ES2929641T3 - Método para determinar la capacidad de degradación de histamina total en muestras biológicas - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método novedoso para determinar la capacidad total de degradación de histamina en muestras biológicas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método para determinar la capacidad de degradación de histamina total en muestras biológicas

La histamina, una amina biogénica básica, es una sustancia química simple con un peso molecular de 111 Da. Su designación IUPAC es 1H-imidazol-4-etilamina.

La histamina es un mediador importante en diversas enfermedades alérgicas, urticaria y alergias o intolerancias a fármacos.

La concentración de histamina libre está muy estrictamente regulada tanto intracelular como extracelularmente por varios mecanismos, y su actividad o eficacia fisiológica está controlada por cuatro receptores diferentes en el organismo humano.

Se conoce un método inmunológico para cuantificar la histamina en muestras biológicas líquidas o extractos celulares, por ejemplo, de Morel et al., 1988.

En los organismos de mamíferos, la histamina se degrada principalmente por dos enzimas: Diamino oxidasa (DAO, EC 1.4.3.6) e histamina N-metiltransferasa (NMT, EC 2.1.1.8).

La DAO cataliza la desaminación oxidativa de la histamina a acetaldehído de imidazol; NMT cataliza la N-metilación a N-metilhistamina. Los dos sistemas se complementan entre sí, ya que la DAO regula principalmente la histamina acumulada extracelularmente, mientras que la NMT es la principal responsable de la regulación intracelular en el citosol. Sorprendentemente, apenas hay datos científicamente utilizables hasta el momento sobre la regulación de estas dos enzimas o sobre los mecanismos para controlar la producción de histamina y la liberación de histamina a partir de los mastocitos o la degradación de histamina.

Ambas enzimas también pueden metabolizar la mayoría de las otras aminas biogénicas naturales tales como putrescina, cadaverina, espermina, espermidina, tiramina y feniletilamina, pero en diversos grados.

Las concentraciones absolutas de las diversas aminas biogénicas en una muestra respectiva determinan finalmente la capacidad de las enzimas en esa muestra para degradar la histamina agregada externamente, así como la histamina contenida en la muestra.

La experiencia clínica hasta la fecha sugiere que un desequilibrio entre la liberación de histamina o la ingesta de histamina inducida por alimentos por un lado y la capacidad de degradación de histamina del sistema afectado por el otro es responsable del complejo de síntomas conocido como intolerancia a la histamina (HIT).

La intolerancia a la histamina significa que el cuerpo tiene reacciones de intolerancia a un nivel elevado de histamina. La histamina se produce de forma natural en el organismo, pero también la aportan los alimentos madurados tales como el queso añejo, los embutidos o las bebidas alcohólicas. De acuerdo con los conocimientos actuales, la intolerancia es provocada por una deficiencia o falta de actividad de DAO y/o HNMT, lo que lleva a un desequilibrio entre el suministro y la degradación de histamina.

Esto es esencial porque la capacidad para la degradación de histamina parece estar correlacionada con los síntomas de la enfermedad de intolerancia a la histamina. Sorprendentemente, la concentración inicial o concentración basal de histamina en muestras biológicas se somete a grandes fluctuaciones; más aún, la concentración basal, especialmente en muestras de sangre, está fuertemente influenciada por el procedimiento de muestreo de sangre y la centrifugación posterior y es prácticamente incontrolable. Además, dependiendo de la muestra, la histamina se libera de las células de almacenamiento en cantidades variables; por lo tanto, no se puede determinar claramente una concentración basal fisiológicamente efectiva antes de tomar la muestra de sangre. Este proceso de degradación, poco del cual se ha investigado científicamente, es un desafío adicional al intentar determinar la capacidad de degradación de histamina específica de la muestra. Este efecto se superpone con una capacidad de degradación intrínseca de la histamina específica de la muestra, que se produce a tasas variables y que tampoco se ha explorado en su mayor parte hasta la fecha.

La experiencia clínica ha mostrado que, entre otras cosas, la capacidad de degradación de histamina también depende en gran medida de los hábitos dietéticos de aquellos afectados.

Los posibles síntomas de una dieta rica en histamina incluyen irritaciones de la piel, cefaleas, problemas respiratorios, problemas del tracto digestivo y presión arterial alta. Sin embargo, estos síntomas también se pueden atribuir a otros patrones de enfermedad. Por lo tanto, hasta ahora no ha habido una forma de excluir o especificar la intolerancia a la histamina como la causa de estos problemas en base a procedimientos de prueba adecuados.

La dependencia descrita anteriormente de la capacidad de degradación de histamina sobre el estado nutricional individual de un sujeto de prueba se puede deber al hecho de que, contrariamente a la opinión generalizada, la histamina no es, con mucho, la amina biogénica más común en los productos alimenticios (véase Fig. 1).

Desafortunadamente, sin embargo, es de facto imposible en la práctica determinar la influencia actual del estado nutricional de los sujetos y, por lo tanto, tener en cuenta la influencia potencial de otras aminas biogénicas sobre la degradación de histamina.

Se han realizado intentos en la técnica anterior para realizar intervenciones diagnósticas sobre el complejo sintomático de la intolerancia a la histamina mediante la determinación de la actividad DAO a partir de suero o plasma (por ejemplo, utilizando la prueba DAO-REA (Sciotec)), basándose esencialmente en el contenido de las patentes WO2007056788; EP 1948819 o en su documento de prioridad común, AT 411688. Otro método basado en ELISA para determinar la actividad DAO en sangre se conoce de Pfisterer et al., 2007. De Raithel et al., 1999, se conoce un método para determinar la capacidad de degradación de histamina total al identificar la diferencia entre las muestras medidas en el tiempo t0min y en el tiempo t60min después de la incubación a 37 °C, ambas procedentes de una muestra de origen común, mediante radio inmunoensayo. Esto no implica ninguna adición de solución de histamina externa a ninguna de las dos muestras (t0 y t60), por lo que no hay independencia de la matriz de la muestra. Sin embargo, la experiencia clínica de los últimos años ha demostrado que estos datos de medición sólo pueden conciliarse con síntomas clínicos en un grado menor de importancia, lo que es desventajoso para cualquier uso diagnóstico de los sistemas. Por lo tanto, la prueba DAO-REA y la prueba de acuerdo con Raithel et al., 1999, solo reaccionan si el paciente tiene síntomas; en consecuencia, el paciente no debe tener una dieta libre de histamina.

En la práctica, también se ha intentado utilizar y establecer la cantidad de DAO en sangre como un factor de diagnóstico, pero con un éxito moderado, especialmente porque los síntomas no dependen de la cantidad de la enzima.

A la luz de estas desventajas del estado de la técnica, los inventores de la presente invención se han propuesto desarrollar un procedimiento que supere al menos parcialmente las desventajas mencionadas en la técnica anterior. En particular, se han propuesto la tarea de proporcionar un método que determine, por primera vez, la capacidad total de la degradación de aminas en una matriz biológica (muestra) independientemente del tipo de ruta de degradación o de los mediadores de degradación presentes, en particular de las enzimas degradadoras de histamina, y también independientemente del estado nutricional específico de cada paciente.

