CN113125733A - 一种用于监测人体免疫状态的42抗体试剂盒及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种可检测人体免疫状态的试剂盒，所述试剂盒可用于监测人体免疫状态的变化，所述试剂盒包含被标记的42种抗体，所述42种抗体为单克隆抗体CD57、CD3、CD68、CD56、gdTCR、CCR6、CD14、IgD、CD123(IL‑3R)、CD85j、CD19、CD25、CD274(PD‑L1)、CD278(ICOS)、CD39、CD27、CD24、CD45RA、CD86、CD28、CD197(CCR7)、CD11c、CD33、CD152(CTLA‑4)、FoxP3、CD161、CXCR5、CD66b、CD183(CXCR3)、CD94、T‑bet、Ki‑67、CD127(IL‑7Ra)、CD279(PD‑1)、CD38、Granzyme B、CD20、CD16、HLA‑DR、CD4、CD8a、CD11b。本发明公开的试剂盒，利用42种抗体，可以在多色流式细胞仪或者质谱流式细胞仪平台通过静脉采集外周血即可快速、准确地对外周血中免疫细胞进行深度分析，所述试剂盒特异性强，灵敏度高。

Description

一种用于监测人体免疫状态的42抗体试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及细胞生物学、生物医学检测领域中的检测试剂盒，尤其是一种用于检测人体免疫状态的检测试剂盒，可以用于评估人体免疫状态及疾病风险预测。
背景技术
外周血淋巴细胞根据生物学功能和细胞表面抗原表达分为T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK淋巴细胞。T淋巴细胞主要参与细胞免疫，表达CD3抗原；B细胞主要参与体液免疫，表达CD19抗原；NK细胞表达CD16和/或CD56，在机体中不依赖抗原刺激自发地发挥细胞毒效应。其中，T细胞又包括辅助T细胞(Th)和抑制T细胞(Ts)，它们分别表达CD4和CD8，而根据转录因子和分泌的细胞因子的不同，Th细胞可以分为Th1、Th2、Th17、Th19、Th22、Tfh、Treg等多种类型，根据T细胞激活状态不同，又能够分为初始T细胞、效应T细胞和记忆性T细胞。
免疫调节治疗在多种癌症、自身免疫病及炎症、过敏中都取得了临床疗效，广泛应用的治疗策略如造血干细胞移植、免疫检查点抑制、CART疗法等，许多免疫治疗试验都伴随着免疫监测，从免疫亚群和单细胞水平提供免疫细胞状态的重要提示。监测外周血免疫细胞是免疫诊断和生物标志物筛查的重要工具，有望更好地了解免疫发病机制和病理学，并确定新的治疗靶点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可用于检测人体免疫状态的试剂盒，同时，本发明还提供了所述试剂盒的制备方法以及所述试剂盒在检测人体免疫状态中的应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种试剂盒，所述试剂盒包含被标记的42种抗体，所述42种抗体为单克隆抗体CD57、CD3、CD68、CD56、gdTCR、CCR6、CD14、IgD、CD123(IL-3R)、CD85j、CD19、CD25、CD274(PD-L1)、CD278(ICOS)、CD39、CD27、CD24、CD45RA、CD86、CD28、CD197(CCR7)、CD11c、CD33、CD152(CTLA-4)、FoxP3、CD161、CXCR5、CD66b、CD183(CXCR3)、CD94、T-bet、Ki-67、CD127(IL-7Ra)、CD279(PD-1)、CD38、Granzyme B、CD20、CD16、HLA-DR、CD4、CD8a、CD11b。
本发明所述试剂盒对外周血中的T和B淋巴细胞和NK细胞、单核细胞、树突状细胞及亚群深入检测。应用于在临床研究期间监测及全面深度分析患者的外周免疫系统状态，不仅有助于阐明新疗法的免疫细胞机制，它还通过识别激活状态、免疫检查点特征预测患者的疾病进展风险，帮助预测对治疗的临床反应。
作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述42种抗体分别被荧光素标记或者金属元素标记。本发明所述试剂盒中的抗体标记，优选采用荧光素标记或金属元素标记，但不限于荧光素标记和金属元素标记。所述42种抗体分别为不同的荧光素(或42种不同的金属元素标记。
