CN105377298B - 一种增加脊柱侧凸受试者的细胞中的gipcr信号传导作用的方法 - Google Patents

Abstract

本文提供一种增加有需要的受试者的细胞中的GIPCR信号传导作用的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的整联蛋白α5β1表达和/或活性的抑制剂，由此增加所述受试者的所述细胞中的GiPCR信号传导作用。整联蛋白α5β1的抑制剂可以是例如抑制骨桥蛋白(OPN)与整联蛋白α5β1之间的相互作用的药剂。还提供基于CD44风险等位基因的至少一个拷贝的存在确定发展脊柱侧凸的风险的方法和分层患有脊柱侧凸的受试者的方法以及用于进行这些方法的试剂盒。具体地说，所述确定风险的方法鉴定SNP rsl467558；在CD44的位置230处的异亮氨酸至苏氨酸突变。

Description

一种增加脊柱侧凸受试者的细胞中的GIPCR信号传导作用的 方法

相关申请的交叉引用

本申请是2014年6月17日提交并且根据PCT条约第21条(2)款以英文公布的PCT申请序列号PCT/CA2014/*，本申请要求2013年6月17日提交的美国临时申请序列号61/835,926的权益。以上所有文件以引用的方式整体并入本文。

关于联邦资助的研究或开发的声明

不适用。

发明领域

本发明涉及一种增加脊柱侧凸受试者的细胞中的GiPCR信号传导作用的方法。

对序列表的引用

根据37C.F.R.1.821(c)，序列表特此作为命名为14033_121_ST25.txt的ASCII兼容文本文件提交，它是在2014年6月17日创建并且具有49千字节的大小。上述文件的内容特此以引用的方式整体并入。

发明背景

特发性脊柱侧凸是不明原因的脊柱畸形，其通常被定义为伴有脊椎旋转的大于10度的侧弯¹。青少年特发性脊柱侧凸(AIS)是全世界最频繁的幼年期畸形之一，其特征在于不明原因的3D脊柱畸形，并且既代表直接的医学挑战，又代表终生影响个体的慢性病状。它是青少年中最常见的需要外科手术的矫形病状，并且影响4％的此群体。所述病状最常见地在9至13岁的年龄之间被诊断^2,3,4。所述诊断主要是排除并且仅在排除脊柱畸形如椎骨畸形、神经肌肉病症或综合征病症的其他原因之后进行。传统地，躯干不对称在身体检查期间通过亚当斯前屈测试揭示并且用脊柱侧凸测量计测量。然后可以使用科布方法通过弯曲的影像学观察和角度测量来确认所述诊断。

一旦诊断，医师在管理脊柱侧凸儿童方面的主要关注是弯曲是否将进展。确实，弯曲进展经常是不可预测的并且在女孩之中比在男孩中更频繁地观察到。如果未经治疗，弯曲可能急剧进展，从而产生显著身体畸形且甚至心肺问题。当弯曲超过70度时，这些表现形式变得威胁生命。用于预防或终止弯曲进展的当前治疗选择包括装矫正架和外科手术。一般来说，对于在25与40度之间的弯曲推荐装矫正架，而对大于45度的弯曲或对装矫正架无反应的弯曲保留外科手术。当前在美国，大约一百万的10与16岁之间的儿童具有某种程度的IS。大约10％的被诊断具有特发性脊柱侧凸的儿童具有需要矫形外科手术的弯曲进展。每年在北美进行约29,000例脊柱侧凸外科手术，从而导致显著的心理和生理发病率。(Goldberg MS,Mayo NE,Poitras B等The Ste-Justine Adolescent IdiopathicScoliosis Cohort Study.Part I:Description of the study.Spine 1994；19:1551-61；Poitras B,Mayo NE,Goldberg MS等The Ste-Justine Adolescent IdiopathicScoliosis Cohort Study.Part IV:Surgical correction and back pain.Spine 1994；19:1582-8)。

当前，没有可靠的方法或测试可供用于鉴定处于发展IS的风险的受试者以预测哪些受影响的个体需要治疗来预防或终止所述疾病的进展，以使得可以尽早提供适当治疗并且预防外科手术并发症以及心脏和/或呼吸问题。(Weinstein SL,Dolan LA,Cheng JC等Adolescent idiopathic scoliosis.Lancet 2008；371:1527-37)。

因此，当前治疗如装矫正架或外科手术矫正的应用被延迟直到检测到显著畸形或直到清楚地展示显著进展，从而导致延迟的、不太理想的治疗并且通常导致严重的心理后遗症(Society SR.Morbidity&Mortality Committee annual Report 1997)。

当前，为了检测畸形，使诊断的儿童在几年内经受多次射线照相，通常直到他们达到骨骼成熟。据估计，患有脊柱侧凸的典型患者将在3年时期内具有大约22次放射学检查。多次射线照相检查存在潜在风险。也是由于这一原因，能够允许进行特发性脊柱侧凸的预后的替代方法是强烈合乎需要的。

在开发能够有助于患者的治疗选择的诊断测试方面的主要限制是AIS的异质性质。在临床水平，AIS的异质性通过弯曲形态的变化性、定位和弯曲幅度、甚至在具有多个受影响的成员的家庭清楚地显示。

在不存在可靠的AIS表型的情况下，需要更好地了解与疾病发作和脊柱畸形进展相关的分子变化。疾病的分子定义正在迅速替代传统的基于病理学的疾病描述，这是部分由于其在鉴定针对患者的最佳治疗方案中的效用。

为此目的，在AIS患者之中报道了差别褪黑激素信号传导功能障碍的存在，从而导致他们分层为三种功能组或生物内在表型(Moreau等,2004)；(Azeddine等,2007)；(Letellier等,2008)以及Moreau的WO2003/073102。更具体地说，AIS患者被分层为代表不同生物内在表型的三个功能组(FG1、FG2和FG3)。根据此分层，当与健康对照受试者相比时，脊柱侧凸患者和处于更高发展脊柱侧凸风险的儿童对Gi蛋白刺激的反应较小，并且所述分类是基于相对于对照组的减少程度的百分比。分类范围被固定为对于FG3在相对于对照组约10％与40％的反应减少之间，对于FG2在相对于对照组约40％与60％的反应减少之间，对于FG1在相对于对照组约60％与90％的反应减少之间。

最近，使用细胞介电谱(CDS)技术(其是用于G蛋白以及偶联至这些蛋白的内源性受体的功能评价的无标记方法(Verdonk等,2006))，据发现，在通过褪黑激素刺激退黑激素受体之后的细胞反应在正常成骨细胞中主要是Gi依赖性的并且在来源于AIS患者的成骨细胞中减少至不同程度(Akoume等,2010)。大约33％的被诊断具有缺陷型Gi蛋白功能的无症状儿童已在许多年之后发展脊柱侧凸(Akoume等,2010)。

脊柱侧凸的早期检测/预后不仅是对于成功的和侵入性更小的临床结果来说关键的，而且扩大临床医师的治疗选择范围。确实，改进患者分层和疾病分期代表在患者的脊柱畸形太晚期之前选择用于微创外科手术的AIS患者的关键步骤。OPN(多功能细胞因子)已被鉴定为特发性脊柱侧凸的发展中的潜在关键病理生理促成因素。具体地，患有特发性脊柱侧凸的患者中和双足小鼠(所述疾病的完善确立的动物模型)中的血浆OPN水平增加与所述疾病相关(参见Moreau的WO 2008/119170)。

普遍认为脊柱侧凸的发展受姿势机制影响。天然地存在于人中或在动物中实验诱导的双足病状似乎在脊柱侧凸畸形的表现中起重要作用(Machida等,1999)。重要地，据报道，当C57Bl/6或C3HHe背景的小鼠在其前肢和尾部的切断之后获得40周的双足姿势时，所述小鼠发展密切类似于人特发性脊柱侧凸的脊柱侧凸(Machida等,2006)；(Oyama等,2006)。因此，为了解决OPN是否促成特发性脊柱侧凸的发展的问题，我们利用了C57Bl/6背景的OPN缺陷型小鼠的可用性。

本说明书参考多个文献，所述文献的内容以引用的方式整体并入本文。

发明概述

本发明显示OPN主要经由α₅β₁整联蛋白接合减少体外信号传导。不受这种假设约束，OPN干扰GiPCR的信号传导的机制据信是通过经由整联蛋白β₁亚基螯合一部分Gi蛋白来消减对于这些受体来说必要的功能性Gi蛋白以及使剩余的Gi蛋白在通过接合于α₅β₁整联蛋白的信号传导级联中的不同激酶磷酸化之后失活。此外，结合OPN的CD44水平和/或生物利用率可以调节OPN对GiPCR信号传导的抑制作用。本发明显示CD44的消减加剧OPN的抑制作用并且透明质酸(HA)(一种已知的CD44配体)以剂量依赖性方式进一步增强OPN的作用。HA表现出比OPN针对CD44的更高结合亲和力。因此，HA与OPN竞争连接CD44；从而提高OPN结合α₅β₁整联蛋白且抑制GiPCR信号传导的生物利用率。最后，本发明显示CD44中突变的存在进一步减少脊柱侧凸受试者的成骨细胞中的GiPCR信号传导。

因此，本发明涉及一种增加有需要的受试者的细胞中的GiPCR信号传导作用的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的：(a)OPN表达和/或活性的抑制剂；(b)整联蛋白α₅β₁的抑制剂；或(c)(a)与(b)的组合，由此增加有需要的受试者的细胞中的GiPCR信号传导作用。

根据相关方面，本发明涉及一种治疗或预防有需要的受试者中的脊柱侧凸的方法，所述方法包括降低所述受试者的细胞中的α5β1表达或活性(例如，与OPN的结合)。在一个实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用有效量的整联蛋白α5β1表达或活性的抑制剂。

在一个具体实施方案中，OPN活性的抑制剂是OPN抗体。在另一个具体实施方案中，OPN表达的抑制剂是对OPN具有特异性的siRNA。在另一个具体实施方案中，α₅β₁的抑制剂是(a)特异性地结合整联蛋白亚基α₅的抗体；(b)特异性地结合整联蛋白亚基β₁的抗体；或(c)(a)与(b)的组合。在一个具体实施方案中，α₅β₁的抑制剂是对α₅或β₁具有特异性的siRNA。

根据本发明的另一方面，提供一种选择作为降低或防止由OPN诱导的GiPCR信号传导抑制的潜在候选物的药剂的方法，所述方法包括使候选药剂与表达(i)OPN、(ii)整联蛋白α₅β₁和/或(iii)CD44/sCD44的细胞相接触，其中(a)当OPN表达或活性在所述候选药剂存在下相较于在所述候选药剂不存在下降低时；(b)当整联蛋白α₅β₁表达或活性(例如，与OPN的结合)在所述候选药剂存在下相较于在所述候选药剂不存在下降低时；(c)当sCD44和/或CD44表达(水平)或与OPN的结合在所述候选药剂存在下相较于在所述候选药剂不存在下增加时；或(d)(a)、(b)和(c)中的至少两者的任何组合，选择所述候选药剂。

根据本发明的另一方面，提供一种选择作为降低或防止GiPCR信号传导作用的潜在候选物的药剂的方法，所述方法包括使候选药剂与表达(a)OPN和/或(b)整联蛋白α₅β₁的细胞相接触，其中(a)当OPN表达或活性在所述候选药剂存在下相较于在所述候选药剂不存在下增加时；和/或(b)当整联蛋白α_5/β₁在所述候选药剂存在下相较于在所述候选药剂不存在下增加时，选择所述候选药剂。

根据本发明的另一方面，提供用于在增加有需要的受试者的细胞中的GiPCR信号传导作用中使用的(i)OPN表达或活性的抑制剂；ii)整联蛋白α₅β₁表达或活性的抑制剂；iii)sCD44或sCD44/CD44表达的刺激剂；或iv)(i)至(iii)中的至少两者的任何组合。

根据本发明的另一方面，提供(i)OPN表达或活性的抑制剂；ii)整联蛋白α₅β₁表达或活性的抑制剂；iii)sCD44或sCD44/CD44表达的刺激剂；或iv)(i)至(iii)中的至少两者的任何组合用于制备用以增加有需要的受试者的细胞中的GiPCR信号传导作用的药剂的用途。

根据本发明的另一方面，提供一种用于增加有需要的受试者的细胞中的GiPCR信号传导作用的组合物，所述组合物包含(i)OPN表达或活性的抑制剂；(ii)α₅β₁表达或活性的抑制剂；(iii)sCD44或sCD44/CD44表达的刺激剂；或(iv)(i)至(iii)中的至少两者的任何组合。

在一个具体实施方案中，有需要的受试者是被诊断患有脊柱侧凸或处于发展脊柱侧凸风险的受试者。

根据本发明的另一方面，提供一种增加有需要的受试者的细胞中的GiPCR信号传导作用的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的整联蛋白α₅β₁表达和/或活性的抑制剂，由此增加所述受试者的细胞中的GiPCR信号传导作用。

在一个具体实施方案中，所述方法还包括向所述受试者施用有效量的OPN表达和/或活性的抑制剂。在另一个具体实施方案中，OPN活性的抑制剂是OPN抗体。在另一个具体实施方案中，OPN表达的抑制剂是对OPN具有特异性的siRNA。在另一个具体实施方案中，α₅β₁活性的抑制剂是(a)特异性地结合整联蛋白亚基α₅的抗体；(b)特异性地结合整联蛋白亚基β₁的抗体；(c)特异性地结合整联蛋白亚基α₅β₁的抗体；(d)特异性地阻断OPN与α₅β₁整联蛋白的结合的分子；或(e)(a)至(d)中的至少两者的任何组合。在另一个具体实施方案中，所述特异性地阻断OPN与α₅β₁整联蛋白的结合的分子是RGD肽或其衍生物。在另一个具体实施方案中，所述特异性地阻断OPN与α₅β₁整联蛋白的结合的分子是包含RGD基序的OPN的肽片段。在另一个具体实施方案中，OPN的所述肽片段包含氨基酸序列GRGDSVVYG LRS(SEQ ID NO:18)。在另一个具体实施方案中，α₅β₁表达的抑制剂是对α₅或β₁具有特异性的siRNA。在一个具体实施方案中，所述方法还包括向所述受试者施用i)有效量的sCD44或其片段，所述sCD44或其片段特异性地结合OPN；或ii)sCD44和/或CD44表达的刺激剂。

根据本发明的另一方面，提供整联蛋白α₅β₁表达和/活性的抑制剂在制备用于抑制有需要的受试者的细胞中的GiPCR信号传导作用的药剂中的用途。

根据本发明的另一方面，提供整联蛋白α₅β₁表达和/活性的抑制剂用于抑制有需要的受试者的细胞中的GiPCR信号传导作用的用途。

根据本发明的另一方面，提供一种用于在抑制有需要的受试者的细胞中的GiPCR信号传导作用中使用的整联蛋白α₅β₁表达和/活性的抑制剂。

在所述用途或所述抑制剂的一个具体实施方案中，所述α₅β₁活性的抑制剂是(a)特异性地结合整联蛋白亚基α₅的抗体；(b)特异性地结合整联蛋白亚基β₁的抗体；(c)特异性地结合整联蛋白亚基α₅β₁的抗体；(d)特异性地阻断OPN与α₅β₁整联蛋白的结合的分子；或(e)(a)至(d)中的至少两者的任何组合。在所述用途或所述抑制剂的另一个具体实施方案中，所述特异性地阻断OPN与α₅β₁整联蛋白的结合的分子是RGD肽或其衍生物。在另一个具体实施方案中，所述特异性地阻断OPN与α₅β₁整联蛋白的结合的分子是包含RGD基序的OPN的肽片段。在另一个具体实施方案中，OPN的所述肽片段包含氨基酸序列GRGDSVVYGLRS(SEQ IDNO:18)。在另一个具体实施方案中，整联蛋白α₅β₁表达的抑制剂是对α₅或β₁具有特异性的siRNA。

