TWI443337B - 用於脊柱側彎之分類及診斷的方法 - Google Patents

用於脊柱側彎之分類及診斷的方法 Download PDF

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Description

用於脊柱側彎之分類及診斷的方法 參考相關申請案
本申請書係依據35 U.S.C.§ 119(e)，聲明於2008年10月10日提申之美國專利臨時申請案號61/104,442，以及於2009年7月27日提申之美國專利臨時申請案號61/228,769之優先權，在此併入本案以作為參考資料。
研究或發展之贊助經費聲明
N/A.
發明領域
本發明係相關於一種診斷發展出脊柱側彎(如青少年原發性脊柱側彎(AIS))傾向之方法，以及辨識出可治療脊柱側彎之化合物之篩選試驗。
 發明背景
脊柱側彎為一種疾病狀況，其中個人之脊柱由一側彎曲至另一側，也可能會旋轉。此為不正常脊柱側面彎曲。在x-光圖上，具有典型脊柱側彎之個體脊柱看起來會像“S”或“C”，而非一直線。
脊柱變形與脊柱側彎為在兒童與青少年中最典型與最常見之骨科變形症狀，而原發性脊柱側彎(AIS)為最常見之脊柱側彎形式。青少年原發性脊柱側彎(AIS)之病因仍不清楚。AIS主要會影響女孩，不論是在數量與嚴重度上，雖然有數項研究顯示有基因傾向，但遺傳形式仍未知(Axenovich TIet al. ,Am J Med Genet 1999,86 (4)：389-394；Wise CAet al. ,Spine 2000,25 (18)：2372-2380；Blank RDet al. ,Lupus 1999,8 (5)：356-360；Giampietro PFet al. ,Am J Med Genet 1999,83 (3)：164-177)。目前已提出數種分歧觀點可較佳定義出其病因(Machida M.,Spine 1999,24 (24)：2576-2583；Roth JAet al. ,J Biol Chem 1999,274 (31)：22041-22047；Hyatt BAet al. ,Nature 1996,384 (6604)：62-65；von Gall Cet al. ,Eur J Neurosci 2000,12 (3)：964-972)。基因、生長賀爾蒙之分泌、結締組織結構、肌肉結構、前庭功能障礙、褪黑激素分泌以及血小板微結構為主要焦點。目前的觀點為中央神經系統(CNS)之控制或處理中樞有缺陷，會影響脊柱之成長，且脊柱變形之敏感性因人而異。
可惜的是目前FDA並無方法可辨識出兒童或青少年是否有發展成IS之風險，以預測哪些受影響之個體需要治療，以預防或阻止疾病發展(Weinstein SL,Dolan LA,Cheng JC et al.Adolescent idiopathic scoliosis.Lancet 2008；371：1527-37)。結果，目前之治療如矯正或外科手術校正會延遲，直到偵測到明顯變形或呈現出明顯惡化時才進行，導致治療效果並非最佳(Society SR.Morbidity & Mortality Committee annual Report 1997.)。需要治療之IS病患中，有80至90%會以矯正方式治療，以及約1%需要外科手術校正變形，使用脊柱儀器與胸部及/或腰部脊柱接合手術，會有併發症風險(Weiss HR,Goodall D.Rate of complications in scoliosis surgery-a systematic review of the Pub Med literature.Scoliosis .2008；3：9)。現今在美國有 約一百萬位年齡介於10至16歲間之兒童罹患某些程度之IS。每16位兒童中會有1位被診斷出脊柱側彎，其彎曲程度會惡化至需要積極治療。在南美每年約有29,000件脊柱側彎手術進行，會導致明顯的精神與生理病態。(Goldberg MS,Mayo NE,Poitras B et al.The Ste-Justine Adolescent Idiopathic Scoliosis Cohort Study.Part I：Description of the study.Spine 1994；19：1551-61；Poitras B,Mayo NE,Goldberg MS et al.The Ste-Justine Adolescent Idiopathic Scoliosis Cohort Study.Part IV：Surgical correction and back pain.Spine 1994；19：1582-8)。
目前需要一種將患有脊柱變形(如 脊柱側彎，如AIS)之個體分類之方法，以診斷出脊柱側彎之傾向，以辨識出可預防或治療這類疾病之化合物。
本申請書提供了數份文獻，在此完整併入本案以作為參考資料。
 發明概要
本發明首度呈現脊柱側彎病患(原發性脊柱側彎病患)之細胞具有廣泛之G-蛋白耦合受器(GPCR)訊息傳遞缺損現象。此種缺損現象於數種不同之GPCRs與各種細胞種類中測定，包括骨骼形成細胞、肌肉形成細胞以及血液細胞。
有多種賀爾蒙、神經傳導物質與生物活性物質會經由位於細胞膜上之特定受器，控制、調節或調整活體之功能。許多這些受器會藉由鳥嘌呤核苷酸-結合蛋白(G蛋白)，傳導細胞中訊號至其耦合之受器上。此類受器一般稱之為G蛋白 耦合受器(“GPCR”s)。特定之訊號分子結合至GPCR，會導致受器構形上之變化，產生可結合形式，並可活化G蛋白，因而驅動一連串細胞內事件，最終產生生物反應。一般而言，GPCRs會與G蛋白作用，以調節細胞內第二訊息子之合成，如環狀AMP、肌醇磷酸、二醯基甘油與鈣離子。
更特別的是，本發明係提供一種決定測試化合物是否可用於治療脊柱側彎(如原發性脊柱側彎(IS)，如嬰兒原發性脊柱側彎、青少年原發性脊柱側彎、青少年原發性脊柱側彎(AIS)或成人脊柱側彎)之方法(如體外法)，該方法包括：(a)將表現有耦合至鳥嘌呤核苷酸-結合(Gi )蛋白之受器(即至少一受器)之細胞，與該受器之配位體接觸，在該測試化合物存在或不存在下；(b)測定該細胞中該配位體誘發之訊號幅度；其中，與該測試化合物不存在時相較，在該測試藥物存在時產生之較高訊號，代表該測試藥物可用於治療脊柱側彎(如原發性脊柱側彎，如AIS)。