作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述荧光素选自Biotin、FITC、PE、TRITC、APC、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、APC、APC/Alexa Fluor750、APC/Cy7、APC/eflour 750、APC/FireTM750、PerCP/Cy5.5、PerCP、PerCP-eFlour 710、PE/Cy7、PE、PE/Cy5、PE/Dazzle 594、PE-CF594、Pacific Blue、Brilliant Violet 421、Brilliant Violet 510、Brilliant Violet 570、Brilliant Violet 605、BrilliantViolet 650、Brilliant Violet 711、Brilliant Violet 750、Brilliant Violet 785、Super Bright 436、Super Bright 600、Super Bright 645、Super Bright 702、eFluor450、eFluor 506、eFluor 660、eFluor 710、eFluor 780、BD Horizon BB515、BD HorizonPE-CF594、BD Horizon BV421、BD Horizon BV480、BD Horizon BV510、BD Horizon BV605、BD Horizon BV650、BD Horizon BV711、BD Horizon BV786、BD Horizon BUV395、BDHorizon BUV496、BD Horizon BUV737、BD Horizon BUV805、BD Horizon APC R700、Cy3、Cy5、Cy7。
作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述金属元素选自89Y、106Cd、110Cd、111Cd、112Cd、113Cd、114Cd、115In、116Cd、139La、141Pr、142Nd、143Nd、144Nd、145Nd、146Nd、147Sm、148Nd、149Sm、150Nd、151Eu、152Sm、153Eu、154Sm、155Gd、156Gd、157Gd、158Gd、159Tb、160Gd、161Dy、162Dy、163Dy、164Dy、165Ho、166Er、167Er、168Er、169Tm、170Er、171Yb、172Yb、173Yb、174Yb、175Lu、176Yb、197Au、198Pt、209Bi。
作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒中的抗体被金属元素标记，且抗体与金属元素标记对应如下：
Figure BDA0003024618800000031
Figure BDA0003024618800000041
作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述被标记的42种抗体中，每种抗体在所述试剂盒中的体积百分含量为0.5～79.5％。
本发明所述试剂盒中的42种单克隆抗体，不限于抗体克隆号，不限于抗体的荧光标签颜色、或金属标签质量数、或者其他抗体标记及检测方法。
另外，本发明还提供了上述所述试剂盒的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将抗体进行荧光素或金属元素标记；
(2)进行抗体滴定；
(3)按照滴定结果对标记后的抗体进行分装。
本发明所述试剂盒的制备方法中，首先将抗体进行荧光或金属标记，然后通过滴定确定抗体的使用量，最后将计量的标记的抗体放入试剂瓶内，混合均匀，密封，荧光抗体需要注意避光保存。
最后，本发明还提供了如上所述试剂盒在检测人体免疫状态中的应用。
本发明中所述的试剂盒可用于检测外周血中的免疫细胞，所述外周血中免疫细胞的比例通过各类免疫细胞表面独特的蛋白表达特征区分。
作为本发明所述试剂盒在检测人体免疫状态中的应用的优先实施方式，所述试剂盒用于检测人体免疫状态时，其检测样本来自人体外周血，所述人体包含各年龄段人群。
作为本发明所述试剂盒在检测人体免疫状态中的应用的优先实施方式，所述的试剂盒用于检测人体外周血中的T和B淋巴细胞和NK细胞、单核细胞、树突状细胞及亚群深入检测，并包含一系列细胞激活标记及免疫检查点蛋白。
作为本发明所述试剂盒在检测人体免疫状态中的应用的优先实施方式，所述试剂盒在检测人体免疫状态时包括以下步骤：
(1)分离外周血单个核细胞；
(2)通过流式细胞仪或者质谱流式细胞仪检测样本外周血中的淋巴细胞抗体对应抗原的表达丰度；
(3)根据外周血中免疫细胞各蛋白表达的丰度，使用算法进行降维分析及运算，确定检测样本的免疫状态。
本发明所述试剂盒应用于检测人体免疫状态时，使用的检测仪器优选但不限于荧光流式细胞仪、质谱流式细胞仪。
作为本发明所述试剂盒在检测人体免疫状态中的应用的优先实施方式，所述步骤(2)中流式细胞仪检测包括以下步骤：
1)采集不少于100μL的人体外周血作为检测样本；样本采集后即刻检测，或者2～8℃冷藏，48h内检测；
2)从所述试剂盒分别吸取42种试剂0.5～20μL于流式管内，将所述的检测样本加入所述的流式管，振荡混匀，得第一预样品；