根据本发明的另一方面，提供一种组合物，所述组合物包含本发明的抑制剂和药物载体。

在另一个具体实施方案中，所述组合物是用于增加有需要的受试者的细胞中的GiPCR信号传导。

在本发明的所述方法、所述用途、所述抑制剂或所述组合物的具体实施方案中，所述受试者是被诊断患有脊柱侧凸或处于发展脊柱侧凸风险的受试者。在另一个具体实施方案中，所述脊柱侧凸是特发性脊柱侧凸。在另一个具体实施方案中，所述脊柱侧凸是青少年特发性脊柱侧凸(AIS)。

根据本发明的另一方面，提供一种确定受试者中发展脊柱侧凸的风险的方法，所述方法包括：(i)提供从所述受试者分离的细胞样品；(ii)检测来自所述受试者的细胞样品中CD44风险等位基因或与其连锁不平衡的标记物的至少一个拷贝的存在，所述CD44风险等位基因在CD44的氨基酸位置230处引入突变；以及(iii)当在来自所述受试者的细胞样品中检测到所述风险等位基因或与其连锁不平衡的标记物的至少一个拷贝时，确定所述受试者处于发展脊柱侧凸的风险。

在一个具体实施方案中，所述风险等位基因包含SNP rs1467558并且所述突变将CD44的位置230处的异亮氨酸改变成苏氨酸。

根据本发明的另一方面，提供一种分层患有脊柱侧凸(例如，特发性脊柱侧凸，如青少年特发性脊柱侧凸(AIS))的受试者的方法，所述方法包括：(i)提供从所述受试者分离的细胞样品；(ii)检测来自所述受试者的细胞样品中CD44风险等位基因或与其连锁不平衡的标记物的至少一个拷贝的存在，所述CD44风险等位基因在CD44的氨基酸位置230处引入突变；以及(iii)(a)当在来自所述受试者的细胞样品中检测到所述CD44风险等位基因或与其连锁不平衡的标记物的至少一个拷贝时，将所述受试者分层为第一AIS亚类；或(b)当在来自所述受试者的细胞样品中未检测到所述CD44风险等位基因时，将所述受试者分层为第二AIS亚类。

在一个具体实施方案中，所述突变将CD44的位置230处的异亮氨酸改变成苏氨酸。在另一个具体实施方案中，所述CD44风险等位基因的至少一个拷贝由所述CD44风险等位基因的两个拷贝组成，并且所述受试者对于所述突变来说是纯合子。在另一个具体实施方案中，所述样品是核酸样品。在另一个具体实施方案中，所述样品是蛋白质样品。

根据本发明的另一方面，本发明提供一种用于进行如权利要求24至30中任一项所定义的方法的试剂盒，所述试剂盒包括：(i)用于检测CD44风险等位基因的核酸探针或引物，所述CD44风险等位基因在编码CD44的氨基酸230的密码子中包含突变；和/或(ii)特异性地检测CD44的氨基酸230处的突变的蛋白质配体。

在一个具体实施方案中，所述核酸探针或引物包含核酸序列，所述核酸序列与编码CD44的氨基酸位置230处的苏氨酸的核酸特异性地杂交。在另一个具体实施方案中，所述蛋白质配体是对在氨基酸位置230处包含苏氨酸的CD44蛋白具有特异性的抗体。

在阅读仅参考附图通过举例给出的本发明的具体实施方案的以下非限制性描述后，本发明的其他目的、优点和特征变得更明显。

附图简述

在附图中：

图1示出OPN的遗传缺失通过改善Gi蛋白介导的受体信号转导来保护双足C57BL6免于脊柱侧凸。(A-D)使雌性C57Bl/6野生型(WT)和OPN敲除(OPN^-/-)小鼠在1月龄时截去前肢和尾部且经受双足步行持续36周以诱导脊柱侧凸。如在实验期结束时取得的脊柱的X射线照片。OPN^-/-小鼠不会在四足或甚至双足小鼠中发展脊柱侧凸，而WT在双足小鼠中发展脊柱侧凸。(E)在C57Bl/6(WT)四足和双足小鼠中检测到血浆OPN，并且双足小鼠显示比四足WT小鼠更高的血浆OPN。(F-I)使用DAMGO、生长激素抑制素、羟甲唑啉(oxymethazolin)以及爱帕林(apelin)检查来自WT和OPN-/-小鼠的成骨细胞中的GiPCR信号传导。所述反应在OPN^-/-成骨细胞中比WT成骨细胞中更大。另一方面，双足WT小鼠显示比四足WT更低的反应。(J-M)用PTX预处理来自WT和OPN^-/-小鼠的成骨细胞响应于先前激动剂中的每种阻断Gi对其在这些细胞中的同源受体的偶联。这指示这些化合物引起WT和OPN^-/-成骨细胞中的GiPCR的典型CDS反应分布。(N-O)异丙肾上腺素和去氨加压素用于活化Gs，而缓激肽和内皮素-1用于通过其同源受体活化Gq。来自OPN^-/-小鼠的成骨细胞对Gs刺激的反应比来自WT小鼠的成骨细胞对Gs刺激的反应小，而在WT和OPN^-/-成骨细胞中引发的Gq刺激中无差异。

图2示出细胞外OPN引起Gi蛋白偶联受体信号传导功能障碍。(A)将OPN在MC3T3-E1成骨细胞细胞系中通过siRNA敲低并且通过CDS测量GiPCR配体诱导细胞信号传导的能力。对DAMGO和羟甲唑啉的的细胞反应显著大于消减OPN的细胞。(B)在MC3T3-E1成骨细胞细胞系中通过OPN特异性抗体阻断的OPN给出与(A)中相同的结果。(C-D)将MC3T3-E1成骨细胞在DAMGO和羟甲唑啉刺激之前用外源性重组OPN(rOPN)进行处理。在每种情况下，rOPN以浓度依赖性方式引起综合反应的降低，这通过OPN抗体防止。

图3示出CD44不参与由细胞外OPN引起的GiPCR信号传导抑制但可调节OPN的作用。(A)在MC3T3-E1成骨细胞细胞系中通过CD44特异性抗体阻断CD44并且用rOPN 0.5μg/ml处理细胞进一步加重由OPN诱导的GiPCR信号传导缺陷而不会降低由OPN引起的GiPCR信号传导缺陷。DAMGO和羟甲唑啉用作GiPCR的激动剂。(B-C)为了验证抗CD44抗体的活性，将用IgG对照或CD44抗体预处理的细胞用增加浓度的透明质酸(HA)(CD44的高亲和力配体)刺激。由HA诱导的综合反应通过用CD44抗体预处理完全消除。此外，CD44抗体对于对HA刺激的反应的作用是浓度依赖性的。(D-E)将CD44在MC3T3-E1成骨细胞细胞系中通过siRNA敲低。siRNA转染的效率和CD44表达的抑制通过qPCR(D)和蛋白质印迹分析(E)展示。(F)CD44的敲低导致与(A)类似的结果，并且CD44敲低不会降低由OPN引起的GiPCR信号传导缺陷，而是进一步加重所述缺陷。(G-H)rOPN处理引起来自双足CD44敲除(CD44-/-)小鼠的成骨细胞中对DAMGO和羟甲唑啉两者的反应的浓度依赖性降低。(I-J)当与来自四足(CD44-/-)小鼠的成骨细胞相比时，来自双足(CD44-/-)小鼠的成骨细胞对DAMG或羟甲唑啉的反应较低。(K-P)CD44抑制和HA以剂量依赖性方式加强OPN对GiPCR信号传导的作用。(K)响应于对GiPCR信号传导的LPA刺激，以剂量依赖性方式，相较于野生型细胞，CD44-/-成骨细胞的反应较低并且OPN-/-成骨细胞反应较高。(L)相较于对照，用HA(CD44受体的天然激动剂)处理加剧野生型成骨细胞中的GiPCR信号传导缺陷。在重组OPN(rOPN)存在下使用HA或抗体(CD44fab)抑制CD44也加剧所述信号传导缺陷。当以两种方式(HA+CD44Fab)抑制CD44时，反应被降低最多。(M)使用CD44-/-成骨细胞的相同实验未显示对HA或抗CD44抗体的任何敏感性。(N、O和P).在OPN存在下通过使用CD44-/-成骨细胞去除CD44的作用或通过用HA处理野生型细胞来抑制CD44受体对GiPCR信号传导反应具有相同作用。

图4示出RGD依赖性整联蛋白介导OPN对GiPCR信号传导的抑制作用。(A-B和C)OPN通过RGD基序结合整联蛋白并且这在通过bio1211抑制SVVYGLR结合基序时是清楚的，bio1211选择性地抑制α₄β₁整联蛋白(成骨细胞中存在的唯一含有SVVYGLR的整联蛋白)。Bio1211不会影响OPN信号传导，而用rOPN和RDG肽共同孵育细胞完全防止rOPN对于对DAMGO和羟甲唑啉的反应的抑制作用。(D-E)用高浓度的RGD孵育来自WT小鼠的成骨细胞展示对DAMGO或羟甲唑啉的反应的显著增加，而在来自OPN^-/-小鼠的成骨细胞中未观察到变化。

图5示出参与通过OPN抑制GiPCR信号传导的整联蛋白的鉴定。(A，B)使用特异性抗体阻断不同整联蛋白和(C)敲低MC3T3-E1成骨细胞中的这些整联蛋白。只有抑制细胞中的α₅和β₁整联蛋白才逆转OPN对GiPCR信号传导的抑制作用。(D-E-F敲低C57Bl/6双足WT和CD44^-/-小鼠中的α₅和β₁整联蛋白逆转rOPN对于对DAMGO和羟甲唑啉两者的反应的抑制作用。

图6示出OPN降低Gi蛋白对其同源受体的可用性。(A、B、C)将MC3T3-E1成骨细胞用PBS或rOPN处理。针对三种不同GPCR的表达通过蛋白质印迹对细胞裂解产物进行分析：μ-阿片(MO)受体、溶血磷脂酸1型(LPA1)受体和褪黑激素2型(MT2)受体(A)，同时通过蛋白质印迹(B)和qPCR(C)检测Gi₁、Gi₂和Gi₃蛋白同种型表达。rOPN处理对Gi蛋白或mRNA(B,C)或GiPCR蛋白(A)的量无显著作用。(D-E-F)将细胞裂解产物用针对MO、MT2或β1整联蛋白受体的抗体免疫沉淀，并且使用对Gi₁、Gi₂或Gi₃同种型具有特异性的抗体通过蛋白质印迹检查每种沉淀物中Gi蛋白的存在。在rOPN处理之后这些Gi蛋白同种型中的每种的量在β1整联蛋白沉淀物中升高。

图7示出OPN增强Gi蛋白的磷酸化。(A)将MC3T3-E1细胞用rOPN处理或在rOPN处理之前用针对α₅β₁整联蛋白的抗体预处理，并且然后使用针对Gi₁、Gi₂或Gi₃蛋白同种型的抗体对细胞裂解产物进行免疫沉淀(IP)，并且通过抗磷酸丝氨酸/苏氨酸或抗酪氨酸抗体通过蛋白质印迹揭示磷酸化的存在。(B)将来自脊柱侧凸双足WT或CD44^-/-小鼠的成骨细胞裂解产物通过针对Gi₁、Gi₂和Gi₃蛋白的抗体免疫沉淀，接着使用针对抗磷酸丝氨酸/苏氨酸或抗磷酸酪氨酸的抗体蛋白质印迹。(C-E)将从MC3T3-E1细胞制备的细胞提取物在激酶抑制剂存在或不存在下用rOPN处理，接着用针对Gi₁、Gi₂或Gi₃蛋白同种型的抗体免疫沉淀，并且使用抗磷酸丝氨酸/苏氨酸或抗磷酸酪氨酸抗体蛋白质印迹。

图8示出OPN对GsPCR蛋白的作用。(A)将MC3T3-E1细胞用rOPN或PBS处理(A)通过异丙肾上腺素或去氨加压素刺激；或(B)通过针对Gs的抗体免疫沉淀，接着用针对抗磷酸丝氨酸/苏氨酸的抗体免疫印迹；或(C-D)通过针对MOR或MT2R的抗体免疫沉淀，接着用针对Gs的抗体蛋白质印迹。(E)将MC3T3-E1细胞用PTX处理以模拟rOPN的破坏作用并且与用单独rOPN或与用于防止酪氨酸磷酸化的Src抑制剂(PP2)组合处理的细胞相比较。

图9示出CD44中的CT SNP加剧OPN对GiPCR信号传导的抑制作用。(A)将来自携带CTSNP的AIS受试者和来自健康受试者的成骨细胞用OPN处理并且在用LPA刺激之后评定对GiPCR信号传导的作用。(B)与(A)中相同，除了将所述细胞样品用增加浓度的OPN处理之外。CT SNP的存在降低约50％GiPCR信号传导。

图10示出所提出的机制的示意性图示，通过所述机制OPN降低GiPCR信号传导并且促成脊柱畸形的发展。在OPN结合之后，α₅β₁整联蛋白从共同库募集一部分Gi蛋白，然后促进不同信号传导途径，从而导致不同激酶的活化，这直接或间接地磷酸化所述共同库中的一部分剩余的Gi蛋白，从而导致降低的GiPCR信号传导。

示意性实施方案的说明

如本文所用，术语“发展脊柱侧凸的风险”是指受试者在未来发展脊柱侧凸(即脊柱畸形)和/或发展更严重的脊柱侧凸(即弯曲进展)的遗传或代谢素因。例如，受试者的科布角(Cobb’s angle)的增加(例如，从40°至50°或从18°至25°)是脊柱侧凸的“发展”。

在一个实施方案中，上述受试者是发展脊柱侧凸，如特发性脊柱侧凸(例如，婴儿特发性脊柱侧凸、少年型特发性脊柱侧凸或青少年特发性脊柱侧凸(AIS))的可能候选者。如本文所用，术语“发展脊柱侧凸的可能候选者”包括父母中至少有一人具有脊柱侧凸(例如，青少年特发性脊柱侧凸)的受试者(例如，儿童)。在其他因素之中，年龄(青春期)、性别和其他家族前因是已知促成发展脊柱侧凸风险的因素并且在一定程度上用于评定发展脊柱侧凸的风险。在某些受试者中，脊柱侧凸在短时期内迅速发展至需要矫正外科手术的地步(经常是畸形达到科布角≥50°时)。从脊柱侧凸如AIS被诊断的时刻(当脊柱侧凸明显时)可供使用的当前做法包括观察(当科布角在约10°-25°时)、矫形装置(当科布角在约25°-30°时)和外科手术(超过45°)。进展风险的更可靠的确定可以使得能够1)选择适当的饮食以除去被鉴定为脊柱侧凸的促成因素的某些食品；2)选择最佳治疗剂；和/或3)选择侵入性最小的可用治疗如姿势锻炼、矫形装置或侵入性较小的外科手术或无需融合的外科手术(一种不融合脊椎且保留脊柱运动性的外科手术)。本发明涵盖鉴于发展脊柱侧凸的确定的风险选择最有效的且侵入性最小的已知预防措施或治疗。

