CN109212215A - 肿瘤患者免疫细胞功能评估试剂盒及评估方法 - Google Patents

肿瘤患者免疫细胞功能评估试剂盒及评估方法 Download PDF

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CN109212215A CN201811191480.9A CN201811191480A CN109212215A CN 109212215 A CN109212215 A CN 109212215A CN 201811191480 A CN201811191480 A CN 201811191480A CN 109212215 A CN109212215 A CN 109212215A
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Abstract

本发明提供一种肿瘤患者免疫细胞功能评估试剂盒及评估方法。本发明的肿瘤患者免疫细胞功能评估试剂盒包括：抗人CD3抗体、抗人CD4抗体、抗人CD8抗体、抗人CD25抗体、抗人CD28抗体、抗人CD38抗体、抗人CD56抗体、抗人CD57抗体、抗人CD94抗体、抗人CD127抗体、抗人CD45RA抗体、抗人CCR7抗体、抗人HLA‑DR抗体、抗人PD‑1抗体、抗人NKP30抗体、抗人NKP46抗体、抗人NKG2D抗体、抗人KIR抗体、抗人γδ抗体、抗人Vδ2抗体，以上抗体均携带荧光素标记。该试剂盒能够用于对肿瘤患者的免疫细胞功能进行综合评估，使用方便、安全。

Description

肿瘤患者免疫细胞功能评估试剂盒及评估方法
技术领域
本发明涉及医疗领域，尤其涉及一种肿瘤患者免疫细胞功能评估试剂盒及评估方法。
背景技术
人体免疫细胞的免疫功能与各类疾病的发生、进展均有直接相关性，比如肿瘤的发生、发展过程就是因为人体自身免疫细胞功能长期下调或受到抑制的结果。但是，纵观国内外研究文献，发现目前国际上还没有用于专门评估肿瘤患者的免疫细胞功能的方法。目前国内外临床、第三方检测机构评价人体免疫功能的方法还停留在细胞的数量、比例等常规指标。比如，医院的血常规仅仅给出了白细胞的数量范围和比例，如CD3细胞的数量、比例，CD4+T细胞的数量、比例等。这些数据对医生进行临床诊断的参加意义不大。
目前，包括临床和第三方检测机构等均没有真正能评价肿瘤患者的免疫细胞本身功能和质量的方法。
发明内容
本发明的目的首先在于提供一种肿瘤患者免疫细胞功能评估试剂盒，能够结合流式细胞仪用于对肿瘤患者的免疫细胞功能进行综合评估，使用方便、安全。
本发明的目的还在于提供一种肿瘤患者免疫细胞功能评估方法，能够对肿瘤患者的免疫细胞功能进行综合评估。
为实现以上目的，本发明首先提供一种肿瘤患者免疫细胞功能评估试剂盒，包括：抗人CD3抗体、抗人CD4抗体、抗人CD8抗体、抗人CD25抗体、抗人CD28抗体、抗人CD38抗体、抗人CD56抗体、抗人CD57抗体、抗人CD94抗体、抗人CD127抗体、抗人CD45RA抗体、抗人CCR7抗体、抗人HLA-DR抗体、抗人PD-1抗体、抗人NKP30抗体、抗人NKP46抗体、抗人NKG2D抗体、抗人KIR抗体、抗人γδ抗体、抗人Vδ2抗体。
可选的，所述抗人CD3抗体、抗人CD4抗体、抗人CD8抗体、抗人CD25抗体、抗人CD28抗体、抗人CD38抗体、抗人CD56抗体、抗人CD57抗体、抗人CD94抗体、抗人CD127抗体、抗人CD45RA抗体、抗人CCR7抗体、抗人HLA-DR抗体、抗人PD-1抗体、抗人NKP30抗体、抗人NKP46抗体、抗人NKG2D抗体、抗人KIR抗体、抗人γδ抗体、抗人Vδ2抗体均为单克隆抗体。
可选的，所述抗人CD3抗体、抗人CD4抗体、抗人CD8抗体、抗人CD25抗体、抗人CD28抗体、抗人CD38抗体、抗人CD56抗体、抗人CD57抗体、抗人CD94抗体、抗人CD127抗体、抗人CD45RA抗体、抗人CCR7抗体、抗人HLA-DR抗体、抗人PD-1抗体、抗人NKP30抗体、抗人NKP46抗体、抗人NKG2D抗体、抗人KIR抗体、抗人γδ抗体、抗人Vδ2抗体中的任意一种为粉剂或者液体制剂。
可选的，所述抗人CD3抗体、抗人CD4抗体、抗人CD8抗体、抗人CD25抗体、抗人CD28抗体、抗人CD38抗体、抗人CD56抗体、抗人CD57抗体、抗人CD94抗体、抗人CD127抗体、抗人CD45RA抗体、抗人CCR7抗体、抗人HLA-DR抗体、抗人PD-1抗体、抗人NKP30抗体、抗人NKP46抗体、抗人NKG2D抗体、抗人KIR抗体、抗人γδ抗体、抗人Vδ2抗体均采用抗体试剂管封装，所述抗体试剂管为透光率在10％以下的棕色塑料管。
优选的，所述抗体试剂管的透光率为零，即完全不透光。
可选的，所述抗体试剂管中盛装的抗体为液体制剂时，所述抗体试剂管中抗体的体积为0.5ml-5ml。
可选的，所述抗人CD3抗体、抗人CD4抗体、抗人CD8抗体、抗人CD25抗体、抗人CD28抗体、抗人CD38抗体、抗人CD56抗体、抗人CD57抗体、抗人CD94抗体、抗人CD127抗体、抗人CD45RA抗体、抗人CCR7抗体、抗人HLA-DR抗体、抗人PD-1抗体、抗人NKP30抗体、抗人NKP46抗体、抗人NKG2D抗体、抗人KIR抗体、抗人γδ抗体、抗人Vδ2抗体均为液体制剂。