Para este propósito, la invención proporciona un método de acuerdo con la reivindicación 1. Las realizaciones preferidas se establecen en las reivindicaciones subordinadas.

El método de la invención para determinar la capacidad de degradación de amina se explicará utilizando el ejemplo de la capacidad de degradación de histamina total en una muestra biológica líquida y comprende las siguientes etapas:

- dividir igualmente una cantidad proporcionada de muestra biológica líquida en una primera muestra parcial y una segunda muestra parcial;

- agregar y mezclar la primera muestra parcial con una cantidad específica de solución de provocación de histamina que contiene histamina;

- incubar la primera muestra parcial dosificada con solución de provocación de histamina durante un período de tiempo específico y en primeras condiciones de incubación específicas bajo las cuales no se puede degradar la histamina mediante cualquier mediadores presentes en la muestra, mientras al mismo tiempo se incuba la segunda muestra parcial para el mismo período de tiempo específico como la primera muestra parcial y en segundas condiciones de incubación específicas bajo las cuales no se degrada la histamina o solo se degrada en forma insignificante en términos de cantidad mediante cualesquier mediadores presentes en la muestra;

- agregar y mezclar la segunda muestra parcial después de dicha incubación con la misma cantidad específica de solución de provocación de histamina como se empleó anteriormente para la primera muestra parcial;

- extraer una fracción cuantitativamente igual de las cargas de la primera y segunda muestras parciales que contienen solución de provocación, y modificar la histamina aún presentes en ambas cargas;

- determinar las concentraciones absolutas de la histamina modificada (valor de histamina) en las dos muestras parciales;

- determinar la (porcentaje) capacidad de degradación de histamina total.

El método descrito en el presente documento sortea ventajosamente todos los problemas precedentes de la técnica anterior al dividir cada muestra de medición en una primera y una segunda muestra parcial antes de la medición. Ahora se agrega (inmediatamente) una cantidad definida de solución de provocación de histamina a una parte de la muestra total (primera muestra parcial). Ambas muestras parciales se someten entonces a una etapa de incubación simultánea, es decir, incubación durante el mismo período de tiempo, pero bajo diferentes condiciones de incubación, en particular diferentes perfiles de temperatura. Posteriormente, se agrega la misma cantidad definida de solución de provocación de histamina a la otra parte de la muestra total (segunda muestra parcial) y se determina inmediatamente después la cantidad de histamina en ambas muestras parciales.

La diferencia en los valores medidos refleja la capacidad de degradación de histamina total de la muestra bajo estas condiciones. En otras palabras, la segunda muestra parcial que contiene solución de provocación con histamina sirve como el valor inicial/basal interno de la muestra (parte intrínseca de histamina de la muestra y cantidad de histamina de la solución de provocación definida que contiene histamina) de la muestra total, es decir, estándar interno de nuestra. Por lo tanto, todos los componentes específicos de la muestra se incluyen ventajosamente en la medición, de manera que la determinación de la capacidad de degradación de histamina total, a diferencia de la técnica anterior, se puede llevar a cabo con mucha precisión y menos susceptible a las variables perturbadoras.

Además, el método de acuerdo con la invención no requiere ningún suministro de histamina externo, por ejemplo, a través de alimentos o provocación de histamina en el paciente. El paciente puede incluso tener una dieta libre de histamina y no tiene que presentar ningún síntoma agudo, lo que por sí solo es ventajoso para el estado de salud del paciente, en particular para su bienestar general. En el método de acuerdo con la invención, existe una provocación in vitro de la muestra biológica líquida investigada, por ejemplo, una muestra de suero.

El método de acuerdo con la invención proporciona así una indicación fiable de una posible intolerancia a la histamina en el paciente, proporcionando ventajosamente conclusiones clínicas más precisas que las que son actualmente posibles con los métodos de la técnica anterior.

Ventajosamente, los valores de concentración de histamina absolutos y relativos se pueden determinar con precisión utilizando el método de acuerdo con la invención. Además, se puede calcular el porcentaje de degradación de histamina, la capacidad de degradación de histamina total.

Sin estar ligado a ninguna teoría, se supone que los mediadores de degradación de histamina son y/o comprenden, en particular, diamino oxidasa (DAO) y/o histamina N-metiltransferasa (NMT).

En el contexto de la presente invención, la frase “condiciones de incubación bajo las que la histamina no se degrada o solo se degrada insignificantemente en términos de cantidad mediante cualesquier mediadores presentes en la muestra” describe condiciones de incubación que previenen completamente la degradación de histamina o actividad de conversión de mediadores presentes en la muestra, por ejemplo, de enzimas, tales como DAO y NMT, o que la reducen de manera tan significativa que no se puede detectar mediante métodos convencionales o se encuentra en dicho nivel insignificante que cualquier histamina presente no se convierte de manera eficiente durante el período especificado, por ejemplo, una actividad de aproximadamente < 3 U/ml.

En otra realización del método de acuerdo con la invención, el período de tiempo específico para incubación de la primera y segunda muestras parciales es 1 a 50 horas o 5 a 50 horas, preferiblemente 12 a 36 horas y particular y preferiblemente 20 a 28 horas.

Además, las primeras condiciones de incubación específicas comprenden una temperatura de 27 °C a 42 °C, preferiblemente de 30 °C a 40 °C y particular y preferiblemente de 34 °C a 38 °C, mientras que las segundas condiciones de incubación específicas de la segunda muestra parcial comprenden una temperatura de 2 °C a 27 °C, preferiblemente de 3 °C a 10 °C, y particular y preferiblemente de 4 °C a 8 °C.

A dichas temperaturas aplicadas como durante la incubación de la primera muestra parcial, es posible que cualesquier mediadores presentes en la muestra degraden o conviertan eficazmente la histamina; en particular, se promueve u optimiza la actividad de degradación o conversión de histamina por mediadores presentes en la muestra, por ejemplo, de enzimas tales como DAO y NMT.

En comparación, la degradación o conversión de histamina se previene o reduce significativamente a dichas temperaturas aplicadas como durante la incubación de la segunda muestra parcial, en particular a través de una influencia inhibidora sobre la degradación de histamina o actividad de conversión de mediadores, por ejemplo, de enzimas tales como DAO y NMT.

Alternativamente, también está dentro del alcance de la presente invención que las segundas condiciones de incubación sean idénticas a las primeras condiciones de incubación descritas anteriormente.

En una realización preferida, la capacidad de degradación de histamina total se calcula en base de la siguiente fórmula:

[(R - H)/(R/100)], donde R = la concentración de la histamina modificada (valor de histamina) de la segunda muestra parcial (valor de referencia) y H = la concentración de la histamina modificada (valor de histamina) de la primera muestra parcial.