如本文所用，术语“受试者”意指任何哺乳动物，包括人、小鼠、大鼠、狗、鸡、猫、猪、猴、马等。在一个具体实施方案中，受试者是指人。

在本发明的背景下“有需要的受试者”或“患者”旨在包括将受益于或可能受益于调节(增加或降低)OPN对GiPCR信号转导的作用的任何受试者。在一个实施方案中，有需要的受试者是将受益于或可能受益于GiPCR信号转导的增加且因此受益于(a)OPN表达和/或活性的拮抗剂(抑制剂)；(b)α₅(例如，基因ID 3678，NP_002196)和/或β₁表达和/或活性的拮抗剂(抑制剂)；或(c)sCD44或CD44表达的增加的受试者。在一个具体实施方案中，有需要的受试者是相较于对照受试者具有高OPN水平的受试者。在一个具体实施方案中，高OPN水平对应于≥至约600ng/ml、≥至约700ng/ml、≥至约800ng/ml、≥至约900ng/ml或≥至约1000ng/ml的OPN水平，如在来自受试者的血液样品中所测量。在一个实施方案中，有需要的受试者是被诊断患有脊柱侧凸(例如，AIS)的受试者。在另一个实施方案中，有需要的受试者是可能发展脊柱侧凸(例如，AIS)的受试者。

如本文所用，术语“生物样品”是指从生物分离的任何固体或液体样品。在一个具体实施方案中，生物样品是指从人分离的任何固体或液体样品。不受如此限制，生物样品包括活组织检查材料、血液、泪液、唾液、母乳、滑液、尿液、耳液、羊水和脑脊液。在一个具体实施方案中，生物样品是指血液样品。

如本文所用，术语“血液样品”意指血液、血浆或血清。

如本文所用，术语“对照样品”意指不来自已知患有脊柱侧凸或已知是发展脊柱侧凸的可能候选者的受试者的样品。在用于确定被预先诊断患有脊柱侧凸的受试者中发展脊柱侧凸风险的方法中，然而所述样品还可来自在所述疾病或病症的早期阶段在密切注意下的受试者。在一个具体实施方案中，对照样品可来自被诊断患有脊柱侧凸且属于同一功能组(例如，FG1、FG2或FG3)在所述疾病或病症的早期阶段(或晚期阶段)的另一个受试者。

如本文所用，术语“对照”意指涵盖“对照样品”。在某些实施方案中，术语“对照”还指在测定多种样品(例如，从未知患有脊柱侧凸且未知是发展脊柱侧凸的可能候选者的一些受试者获得的样品)中的GiPCR信号传导作用之后获得的平均值或中值。

如本文所用，关于脊柱侧凸的术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”意指以下中的至少一种：预先存在的脊柱畸形的科布角的减小；改善脊柱运动性；保留/维持脊柱运动性；改善具体计划中的均衡和平衡；维持/保留具体计划中的均衡/平衡；改善具体计划中的功能性；保留/维持具体计划中的功能性；美容学改善；以及任何以上的组合。

如本文所用，关于脊柱侧凸的术语“预防(preventing)”或“预防(prevention)”意指以下中的至少一种：患有脊柱侧凸的患者中或无症状患者中科布角进展的降低；脊柱畸形的出现(包括在3D上影响肋架和骨盆的变化)的完全预防；以及任何以上的组合。

术语“抑制因子”、“抑制剂”和“拮抗剂”是本领域中熟知的并且在本文可互换地使用。它们包括细胞内以及细胞外抑制剂。

术语“OPN的抑制剂”或“OPN拮抗剂”包括能够不利地影响(即，完全或部分降低)细胞中的OPN(例如，基因ID 6696，NP_001035147.1(SEQ ID NO:25)和NM_001040058(SEQ IDNO:26))的表达和/或活性的任何化合物。在一个具体实施方案中，细胞中的OPN的活性是GiPCR信号传导的降低。类似地，术语“α₅β₁的抑制剂”、“α₅的抑制剂”或“β₁的抑制剂”等包括能够不利地影响细胞中的α₅(例如，基因ID3678，NP_002196(SEQ ID NO:23)和NM_002205.2(SEQ ID NO:24))和/或β₁(基因ID 3688，NP_002202(SEQ ID NO:21)和NM_002211.3(SEQID NO:22))的表达和/或活性的任何化合物。在一个具体实施方案中，细胞中的α₅和/或β₁的“活性”是导致GiPCR信号传导的OPN依赖性抑制的信号的转导。

术语“OPN表达的抑制剂”或“α₅β₁表达的抑制剂”包括能够不利地影响OPN、α₅和/或β₁的表达(即，在转录和/或翻译水平)、即OPN/α₅或β₁mRNA和/或蛋白质的水平或所述蛋白质的稳定性的任何化合物。不受如此限制，这类抑制剂包括RNA干扰剂(siRNA、shRNA、miRNA)、反义分子和核酶。这类RNA干扰剂被设计成在适合条件下与其靶核酸特异性地杂交并且因此与其靶核酸大致上互补。

术语“OPN活性的抑制剂”或“α₅β₁活性的抑制剂”是指能够降低或阻断OPN或α₅β₁对Gi介导的信号传导的作用的任何分子。这些分子通过完全或部分地阻断/降低由OPN和/或α₅β₁活性诱导的抑制作用来增加细胞中的GiPCR信号传导。OPN活性的抑制剂的非限制性实例包括蛋白质(例如，显性阴性、无活性变体)、肽、小分子、抗OPN抗体(中和抗体)、抗体片段、α₅和/或β₁整联蛋白的无活性片段等。α₅β₁活性的抑制剂的非限制性实例包括蛋白质(例如，显性阴性、无活性变体)、肽(RGD肽或RGD肽衍生物)、小分子、抗α₅和/或β₁抗体(例如，中和抗体，如Volociximab^TMM200)、抗体片段等。在一个实施方案中，所述RGD肽是包含RGD基序的OPN的肽片段，所述RGD基序包含对应于OPN的氨基酸158至169的氨基酸序列GRGDSVVYGLRS(SEQ ID NO:18)。在一个实施方案中，包含RGD基序的OPN片段包含OPN的氨基酸158至162、158至165、158至167、158至170、158至175、158至180、158至185、158至190、158至195或158至200(例如，SEQ ID NO:25)。在一个实施方案中，包含RGD基序的OPN的肽片段包含OPN的氨基酸158至161、156至161、154至161、152至162、150至162、148至162、146至162、144至162、140至162、159至163、159至164、159至162、159至166、159至167或159至169(例如，SEQ ID NO:25)。

在一个实施方案中，“OPN活性的抑制剂”是针对(或特异性地结合)人OPN多肽的中和抗体，所述中和抗体抑制OPN与α₅β₁的结合(即，与α₅和/或β₁整联蛋白的结合)。在一个实施方案中，“α₅β₁活性的抑制剂”是针对(或特异性地结合)人α₅β₁(α₅和/或β₁)多肽的中和抗体，所述中和抗体抑制OPN与α₅β₁的结合(即，与α₅和/或β1整联蛋白的结合)。在一个实施方案中，所述抗体结合OPN的RGD结构域。在一个实施方案中，所述抗体是针对OPN的氨基酸159至162、158至162、158至165、158至167、158至170、158至175、158至180、158至185、158至190、158至195或158至200(例如，SEQ ID NO:25)。在一个实施方案中，所述抗体是针对OPN的氨基酸158至161、156至161、154至161、152至162、150至162、148至162、146至162、144至162、140至162、159至163、159至164、159至162、159至166、159至167或159至169(例如，SEQID NO:25)。

术语sCD44/CD44表达(例如，基因ID 960，NM_000610(SEQ ID NO:19)，NP_000601.3(SEQ ID NO:20))的“刺激剂”或“增强剂”是指能够增加CD44的水平或表达的药剂，能够增加CD44分泌的药剂。在一个实施方案中，sCD44/CD44的刺激剂是能够增加CD44针对OPN的亲和力的药剂。不受如此限制，所述药剂可以是蛋白质、肽、小分子或核苷酸。

降低OPN对GiPCR信号传导的作用的一种可能的方式是通过例如增加或促进OPN与CD44的结合来降低OPN与α₅β₁整联蛋白的相互作用。透明质酸(HA)已知结合CD44。如本文所示，HA可能地通过增加OPN对α₅β₁的生物利用率(例如，通过螯合不再可用于结合OPN的CD44)来增强OPN的作用。因此，将受益于OPN抑制和GiPCR信号传导作用的增加的受试者不应服用HA补充剂和/或应通过例如避免或减少他/她的特别富含HA或已知增加HA合成的食物消耗来减少他们的食物HA摄取。这类食物的非限制性实例包括肉类和肉类器官(如，小牛肉、小羊肉、牛肉和胗、肝脏、心脏和肾脏)、鱼、家禽(包括肉鱼和家禽肉汤)、大豆(包括豆奶)、含淀粉的根类蔬菜(包括土豆和甘薯)。特别富含HA的甘薯包括satoimo和imoji(两种日本甘薯)。

本发明还涉及用于测定OPN、α₅β₁整联蛋白和/或CD44的表达(即转录物(RNA)或翻译产物(蛋白质))的水平的方法。如本文所用，术语α₅β₁在本文用于指α₅β₁整联蛋白。在具体实施方案中，本发明还包括一种方法，所述方法包括测定一种或多种其他脊柱侧凸标记物的表达水平(参见例如Moreau的WO 2008/119170)。本发明因此涵盖用于这种测定的任何已知的方法，包括ELISA(酶联免疫吸附测定)、RIA(放射免疫测定)、免疫荧光、实时PCR和竞争性PCR、RNA印迹、核酸酶保护、噬菌斑杂交以及狭线印迹。

本发明还涉及分离的核酸分子，包括用于检测OPN、α₅β₁和sCD44/CD44(以及任选地其他脊柱侧凸标记物)的探针和引物。在具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有不超过300、或不超过200、或不超过100、或不超过90、或不超过80、或不超过70、或不超过60、或不超过50、或不超过40或不超过30个核苷酸。在具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有至少17、或至少18、或至少19、或至少20、或至少30、或至少40个核苷酸。在其他具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有至少20且不超过300个核苷酸。在其他具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有至少20且不超过200个核苷酸。在其他具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有至少20且不超过100个核苷酸。在其他具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有至少20且不超过90个核苷酸。在其他具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有至少20且不超过80个核苷酸。在其他具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有至少20且不超过70个核苷酸。在其他具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有至少20且不超过60个核苷酸。在其他具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有至少20且不超过50个核苷酸。在其他具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有至少20且不超过40个核苷酸。在其他具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有至少17且不超过40个核苷酸。在其他具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有至少20且不超过30个核苷酸。在其他具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有至少17且不超过30个核苷酸。在其他具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有至少30且不超过300个核苷酸。在其他具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有至少30且不超过200个核苷酸。在其他具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有至少30且不超过100个核苷酸。在其他具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有至少30且不超过90个核苷酸。在其他具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有至少30且不超过80个核苷酸。在其他具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有至少30且不超过70个核苷酸。在其他具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有至少30且不超过60个核苷酸。在其他具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有至少30且不超过50个核苷酸。在其他具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有至少30且不超过40个核苷酸。应理解在实时PCR中，引物还构成探针，而不是所述术语的传统意义。适用于检测本发明的方法中的OPN和/或α₅β₁的引物或探针可使用分布在其对应核苷酸序列上的序列用已知的方法来设计。本发明的探针和/或引物被设计成与其靶核酸(α₅(SEQ ID NO:24)、β₁(SEQ ID NO:22)、CD44野生型(SEQ ID NO:19)或CD44风险等位基因(例如，包含230I→T(SNP(CT))变体)和/或OPN(SEQ ID NO:26))特异性地杂交。在一个实施方案中，本发明的引物和探针与其靶核酸大致上互补。

大致上互补的核酸是其中一个分子的互补序列与另一分子大致上相同的核酸。在最优比对时，如果两个核酸或蛋白质序列共享至少约70％序列同一性，那么它们被认为是大致上相同的。在替代实施方案中，序列同一性可以是例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少98％或至少99％。用于同一性比较的序列最优比对可使用多种算法进行，如Smith和Waterman,1981,Adv.Appl.Math 2:482的局部同源性算法；Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法；Pearson和Lipman的相似性搜索方法；以及这些算法的计算机化实施(如Wisconsin Genetics SoftwarePackage,Genetics Computer Group,Madison,WI,U.S.A.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)。序列同一性还可使用描述于Altschul等1990中的BLAST算法(使用公开的默认设置)来测定。用于执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心获得(通过互联网http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。所述BLAST算法涉及首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字串来鉴定高得分序列对(HSP)，所述短字串在与数据库序列中具有相同长度的字串比对时匹配或满足某些正值的阈值分数T。T被称为指邻近字串得分阈值。初始邻近字串命中充当种子用于起始搜索以发现较长的HSP。所述字串命中沿着每个序列在两个方向延伸，远至能够增加累积比对得分。每个方向上字串命中的延伸在满足以下参数时停止：累积比对得分由其达到的最大值降低数量X；由于一个或者多个残基比对负值的积累而使累积得分降至0或者以下；或者达到任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。一种使用BLAST算法的两个序列之间的统计相似性量度是最小和概率(P(N))，其提供两个核苷酸或者氨基酸序列之间将偶然发生匹配的概率的指示。在本发明的替代实施方案中，如果测试序列的比较中的最小和概率小于约1、优选小于约0.1、更优选小于约0.01、并且最优选小于约0.001，则认为核苷酸或氨基酸序列大致上相同。

两个核酸序列大致上互补的替代指示是所述两个序列在中等严格条件或优选地严格条件下彼此杂交。在中等严格条件下与滤膜结合的序列杂交可以例如在65℃下在0.5MNaHPO4、7％十二烷基硫酸钠(SDS)、1mM EDTA中进行，并且在42℃下在0.2x SSC/0.1％SDS中洗涤。或者，在严格条件下与滤膜结合的序列杂交可以例如在65℃下在0.5M NaHPO4、7％SDS、1mM EDTA中进行，并且在68℃下在0.1x SSC/0.1％SDS中洗涤。杂交条件可取决于目标序列根据已知的方法进行修改。总体上，严格条件被选择为在限定离子强度和pH下比针对所述特定序列的热解链点低约5℃。

本发明的探针可用于天然存在的糖-磷酸主链以及修饰的主链(包括硫代磷酸酯、连二硫酸酯、烷基膦酸酯以及α-核苷酸等)。修饰的糖-磷酸主链通常是已知的。本发明的探针可由核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)构建，且优选地由DNA构建。

可使用探针的检测方法的类型包括DNA印迹(DNA检测)、斑点或狭线印迹(DNA、RNA)和RNA印迹(RNA检测)。虽然是次优选的，但标记的蛋白质也可用于检测它所结合的特定核酸序列。其他检测方法包括含有在浸渍片装置上的探针的试剂盒等。

如本文所用，术语“可检测标记的”是指标记根据本发明的探针或抗体，这将允许检测根据本发明的OPN和/或α₅β₁。虽然本发明不具体地依赖于使用用于检测特定核酸序列的检测的标记，但是这种标记通过增加检测的灵敏度而可能是有益的。此外，所述标记能实现自动化。探针可根据众多熟知的方法进行标记。标记的非限制性实例包括³H、¹⁴C、³²P和³⁵S。可检测标记物的非限制性实例包括配体、荧光团、化学发光剂、酶和抗体。用于与探针一起使用的能够实现本发明的方法的灵敏度增加的其他可检测的标记物包括生物素和放射性核苷酸。对于本领域的普通技术人员将变得显而易见的是具体标记的选择决定它结合探针的方式。