此方法可用於篩選可調節一般性Gi -蛋白-訊息傳遞缺損之化合物。然而其亦可用於決定何種化合物可最有效調節，尤其是降低或反向作用細胞中之Gi -蛋白-訊息傳遞缺損現象，就特定族群之病患或特定病患而言。的確，就這些目的而言，最有效之化合物因人而異。因此，本發明之篩選方法可用於辨識出哪一化合物可最有效反向作用細胞中之Gi -蛋白-訊息傳遞缺損現象，就特定族群之病患或特定病患而言。
本發明亦提供一種診斷個體是否有發展出脊柱側彎(如原發性脊柱側彎，如嬰兒原發性脊柱側彎、少年原發性 脊柱側彎或青少年原發性脊柱側彎(AIS))之傾向之方法(如體外法)，包括：(a)將得自該個體之表現有一與抑制性鳥嘌呤核苷酸-結合(Gi )蛋白耦合之受器之細胞，與該受器之配位體接觸；(b)測定該細胞中該配位體誘發之訊號幅度；(c)比較該訊號與對應之參考訊號；以及(d)以該項比較結果為基礎決定該傾向。
於此使用之術語“發展為脊柱側彎之傾向”，係指個體發展為脊柱側彎(即脊柱變形)，及/或在未來會有更嚴重脊柱側彎之基因性或代謝性傾向。
在另一觀點中，本發明係提供一種將患有原發性脊柱側彎，如嬰兒原發性脊柱側彎、少年原發性脊柱側彎或青少年原發性脊柱側彎(AIS)，之人類個體分類之方法，包括：(a)將得自該個體之表現有一與抑制性鳥嘌呤核苷酸-結合(Gi )蛋白耦合之受器之細胞，與該受器之配位體接觸；以及(b)測定該細胞中該配位體誘發之訊號幅度，其中該決定步驟之結果可將一患有原發性脊柱側彎(如AIS)之個體分類至某一原發性脊柱側彎亞群中。
在一實施例中，上述之原發性脊柱側彎為AIS。在一實施例中，AIS個體(i)若該訊號之振幅為約34%或更低，相較於由控制組個體細胞測得之對應訊號，係分類至亞群1，(ii)若該訊號之振幅介於約34%至約57%，相較於由控制組個體細胞測得之對應訊號，則分類至亞群2，以及(iii)若該訊號 之振幅介於約57%至約80%，相較於由控制組個體細胞測得之對應訊號，則分類至亞群3。
因此，本發明之方法較佳亦用於測定如該疾病之種類及/或嚴重度，或疾病本身之缺損特性(即將個體“分類”或“分級”)。這相當重要，尤其當最有效可治療或預防原發性脊柱側彎(如AIS)之藥物，在患有不同種類及/或嚴重度原發性脊柱側彎之病患間有差異時。因此，本發明之分類方法可提供較佳之藥物篩選方法，用於特定病患。此方法亦可用於將已診斷出脊柱側彎之病患(如成人脊柱側彎)分類/分級。
在一實施例中，上述之個體為可能發展為脊柱側彎之候選人，如原發性脊柱側彎(如嬰兒原發性脊柱側彎、少年原發性脊柱側彎或青少年原發性脊柱側彎(AIS))。如此所述，術語“可能發展為脊柱側彎之候選人”，包括其父母至少有一位患有脊柱側彎(如青少年原發性脊柱側彎)之個體(如兒童)。在其他因素中，年紀(青少年)、性別與其他家族祖先，皆為已知可能發展出脊柱側彎風險之因素，因而某些程度上可用於評估發展出脊柱側彎之風險。在某個體中，脊柱側彎會在短時間快速發展至需要校正手術之程度(通常當變形到達Cobb’s角50°)。目前對於診斷脊柱側彎如AIS(當脊柱側彎相當明顯)之積極方式包括觀察(當Cobb’s角為約10-25°)、骨科裝置(當Cobb’s角為約25-30°)，以及外科手術(大於45°)。測定惡化風險更可信之方法為可1)篩選適當之飲食，以免除已知會造成脊柱側彎之食物；2)選出最佳之治療試劑；及/或3)選出最不具侵入式之治療法，如 姿勢矯正運動、骨科裝置，或較低侵入式之外科手術，或不需接合之外科手術(不需接合脊椎骨並可維持脊柱的運動性)。本發明包含了選出最有效且最不具侵入式的已知預防措施或治療法，以測定發展為脊柱側彎之風險。
本發明方法可使用表現有一或多個與Gi 蛋白(亦稱之為Gi α次單元)耦合之受器之細胞進行。此處所稱之“受器”係指野生型受器，以及可維持其活性(即GPCR-媒介之活性)之片段及/或變異物。與Gi 蛋白耦合之GPCRs(此後稱之為Gi PCRs)包括，例如，CD47、血清素受器(5-HT)、腺苷酸受器、正腎上腺素受器、大麻素受器、組織胺受器、前列腺素受器以及多巴胺受器。第15圖顯示適用於本發明方法之GiPCRs，但並非全部。
在一實施例中，上述與Gi 蛋白耦合之受器為血清素受器、α-腎上腺素受器、腺苷酸受器、大麻素受器或其任一組合。在另一實施例中，上述受器為5-HT1A、α2-AD、A3或CB2。在另一實施例中，上述受器並非褪黑激素受器(如MT2)。
在一實施例中，上述方法係於大於一種耦合至Gi 蛋白之受器上進行。在另一實施例中，上述方法係使用大於一種具配位體特異性之與Gi 蛋白耦合之受器。在另一特定實施例中，每一配位體係特異於不同之與Gi 蛋白耦合之受器(如2、3、4、5或6個配位體)。第16圖代表GiPCRs配位體之列表，但並非全部。在一特定實施例中，用於本發明之配位體並非MT2配位體。
任何可表現一或多種Gi -耦合受器及/或Gi 蛋白之樣本 (如細胞、組織)，皆可使用於本發明方法中。該細胞可天然地或重組地表現一或多種Gi -耦合受器，及/或Gi 蛋白。就重組性表現而言，編碼Gi PCR之核酸及/或編碼Gi 蛋白之核酸係引入適當之細胞中，且該細胞在可使該蛋白表現之條件下培養。於此所使用之細胞可天然性表現一或多種與Gi 蛋白耦合之受器，部分原因是由於方便由個體採集而選擇。因此，細胞如成骨細胞、蝕骨細胞或周邊血液單核細胞(PBMC)(主要包括淋巴細胞與單核細胞)，以及肌母細胞為較佳可取得，且較方便使用於本發明方法中。血液細胞(如PBMCs、血小板(凝血細胞)等)為尤佳，且可提供更快速之測試。任何血液細胞皆可用於本發明方法中，只要其具有至少一耦合至Gi蛋白之GPCR受器。在一實施例中，該細胞係得自或衍生自患有原發性脊柱側彎(如嬰兒原發性脊柱側彎、少年原發性脊柱側彎或青少年原發性脊柱側彎(AIS))之個體。就本發明而言，PBMCs並不需要培養建立，因為此述之方法可使用具有新鮮或冷凍PBMCs之細胞懸浮液進行。
任何Gi -蛋白耦合受器之配位體皆可使用，依據本發明之數個觀點。Gi PCRs之配位體(如天然或合成的)為技術上已知，這些配位體中已有數種可於商業上購得(例如購自Tocris Bioscience)。第15圖代表適用於本發明方法之Gi PCR配位體列表，但並非全部，不論是單獨使用或與其他配位體組合。在一特定實施例中，上述配位體為已知之受器協同劑。在一實施例中，上述配位體為(a)1-[3-(3,4-亞甲基二氧基苯氧基)丙基]-4-苯基-哌嗪順丁烯二酸鹽(已知為BP554順丁烯二酸鹽)，就5-HT1A受器而言，(b)5-溴-N-(4,5- 二氫-1H-咪唑-2-基)-6-喹噁啉胺(已知為UK14304)，就α2-AD受器而言；(c)1-去氧-1-[6-[[(3-碘化苯基)甲基]胺基]-9H-嘌呤-9-基]-N-甲基-β-D-呋喃核醣脲醯胺(已知為IB-MECA)，就A3受器而言；(d)N-環己基-7-氯-1-[2-(4-嗎啉基)乙基]喹啉-4(1H)-酮-3-羧醯胺(已知為CB65)，就CB2受器而言。
