，其中在表达所述表面蛋白的所述第二同种型的细胞的特异性消融之前、同时或之后施用所述细胞，特别是其中表达所述表面蛋白的所述第二同种型的细胞的消融通过向所述患者施用选自以下的试剂来进行：抗体样分子、抗体、携带抗体或抗体样分子的免疫效应物细胞，和携带嵌合抗原受体的免疫效应物细胞，特别是T细胞，其中所述试剂对所述细胞表面蛋白的所述第二同种型(但不是所述第一同种型)具有特异性反应性。

11.根据前述任一项权利要求所述的哺乳动物细胞在医学治疗中的用途，其中所述细胞表达对所述表面蛋白的第二同种型具有反应性的抗体或抗体样分子，特别是嵌合抗原受体。

12.根据权利要求11所述的哺乳动物细胞在医学治疗中的用途，其中所述表面蛋白选自CD45、CD19、CD8和CD4，特别是其中表面蛋白是CD45。

13.根据前述任一项权利要求所述的哺乳动物细胞在医学治疗中的用途，其中所述哺乳动物细胞是造血细胞，特别是造血干细胞或T细胞。

14.根据前述任一项权利要求所述的哺乳动物细胞在医学治疗中的用途，其中所述细胞包含纠正在所述患者中存在的疾病相关基因缺陷的遗传改变。

15.根据权利要求14所述的哺乳动物细胞在医学治疗中的用途，其中所述疾病相关基因缺陷是Foxp3中的突变。

16.根据前述任一项权利要求所述的哺乳动物细胞在医学治疗中的用途，其中所述治疗是T细胞介导的疾病的治疗，特别是IPEX样综合征、CTLA-4相关免疫失调、血细胞综合征、ALPS综合征，或由杂合PTEN种系突变引起的综合征。

17.选自以下的试剂用于治疗医学病症的用途：

a.包含抗体或抗体样分子或由其组成的化合物，和

b.携带抗体或抗体样分子的免疫效应物细胞或携带嵌合抗原受体的免疫效应物细胞，

其中所述试剂对表面蛋白的第一或第二同种型具有特异性反应性，其中所述表面蛋白的所述第一同种型与所述表面蛋白的所述第二同种型在功能上无法区分，但在免疫学上可以区分，其中施用所述试剂以消融携带所述试剂对其具有反应性的同种型的细胞。

18.根据权利要求17所述的试剂，其中所述抗体或抗体样分子与毒素，特别是皂角素偶联。

19.根据权利要求17或18所述的试剂，其中所述试剂是双特异性抗体或双特异性抗体样分子。

20.根据权利要求17所述的试剂，其中所述试剂是携带双特异性抗体或双特异性抗体样分子的免疫效应物细胞。

21.根据权利要求17所述的试剂，其中所述试剂是携带以下的免疫效应物细胞：

a.对第一表面蛋白的第一或第二同种型具有特异性反应性的第一抗体或抗体样分子，其中所述第一表面蛋白的所述第一和所述第二同种型在功能上无法区分，但在免疫学上可区分，和

b.对第二表面蛋白的第一或第二同种型具有特异性反应性的第二抗体或抗体样分子，其中所述第二表面蛋白的所述第一和所述第二同种型在功能上无法区分，但在免疫学上可区分。

22.根据权利要求17、20或21任一项所述的试剂，其中所述试剂是携带抗体样分子，特别是嵌合抗原受体的免疫效应物细胞，特别是T细胞，并且所述医学病症是造血系统疾病，特别是恶性造血系统疾病。