De acuerdo con la invención, las muestras biológicas incluyen, pero no se limitan a, sangre completa, suero, plasma, líquido cefalorraquídeo, saliva, líquido lagrimal, orina y/o un homogeneizado de, por ejemplo, un tejido de biopsia (muestra de tejido) o de una muestra de heces.

Preferiblemente, la muestra biológica se selecciona de sangre total, suero o plasma.

Además, las matrices biológicas distintas de las mencionadas anteriormente también pueden ser consideradas como muestras biológicas. En particular, la muestra bajo investigación no tiene que ser líquida por sí misma, sino que se puede hacer líquida (licuada) o absorberse en líquido por medios y métodos adecuados.

La muestra biológica se puede derivar de varias especies, en particular de especies de la clase de los mamíferos, que incluyen, por ejemplo, humanos, orangutanes, chimpancés, ratones, ratas, perros, conejos, cabras, ovejas, vacas y similares.

En una realización preferida, la muestra biológica es de un humano.

En otra realización, la solución de provocación de histamina contiene histamina en un tampón de estabilización a una concentración de entre 1 y 300 ng/ml o entre 1 y 100 ng/ml, preferiblemente entre 3 y 60 ng/ml o entre 6 y 30 ng/ml, y particular y preferiblemente entre 17 y 23 ng/ml. Los tampones de estabilización de histamina son conocidos por el experto y se incluyen en el presente documento en su totalidad

Cuando se determina la concentración de histamina utilizando el método de acuerdo con la invención, puede ser necesario alterar químicamente la histamina, es decir, modificarla de tal manera que pueda ser reconocida por un anticuerpo. La histamina per se es demasiado pequeña para funcionar como un antígeno y también está presente de forma ubicua en todos los mamíferos, de tal manera que, en principio, la inmunización con histamina no modificada fallaría.

La modificación de histamina necesaria para la cuantificación inmunológica se lleva a cabo, por ejemplo, como acilación. Sin embargo, el experto en la técnica también conoce varias otras opciones de modificación, y el método de acuerdo con la invención no se debe limitar a un único y específico tipo de modificación.

En una realización preferida, el paso del proceso de modificación de la histamina presente comprende la acilación.

De acuerdo con el método de la invención, la concentración de histamina modificada se puede determinar utilizando un inmunoensayo, particularmente un ensayo inmunoabsorbente basado en enzimas (ELISA) y/o radio inmunoensayo (RIA); cromatografía, en particular con cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC); cromatografía de gases (GS); electroforesis o electroforesis capilar (CE).

En una realización preferida, la concentración de la histamina modificada se determina utilizando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas competitivo.

En otra realización preferida, la concentración de la histamina modificada se determina utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y/o cromatografía de gases (GS).

En una realización alternativa del método de acuerdo con la invención, la concentración de histamina también se puede determinar directamente, es decir, sin modificación previa de la histamina, por ejemplo, por medio de cromatografía, especialmente con cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC); cromatografía de gases (GS); electroforesis o electroforesis capilar (CE).

La concentración de histamina modificada y/o no modificada basada en cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y cromatografía de gases (GS) puede ser, por ejemplo, de tal manera que primero se lleve a cabo una cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), lo que incluye obtener al menos una fracción de una muestra de entrada (fraccionamiento) y posteriormente la al menos una fracción se analiza posteriormente por medio de cromatografía de gases (GS), es decir, metódicamente, se presenta acoplamiento de HPLC-GS.

El presente método es particularmente interesante y ventajoso para dar a los pacientes que tienen síntomas asociados con la histamina relacionados con la dieta, tales como problemas digestivos y/o irritaciones de la piel, claridad a cerca de las causas de esos problemas y, si es necesario, iniciar las medidas terapéuticas apropiadas para su alivio o eliminación, o para verificar la eficacia de las medidas terapéuticas que se hayan iniciado.

Teniendo en cuenta los datos disponibles hasta el momento, la HIT se ha diagnosticado al determinar la actividad de la diaminooxidasa (DAO) y al determinar la cantidad de DAO en combinación con una anamnesis detallada, pero muchos de aquellos afectados solo pudieron ser diagnosticados de manera inadecuada, porque los síntomas subjetivos no se correlacionan suficientemente con los datos de medición de los métodos de la técnica anterior.

El método de acuerdo con la invención, que implica una estandarización interna, incluye todos los componentes específicos de la muestra en la medición y, por lo tanto, permite por primera vez un diagnóstico dirigido y clínicamente relevante (véase Fig. 6).

Por lo tanto, se pudo determinar que los pacientes que alcanzan una capacidad de degradación de histamina total > 40 % no presentan ningún síntoma detectable de HIT. También se pudo demostrar que los pacientes que presentan una capacidad de degradación de histamina total < 25 % padecen de síntomas de HIT claramente detectables.

Por lo tanto, la presente invención ofrece ventajas significativas como método de diagnóstico sobre los métodos actuales de la técnica anterior, que no pueden diagnosticar clínicamente correctamente ciertos grupos de pacientes que padecen una degradación deficiente de la histamina. También, la proporción de pacientes clasificados falsamente como negativos o positivos se reduce mediante el método de acuerdo con la invención.

En otra realización, la determinación de la capacidad de degradación de histamina total se utiliza como una base para el diagnóstico y/o para la monitorización de un tratamiento terapéutico de un conjunto de síntomas relacionados con la capacidad de degradación de histamina total deficiente.

Uno de dichos conjuntos típicos de síntomas, o complejo de síntomas, se conoce como intolerancia a la histamina (HIT), como se describió anteriormente, en el que el cuerpo reacciona a una mayor cantidad de histamina con una variedad de reacciones de intolerancia.

Al mismo tiempo, el presente método es la primera oportunidad ventajosa para categorizar y luego excluir los riesgos anestésicos provocados por una liberación excesiva de histamina junto con una capacidad de degradación de histamina total deficiente, o para valorar y evaluar un riesgo correspondiente.

De manera correspondiente, en otra realización, el método de la invención para determinar la capacidad de degradación de histamina total se utiliza como una base para la valoración de los riesgos en preparación para la anestesia para un conjunto de síntomas relacionados con la capacidad de degradación de histamina total deficiente.

También se ha mostrado que, en algunas muestras parciales, la diamino oxidasa que contienen puede ser inhibida, por ejemplo, por el peróxido de hidrógeno, que es uno de sus productos de reacción. Para prevenir o reducir esta inhibición, en otra realización, se agrega peroxidasa (EC 1.11.1), preferiblemente catalasa (EC 1.11.1.6), a la muestra total antes de su división en una primera y una segunda muestra parcial y/o después de la división a la primera y segunda muestra parcial.

En una realización preferida, la peroxidasa o catalasa se agrega en una cantidad de 0.1 a 10 unidades, preferiblemente de 0.2 a 5 unidades, más preferiblemente de 0.5 a 2 unidades, particularmente de 1 unidad, por 100 pl de muestra.

