CN109254148A - 人体外周血t细胞免疫功能精简评估试剂盒及评估方法 - Google Patents

人体外周血t细胞免疫功能精简评估试剂盒及评估方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种人体外周血T细胞免疫功能精简评估试剂盒及评估方法。本发明的人体外周血T细胞免疫功能精简评估试剂盒包括：带第一荧光素标记的抗人CD3抗体、带第二荧光素标记的抗人CD25抗体、带第三荧光素标记的抗人CD4抗体、带第四荧光素标记的抗人CD8抗体、带第五荧光素标记的抗人CD45RA抗体、带第六荧光素标记的抗人CCR7抗体、带第七荧光素标记的抗人CD28抗体、带第八荧光素标记的抗人CD127抗体。本发明的人体外周血T细胞免疫功能精简评估试剂盒可用于对人体外周血T细胞的免疫功能进行综合评估，使用方便，且对人体安全。

Description

人体外周血T细胞免疫功能精简评估试剂盒及评估方法
技术领域
本发明涉及医疗领域，尤其涉及一种人体外周血T细胞免疫功能精简评估试剂盒及评估方法。
背景技术
T淋巴细胞来源于骨髓的多能干细胞(胚胎期则来源于卵黄囊和肝)。在人体胚胎期和初生期，骨髓中的一部分多能干细胞或前T细胞迁移到胸腺内，在胸腺激素的诱导下分化成熟，成为具有免疫活性的T细胞。
成熟的T细胞经血流分布至外周免疫器官的胸腺依赖区定居，并可经淋巴管、外周血和组织液等进行再循环，发挥细胞免疫及免疫调节等功能。T细胞的再循环有利于广泛接触进入体内的抗原物质，加强免疫应答，较长期保持免疫记忆。T细胞的细胞膜上有许多不同的标志，主要是表面抗原和表面受体，这些表面标志都是结合在细胞膜上的巨蛋白分子。
人体T细胞的免疫功能与各类疾病的发生、进展均有直接相关性，比如肿瘤的发生、发展过程就是因为人体自身免疫细胞功能长期下调或受到抑制的结果。但是，纵观国内外研究文献发现，目前国际上还没有用于专门评估人体外周血免疫细胞如T细胞功能的方法。目前国内外临床、第三方检测机构评价人体免疫功能的方法还停留在单一细胞的数量与比例等常规指标。比如，医院的血常规仅仅给出了白细胞的数量范围和比例，如CD3细胞的数量与比例、CD4+T细胞的数量与比例等，这些数据对医生进行临床诊断的参考意义不大。
目前，临床和第三方检测机构都没有能够综合评估人体T细胞的免疫功能的方法。
发明内容
本发明的目的首先在于提供一种人体外周血T细胞免疫功能精简评估试剂盒，能够结合流式细胞仪用于对人体外周血T细胞的免疫功能进行综合评估，使用方便、安全。
本发明的目的还在于提供一种人体外周血T细胞免疫功能评估方法，能够对人体外周血T细胞的免疫功能进行综合评估。
为实现以上目的，本发明首先提供一种人体外周血T细胞免疫功能精简评估试剂盒，包括：带第一荧光素标记的抗人CD3抗体、带第二荧光素标记的抗人CD25抗体、带第三荧光素标记的抗人CD4抗体、带第四荧光素标记的抗人CD8抗体、带第五荧光素标记的抗人CD45RA抗体、带第六荧光素标记的抗人CCR7抗体、带第七荧光素标记的抗人CD28抗体、带第八荧光素标记的抗人CD127抗体。
可选的，所述抗人CD3抗体、抗人CD25抗体、抗人CD4抗体、抗人CD8抗体、抗人CD45RA抗体、抗人CCR7抗体、抗人CD28抗体、抗人CD127抗体均为单克隆抗体。
可选的，所述抗人CD3抗体、抗人CD25抗体、抗人CD4抗体、抗人CD8抗体、抗人CD45RA抗体、抗人CCR7抗体、抗人CD28抗体、抗人CD127抗体中的任意一种为粉剂或者液体制剂。
可选的，所述抗人CD3抗体、抗人CD25抗体、抗人CD4抗体、抗人CD8抗体、抗人CD45RA抗体、抗人CCR7抗体、抗人CD28抗体、抗人CD127抗体均采用抗体试剂管封装，所述抗体试剂管为透光率在10％以下的棕色塑料管。
优选的，所述抗体试剂管的透光率为零，即完全不透光。
可选的，所述抗体试剂管中盛装的抗体为液体制剂时，所述抗体试剂管中抗体的体积为0.5ml-2.5ml。
可选的，所述抗人CD3抗体、抗人CD25抗体、抗人CD4抗体、抗人CD8抗体、抗人CD45RA抗体、抗人CCR7抗体、抗人CD28抗体、抗人CD127抗体均为液体制剂。