3)将所述的第一预样品于常温下避光孵育10～20min，优选15min，得第二预样品；将所述的第一预样品于常温下避光孵育10～20min，优选15min，或2～8℃20～40min，优选30min，得第二预样品；
4)于所述的第二预样品中加入红细胞裂解液300ul～2mL，振荡混匀，于常温下避光孵育2min，得第三预样品；
5)将所述的第三预样品离心，得第四预样品；所述离心的离心条件为500×g，常温，5min；
6)弃所述的第四预样品的上清液，向弃上清液后剩余的样品中加入PBS缓冲液重悬，得检测样品；
7)将检测样品上流式细胞仪检测。
作为本发明所述试剂盒在检测人体免疫状态中的应用的优先实施方式，所述步骤(2)中质谱流式细胞仪检测包括以下步骤：
1)采集不少于5mL的人体外周血作为检测样本；样本采集后即刻检测，或者2～8℃冷藏，48h内检测；
2)将检测样本使用淋巴细胞分离液分离，获得单个核细胞；
3)进行细胞计数，取1～3×106细胞；
4)用PBS缓冲液配置终浓度0.25μM 194Pt(1mM)死活染液，取50ul～1.5ml 194Pt死活染液重悬细胞，优选100μL，冰上染色5min；
5)每个样本加入100ul～1.5ml FACS Buffer，优选500ul，重悬细胞，2～8℃离心400g/5min，弃上清；
6)每个样本加入20ul～1.5ml封闭液，优选50ul，重悬细胞，冰上封闭20min～1h，优选20min；
7)从所述试剂盒分别吸取37种金属抗体(除去胞内抗体CD68、FoxP3、Granzyme B、Ki-67、T-bet)各0.5～4μL于离心管内，用封闭液将总体积调整至50μL；
8)将所述的检测样本加入所述的离心管，总体积为100μL，振荡混匀；
9)轻柔吹打混匀细胞，冰上染色20～60min，优选30min；
10)每个样本加入1mL FACS Buffer，重悬细胞，2～8℃离心400g/5min，弃上清；
11)用Fix and Perm Buffer配置终浓度100～500nM Ir染液，优选250nM，每个样本取200μL～1.5ml重悬细胞，室温孵育1h；
12)用ddH2O稀释10x Permeabilization Buffer配置1x PermeabilizationBuffer，每个样本加入500μL～2ml重悬细胞，优选1ml，室温离心800g/5min，弃上清；
13)用Fixation/Permeabilization Diluent稀释Fixation/PermeabilizationConcentrate，体积比3:1。每个样本加入50μL～1.5ml重悬细胞，优选100μL，室温孵育30min。
14)每个样本加入1x Permeabilization Buffer 500μL～2ml重悬细胞，优选1ml，2～8℃室温离心800g/5min，弃上清；
15)从所述试剂盒分别吸取胞内抗体CD68、FoxP3、Granzyme B、Ki-67、T-bet共5种金属抗体各0.5～4μL于离心管内，用1x Permeabilization Buffer将总体积调整至50μL；
16)将所述的检测样本加入所述的离心管，总体积为100μL，振荡混匀；
17)轻柔吹打混匀细胞，冰上染色20～60min，优选30min；弃上清液，使用500ul～1.5mL FACS Buffer，优选1mL，重悬细胞，2～8℃离心800g/5min，弃上清，去离子水重悬细胞，将检测样品上质谱流式细胞仪检测。
本发明提供的试剂盒利用42种抗体，提供了一组42色抗体组合方案，在多色流式细胞仪或者质谱流式细胞仪平台，运用本发明提供的试剂盒，实现单个样本的单管检测，通过生物信息学分析，即可对免疫细胞进行深度分析，可有效地监测体检者的免疫能力。采用本发明的试剂盒，通过静脉采集外周血即可快速、准确地对外周血中免疫细胞进行深度分析；该试剂盒适用于各年龄段体检者的免疫状态监测。本发明的试剂盒特异性强，灵敏度高；每种抗体仅需要0.5μL～4ul的量即可准确测量，且测量数据的重复性再现性均很好；样本易得，报告周期短，检测时间、成本都有效降低。
随着现代人类生活方式的改变，很多人处于一种亚健康状态，本发明的试剂盒通对外周血淋巴细胞进行深度分析，建立机体免疫状态评分系统，评估自身免疫力，辅助诊断某些疾病，分析发病机制，观察疗效及检测预后。本发明的试剂盒通过检测可以发现体检者是否存在免疫状态异常的问题，对于免疫状态异常的人群，通过调整自身状态，或在医生指导下，采用医学手段干预增强免疫力的方式进行调理。
附图说明
图1为本发明所述试剂盒中42种抗体的质谱流式有效性检测结果图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和有益效果，下面将结合附图和具体实施例对本发明进一步说明。
本发明提供的监测人体免疫状态的试剂盒，其测试方法适用于各年龄段的体检者。所述试剂盒应用流式细胞仪或者质谱流式细胞仪对外周血免疫细胞蛋白表达丰度进行分析，并辅以生物信息学分析，对免疫状态进行评估。
