CN107727843A

CN107727843A - 检测抗血小板表面受体特异性自身抗体的试剂及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN107727843A
Application number: CN201710949437.3A
Authority: CN
Inventors: 戴克胜
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2017-10-12
Filing date: 2017-10-12
Publication date: 2018-02-23

Abstract

本发明公开了检测抗血小板表面受体特异性自身抗体的试剂及其制备方法与应用，具有较高的特异性和敏感性；采用基因重组和转染的方法使CHO细胞表达人血小板特异性受体膜糖蛋白GP Ib‑IX和/或GP IIb/IIIa受体，将特异性膜糖蛋白受体表达阳性的CHO细胞与待测血清共孵育，最后加入荧光素标记的抗人免疫球蛋白多克隆抗体（二抗）结合。若血清或血浆中存在抗血小板受体特异性抗体则形成“CHO‑膜糖蛋白特异性抗体‑荧光素标记的抗人免疫球蛋白多克隆抗体”复合物结构，表现为CHO细胞荧光强度增高，可用流式细胞仪或荧光显微镜检测。本方法操作简便、特异性膜糖蛋白表达阳性CHO细胞来源充足、特异性和敏感性高、诊断效率高，可应用于基础研究和临床检测。

Description

检测抗血小板表面受体特异性自身抗体的试剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于检测抗血小板表面受体特异性自身抗体检测技术领域，具体涉及检测抗血小板表面受体特异性自身抗体的试剂及其制备方法与应用，具有较高的特异性和敏感性。

背景技术

出血性疾病是临床常见多发病，如若得不到快速诊断和及时干预可能会导致剧烈疼痛、脏器损伤甚至死亡。而全世界仅有约30%的出血性疾病患者得到了确诊。免疫性血小板减少症(immune thrommbocytopenic, ITP)是一种免疫介导的血小板减少综合征，是临床最常见的出血性疾病之一，可发生在各个年龄段，以女性多见。可分为急性和慢性两种类型，成人常见为慢性，儿童以急性多见。临床表现为皮肤多处瘀点、瘀斑，严重时出现颅内出血危及生命。该病的发病率为5～10/10万人口，中国约有150万患者。大部分ITP患者发病机制为患者体内存在抗血小板特异性抗体，抗体与血小板上抗原形成抗原抗体复合物，被免疫性系统识别，免疫细胞攻击血小板导致其被清除。因此，血小板特异性抗体可能是导致血小板数目减少的重要原因。

现有的实验室检测血小板特异性抗体的方法有如下几种，最早的方法是检测ITP患者血清或血浆在体外对正常人血小板功能的影响，这种间接的检测方法敏感性和特异性很低，且干扰因素较多，已淘汰。后来采用酶联免疫法检测血清中抗血小板抗体，该方法敏感性较高，阳性率可达到80-90%，但特异性较差，因该方法检测的是抗血小板抗体，而非特异性吸附到血小板表面的免疫球蛋白。目前单克隆抗体特异性捕获血小板抗原实验（MAIPA）是检测血小板特异性抗体的常用方法；但该方法存在敏感性低、操作繁琐等不足。亟需研发一种操作简便、特异性和敏感性均较高的检测方法。

发明内容

本发明公开了一种检测抗血小板表面受体特异性自身抗体的试剂及其制备方法，用于检测血清或血浆中游离血小板表面受体特异性自身抗体，具有较高特异性和敏感性，且操作简便，有效解决了现有双抗夹心检测法存在的敏感性低、操作繁琐等不足。

本发明试剂盒包含表达人血小板特异性受体膜糖蛋白的细胞，这些细胞能够结合血清中抗游离血小板表面受体特异性自身抗体，最后通过荧光标记的二抗显色，即形成细胞-抗原-抗体-二抗复合物，并能够在荧光显微镜及流式细胞仪上应用，从而联合确定ITP（免疫性血小板减少）患者血清中游离的抗GP Ib-IX和/或GP IIb/IIIa抗体，结果可以明确诊断ITP患者亚类，指导用药治疗，也可以作为非疾病诊断指导人们健康生活。