可选的，所述抗人CD3抗体、抗人CD25抗体、抗人CD4抗体、抗人CD8抗体、抗人CD45RA抗体、抗人CCR7抗体、抗人CD28抗体、抗人CD127抗体中的至少一种为粉剂，所述人体外周血T细胞免疫功能精简评估试剂盒还包括磷酸盐缓冲液。
可选的，所述第一荧光素标记、第二荧光素标记、第三荧光素标记、第四荧光素标记、第五荧光素标记、第六荧光素标记、第七荧光素标记、第八荧光素标记为PerCP-Cy5.5、APC-H7、BV510、PE-Cy7、BV421、AF647、PE、FITC的任意排列组合。
本发明还提供一种人体外周血T细胞免疫功能评估方法，包括如下步骤：
步骤1、提供如上文所述的人体外周血T细胞免疫功能精简评估试剂盒；
从2ml-10ml人体外周血中提取外周血单个核细胞；
步骤2、当所述人体外周血T细胞免疫功能精简评估试剂盒中的所有抗体均为液体制剂时，从所有抗体中分别取1μl-5μl，全部与所述外周血单个核细胞进行混合，在2℃-6℃条件下避光孵育10分钟至30分钟，得到细胞检测样本；
当所述人体外周血T细胞免疫功能精简评估试剂盒中至少有一种抗体为粉剂时，首先采用磷酸盐缓冲液将粉剂溶解为抗体溶液，之后从所有液体形式的抗体中分别取1μl-5μl，全部与所述外周血单个核细胞进行混合，在2℃-6℃条件下避光孵育10分钟至30分钟，得到细胞检测样本；
所述液体制剂中抗体的浓度为0.1-2mg/ml；所述粉剂与磷酸盐缓冲液混合后得到的抗体溶液中抗体的浓度为0.1-2mg/ml；
步骤3、采用流式细胞仪对所述细胞检测样本进行检测分析。
本发明的有益效果：
本发明的人体外周血T细胞免疫功能精简评估试剂盒能够结合流式细胞仪用于对人体外周血T细胞的免疫功能进行综合评估，使用方便，且对人体安全，该试剂盒可用于人体免疫健康管理评价以及相关感染患者的免疫功能评估等多种免疫功能评估项目中。本发明的人体外周血T细胞免疫功能评估方法能够对人体外周血T细胞的免疫功能进行综合评估，操作步骤简单，操作过程安全。
本发明在国际范围内第一次建立了对人体外周血T细胞的免疫功能进行综合评估的方法，采用了多种免疫功能指标对人体外周血T细胞的免疫功能进行综合评估，若判断人体外周血T细胞的免疫功能过低，则提示被检测者采用免疫治疗等干预手段对自身的免疫功能进行提升，提升人体的健康状态。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对本发明范围的限定。
图1展示了采用本发明的人体外周血T细胞免疫功能评估方法对人体外周血T细胞进行检测分析后得到的部分结果。
具体实施方式
如本文所用之术语：
“由……制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
连接词“由……组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由……组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1～5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1～4”、“1～3”、“1～2”、“1～2和4～5”、“1～3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
“质量份”指表示多个组分的质量比例关系的基本计量单位，1份可表示任意的单位质量，如可以表示为1g，也可表示2.689g等。假如我们说A组分的质量份为a份，B组分的质量份为b份，则表示A组分的质量和B组分的质量之比a：b。或者，表示A组分的质量为aK，B组分的质量为bK(K为任意数，表示倍数因子)。不可误解的是，与质量份数不同的是，所有组分的质量份之和并不受限于100份之限制。
“和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生，例如，A和/或B包括(A和B)和(A或B)；