本申请发明人通过对外周血免疫细胞蛋白表达丰度进行分析，搭建了以CD57、CD3、CD68、CD56、gdTCR、CCR6、CD14、IgD、CD123(IL-3R)、CD85j、CD19、CD25、CD274(PD-L1)、CD278(ICOS)、CD39、CD27、CD24、CD45RA、CD86、CD28、CD197(CCR7)、CD11c、CD33、CD152(CTLA-4)、FoxP3、CD161、CXCR5、CD66b、CD183(CXCR3)、CD94、T-bet、Ki-67、CD127(IL-7Ra)、CD279(PD-1)、CD38、Granzyme B、CD20、CD16、HLA-DR、CD4、CD8a、CD11b为基础的监测方案，每种抗体被分别标记如Biotin、FITC、PE、TRITC、APC、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、AlexaFluor 750、APC、APC/Alexa Fluor750、APC/Cy7、APC/eflour 750、APC/FireTM750、PerCP/Cy5.5、PerCP、PerCP-eFlour 710、PE/Cy7、PE、PE/Cy5、PE/Dazzle 594、PE-CF594、PacificBlue、Brilliant Violet 421、Brilliant Violet 510、Brilliant Violet 570、BrilliantViolet 605、Brilliant Violet 650、Brilliant Violet 711、Brilliant Violet 750、Brilliant Violet 785、Super Bright 436、Super Bright 600、Super Bright 645、SuperBright 702、eFluor 450、eFluor 506、eFluor 660、eFluor 710、eFluor 780、BD HorizonBB515、BD Horizon PE-CF594、BD Horizon BV421、BD Horizon BV480、BD Horizon BV510、BD Horizon BV605、BD Horizon BV650、BD Horizon BV711、BD Horizon BV786、BDHorizon BUV395、BD Horizon BUV496、BD Horizon BUV737、BD Horizon BUV805、BDHorizon APC R700、Cy3、Cy5、Cy7等流式细胞仪可检测的荧光搭配，或89Y、115In、139La、141Pr、142Nd、143Nd、144Nd、145Nd、146Nd、147Sm、148Nd、149Sm、150Nd、151Eu、152Sm、153Eu、154Sm、155Gd、156Gd、157Gd、158Gd、159Tb、160Gd、161Dy、162Dy、163Dy、164Dy、165Ho、166Er、167Er、168Er、169Tm、170Er、171Yb、172Yb、173Yb、174Yb、175Lu、176Yb、197Au、198pt、209Bi质谱流式细胞仪可检测的金属搭配。利用质谱流式检测了数百例健康人群的基础样本，建立了适合中国人的反映外周血淋巴细胞稳态的“免疫状态”模型，可准确评估个人外周血淋巴细胞比例与免疫状态的相关性，从而判断其免疫力是否出现异常或紊乱，帮助个人进行正确的健康管理。
本发明中所使用的荧光素或金属元素标记的42种单克隆抗体为市售，例如但不限于美国Biolegend、BD、R&D等品牌。
本发明中所使用的荧光素为市售，例如但不限于ThermoFisher、BD等品牌。
本发明中所使用的金属元素为市售，例如但不限于美国Fluidigm品牌。
本申请发明人在大量试验研究基础上，对于免疫状态进行监测，建立相应的流式细胞术或者质谱流式细胞术方案，通过标记的CD57、CD3、CD68、CD56、gdTCR、CCR6、CD14、IgD、CD123(IL-3R)、CD85j、CD19、CD25、CD274(PD-L1)、CD278(ICOS)、CD39、CD27、CD24、CD45RA、CD86、CD28、CD197(CCR7)、CD11c、CD33、CD152(CTLA-4)、FoxP3、CD161、CXCR5、CD66b、CD183(CXCR3)、CD94、T-bet、Ki-67、CD127(IL-7Ra)、CD279(PD-1)、CD38、GranzymeB、CD20、CD16、HLA-DR、CD4、CD8a、CD11b共42种抗体组合对人体免疫状态进行测定。
本申请所述的人体免疫状态监测方法适用于各年龄段的体检者，通过抗体滴定等方法，确定抗体的最适用量，单种抗体的用量在0.1～4ul范围内，可以达到理想的分群，检测效果达到预期；本发明提供的免疫状态监测模型建立时的样本取自健康人外周血；取200个健康人样本对其进行外周血免疫细胞对应抗原的表达丰度检测。