應瞭解到有各種不同測試化合物可由上述方法篩選。測試化合物涵蓋數種化學群組，一般為有機分子，較佳為小型有機化合物，具有分子量大於50但小於約2,500道耳吞。測試化合物包含有與蛋白質產生結構性作用力，尤其是氫鍵，所需之官能基，一般包括至少一胺基、羰基、羥基或羧基，較佳至少二官能性化學基團。測試化合物通常包含環狀碳或雜環結構，及/或芳香或多芳香結構，經一或多個上述官能基取代。測試化合物亦可為生物分子包括胜肽(如目標為一或多個涉及Gi 蛋白耦合受器之訊息傳遞之缺陷蛋白之胜肽)、核酸(如寡核苷酸，如目標為一或多個涉及Gi 蛋白耦合受器之訊息傳遞之缺陷蛋白之反義分子)、抗體、醣類、脂肪酸、類固醇、嘌呤、嘧啶、及其衍生物、結構類似物或組合物。測試化合物可得自多種來源，包括合成或天然化合物庫。例如數種可隨機或定位合成廣範圍有機化合物與生物分子之方法，包括表現隨機化寡核苷酸與寡胜肽。此外，細菌、黴菌、植物與動物萃取物之天然化合物庫為可獲得或立即可製造。此外，天然或合成製造之化合物庫與化合物，可立即經由一般化學、物理與生化方法進行修飾，且可用於製造組合式化合物庫。已知之藥 學試劑可用於進行定位或隨機性化學修飾，如醯基化、烷基化、酯化、醯胺基化等，以產生結構類似物。
在一實施例中，參考訊號為得自或衍生自控制組個體(如年紀及/或性別-符合)，其並未發展出脊柱側彎(如原發性脊柱側彎，如嬰兒原發性脊柱側彎、少年原發性脊柱側彎或青少年原發性脊柱側彎(AIS))，或並無發展出脊柱側彎之傾向，之對應樣本(如一細胞)之訊號。在此情況下，得自個體細胞之訊號若較低，相對於參考訊號，代表該個體具有發展為脊柱側彎之傾向，其中較高或實質上相等之訊號代表該個體並不具有發展為脊柱側彎之傾向。
在另一實施例中，上述參考訊號為得自或衍生自控制組個體(如年紀及/或性別-符合)，其已發展出脊柱側彎(如原發性脊柱側彎，如嬰兒原發性脊柱側彎、少年原發性脊柱側彎或青少年原發性脊柱側彎(AIS))，或具有發展出脊柱側彎之傾向，之對應樣本(如一細胞)之訊號。在此情況下，得自個體細胞之訊號若較低，相對於參考訊號，代表該個體具有發展為脊柱側彎之傾向，而訊號較高則代表該個體並無發展為脊柱側彎之傾向。
在一實施例中，對應樣本為與得自該個體相同形式之細胞(如測試樣本與參考樣本二者皆為淋巴細胞)。在一實施例中，該試驗係於含有測試化合物與控制組化合物之盤上(如96-孔、384-孔等)進行。在另一實施例中，該盤亦含有得自健康個體之參考樣本，以及得自群組1、2與3之個體之樣本。
在一實施例中，較低或較高訊號係指測試樣本(得自待 測個體之樣本)之訊號相對於參考訊號之差異為至少約10%，在其他實施例中，至少約15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、150%或200%。在一實施例中，實質上相等之訊號係指一訊號，其與參考訊號相較之差異小於10%，在其他實施例中小於9%、8%、7%、6%或5%。
由配位體(如一協同劑)誘發之訊號幅度變化，可使用任一方法偵測。用於偵測經由GiPCRs產生之訊號(如細胞內反應)幅度或強度之方法為技術上已知。訊號之幅度可使用測量某一分子含量之方法測定，如二級信息子(如cAMP、Ca2+ )或基因產物(如mRNA或蛋白)，其含量經調節，在受器經配位體驅動後。該訊號幅度可經由如在配位體驅動受器之後，測量蛋白質-蛋白質間交互作用(如藉由螢光共振能量轉移[FRET]，或生物冷光共振能量轉移[BRET])而測得。其他可測量由GiPCRs產生訊號之方法包括，如測量cAMP含量(Medhurstet al. ,2003.In：J Neurochem.,84)、使用GIRK-鉈流量試驗測量鉈流量(Niswenderet al. ,2008；In：Mol Pharmacol.73(4))、膜片鉗夾(Saugstadet al. ,1996.In：J.Neurosci.16)、使用[35 S]GTPγS標記試驗測量GTPγS之結合(Rioboet al. ,2006.In：Proc Natl Acad Sci USA,103)，以及測量阻抗之改變(Peterset al. ,2007.In：J Biomol.Screen.12：312-9)。在一實施例中，該訊號之幅度係於細胞中受器經驅動後，使用阻抗之變化而測定(如細胞介電譜[CDS])。此種測量可使用即時細胞電子感測(RT-CESTM )技術測量(ACEA Biosciences Inc.,San Diego,CA,USA)(Huanget al. , Analyst,2008,133(5)：643-648；Sollyet al. ,Assay Drug Dev.Technol,2004,2(4)：363-372)，或使用CellKeyTM 技術(MDS Sciex,Concord,Ontario,Canada)，依據下述方法。
在一實施例中，該方法係於適用於高效能試驗法之形式進行，如96-或384-孔形式，以及適當之機械手臂(如抽吸機械手臂)與儀器。
本發明亦提供一種實施上述方法之套組。該套組包括如一或多種可測定Gi 蛋白耦合受器訊號之試劑，以及緩衝液、細胞、控制組樣本(如得自健康個體之樣本、得自群組1、2與3之病患樣本)，容器等，進行試驗。該套組之各組件可置於個別容器中，或某些可相容組件可依照需要於單一容器中預先組合。
除了上述成分外，該套組一般更包括使用指示，說明如何使用該套組中之各組件，以完成該方法。用於實施主要方法之指示一般會紀錄於適當之紀錄媒體上。例如，該指示可印於一基板上，如紙或塑膠等。如此，該份指示便可以出現於包裝內、標示於套組容器或組件上等方式存在於套組中(即與包裝或內包裝結合)等。在其他實施例中，該指示係以電子儲存資料檔案形式，存在於適當之電腦可讀取儲存媒介中，如CD-ROM、磁碟等。在其他實施例中，實際的指示並不存在於套組中，但可由遠端資源獲得，如經由網路。此實施例之一範例為一套組，其包括一網址，其中該指示可檢視及/或該指示可被下載。隨同該指示，此可取得指示之方法係紀錄於適當基板上。
在另一觀點中，本發明係提供一種預防及/或治療脊柱 側彎(如原發性脊柱側彎，如嬰兒原發性脊柱側彎、少年原發性脊柱側彎或青少年原發性脊柱側彎(AIS))之方法，包含投以由上述篩選方法辨識出之有效劑量化合物(及/或包含一化合物之組成物)至一個體中。