此外，本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显旨指单数形式。
本发明首先提供一种人体外周血T细胞免疫功能精简评估试剂盒，包括：带第一荧光素标记的抗人CD3抗体、带第二荧光素标记的抗人CD25抗体、带第三荧光素标记的抗人CD4抗体、带第四荧光素标记的抗人CD8抗体、带第五荧光素标记的抗人CD45RA抗体、带第六荧光素标记的抗人CCR7抗体、带第七荧光素标记的抗人CD28抗体、带第八荧光素标记的抗人CD127抗体。
本发明的人体外周血T细胞免疫功能精简评估试剂盒能够结合流式细胞仪检测用于对人体外周血中的T细胞进行检测分析，获得17项免疫功能指标，所述17项免疫功能指标包括：
T细胞总比例、辅助性T细胞(CD4+T细胞)的比例、杀伤性T细胞(CD8+T细胞)的比例、双阳性T细胞的比例、辅助性T细胞与杀伤性T细胞的比值、初始化CD4+T细胞的比例、终末分化CD4+T细胞的比例、中心记忆CD4+T细胞的比例、效应性记忆CD4+T细胞的比例、衰竭CD4+T细胞的比例、功能性CD4+T细胞的比例、调节性T细胞的比例、初始化CD8+T细胞的比例、终末分化CD8+T细胞的比例、中心记忆CD8+T细胞的比例、效应性记忆CD8+T细胞的比例、衰竭CD8+T细胞的比例。
T细胞总比例为相同体积的人体外周血中T细胞总数与淋巴细胞总数的比值；T细胞的作用在于发挥适应性免疫功能；T细胞总比例的参考范围为45.76％～77.45％。
辅助性T细胞的比例为相同体积的人体外周血中辅助性T细胞数与T细胞总数的比值；辅助性T细胞能够在适应性免疫中发挥关键作用，如抗体产生、巨噬细胞的吞噬功能、杀伤细胞的杀伤作用等需由辅助性T细胞传递信号；辅助性T细胞的比例的参考范围为40％～67％。
杀伤性T细胞的比例为相同体积的人体外周血中杀伤性T细胞数与T细胞总数的比值；杀伤性T细胞能够有效消灭受感染的细胞并且对产生特殊抗原反应的目标细胞进行杀灭；杀伤性T细胞的比例的参考范围为31％～58％。
双阳性T细胞的比例为相同体积的人体外周血中双阳性T细胞数与T细胞总数的比值；双阳性T细胞主要为未分化的胸腺T细胞；双阳性T细胞的比例的参考范围为1％～5％。
辅助性T细胞与杀伤性T细胞的比值(Th/Tc)为相同体积的人体外周血中辅助性T细胞数与杀伤性T细胞数的比值；辅助性T细胞与杀伤性T细胞的比值(Th/Tc)的参考范围为0.57％～2.44％，该比值在免疫功能评估中有重要意义，Th/Tc比值超出上述参考范围时，如无急性感染或过敏，应警惕恶性肿瘤和自身免疫性疾病；比值低于上述参考范围常见于恶性肿瘤患者、遗传性免疫缺陷症患者、艾滋病患者或应用免疫抑制剂者。
初始化CD4+T细胞的比例为相同体积的人体外周血中初始化CD4+T细胞数与CD4+T细胞总数的比值；初始化CD4+T细胞能够对免疫系统从未遇过的病原体进行识别并产生免疫应答产生反应；初始化CD4+T细胞的比例的参考范围为36.3％±15.3％。
终末分化CD4+T细胞的比例为相同体积的人体外周血中终末分化CD4+T细胞数与CD4+T细胞总数的比值；终末分化CD4+T细胞为无分化更新能力的CD4+T细胞；终末分化CD4+T细胞的比例的参考范围为15.3％±1.5％。
中心记忆CD4+T细胞的比例为相同体积的人体外周血中中心记忆CD4+T细胞数与CD4+T细胞总数的比值；中心记忆CD4+T细胞对抗原刺激有快速的反应，对疫苗产生效应尤为重要；中心记忆CD4+T细胞的比例的参考范围为33.8％±15.6％。
效应性记忆CD4+T细胞的比例为相同体积的人体外周血中效应性记忆CD4+T细胞数与CD4+T细胞总数的比值；效应性记忆CD4+T细胞具有效应功能，可快速释放各类炎症因子；效应性记忆CD4+T细胞的比例的参考范围为27.6％～55.9％。
衰竭CD4+T细胞的比例为相同体积的人体外周血中衰竭CD4+T细胞数与CD4+T细胞总数的比值；衰竭CD4+T细胞数与多种自身免疫疾病相关联，比如1型糖尿病、类风湿等；衰竭CD4+T细胞的比例的参考范围为11.96％±8.60％。