Otro aspecto de la presente solicitud se refiere a un kit, y otro aspecto se refiere al uso de ese kit para determinar la capacidad de degradación de histamina total en una muestra biológica líquida de acuerdo con el método de la invención.

El kit comprende al menos:

- uno o más recipientes de recepción de muestras;

- una solución de provocación de histamina que contiene histamina en un tampón de estabilización a una concentración de entre 1 y 300 ng/ml o entre 1 y 100 ng/ml, preferiblemente entre 3 y 60 ng/ml o entre 6 y 30 ng/ml, y particular y preferiblemente entre 17 y 23 ng/ml;

- uno o más recipientes de recepción de muestras, opcionalmente que incluyen una placa recubierta con histamina modificada, particularmente con histamina acilatada;

- un reactivo de modificación de histamina, particularmente un reactivo de acilación de histamina;

- medios para determinar histamina modificada, particularmente en base a ELISA;

- opcionalmente una peroxidasa o catalasa, particularmente en forma liofilizada;

- opcionalmente un tampón de modificación de histamina, particularmente un tampón de acilación de histamina; y

- opcionalmente un estándar de histamina modificada, particularmente histamina acilatada.

En este contexto, el reactivo de modificación de histamina comprende esencialmente los productos químicos, tampones y similares necesarios para modificar una histamina. El componente más importante y posiblemente único del reactivo de modificación de histamina es o son aquellos reactivos que son responsables de modificar la histamina (por ejemplo, un donante de grupo acilo).

Además, el kit puede comprender medios para determinar la histamina modificada. Estos medios comprenden preferiblemente anticuerpos dirigidos contra la histamina modificada, en particular anticuerpos policlonales, y opcionalmente anticuerpos secundarios, en los que al menos uno de estos anticuerpos está preferiblemente marcado enzimática o químicamente. Además, estos agentes también pueden comprender, por ejemplo, aptámeros y otros reactivos de bioafinidad correspondientes a la técnica anterior respectiva. Los anticuerpos proporcionados pueden ser de una gran variedad de fuentes (por ejemplo, de un cultivo celular, de un animal, tal como una oveja, un conejo o un ratón) y marcados (por ejemplo, con una enzima, con biotina, con estreptavidina, con un radionúclido) o sin etiquetar, dependiendo de su uso. Los métodos se pueden basar en la medición de la absorción o transmisión de luz o la intensidad de la luz penetrante, por ejemplo, mediante turbidimetría.

En particular, estos medios están basados en ELISA. Además, los medios especialmente basados en ELISA pueden comprender opcionalmente al menos uno de los siguientes componentes:

- un antisuero contra la histamina modificada, en particular la histamina acilada;

- un conjugado ligado a enzima;

- un sustrato para la enzima del conjugado ligado a enzima;

- un tampón de lavado;

- un tampón de detención para detener una reacción de conversión de colorante acoplada a enzima.

Para realizar una reacción de control positivo en la que se puede utilizar una cantidad definida de DAO y/o NMT, el kit también puede contener opcionalmente una preparación de DAO y/o NMT estabilizada. Esta preparación de DAO/NMT puede contener, por ejemplo, DAO/NMT liofilizada o estabilizada en frío.

Además, el kit también puede comprender opcionalmente un tampón de modificación de histamina, en particular un tampón de acilación de histamina que es particularmente adecuado para la modificación/acilación de histamina. El tampón de modificación de histamina también puede estar presente en el kit en forma concentrada.

Opcionalmente, el kit también puede contener histamina modificada, en particular histamina acilada, que se puede utilizar como estándar para determinar la capacidad de degradación de histamina total en una muestra biológica líquida, en particular mediante la determinación de la cantidad de histamina modificada.

En otras realizaciones, el método de la invención es adaptable y se puede emplear para determinar la capacidad de degradación de otras aminas biogénicas.

Referencias

Morel et al., 1988:

A M Morel; M A Delaage: “Immunoanalysis of histamine through a novel chemical derivatization”, J. ALLERGY& CLIN. IMMUNOL., vol. 82, no. 4, 1 October 1988, pp. 646-654.

Pfisterer et al., 2007:

M Pfisterer; A Missbichler: “New diagnostic and treatment opportunities of foodintolerance caused by histamine: first clinical results”, ALL, vol. 62, no. Suppl. 83, 1 June 2007, p. 333

Raithel et al., 1999:

M Raithel; M Küfner; P Ulrich; EG Hahn: “The involvement of the histamine degradation pathway by diamine oxidase in manifest gastrointestinal allergies”, Inflamm. Res. 48, Supplement 1, (1999) S75-S76.

La invención se explicará adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos, pero sin limitarse a ellos.

Breve descripción de las figuras.

La Fig. 1 muestra que la histamina no es, con mucho, la amina biogénica más común en los alimentos. La cantidad de diferentes aminas biogénicas se muestra en mg/porción de bebida o alimento, que incluye la histamina en bebidas y alimentos. Entre las aminas biogénicas mostradas, la amina cadaverina es con mucho la más abundante en los alimentos, seguida de las aminas putrescina y tiramina. Por el contrario, entre las aminas investigadas, existe una cantidad media de histamina en los alimentos. En las bebidas, sin embargo, la histamina tiene la cantidad significativamente más alta en comparación con las otras aminas examinadas, pero la cantidad total/porción es bastante baja en comparación con la cantidad de cadaverina y putrescina en los alimentos.

Fig. 2: una curva de concentración de la serie de diluciones del estándar de histamina acilada de ELISA de la presente invención (curva estándar) a absorbancia de 450 nm.

Figuras 3/4: se muestra una distribución de concentración típica de las dos muestras parciales (primera y segunda muestra parcial), donde los grupos de pacientes se formaron en función de su evaluación clínica existente. Los primeros tres pacientes no tenían síntomas (P1-3). El paciente 4 (P4) tenía síntomas y los pacientes 5-7 (P5-7) tenían intolerancia a la histamina (HIT). La Fig. 3 muestra la distribución de concentraciones de las muestras parciales antes y después de la provocación con histamina in vitro, determinada doble por paciente. La Fig. 4 muestra el porcentaje de capacidad de degradación de histamina total de las muestras calculado en base a las concentraciones de la Fig. 3. Derecha: pacientes diagnosticados con HIT; capacidad de degradación de histamina total baja/insuficiente (la degradación en un rango de 0-25 % indica capacidad de degradación de histamina insuficiente o patológicamente baja; patológica); centro: pacientes con síntomas, pero no se puede diagnosticar HIT (la degradación dentro de un rango de 25-40 % indica capacidad de degradación de histamina total limitada; límite); izquierda: sujetos sanos, sin síntomas (la degradación en un rango superior al 40 % indica suficiente capacidad de degradación de histamina total, negativo a HIT).

La Fig. 5 muestra una distribución típica de concentraciones en un colectivo de pacientes más grande; número de muestras total: n = 32, así como dos controles que no deben mostrar ninguna degradación significativa de histamina. Los pacientes se dividen en tres grupos, como se muestra en la Fig. 4, en base en la capacidad de degradación de histamina total medida en sus muestras de acuerdo con el método de la invención.