可选的，所述抗人CD3抗体、抗人CD4抗体、抗人CD8抗体、抗人CD25抗体、抗人CD28抗体、抗人CD38抗体、抗人CD56抗体、抗人CD57抗体、抗人CD94抗体、抗人CD127抗体、抗人CD45RA抗体、抗人CCR7抗体、抗人HLA-DR抗体、抗人PD-1抗体、抗人NKP30抗体、抗人NKP46抗体、抗人NKG2D抗体、抗人KIR抗体、抗人γδ抗体、抗人Vδ2抗体中的至少一种为粉剂，所述肿瘤患者免疫细胞功能评估试剂盒还包括磷酸盐缓冲液。
可选的，所述抗人CD3抗体、抗人CD4抗体、抗人CD8抗体、抗人CD25抗体、抗人CD28抗体、抗人CD38抗体、抗人CD56抗体、抗人CD57抗体、抗人CD94抗体、抗人CD127抗体、抗人CD45RA抗体、抗人CCR7抗体、抗人HLA-DR抗体、抗人PD-1抗体、抗人NKP30抗体、抗人NKP46抗体、抗人NKG2D抗体、抗人KIR抗体、抗人γδ抗体、抗人Vδ2抗体的荧光素标记选自PerCP-Cy5.5、BV510、FITC、AF647、PE-Cy7、BV421、PE、AF647、APC-H7、BB515。
本发明还提供一种肿瘤患者免疫细胞功能评估方法，包括如下步骤：
步骤1、提供如上文所述的肿瘤患者免疫细胞功能评估试剂盒；
从2ml-10ml人体外周血中提取外周血单个核细胞；
步骤2、当所述肿瘤患者免疫细胞功能评估试剂盒中的所有抗体均为液体制剂时，从所有抗体中分别取1μl-5μl，全部与所述外周血单个核细胞进行混合，在2℃-6℃条件下避光孵育10分钟至30分钟，得到细胞检测样本；
当所述肿瘤患者免疫细胞功能评估试剂盒中至少有一种抗体为粉剂时，首先采用磷酸盐缓冲液将粉剂溶解为抗体溶液，之后从所有液体形式的抗体中分别取1μl-5μl，全部与所述外周血单个核细胞进行混合，在2℃-6℃条件下避光孵育10分钟至30分钟，得到细胞检测样本；
所述液体制剂中抗体的浓度为0.1-2mg/ml；所述粉剂与磷酸盐缓冲液混合后得到的抗体溶液中抗体的浓度为0.1-2mg/ml；
步骤3、采用流式细胞仪对所述细胞检测样本进行检测分析。
本发明的有益效果：
本发明的肿瘤患者免疫细胞功能评估试剂盒能够结合流式细胞仪用于对肿瘤患者的免疫细胞功能进行综合评估，使用方便，对人体安全。本发明的肿瘤患者免疫细胞功能评估方法能够对肿瘤患者外周血中的免疫细胞的功能进行综合评估，操作步骤简单，操作过程安全。
本发明在国际范围内第一次建立了对肿瘤患者的免疫细胞功能进行综合评估的方法，采用了多种免疫功能指标对肿瘤患者外周血中的免疫细胞的功能进行综合评估，若判断肿瘤患者的免疫功能过低，则提示肿瘤患者采用免疫治疗等干预手段对自身的免疫功能进行提升，避免出现与免疫功能相关的各种疾病。
具体实施方式
如本文所用之术语：
“由……制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
连接词“由……组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由……组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1～5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1～4”、“1～3”、“1～2”、“1～2和4～5”、“1～3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
“质量份”指表示多个组分的质量比例关系的基本计量单位，1份可表示任意的单位质量，如可以表示为1g，也可表示2.689g等。假如我们说A组分的质量份为a份，B组分的质量份为b份，则表示A组分的质量和B组分的质量之比a：b。或者，表示A组分的质量为aK，B组分的质量为bK(K为任意数，表示倍数因子)。不可误解的是，与质量份数不同的是，所有组分的质量份之和并不受限于100份之限制。
“和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生，例如，A和/或B包括(A和B)和(A或B)；
此外，本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显旨指单数形式。
由于CD4+T细胞、CD8+T细胞与所有疾病具有高度相关性，特别是，CD4+T细胞的比例与CD8+T细胞的比例是临床预后监测的重要指标，而NK细胞和γδT细胞是天然免疫的第一道防线，具有抗肿瘤的重要作用，特别是γδT细胞是肿瘤预后监测及预后好坏判断的最好指标，因此本发明主要针对CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞、γδT细胞进行功能检测。
本发明首先提供一种肿瘤患者免疫细胞功能评估试剂盒，包括：带荧光素标记的抗人CD3抗体、带荧光素标记的抗人CD4抗体、带荧光素标记的抗人CD8抗体、带荧光素标记的抗人CD25抗体、带荧光素标记的抗人CD28抗体、带荧光素标记的抗人CD38抗体、带荧光素标记的抗人CD56抗体、带荧光素标记的抗人CD57抗体、带荧光素标记的抗人CD94抗体、带荧光素标记的抗人CD127抗体、带荧光素标记的抗人CD45RA抗体、带荧光素标记的抗人CCR7抗体、带荧光素标记的抗人HLA-DR抗体、带荧光素标记的抗人PD-1抗体、带荧光素标记的抗人NKP30抗体、带荧光素标记的抗人NKP46抗体、带荧光素标记的抗人NKG2D抗体、带荧光素标记的抗人KIR抗体、带荧光素标记的抗人γδ抗体、带荧光素标记的抗人Vδ2抗体。