功能性CD4+T细胞的比例为相同体积的人体外周血中功能性CD4+T细胞数与CD4+T细胞总数的比值；功能性CD4+T细胞是可活化性CD4+T细胞；功能性CD4+T细胞的比例的参考范围为89.56％±3.06％。
调节性T细胞的比例为相同体积的人体外周血中调节性T细胞数与CD4+T细胞总数的比值；调节性T细胞是维持免疫平衡的重要调节因素，在肿瘤、免疫缺陷、排斥中都起到重要作用；调节性T细胞的比例的参考范围为4.14％±1.85％。
初始化CD8+T细胞的比例为相同体积的人体外周血中初始化CD8+T细胞数与CD8+T细胞总数的比值；初始化CD8+T细胞是细胞免疫治疗的重要细胞群之一；初始化CD8+T细胞的比例的参考范围为35.4％～53.2％。
终末分化CD8+T细胞的比例为相同体积的人体外周血中终末分化CD8+T细胞数与CD8+T细胞总数的比值；终末分化CD8+T细胞是无分化更新功能的CD8细胞；终末分化CD8+T细胞的比例的参考范围为21.2％～40.3％。
中心记忆CD8+T细胞的比例为相同体积的人体外周血中中心记忆CD8+T细胞数与CD8+T细胞总数的比值；中心记忆CD8+T细胞对病毒感染敏感；中心记忆CD8+T细胞的比例的参考范围为4.61％～6.0％。
效应性记忆CD8+T细胞的比例为相同体积的人体外周血中效应性记忆CD8+T细胞数与CD8+T细胞总数的比值；效应性记忆CD8+T细胞具有抗病毒功能，可释放多种抗病毒细胞活素及具有杀伤能力；效应性记忆CD8+T细胞的比例的参考范围为33.1％～56.3％。
衰竭CD8+T细胞的比例为相同体积的人体外周血中衰竭CD8+T细胞数与CD8+T细胞总数的比值；衰竭CD8+T细胞数与多种病毒性感染相关联；衰竭CD8+T细胞的比例的参考范围为30％～55％。
由于辅助性T细胞即为CD4+T细胞，杀伤性T细胞即为CD8+T细胞，因此上述内容中辅助性T细胞数与CD4+T细胞总数相同，杀伤性T细胞数与CD8+T细胞总数相同。
具体的，本申请中提到的参考范围均指的是健康人的正常范围。
上述17项免疫功能指标能够比较全面的反映人体外周血T细胞的免疫功能状态，通过对以上17项免疫功能指标进行分析，若判定人体的免疫功能低下(比如初始化CD4+T细胞与初始化CD8+T细胞变少，功能性CD4+T细胞与功能性CD8+T细胞变少，衰竭CD4+T细胞与衰竭CD8+T细胞增多等)，则提示可能需要进行免疫干预，如通过药物、功能食品或生物治疗的方法来提高机体的免疫功能。
为获得上述17项免疫功能指标，首先需要从人体外周血中提取外周血单个核细胞(PBMC)，之后从本试剂盒的所有抗体中分别取一定量，全部与外周血单个核细胞进行混合、孵育，获得细胞检测样品，之后采用流式细胞仪对细胞检测样品进行检测，利用流式细胞仪自带的分析软件或者第三方分析软件对各种免疫细胞的分析结果进行统计分析后，获得上述17项免疫功能指标。
具体的，外周血单个核细胞(PBMC)包括淋巴细胞、单核细胞(monocyte)、树突状细胞和其它少量细胞(造血干细胞等)。本发明中，将由外周血单个核细胞与抗体孵育后得到的细胞检测样品进入流式细胞仪分析后，可以根据细胞的分布区域、密度等参数判断出淋巴细胞的集合的边界，这是业界公认的判定标准，也即是说，对淋巴细胞的总数的判定不需要通过抗体标记即可实现。
可以理解的是，淋巴细胞包括T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞。本发明的试剂盒仅针对T细胞的免疫功能进行评估。
具体的，各免疫细胞群的细胞标志为：
T细胞总群：CD3+；
辅助性T细胞：CD3+CD4+；
杀伤性T细胞：CD3+CD8+；
双阳性T细胞：CD3+CD4+CD8+；
初始化CD4+T细胞：CD3+CD4+CD45RA+CCR7+；
终末分化CD4+T细胞：CD3+CD4+CD45RA+CCR7-；
中心记忆CD4+T细胞：CD3+CD4+CD45RA-CCR7+；
效应性记忆CD4+T细胞：CD3+CD4+CD45RA-CCR7-；
衰竭CD4+T细胞：CD3+CD4+CD28-；
功能性CD4+T细胞：CD3+CD4+CD28+；
调节性T细胞：CD3+CD4+CD25+CD127-；