由上述方法辨識出之組成物(如醫藥組成物)，係以適當之醫藥載體/輔劑或醫藥載體/輔劑組合物，配製該由上述篩選方法辨識出之化合物(如胜肽、小分子)而製備。製劑可以任何路徑投藥，如靜脈內、肌肉內、皮下、口服、直腸、陰道、經皮、經黏膜、舌下及類似方式。
在一實施例中，上述之個體為哺乳動物，在另一實施例中，為人類。
本發明之其他目的、優點與特徵，將經由下列特定實施例之非限制性範例敘述而更臻清楚，所附之圖示僅用於說明。
 較佳實施例之詳細說明
本發明以下列非限制性範例進行詳細說明。
範例1 個體之臨床特性(控制組、AIS與無症狀)
健康個體(控制組)、AIS個體，以及無症狀但有風險之個體所檢驗出之臨床特性係分別列於下表I-III。
用於實驗3-4與8-10之細胞所屬個體之臨床特性
Sainte-Justine醫院、Montreal兒童醫院、Montreal and McGill大學之Shriners兒童醫院之人體試驗委員會核准此試驗。所有參與者之雙親或法定代理人皆提供簽名書面同意書(consent)，少部分提供非書面同意(assent)。所有患有IS之病患由此試驗六位骨科醫師之一檢查。若病史與物理性檢查與IS診斷一致，且在放射圖上觀察到冠狀平面最少有10度彎曲，且有脊椎旋轉現象，便會被視為有影響。這些個體之人口統計與臨床特徵列於下表IV。這些個體亦包括於上表II。
數位雙親之一患有IS之無症狀幼童，亦包含入本試驗中，以評估無症狀族群之試驗表現度。每一個體係以相同之骨科檢驗鑑定，以IS早期偵測方式檢驗，於Sainte-Justine大學醫院進行。這些個體亦包括於上表III。
亦招收Montreal’s小學之健康幼童作為控制組，在取得其父母之書面同意書；少部分人提供非書面同意之後。此招收係經過Montreal英語學校委員會、Affluent學校委員會，以及上述所有人體試驗委員會核准。每一位正常之個體亦經過上述骨科檢驗，使用Adam’s前彎試驗，使用脊柱測量儀(表IV)，以在進入試驗前找出潛在之脊柱側彎現象。這些個體亦包括於上表I中。
範例2 材料與方法
Gi 蛋白-耦合受器之反應係於不同形式細胞中進行(成骨細胞、肌母細胞與PBMCs(主要包括淋巴細胞))，得自患有臨床上定義AIS之病患，並與年紀及性別相符之控制組個體(未患有脊柱側彎)相較。
係研究三個族群：患有IS之病患、無脊柱側彎家族病史之健康控制組，以及父母之一有脊柱側彎但無症狀之孩子，其被視為有風險發展出脊柱側彎。招收患有IS之44位病患(19位AIS病患彎曲度大於45°，以及25位AIS病患彎曲度介於10°至29°間)(上表II)，以及42位健康控制組病患(上表I)，以及30位無症狀但有風險發展為脊柱側彎者(上表III)，每6個月檢查一次。所有個體皆為白種人。
成骨細胞與肌母細胞
骨骼樣本係於脊椎骨外科手術時取得(依據手術情況取得T3至L4不同部分)，而使用作為非脊柱側彎控制組骨骼樣本之受傷情況，則得自其他切片位置(脛骨或股骨，其中一例得自髂嵴切片)。成骨細胞與肌母細胞依據前述單離出(Moreau A,Wang DS,Forget S et al.Melatonin Signaling Dysfunction in Adolescent Idiopathic Scoliosis.Spine 2004；29：1772-81；Azeddineet al. ,2007Molecular determinants of melatonin signaling dysfunction in adolescent idiopathic scoliosis. Clin Orthop Relat Res.2007,462：45-52)，係培養於37℃[/5%CO2 ，於補充有10%胎牛血清(FBS)與100μg/mL鏈黴素之MEM培養液中。進行實驗 前，細胞植於CellKeyTM 標準96-孔盤中，密度為5×104 /孔，並培養24h，靜置於標準條件下(37℃/5% CO2 )。在某些盤中，在CDS試驗之前進行百日咳(Pertussis)毒素處理(100ng/mL,Sigma,Oakville,ON,Canada)16h。經整夜培養後，該盤置於CellKeyTM 系統下，並在實驗開始前將培養液更換為試驗緩衝液(Hanks，平衡鹽類溶液，含有20mM HEPES與0.1% BSA)。之後細胞於室溫下平衡30分鐘。進行預添加試驗5分鐘，得基準線讀數。之後，同時加入配位體(褪黑激素、2-碘化褪黑激素、BP554順丁烯二酸鹽，UK14304、IB-MECA，及/或CB65)至96孔中，使用整合式流體系統。內生性受器之活化會導致阻抗改變，在流體加入與混合後立即產生。CellKeyTM 系統之快速更新速率(2s.)允許偵測到這些阻抗之立即變化。於28℃測量阻抗10分鐘至15分鐘，加入配位體後監測細胞對於配位體之反應，並產生CellKeyTM 反應圖，其為訊息傳遞機制之特性。
PBMCs
血液樣本係得自病患與控制組，收集於含有EDTA之集血管中，之後於Ficoll-Plaque(GE Healthcare,Mississauga,ON,Canada)溶液中離心，得PBMCs(主要含有淋巴細胞)。PBMC分液冷凍保存於含有10% DMSO之FBS中，保存於液態氮中至解凍與進行實驗。PBMCs由組織培養錐形瓶中收穫，並以試驗緩衝液清洗三次。細胞單離自肝素化周邊血液，使用ficoll-Hypaque密度梯度離心，並培養於RPMI 1640培養基中，補充有10% FBS、100μg/mL鏈黴素與1%植物血球凝集素。培養於37℃/CO2 ，48h後，細胞以試驗緩衝液清 洗三次，並植於CellKeyTM 小型96-孔盤中。一般而言，每孔加入1×105 至1.5×105 個細胞，並於室溫下沈降30分鐘。此動作會使電極頂部產生單層細胞。待細胞沈降後，該細胞盤置於儀器中，並如下述起始實驗，在進行5分鐘基準線測量後。所有實驗皆於28℃進行。
細胞介電譜(CDS)
由各種受器對應之配位體誘發之反應係以細胞介電譜(CDS)測量，使用CellKeyTM 技術(MDS Sciex,San Francisco,CA,USA)。CellKeyTM 系統整合阻抗測量系統、客製化96-孔微滴定盤、板載96-孔射流，以及環境控制，與完整解決方案包裝之客製化取得與分析軟體(MDS Sciex)，可與商業上可取得之機械手臂平台相容。有24個頻率之低電壓，自1KHz至10MHz，施加於96-孔微盤中所沈降之單層細胞上，該盤底部有電極，所產生電流之測量更新速率為2s。該系統為熱調節，且該實驗可於28至37℃間進行，於此所呈現之實驗一般係於28℃進行。板載流體之添加與更換係以96-孔頭流體傳送裝置進行，範圍為5-500μL。除了細胞盤位置外，該CellKeyTM 系統尚包含二額外置放站供96-或384-孔化合物盤使用。所有試驗設定、執行及資料取得與分析皆以CellKeyTM 軟體控制。