如通常所已知，放射性核苷酸可通过几种方法并入本发明的探针中。其非限制性实例包括使用γ³²P ATP和多核苷酸激酶来激酶化(kinasing)探针的5’端、在放射性dNTP存在下使用大肠杆菌的Pol I的Klenow片段(例如，在低熔点凝胶中使用随机寡核苷酸引物均匀标记的DNA探针)、在一种或多种放射性NTP存在下使用SP6/T7系统来转录DNA区段等。

本发明还涉及选择化合物的方法。如本文所用，术语“化合物”意指涵盖天然、合成或半合成的化合物，包括但不限于化学品、大分子、细胞或组织提取物(来自植物或动物)、核酸分子、肽、抗体以及蛋白质。

本发明还涉及阵列。如本文所用，“阵列”是可合成或生物合成制备的有意产生的分子的集合。阵列中的分子可以彼此相同或不同。所述阵列可采取多种型式，例如可溶性分子的文库；连接至树脂珠粒、二氧化硅芯片或其他固相支持体的化合物的文库。

如本文所用，“核酸分子的阵列”是可以多种不同型式合成或生物合成制备的有意产生的核酸的集合(例如，可溶性分子的文库；以及连接至树脂珠粒、二氧化硅芯片或其他固相支持体的寡核苷酸的文库)。此外，术语“阵列”意指包括可通过将基本上任何长度(例如，1至约1000个核苷酸单体长度)的核酸点样至衬底上来制备的核酸的那些文库。如本文所用的术语“核酸”是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或肽核酸(PNA))的聚合形式，其包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然、合成或生物合成修饰的、非天然或衍生化的核苷酸碱基。多核苷酸的主链可包含糖和磷酸基团(如通常可在RNA或DNA中发现)或修饰的或取代的糖或磷酸基团。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分间断。因此，术语核苷、核苷酸、脱氧核苷和脱氧核苷酸通常包括类似物，如本文所描述的那些。这些类似物是与天然存在的核苷或核苷酸具有一些共同结构特征的那些分子，以使得当并入核酸或寡核苷酸序列中时，所述分子允许与溶液中的天然存在的核酸序列杂交。通常，这些类似物通过替代和/或修饰碱基、核糖或磷酸二酯部分源自天然存在的核苷和核苷酸。所述变化可定制进行以根据需要使杂合体形成稳定或不稳定或增强与互补核酸序列的杂交的特异性。

如本文所用，“固相支持体”、“支持体”和“衬底”可互换地使用并且是指具有一个或多个刚性或半刚性表面的材料或一组材料。在许多实施方案中，所述固相支持体的至少一个表面将是大致上平坦的，但是在一些实施方案中，可能希望针对不同化合物用例如孔、隆起区域、销、蚀刻槽等来物理上分离合成区域。根据其他实施方案，所述固相支持体将采取珠粒、树脂、凝胶、微球的形式或其他几何构型。

可根据本发明使用任何已知的核酸阵列。例如，这类阵列包括基于短或较长寡核苷酸探针以及cDNA或聚合酶链式反应(PCR)产物的阵列。其他方法包括基因表达的系列分析(SAGE)、差别显示以及消减杂交方法、差异筛选(DS)、RNA任意引物(RAP)-PCR、差异表达序列的限制性内切核苷酸分析(READS)、扩增的限制性片断长度多态性(AFLP)。

抗体

本发明涵盖使用用于检测或测定例如受试者的样品中的OPN和/或α₅β₁水平且用于包括在本发明的试剂盒中的抗体。特异性地结合这些生物标记物的抗体可用以下进一步描述的方法常规地产生。本发明还涵盖使用可商购的抗体。不受如此限制，特异性地结合OPN和/或α₅β₁的抗体包括以下表1中列出的那些。

表1：可商购的人OPN Elisa试剂盒的非限制性实例

表2：针对OPN(人，未缀合的)的可商购的抗体的非限制性实例

表4：针对整联蛋白α₅(ITGA5，人)的可商购的ELISA试剂盒的非限制性实例

表5：针对α₅(ITGA5，人)的可商购的抗体的非限制性实例

表6：针对β1(ITGB1，人)的可商购的ELISA试剂盒的非限制性实例

公司名称	目录号	范围	灵敏度
				antibodies-online	ABIN833710	未分析	未分析
Merck Millipore	ECM470	未分析	未分析
				DLdevelop	DL-ITGb1-Hu	1.56-100ng/mL	未分析
Biomatik	E91042Hu	1.56-100ng/mL	0.64ng/mL

表7：针对β₁ITGB1(人，未缀合的)的可商购的抗体的非限制性实例

针对OPN、α₅和/或β₁的单克隆抗体和多克隆抗体两者包括于本发明的范围内，因为它们可通过本领域的技术人员已知的完善建立的工序来产生。此外，针对第一抗体的任何第二抗体(单克隆或多克隆)也包括于本发明的范围内。

如本文所用，术语“抗OPN抗体”、“抗α₅抗体”、“抗β₁抗体”和“抗α₅β₁抗体”或“免疫特异性抗OPN抗体”、“免疫特异性抗α₅抗体”、“免疫特异性抗β₁抗体”或“免疫特异性抗α₅β₁抗体”是指分别与OPN、α₅、β₁或α₅β₁蛋白特异性地结合(相互作用)且分别与不同于与OPN、α₅、β₁或α₅β₁蛋白共有相同抗原决定簇的蛋白质的其他天然存在的蛋白质不展示实质性结合的抗体。术语抗体或免疫球蛋白以最广泛意义使用且涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体以及抗体片段，只要其表现出所需的生物活性。抗体片段包含全长抗体的一部分，通常是其抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')₂和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；单结构域抗体(例如，来自骆驼科动物)；鲨NAR单结构域抗体；以及从抗体片段形成的多特异性抗体。抗体片段还可指包含CDR或抗原结合结构域的结合部分，包括但不限于，VH区(V_H、V_H-V_H)、anticalin、PepBodies^TM、抗体-T-细胞表位融合体(Troybodies)或肽抗体。此外，针对第一抗体的任何第二抗体(单克隆或多克隆)也包括于本发明的范围内。

总之，用于制备抗体(包括单克隆抗体和杂交瘤)和使用抗体检测抗原的技术是本领域中熟知的(Campbell,1984,In“Monoclonal Antibody Technology:LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology”,Elsevier Science Publisher,Amsterdam,The Netherlands)和Harlow等,1988(刊于：Antibody A Laboratory Manual,CSH Laboratories中)。术语抗体在本文中涵盖多克隆抗体、单克隆抗体和抗体变体，如单链抗体、人源化抗体、嵌合抗体以及抑制或中和其Hyphen中的对应相互作用结构域和/或对其有特异性的抗体的免疫活性片段(例如，Fab和Fab'片段)。

优选通过多次皮下(sc)、静脉内(iv)或腹膜内(ip)注射相关抗原(用或不用佐剂)在动物中产生多克隆抗体。使用双功能或衍生剂，例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl₂或R¹N＝C＝NR(其中R和R¹是不同的烷基)，将相关抗原与在待免疫的物种中具有免疫原性的蛋白质(例如匙孔

血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)缀合可能是有用的。

可针对抗原、免疫原性缀合物或衍生物，通过将抗原或缀合物(例如，对于兔是100μg或对于小鼠是5μg)与3体积的完全弗氏佐剂混合并且在多个部位皮内注射所述溶液来免疫动物。一个月后，通过在多个部位皮下注射用完全弗氏佐剂中的抗原或缀合物(例如，用于免疫的原始量的1/5至1/10)来加强免疫动物。7至14天后，对动物采血，并且针对抗体滴度测定血清。对动物加强免疫，直到滴度达到稳定。优选地，对于缀合物免疫，用相同抗原但缀合至不同蛋白质和/或通过不同交联试剂缀合的缀合物对动物加强免疫。还可在重组细胞培养物中将缀合物制备成蛋白质融合体。此外，聚集剂如明矾也适用于增强免疫反应。

可使用最初由Kohler等,Nature,256:495(1975)描述的杂交瘤方法来制备或可通过重组DNA方法(例如，美国专利号6,204,023)来制备单克隆抗体。还可使用美国专利号6,025,155和6,077,677以及美国专利申请公布号2002/0160970和2003/0083293中所描述的技术来制备单克隆抗体。

在杂交瘤方法中，免疫(例如，如上所述)小鼠或其他适当的宿主动物，如大鼠、仓鼠或猴以引发产生或能够产生将特异性地结合用于免疫的抗原的抗体的淋巴细胞。或者，可体外免疫淋巴细胞。然后使用适合的融合剂(如聚乙二醇)使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞。

将如此制备的杂交瘤细胞接种且生长在优选含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质的适合培养基中。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，那么用于杂交瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，所述物质防止HGPRT缺陷型细胞的生长。

如本文所用，表述“纯化抗体”中的术语“纯化”仅意味着区分人造抗体与动物针对其自己的抗原而天然产生的抗体。因此，含有抗-OPN抗体的原始血清和杂交瘤培养基是本发明意义内的“纯化抗体”。

本发明还涵盖用于检测和/或定量OPN和α₅β₁的翻译产物的阵列。所述阵列包括蛋白质微阵列或大阵列，包括高分辨2D-凝胶方法在内的凝胶技术，可能在细胞水平与质谱成像系统联用，如显微镜与荧光标记系统组合。

本发明还涵盖使用全细胞测定筛选/选择潜在有用的治疗剂的方法，所述治疗性化合物能够增加OPN和/或α₅和/或β₁的转录和/或合成、或减少CD44/sCD44的转录或合成。用于所述方法中的细胞包括任何来源(包括内部或可商购的细胞系)和类型(任何组织)的细胞。可通过例如无限增殖来自AIS受试者的细胞来制备内部细胞系。在具体实施方案中，本发明的筛选方法寻求鉴定抑制OPN和/或α₅β₁表达和/或活性的药剂。对于这些实施方案有用的细胞系包括产生高水平的OPN和/或α₅β₁或低水平的CD44/sCD44的那些细胞系。有用细胞的非限制性实例包括MC3T3-E1细胞和PBMC。

在一个具体实施方案中，所述细胞包括源自脊柱侧凸患者的任何细胞类型的细胞。(全细胞测定)。在具体实施方案中，所述细胞包括成骨细胞、软骨细胞、成肌细胞或血细胞，包括PBMC(包括淋巴细胞)。如本文所用，术语“源自脊柱侧凸患者的细胞”是指从脊柱侧凸患者直接分离的细胞，或源自从脊柱侧凸患者直接分离的细胞的无限增殖细胞系。在具体实施方案中，所述细胞是脊柱旁肌肉细胞。这类细胞可通过例如穿刺活检从受试者分离。

本发明还涉及用于调节OPN介导的GiPCR细胞信号传导和/或用于治疗或预防有需要的受试者中的脊柱侧凸(例如，特发性脊柱侧凸或AIS)的药物组合物。所述组合物包括用于增加或降低有需要的受试者中的OPN介导的GiPCR信号传导抑制的药剂。例如，本发明的药物组合物可包含针对OPN、α₅、β₁和/或α₅β₁的OPN、α₅、β₁和/或α₅β₁抗体(即，中和抗体)、RGD肽或反义/siRNA以降低OPN和/或α₅β₁活性。在一个实施方案中，所述药物混合物可包含sCD44或sCD44/CD44表达的刺激剂/增强剂。药物组合物可通过任何适合的途径施用，所述途径如经鼻、静脉内、肌肉内、皮下、舌下、鞘内或皮内。施用途径可取决于多种因素，如环境和治疗目的。

剂量

可将任何适合量的药物组合物施用至受试者。剂量将取决于包括施用方式在内的许多因素。通常，单次剂量内所包含的抗脊柱侧凸组合物(例如，减少OPN和/或α₅β₁的药剂)的量将是有效预防、延迟或减轻脊柱侧凸而不会诱导显著毒性的量，即“治疗有效量”。

还可直接测量减少OPN和/或α₅β₁的药剂的有效量。可每日或每周给予所述有效量或其几分之一。通常，本发明的药物和/或营养制品和/或饮食补充剂组合物可按每日每kg体重约0.001mg至最多约500mg(例如，10mg、50mg、100mg或250mg)的量施用。可按单次或多次剂量方案提供剂量。例如，在一些实施方案中，有效量是在以下范围内的剂量：每天约1mg至约25克抗脊柱侧凸制剂、每天约50mg至约10克抗脊柱侧凸制剂、每天约100mg至约5克抗脊柱侧凸制剂、每天约1克抗脊柱侧凸制剂、每周约1mg至约25克抗脊柱侧凸制剂、每周约50mg至约10克抗脊柱侧凸制剂、每隔一天约100mg至约5克抗脊柱侧凸制剂以及每周一次约1克抗脊柱侧凸制剂。

作为举例，本发明的药物(例如，含有减少OPN和/或α₅β₁的药剂)组合物可以是以下形式：液体、溶液、混悬液、丸剂、胶囊、片剂、软胶囊、粉末、凝胶、软膏、乳膏、喷雾剂、轻雾、雾化蒸汽、气溶胶或磷脂复合物(phytosome)。对于口服施用，可通过常规方法，用至少一种药学上可接受的赋形剂如粘合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂或润湿剂来制备片剂或胶囊。可通过本领域中已知的方法包衣片剂。用于口服施用的液体制剂可采取例如溶液、糖浆或混悬液的形式，或它们可呈现为用于在使用之前用盐水或其他适合的液体媒介物复原的干燥产品。用于口服施用的制剂还可适合地配制以给予活性成分的控制释放。

此外，本发明的药物(例如，含有减少OPN和/或α₅β₁的药剂)组合物可含有用于施用至哺乳动物的药学上可接受的载体，包括但不限于无菌水性或非水性溶液、混悬液和乳液。非水性溶剂的实例包括但不限于丙二醇、聚乙二醇、植物油以及可注射有机酯。水性载体包括但不限于，水、醇、盐水和缓冲溶液。药学上可接受的载体还可包括生理学上可接受的水性媒介物(例如，生理盐水)或对于特定施用途径来说适当的其他己知的载体。

可将降低OPN和/或α₅和/或β₁表达或活性的药剂或增加sCD44/CD44水平(例如，与OPN的结合)的药剂与药物制剂中通常采用的任何媒介物，例如滑石、阿拉伯胶、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、可可脂、水性或非水性溶剂、油、石蜡衍生物或乙二醇结合并入剂型中。还可使用乳液，如美国专利号5,434,183中所述的那些，其中将植物油(例如，大豆油或红花油)、乳化剂(例如，卵黄磷脂)和水与甘油组合。用于制备适当制剂的方法是本领域中熟知的(参见例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版,1980,A.Oslo Ed.,Easton,Pa.)。

在选择胃肠外施用作为施用途径的情况下，可将含有减少OPN和/或α₅β₁的药剂的制剂与药学上可接受的无菌水性或非水性溶剂、混悬液或乳液组合提供给患者。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油、鱼油以及可注射有机酯。水性载体包括水、水-醇溶液、乳液或混悬液，包括盐水或缓冲的医学胃肠外媒介物，包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖溶液、葡萄糖加氯化钠溶液、含乳糖的林格氏溶液或不挥发性油。静脉内媒介物可包括流体和营养补充剂、电解质补充剂，如基于林格氏葡萄糖的那些补充剂等。

由于实际剂量必须由主治医生基于各个患者的独特临床因素或由营养学家仔细选择和滴定，因此这些仅为简单的指导。最佳每日剂量将通过本领域中已知的方法测定，并且将受如患者的年龄的因素以及其他临床相关因素影响。此外，患者可正在服用用于其他疾病或病状的药物。可在减少OPN和/或α₅β₁的药剂给予患者期间继续其他药物治疗，但在这类情况下特别建议以低剂量开始以测定是否经历不良副作用。