本发明的肿瘤患者免疫细胞功能评估试剂盒能够结合流式细胞仪用于对肿瘤患者的免疫细胞进行检测分析，获得44项免疫功能指标，所述44项免疫功能指标包括：
T细胞总比例、辅助性T细胞的比例、杀伤性T细胞的比例、双阳性T细胞的比例、辅助性T细胞与杀伤性T细胞的比值、初始化CD4+T细胞的比例、终末分化CD4+T细胞的比例、中心记忆CD4+T细胞的比例、效应性记忆CD4+T细胞的比例、衰竭CD4+T细胞的比例、功能性CD4+T细胞的比例、调节性T细胞的比例、初始化CD8+T细胞的比例、终末分化CD8+T细胞的比例、中心记忆CD8+T细胞的比例、效应性记忆CD8+T细胞的比例、衰竭CD8+T细胞的比例、功能阻断性CD8+T细胞的比例、功能性CD8+T细胞的比例、总的记忆性CD8+T细胞的比例、回巢性记忆性CD8+T细胞的比例、终末衰老CD8+T细胞的比例、NK T细胞的比例、NK细胞的比例、未成熟NK细胞的比例、成熟NK细胞(Mature NK cells)的比例、未成熟/成熟NK的比值、早期功能阻断性NK细胞的比例、晚期功能阻断性NK细胞的比例、活化NK细胞的比例、常规的杀伤性NK细胞的比例、病毒感染特异杀伤性NK细胞的比例、γδT细胞的比例、Vδ1阳性T细胞的比例、Vδ2阳性T细胞的比例、Vδ1+/Vδ2+的比值、功能性Vδ2阳性T细胞的比例、功能抑制性Vδ2阳性T细胞的比例、常规的杀伤性Vδ2阳性T细胞的比例、病毒感染特异杀伤性Vδ2阳性T细胞的比例、功能性Vδ1阳性T细胞的比例、功能抑制性Vδ1阳性T细胞的比例、常规的杀伤性Vδ1阳性T细胞的比例、病毒感染特异杀伤性Vδ1阳性T细胞的比例。
T细胞总比例为相同体积的人体外周血中T细胞总数与淋巴细胞总数的比值；T细胞的作用在于发挥适应性免疫功能；T细胞总比例的参考范围为45.76％～77.45％。
辅助性T细胞的比例为相同体积的人体外周血中辅助性T细胞数与T细胞总数的比值；辅助性T细胞能够在适应性免疫中发挥关键作用，如抗体产生、巨噬细胞的吞噬功能、杀伤细胞的杀伤作用等需由辅助性T细胞传递信号；辅助性T细胞的比例的参考范围为40％～67％。
杀伤性T细胞的比例为相同体积的人体外周血中杀伤性T细胞数与T细胞总数的比值；杀伤性T细胞能够有效消灭受感染的细胞并且对产生特殊抗原反应的目标细胞进行杀灭；杀伤性T细胞的比例的参考范围为31％～58％。
双阳性T细胞的比例为相同体积的人体外周血中双阳性T细胞数与T细胞总数的比值；双阳性T细胞主要为未分化的胸腺T细胞；双阳性T细胞的比例的参考范围为1％～5％。
辅助性T细胞与杀伤性T细胞的比值(Th/Tc)为相同体积的人体外周血中辅助性T细胞数与杀伤性T细胞数的比值；辅助性T细胞与杀伤性T细胞的比值(Th/Tc)的参考范围为0.57％～2.44％，该比值在免疫功能评估中有重要意义，Th/Tc比值超出上述参考范围时，如无急性感染或过敏，应警惕恶性肿瘤和自身免疫性疾病；比值低于上述参考范围常见于恶性肿瘤患者、遗传性免疫缺陷症患者、艾滋病患者或应用免疫抑制剂者。
初始化CD4+T细胞的比例为相同体积的人体外周血中初始化CD4+T细胞数与CD4+T细胞总数的比值；初始化CD4+T细胞能够对免疫系统从未遇过的病原体进行识别并产生免疫应答产生反应；初始化CD4+T细胞的比例的参考范围为36.3％±15.3％。
终末分化CD4+T细胞的比例为相同体积的人体外周血中终末分化CD4+T细胞数与CD4+T细胞总数的比值；终末分化CD4+T细胞为无分化更新能力的CD4+T细胞；终末分化CD4+T细胞的比例的参考范围为15.3％±1.5％。
中心记忆CD4+T细胞的比例为相同体积的人体外周血中中心记忆CD4+T细胞数与CD4+T细胞总数的比值；中心记忆CD4+T细胞对抗原刺激有快速的反应，对疫苗产生效应尤为重要；中心记忆CD4+T细胞的比例的参考范围为33.8％±15.6％。
效应性记忆CD4+T细胞的比例为相同体积的人体外周血中效应性记忆CD4+T细胞数与CD4+T细胞总数的比值；效应性记忆CD4+T细胞具有效应功能，可快速释放各类炎症因子；效应性记忆CD4+T细胞的比例的参考范围为27.6％～55.9％。
衰竭CD4+T细胞的比例为相同体积的人体外周血中衰竭CD4+T细胞数与CD4+T细胞总数的比值；衰竭CD4+T细胞数与多种自身免疫疾病相关联，比如1型糖尿病、类风湿等；衰竭CD4+T细胞的比例的参考范围为11.96％±8.60％。
功能性CD4+T细胞的比例为相同体积的人体外周血中功能性CD4+T细胞数与CD4+T细胞总数的比值；功能性CD4+T细胞是可活化性CD4+T细胞；功能性CD4+T细胞的比例的参考范围为89.56％±3.06％。
调节性T细胞的比例为相同体积的人体外周血中调节性T细胞数与CD4+T细胞总数的比值；调节性T细胞是维持免疫平衡的重要调节因素，在肿瘤、免疫缺陷、排斥中都起到重要作用；调节性T细胞的比例的参考范围为4.14％±1.85％。
初始化CD8+T细胞的比例为相同体积的人体外周血中初始化CD8+T细胞数与CD8+T细胞总数的比值；初始化CD8+T细胞是细胞免疫治疗的重要细胞群之一；初始化CD8+T细胞的比例的参考范围为35.4％～53.2％。
终末分化CD8+T细胞的比例为相同体积的人体外周血中终末分化CD8+T细胞数与CD8+T细胞总数的比值；终末分化CD8+T细胞是无分化更新功能的CD8细胞；终末分化CD8+T细胞的比例的参考范围为21.2％～40.3％。