使用CellKeyTM 技術可在低受器表現量之條件下(如使用衍生自病患之初代與第二代細胞)，準確地定量出天然或合成配位體之協同劑與拮抗劑活性。
成骨細胞之cAMP試驗
得自患有IS之病患與控制組個體之成骨細胞，係四重複 植於24-孔盤中(1×105 個細胞每孔)，並如先前文獻所述進行測試(Moreau A,Wang DS,Forget S et al.Melatonin Signaling Dysfunction in Adolescent Idiopathic Scoliosis.Spine 2004；29：1772-81)。所有試驗皆進行二重複。
統計分析
每一個體皆進行三次實驗，每個實驗二重複，這些結果係以平均值±SE表示。試驗變異係數一般小於10%。所有濃度反應曲線皆以非線性回歸分析，使用GraphPadTM (San Diego,CA)。用於統計分析，多重比較係使用單因子變異分析(ANOVA)，之後進行Newman-Keuls之post-hoc事後檢定。機率值小於0.05視為有顯著性。
數據係以平均值±SE表示。平均值之多重比較係以單因子變異分析(ANOVA)進行，之後進行Dunnett post-hoc事後檢定，使用GraphPadTM Prism 4.0軟體，只有在P值<0.05時視為有顯著性。
範例3 CDS偵測相關於褪黑激素訊息傳遞中Gi蛋白之傳導路徑
CDS偵測相關於褪黑激素訊息傳遞中之Gi蛋白傳導路徑之能力，係以百日咳毒素(PTX)阻斷此路徑而測得。此毒素會使雜三合體Gi蛋白之αi 次單元ADP-核醣化，因而阻止其活性。MG63成骨細胞株係經血清飢餓(serum-starved)16h，在100ng/mL之PTX不存在或存在下，抑制Gi蛋白之αi 次單元。之後細胞係以10uM褪黑激素或碘化褪黑激素，於37℃處理5分鐘。細胞反應係以CellKeyTM 測量，如同材料與方法中所述。
結果示於第1圖中，顯示出經PTX處理之MG63成骨細胞株，會大幅抑制以褪黑激素或碘化褪黑激素刺激後之細胞內反應，使用CDS測量。褪黑激素之抑制程度約為75%，碘化褪黑激素之抑制程度約為90%，代表Gi蛋白對於褪黑激素訊息傳遞為主要影響，以CDS測量。
範例4 褪黑激素缺損之比較，以cAMP與CDS測量
衍生自健康控制組與三個嚴重IS病患(外科案例，Cobb’s角>45°)之第一代成骨細胞，經福司高林(forskolin)預處理，誘發腺苷酸環化酶之活性與後續cAMP之產生。之後細胞係以高濃度之褪黑激素刺激，褪黑激素訊息傳遞之功能狀態係以褪黑激素降低cAMP含量之能力預估。數據係以無褪黑激素存在時，由福司高林(forskolin)誘發之cAMP產生量校正。如同預期的，得自IS病患之成骨細胞具有較高之cAMP產生量，對應於福司高林(forskolin)刺激後之褪黑激素反應，當與健康控制組個體相較時(第2圖)。此外，此製造量在三位IS病患間不同。這些數據與先前發現一致(Goldberg MS,Mayo NE,Poitras B et al.The Ste-Justine Adolescent Idiopathic Scoliosis Cohort Study.Part I：Description of the study.Spine 1994；19：1551-61)，因而確認了這些病患之成骨細胞褪黑激素訊息傳遞功能失常程度不同。
之後係評估CDS試驗偵測此種缺陷之能力，藉由研究各種濃度之褪黑激素與碘化褪黑激素對於這些細胞之CDS反應之作用而得。高濃度之褪黑激素或碘化褪黑激素，係施加至得自健康(控制組)與患有IS之病患(第1、2與3組)之 成骨細胞與PBMCs(主要包括淋巴細胞)上。後續之細胞內反應係以CDS測量，於CellKeyTM 儀器中。曲線圖係產生自最大阻抗幅度。數據係以得自控制組個體之最大反應值校正，並以平均值±SE表示，三個獨立實驗皆進行二重複。獲得之結果顯示，褪黑激素與碘化褪黑激素會誘發類似之濃度依賴性反應，於來自控制組與IS病患之成骨細胞中。然而，該反應之幅度在IS成骨細胞中明顯較低(第4圖)。另一方面，亦於三位IS病患中觀察到明顯之CDS反應差異。這些結果顯示IS病患之褪黑激素功能失常，並顯示這些病患缺損程度各有不同，以CDS測量。
有趣的是，使用CDS篩選PBMCs對於褪黑激素或碘化褪黑激素之反應，顯示出類似於由成骨細胞得到的結果(第4圖與第8圖)，顯示出褪黑激素訊息傳遞之功能失常亦發生於PBMCs。
範例5 比較單離自IS與控制組個體之各細胞形式不同Gi-耦合受器反應
如第3圖至第8圖所示，單離自AIS病患之成骨細胞、肌母細胞與PBMCs，以特異於不同Gi-蛋白耦合受器之各配位體刺激(MT2、5-HT1A、α2-AD、A3或CB2)，產生反應改變(即刺激後阻抗產生變化)，與來自正常、非脊柱側彎個體之細胞比較，因而呈現出IS病患具有Gi-蛋白媒介訊息傳遞之共通性缺損。如下表V所示，來自所有IS病患(第I相與第II相)之細胞，皆測量到Gi-蛋白耦合受器反應之缺損。此外，來自12/31位無症狀但有風險之個體(其父母有一位為IS 病患)，顯示Gi-蛋白耦合受器反應之缺損。有趣的是，12位偵測到Gi-蛋白耦合受器反應缺損之個體中有4位之後發展為出脊柱側彎之症狀，以X-光分析判定，顯示該缺損/缺陷Gi-蛋白耦合受器反應可用於診斷IS(或預先診斷是否會發展為IS)。
範例6 測量得自AIS家族成員之細胞內Gi-耦合受器反應
第9圖至第10圖顯示PBMCs(主要包括淋巴細胞)之不同Gi-耦合受器之反應變化，單離自患有IS之母女，但非未受影響之父子。有趣的是，由母女之細胞測得之Gi-耦合受器反應非常類似(第2組，如下定義)，顯示該缺陷由母親基因性遺傳至女兒。此外，即使接受了外科手術降低脊柱彎曲度，該缺陷仍舊存在於母體中。女兒臨床上之數據如下：年齡13.5，彎曲情況：右胸，Cobb角：6。
範例7 於成骨細胞中測量Gi-耦合受器反應為基礎，進行AIS個體之分組/分類