本发明利用所述试剂盒检测人体免疫状态时，首先检测健康人样本外周血免疫细胞。具体方法如下：
采用本发明中所述的试剂盒进行检测，本发明试剂盒含有被标记的抗体，所述抗体包括CD57、CD3、CD68、CD56、gdTCR、CCR6、CD14、IgD、CD123(IL-3R)、CD85j、CD19、CD25、CD274(PD-L1)、CD278(ICOS)、CD39、CD27、CD24、CD45RA、CD86、CD28、CD197(CCR7)、CD11c、CD33、CD152(CTLA-4)、FoxP3、CD161、CXCR5、CD66b、CD183(CXCR3)、CD94、T-bet、Ki-67、CD127(IL-7Ra)、CD279(PD-1)、CD38、Granzyme B、CD20、CD16、HLA-DR、CD4、CD8a、CD11b单克隆抗体，所述抗体不限于抗体克隆号，所述抗体分别标记有适用于流式细胞仪检测的42种荧光素，或者适用于质谱流式细胞仪检测的42种金属元素。
优选地，所述荧光素选自Biotin、FITC、PE、TRITC、APC、Alexa Fluor 405、AlexaFluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor700、Alexa Fluor 750、APC、APC/Alexa Fluor750、APC/Cy7、APC/eflour750、APC/FireTM750、PerCP/Cy5.5、PerCP、PerCP-eFlour 710、PE/Cy7、PE、PE/Cy5、PE/Dazzle 594、PE-CF594、Pacific Blue、Brilliant Violet 421、Brilliant Violet 510、BrilliantViolet 570、Brilliant Violet 605、Brilliant Violet 650、Brilliant Violet 711、Brilliant Violet 750、Brilliant Violet 785、Super Bright 436、Super Bright600、Super Bright 645、Super Bright 702、eFluor 450、eFluor 506、eFluor 660、eFluor710、eFluor 780、BD Horizon BB515、BD Horizon PE-CF594、BD Horizon BV421、BDHorizon BV480、BD Horizon BV510、BD Horizon BV605、BD Horizon BV650、BD HorizonBV711、BD Horizon BV786、BD Horizon BUV395、BD Horizon BUV496、BD Horizon BUV737、BD Horizon BUV805、BD Horizon APC R700、Cy3、Cy5、Cy7中的任意一种。
优选地，所述金属元素选自89Y、115In、139La、141Pr、142Nd、143Nd、144Nd、145Nd、146Nd、147Sm、148Nd、149Sm、150Nd、151Eu、152Sm、153Eu、154Sm、155Gd、156Gd、157Gd、158Gd、159Tb、160Gd、161Dy、162Dy、163Dy、164Dy、165Ho、166Er、167Er、168Er、169Tm、170Er、171Yb、172Yb、173Yb、174Yb、175Lu、176Yb、197Au、198pt、209Bi中的任意一种。
优选的，所述被标记的42种抗体中，每种被标记抗体在所述试剂盒中的体积百分含量为0.5～79.5％。
上述所述试剂盒的制备方法包括以下步骤：
1)将抗体进行荧光或者金属标记；
2)进行抗体滴定；
3)按照滴定结果对标记后的抗体进行分装。
所述试剂盒制备完成后，保存条件为为2～8℃，荧光抗体试剂盒需要注意避光保存。所述试剂盒制备完成后，对上述所述来自200个样本的人体外周血进行检测。
优选地，采用流式细胞仪对待测样本进行检测，所述待测样本的流式检测制备包括以下步骤：
1)采集不少于100μL的人体外周血作为检测样本；样本采集后即刻检测，1)采集不少于100μL的人体外周血作为检测样本；样本采集后即刻检测，或者2～8℃冷藏，48h内检测；
2)从所述试剂盒分别吸取42种试剂0.5～20μL于流式管内，将所述的检测样本加入所述的流式管，振荡混匀，得第一预样品；
3)将所述的第一预样品于常温下避光孵育10～20min，优选15min，得第二预样品；将所述的第一预样品于常温下避光孵育10～20min，优选15min，或2～8℃20～40min，优选30min，得第二预样品；
4)于所述的第二预样品中加入红细胞裂解液300ul～2mL，振荡混匀，于常温下避光孵育2min，得第三预样品；
5)将所述的第三预样品离心，得第四预样品；所述离心的离心条件为500×g，常温，5min；
6)弃所述的第四预样品的上清液，向弃上清液后剩余的样品中加入PBS缓冲液(pH7.4)重悬，得检测样品；