中心记忆CD8+T细胞的比例为相同体积的人体外周血中中心记忆CD8+T细胞数与CD8+T细胞总数的比值；中心记忆CD8+T细胞对病毒感染敏感；中心记忆CD8+T细胞的比例的参考范围为4.61％～6.0％。
效应性记忆CD8+T细胞的比例为相同体积的人体外周血中效应性记忆CD8+T细胞数与CD8+T细胞总数的比值；效应性记忆CD8+T细胞具有抗病毒功能，可释放多种抗病毒细胞活素及具有杀伤能力；效应性记忆CD8+T细胞的比例的参考范围为33.1％～56.3％。
衰竭CD8+T细胞的比例为相同体积的人体外周血中衰竭CD8+T细胞数与CD8+T细胞总数的比值；衰竭CD8+T细胞与多种病毒性感染相关联；衰竭CD8+T细胞的比例的参考范围为30％～55％。
功能阻断性CD8+T细胞的比例为相同体积的人体外周血中功能阻断性CD8+T细胞数与CD8+T细胞总数的比值。功能阻断性CD8+T是功能抑制性的CD8+T细胞，特别是与抗肿瘤能力相关，在维持机体免疫功能稳态及建立移植免疫耐受中发挥着重要作用，可作为一些自身免疫性疾病、爱滋病及免疫缺陷的免疫检测指标，比例升高，则免疫效应作用受到抑制。功能阻断性CD8+T细胞的比例的参考范围为16.8％～32％。
功能性CD8+T细胞的比例为相同体积的人体外周血中功能性CD8+T细胞数与CD8+T细胞总数的比值。功能性CD8+T细胞是具有免疫功能活性的CD8+T细胞，能杀伤病病菌感染的靶细胞及肿瘤细胞，在抗肿瘤、抗感染和同种异体移植排斥中发挥重要的效应功能。功能性CD8+T细胞的比例的参考范围为52.5％-70％。
总的记忆性CD8+T细胞的比例为相同体积的人体外周血中总的记忆性CD8+T细胞数与CD8+T细胞总数的比值。总的记忆性CD8+T细胞是可被抗原再刺激并快速激活而起到直接杀伤肿瘤细胞或病菌感染细胞的亚群。总的记忆性CD8+T细胞的比例的参考范围为12.9％～25.8％。
回巢性记忆性CD8+T细胞的比例为相同体积的人体外周血中回巢性记忆性CD8+T细胞数与总的记忆性CD8+T细胞细胞数的比值。回巢性记忆性CD8+T细胞能迁移到二级淋巴器官接受抗原刺激而二次活化为效应细胞，是HIV感染患者的治疗与预后的重要指标。回巢性记忆性CD8+T细胞的比例的参考范围为62.7％～83.3％。
终末衰老CD8+T细胞的比例为相同体积的人体外周血中终末衰老CD8+T细胞数与CD8+T细胞总数的比值。终末衰老CD8+T细胞具有低增殖、易凋亡的特点，其比例升高与其免疫效应下降相关。终末衰老CD8+T细胞的比例的参考范围为5.45％～20.48％。
NK T细胞的比例为相同体积的人体外周血中NK T细胞数与淋巴细胞总数的比值。NK T细胞是具有直接杀伤活性的一类NK细胞。NK T细胞的比例的参考范围为11.71％～33.1％。
NK细胞的比例为相同体积的人体外周血中NK细胞数与淋巴细胞总数的比值。NK细胞是人体重要的免疫细胞，与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有着密切的联系，亦参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生，能够识别靶细胞、杀伤介质。NK细胞的比例的参考范围为6.26％～37.16％。
未成熟NK细胞的比例为相同体积的人体外周血中未成熟NK细胞数与NK细胞总数的比值。未成熟NK细胞是NK细胞的一个亚群，与成熟的NK细胞比，其对靶细胞的杀伤能力较低，但能最高效产生细胞因子如IFN-gamma。未成熟NK细胞的比例的参考范围为5.6～27.8％。
成熟NK细胞的比例为相同体积的人体外周血中成熟NK细胞数与NK细胞总数的比值。成熟NK细胞由不成熟NK细胞分化而来，具强大的杀伤活性，可直接杀伤耙细胞。成熟NK细胞的比例的参考范围为43～82％。
未成熟/成熟NK的比值为未成熟NK细胞数与成熟NK细胞数的比值。该比值跟病情发展及疗效有密切联系，比值升高一般与疗效不佳或病情进展相关。该比值的参考范围为0.068～0.72。
早期功能阻断性NK细胞的比例为相同体积的人体外周血中早期功能阻断性NK细胞数与NK细胞总数的比值。早期功能阻断性NK细胞能够加强NK细胞的杀伤功能。早期功能阻断性NK细胞的比例的参考范围为36.3％～52.7％。
晚期功能阻断性NK细胞的比例为相同体积的人体外周血中晚期功能阻断性NK细胞数与NK细胞总数的比值。晚期功能阻断性NK细胞为调节性NK细胞。晚期功能阻断性NK细胞的比例的参考范围为22％～29％。
活化NK细胞的比例为相同体积的人体外周血中活化NK细胞数与NK细胞总数的比值。活化NK细胞是具有抗肿瘤、抗病毒功能的功能性NK细胞。活化NK细胞的比例的参考范围为25％～53％。
常规的杀伤性NK细胞的比例为相同体积的人体外周血中常规的杀伤性NK细胞数与NK细胞总数的比值。常规的杀伤性NK细胞为抗肿瘤免疫的效应细胞，主要对肿瘤细胞和病菌感染的细胞起杀伤或清除作用。常规的杀伤性NK细胞的比例的参考范围为38.5％～64％。
病毒感染特异杀伤性NK细胞的比例为相同体积的人体外周血中病毒感染特异杀伤性NK细胞数与NK细胞总数的比值。病毒感染特异杀伤性NK细胞与病毒感染直接相关，病毒感染特异杀伤性NK细胞的比例降低与病毒感染、肿瘤进展等相关。病毒感染特异杀伤性NK细胞的比例的参考范围为9.93％～80.85％。