本发明检测用试剂具有较高的敏感性。研究表明，细胞表面表达的蛋白含量比传统ELISA方法包被的抗原量高至少4倍，客观上可以增加该检测方法的敏感性。本发明检测用试剂具有较高的特异性，经检测53例健康献血者以及102例ITP患者，ITP患者组荧光强度高于健康献血者2-3倍，该试剂检测抗GP Ib-IX抗体的敏感性为85.2%，特异性为90.4%；检测抗GP IIb/IIIa抗体的敏感性为91.3%，特异性为95.2%；同时检测抗GP Ib-IX和GP IIb/IIIa抗体的敏感性为86.3%，特异性为95.2%；联合三种细胞同时检测抗GP Ib-IX、GP IIb/IIIa、GP Ib-IX和/或GP IIb/IIIa抗体，与临床符合率可达90%以上。用本试剂盒及检测方法用血量少，只要0.5ml血清；操作简便，不需要裂解血小板；用时较少，整个实验过程需大约2小时；已报道的方法多数采用双抗体夹心法检测与血小板结合的自身抗体，即包被抗体捕获裂解血小板的特异性抗原，若该抗原上结合了特异性自身抗体，则与二抗结合形成复合物，最后显色被检测，这种方法不能检测血清中游离的抗血小板自身抗体，需要制备病人的血小板裂解液，操作繁琐费时，本发明有效解决了这一缺陷。

为达到上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种检测抗血小板表面受体特异性自身抗体的试剂，包括表达人血小板特异性受体膜糖蛋白的细胞以及荧光素标记的抗体。

优选的，所述人血小板特异性受体膜糖蛋白包括GP Ib-IX和/或GP IIb/IIIa；所述细胞包括中国地鼠卵巢细胞；所述荧光素包括异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明或者藻红蛋白；所述荧光素标记的抗体包括荧光素标记的羊抗人、鼠抗人、兔抗人免疫球蛋白多克隆抗体。

上述技术方案中，所述表达人血小板特异性受体膜糖蛋白的细胞的制备方法为，将编码人血小板特异性受体膜糖蛋白的基因片段克隆进质粒载体得到重组质粒；然后将重组质粒转染细胞，得到转染细胞株；然后经过分选与培养得到表达人血小板特异性受体膜糖蛋白的细胞。

优选的，所述编码人血小板特异性受体膜糖蛋白的基因序列包括人血小板膜蛋白GP Ibα亚基基因序列、人血小板膜蛋白GP Ibβ亚基基因序列、人血小板膜蛋白GP IX亚基基因序列、人血小板膜蛋白GP IIb亚基基因序列以及人血小板膜蛋白GPIIIa亚基基因序列中的一种或几种；所述质粒载体包括pcDNA3.3质粒载体。

本发明还公开了一种检测抗血小板表面受体特异性自身抗体的试剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）将编码人血小板特异性受体膜糖蛋白的基因序列克隆进质粒载体得到重组质粒；

（2）将重组质粒转染细胞，得到转染细胞株；

（3）将转染细胞株经过分选与培养得到表达人血小板特异性受体膜糖蛋白的细胞；本发明表达人血小板特异性受体膜糖蛋白的细胞通过多聚甲醛固定后，可长期保持，用于检测；

（4）表达人血小板特异性受体膜糖蛋白的细胞与荧光素标记的抗体组成检测游离抗血小板表面受体特异性自身抗体的试剂，可通过流式细胞仪、荧光显微镜等观察结果。

优选的，所述编码人血小板特异性受体膜糖蛋白的基因序列包括人血小板膜蛋白GP Ibα亚基基因序列、人血小板膜蛋白GP Ibβ亚基基因序列、人血小板膜蛋白GP IX亚基基因序列、人血小板膜蛋白GPIIb亚基基因序列、人血小板膜蛋白GP IIIa亚基基因序列中的一种或几种；所述质粒载体包括pcDNA3.3质粒载体。