7)将检测样品上流式细胞仪检测。
优选地，采用质谱流式细胞仪对待测样本进行检测，所述待测样本的质谱流式检测制备包括以下步骤：
1)采集不少于5mL的人体外周血作为检测样本；样本采集后即刻检测，或者2～8℃冷藏，48h内检测；
2)将检测样本使用淋巴细胞分离液分离，获得单个核细胞；
3)进行细胞计数，取1～3×106细胞；
4)用PBS缓冲液(pH7.4)配置终浓度0.25μM 194Pt(1mM)死活染液，取50ul～1.5ml194Pt死活染液重悬细胞，优选100μL，冰上染色5min；
5)每个样本加入100ul～1.5ml FACS Buffer，优选500ul，重悬细胞，2～8℃离心400g/5min，弃上清；
6)每个样本加入20ul～1.5ml封闭液，优选50ul，重悬细胞，冰上封闭20min～1h，优选20min；
7)从所述试剂盒分别吸取37种金属抗体(除去胞内抗体CD68、FoxP3、Granzyme B、Ki-67、T-bet)各0.5～4μL于离心管内，用封闭液将总体积调整至50μL；
8)将所述的检测样本加入所述的离心管，总体积为100μL，振荡混匀；
9)轻柔吹打混匀细胞，冰上染色20～60min，优选30min；
10)每个样本加入1mL FACS Buffer，重悬细胞，2～8℃离心400g/5min，弃上清；
11)用Fix and Perm Buffer配置终浓度100～500nM Ir染液，优选250nM，每个样本取200μL～1.5ml重悬细胞，室温孵育1h；
12)用ddH2O稀释10x Permeabilization Buffer配置1x PermeabilizationBuffer，每个样本加入500μL～2ml重悬细胞，优选1ml，室温离心800g/5min，弃上清；
13)用Fixation/Permeabilization Diluent稀释Fixation/PermeabilizationConcentrate，体积比3:1。每个样本加入50μL～1.5ml重悬细胞，优选100μL，室温孵育30min。
14)每个样本加入1x Permeabilization Buffer 500μL～2ml重悬细胞，优选1ml，2～8℃室温离心800g/5min，弃上清；
15)从所述试剂盒分别吸取胞内抗体CD68、FoxP3、Granzyme B、Ki-67、T-bet共5种金属抗体各0.5～4μL于离心管内，用1x Permeabilization Buffer将总体积调整至50μL；
16)将所述的检测样本加入所述的离心管，总体积为100μL，振荡混匀；
17)轻柔吹打混匀细胞，冰上染色20～60min，优选30min；弃上清液，使用500ul～1.5mL FACS Buffer，优选1mL，重悬细胞，2～8℃离心800g/5min，弃上清，去离子水重悬细胞，将检测样品上质谱流式细胞仪检测。
本发明所述试剂盒的应用基于流式细胞仪或质谱流式细胞仪，所述试剂盒用于检测人体外周血中的T和B淋巴细胞和NK细胞、单核细胞、树突状细胞及亚群深入检测，并包含一系列细胞激活标记及免疫检查点蛋白。通过所述200个样本的外周血中的免疫细胞的检测结果，即利用受试者45个抗体检测的相应蛋白表达丰度，进行降维分析及机器学习计算，建立免疫状态评分系统，用于为各类人群的自身免疫状态进行检测评估。
本发明还提供一种所述的试剂盒在用于监测人体免疫状态中的应用。
优选地，上述所述试剂盒在用于监测人体免疫状态中应用时，所述试剂盒可检测人体免疫状态，具体检测包括以下步骤：
1)通过流式细胞仪或者质谱流式细胞仪检测所述检测样品的T和B淋巴细胞和NK细胞、单核细胞、树突状细胞及亚群深入检测，并包含一系列细胞激活标记及免疫检查点蛋白；
2)根据各个蛋白的表达情况，对照上述稳态模型，评估所述检测样本的免疫状态。
实施例1
本发明试剂盒的一种实施例，准备上述所述42种荧光或金属标记的单克隆抗体，根据抗体滴定的结果，选择能够明确分群或者与生产厂家宣称的性能相符合的抗体浓度，按照相应的浓度分别将每支抗体加入到1.5ml离心管种，用封闭液将总体积补足到50μL，荧光抗体需要避光保存，即成为1人份本发明的产品。
实施例2
试剂盒的制备：
准备上述所述42种已标记的单克隆抗体，根据抗体滴定的结果，选择能够明确分群或者与生产厂家宣称的性能相符合的抗体浓度，按照相应的浓度将1～100份荧光抗体分别混合后，避光保存，即成为1～100人份本发明的产品。
所述试剂盒配制完成后，试剂盒标识有产品的使用量。
所述试剂盒中42个抗体的质谱流式有效性检测结果如附图1所示。
使用相同的试剂盒对同一待测样本进行多次检测，所产生的结果具有可重复和可再现的特点。
通过实验，对受试者样本使用上述实施例的质谱流式抗体试剂盒进行检测。
使用同样的试剂盒质谱流式检测样本的42个marker的阳性比率示例如表1所示。B011～B020代表不同受试者编号，通过表1表明在不同个体中，免疫细胞中各种蛋白marker的丰度具有差异性。
表1不同个体42个marker检测结果