初始化CD8+T细胞：CD3+CD8+CCR7+CD45RA+；
终末分化CD8+T细胞：CD3+CD8+CCR7-CD45RA+；
中心记忆CD8+T细胞：CD3+CD8+CCR7+CD45RA-；
效应性记忆CD8+T细胞：CD3+CD8+CCR7-CD45RA-；
衰竭CD8+T细胞：CD3+CD8+CD28-。
上述反应结果中，抗体后面的+代表细胞对该抗体的反应为阳性，抗体后面的-代表细胞对该抗体的反应为阴性，由于各免疫细胞群的标记抗体不同，因此流式细胞仪可以根据不同的反应结果对各细胞亚群进行筛选与分析。
优选的，所述抗人CD3抗体、抗人CD25抗体、抗人CD4抗体、抗人CD8抗体、抗人CD45RA抗体、抗人CCR7抗体、抗人CD28抗体、抗人CD127抗体均为单克隆抗体。这是因为单克隆抗体的特异性好，染色后的荧光强度与抗原表达水平是线性关系，并且单克隆抗体不同生产批次间的差异较小。多克隆抗体虽然可以产生更强的信号，但是特异性差，染色后荧光强度与抗原水平不是线性关系，并且多克隆抗体不同生产批次间的差异很大，因此在流式检测过程中使用单克隆抗体能够保证较高的检测精确度。
可选的，所述抗人CD3抗体、抗人CD25抗体、抗人CD4抗体、抗人CD8抗体、抗人CD45RA抗体、抗人CCR7抗体、抗人CD28抗体、抗人CD127抗体中的任意一种为粉剂或者液体制剂。
所述粉剂在使用前需要加入适量磷酸盐缓冲液(PBS)进行溶解，所述液体制剂不需溶解，直接使用。所述粉剂与液体制剂均可以置于4℃条件下保存，粉剂还可以置于-20℃条件下保存。
具体的，所述液体制剂中抗体的浓度为0.1-2mg/ml(例如0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml)。
可选的，所述液体制剂的成分包括抗体与磷酸盐缓冲液。
具体的，所述粉剂使用时，将所述粉剂与磷酸盐缓冲液混合得到抗体溶液，所述抗体溶液中抗体的浓度为0.1-2mg/ml(例如0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml)。
可选的，所述抗人CD3抗体、抗人CD25抗体、抗人CD4抗体、抗人CD8抗体、抗人CD45RA抗体、抗人CCR7抗体、抗人CD28抗体、抗人CD127抗体均采用抗体试剂管封装。
优选的，所述抗体试剂管为透光率在10％以下的棕色塑料管；更优选的，所述抗体试剂管的透光率为零，即完全不透光。
可选的，所述抗体试剂管中盛装的抗体为液体制剂时，所述抗体试剂管中抗体的体积为0.5ml-2.5ml，例如0.5ml、1ml、1.5ml、2ml、2.5ml等，该抗体试剂管中的抗体的使用次数为50-500次。
可选的，所述抗人CD3抗体、抗人CD25抗体、抗人CD4抗体、抗人CD8抗体、抗人CD45RA抗体、抗人CCR7抗体、抗人CD28抗体、抗人CD127抗体均为液体制剂，液体制剂使用起来更为方便，能够省去粉剂使用前的溶解步骤，并且能避免粉剂溶解不均匀时导致的检测误差问题。
能够理解的是，粉剂形式的抗体虽然使用起来比较繁琐，需要增加溶解的步骤，但是相较于液体制剂形式的抗体来说，粉剂形式的抗体的保质期更长。
当所述抗人CD3抗体、抗人CD25抗体、抗人CD4抗体、抗人CD8抗体、抗人CD45RA抗体、抗人CCR7抗体、抗人CD28抗体、抗人CD127抗体中的至少一种为粉剂时，所述人体外周血T细胞免疫功能精简评估试剂盒还包括磷酸盐缓冲液(PBS)，所述磷酸盐缓冲液可置于试剂瓶中。通过提供磷酸盐缓冲液，为使用者节约了配制磷酸盐缓冲液的时间，使抗体的使用更加便捷。
可选的，所述第一荧光素标记、第二荧光素标记、第三荧光素标记、第四荧光素标记、第五荧光素标记、第六荧光素标记、第七荧光素标记、第八荧光素标记为PerCP-Cy5.5、APC-H7、BV510、PE-Cy7、BV421、AF647、PE、FITC的任意排列组合。
可选的，所述第一荧光素标记为PerCP-Cy5.5；所述第二荧光素标记为PE；所述第三荧光素标记为APC-H7；所述第四荧光素标记为BV510；所述第五荧光素标记为FITC；所述第六荧光素标记为AF647；所述第七荧光素标记为PE-Cy7；所述第八荧光素标记为BV421。