γδT细胞的比例为相同体积的人体外周血中γδT细胞数与T细胞总数的比值。γδT细胞为参与机体免疫的第一道防线，具有一定的非特异性杀伤作用，并且具有广谱的抗肿瘤、抗感染的功能。γδT细胞的比例的参考范围为0.5％～8.2％。
Vδ1阳性T细胞的比例为相同体积的人体外周血中Vδ1阳性T细胞数与γδT细胞总数的比值。Vδ1阳性T细胞是具有免疫抑制、调节功能的γδ细胞亚群。Vδ1阳性T细胞的比例的参考范围为8.2％～24％。
Vδ2阳性T细胞的比例为相同体积的人体外周血中Vδ2阳性T细胞数与γδT细胞总数的比值。Vδ2阳性T细胞是主要发挥抗肿瘤、抗感染作用的γδT细胞亚群。Vδ2阳性T细胞的比例的参考范围为46.8％～72％。
Vδ1+/Vδ2+的比值为Vδ1阳性T细胞数与Vδ2阳性T细胞数的比值。该比值与γδT细胞亚群的功能状态直接相关，比值升高一般表明γδT细胞亚群的功能下降。Vδ1阳性T细胞数与Vδ2阳性T细胞的比值的参考范围为0.12～0.51。
功能性Vδ2阳性T细胞的比例为相同体积的人体外周血中功能性Vδ2阳性T细胞数与γδT细胞总数的比值。该比例与抗肿瘤、抗感染功能直接相关。功能性Vδ2阳性T细胞的比例的参考范围为94.6％～99.8％。
功能抑制性Vδ2阳性T细胞的比例为相同体积的人体外周血中功能抑制性Vδ2阳性T细胞数与Vδ2γδT细胞总数的比值。功能抑制性Vδ2阳性T细胞能够控制细胞过度激活，肿瘤患者中比例升高表明抗肿瘤功能受到抑制。功能抑制性Vδ2阳性T细胞的比例的参考范围为6.4％～38.9％。
常规的杀伤性Vδ2阳性T细胞的比例为相同体积的人体外周血中常规的杀伤性Vδ2阳性T细胞数与Vδ2γδT细胞总数的比值。常规的杀伤性Vδ2阳性T细胞能够发挥抗肿瘤、抗感染作用。常规的杀伤性Vδ2阳性T细胞的比例的参考范围为0～1％。
病毒感染特异杀伤性Vδ2阳性T细胞的比例为相同体积的人体外周血中病毒感染特异杀伤性Vδ2阳性T细胞数与Vδ2γδT细胞总数的比值。病毒感染特异杀伤性Vδ2阳性T细胞与病毒感染直接相关，病毒感染特异杀伤性Vδ2阳性T细胞的比例降低与病毒感染、肿瘤进展等相关，且影响细胞的活化。病毒感染特异杀伤性Vδ2阳性T细胞的比例的参考范围为0～0.8％。
功能性Vδ1阳性T细胞的比例为相同体积的人体外周血中为相同体积的人体外周血中功能性Vδ1阳性T细胞与Vδ1γδT细胞总数的比值。功能性Vδ1阳性T细胞为具有抗肿瘤功能的Vdelta1细胞群。功能性Vδ1阳性T细胞的比例的参考范围为94.6％～99.8％。
功能抑制性Vδ1阳性T细胞的比例为相同体积的人体外周血中功能抑制性Vδ1阳性T细胞数与Vδ1γδT细胞总数的比值。功能抑制性Vδ1阳性T细胞是具有功能抑制性的Vdelta1细胞群，抑制细胞过度活化。功能抑制性Vδ1阳性T细胞的比例的参考范围为8.4％～38.9％。
常规的杀伤性Vδ1阳性T细胞的比例为相同体积的人体外周血中常规的杀伤性Vδ1阳性T细胞数与Vδ1γδT细胞总数的比值。常规的杀伤性Vδ1阳性T细胞是能发挥抗肿瘤、抗感染作用的Vdelta1细胞群。常规的杀伤性Vδ1阳性T细胞的比例的参考范围为0～1％。
病毒感染特异杀伤性Vδ1阳性T细胞的比例为相同体积的人体外周血中人体外周血中病毒感染特异杀伤性Vδ1阳性T细胞数与Vδ1γδT细胞总数的比值。病毒感染特异杀伤性Vδ1阳性T细胞与病毒感染直接相关，比例降低与病毒感染、肿瘤进展等相关。病毒感染特异杀伤性Vδ1阳性T细胞的比例的参考范围为0～9.6％。
具体的，本申请中提到的参考范围均指的是健康人的正常范围。
上述44项免疫功能指标能够比较全面的反映肿瘤患者的免疫功能状态，通过对以上44项免疫功能指标进行分析，若判定人体的免疫功能低下(比如初始化细胞变少、功能性细胞变少、衰竭细胞增多等)，则提示可能需要进行免疫干预，如通过药物、功能食品或生物治疗的方法来提高机体的免疫功能。
为获得上述44项免疫功能指标，首先需要从人体外周血中提取外周血单个核细胞(PBMC)，之后从本试剂盒的所有抗体中分别取一定量，全部与外周血单个核细胞进行混合、孵育，获得细胞检测样品，之后采用流式细胞仪对细胞检测样品进行检测，利用流式细胞仪自带的分析软件或者第三方分析软件对各种免疫细胞的分析结果进行统计分析后，获得上述44项免疫功能指标。
具体的，各免疫细胞群的细胞标志为：
T细胞总群：CD3+；
辅助性T细胞：CD3+CD4+；
杀伤性T细胞：CD3+CD8+；
双阳性T细胞：CD3+CD4+CD8+；
初始化CD4+T细胞：CD3+CD4+CD45RA+CCR7+；
终末分化CD4+T细胞：CD3+CD4+CD45RA+CCR7-；
中心记忆CD4+T细胞：CD3+CD4+CD45RA-CCR7+；
效应性记忆CD4+T细胞：CD3+CD4+CD45RA-CCR7-；
衰竭CD4+T细胞：CD3+CD4+CD28-；
功能性CD4+T细胞：CD3+CD4+CD28+；
调节性T细胞：CD3+CD4+CD25+CD127-；
初始化CD8+T细胞：CD3+CD8+CCR7+CD45RA+；
终末分化CD8+T细胞：CD3+CD8+CCR7-CD45RA+；
中心记忆CD8+T细胞：CD3+CD8+CCR7+CD45RA-；
效应性记忆CD8+T细胞：CD3+CD8+CCR7-CD45RA-；
衰竭CD8+T细胞：CD3+CD8+CD28-；