本发明进一步公开了上述检测抗血小板表面受体特异性自身抗体的试剂在检测抗血小板表面受体特异性自身抗体中的应用或者在制备检测血小板表面受体特异性自身抗体制剂中的应用。

本发明还公开了上述表达人血小板特异性受体膜糖蛋白的细胞在制备检测抗血小板表面受体特异性自身抗体的试剂中的应用。

本发明还公开了一种检测抗血小板表面受体特异性自身抗体的试剂盒，包括表达人血小板特异性受体膜糖蛋白的细胞、荧光素标记的抗体、缓冲液、封片剂。

本发明进一步公开了上述检测抗血小板表面受体特异性自身抗体的试剂检测血小板表面特异性自身抗体的方法，包括以下步骤，将待检测样本，血清或血浆与表达人血小板特异性受体膜糖蛋白的细胞孵育，然后加入荧光素标记的抗体孵育；然后通过仪器检测完成血小板表面特异性自身抗体的检测，比如通过荧光法或流式细胞术完成游离血小板表面受体特异性自身抗体的检测。

上述技术方案中，通过荧光法检测时，若细胞膜显示绿色荧光则判定为阳性；通过流式细胞学法检测时，若荧光强度超过临界值则判定为阳性。

上述技术方案可以具体包括如下步骤：

DNA片段的获取：合成人类血小板膜蛋白GP Ibα亚基、GP Ibβ亚基、GP IX、GP IIb亚基、GP IIIa亚基基因序列，然后连接在载体 pcDNA3.3 上，构建pcDNA-GP Ibα、pcDNA-GP Ibβ、pcDNA-GP IX、pcDNA-GP IIb和pcDNA-GP IIIa重组质粒，经过酶切和测序鉴定碱基序列准确无误。

细胞转染：采用转染质粒的方法将带目的基因的重组质粒导入CHO细胞中，加入G418筛选混合阳性克隆。在阳性混合克隆的基础上，得到单细胞长出的阳性单克隆，最后获得稳定转染细胞株。

细胞分选与蛋白表达：采用贝克曼库尔特MoFlo XDP 超速流式分选系统对表达阳性细胞进行分选和收集。分选后的细胞用含10%胎牛血清及PS的IMDM培养基进行培养。待细胞后进行下一次分选，总共分选8次，获得了稳定表达细胞株，根据重组质粒的选用可以得到表面表达相应蛋白的细胞，比如实施例的CHO-IbIX、CHO-IIbIIIa和CHO-123。

稳定表达细胞株的保存：消化需要固定的阳性细胞，加入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液4℃固定12h。该保存方法可以持续180天维持细胞目的蛋白表达率不低于80%。

样本血清中游离血小板表面特异性自身抗体检测：固定后表达稳定的细胞（CHO-IbIX、CHO-IIbIIIa和CHO-123）与待测血清孵育，洗涤未结合的抗体，加入FITC-羊抗人IgG孵育。采用荧光显微镜直接观察，若细胞膜显示绿色荧光则判定为阳性，反之则为阴性；还可以采用流式细胞仪检测，若荧光强度超过临界值则判定为阳性，反之则为阴性。

本发明采用基因重组和转染的方法促使CHO（中国地鼠卵巢细胞）表达人血小板特异性糖蛋白GP Ib-IX和/或GP IIb/IIIa。将特异性膜糖蛋白表达阳性CHO与待测血清共孵育，最后加入异硫氰酸荧光素标记的羊抗人免疫球蛋白多克隆抗体（二抗）结合。若血清中存在抗血小板特异性抗体则形成“CHO-膜糖蛋白特异性抗体-异硫氰酸荧光素标记的羊抗人免疫球蛋白多克隆抗体”复合物结构，表现为CHO细胞绿色荧光强度增高。本方法操作简便、特异性膜糖蛋白表达阳性CHO细胞来源充足、特异性和敏感性高、诊断效率高，可应用于基础研究和临床诊断实验。