具体的，PerCP-Cy5.5发射荧光的峰值为676nm；APC-H7发射荧光的峰值为785nm；BV510发射荧光的峰值为510nm；PE-CY7发射荧光的峰值为785nm；BV421发射荧光的峰值为421nm；AF647发射荧光的峰值为668nm；PE发射荧光的峰值为578nm；FITC发射荧光的峰值为520nm。
其中，虽然APC-H7与PE-CY7发射荧光的峰值相同，但是二者的激发波长不同，因此在流式细胞仪检测中这两种荧光通过不同的检测通道进行检测，检测结果互不影响。
PerCP-Cy5.5是一种复合荧光素，由PerCP和Cy5.5这两种荧光素通过共价结合在一起；PerCP(peridinin chlorophyll protein)的中文名是多甲藻叶绿素蛋白。
PE(Phycoerythrin)的中文名是藻红蛋白。
APC-H7是一种复合荧光素，由APC和H7这两种荧光素通过共价结合在一起；APC(allophycocyanin)的中文名是别藻蓝蛋白。
FITC(fluorescein isothiocyanate)的中文名是异硫氰酸荧光素。
AF(Alexa Fluor)系列染料是由美国生命技术公司(Life technologies)旗下的分子探针公司(Molecular Probes)开发的系列荧光染料，其激发光和发射光光谱覆盖大部分可见光和部分红外线光谱区域，应用广泛。AF系列染料以高亮度、稳定性、仪器兼容性、多种颜色、pH值不敏感以及水溶性为主要特点。AF系列染料包括AF350、AF405、AF4300......AF647、AF680、AF680、AF700在内的多种染料，其中AF647是优于Cy5的替代品，AF647与Cy5偶联物的光谱及滤光器相匹配。在与大多数的蛋白质、寡核苷酸和核酸结合时，AF647相比Cy5荧光吸收光谱波动很小，因此在同等程度的替换时发出的荧光更强。
BV(Brilliant Violent)是诺贝尔奖获得者发明的最新一代的荧光染料，BV染料是有机聚合物，它有很强的光吸收能力(消光系数)和光转换能力(量子产率)，这些物理特性使BV染料的亮度很强，更适合弱表达蛋白的检测。Brilliant Violent荧光素家族，包括：BV421、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV785七个成员，充分利用流式细胞仪405nm激发管，与其它各种荧光素兼容性好。
PE-Cy7是一种复合荧光素，由PE和Cy7这两种荧光素通过共价结合在一起。
本发明还提供一种人体外周血T细胞免疫功能评估方法，包括如下步骤：
步骤1、提供上述人体外周血T细胞免疫功能精简评估试剂盒；
从2ml-10ml(例如2ml、4ml、6ml、8ml、10ml)人体外周血中提取外周血单个核细胞(PBMC)。
由于所述人体外周血T细胞免疫功能精简评估试剂盒的具体内容已在上文进行详细描述，因此此处不再赘述。
可选的，从人体外周血中提取外周血单个核细胞(PBMC)的方法包括如下步骤：
1)将2ml-10ml人体外周血的全血标本加入离心管内；
2)在全血标本中加入等体积的磷酸盐缓冲液(PBS)，将PBS+全血标本上下摇动混均匀，得到标本稀释液；
3)取新的15ml离心管，加入FICOLL液与标本稀释液，通常按照FICOLL液与标本稀释液的体积比1:1的比例添加；
4)将离心管倾斜45°，用1000μL枪头贴壁将标本稀释液小心加入离心管内；
5)以2000rpm转速离心20min；
6)采用1000μl枪头吸掉少许上层黄色血清，后吸白色层细胞至新的离心管(不能吸到红细胞)；
7)取等体积的磷酸盐缓冲液(PBS)以1500rpm转速离心15min；
8)倒掉PBS，将离心管倒置在纸上吸水；
9)在离心管中加入3ml红细胞裂解液，吹打均匀后裂解5min，期间不时上下颠倒混匀；
10)以1000rpm转速离心5min；
11)倒掉红细胞裂解液，将离心管倒置在纸上吸水；