功能阻断性CD8+T细胞：CD3+CD8+PD-1+；
功能性CD8+T细胞：CD3+CD8+CD28+；
终末衰老CD8+T细胞：CD3+CD8+CD28-CD57+；
总的记忆性CD8+T细胞：CD3+CD8+HLADR+；
回巢性记忆性CD8+T细胞：CD3+CD8+HLADR+CD38+；
NKT细胞：CD3+CD56+；
NK细胞：CD3-CD56+；
未成熟NK细胞：CD3-CD56+bright；
成熟的NK细胞：CD3-CD56+dim；
早期功能阻断性NK细胞：CD3-CD56+CD94+KIR-；
晚期功能阻断性NK细胞：CD3-CD56+CD94-KIR+；
活化NK细胞：CD3-CD56+NKG2D+；
常规的杀伤性NK细胞：CD3-CD56+NKP30+；
病毒感染特异杀伤性NK细胞：CD3-CD56+NKP46+；
γδT细胞：CD3+γδ+；
Vδ2阳性T细胞：CD3+γδ+Vδ2+；
功能性Vδ2阳性T细胞：CD3+γδ+Vδ2+NKG2D+；
功能抑制性Vδ2阳性T细胞：CD3+γδ+Vδ2+PD1+；
常规的杀伤性Vδ2阳性T细胞：CD3+γδ+Vδ2+NKP30+；
病毒感染特异杀伤性Vδ2阳性T细胞：CD3+γδ+Vδ2+NKP46+；
功能性Vδ1阳性T细胞：CD3+γδ+Vδ1+NKG2D+；
功能抑制性Vδ1阳性T细胞：CD3+γδ+Vδ1+PD1+；
常规的杀伤性Vδ1阳性T细胞：CD3+γδ+Vδ1+NKP30+；
病毒感染特异杀伤性Vδ1阳性T细胞：CD3+γδ+Vδ1+NKP46+。
其中，CD56+bright表示CD56膜蛋白分子表达量高，CD56+dim表示CD56膜蛋白分子表达量低。
上述反应结果中，抗体后面的+代表细胞对该抗体的反应为阳性，抗体后面的-代表细胞对该抗体的反应为阴性，由于各免疫细胞群的标记抗体不同，因此流式细胞仪可以根据不同的反应结果对各细胞亚群进行筛选与分析。
具体的，Vδ1阳性T细胞的计数方式是γδT细胞的数量减去Vδ2阳性T细胞的数量。
优选的，所述抗人CD3抗体、抗人CD4抗体、抗人CD8抗体、抗人CD25抗体、抗人CD28抗体、抗人CD38抗体、抗人CD56抗体、抗人CD57抗体、抗人CD94抗体、抗人CD127抗体、抗人CD45RA抗体、抗人CCR7抗体、抗人HLA-DR抗体、抗人PD-1抗体、抗人NKP30抗体、抗人NKP46抗体、抗人NKG2D抗体、抗人KIR抗体、抗人γδ抗体、抗人Vδ2抗体均为单克隆抗体。这是因为单克隆抗体的特异性好，染色后的荧光强度与抗原表达水平是线性关系，并且单克隆抗体不同生产批次间的差异较小。多克隆抗体虽然可以产生更强的信号，但是特异性差，染色后荧光强度与抗原水平不是线性关系，并且多克隆抗体不同生产批次间的差异很大，因此在流式检测过程中使用单克隆抗体能够保证较高的检测精确度。
可选的，所述抗人CD3抗体、抗人CD4抗体、抗人CD8抗体、抗人CD25抗体、抗人CD28抗体、抗人CD38抗体、抗人CD56抗体、抗人CD57抗体、抗人CD94抗体、抗人CD127抗体、抗人CD45RA抗体、抗人CCR7抗体、抗人HLA-DR抗体、抗人PD-1抗体、抗人NKP30抗体、抗人NKP46抗体、抗人NKG2D抗体、抗人KIR抗体、抗人γδ抗体、抗人Vδ2抗体中的任意一种为粉剂或者液体制剂。
所述粉剂在使用前需要加入适量磷酸盐缓冲液(PBS)进行溶解，所述液体制剂不需溶解，直接使用。所述粉剂与液体制剂均可以置于4℃条件下保存，粉剂还可以置于-20℃条件下保存。
具体的，所述液体制剂中抗体的浓度为0.1-2mg/ml(例如0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml)。
可选的，所述液体制剂的成分包括抗体与磷酸盐缓冲液。
具体的，所述粉剂使用时，将所述粉剂与磷酸盐缓冲液混合得到抗体溶液，所述抗体溶液中抗体的浓度为0.1-2mg/ml(例如0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml)。
可选的，所述抗人CD3抗体、抗人CD4抗体、抗人CD8抗体、抗人CD25抗体、抗人CD28抗体、抗人CD38抗体、抗人CD56抗体、抗人CD57抗体、抗人CD94抗体、抗人CD127抗体、抗人CD45RA抗体、抗人CCR7抗体、抗人HLA-DR抗体、抗人PD-1抗体、抗人NKP30抗体、抗人NKP46抗体、抗人NKG2D抗体、抗人KIR抗体、抗人γδ抗体、抗人Vδ2抗体均采用抗体试剂管封装。
优选的，所述抗体试剂管为透光率在10％以下的棕色塑料管；更优选的，所述抗体试剂管的透光率为零，即完全不透光。
可选的，所述抗体试剂管中盛装的抗体为液体制剂时，所述抗体试剂管中抗体的体积为0.5ml-5ml，例如0.5ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml等，该抗体试剂管中的抗体的使用次数为50-500次。
可选的，所述抗人CD3抗体、抗人CD4抗体、抗人CD8抗体、抗人CD25抗体、抗人CD28抗体、抗人CD38抗体、抗人CD56抗体、抗人CD57抗体、抗人CD94抗体、抗人CD127抗体、抗人CD45RA抗体、抗人CCR7抗体、抗人HLA-DR抗体、抗人PD-1抗体、抗人NKP30抗体、抗人NKP46抗体、抗人NKG2D抗体、抗人KIR抗体、抗人γδ抗体、抗人Vδ2抗体均为液体制剂，液体制剂使用起来更为方便，能够省去粉剂使用前的溶解步骤，并且能避免粉剂溶解不均匀时导致的检测误差问题。