本发明还涉及检测有需要的受试者中的CD44风险等位基因(例如，包含一个或多个SNP)。根据本发明，所述CD44风险等位基因包含位于CD44的编码区中的SNP并且因此能够在基因组、mRNA或蛋白质水平下检测到。SNP基因分型是物种(例如，人)的成员之间的单核苷酸多态性(SNP)的遗传变异的测量。SNP是特异性基因座处的单个碱基对突变，通常由两个等位基因组成(其中罕见等位基因频率是>1％)。SNP基因分型可使用本领域中熟知的方法来进行，所述方法如测序(例如，微测序、焦磷酸测序)、基于杂交的方法(使用与所述SNP位点互补的探针，所述探针在高严格性条件下杂交)、基于酶的方法、单链构象多态性(SSCP)、温度梯度凝胶电泳、变性高效液相色谱法、整个扩增子的高分辨率解链、使用DNA错配-结合蛋白质或SNPlexTM平台。基于杂交的方法的非限制性实例包括动态等位基因特异性杂交和使用分子信标。基于酶的方法的非限制性实例包括，限制性片段长度多态性(RFLP)、基于PCR的方法(例如ARMS)、侧翼核酸内切酶(例如，Invader)、引物延伸、5’-核酸酶(TaqManTM测定)、寡核苷酸连接测定。

在一个实施方案中，本发明的方法包括用于以下的方法：i)确定发展脊柱侧凸的风险；和ii)分层患有脊柱侧凸的受试者的方法，所述方法包括确定包含SNP rs1467558的CD44风险等位基因或与其连锁不平衡的突变/SNP/标记物的存在。

在本发明的具体实施方案中，连锁不平衡(LD)由具体定量截断定义。如本文详细描述，连锁不平衡可通过量度如r²和|D'|定量地测定。因此，本发明的某些实施方案涉及通过由r²和/或|D'|的特定值指定的某一范围内的量度取代连锁不平衡的标记物。在一个实施方案中，LD特征在于对于r²大于0.1的数值。在另一个实施方案中，LD特征在于对于r²大于0.5的数值。在另一个实施方案中，LD特征在于对于r²大于0.8的数值。在另一个实施方案中，LD特征在于对于r²为0.9或更大的数值。

连锁不平衡

在每个减数分裂事件期间对于每一染色体对平均发生一次的重组的自然现象表示其中自然提供序列(且因此生物功能)变异的一种方式。已经发现，重组并非在基因组中随机发生；而是存在重组率的频率的较大变异，从而产生高重组频率的较小区(还被称为重组热点)和低重组频率的较大区，所述较大区通常被称为连锁不平衡(LD)模块(Myers,S.等,Biochem Soc Trans 34:526-530(2006)；Jeffreys,AJ.等,Nature Genet 29:217-222(2001)；May,C.A.等,Nature Genet31:272-275(2002))。

连锁不平衡(LD)是指两个遗传元件的非随机分配。因此，术语“连锁不平衡”是指两个不同多态DNA序列的一个或更多个等位基因之间的非随机遗传关联，其是由于两个基因座的物理接近度。当在给定染色体上非常接近于彼此的两个DNA区段将倾向于保持未分离持续数代时存在连锁不平衡，其中结果是一个区段中的DNA多态性(或标记物)的等位基因将显示与位于附近的另一DNA区段中的不同DNA多态性(或标记物)的等位基因非随机关联。当研究非常接近于彼此的两个DNA多态性时，这种情况在整个人基因组中遇到。连锁不平衡及其在遗传研究中的用途在本发明所涉及的领域中是熟知的，如由出版物如Risch和Merikangas,Science273:1516-1517(1996)；Maniatis,Methods Mol Biol.376:109-21(2007)和Borecki等,Adv Genet 60:51-74(2008)所例示。

例如，如果特定遗传元件(例如，多肽标记物的等位基因，或单倍型)在群体中以0.25(25％)的频率出现，并且另一个元件以0.25(25％)的频率出现，那么具有两个元件的人的预测出现是0.125(12.5％)，从而假定所述元件的随机分布。然而，如果发现所述两个元件一起以高于0.125的频率出现，那么所述元件被说成是连锁不平衡，因为它们倾向于以比将预测的其单独出现频率(例如，等位基因或单倍型频率)更高的比率一起遗传。粗略地将，LD通常与两个元件之间的重组事件的频率相关。可通过基因分型群体中的个体且测定每种等位基因或单倍型在所述群体中的出现频率来测定所述群体中的等位基因或单倍型频率。

许多不同的量度已被提出用于评定连锁不平衡(LD)的强度。大多数捕获双等位基因位点对之间的关联强度。LD的两个重要的成对量度是r²(有时指定为Δ)和|D'|。两个量度均在0(无不平衡)至1(“完全不平衡”)的范围内，但其解释略微不同。|D'|是以以下这种方式定义：如果仅存在可能的单倍型中的两至三个则它等于1，并且如果存在所有四个可能的单倍型则它<1。因此，<1的|D'|值指示历史重组可能已经在两个位点之间发生(频发突变也可以引起|D'|<1，但对于单核苷酸多态性(SNP)，这通常被认为比重组的可能性更低)。量度r²表示两个位点之间的统计相关性，并且如果仅存在两个单倍型则采用值1。

r²量度可以说是用于关联映射的最相关的量度，因为在r²与用于检测易感性基因座与SNP之间的关联所需的样品大小之间存在简单逆相关。这些量度是针对位点对所定义，但是对于一些应用，可能希望测定LD在包含许多多肽位点的整个区内的强度程度(例如，测试LD的强度是否在基因座之中或群体内显著不同，或在一个区中是否存在比在特定模型下所预测的更多或更少的LD)。

测量一个区内的LD的一种方法是使用量度r，其是在群体遗传学中开发的。粗略地讲，r测量在特定群体模型下用于产生在数据中观察到的LD将需要多少重组的量。这种类型的方法还可潜在地提供以下问题的严格统计方法：测定LD数据是否提供存在重组热点的证据。对于本文所述的方法和程序，显著r²值可以是至少0.1，如至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99或1.0。在一个优选实施方案中，显著r²值可以是至少0.8。或者，如本文所述的连锁不平衡是指特征在于|D'|的值为至少0.2，如0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.85、0.9、0.95、0.96、0.97、0.98或0.99的连锁不平衡。因此，连锁不平衡表示不同标记物的等位基因之间的相关性。它通过相关系数或|D'|(r²高达1.0且|D'|高达1.0)来测量。可在单个人类群体中测定连锁不平衡，如本文所定义，或可在包括来自多于一个人类群体的个体的样品集合中测定连锁不平衡。在本发明的一个实施方案中，在来自一个或多个HapMap^TM群体(高加索人、非洲人、日本人、中国人)的样品中测定LD，如所定义(http://www.hapmap.org)。在一个这种实施方案中，在HapMap^TM III样品的CEU群体中测定LD。

如果基因组中的所有多态性是在群体水平下相同的，则所述多态性中的每一个将需要在关联研究中进行研究。然而，由于多态性之间的连锁不平衡，紧密连锁的多态性是强相关的，其减少需要在关联研究中进行研究以观察显著关联的多态性的数目。已经在整个基因组内产生了基因组LD图谱，并且这类LD图谱已被提出充当用于绘制疾病基因的图谱的框架(Risch,N和Merkiangas,K,Science273:1516-1517(1996)；Maniatis,N.等,Proc NatlAcad Sci USA99:2228-2233(2002)；Reich,DE等,Nature 411:199-204(2001))。

现在确立，人基因组的许多部分可被分解成一系列含有一些共同单倍型的离散单倍型模块；对于这些模块，连锁不平衡数据提供较少指示重组的证据(参见例如，Wall.,J.D.和Pritchard,J.K.,Nature Reviews Genetics 4:587-597(2003)；Daly,M.等,NatureGenet.29:229-232(2001)；Gabriel,S.B.等,Science 296:2225-2229(2002)；Patil,N.等,Science 294:1719-1723(2001)；Dawson,E.等,Nature 4JS:544-548(2002)；Phillips,M.S.等,Nature Genet 33:382-387(2003))。

存在两种主要方法用于定义这些单倍型模块：模块可被定义为具有有限单倍型多样性的DNA区域(参见例如，Daly,M.等,Nature Genet.29:229-232(2001)；Patil,N.等,Science 294:1719-1723(2001)；Dawson,E.等,Nature 418:544-548(2002)；Zhang,K.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:7335-7339(2002))，或被定义为使用连锁不平衡鉴定的具有广泛历史重组的翻译区之间的区域(参见例如，Gabriel,S.B.等,Science 296:2225-2229(2002)；Phillips,M.S.等,Nature Genet.33:382-387(2003)；Wang,N.等,Am.J.Hum.Genet.7:1227-1234(2002)；Stumpf,M.P.和Goldstein,D.B.,Curr.Biol.13:1-8(2003))。最近，已经生成了整个人基因组内的重组率和相应热点的精细尺度图谱(Myers,S.等,Science 310:321-32324(2005)；Myers,S.等,Biochem Soc Trans 34:526530(2006))。所述图谱揭示所述基因组内的重组的巨大变异，其中在热点中重组率高达10-60cM/Mb，而在插入区域中更接近0，它们因此代表有限单倍型多样性和高LD的区域。所述图谱因此可用于将单倍型模块/LD模块定义为由重组热点侧接的区域。如本文所用，术语“单倍型模块”或“LD模块”包括通过任何上述特征或由本领域的技术人员用于定义这类区域的其他替代方法定义的模块。

单倍型模块可用于绘制表型与单倍型状态之间的关联的图谱，使用单一标记物或包含多种标记物的单倍型。

可在每个单倍型模块中鉴定主要单倍型，且然后可鉴定“标记的”SNP或标记物的集合(SNP或标记物的最小集合需要在所述单倍型之间辨别)。这些标记的SNP或标记物然后可用于评定来自多组个体的样品，以便鉴定表型与单倍型之间的关联。如果需要，可同时评定邻近单倍型模块，因为在所述单倍型模块中也可能存在连锁不平衡。因此，熟练的技术人员能够容易地鉴定与本文所鉴定的CD44风险等位基因连锁不平衡的SNP/变体/标记物，并且能够使用这种连锁不平衡的标记物来分层受试者且确定发展脊柱侧凸的风险。

当所述SNP在蛋白质水平下翻译时，可使用熟知的蛋白质检测方法，如ELISA、免疫荧光、蛋白质印迹、测序、电泳、HPLC、MS等来检测所述突变/变异。

本发明还涉及试剂盒。不受如此限制，本发明涉及用于以下的试剂盒：i)增加细胞中的GiPCR信号传导；ii)分层脊柱侧凸受试者；和/或iii)预测受试者是否处于发展脊柱侧凸的风险，所述试剂盒包括分离的核酸(例如，如上所述对根据本发明的蛋白质或配体如抗体(对于α₅、β₁、CD44(野生型或SNP风险等位基因(例如，230I→T变体)和/或OPN)具有特异性的引物或探针(所述引物或探针与α₅(SEQ ID NO:24)、β₁(SEQ ID NO:22)、CD44(野生型(SEQID NO:19)或SNP风险等位基因(例如，230I→T(CT)变体)和/或OPN(SEQ ID NO:26)大致上互补或杂交)。例如，根据本发明的分隔式试剂盒(compartmentalized kit)包括试剂包含于单独容器中的任何试剂盒。这类容器包括小玻璃容器、塑料容器或塑料或纸条带。这类容器允许将试剂从一个隔室有效转移至另一个隔室，以使得所述样品和试剂不会交叉污染，并且可将每个容器中的试剂或溶液以定量方式从一个隔室添加至另一个。这类容器将包括将接受受试者样品(DNA基因组核酸、细胞样品或血液样品)的容器、含有(在本发明的一些试剂盒中)本发明的方法中所用的探针的容器、含有酶的容器、含有洗涤试剂的容器以及含有用于检测延伸产物的试剂的容器。本发明的试剂盒还可包括使用这些探针和或抗体来分层脊柱侧凸受试者或预测受试者是否处于发展脊柱侧凸风险的说明书。

冠词“一个/种(a/an)”和“所述”在本文中用来指代冠词的语法对象中的一个或多于一个(即，指代“至少一个”)。

术语“包括(including)”和“包含(comprising)”在本文用于意指短语“包括但不限于”和“包含但不限于”且可与所述短语互换使用。

术语“如”在本文用于意指短语“如但不限于”且可与所述术语互换使用。

通过以下非限制性实施例进一步详细地说明本发明。

实施例1

材料和方法

实验动物模型

研究中使用的动物的护理和处理审查委员会(CHU Sainte-Justine)已根据加拿大动物护理委员会(Canadian Council of Animal Care)的准则批准了所述方案。

无OPN(OPN-缺乏小鼠)或CD44(CD44-缺乏小鼠)的C57Bl/6j小鼠的繁殖对获自Susan Rittling博士(Rutger University,NJ,USA)并且在C57Bl/6j背景中回交10代以上以建立我们自己的集群，而C57Bl/6j小鼠用作野生型对照小鼠(Charles-River,Wilmington,MA,USA)。使用C57Bl6/6j小鼠品系是因为它天然缺乏褪黑激素(Von Gall等,2000)并且表现出高循环OPN水平(Aherrahrou等,2004)。这些小鼠在它们被维持于两足阶段时发展脊柱侧凸。(Machida等,2006)。如先前所报道，在断奶(出生后5周)后通过在麻醉下截去前肢和尾部来进行双足外科手术。(Machida等,2006)。类似地，产生双足C57Bl/6jCD44-缺乏小鼠。

原代成骨细胞培养物的衍生

来自小鼠的骨标本是在安乐死之后从脊柱获得的。在无菌条件下用切割器将骨片段减小至更小碎片。在37℃下在5％CO₂中在10-cm²培养皿中在含有10％胎牛血清(FBS；保证合格的FBS,Invitrogen,Burlington,ON,Canada)和1％青霉素/链霉素(Invitrogen)的αMEM培养基中孵育所述较小骨碎片。在一个月之后，通过胰蛋白酶化将自所述骨碎片出现的成骨细胞与剩余的骨片段分离。使用TRIzol^TM方法(Invitrogen)从所述成骨细胞提取RNA。通过qPCR研究表达谱。用Stratagene^TM Mx3000P(Agilent Technologies,La Jolla,CA)评定转录物表达。

G蛋白的功能评价

如先前所述(Akoume等,2010和Moreau等的WO 2010/040234)，使用来源于C57Bl/6j WT小鼠和C57Bl/6j OPN^-/-小鼠(双足和四足)的成骨细胞、使用CellKey^TM设备通过CDS测定来评定Gi、Gs和Gq蛋白的功能评价。

骨桥蛋白酶联免疫吸附测定

将外周血样品收集在EDTA处理的管中且然后离心。获得血浆样品，且然后将所述血浆样品分成等分且在-80℃下冷冻保存直到解冻且分析。如由制造商(IBL,Hamburg,Germany)所提供的方案所述，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来测量血浆OPN的浓度。这种OPN ELISA试剂盒测量血浆中OPN的磷酸化形式和非磷酸化形式两者的总浓度。所有ELISA测试一式两份进行并且使用DTX880酶标仪(Beckman Coulter,USA)测量450nm下的光密度。

定量逆转录-聚合酶链式反应(qPCR)

Thermo-Script^TM逆转录酶(Invitrogen)用于将mRNA逆转录成cDNA(1mg总浓度)。测试了几种稀释液以选择产生最有效扩增的浓度。所使用的人引物是以下：