Fig. 6: El eje y muestra el porcentaje de especificidad del método de la invención para los síntomas clínicos en comparación con la prueba DAO-REA (Sciotec) o DAO- ELISA total (inmunodiagnóstico). Se probó un colectivo de pacientes de 119 pacientes que no tenían síntomas (barra a la derecha), síntomas que indicaban intolerancia a la histamina (barra central) o tenían HIT diagnosticada (barra a la izquierda).

El método de acuerdo con la presente invención se puede utilizar, en particular, como prueba de diagnóstico y ahora está disponible comercialmente, posiblemente con algunas modificaciones, como la Prueba de Capacidad de Degradación de Histamina Total de Frost Diagnostika (prueba FD THAK/THDC). El sistema de pruebas de acuerdo con la invención se basa en un Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzimas (ELISA) para la detección cuantitativa de la capacidad de degradación de histamina total en la muestra de suero. Esta prueba está diseñada principalmente para uso diagnóstico in vitro en hospitales o laboratorios médicos especializados. No obstante, son concebibles y deseables otras áreas de aplicación.

Este ensayo es el primero en determinar la capacidad de degradación de histamina en una muestra de suero, independientemente del tipo de degradación de histamina. También son concebibles otras muestras biológicas líquidas y sólidas tales como sangre completa o plasma sanguíneo, muestras de heces o tejidos de biopsia. Esto es importante porque esta capacidad de degradación representa el problema de la intolerancia a la histamina. Dado que las concentraciones de histamina basales en muestras de suero que exhiben fuertes fluctuaciones, el método de acuerdo con la invención proporciona por primera vez una indicación fiable y una correlación directa entre la capacidad de degradación de histamina total y el complejo de síntomas de intolerancia a la histamina en pacientes examinados.

Ventajosamente, la prueba no requiere ninguna ingesta de histamina ni provocación de histamina en el paciente, lo que siempre implica desventajas para el paciente. El paciente puede incluso llevar una dieta libre de histamina y no tiene que presentar síntomas agudos, ya que en el método de acuerdo con la invención se lleva a cabo una provocación de histamina in vitro de la muestra de suero al aplicar una solución de provocación de histamina; por lo tanto, la capacidad de degradación de histamina total también se determina independientemente del estado nutricional específico del paciente.

Ejemplo 1

Descripción detallada de la prueba de acuerdo con la invención

La prueba FD THAK/THDC ELISA de acuerdo con la presente invención se basa en una reacción de color enzimática y por lo tanto pertenece a los métodos de inmunoadsorción enzimática (EIA). La prueba contiene materiales para determinar la capacidad de degradación de histamina total de las muestras de suero.

El inmunoensayo enzimático basado en ELISA desarrollado (ensayo competitivo) para medir la capacidad de degradación de histamina total en muestras biológicas se caracteriza por su independencia de la matriz de la muestra. Dado que cada muestra se mide contra sí misma como valor de referencia, todas las influencias concebibles de la matriz de la muestra se neutralizan dentro del sistema. De este modo, se eliminan ventajosamente las fluctuaciones de medición internas de la muestra.

Además del ensayo ELISA competitivo descrito en el presente documento, también son posibles otros métodos ELISA, tales como el ELISA tipo intercalado clásico, de acuerdo con el método de la invención.

Las muestras de suero se dividen (muestras A y B) y se pipetean en una placa de incubación en determinación única (serie de muestra A). Posteriormente, se agrega una solución de provocación de histamina a las primeras muestras parciales (serie de muestra A). A continuación, la placa de incubación se incuba con la primera muestra parcial (serie de muestra A) durante 24 h a 37 °C.

Después de 24 h, la muestra de suero de la segunda muestra parcial en la serie de muestras B se pipetea en la placa de incubación paralelamente a la serie de muestras A. A continuación, se agrega la misma cantidad de solución de provocación de histamina que para la primera muestra parcial (serie de muestra A) a la segunda muestra parcial (serie de muestra B) (véase Tabla 1).

Después de la preparación de la muestra, se realiza una sola etapa de acilación desde la placa de incubación. A continuación, se realiza el ELISA de capacidad de degradación de histamina en base a esta acilación.

En el curso de la preparación de la muestra, la histamina se modifica/acila a N-acil histamina. El ELISA competitivo subsiguiente se basa en el formato de placa de microtitulación; las modificaciones también son posibles y conocidas por el experto en la técnica. El antígeno (histamina acilada) se une a una fase sólida (placas de microtitulación recubiertas con histamina acilada). Las concentraciones de analitos de los estándares, controles y muestras, y las concentraciones de analitos unidos a la fase sólida, compiten por los sitios de unión disponibles de los anticuerpos solubilizados que luego se agregan y emplean, de los cuales hay una cantidad insuficiente. En el equilibrio, los antígenos libres y los complejos antígeno-antisuero libres se eliminan mediante lavado. Cuanta menos histamina acilada esté presente en la muestra de entrada, más anticuerpos podrán unirse a las histaminas aciladas (antígenos) del recubrimiento de la placa. El complejo antígeno-anticuerpo unido a la histamina acilada sobre la fase sólida se determina con un anticuerpo marcado con enzima y se detecta mediante una reacción de color utilizando un sustrato. La conversión de color se determina al medir la absorbancia a 450 nm. Las concentraciones en las muestras se determinan ventajosamente con mucha precisión utilizando una curva estándar a partir de diluciones del estándar (véase Fig. 2).

Al medir con ELISA de capacidad de degradación de histamina, la concentración de la muestra antes de la provocación de histamina y con la provocación de histamina entonces se puede determinar de forma ventajosa y exacta. Ventajosamente, los valores absolutos y relativos de concentración de histamina se pueden determinar con precisión. Además, se puede calcular el porcentaje de degradación de histamina, la capacidad de degradación de histamina total (véanse las Fig. 3/4).

El método de la invención y/o el uso del kit de la invención que utiliza ese método, cuando se modifica apropiadamente, también son adecuados en principio para determinar la capacidad de degradación de otras aminas médicamente relevantes, por ejemplo, las otras aminas mencionadas al principio, que se convierten por DAO y/o NMT, tales como putrescina, cadaverina, espermina, espermidina, tiramina y feniletilamina.

Ejemplo 2

En un ejemplo de prueba, la preparación se llevó a cabo en tubos de polipropileno adecuados o placas DeepWell para detección cuantitativa de la capacidad de degradación de histamina total en la muestra de suero respectiva.

El procedimiento general se presentará primero como una descripción general y luego en detalle.

Breve resumen

Lo siguiente es una descripción general:

• Se proporcionaron 100 pl de la muestra total y se pipetearon en cada recipiente de reacción “H” con 500 pl de solución de provocación de histamina (muestra de medición de histamina, primera muestra parcial).