能够理解的是，粉剂形式的抗体虽然使用起来比较繁琐，需要增加溶解的步骤，但是相较于液体制剂形式的抗体来说，粉剂形式的抗体的保质期更长。
当所述抗人CD3抗体、抗人CD4抗体、抗人CD8抗体、抗人CD25抗体、抗人CD28抗体、抗人CD38抗体、抗人CD56抗体、抗人CD57抗体、抗人CD94抗体、抗人CD127抗体、抗人CD45RA抗体、抗人CCR7抗体、抗人HLA-DR抗体、抗人PD-1抗体、抗人NKP30抗体、抗人NKP46抗体、抗人NKG2D抗体、抗人KIR抗体、抗人γδ抗体、抗人Vδ2抗体中的至少一种为粉剂时，所述肿瘤患者免疫细胞功能评估试剂盒还包括磷酸盐缓冲液(PBS)，所述磷酸盐缓冲液可置于试剂瓶中。通过提供磷酸盐缓冲液，为使用者节约了配制磷酸盐缓冲液的时间，使抗体的使用更加便捷。
可选的，所述抗人CD3抗体、抗人CD4抗体、抗人CD8抗体、抗人CD25抗体、抗人CD28抗体、抗人CD38抗体、抗人CD56抗体、抗人CD57抗体、抗人CD94抗体、抗人CD127抗体、抗人CD45RA抗体、抗人CCR7抗体、抗人HLA-DR抗体、抗人PD-1抗体、抗人NKP30抗体、抗人NKP46抗体、抗人NKG2D抗体、抗人KIR抗体、抗人γδ抗体、抗人Vδ2抗体的荧光素标记选自PerCP-Cy5.5、BV510、FITC、AF647、PE-Cy7、BV421、PE、AF647、APC-H7、BB515。
本发明还提供一种肿瘤患者免疫细胞功能评估方法，包括如下步骤：
步骤1、提供上文所述的肿瘤患者免疫细胞功能评估试剂盒；
从2ml-10ml(例如2ml、4ml、6ml、8ml、10ml)人体外周血中提取外周血单个核细胞(PBMC)。
由于所述肿瘤患者免疫细胞功能评估试剂盒的具体内容已在上文进行详细描述，因此此处不再赘述。
可选的，从人体外周血中提取外周血单个核细胞(PBMC)的方法包括如下步骤：
1)将2ml-10ml人体外周血的全血标本加入离心管内；
2)在全血标本中加入等体积的磷酸盐缓冲液(PBS)，将PBS+全血标本上下摇动混均匀，得到标本稀释液；
3)取新的15ml离心管，加入FICOLL液与标本稀释液，通常按照FICOLL液与标本稀释液的体积比1:1的比例添加；
4)将离心管倾斜45°，用1000μL枪头贴壁将标本稀释液小心加入离心管内；
5)以2000rpm转速离心20min；
6)采用1000μl枪头吸掉少许上层黄色血清，后吸白色层细胞至新的离心管(不能吸到红细胞)；
7)取等体积的磷酸盐缓冲液(PBS)以1500rpm转速离心15min；
8)倒掉PBS，将离心管倒置在纸上吸水；
9)在离心管中加入3ml红细胞裂解液，吹打均匀后裂解5min，期间不时上下颠倒混匀；
10)以1000rpm转速离心5min；
11)倒掉红细胞裂解液，将离心管倒置在纸上吸水；
12)加入5ml PBS，以1000rpm转速离心5min；
13)倒掉PBS，白色沉淀即为外周血单个核细胞(PBMC)。
步骤2、当所述肿瘤患者免疫细胞功能评估试剂盒中的所有抗体均为液体制剂时，从所有抗体中分别取1μl-5μl(例如1μl、2μl、3μl、4μl、5μl)，全部与所述外周血单个核细胞进行混合，在2℃-6℃(例如2℃、3℃、4℃、5℃、6℃，优选为4℃)条件下避光孵育10分钟至30分钟(例如10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟)，得到细胞检测样本；
当所述肿瘤患者免疫细胞功能评估试剂盒中至少有一种抗体为粉剂时，首先采用适量磷酸盐缓冲液(PBS)将粉剂溶解为抗体溶液，之后从所有液体形式的抗体中分别取1μl-5μl(例如1μl、2μl、3μl、4μl、5μl)，全部与所述外周血单个核细胞进行混合，在2℃-6℃(例如2℃、3℃、4℃、5℃、6℃，优选为4℃)条件下避光孵育10分钟至30分钟(例如10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟)，得到细胞检测样本。
具体的，所述避光的条件指的是光照强度在0.2lux以下的环境。
具体的，所述液体制剂中抗体的浓度为0.1-2mg/ml；所述粉剂与磷酸盐缓冲液混合后得到的抗体溶液中抗体的浓度为0.1-2mg/ml。
步骤3、采用流式细胞仪对所述细胞检测样本进行检测分析。
综上所述，本发明的肿瘤患者免疫细胞功能评估试剂盒能够结合流式细胞仪用于对肿瘤患者的免疫细胞功能进行综合评估，使用方便，对人体安全。本发明的肿瘤患者免疫细胞功能评估方法能够对肿瘤患者的免疫细胞功能进行综合评估，操作步骤简单，操作过程安全。
由于本发明中所涉及的各工艺参数的数值范围在上述实施例中不可能全部体现，但本领域的技术人员完全可以想象到只要落入上述该数值范围内的任何数值均可实施本发明，当然也包括若干项数值范围内具体值的任意组合。此处，出于篇幅的考虑，省略了给出某一项或多项数值范围内具体值的实施例，此不应当视为本发明的技术方案的公开不充分。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式选择等，落在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种肿瘤患者免疫细胞功能评估试剂盒，其特征在于，包括：抗人CD3抗体、抗人CD4抗体、抗人CD8抗体、抗人CD25抗体、抗人CD28抗体、抗人CD38抗体、抗人CD56抗体、抗人CD57抗体、抗人CD94抗体、抗人CD127抗体、抗人CD45RA抗体、抗人CCR7抗体、抗人HLA-DR抗体、抗人PD-1抗体、抗人NKP30抗体、抗人NKP46抗体、抗人NKG2D抗体、抗人KIR抗体、抗人γδ抗体、抗人Vδ2抗体。