β-肌动蛋白正向5'-GGAAATCGTGCGTGACAT-3'(SEQ ID NO:1)，

β-肌动蛋白反向5'-TCATGATGGAGTTGAAGGTAGTT-3'(SEQ ID NO:2)，

CD44正向5'-AGCATCGGATTTGAGACCTG-3'(SEQ ID NO:3)，

CD44反向5'-TGAGTCCACTTGGCTTTCTG-3'(SEQ ID NO:4)，

β1整联蛋白正向5'-ATGTGTCAGACCTGCCTTG-3'(SEQ ID NO:5)，

β1整联蛋白反向5'-TTGTCCCGACTTTCTACCTTG-3'(SEQ ID NO:6)，

αv整联蛋白正向5'-GTCCCCACAGTAGACACATATG-3'(SEQ ID NO:7)，

αv整联蛋白反向5'-TCAACTCCTCGCTTTCCATG-3'(SEQ ID NO:8)。

每个扩增一式两份进行，使用5ml稀释的cDNA、7.5ml的3mM引物溶液和12.5ml的2XQuantiTect^TM SYBR Green PCR主混合物(QIAGEN Inc,Ontario,Canada)。将所有反应混合物在来自Stratagene(Agilent Technologies Company,La Jolla,CA)的Mx3000P^TM系统上运行且用也来自Stratagene的MxPro^TM QPCR软件进行分析。使用β-肌动蛋白作为内源对照用ΔCT方法计算相对定量。

细胞系和siRNA转染

MC3T3-E1细胞用于检查OPN及其受体的敲低的作用。根据制造商的说明书，使用Lipofectamine^TM RNAiMAX试剂(Invitrogen)，在不含血清的培养基中瞬时转染MC3T3-E1成骨细胞，并且在转染后48小时进行功能实验。用于敲低不同基因的RNA寡核苷酸的序列是：ssp1(编码OPN)(CCA CAG CCA CAA GCA GUC CAG AUU A(SEQ ID NO:9))、整联蛋白β1(CCUAAG UCA GCA GUA GGA ACA UUA U(SEQ ID NO:10))、整联蛋白β3(CCU CCA GCU CAU UGUUGA UGC UUA U(SEQ ID NO:11))、整联蛋白α5(CCG AGU ACC UGA UCA ACC UGG UUC A(SEQID NO:12))、整联蛋白α8(GAG AUG AAA CUG AAU UCC GAG AUA A(SEQ ID NO:13))、整联蛋白αv(GAC UGU UGA GUA UGC UCC AUG UAG A(SEQ ID NO:14)以及CD44(GAA CAA GGA GUCGUC AGA AAC UCC A(SEQ ID NO:15))。测试了针对整联蛋白α5的两个其他siRNA(UCC ACCAUG UCU AUG AGC UCA UCA A(SEQ ID NO:16)和UCA GGA GCA GAU UGC AGA AUC UUA U(SEQ ID NO:17))。对于所有siRNA获得可比较的结果。

OPN对GPCR和Gi蛋白表达的作用的评价

使用蛋白质印迹技术测定Gi蛋白同种型表达水平。将MC3T3-E1细胞用PBS或rOPN0.5μg/ml处理过夜(R&D systems Inc.,Minneapolis,USA)。将这些细胞用冷PBS洗涤1次，然后溶解于添加5mM NaVO₄和蛋白酶抑制剂混合物(Roche molecular Biochemicals,Mannheim,Germany)的RIPA缓冲液(25mM Tris.Hcl pH 7.4、150mM NaCl、1％NP-40、1％脱氧胆酸钠、0.1％SDS)中。用特异性地针对Gi₁、Gi₂、Gi_3、Gs、磷酸丝氨酸、整联蛋白β1(SantaCruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)、μ阿片受体(MOR)(abcam Toronto,ON,Canada)、溶血磷脂酸受体1(LPAR1)(assaybiotech Inc.,USA)、退黑激素受体2(MT2)以及过氧化物酶缀合的第二抗体的第一抗体进行免疫印迹。然后使用SuperSignal^TM化学发光底物(Pierce,Rockford,IL)可视化条带。

OPN对Gi蛋白与GPCR和β1整联蛋白的相互作用的作用

将MC3T3-E1细胞用PBS或rOPN(0.5μg/ml)处理，然后将全细胞蛋白(1mg)与抗MOR(Abcam Toronto,ON,Canada)、抗MT2或抗β₁整联蛋白(Santa Cruz Biotechnology)加用于免疫沉淀(IP)的蛋白质G珠粒一起在4℃下孵育过夜。在免疫沉淀之后将纯化的蛋白质负载在10％凝胶上，然后加工以用于凝胶转移至PVDF膜和5％BSA封闭。在4℃下使膜暴露于对Gi₁、Gi₂、Gi₃、MOR、MT2和β₁整联蛋白具有特异性的抗体过夜，且随后在室温下用第二抗体处理1小时。使用SuperSignal^TM化学发光(Pierce,Rockford,IL)可视化条带并且通过光密度扫描定量。

AIS受试者中与增加的脊柱畸形进展风险相关的SNP的全外显子组测序鉴定

使用Agilent靶向外显子捕获和Life technologies SOLiD 5500TM用于测序来进行全外显子组测序(WES)研究。GEMINI1TM用于SNV(单核苷酸变体)注释。在患有更严重的AIS的AIS受试者中鉴定了SNP(rs1467558)，所述SNP使CD44编码序列中的氨基酸异亮氨酸230改变成苏氨酸。

统计分析

数据被呈现为平均值±SE，并且使用GraphPad^TM Prism 4.0软件通过ANOVA或学生t检验对所述数据进行分析。使用单向ANOVA、接着使用邓尼特(Dunnett)事后检验进行平均值的多重比较。仅P值<0.05被认为是显著的。

实施例2

OPN的遗传缺失保护双足C57Bl/6免于脊柱侧凸

双足C57Bl/6小鼠被广泛用作动物模型以研究导致特发性脊柱侧凸的病理生理学事件。这些小鼠在40周双足步行后快速发展脊柱畸形(Oyama等,2006)。为了确定OPN是否参与特发性脊柱侧凸的发展，将雌性野生型(WT)和OPN敲除(OPN^-/-)C57Bl/6小鼠在1月龄时截去前肢和尾部且经受双足步行持续36周以诱导脊柱侧凸。在实验期结束时取得的脊柱的代表性射线照片在图1A-1D中示出。如所预期，脊柱侧凸未在WT或OPN^-/-四足小鼠中的任一者中发展。然而，侧弯在所有双足WT小鼠中明显。弯曲的凸度是指向任一侧，无一致偏向。相比之下，射线照片的分析未产生双足OPN^-/-小鼠中脊柱侧凸的证据。所有双足OPN^-/-小鼠具有与四足小鼠不可区分的直脊柱。这些数据强烈强调遗传OPN缺失保护双足C57Bl/6小鼠免于脊柱侧凸。

为了对这一假设提供进一步证据，在来自外科手术之后12、24和36周的双足小鼠的血浆中测量OPN(图1E)，并且与年龄匹配的四足小鼠中的OPN水平相比较。虽然未能在四足或双足OPN^-/-小鼠中检测到OPN(数据未示出)，但在所有指示的时间点双足WT显示比四足WT小鼠显著更高的血浆OPN。在术后三十六周时观察到最大值。

实施例3

OPN缺陷改善Gi蛋白介导的受体信号转导

接下来确定OPN的缺乏是否能够影响Gi蛋白介导的信号传导。为此目的，将来自WT和OPN^-/-小鼠的成骨细胞针对其响应于DAMGO、生长激素抑制素、羟甲唑啉和爱帕林分别活化阿片、生长激素抑制素、α2-肾上腺素能受体和APJ受体进行筛选。这些受体众所周知通过Gi蛋白介导信号转导。图1F-1I中所示的结果显示所有四种化合物都引起来自WT和OPN^-/-小鼠的成骨细胞中的浓度依赖性的反应增加。然而，在每种情况下，反应幅度在OPN^-/-成骨细胞中比WT成骨细胞中更大，这表明Gi蛋白的活化在OPN^-/-成骨细胞中得以促进。此外，虽然反应幅度在来自四足和双足OPN^-/-小鼠的成骨细胞中类似，但在来自四足和双足WT小鼠的反应之间观察到显著差异(数据未示出)。反应的程度在来自双足WT小鼠的成骨细胞中低得多。

为了证实这些结果与Gi蛋白的功能，将成骨细胞用百日咳毒素(PTX)进行处理，所述百日咳毒素ADP-核糖基化Gi蛋白并且破坏其与受体的相互作用(Gilman,1987)；(Moss等,1984)。图1G-1M中所示的结果显示对四种测试的激动剂中的每种的细胞反应在来自任一表型的成骨细胞中在很大程度上通过PTX预处理降低。然而，降低的程度在OPN^-/-成骨细胞中更高。值得注意的是，WT和OPN^-/-成骨细胞之间反应幅度的差异通过PTX处理完全消除。总的来说，这些数据指示OPN缺陷增强成骨细胞中Gi蛋白介导的受体信号转导。

为了确定OPN的损失是否特异性地增强Gi蛋白信号传导，我们检查了OPN对由其他G蛋白如Gs和Gq启动的信号传导的作用。我们分别使用异丙肾上腺素和去氨加压素来通过β-肾上腺素能受体和血管加压素受体活化Gs；而缓激肽和内皮素-1用于通过其同源受体活化Gq。图1N和1O中的结果显示来自OPN^-/-小鼠的成骨细胞对Gs刺激的反应比来自WT小鼠的成骨细胞对Gs刺激的反应小，而在WT和OPN^-/-成骨细胞中引发的Gq刺激具有可比较的幅度。这些发现强烈指示OPN缺陷排他性地改善Gi蛋白介导的信号传导。

实施例4

细胞外OPN破坏Gi蛋白介导的受体信号转导

为了进一步研究OPN在Gi蛋白介导的受体信号传导中的作用，使用MC3T3-E1成骨细胞细胞系进行了若干细胞系实验。因为这些细胞表达OPN，所以首先检查通过siRNA消减OPN是否影响GiPCR配体诱导细胞信号传导的能力，如在MC3T3-E1细胞中通过CDS所测量。图2A中所示的结果显示对DAMGO的综合反应在消减OPN的细胞中显著更大。当用羟甲唑啉刺激细胞时，获得类似的结果。令人感兴趣地，通过使细胞暴露于中和OPN抗体阻断分泌的OPN也增加对两种化合物的反应(图2B)。这些结果表明细胞外OPN破坏GiPCR信号传导。为了证实这一假设，将细胞在DAMGO和羟甲唑啉刺激之前用外源性重组OPN(rOPN)进行处理。在每种情况下，rOPN以浓度依赖性方式引起综合反应的降低，这通过OPN抗体防止(图2C-2D)。

实施例5

CD44不参与由细胞外OPN引起的GiPCR信号传导抑制

OPN已知通过与多种细胞表面受体(包括CD44和许多整联蛋白)相互作用来起作用(Weber等,1996)；(Rangaswami等,2006)。因为CD44被认为是OPN的关键受体，所以首先探究CD44是否负责OPN对GiPCR信号传导的抑制作用。为此目的，使用CD44抗体干扰OPN与CD44之间的相互作用。如图3A中所示，在用IgG对照或CD44抗体预处理的细胞中OPN降低对DAMGO的综合反应。当用羟甲唑啉刺激细胞时获得类似的结果(图3A)，从而表明阻断CD44不会防止由OPN诱导的GiPCR信号传导降低且甚至增强其作用。为了排除通过CD44抗体防止OPN抑制的缺乏是由于其无效力，将用IgG对照或CD44抗体预处理的细胞用增加浓度的透明质酸(HA)(CD44的高亲和力配体)刺激。如图3B中所示，由HA诱导的综合反应通过用CD44抗体预处理完全消除。此外，CD44抗体对于对HA刺激的反应的作用是浓度依赖性的(图3C)。这些数据清楚地指示CD44抗体是有活性的。

小干扰RNA(siRNA)方法进一步用于敲低CD44的表达，并且通过定量实时PCR和蛋白质印迹分析展示siRNA转染的效率(图3D和3E)。通过siRNA缺失CD44不会防止OPN对于对DAMGO或羟甲唑啉的反应的抑制作用(图3F)。与这些发现一致，rOPN处理引起来自双足CD44敲除(CD44^-/-)小鼠的成骨细胞中对DAMGO和羟甲唑啉两者的反应的浓度依赖性降低(图3G和H)。此外，当与来自四足(CD44^-/-)小鼠的成骨细胞相比时，这些成骨细胞对DAMG或羟甲唑啉的反应较低(图3I和3J)。

在HA存在或不存在下在野生型和CD44-/-细胞中的进一步实验证实OPN的抑制作用在CD44不存在下加剧并且在HA(已知的CD44配体)存在下加强(图3K至3P)。CD44不是GiPCR信号传导缺陷的原因，而是这种作用是由于OPN所致。然而因为CD44结合OPN，所以抑制CD44或其作用(通过HA、CD44抗体、抗CD44siRNA或使用CD44-/-细胞)加剧OPN的破坏作用。

总的来说，这些数据明确地指示CD44不参与由OPN引起的GiPCR信号传导的抑制，并且其存在降低OPN对GiPCR信号传导的作用。

实施例6

RGD依赖性整联蛋白介导OPN对GiPCR信号传导的抑制作用

接下来检查整联蛋白的可能需求。鉴于OPN包含接合细胞表面整联蛋白的亚群的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)基序以及与其他整联蛋白相互作用的含有丝氨酸-缬氨酸-缬氨酸-酪氨酸-谷氨酸-亮氨酸-精氨酸(SVVYGLR)的结构域，所以检查OPN作用是否需要特定结构域依赖性整联蛋白是令人感兴趣的。为此目的，小合成肽用于与整联蛋白竞争结合OPN中的RGD或SVVYLRG序列。BIO1211用于选择性地抑制α₄β₁整联蛋白，其是成骨细胞中存在的唯一含有SVVYLRG的整联蛋白。如图4A中所示，OPN对GiPCR信号传导的作用未受MC3T3-E1细胞中的BIO1211显著影响。对DAMGO或羟甲唑啉的反应通过rOPN在BIO1211存在或不存在下降低，从而表明在这个过程中不需要具有SVVYLRG识别特异性的整联蛋白。相比之下，用rOPN和RDG肽共同孵育细胞完全防止rOPN对于对DAMGO和羟甲唑啉的反应的抑制作用。图4B和4C示出RDG的这种防止作用是浓度依赖性的。增加浓度的RGD导致OPN的抑制作用的逐渐衰减，从而在浓度超过10μg/ml时逆转OPN的作用。类似地，用高浓度的RGD孵育来自WT小鼠的成骨细胞展示对DAMGO或羟甲唑啉的反应的显著增加(图4D)，从而表明通过RGD有效抑制分泌的OPN的作用。与这一观点一致，当使用来自OPN^-/-小鼠的成骨细胞时RGD没有作用(图4E)，从而指示RGD的作用严格依赖于OPN的存在。