12)加入5ml PBS，以1000rpm转速离心5min；
13)倒掉PBS，白色沉淀即为外周血单个核细胞(PBMC)。
步骤2、当所述人体外周血T细胞免疫功能精简评估试剂盒中的所有抗体均为液体制剂时，从所有抗体中分别取1μl-5μl(例如1μl、2μl、3μl、4μl、5μl)，全部与所述外周血单个核细胞进行混合，在2℃-6℃(例如2℃、3℃、4℃、5℃、6℃，优选为4℃)条件下避光孵育10分钟至30分钟(例如10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟)，得到细胞检测样本；
当所述人体外周血T细胞免疫功能精简评估试剂盒中至少有一种抗体为粉剂时，首先采用适量磷酸盐缓冲液(PBS)将粉剂溶解为抗体溶液，之后从所有液体形式的抗体中分别取1μl-5μl(例如1μl、2μl、3μl、4μl、5μl)，全部与所述外周血单个核细胞进行混合，在2℃-6℃(例如2℃、3℃、4℃、5℃、6℃，优选为4℃)条件下避光孵育10分钟至30分钟(例如10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟)，得到细胞检测样本。
具体的，所述避光的条件指的是光照强度在0.2lux以下的环境。
具体的，所述液体制剂中抗体的浓度为0.1-2mg/ml；所述粉剂与磷酸盐缓冲液混合后得到的抗体溶液中抗体的浓度为0.1-2mg/ml。
步骤3、采用流式细胞仪对所述细胞检测样本进行检测分析。
图1展示了采用本发明的人体外周血T细胞免疫功能评估方法对人体外周血T细胞进行检测分析后得到的部分结果。
图1上方的CD3+CD4+表示图1中的所有细胞均对CD3抗体反应阳性并且对CD4抗体反应阳性，这些细胞即为辅助性T细胞(CD4+T细胞)；图1中还设有由相互垂直交错的横线与纵线组成的十字；
首先，对纵轴的CCR7进行分析，以十字中的横线为分界线，横线上方显示的是CCR7+的结果，横线下方显示的是CCR7-的结果；
其次，对横轴的CD45RA进行分析，以十字中的纵线为分界线，纵线左侧显示的是CD45RA-的结果，纵线右侧显示的是CD45RA+的结果；
也即是说，以十字进行划分，图1中左上方的区域是反应结果为CD3+CD4+CD45RA-CCR7+的区域，即为中心记忆CD4+T细胞的分布区域，图1中的数字显示中心记忆CD4+T细胞在辅助性T细胞中的占比(即中心记忆CD4+T细胞的比例)为4.88％；
图1中右上方的区域是反应结果为CD3+CD4+CD45RA+CCR7+的区域，即初始化CD4+T细胞的分布区域，图1中的数字显示初始化CD4+T细胞在辅助性T细胞中的占比(即初始化CD4+T细胞的比例)为4.88％；
图1中左下方的区域是反应结果为CD3+CD4+CD45RA-CCR7-的区域，即效应性记忆CD4+T细胞的分布区域，图1中的数字显示效应性记忆CD4+T细胞在辅助性T细胞中的占比(即效应性记忆CD4+T细胞的比例)为49.8％；
图1中右下方的区域是反应结果为CD3+CD4+CD45RA+CCR7-的区域，即终末分化CD4+T细胞的分布区域，图1中的数字显示终末分化CD4+T细胞在辅助性T细胞中的占比(即终末分化CD4+T细胞的比例)为34.4％。
综上所述，本发明的人体外周血T细胞免疫功能精简评估试剂盒能够结合流式细胞仪用于对人体外周血T细胞的免疫功能进行综合评估，可用于人体免疫健康管理评价以及相关感染患者的免疫功能评估等多种免疫功能评估项目中。本发明的试剂盒使用方便，且对人体安全。本发明的人体外周血T细胞免疫功能评估方法能够对人体外周血T细胞的免疫功能进行综合评估，操作步骤简单，操作过程安全。