23.根据权利要求17-22任一项所述的试剂用于治疗移植物抗宿主病的用途。

24.特别用于治疗造血系统疾病，更特别用于治疗恶性造血系统疾病的组合药物，其包含：

a.根据权利要求17-23任一项所述的第一试剂，其中所述试剂对第一表面蛋白具有反应性；和

b.根据权利要求17-23任一项所述的第二试剂，其中所述试剂对第二表面蛋白具有反应性。

25.根据权利要求24所述的组合药物，其中所述第一和所述第二试剂是携带嵌合抗原受体的T细胞。

26.根据权利要求24或25所述的组合药物，其中所述第一表面蛋白是CD19，且所述第二表面蛋白是CD45。

27.一种用于在体内追踪患者中表达表面蛋白的第一同种型的细胞的方法，其中所述表面蛋白的所述第一同种型与所述表面蛋白的第二同种型在功能上无法区分，但在免疫学上可区分，所述方法包括向所述患者施用对所述第一同种型具有特异性反应性的配体。

28.一种用于在体内选择性消耗或富集细胞的方法，包括以下步骤：

a.提供细胞，其中所述细胞表达表面蛋白的第一同种型，其与所述表面蛋白的第二同种型在氨基酸标志物方面不同，其中所述第一同种型包含由核酸序列A编码的氨基酸标志物A，所述第二同种型包含由核酸序列B编码的氨基酸标志物B；

b.在所述细胞的基因组DNA中诱导从所述核酸序列A到所述核酸序列B的突变；

c.基于所述表面蛋白的所述第一或所述第二同种型的表达选择性富集/消耗所述细胞。

29.包含以下组分的试剂盒：

a.靶向编码细胞表面蛋白的基因的基因组位置的碱基编辑器向导RNA，其中

i.所述基因存在于核酸标志物序列不同的两种同种型中，其中同种型1包含第一标志物序列，同种型2包含第二标志物序列；和

ii.所述基因组位置包含碱基编辑器PAM序列和所述第一或第二标志物序列；和

b.任选地，分别与同种型1和同种型2的基因产物特异性结合的第一和第二抗体。

30.根据权利要求29所述的试剂盒，其中所述细胞表面蛋白是鼠Thy1或鼠CD45。

31.根据权利要求30所述的试剂盒，其中所述细胞表面蛋白是鼠CD45，所述碱基编辑器向导RNA包含选自SEQ ID NO 004、SEQ ID NO 005和SEQ ID NO 006的核酸序列。

32.包含以下组分的试剂盒：

a.靶向编码细胞表面蛋白的基因的基因组位置的向导RNA，其中

i.所述基因存在于核酸标志物序列不同的两种同种型中，其中同种型1包含第一标志物序列，同种型2包含第二标志物序列；和

ii.所述基因组位置包含PAM序列和所述第一或第二标志物序列；和

b.包含以下的DNA构建体：

i.所述第一标志物序列或所述第二标志物序列；

ii.所述PAM序列，其中特别是所述PAM序列是突变的且无功能；

iii.一对同源臂，其与编码所述细胞表面蛋白的基因的所述基因组位置的5’和3’基因组DNA序列同源；和

c.任选地，分别与同种型1和同种型2的基因产物特异性结合的第一和第二抗体。

33.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述同源臂各自包含至少85个碱基对(bp)，更特别各自包含至少450bp，甚至更特别各自包含约2000bp。

34.根据权利要求32-33任一项所述的试剂盒，其中所述细胞表面蛋白是鼠Thy1或鼠CD45。

35.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述细胞表面蛋白是鼠Thy1，并且：

a.所述向导RNA是SEQ ID NO 001，且所述DNA构建体选自SEQ ID NO 007(无mut)、SEQID NO 008(mut)、SEQ ID NO 009(4x mut)、SEQ ID NO 010(2kb)、SEQ ID NO 011(4kb)、SEQ ID NO 012(1kb)和SEQ ID NO 013(160bp)；或

b.所述向导RNA是SEQ ID NO 002，且所述DNA构建体选自SEQ ID NO 014(120bp)和SEQID NO 015(180bp)。

36.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述细胞表面蛋白是鼠CD45，所述向导RNA是SEQ ID NO 003，且所述DNA构建体选自SEQ ID NO 016、SEQ ID NO 017(1kb)、SEQ ID NO018(2kb)和SEQ ID NO 019(4kb)。

37.根据权利要求32-36任一项所述的试剂盒，包含已经被遗传改造用于稳定Cas9表达的鼠T细胞。