总的来说，这些数据表明OPN对GiPCR信号传导的抑制作用是通过成骨细胞中表达的一种或多种RGD依赖性整联蛋白介导的。

实施例7

参与由OPN引起的GiPCR信号传导抑制的整联蛋白的鉴定

已经确立了RGD依赖性整联蛋在OPN对成骨细胞中的GiPCR信号传导的抑制作用中的可能作用，对特定整联蛋白进行检查以确它们是否能够介导这种作用。为此目的，抗体用于选择性地中和α_vβ₁、α_vβ₃、α_vβ₅、α₅β₁和α₈β₁的亚基，它们是已显示在成骨细胞中表达的RGD依赖性整联蛋白(Hughes等,1997)；(Gronthos等,1997)；(Grzesik和Robey,1994)；(Clover等,1992)；(Moursi等,1997)；(Pistone等,1996)。图5A和5B显示rOPN对于对DAMGO和羟甲唑啉的抑制作用通过β₃、β₅、α_v和α₈抗体以不同程度衰减，但未消除。相反，针对α₅或β₁的抗体逆转rOPN对于对DAMGO和羟甲唑啉两者的反应的抑制作用。用这些抗体预处理的细胞显示在rOPN存在下相较于未处理的细胞综合反应幅度的增加，这与在用IgG预处理的细胞中由rOPN诱导的降低形成鲜明对比。这些结果表明α₅和β₁整联蛋白是OPN对GiPCR信号传导的抑制作用的主要介质。

为了进一步支持这一假设，使用siRNA方法。当与未处理的细胞相比较时，用乱序siRNA转染的MC3T3-E1展示较低反应，而用α₅或β₁整联蛋白siRNA转染的细胞在rOPN存在下展示高反应。用α₅和β₁整联蛋白siRNA两者转染的细胞展示进一步增加(图5C)。此外，两种整联蛋白亚基的沉默同时导致来自双足WT和CD44^-/-细胞的成骨细胞中对DAMGO和羟甲唑啉的反应增加(图5D和5E)。整联蛋白表达的有效沉默通过q-RT-PCR得到支持(图5F)。在所有情况下，用其他整联蛋白转染细胞导致OPN对GiPCR信号传导的抑制作用的部分衰减(数据未示出)。总之，这些结果是α₅β₁是参与介导OPN对成骨细胞中的GiPCR信号传导的抑制作用的主要整联蛋白二聚体的令人信服的证据。

实施例8

OPN对Gi蛋白及其同源受体的表达无作用

鉴于GPCR的水平对于其信号传导来说是关键的，所以检查由OPN诱导的缺陷型GiPCR信号传导是否是这些受体的定量减少的结果是令人感兴趣的。为此目的，将MC3T3-E1细胞用PBS或rOPN进行处理并且针对三种不同GPCR的表达通过蛋白质印迹对细胞裂解产物进行分析；包括μ-阿片受体(MOR)、溶血磷脂酸1型受体(LPA1R)和褪黑激素2型受体(MT2R)。如图6A中所示，在MC3T3-E1细胞中免疫检测到所有三种受体并且每种受体的水平未通过rOPN处理改变。因此，检查了rOPN对Gi蛋白的表达的作用。相对于PBS处理的细胞，rOPN处理对Gi蛋白的量不存在显著作用，如使用针对Gi₁、Gi₂和Gi₃同种型的抗体通过免疫印迹所测定(图6B)。qPCR分析还揭示在PBS处理的细胞与rOPN处理的细胞之间任何这些同种型的mRNA表达无显著差异(图6C)。这些结果排除了rOPN降低受体或Gi蛋白的表达的可能性。

实施例9

OPN降低Gi蛋白对其同源受体的可用性

Gi蛋白已显示由β₁整联蛋白经由衔接子分子募集并且介导整联蛋白信号传导(Green等,1999)。值得注意当不同受体通过同一G蛋白亚家族传导信号时，所述受体共享相同有限的G蛋白库。因此，如果OPN增强β₁整联蛋白复合物中的Gi蛋白的募集，那么将预期GiPCR复合物中的Gi蛋白的量的减少。为了评价这种可能性，将细胞裂解产物用针对MO、MT2或β₁整联蛋白受体的抗体免疫沉淀，并且使用对Gi₁、Gi₂或Gi₃同种型具有特异性的抗体通过蛋白质印迹检查每种沉淀物中Gi蛋白的存在。图6D、6E和6F显示用MO或MT2受体免疫沉淀的Gi₁同种型的相对量在rOPN处理的细胞中相较于PBS处理的细胞减少。对于Gi₂和Gi₃同种型注意到类似的观察结果。相比之下，在rOPN处理之后这些Gi蛋白同种型中的每种的量在β₁整联蛋白沉淀物中升高。这些结果表明OPN引起Gi蛋白的绑架并且降低其对GiPCR的可用性。

实施例10

OPN增强Gi蛋白的磷酸化

鉴于与特发性脊柱侧凸相关的缺陷型GiPCR信号传导已与Gi蛋白的磷酸化增加在病因上相关(Moreau等,2004)，所以检查OPN是否影响Gi蛋白的磷酸化状态是令人感兴趣的。因此，将MC3T3-E1细胞用rOPN处理，然后用针对Gi₁、Gi₂或Gi₃蛋白同种型的抗体免疫沉淀细胞裂解产物，并且使用抗磷酸丝氨酸/苏氨酸抗体或抗酪氨酸抗体通过蛋白质印迹检查磷酸化水平。结果揭示在获自用PBS或rOPN处理的细胞的Gi₁沉淀物中存在磷酸化的丝氨酸和酪氨酸残基。然而，在OPN处理的细胞中条带密度更高。在Gi₂和Gi₃沉淀物中注意到类似的观察结果(图7A)。这些结果显示OPN增强丝氨酸和酪氨酸残基处的Gi蛋白的磷酸化。

为了支持α₅β₁整联蛋白在所述过程中的参与，将细胞在rOPN处理之前用针对α₅β₁整联蛋白的抗体进行预处理。蛋白质印迹分析揭示通过rOPN处理诱导的Gi磷酸化通过α₅β₁整联蛋白封闭型抗体衰减(图7A)。

为了使这些发现与脊柱侧凸中降低的GiPCR信号传导相关联，直接检查Gi蛋白以确定它们是否在来自脊柱侧凸小鼠的成骨细胞中经历增加的磷酸化。用抗磷酸-丝氨酸/苏氨酸或抗磷酸-酪氨酸特异性抗体探测Gi₁、Gi₂和Gi₃蛋白的免疫沉淀并且观察到相较于来自四足对照小鼠的成骨细胞，每种Gi同种型的磷酸化水平在来自脊柱侧凸双足WT或CD44^-/-小鼠的成骨细胞中显著更高(图7B)。重要地，磷酸化水平通过抗α₅β₁整联蛋白封闭型抗体衰减(数据未示出)。这些结果提供令人信服的证据：脊柱侧凸小鼠中的GiPCR信号传导与由OPN经由α₅β₁整联蛋白接合诱导的Gi蛋白磷酸化相关。

实施例11

由OPN诱导的Gi蛋白磷酸化涉及各种激酶

为了鉴定哪些激酶参与由OPN诱导的Gi蛋白磷酸化，对FAK、MEK、ERK1/2、P38、JNK、PI3K、Src、PKC和CaMKII进行药理学抑制。使从已在对每种激酶具有特异性的抑制剂的存在或不存在下用rOPN处理的MC3T3-E1制备的细胞提取物经受免疫沉淀和蛋白质印迹分析。图7C-7E中的结果显示PKC

的抑制剂衰减Gi蛋白沉淀物中的丝氨酸磷酸化水平，但对酪氨酸磷酸化水平无作用。然而，丝氨酸和酪氨酸磷酸化两者均通过FAK(FAK抑制剂-14)、Scr(PP2)、CaMKII(KN93)、PI3K(渥曼青霉素-数据未示出)、MEK(PD98059)、ERK1/2(FR180204)、JNK(SP60125)和P38(SB203580)衰减。这些结果指示各种激酶直接或间接地参与由OPN诱导的Gi蛋白磷酸化。

实施例12

OPN对Gi和Gs蛋白的作用有利于GsPCR信号传导

一些报道指示抑制Gi蛋白破坏来自GiPCR的信号且增强GsPCR信号传导(Itoh等,1984)；(Katada等,1985)；(Wesslau和Smith,1992)。另一方面，已证明Gs蛋白通过Src的酪氨酸磷酸化也增强GsPCR信号传导，这可能是通过增加Gs蛋白的活性及其与受体的缔合(Hausdorff等,1992)；(Chakrabarti和Gintzler,2007)。

考虑到这些因素且已经观察到OPN的遗传缺失相反地影响对Gi和Gs刺激的反应(图1)，检查OPN对Gs蛋白的功能和磷酸化状态以及对其与受体的相互作用的作用是令人感兴趣的。为此目的，使细胞在rOPN或PBS存在下经受异丙肾上腺素和去氨加压素。如所预期，在rOPN处理的细胞中对异丙肾上腺素的反应比PBS处理的细胞中更高。当用去氨加压素刺激细胞时获得类似的结果，从而指示OPN增加对GsPCR刺激的反应(图8A)。令人感兴趣地，用抗酪氨酸抗体探测的Gs蛋白的免疫沉淀物在rOPN处理的细胞中表现出相较于PBS处理的细胞更高的强度(图8B)。更令人感兴趣地，rOPN处理增强Gs蛋白在MT2和MO受体的免疫沉淀物中的存在(图8C-8D)。

总的来说，这些结果证明OPN不仅增强GsPCR信号传导，而且增强Gs蛋白的酪氨酸磷酸化及其与受体的缔合。

假定Gi蛋白的抑制和Gs蛋白的磷酸化负责与rOPN相关的GsPCR信号传导增加，接下来的实验目的在于确定每种参数的贡献。为此目的，将细胞用PTX处理以模拟rOPN的破坏作用并且与用单独rOPN或与用于防止酪氨酸磷酸化的Src抑制剂(PP2)组合处理的细胞相比较。图8E中的结果显示rOPN处理的细胞对异丙肾上腺素刺激的反应比PTX处理的细胞多30％。这种适度差异通过Src抑制剂(PP2)消除。当用去氨加压素刺激细胞时，注意到类似的观察结果。这些结果指示Gs磷酸化仅促成rOPN对GsPCR信号转导的刺激作用的一部分并且破坏来自GiPCR的抑制信号代表这种现象的主要原因。

实施例13：

AIS受试者中与增加的脊柱畸形进展风险相关的CT SNP的鉴定及对GiPCR信号传导的作用

对来自AIS受试者的细胞样品进行全外显子组测序(WES)研究，并且在患有严重AIS的AIS受试者中鉴定了SNP(rs1467558)，所述SNP使CD44编码序列中的氨基酸异亮氨酸230改变成苏氨酸。

接下来，评定CT SNP对GiPCR信号传导的作用。将来自严重AIS患者(其经历外科手术)的携带所述CT SNP的成骨细胞和来自健康对照的具有野生型CD44(CC)的成骨细胞在重组OPN(rOPN)存在下用LPA刺激。响应于相同rOPN处理的GiPCR缺陷型信号传导作用相较于野生型CD44(CC)成骨细胞中，在突变的CD44(CT)成骨细胞中被降低50％以上(图9A)。已经使用不同浓度的OPN获得了可比较的结果。CD44中的CT突变因此增加脊柱侧凸患者对于OPN对GiPCR信号传导的破坏作用的敏感性，从而促成在这些受试者中观察到的更严重的表型。

基于本文呈现的发现和可获得的证据，并且不受如此限制，概略于图9中的假定情形解释OPN降低GiPCR信号传导且促成脊柱畸形的发展的机制。根据所提出的机制，在OPN结合之后，α₅β₁整联蛋白从共同库募集一部分Gi蛋白，然后促进不同信号传导途径，从而导致不同激酶的活化，这直接或间接地磷酸化所述共同库中的一部分剩余的Gi蛋白。这些事件同时引起库的消减和不同同种型的失活，从而导致有效GiPCR信号传导所需的功能性Gi蛋白的量的减少。这将降低对Gi蛋白的抑制性控制且有利于GsPCR信号传导，其通过由Src磷酸化Gs蛋白加剧。所述增大的GsPCR信号传导增加骨形成(Hsiao等,2008)并且减少成肌细胞增殖(Marchal等,1995)，从而导致脊柱周围的骨量与肌肉强度之间的不平衡。因此，脊柱将失去平衡并且将出现侧弯。因为通过Gs蛋白信号转导增强OPN mRNA和蛋白质水平(Nagao等,2011)，所以增大的GsPCR信号传导将维持高OPN产生并且扩增驱动脊柱畸形的发展的事件。虽然另外的机制可以是可操作的，但GsPCR信号传导的贡献通过向通常与骨的纤维性发育异常相关的骨科问题的构象添加脊柱畸形得到进一步支持，骨的纤维性发育异常是由Gs蛋白的先天性突变引起的不常见的疾病(Leet等,2004)。

本文呈现的结果证明CD44表达的不存在增强OPN的作用并且进一步降低细胞中的GiPCR信号传导作用(图3)。此外，HA显示增强这种作用。CD44已知结合OPN和HA。最后，在患有严重脊柱侧凸的AIS受试者中(不限于任何具体理论)，CD44能够通过螯合可供用于与整联蛋白受体相互作用的OPN库的一部分来起作用。在较少CD44可供用于结合OPN的情况下(例如，在CD44的表达水平被降低的情况下，在OPN对CD44的亲和力被降低的情况下或在与OPN的结合被阻断(例如，通过对CD44具有特异性的抗体或通过另一种配体如HA)的情况下)，OPN对α₅β₁的生物利用率增加并且GiPCR信号传导作用进一步降低。相反，增加CD44/sCD44表达(结合OPN的可用性)能够促进降低OPN与整联蛋白的结合且增加细胞中的GiPCR信号传导作用。

权利要求的范围不应受实施例中阐明的优选实施方案的限制，而是应给予总体上与说明书一致的最广泛的解释。

参考文献：

1.Kane，W.J.(1977)Scoliosis prevalence：a call for a statement ofterms.Clinical orthopaedics and related research，43-46.

2.Dickson，R.A.(1992)The etiology and pathogenesis of idiopathicscoliosis.Acta orthopaedica Belgica 58Suppl 1，21-25.

3.Machida，M.(1999)Cause of idiopathic scoliosis.Spine 24，2576-2583.

4.Burwell，R.G.(2003)Aetiology of idiopathic scoliosis：currentconcepts.Pediatric rehabilitation 6，137-170.

5.Aherrahrou，Z.，S.B.Axtner，P.M.Kaczmarek，A.Jurat，S.Korff，L.C.Doehring，D.Weichenhan，H.A.Katus，and B.T.Ivandic.2004.A locus onchromosome 7determines dramatic up-regulation of osteopontin in dystrophiccardiac calcification in mice.The American journal of pathology 164：1379-1387.

6.Akoume，M.Y.，B.Azeddine，I.Turgeon，A.Franco，H.Labelle，B.Poitras，C.H.Rivard，G.Grimard，J.Ouellet，S.Parent，and A.Moreau.2010.Cell-basedscreening test for idiopathic scoliosis using cellular dielectricspectroscopy.Spine(Phila Pa 1976)35：E601-608.

7.Azeddine，B.，K.Letellier，S.Wang da，F.Moldovan，andA.Moreau.2007.Molecular determinants of melatonin signaling dysfunction inadolescent idiopathic scoliosis.Clinical orthopaedics and related research462：45-52.

8.Berg，K.A.，G.Zardeneta，K.M.Hargreaves，W.P.Clarke，andS.B.Milam.2007.Integrins regulate opioid receptor signaling in trigeminalganglion neurons.Neuroscience 144：889-897.

9.Brown，E.J.，and W.A.Frazier.2001.Integrin-associated protein(CD47)and its ligands.Trends Cell Biol11：130-135.

10.Bushfield，M.，B.E.Lavan，and M.D.Houslay.1991.Okadaic acididentifies a phosphorylation/dephosphorylation cycle controlling theinhibitory guanine-nucleotide-binding regulatory protein Gi2.The Biochemicaljournal 274(Pt 2)：317-321.