第11圖顯示由控制組(n=3)與IS個體(n=9)獲得之平均值範圍，使用不同之Gi-耦合受器配位體，於成骨細胞中測量。最小(min)與最大(max)值代表三個獨立測量，每次二重複之平均值(總共六個值)，就特定病患/控制組個體而言。所有經測試之AIS個體皆顯示出較低之Gi -耦合受器反應，與控制組個體相較，但亦觀察到AIS病患一般會顯示出三種反應(AIS病患以三種不同曲線代表，示於第3圖至第8圖)，因此可分類為三組。具有最低值之AIS個體(低Gi -耦合受器反應)分類為子群組1，具有最高值之AIS病患(“高”Gi -耦合受器反應，但總是低於控制組個體)，分類為子群組3，而介於子群組1與子群組3間之AIS個體(“中度”Gi -耦合受器反應)係分類為子群組2。使用不同配位體獲得之數據(dZiec值與控制組之%)摘錄於下表VI。列出三獨立實驗，各二重複(n1與n2)。
表VII：每一組觀察到成骨細胞對於不同配位體反應之最小與最大值，以及由控制組個體之最小與最大值間之差異。
該值由第11A至F圖所示之數據計算而得。
範例8 依據PBMCs中Gi-耦合受器之反應將IS個體分組/分類
患有AIS之個體(n=45)(請見表II)或未患有AIS之個體(n=42)(請見表I)，係進行試驗以決定CDS細胞基礎試驗之敏 感性與特異性，藉由研究來自每一個體之PBMCs(主要包括淋巴細胞)中褪黑激素訊息傳遞之功能狀態。
PBMCs單離自控制組個體、IS個體，如上範例2所述。300μM碘化褪黑激素之訊息傳遞影響係以細胞介電譜(CDS)測定。
第12A圖顯示所有患有IS之病患對於碘化褪黑激素反應較低，與健康志願者相較(控制組)。褪黑激素組亦獲得類似結果(數據未顯示)，因而說明此試驗之高選擇性。來自健康志願者之PBMCs測到碘化褪黑激素反應之最小幅度為124歐姆，在實驗條件下。受測之AIS病患中並未有CDS反應到達此幅度者。IS病患中測到之最大幅度為110歐姆，而最小值為16歐姆。褪黑激素訊號，對應於碘化褪黑激素，於正常/健康個體中係大於120歐姆。CDS反應範圍介於10至40歐姆間之IS病患分類為群組1，40至80歐姆間分類為群組2，而介於80至120歐姆間則分類為群組3。在所有受測之AIS病患中，分別有11%(5/44)、30%(13/44)與59%(26/44)被診斷歸為群組1、2與3。依據其CDS反應，對於這些病患之分類相當清楚。群組1之CDS反應平均值為27.86±4.18，而群組2為65.71±3.42，而群組3為97.94±1.36，控制組為155.17±3.91。這些差異相當明顯(P<0.001)。這些結果顯示以CDS試驗評估PBMC中褪黑激素之訊息傳遞情況之功能性測試，可有效辨識出患有IS之病患，不僅可與健康個體分別，甚至可分為不同功能組。這些結果顯示出此功能測試之敏感性、特異性與動力學特性，可作為診斷工具。下表VII亦顯示出每一組以及控制組之PBMCs對於碘化褪黑 激素反應之最小與最大值差異。
範例9 由PBMCs預測發展為IS之風險
健康控制組(n=42)(表I)或被認為有風險發展為此疾病之個體(n=30)(表III)，係經測試以決定此試驗預測發展出IS風險之能力。
PBMCs係單離自無症狀但有風險之個體，如上範例2所述。300μM碘化褪黑激素之訊息傳遞影響，如以細胞介電譜(CDS)測量，係於這些細胞中測定，並與上範例6之健康控制組相較。
得自無症狀但至少父母之一患有脊柱側彎之孩童之PBMCs功能篩檢，顯示出在此群組中可偵測到褪黑激素訊息傳遞缺陷(第12B圖)。在所有受測之無症狀孩童中，60%(19/31)具有CDS反應範圍為正常幅度(>120歐姆)，其中 CDS反應降低40%(12/31)。後者群組被視為更容易發展出脊柱側彎。在這12位高風險孩童中，有4位(33%)在24個月之後已發展出脊柱變形，具有平均Cobb角11.7°，如同X-光片上所示(資料未顯示)。在19位正常範圍中之個體並無人發展為脊柱側彎。
目前已知IS之流行程度在至少雙親之一患病之無症狀孩童中日益增加。上述呈現之結果證實了此現象，並確認此類孩童更容易發展出IS。試驗預測無症狀孩童發展出脊柱側彎之風險為40%(即12/31)，其中33%在數個月後發展為脊柱變形。例如，表III中3116號之無症狀病患(9歲)，在11歲時在右胸與左腰呈現出彎曲情況，具有Cobb角9-14度。
剩下67%之有懷疑孩童並無脊柱變形現象，這似乎與其年齡有關。事實上，脊柱變形通常在年齡為10至16歲間辨識出。然而參與本試驗之無症狀孩童平均年齡為10.2±3.2歲，他們被追蹤24個月。因此並非所有受測孩童皆到達此階段適合發展出脊柱變形之年紀。
在這些受測孩童中(包括年紀10歲或更老(脊柱側彎約於10歲出現))，不論是具有正常褪黑激素訊息傳遞之無症狀孩童，或是無脊柱側彎家族病史之控制組孩童，在此學習階段皆未發展出任何脊椎變形。
範例10 測量無症狀但有風險個體之Gi-耦合受器反應
第13A與B圖顯示Gi -耦合受器反應缺陷可於18個月後，無症狀個體(n=31)(雙親之一患有AIS之個體)之PBMCs(主要包括淋巴細胞)中偵測到。此外，缺陷幅度在 這段時間內會增加(即若個體在第一時間點(t0 )與18個月後(t18 ))，顯示出類似之反應曲線，表示此缺陷並不會隨時間改變。
範例11 測量成骨細胞中Gi-耦合受器之反應
成骨細胞係植於CellKeyTM 標準96-孔微盤中，密度為5×104 /150uL每孔，並靜置於標準條件下(37℃/5% CO2 )。靜置整夜後，該盤係置於CellKeyTM 系統中，並在開始試驗前將培養液置換為試驗緩衝液(Hanks，經平衡鹽類溶液，含有20mM HEPES與0.1% BSA)。之後細胞於室溫下平衡30分鐘。在此期間終點，該盤置於系統下，並進行預添加測量5分鐘，以獲得基準線讀數。之後，同時加入福司高林(forskolin)、異丙基腎上腺素(isoproterenol)、褪黑激素或緩激肽(bradykinin)至所有96孔中，使用整合式流體系統。添加化合物會導致阻抗改變，在流體加入與混合後立即產生。阻抗係於28℃測量15分鐘。第14圖顯示GPCR於AIS中之訊息傳遞係特異於Gi 耦合受器。觀察在異丙基腎上腺素存在下Gs -耦合GPCR之反應差異，以及在福司高林(forskolin)存在下cAMP之製造，在每一群組間，說明了無功能性Gi 存在。在細胞中Gi 約為Gs的10倍多。因此，若某些Gi 為非功能性，便無法在福司高林(forskolin)存在下抑制cAMP之產生，因此，Gs -耦合反應亦會被影響。
雖然本發明已經上述特定實施例描述，但可在不脫離本發明精神與特徵範疇內進行修飾，本發明範圍如後附申請專利範圍所述。