Se pipetearon 100 pl de la muestra total en cada recipiente de reacción “R” (referencia) (segunda muestra parcial). Se sellaron los recipientes de reacción “H” y se incubaron a 37 °C durante 24 h.

Se sellaron los recipientes de reacción “R” y almacenaron a 4 °C, o alternativamente a 6 °C, durante 24 h.

Se pipetearon 500 pl de solución de provocación de histamina en los recipientes de reacción “R”.

Se pipetearon 50 pl de las preparaciones en cada uno de los recipientes de reacción “H” y “R” en los recipientes de reacción “M” (modificación); luego se agregaron 25 pl de solución de modificación, seguido por 250 pl de tampón de reacción.

• La incubación tuvo lugar a temperatura ambiente (T.amb.) durante 30 min.

• Luego se determinaron las concentraciones de histamina modificada en todas las muestras parciales utilizando una curva estándar (véase Fig. 2).

• A partir de la diferencia en las concentraciones de histamina modificada [R - menos H], se calcula la capacidad de degradación en concentraciones absolutas o [(RH)/(R/100)] porcentaje de degradación

Debido al enfoque completamente novedoso de estandarización interna utilizando la propia muestra, el sistema de pruebas de acuerdo con la presente invención también establece nuevos estándares en el diagnóstico de apoyo de la denominada intolerancia a la histamina (HIT).

Descripción de los ensayos

Se examinaron muestras de suero sanguíneo de sujetos sanos (pacientes) y pacientes con sospecha de deficiencias en la capacidad de degradación de histamina total. Solo se utilizaron sueros frescos, pobres en plaquetas, no inactivados.

Recolección de suero

• Se obtuvo el suero al dejar la sangre (sin aditivo) en un tubo a temperatura ambiente hasta coagulación completa. El tiempo hasta que se produjo la coagulación fue de 30 min a 2 horas.

• Luego, se centrifugó el material a 1000 - 3000 x g durante 5 a 10 minutos y se retiró con una pipeta el sobrenadante de suero.

Vida útil del suero y tratamiento

• Siempre se prepararon recientemente las diluciones de suero.

• Se almacenaron los sueros en un lugar fresco (2-8 °C).

• Se utilizaron recipientes de muestra sellados.

• Almacenamiento:

- máx. 1 a 3 días a temperatura ambiente, 5 días a 2-8 °C

- varios meses a -20 °C

- varios años a -80 °C

• Se evitaron descongelaciones múltiples.

Implementación de la prueba

Preparación de muestras

La muestra de suero a ser medida (muestra total) se agitó y dividió en cantidades iguales de cada alícuota

-> muestras A y B (primera y segunda muestras parciales de la muestra total)

Placa de incubación

Las alícuotas de las muestras de suero frescas a ser analizada (muestras totales) se dividieron cada una por igual en una primera y una segunda muestra parcial y se pipetearon en una placa de incubación en una sola determinación (primera muestra parcial: serie de muestra A).

• Se pipetearon 100 pl de muestra A (primera muestra parcial) por sujeto de prueba en la placa de incubación de acuerdo con la asignación de pozos mostrada en la Tabla 1.

Luego se agregaron 500 pl de solución de provocación a la muestra A.

Se tapó la placa de incubación con una lámina de plata y se incubó en un agitador a 37 °C y 600 rpm durante 24 h.

Se almacenó la muestra B (segunda muestra parcial) a 4-8 °C durante 24 h.

Después de incubación, se retiró la lámina y se dejó enfriar la placa durante 10 min.

Después de 24 h, se pipetearon 100 pl de la muestra B en la placa de incubación en cada caso de acuerdo con la asignación de pozos mostrada en la Tabla 1.

Luego se agregaron 500 pl de solución de provocación a las respectivas muestras B.

Se colocó la placa de incubación sobre el agitador para mezclar a 600 rpm durante 1 min.

Placa de acilación (véase la asignación de pozos que mostrada en la Tabla 2)

Acilación

1. Se pipetearon 50 pl de los estándares, controles y muestras cada uno en los pozos correspondientes de la placa de acilación. Las diluciones del estándar (estándares A a F) para generar una curva estándar (véase Fig. 2) estaban listas para uso en recipientes de reacción separados.

2. Se pipetearon 25 pl de reactivo de acilación en todos los pozos.

3. Se pipetearon 250 pl de tampón de acilación en todos los pozos.

La placa no estaba tapada ni sellada.

4. La incubación tuvo lugar sobre un agitador (aproximadamente 600 rpm) a temperatura ambiente (T.amb.) (20­ 25 °C) durante 30 min.

5. Se necesitaron para el ELISA 25 pl de cada uno de los estándares, controles y muestras preparados.

Ejemplo de asignación de pozos

Tabla 1: Ejemplo de la placa de incubación con las primeras muestras parciales (fila A) y las segundas muestras parciales (fila B) de las diversas muestras totales de los sujetos de prueba, cada una dividida en dos muestras parciales, Todo en ocupación individual.

Tabla 2: Ejemplo de asignación de pozos en la placa de acilación con las primeras muestras parciales (fila A) y las segundas muestras parciales (fila B) de las diversas muestras totales de los sujetos de prueba (pacientes P 1-16), cada una dividida en dos muestras parciales, todas las muestras de prueba en ocupación individual. Todas las diluciones del estándar de histamina acilada (A-F) y los controles (K1, K2) se llenaron en ocupación doble.

Tabla 3: Ejemplo de asignación de pozos en la placa ELISA con las primeras muestras parciales (fila A) y las segundas muestras parciales (fila B) de las diversas muestras totales de los sujetos de prueba (pacientes P1-16), cada una dividida en dos muestras parciales, así como las diluciones del estándar de histamina acilada (A-F) y los controles (K1, K2), todos en ocupación doble.

Placa de ELISA

ELISA

1. Se pipetearon 25 pl de los estándares, controles y muestras acilados en los pozos apropiados de la placa de microtitulación ELISA (véase la asignación de pozos de acuerdo con la Tabla 3). La placa de ELISA está precubierta con histamina, especialmente en el fondo de los pozos (ELISA competitivo).

2. A continuación, se agregaron 100 pl de antisuero de histamina a todos los pozos.

3. Se incubó la placa en un agitador (aproximadamente 600 rpm) a T.amb. (20- 25 °C) durante 30 min. La placa se selló con una lámina.

4. Se retiró la lámina y se vació o aspiró el contenido de los pozos. Los pozos se lavaron minuciosamente 3 veces con 300 pl de tampón de lavado (1x), luego se vaciaron y el líquido residual se eliminó cada al golpear suavemente sobre una almohadilla absorbente.

5. Se pipetearon 100 pl de conjugado en todos los pozos.

6. A continuación, se incubaron las muestras en un agitador (aproximadamente 600 rpm) a T.amb. (20-25 °C) durante 15 min o, alternativamente, 20 min.