11.Chakrabarti，S.，and A.R.Gintzler.2007.Phosphorylation of Galphasinfluences its association with the micro-opioid receptor and is modulated bylong-term morphine exposure.Molecular pharmacology72：753-760.

12.Chiba，S.，M.M.Rashid，H.Okamoto，H.Shiraiwa，S.Kon，M.Maeda，M.Murakami，M.Inobe，A.Kitabatake，and A.F.Chambers.1999.The role of osteopontin in thedevelopment of granulomatous lesions in lung.Microbiology and immunology 44：319-332.

13.Clover，J.，R.A.Dodds，and M.Gowen.1992.Integrin subunit expressionby human osteoblasts and osteoclasts in situ and in culture.Journal of cellscience 103(Pt 1)：267-271.

14.Denhardt，D.，E.Burger，C.Kazanecki，S.Krishna，C.Semeins，and J.Klein-Nulend.2001a.Osteopontin-deficient bone cells are defective in their abilityto produce NO in response to pulsatile fluid flow.Biochemical and biophysicalresearch communications 288：448-453.

15.Denhardt，D.T.，C.M.Giachelli，and S.R.Rittling.2001b.Role ofosteopontin in cellular signaling and toxicant injury.Annual review ofpharmacology and toxicology 41：723-749.

16.Denhardt，D.T.，and X.Guo.1993.Osteopontin：a protein with diversefunctions.FASEB joumal：official publication of the Federation of AmericanSocieties for Experimental Biology 7：1475-1482.

17.Denhardt，D.T.，M.Noda，A.W.O′Regan，D.Pavlin，andJ.S.Berman.2001c.Osteopontin as a means to cope with environmental insults：regulation of inflammation，tissue remodeling，and cell survival.The Journal ofclinical investigation 107：1055-1061.

18.Fitzpatrick，L.，A.Severson，W.Edwards，and R.Ingram.1994.Diffusecalcification in human coronary arteries.Association of osteopontin withatherosclerosis.Journal of Clinical Investigation 94：1597.

19.Giachelli，C.M.，N.Bae，M.Almeida，D.T.Denhardt，C.E.Alpers，andS.M.Schwartz.1993.Osteopontin is elevated during neointima formation in ratarteries and is a novel component of human atherosclerotic plaques.TheJournal of clinical investigation 92：1686-1696.

20.Giachelli，C.M.，L.Liaw，C.E.Murry，S.M.Schwartz，andM.Almeida.1995.Osteopontin expression in cardiovascular diseases.Annals ofthe New York Academy of Sciences 760：109-126.

21.Giachelli，C.M.，R.Pichler，D.Lombardi，D.T.Denhardt，C.E.Alpers，S.M.Schwartz，and R.J.Johnson.1994.Osteopontin expression in angiotensin II-induced tubulointerstitial nephritis.Kidney international 45：515-524.

22.Gilman，A.G.1987.G proteins：transducers of receptor-generatedsignals.Annual review of biochemistry 56：615-649.

23.Green，J.M.，A.Zhelesnyak，J.Chung，F.P.Lindberg，M.Sarfati，W.A.Frazier，and E.J.Brown.1999.Role of cholesterol in formation and functionof a signaling complex involving alphavbeta3，integrin-associated protein(CD47)，and heterotrimeric G proteins.The Journal of cell biology 146：673-682.

24.Gronthos，S.，K.Stewart，S.E.Graves，S.Hay，andP.J.Simmons.1997.Integrin Expression and Function on Human Osteoblast-likeCells.Journal of Bone and Mineral Research 12：1189-1197.

25.Grzesik，W.J.，and P.G.Robey.1994.Bone matrix RGD glycoproteins：immunolocalization and interaction with human primary osteoblastic bone cellsin vitro.Journal of bone and mineral research：the official journal of theAmerican Society for Bone and Mineral Research 9：487-496.

26.Hausdorff，W.P.，J.A.Pitcher，D.K.Luttrell，M.E.Linder，H.Kurose，S.J.Parsons，M.G.Caron，and R.J.Lefkowilz.1992.Tyrosine phosphorylation of Gprotein alpha subunits by pp60c-src.Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 89：5720-5724.

27.Hsiao，E.C.，B.M.Boudignon，W.C.Chang，M.Bencsik，J.Peng，T.D.Nguyen，C.Manalac，B.P.Halloran，B.R.Conklin，and R.A.Nissenson.2008.Osteoblastexpression of an engineered Gs-coupled receptor dramatically increases bonemass.Proceedings of the National Academy of Sciences105：1209-1214.

28.Hughes，P.E.，M.W.Renshaw，M.Pfaff，J.Forsyth，V.M.Keivens，M.A.Schwartz，and M.H.Ginsberg.1997.Suppression of integrin activation：a novelfunction of a Ras/Raf-initiated MAP kinase pathway.Cell 88：521-530.

29.Illario，M.，V.Amideo，A.Casamassima，M.Andreucci，T.di Matola，C.Miele，G.Rossi，G.Fenzi，and M.Vitale.2003.Integrin-dependent cell growth and survivalare mediated by different signals in thyroid cells.The Journal of clinicalendocrinology and metabolism 88：260-269.

30.Itoh，H.，F.Okajima，and M.Ui.1984.Conversion of adrenergic mechanismfrom an alpha-to a beta-type during primary culture of rathepatocytes.Accompanying decreases in the function of the inhibitory guaninenucleotide regulatory component of adenylate cyclase identified as thesubstrate of islet-activating protein.The Journal of biological chemistry259：15464-15473.

31.Katada，T.，A.G.Gilman，Y.Watanabe，S.Bauer，andK.H.Jakobs.1985.Protein kinase C phosphorylates the inhibitory guanine-nucleotide-binding regulatory component and apparently suppresses itsfunction in hormonal inhibition of adenylate cyclase.European joumal ofbiochemistry/FEBS 151：431-437.

32.Katagiri，Y.U.，J.Sleeman，H.Fujii，P.Herrlich，H.Hotta，K.Tanaka，S.Chikuma，H.Yagita，K.Okumura，M.Murakami，I.Saiki，A.F.Chambers，andT.Uede.1999.CD44 variants but not CD44s cooperate with beta1-containingintegrins to permit cells to bind to osteopontin independently of arginine-glycine-aspartic acid，thereby stimulating cell motility and chemotaxis.Cancerresearch 59：219-226.

33.Leet，A.I.，E.Magur，J.S.Lee，S.Wientroub，P.G.Robey，andM.T.Collins.2004.Fibrous dysplasia in the spine：prevalence of lesions andassociation with scoliosis.The Journal of Bone&Joint Surgery86：531-537.

34.Liaw，L.，D.E.Birk，C.B.Ballas，J.S.Whitsitt，J.M.Davidson，andB.L.Hogan.1998.Altered wound healing in mice lacking a functional osteopontingene(spp1).The Journal of clinical investigation 101：1468-1478.

35.Machida，M.，J.Dubousset，T.Yamada，J.Kimura，M.Saito，T.Shiraishi，andM.Yamagishi.2006.Experimental scoliosis in melatonin-deficient C57BL/6J micewithout pinealectomy.Journal of pineal research 41：1-7.

36.Machida，M.，I.Murai，Y.Miyashita，J.Dubousset，T.Yamada，andJ.Kimura.1999.Pathogenesis of idiopathic scoliosis.Experimental study inrats.Spine(Phila Pa 1976)24：1985-1989.

37.Marchal，S.，I.Cassar-Malek，J.P.Magaud，J.P.Rouault，C.Wrutniak，andG.Cabello.1995.Stimulation of avian myoblast differentiation bytriiodothyronine：possible involvement of the cAMP pathway.Experimental cellresearch 220：1-10.

38.Moreau，A.，S.Forget，B.Azeddine，D.Angeloni，F.Fraschini，H.Labelle，B.Poitras，C.-H.Rivard，and G.Grimard.2004.Melatonin signaling dysfunction inadolescent idiopathic scoliosis.Spine 29：1772-1781.

39.Moss，J.，P.Bruni，J.A.Hsia，S.C.Tsai，P.A.Watkins，J.L.Halpem，D.L.Burns，Y.Kanaho，P.P.Chang，E.L.Hewlett，and et al.1984.Pertussis toxin-catalyzed ADP-ribosylation：effects on the coupling of inhibitory receptors tothe adenylate cyclase system.Journal of receptor research 4：459474.

40.Moursi，A.M.，R.K.Globus，and C.H.Damsky.1997.Interactions betweenintegrin receptors and fibronectin are required for calvarial osteoblastdifferentiation in vitro.Journal of cell science 110(Pt18)：2187-2196.

41.Murry，C.E.，C.M.Giachelli，S.M.Schwartz，andR.Vracko.1994.Macrophages express osteopontin during repair of myocardialnecrosis.The American journal of pathology 145：1450-1462.

42.Murthy，K.S.，J.R.Grider，and G.M.Makhlouf.2000.Heterologousdesensitization of response mediated by selective PKC-dependentphosphorylation of G(i-1)and G(i-2).American journal of physiology.Cellphysiology 279：C925-934.

43.Nagao，M.，T.N.Feinstein，Y.Ezura，T.Hayata，T.Notomi，Y.Saita，R.Hanyu，H.Hemmi，Y.Izu，S.Takeda，K.Wang，S.Rittling，T.Nakamoto，K.Kaneko，H.Kurosawa，G.Karsenty，D.T.Denhardt，J.P.Vilardaga，and M.Noda.2011.Sympathetic control ofbone mass regulated by osteopontin.Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 108：17767-17772.

44.O’Brien，K.D.，J.Kuusisto，D.D.Reichenbach，M.Ferguson，C.Giachelli，C.E.Alpers，and C.M.Otto.1995.Osteopontin is expressed in human aorticvalvular lesions.Circulation 92：2163-2168.

45.Oates，A.，R.Barraclough，and P.Rudland.1997.The role of osteopontinin tumorigenesis and metastasis.Invasion&metastasis 17：1.

46.Ophascharoensuk，V.，C.M.Giachelli，K.Gordon，J.Hughes，R.Pichler，P.Brown，L.Liaw，R.Schmidt，S.J.Shankland，C.E.Alpers，W.G.Couser，andR.J.Johnson.1999.Obstructive uropathy in the mouse：role of osteopontin ininterstitial fibrosis and apoptosis.Kidney international 56：571-580.

47.Oyama，J.，I.Murai，K.Kanazawa，and M.Machida.2006.Bipedal ambulationinduces experimental scoliosis in C57BL/6J mice with reduced plasma andpineal melatonin levels.Journal of pineal research40：219-224.

48.Pistone，M.，C.Sanguineti，A.Federici，F.Sanguineti，P.Defilippi，F.Santolini，G.Querze，P.C.Marchisio，and P.Manduca.1996.Integrin synthesis andutilization in cultured human osteoblasts.Cell biology international 20：471-479.

49.Rangaswami，H.，A.Bulbule，and G.C.Kundu.2006.Osteopontin：role incell signaling and cancer progression.Trends in cell biology 16：79-87.

50.Reinholt，F.P.，K.Hultenby，A.Oldberg，andD.Heinegard.1990.Osteopontin--a possible anchor of osteoclasts tobone.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica87：4473-4475.

51.Shangguan，Y.，K.E.Hall，R.R.Neubig，and J.W.Wiley.2003.Diabeticneuropathy：inhibitory G protein dysfunction involves PKC-dependentphosphorylation of Goalpha.Journal of neurochemistry 86：1006-1014.

52.Sodek，J.，B.Ganss，and M.McKee.2000.Osteopontin.Critical Reviews inOral Biology&Medicine11：279-303.

53.Strassheim，D.，and C.C.Malbon.1994.Phosphorylation of Gi alpha 2attenuates inhibitory adenylyl cyclase in neuroblastoma/glioma hybrid(NG-108-15)cells.The Journal of biological chemistry269：14307-14313.

54.Von Gall，C.，A.Lewy，C.Schomerus，B.Vivien-Roels，P.Pevét，H.W.Korf，andJ.H.Stehle.2000.Transcription factor dynamics and neuroendocrine signallingin the mouse pineal gland：a comparative analysis of melatonin-deficient C57BLmice and melatonin-proficient C3H mice.European Journal of Neuroscience 12：964-972.

55.Weber，G.F.，S.Ashkar，M.J.Glimcher，and H.Cantor.1996.Receptor-ligandinteraction between CD44and osteopontin(Eta-1).Science 271：509-512.

56.Wesslau，C.，and U.Smith.1992.The inhibitory GTP-binding protein(Gi)regulates the agonistic property of beta-adrenergic ligands in isolated ratadipocytes.Evidence for a priming effect of cyclic AMP.The Biochemicaljournal 288(Pt 1)：41-46.

57.Letellier K，Azeddine B，Parent S，Labelle H，Rompré PH，Moreau A，Moldovan F.Estrogen cross-talk with the melatonin signaling pathway in humanosteoblasts derived from adolescent idiopathic scoliosis patients.J PinealRes.2008 Nov；45(4)：383-93.

58.Verdonk E，Johnson K，McGuinness R，Leung G，Chen YW，Tang HR，Michelotti JM，Liu VF.Cellular dielectric spectroscopy：a label-freecomprehensive platform for functional evaluation of endogenousreceptors.Assay Drug Dev Technol.2006 Oct；4(5)：609-19.

Claims (8)

1.用于检测细胞样品中存在至少一个拷贝的CD44风险等位基因的试剂在制备用于确定受试者中发展脊柱侧凸的风险的试剂盒中的用途，所述确定风险包括：

(i)提供从所述受试者分离的细胞样品；

(ii)通过所述试剂检测来自所述受试者的所述细胞样品中包含SNP rs1467558的CD44风险等位基因的至少一个拷贝的存在；以及

(iii)当在来自所述受试者的所述细胞样品中检测到所述风险等位基因的至少一个拷贝时，确定所述受试者处于发展脊柱侧凸的风险。

2.用于检测细胞样品中存在至少一个拷贝的CD44风险等位基因的试剂在制备用于分层患有脊柱侧凸的受试者的试剂盒中的用途，所述分层包括：

(i)提供从所述受试者分离的细胞样品；

(ii)通过所述试剂检测来自所述受试者的所述细胞样品中包含SNP rs1467558的CD44风险等位基因的至少一个拷贝的存在；以及

(iii)(a)当在来自所述受试者的所述细胞样品中检测到所述CD44风险等位基因的至少一个拷贝时，将所述受试者分层为第一AIS亚类；或

(b)当在来自所述受试者的所述细胞样品中未检测到所述CD44风险等位基因时，将所述受试者分层为第二AIS亚类。

3.如权利要求1或2所述的用途，其中所述CD44风险等位基因的所述至少一个拷贝由所述CD44风险等位基因的两个拷贝组成，并且所述受试者对于所述突变SNP rs1467558来说是纯合子。

4.如权利要求1或2所述的用途，其中所述样品是核酸样品。

5.如权利要求1或2所述的用途，其中所述样品是蛋白质样品。

6.如权利要求1或2所述的用途，其中所述试剂盒包括：

(i)用于检测包含SNP rs1467558的CD44风险等位基因的核酸探针或引物；和/或

(ii)特异性地检测CD44蛋白中由SNP rs1467558编码的突变引起的苏氨酸的蛋白质配体。

7.如权利要求6所述的用途，其中所述核酸探针或引物包含核酸序列，所述核酸序列与包含SNP rs1467558的核酸特异性地杂交。

8.如权利要求6所述的用途，其中所述蛋白质配体是对包含由SNP rs1467558编码的突变引起的苏氨酸的CD44蛋白具有特异性的抗体。

Images