第1圖代表Gi蛋白對於褪黑激素訊息傳遞之影響，以CDS偵測。圖中資料得自最大阻抗反應，對應於平均值±SE，由3個獨立實驗進行三重複而得；第2圖顯示得自控制組個體(無-IS)與患有IS個體之成骨細胞，係經福司高林(forskolin)預處理，誘發腺苷酸環化酶活性與後續之cAMP製造。之後細胞經高濃度之褪黑激素處理，褪黑激素之訊息傳遞功能狀態係以褪黑激素降低cAMP含量之能力預估。資料係以無褪黑激素存在時，福司高林(forskolin)誘發產生之cAMP校正；第3圖顯示表現有不同Gi 蛋白耦合受器之成骨細胞，得自AIS患者與控制組個體，經特定配位體活化後之反應，係以細胞介電譜(CDS)測量。與控制組(*)、第3組(Ψ)或第2組(Ω)之比較係表示為：*,Ψ,Ω,p<0.05；**,ΨΨ,ΩΩ,p<0.01；***,ΨΨΨ,p<0.001；第4圖比較Gi耦合蛋白之訊息傳遞功能失常情況，使用不同之配位體，以細胞介電譜(CDS)最大反應之百分比表示。高濃度之褪黑激素、碘化褪黑激素、BP554、UK14304、IB-meca與CB65，係加至來自控制組(非-IS)，與患有IS(第1、2與3組)個體之成骨細胞上。後續之細胞反應係以CDS測量，使用CellKeyTM 儀器。以最大阻抗幅度產生曲線圖。數據係以得自控制組病患之細胞之最大反應校正，表示為平均值±SE，於三獨立實驗中進行三重複；第5圖顯示表現不同Gi 蛋白耦合受器之肌母細胞，得自 AIS患者與控制組個體，經特定配位體活化後之反應，使用細胞介電譜(CDS)測量。與控制組(*)、第3組(Ψ)或第2組(Ω)之比較係表示為：*,Ψ,Ω,p<0.05；**,ΨΨ,ΩΩ,p<0.01；***,ΨΨΨ,p<0.001；第6圖比較Gi耦合蛋白之訊息傳遞功能失常情況，使用不同之配位體，以細胞介電譜(CDS)最大反應之百分比表示。高濃度之褪黑激素、碘化褪黑激素、BP554、UK14304、IB-meca與CB65，係加至來自控制組(非-IS)，與患有IS(第1、2與3組)個體之肌母細胞上。後續之細胞反應係以CDS測量，使用CellKeyTM 儀器。以最大阻抗幅度產生曲線。數據係以得自控制組病患之細胞之最大反應校正，表示為平均值±SE，於三獨立實驗中進行三重複；第7圖顯示表現不同Gi 蛋白耦合受器之PBMCs，得自AIS患者與控制組個體，經特定配位體活化後之反應，使用細胞介電譜(CDS)測量。與控制組(*)、第3組(Ψ)或第2組(Ω)之比較係表示為：*,Ψ,Ω,p<0.05；**,ΨΨ,ΩΩ,p<0.01；***,ΨΨΨ,p<0.001；第8圖係比較Gi耦合蛋白之訊息傳遞功能失常情況，使用不同之配位體，以細胞介電譜(CDS)最大反應之百分比表示。高濃度之褪黑激素、碘化褪黑激素、BP554、UK14304、IB-meca與CB65，係加至來自控制組(非-IS)與患有IS(第1、2與3組)個體之PBMCs(主要包含淋巴細胞)上。後續之細胞反應係以CDS測量，使用CellKeyTM 儀器。以最大阻抗幅度產生曲線。數據係以得自控制組病患之細胞之最大反應校 正，表示為平均值±SE，於三獨立實驗中進行三重複；第9圖顯示Gi-耦合受器對於配位體刺激之反應變化，於得自#24家族之PBMCs上測量。該家族所有成員皆顯示最大阻抗，使用細胞介電譜(CDS)測量。***代表p<0.001；第10圖顯示Gi-耦合受器對於配位體刺激之反應變化，於得自#23、24、29與39家族之PBMCs上測量。該家族所有成員皆顯示最大阻抗，使用細胞介電譜(CDS)測量。***代表p<0.001；第11圖顯示得自控制組個體與來自功能組1、2與3之AIS病患之成骨細胞，使用(A)300μM褪黑激素、(B)300μM碘化褪黑激素、(C)300μM BP554、(D)300μM UK14304、(E)300μM IB-meca與(F)300μM CB65，以細胞介電譜(CDS)測量之值；第12圖顯示得自控制組個體與來自A)AIS病患，或B)無症狀但有風險之個體病患之PBMCs，使用300μM碘化褪黑激素，以細胞介電譜(CDS)測量。每一點皆代表每個個體三格之平均值，試驗係數變化值一般小於10%；第13圖A)顯示Gi-耦合受器之反應，使用得自無症狀但有風險病患、AIS個體與控制組個體之PBMCs，以細胞介電譜(CDS)測量，於時間點0(T0 )，與18個月後(T18 )。B)提供無症狀但有風險病患之PBMCs(主要含有淋巴細胞)上褪黑激素受器之反應單一圖；第14圖顯示控制組個體與AIS個體(群組1、2與3)成骨細胞之GPRC訊息傳遞，使用不同配位體Gs、Gi與Gq，以 測定是否該訊息傳遞特異於該Gi-耦合受器；第15圖顯示已知之Gi-蛋白耦合受器之列表；以及第16圖顯示已知之Gi-蛋白耦合受器之配位體之列表。

Claims (59)

  1. 一種測定待測化合物是否可用於治療脊柱側彎之方法，該方法包含：(a)在該待測化合物存或不存在情況下，將表現有一與抑制性鳥嘌呤核苷酸-結合(Gi )蛋白耦合之受器之細胞，與該受器之配位體接觸；(b)測定該細胞中該配位體誘發之訊號幅度；其中，與該待測化合物不存在時相較，在該待測化合物物存在時產生之較高訊號，代表該待測化合物可用於治療脊柱側彎，其中該受器不為褪黑激素受器。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該脊柱側彎為原發性脊柱側彎。
  3. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該原發性脊柱側彎為青少年原發性脊柱側彎(AIS)。
  4. 如申請專利範圍第3項之方法，其中該細胞係得自於患有AIS之個體。
  5. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該訊號為細胞阻抗(impedance)之改變。
  6. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該阻抗之改變係以細胞介電譜(CDS)測量。
  7. 如申請專利範圍第1至6項任一項之方法，其中該細胞為成骨細胞、肌母細胞或周邊血液單核細胞(PBMC)。
  8. 如申請專利範圍第1至6項任一項之方法，其中該細胞為PBMC。
  9. 如申請專利範圍第8項之方法，其中該細胞為淋巴細胞。
  10. 如申請專利範圍第1至6項任一項之方法，其中該受器為血清素受器、α-腎上腺素受器、腺苷酸受器或大麻素(cannabinoid)受器。
  11. 如申請專利範圍第10項之方法，其中該血清素受器為5-HT1A。
  12. 如申請專利範圍第10項之方法，其中該α-腎上腺素受器為α2-AD。
  13. 如申請專利範圍第10項之方法，其中該腺苷酸受器為A3 。