2.如权利要求1所述的肿瘤患者免疫细胞功能评估试剂盒，其特征在于，所述抗人CD3抗体、抗人CD4抗体、抗人CD8抗体、抗人CD25抗体、抗人CD28抗体、抗人CD38抗体、抗人CD56抗体、抗人CD57抗体、抗人CD94抗体、抗人CD127抗体、抗人CD45RA抗体、抗人CCR7抗体、抗人HLA-DR抗体、抗人PD-1抗体、抗人NKP30抗体、抗人NKP46抗体、抗人NKG2D抗体、抗人KIR抗体、抗人γδ抗体、抗人Vδ2抗体均为单克隆抗体。
3.如权利要求1所述的肿瘤患者免疫细胞功能评估试剂盒，其特征在于，所述抗人CD3抗体、抗人CD4抗体、抗人CD8抗体、抗人CD25抗体、抗人CD28抗体、抗人CD38抗体、抗人CD56抗体、抗人CD57抗体、抗人CD94抗体、抗人CD127抗体、抗人CD45RA抗体、抗人CCR7抗体、抗人HLA-DR抗体、抗人PD-1抗体、抗人NKP30抗体、抗人NKP46抗体、抗人NKG2D抗体、抗人KIR抗体、抗人γδ抗体、抗人Vδ2抗体中的任意一种为粉剂或者液体制剂。
4.如权利要求3所述的肿瘤患者免疫细胞功能评估试剂盒，其特征在于，所述抗人CD3抗体、抗人CD4抗体、抗人CD8抗体、抗人CD25抗体、抗人CD28抗体、抗人CD38抗体、抗人CD56抗体、抗人CD57抗体、抗人CD94抗体、抗人CD127抗体、抗人CD45RA抗体、抗人CCR7抗体、抗人HLA-DR抗体、抗人PD-1抗体、抗人NKP30抗体、抗人NKP46抗体、抗人NKG2D抗体、抗人KIR抗体、抗人γδ抗体、抗人Vδ2抗体均采用抗体试剂管封装，所述抗体试剂管为透光率在10％以下的棕色塑料管。
5.如权利要求4所述的肿瘤患者免疫细胞功能评估试剂盒，其特征在于，所述抗体试剂管的透光率为零，即完全不透光。
6.如权利要求4所述的肿瘤患者免疫细胞功能评估试剂盒，其特征在于，所述抗体试剂管中盛装的抗体为液体制剂时，所述抗体试剂管中抗体的体积为0.5ml-5ml。
7.如权利要求1所述的肿瘤患者免疫细胞功能评估试剂盒，其特征在于，所述抗人CD3抗体、抗人CD4抗体、抗人CD8抗体、抗人CD25抗体、抗人CD28抗体、抗人CD38抗体、抗人CD56抗体、抗人CD57抗体、抗人CD94抗体、抗人CD127抗体、抗人CD45RA抗体、抗人CCR7抗体、抗人HLA-DR抗体、抗人PD-1抗体、抗人NKP30抗体、抗人NKP46抗体、抗人NKG2D抗体、抗人KIR抗体、抗人γδ抗体、抗人Vδ2抗体均为液体制剂。
8.如权利要求1所述的肿瘤患者免疫细胞功能评估试剂盒，其特征在于，所述抗人CD3抗体、抗人CD4抗体、抗人CD8抗体、抗人CD25抗体、抗人CD28抗体、抗人CD38抗体、抗人CD56抗体、抗人CD57抗体、抗人CD94抗体、抗人CD127抗体、抗人CD45RA抗体、抗人CCR7抗体、抗人HLA-DR抗体、抗人PD-1抗体、抗人NKP30抗体、抗人NKP46抗体、抗人NKG2D抗体、抗人KIR抗体、抗人γδ抗体、抗人Vδ2抗体中的至少一种为粉剂，所述肿瘤患者免疫细胞功能评估试剂盒还包括磷酸盐缓冲液。
9.如权利要求1所述的肿瘤患者免疫细胞功能评估试剂盒，其特征在于，所述抗人CD3抗体、抗人CD4抗体、抗人CD8抗体、抗人CD25抗体、抗人CD28抗体、抗人CD38抗体、抗人CD56抗体、抗人CD57抗体、抗人CD94抗体、抗人CD127抗体、抗人CD45RA抗体、抗人CCR7抗体、抗人HLA-DR抗体、抗人PD-1抗体、抗人NKP30抗体、抗人NKP46抗体、抗人NKG2D抗体、抗人KIR抗体、抗人γδ抗体、抗人Vδ2抗体的荧光素标记选自PerCP-Cy5.5、BV510、FITC、AF647、PE-Cy7、BV421、PE、AF647、APC-H7、BB515。
10.一种肿瘤患者免疫细胞功能评估方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、提供如权利要求1至权利要求9中任一项所述的肿瘤患者免疫细胞功能评估试剂盒；
从2ml-10ml人体外周血中提取外周血单个核细胞；
步骤2、当所述肿瘤患者免疫细胞功能评估试剂盒中的所有抗体均为液体制剂时，从所有抗体中分别取1μl-5μl，全部与所述外周血单个核细胞进行混合，在2℃-6℃条件下避光孵育10分钟至30分钟，得到细胞检测样本；
当所述肿瘤患者免疫细胞功能评估试剂盒中至少有一种抗体为粉剂时，首先采用磷酸盐缓冲液将粉剂溶解为抗体溶液，之后从所有液体形式的抗体中分别取1μl-5μl，全部与所述外周血单个核细胞进行混合，在2℃-6℃条件下避光孵育10分钟至30分钟，得到细胞检测样本；
所述液体制剂中抗体的浓度为0.1-2mg/ml；所述粉剂与磷酸盐缓冲液混合后得到的抗体溶液中抗体的浓度为0.1-2mg/ml；
步骤3、采用流式细胞仪对所述细胞检测样本进行检测分析。
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