由于本发明中所涉及的各工艺参数的数值范围在上述实施例中不可能全部体现，但本领域的技术人员完全可以想象到只要落入上述该数值范围内的任何数值均可实施本发明，当然也包括若干项数值范围内具体值的任意组合。此处，出于篇幅的考虑，省略了给出某一项或多项数值范围内具体值的实施例，此不应当视为本发明的技术方案的公开不充分。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式选择等，落在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种人体外周血T细胞免疫功能精简评估试剂盒，其特征在于，包括：带第一荧光素标记的抗人CD3抗体、带第二荧光素标记的抗人CD25抗体、带第三荧光素标记的抗人CD4抗体、带第四荧光素标记的抗人CD8抗体、带第五荧光素标记的抗人CD45RA抗体、带第六荧光素标记的抗人CCR7抗体、带第七荧光素标记的抗人CD28抗体、带第八荧光素标记的抗人CD127抗体。
2.如权利要求1所述的人体外周血T细胞免疫功能精简评估试剂盒，其特征在于，所述抗人CD3抗体、抗人CD25抗体、抗人CD4抗体、抗人CD8抗体、抗人CD45RA抗体、抗人CCR7抗体、抗人CD28抗体、抗人CD127抗体均为单克隆抗体。
3.如权利要求1所述的人体外周血T细胞免疫功能精简评估试剂盒，其特征在于，所述抗人CD3抗体、抗人CD25抗体、抗人CD4抗体、抗人CD8抗体、抗人CD45RA抗体、抗人CCR7抗体、抗人CD28抗体、抗人CD127抗体中的任意一种为粉剂或者液体制剂。
4.如权利要求3所述的人体外周血T细胞免疫功能精简评估试剂盒，其特征在于，所述抗人CD3抗体、抗人CD25抗体、抗人CD4抗体、抗人CD8抗体、抗人CD45RA抗体、抗人CCR7抗体、抗人CD28抗体、抗人CD127抗体均采用抗体试剂管封装，所述抗体试剂管为透光率在10％以下的棕色塑料管。
5.如权利要求4所述的人体外周血T细胞免疫功能精简评估试剂盒，其特征在于，所述抗体试剂管的透光率为零，即完全不透光。
6.如权利要求4所述的人体外周血T细胞免疫功能精简评估试剂盒，其特征在于，所述抗体试剂管中盛装的抗体为液体制剂时，所述抗体试剂管中抗体的体积为0.5ml-2.5ml。
7.如权利要求3所述的人体外周血T细胞免疫功能精简评估试剂盒，其特征在于，所述抗人CD3抗体、抗人CD25抗体、抗人CD4抗体、抗人CD8抗体、抗人CD45RA抗体、抗人CCR7抗体、抗人CD28抗体、抗人CD127抗体均为液体制剂。
8.如权利要求3所述的人体外周血T细胞免疫功能精简评估试剂盒，其特征在于，所述抗人CD3抗体、抗人CD25抗体、抗人CD4抗体、抗人CD8抗体、抗人CD45RA抗体、抗人CCR7抗体、抗人CD28抗体、抗人CD127抗体中的至少一种为粉剂，所述人体外周血T细胞免疫功能精简评估试剂盒还包括磷酸盐缓冲液。
9.如权利要求1所述的人体外周血T细胞免疫功能精简评估试剂盒，其特征在于，所述第一荧光素标记、第二荧光素标记、第三荧光素标记、第四荧光素标记、第五荧光素标记、第六荧光素标记、第七荧光素标记、第八荧光素标记为PerCP-Cy5.5、APC-H7、BV510、PE-Cy7、BV421、AF647、PE、FITC的任意排列组合。
10.一种人体外周血T细胞免疫功能评估方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、提供如权利要求1至权利要求9中任一项所述的人体外周血T细胞免疫功能精简评估试剂盒；
从2ml-10ml人体外周血中提取外周血单个核细胞；
步骤2、当所述人体外周血T细胞免疫功能精简评估试剂盒中的所有抗体均为液体制剂时，从所有抗体中分别取1μl-5μl，全部与所述外周血单个核细胞进行混合，在2℃-6℃条件下避光孵育10分钟至30分钟，得到细胞检测样本；
当所述人体外周血T细胞免疫功能精简评估试剂盒中至少有一种抗体为粉剂时，首先采用磷酸盐缓冲液将粉剂溶解为抗体溶液，之后从所有液体形式的抗体中分别取1μl-5μl，全部与所述外周血单个核细胞进行混合，在2℃-6℃条件下避光孵育10分钟至30分钟，得到细胞检测样本；
所述液体制剂中抗体的浓度为0.1-2mg/ml；所述粉剂与磷酸盐缓冲液混合后得到的抗体溶液中抗体的浓度为0.1-2mg/ml；
步骤3、采用流式细胞仪对所述细胞检测样本进行检测分析。
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