  14. 如申請專利範圍第10項之方法，其中該大麻素受器為CB2。
  15. 如申請專利範圍第1至6項任一項之方法，其中該配位體為同效劑。
  16. 如申請專利範圍第11項之方法，其中該配位體為1-[3-(3,4-亞甲基二氧基苯氧基)丙基]-4-苯基-哌嗪順丁烯二酸鹽(BP554順丁烯二酸鹽)。
  17. 如申請專利範圍第12項之方法，其中該配位體為5-溴-N-(4,5-二氫-1H-咪唑-2-基)-6-喹噁啉胺(UK14304)。
  18. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該配位體為1-去氧-1-[6-[[(3-碘化苯基)甲基]胺基]-9H-嘌呤-9-基]-N-甲基-β-D-呋喃核醣脲醯胺(IB-MECA)。
  19. 如申請專利範圍第14項之方法，其中該配位體為N-環己基-7-氯-1-[2-(4-嗎啉基)乙基]喹啉-4(1H)-酮-3-羧醯胺(CB65)。
  20. 如申請專利範圍第1至6項任一項之方法，包含測定由至少二不同配位體誘發之訊號幅度。
  21. 如申請專利範圍第1至6項任一項之方法，包含測定至少二不同耦合至Gi 蛋白之受器之訊號幅度。
  22. 一種診斷個體是否有發展出脊柱側彎之傾向之方法，包含：(a)將得自該個體之表現有一與抑制性鳥嘌呤核苷酸-結合(Gi )蛋白耦合之受器之細胞，與該受器之配位體接觸；(b)測定該細胞中該配位體誘發之訊號幅度；(c)比較該訊號與對應之參考訊號；以及(d)以該比較結果為基礎決定該傾向，其中該受器不為褪黑激素受器。
  23. 如申請專利範圍第22項之方法，其中該脊柱側彎為原發性脊柱側彎。
  24. 如申請專利範圍第23項之方法，其中該原發性脊柱側彎為青少年原發性脊柱側彎(AIS)。
  25. 如申請專利範圍第23項之方法，其中該訊號為該細胞之阻抗(impedance)改變。
  26. 如申請專利範圍第25項之方法，其中該阻抗之改變係以細胞介電譜(CDS)測量。
  27. 如申請專利範圍第22至26項任一項之方法，其中該細胞為成骨細胞、肌母細胞或周邊血液單核細胞(PBMC)。
  28. 如申請專利範圍第22至26項任一項之方法，其中該細胞為PBMC。
  29. 如申請專利範圍第28項之方法，其中該細胞為淋巴細胞。
  30. 如申請專利範圍第22至26項任一項之方法，其中該受器為血清素受器、α-腎上腺素受器、腺苷酸受器或大麻素受器。
  31. 如申請專利範圍第30項之方法，其中該血清素受器為5-HT1A。
  32. 如申請專利範圍第30項之方法，其中該α-腎上腺素受器為α2-AD。
  33. 如申請專利範圍第30項之方法，其中該腺苷酸受器為A3 。
  34. 如申請專利範圍第30項之方法，其中該大麻素受器為CB2。
  35. 如申請專利範圍第22至26項任一項之方法，其中該配位體為同效劑。
  36. 如申請專利範圍第31項之方法，其中該配位體為1-[3-(3,4-亞甲基二氧基苯氧基)丙基]-4-苯基-哌嗪順丁烯二酸鹽(BP554順丁烯二酸鹽)。
  37. 如申請專利範圍第32項之方法，其中該配位體為5-溴-N-(4,5-二氫-1H-咪唑-2-基)-6-喹噁啉胺(UK14304)。
  38. 如申請專利範圍第33項之方法，其中該配位體為1-去氧-1-[6-[[(3-碘化苯基)甲基]胺基]-9H-嘌呤-9-基]-N-甲基-β-D-呋喃核醣脲醯胺(IB-MECA)。
  39. 如申請專利範圍第34項之方法，其中該配位體為N-環己基-7-氯-1-[2-(4-嗎啉基)乙基]喹啉-4(1H)-酮-3-羧醯胺(CB65)。
  40. 如申請專利範圍第22至26項任一項之方法，包含測定由 至少二不同配位體誘發之訊號幅度。
  41. 如申請專利範圍第22至26項任一項之方法，包含測定至少二耦合至Gi 蛋白之不同受器之訊號幅度。
  42. 如申請專利範圍第24至26項任一項之方法，其中該個體為可能發展為青少年原發性脊柱側彎之候選人。
  43. 一種將患有原發性脊柱側彎之人類個體分類之方法，包括：(a)將得自該個體之表現有一與抑制性鳥嘌呤核苷酸-結合(Gi )蛋白耦合之受器之細胞，與該受器之配位體接觸；以及(b)測定該細胞中該配位體誘發之訊號幅度，藉此該測定步驟之結果可將患有原發性脊柱側彎之個體分類至某一亞群中，其中該受器不為褪黑激素受器。
  44. 如申請專利範圍第43項之方法，其中該原發性脊柱側彎為青少年原發性脊柱側彎(AIS)。
  45. 如申請專利範圍第44項之方法，其中該訊號為該細胞之阻抗(impedance)改變。
  46. 如申請專利範圍第45項之方法，其中該阻抗之改變係以細胞介電譜(CDS)測量。
  47. 如申請專利範圍第43項之方法，其中該細胞為成骨細胞、肌母細胞或周邊血液單核細胞(PBMC)。
  48. 如申請專利範圍第43至47項任一項之方法，其中該受器為血清素受器、α-腎上腺素受器、腺苷酸受器或大麻素受器。
  49. 如申請專利範圍第48項之方法，其中該血清素受器為5-HT1A。
  50. 如申請專利範圍第48項之方法，其中該α-腎上腺素受器為α2-AD。
  51. 如申請專利範圍第48項之方法，其中該腺苷酸受器為A3 。
  52. 如申請專利範圍第48項之方法，其中該大麻素受器為CB2。
  53. 如申請專利範圍第43至47項任一項之方法，其中該配位體為一同效劑。
  54. 如申請專利範圍第49項之方法，其中該配位體為1-[3-(3,4-亞甲基二氧基苯氧基)丙基]-4-苯基-哌嗪順丁烯二酸鹽(BP554順丁烯二酸鹽)。
  55. 如申請專利範圍第50項之方法，其中該配位體為5-溴-N-(4,5-二氫-1H-咪唑-2-基)-6-喹噁啉胺(UK14304)。
  56. 如申請專利範圍第51項之方法，其中該配位體為1-去氧-1-[6-[[(3-碘化苯基)甲基]胺基]-9H-嘌呤-9-基]-N-甲基-β-D-呋喃核醣脲醯胺(IB-MECA)。
  57. 如申請專利範圍第52項之方法，其中該配位體為N-環己基-7-氯-1-[2-(4-嗎啉基)乙基]喹啉-4(1H)-酮-3-羧醯胺(CB65)。
  58. 如申請專利範圍第43至47項任一項之方法，包含測定由至少二不同配位體誘發之訊號幅度。
  59. 如申請專利範圍第43至47項任一項之方法，包含測定至少二耦合至Gi 蛋白之不同受器之訊號幅度。
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