Figure BDA0003024618800000131
Figure BDA0003024618800000141
本发明提供的用于检测人体免疫状态的试剂盒，利用受试者42个抗体检测的相应蛋白表达丰度进行降维分析及机器学习计算，建立免疫状态评分系统用于为各类人群进行检测评估。
使用本发明提供的监测免疫状态的试剂盒，对200例志愿者样本进行监测，并与志愿者的身体状况进行比较。如表2，当免疫状态评分＜0.5时，表明该类受试者自身免疫状态良好，免疫系统衰老程度良好，免疫损伤程度低，与其“无不良生活习惯，身体状况良好”相匹配；当免疫状态评分大于0.5时，表明该类受试者自身免疫状态低于正常水平，免疫系统衰老程度高，免疫损伤程度高，与其“生活作息紊乱，饮食不规律，易疲劳”的身体状况相呼应。
表2体检者免疫状态检测结果与平时身体状况调查表；
检测样本数量 免疫状态评分 受试者身体状况
110例 <0.5 无不良生活习惯，身体状况良好
90例 >0.5 生活作息紊乱，饮食不规律，易疲劳
通过外周血单个核细胞进行深度分析，建立机体免疫状态评分系统，使用本发明所述的试剂盒能够快速准确地检测评估自身免疫力。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含被标记的42种抗体，所述42种抗体为单克隆抗体CD57、CD3、CD68、CD56、gdTCR、CCR6、CD14、IgD、CD123(IL-3R)、CD85j、CD19、CD25、CD274(PD-L1)、CD278(ICOS)、CD39、CD27、CD24、CD45RA、CD86、CD28、CD197(CCR7)、CD11c、CD33、CD152(CTLA-4)、FoxP3、CD161、CXCR5、CD66b、CD183(CXCR3)、CD94、T-bet、Ki-67、CD127(IL-7Ra)、CD279(PD-1)、CD38、Granzyme B、CD20、CD16、HLA-DR、CD4、CD8a、CD11b。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述42种抗体分别被荧光素标记或者金属元素标记。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光素选自Biotin、FITC、PE、TRITC、APC、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、AlexaFluor 546、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、APC、APC/Alexa Fluor750、APC/Cy7、APC/eflour 750、APC/FireTM750、PerCP/Cy5.5、PerCP、PerCP-eFlour 710、PE/Cy7、PE、PE/Cy5、PE/Dazzle 594、PE-CF594、Pacific Blue、Brilliant Violet 421、BrilliantViolet 510、Brilliant Violet 570、Brilliant Violet 605、Brilliant Violet 650、Brilliant Violet 711、Brilliant Violet 750、Brilliant Violet 785、Super Bright436、Super Bright 600、Super Bright 645、Super Bright 702、eFluor 450、eFluor 506、eFluor 660、eFluor 710、eFluor 780、BD Horizon BB515、BD Horizon PE-CF594、BDHorizon BV421、BD Horizon BV480、BD Horizon BV510、BD Horizon BV605、BD HorizonBV650、BD Horizon BV711、BD Horizon BV786、BD Horizon BUV395、BD Horizon BUV496、BD Horizon BUV737、BD Horizon BUV805、BD Horizon APC R700、Cy3、Cy5、Cy7。
4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述金属元素选自89Y、106Cd、110Cd、111Cd、112Cd、113Cd、114Cd、115In、116Cd、139La、141Pr、142Nd、143Nd、144Nd、145Nd、146Nd、147Sm、148Nd、149Sm、150Nd、151Eu、152Sm、153Eu、154Sm、155Gd、156Gd、157Gd、158Gd、159Tb、160Gd、161Dy、162Dy、163Dy、164Dy、165Ho、166Er、167Er、168Er、169Tm、170Er、171Yb、172Yb、173Yb、174Yb、175Lu、176Yb、197Au、198Pt、209Bi。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述被标记的42种抗体中，每种抗体在所述试剂盒中的体积百分含量为0.5～79.5％。