7. A continuación, se vació o aspiró el contenido de los pozos. Los pozos se lavaron minuciosamente 3 veces con 300 pl de tampón de lavado, se vaciaron y el líquido residual se eliminó cada vez al golpear suavemente sobre una almohadilla absorbente.

8. Se pipetearon 100 pl de SUSTRATO en todos los pozos y se incubaron en un agitador (aproximadamente 600 rpm) a T.amb. (20-25 °C) durante 15 min. Se evitó la luz solar directa.

9. Se pipetearon 100 pl de solución de detención en todos los pozos.

10. La absorbancia se midió con un lector de microplacas a 450 nm (contra una longitud de onda de referencia de 620­ 650 nm) en 10 minutos.

Evaluación de prueba

La adición de la solución de provocación da como resultado una dilución 1:1.2. Por lo tanto, las concentraciones leídas de la curva estándar (véase Fig.2) deben ser, y fueron, multiplicadas por un factor de 1.2 para obtener la concentración real de histamina.

En la evaluación, se calcula el porcentaje de capacidad de degradación de histamina de la muestra de suero completa. Para este fin, se ponen en relación las concentraciones medidas tanto de la muestra incubada con solución de provocación de histamina (muestra A, primera muestra parcial) como de la muestra recién pipeteada (muestra B, segunda muestra parcial).

Porcentaje de degradación de histamina o capacidad de degradación de histamina total = [(R - H)/(R /100)], donde R = concentración de histamina acilada (modificada) (valor de histamina) de la segunda muestra parcial (muestra B; referencia valor); H= concentración de histamina acilada (modificada) (valor de histamina) de la primera muestra parcial (muestra A).

Ejemplo de cálculo

Paciente 1:

Muestra A (primera muestra parcial) con solución de provocación de histamina, incubada durante 24 h: 9.913 [ng/ml].

Muestra B (segunda muestra parcial) con solución de provocación de histamina pipeteada a las 24 h de incubación, seguida directamente de la dosificación: 20.819 [ng/ml].

Paciente 2:

Muestra A (primera muestra parcial) con solución de provocación de histamina, incubada durante 24 h: 11.579 [ng/ml]. Muestra B (segunda muestra parcial) con solución de provocación de histamina pipeteada a las 24 h de incubación, seguida directamente de dosificación: 19.772 [ng/ml].

Muestra total del paciente No. 1: (20.819 - 9.913)/(20.819/100) = 52.38 %

Muestra total de sujeto No. 2: (19.772 - 11.579)/(19.772/100) = 41.44 %

Esto significa que el sujeto No. 1 tiene una capacidad de degradación de histamina total del 52.3 %, mientras que el sujeto No. 2 tiene una capacidad de degradación de histamina total del 41.44 %.

Interpretación de los resultados, relación con el cuadro clínico

Los resultados se pueden interpretar como sigue:

0 % - 25 %: la capacidad de degradación de histamina total es baja o nula: La muestra del paciente muestra una capacidad de degradación de histamina total muy baja. Se puede suponer que el paciente es intolerante a la histamina.

25 % - 40 %: capacidad de degradación de histamina total restringida: Se puede suponer que la capacidad de degradación de histamina total en la muestra o paciente está restringida.

> 40 %: suficiente capacidad de degradación de histamina total: se puede suponer que la capacidad de degradación de histamina total no está restringida en la muestra o el paciente; es decir, el paciente es clínicamente normal en términos de capacidad de degradación de histamina.

Por lo tanto, con un porcentaje de capacidad de degradación de histamina total del 52.38 %, el paciente 1 tiene una capacidad de degradación de histamina total fisiológicamente suficiente. Este es un sujeto clínicamente normal. El paciente 2 está justo por encima del umbral de una capacidad de degradación de histamina total fisiológicamente suficiente con un porcentaje de capacidad de degradación de histamina total del 41.44 %. Este es un sujeto clínicamente normal en el rango de umbral normal inferior. Es aconsejable monitorizar más la capacidad de degradación de histamina total en este paciente.

Características de rendimiento de la prueba

Precisión y reproducibilidad

Varianza intraensayo (exactitud)

La varianza intraensayo se ejemplificó mediante varias mediciones (n=39) de dos muestras diferentes y se encontró que era suficiente. La muestra 1 tenía un valor medio de 0.6 ng/ml y una desviación estándar de ± 0.1 ng/ml (12 % de coeficiente de variación (CV)). La muestra 2 tenía un valor medio de 4.6 ng/ml y una desviación estándar de ± 0.3 ng/ml (6.3 % de coeficiente de variación (CV)).

Varianza interensayo (exactitud)

La varianza interensayo se ejemplificó con múltiples mediciones (n=13) de dos muestras diferentes en días diferentes por diferentes individuos y se encontró que era suficiente. La muestra 1 tenía un valor medio de 2.03 ng/ml y una desviación estándar de ± 0.16 ng/ml (8 % de coeficiente de variación (CV)). La muestra 2 tenía un valor medio de 6.74 ng/ml y una desviación estándar de ± 0.37 ng/ml (5.6 % de coeficiente de variación (CV)).

La especificidad (reacción cruzada) de la prueba mostró un porcentaje de reacción cruzada para la histamina de las siguientes sustancias de prueba:

3-metil histamina: 0.1 %

Tiramina: 0.01 %

L-fenilalanina: < 0.001 %

L-histidina: < 0.001 %

L-tirosina: < 0.001 %

triptamina: < 0.001 %

Ácido 5-hidroxi indolacético: < 0.001 %

Serotonina: < 0.001 %

La sensibilidad analítica media (límite de detección) para la histamina acilada (N-azil histamina) es 0.2 ng/ml 2 desviaciones estándar.

Para la reidentificación de histamina acilada, se aplica un rango de 0.74 a 8.48 ng/ml, que corresponde a un rango porcentual de 85-106 % con un valor medio de 100 %.

Por linealidad, se aplica una dilución en serie hasta 1:16 de histamina acilada, que corresponde a un rango porcentual de 92-120 % con un valor medio de 103 %.

El rango de medición para la histamina acilada es 0.1- aproximadamente 40 ng/ml. Una cuantificación más precisa por debajo y por encima de este rango puede ser difícil.

La Fig. 3 muestra una distribución de concentración típica de las dos muestras parciales (primera y segunda muestras parciales; Fig. 3) y de la capacidad de degradación de histamina total (Fig. 4), respectivamente, grupos de pacientes que se han formado de acuerdo con la evaluación clínica disponible (véase clasificación anterior, “Relación con el cuadro clínico”).

La Fig. 3 incluye algunas fluctuaciones de medición menores en las concentraciones de histamina modificada en las dos muestras parciales (muestras parciales primera y segunda) en cada muestra cuando se determinó por duplicado/medida por duplicado. Sin embargo, las fluctuaciones son insignificantes porque no cambian los hallazgos.

En la representación de la fig. 4 del porcentaje total de la capacidad de degradación de histamina calculado a partir de la Fig. 3, estas fluctuaciones entre las muestras doblemente determinadas se nivelan y son despreciables en un grado aún mayor. Esto muestra, en particular, la alta precisión cuando se utiliza el porcentaje de capacidad de degradación de histamina total de una muestra de acuerdo con el método de la invención. Los sujetos sin síntomas muestran una clara diferencia entre las muestras parciales, con una capacidad de degradación de más del 40 %. Los sujetos que a veces son sintomáticos pero que han sido diagnosticados como sanos de acuerdo con la técnica anterior muestran una capacidad de degradación de histamina total significativamente reducida de entre 25 % y 40 %. Los pacientes que han sido clasificados como intolerantes a la histamina utilizando diagnósticos de la técnica anterior muestran todos una capacidad de degradación de histamina total muy baja de menos del 25 % (véase Fig. 4).

En la Fig. 5, con referencia a las Fig. 3 y 4, se muestra una distribución de concentración típica con un colectivo de pacientes más grande. Como en las Fig. 3/4, los pacientes se dividen en tres grupos de pacientes en base a su capacidad de degradación de histamina total medida en sus muestras de acuerdo con el método de la invención.

La Fig. 6 muestra la relación de la prueba de acuerdo con el método de la invención con el cuadro clínico, es decir, con el diagnóstico correcto de una sospecha de afección de HIT. Se puede observar que el método de acuerdo con la invención identificó correctamente al 94.4% de los pacientes HIT como pacientes HIT, mientras que el método de la técnica anterior, es decir, la prueba DAO-REA, diagnosticó correctamente de forma muy desventajosa sólo al 19.4%, y el DAO-ELISA total incluso encontró solo el 5.6 %. Los pacientes que sólo presentaban síntomas se encontraron con una capacidad restringida de degradación total de la histamina con un 85.7 % de especificidad utilizando el método de acuerdo con la invención, mientras que los métodos del estado de la técnica tenían un 52.4 % de especificidad porcentual al cuadro clínico en el caso de la prueba DAO-REA y un 47.6 % con DAO- ELISA total.

Los pacientes sin quejas, es decir, sin ningún síntoma que indique HIT, se podrían diagnosticar correctamente al 100 % utilizando el método de acuerdo con la invención. Los métodos de la técnica anterior dieron como resultado atribuciones clínicas significativamente peores: DAO-REA encontró correctamente el 95.2 %, y DAO- ELISA total incluso encontró solo el 77.4 %.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un método para determinar la capacidad de degradación de histamina total en una muestra biológica líquida, el método comprende las etapas de:

- dividir igualmente una cantidad proporcionada de muestra biológica líquida en una primera muestra parcial y una segunda muestra parcial;

- agregar y mezclar la primera muestra parcial con una cantidad específica de solución de provocación de histamina que contiene histamina;

- incubar la primera muestra parcial dosificada con solución de provocación de histamina durante un período de tiempo específico y en primeras condiciones de incubación específicas, mientras al mismo tiempo se incuba la segunda muestra parcial para el mismo período de tiempo específico como la primera muestra parcial y en segundas condiciones de incubación específicas;

- agregar y mezclar la segunda muestra parcial después de su incubación con la misma cantidad específica de solución de provocación de histamina que contiene histamina como se empleó anteriormente para la primera muestra parcial;

- extraer cuantitativamente fracciones iguales de las cargas de la primera y segunda muestras parciales que contienen solución de provocación, y modificar la histamina aún presentes en las cargas;

- determinar las concentraciones absolutas de la histamina modificada (valor de histamina) en las dos muestras parciales;

- calcular la capacidad de degradación de histamina total.

2. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la capacidad de degradación de histamina total se calcula en base de la siguiente fórmula: [(R - H) / (R/100)], donde R = la concentración de la histamina modificada (valor de histamina) de la segunda muestra parcial (valor de referencia) y H = la concentración de la histamina modificada (valor de histamina) de la primera muestra parcial.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque la muestra biológica líquida es sangre completa, suero sanguíneo, plasma sanguíneo, líquido cefalorraquídeo, saliva, orina, y/o un homogeneizado de un tejido de biopsia (muestra de tejido) o de una muestra de heces.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la solución de provocación de histamina contiene histamina en un tampón de estabilización a una concentración de entre 1 y 300 ng/ml o entre 1 y 100 ng/ml, preferiblemente entre 3 y 60 ng/ml o entre 6 y 30 ng/ml, y particular y preferiblemente entre 17 y 23 ng/ml.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el período de tiempo específico para incubación de la primera y segunda muestras parciales comprende 1 a 50 horas o 5 a 50 horas, preferiblemente 12 a 36 horas y particular y preferiblemente 20 a 28 horas, y las primeras condiciones de incubación específicas comprenden una temperatura de 27 °C a 42 °C, preferiblemente de 30 °C a 40 °C y particular y preferiblemente de 34 °C a 38 °C, y las segundas condiciones de incubación específicas de la segunda muestra parcial comprenden una temperatura de 2 °C a 27 °C, preferiblemente de 3 °C a 10 °C, y particular y preferiblemente de 4 °C a 8 °C.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la etapa de modificar la histamina presente comprende acilatar.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el método comprende una etapa adicional, es decir, agregar peroxidasa o catalasa, particularmente una cantidad de 0.1 a 10 unidades, preferiblemente de 0.2 a 5 unidades, más preferiblemente de 0.5 a 2 unidades, particularmente de 1 unidad, por 100 |jl de muestra.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la concentración de la histamina modificada se determina utilizando un inmunoensayo, particularmente utilizando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la concentración de la histamina modificada se determina utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y/o cromatografía de gases (GS).

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la determinación de la capacidad de degradación de histamina total se utiliza como una base para el diagnóstico y/o para la monitorización de un tratamiento terapéutico de un conjunto de síntomas relacionados con capacidad de degradación de histamina total deficiente.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la determinación de la capacidad de degradación de histamina total se utiliza como una base para evaluación de riesgos en preparación para la anestesia para un conjunto de síntomas relacionados con la capacidad de degradación de histamina total deficiente.

12. Uso de un kit para determinar la capacidad de degradación de histamina total en una muestra biológica líquida en un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende al menos:

- uno o más recipientes de recepción de muestras opcionalmente incluyen una placa recubierta con histamina modificada, particularmente con histamina acilatada;

- una solución de provocación de histamina que contiene histamina en un tampón de estabilización a una concentración de entre 1 y 300 ng/ml o entre 1 y 100 ng/ml, preferiblemente entre 3 y 60 ng/ml o entre 6 y 30 ng/ml, y particular y preferiblemente entre 17 y 23 ng/ml,

- un reactivo de modificación de histamina, particularmente un reactivo de acilación de histamina;

- medios para determinar histamina modificada, particularmente en base a ELISA;

- opcionalmente peroxidasa o catalasa, particularmente en forma liofilizada,

- opcionalmente un tampón de modificación de histamina, particularmente un tampón de acilación de histamina, - opcionalmente una histamina modificada estándar, particularmente acilatada.