6.如权利要求1～5任一项所述试剂盒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将抗体进行荧光素或金属元素标记；
(2)进行抗体滴定；
(3)按照滴定结果对标记后的抗体进行分装。
7.一种如权利要求1～5任一项所述试剂盒在检测人体免疫状态中的应用。
8.如权利要求7所述试剂盒在检测人体免疫状态中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)分离外周血单个核细胞；
(2)通过流式细胞仪或者质谱流式细胞仪检测样本外周血中的淋巴细胞抗体对应抗原的表达丰度；
(3)根据外周血中免疫细胞各蛋白表达的丰度，使用算法进行降维分析及运算，确定检测样本的免疫状态。
9.如权利要求8所述试剂盒在检测人体免疫状态中的应用，其特征在于，所述步骤(2)中流式细胞仪检测包括以下步骤：
1)采集不少于100μL的人体外周血作为检测样本；样本采集后即刻检测，或者2～8℃冷藏，48h内检测；
2)从所述试剂盒分别吸取42种试剂0.5～20μL于流式管内，将所述的检测样本加入所述的流式管，振荡混匀，得第一预样品；
3)将所述的第一预样品于常温下避光孵育10～20min，优选15min，或2～8℃20～40min，优选30min，得第二预样品；
4)于所述的第二预样品中加入红细胞裂解液300ul～2mL，振荡混匀，于常温下避光孵育2min，得第三预样品；
5)将所述的第三预样品离心，得第四预样品；所述离心的离心条件为500×g，常温，5min；
6)弃所述的第四预样品的上清液，向弃上清液后剩余的样品中加入PBS缓冲液50μL重悬，得检测样品；
7)将检测样品上流式细胞仪检测。
10.如权利要求8所述试剂盒在检测人体免疫状态中的应用，其特征在于，所述步骤(2)中质谱流式细胞仪检测包括以下步骤：
1)采集不少于5mL的人体外周血作为检测样本；样本采集后即刻检测，或者2～8℃冷藏，48h内检测；
2)将检测样本使用淋巴细胞分离液分离，获得单个核细胞；
3)进行细胞计数，取1～3×106细胞；
4)用PBS缓冲液配置终浓度0.25μM 194Pt(1mM)死活染液，取50ul～1.5ml 194Pt死活染液重悬细胞，优选100μL，冰上染色5min；
5)每个样本加入100ul～1.5ml FACS Buffer，重悬细胞，2～8℃离心400g/5min，弃上清；
6)每个样本加入20ul～1.5ml封闭液，优选50ul，重悬细胞，冰上封闭20min～1h，优选20min；
7)从所述试剂盒分别吸取37种金属抗体(除去胞内抗体CD68、FoxP3、Granzyme B、Ki-67、T-bet)各0.5～4μL于离心管内，用封闭液将总体积调整至50μL；
8)将所述的检测样本加入所述的离心管，总体积为100μL，振荡混匀；
9)轻柔吹打混匀细胞，冰上染色20～60min，优选30min；
10)每个样本加入1mL FACS Buffer，重悬细胞，2～8℃离心400g/5min，弃上清；
11)用Fix and Perm Buffer配置终浓度100～500nM Ir染液，优选250nM，每个样本取200μL～1.5ml重悬细胞，室温孵育1h；
12)用ddH2O稀释10x Permeabilization Buffer配置1x Permeabilization Buffer，每个样本加入500μL～2ml重悬细胞，优选1ml，室温离心800g/5min，弃上清；
13)用Fixation/Permeabilization Diluent稀释Fixation/PermeabilizationConcentrate，体积比3:1。每个样本加入50μL～1.5ml重悬细胞，优选100μL，室温孵育30min。
14)每个样本加入1x Permeabilization Buffer 500μL～2ml重悬细胞，优选1ml，2～8℃室温离心800g/5min，弃上清；
15)从所述试剂盒分别吸取胞内抗体CD68、FoxP3、Granzyme B、Ki-67、T-bet共5种金属抗体各0.5～4μL于离心管内，用1x Permeabilization Buffer将总体积调整至50μL；
16)将所述的检测样本加入所述的离心管，总体积为100μL，振荡混匀；
17)轻柔吹打混匀细胞，冰上染色20～60min，优选30min；弃上清液，使用500ul～1.5mLFACS Buffer，优选1mL，2～8℃离心800g/5min，弃上清，去离子水重悬细胞，将检测样品上质谱流式细胞仪检测。
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