附图说明

图1为实施例一重组质粒的酶切结果图；

图2为实施例一阳性细胞株分选结果图；

图3为实施例一流式细胞术分析细胞表面特异性蛋白表达情况图；

图4为实施例二中血清样本荧光图；

图5为实施例二中ROC曲线图；

图6为实施例二中流式细胞学方法检测结果图。

具体实施方式

实施例一检测游离抗血小板表面受体特异性自身抗体的试剂的制备

DNA片段的获取

从NCBI数据库中获得人类血小板膜蛋白GP Ibα亚基，序列登录号：NM_000173.6；人类血小板糖蛋白GP Ibβ亚基，序列登录号：NM_000407.4；人类血小板糖蛋白GP IX，序列登录号：NM_000174.4；人类血小板整合素GP IIb亚基，序列登录号：NM_000419.4；人类血小板整合素GP IIIa亚基，序列登录号：NM_000212.2。提交基因公司合成，然后连接在载体pcDNA3.3 上，构建pcDNA-GP Ibα、pcDNA-GP Ibβ 、pcDNA-GP IX、pcDNA- GPIIb和pcDNA-GPIIIa重组质粒，经过酶切和测序鉴定碱基序列准确无误；pcDNA-GP Ibα、pcDNA-GP Ibβ 、pcDNA-GP IX、pcDNA- GP IIb和pcDNA-GPIIIa重组质粒的测序序列分别如下，亦记载在核苷酸与氨基酸序列表中的第1、第2、第3、第4、第5个DNA序列，酶切结果见附图1，说明合成GPIbα亚基、GP Ibβ亚基、GP IX亚基、GP IIb亚基和GP IIIa亚基 DNA片段后，与pcDNA3.3构建重组质粒，用NheI和HindIII进行质粒酶切鉴定，均可释放与目的基因匹配的DNA片段。

GP1bβ序列 (621 nt):

ATGGGCTCCGGGCCGCGCGGGGCGCTGAGCTTACTGCTCCTGCTGCTGGCCCCGCCGAGCCGCCCGGCCGCAGGTTGCCCGGCGCCCTGTAGCTGCGCGGGGACGCTCGTGGACTGCGGGCGCCGCGGGCTGACTTGGGCCTCGCTGCCGACCGCCTTCCCTGTCGACACAACCGAGCTGGTGCTGACCGGCAACAACCTGACGGCGCTGCCGCCGGGGCTGCTGGACGCGCTGCCCGCGCTGCGCACCGCACACCTGGGCGCCAACCCCTGGCGCTGCGACTGCCGCCTTGTGCCGCTGCGCGCCTGGCTGGCCGGCCGCCCCGAGCGTGCGCCCTACCGCGACCTGCGTTGCGTGGCGCCCCCAGCGCTGCGCGGCCGCCTGCTGCCCTATCTGGCCGAGGACGAGCTGCGCGCCGCTTGCGCTCCCGGCCCGCTCTGCTGGGGGGCGCTGGCGGCGCAGCTTGCGCTGCTGGGCCTTGGGCTGCTGCACGCGTTGCTGCTGGTGCTGCTGCTGTGCCGCCTGCGGAGGCTGCGGGCCCGGGCCCGCGCTCGCGCCGCAGCCCGGCTGTCGCTGACCGACCCGCTGGTGGCCGAGCGAGCCGGAACCGACGAGTCCTGA

GP1bα序列(1959 nt):

ATGCCTCTCCTCCTCTTGCTGCTCCTGCTGCCAAGCCCCTTACACCCCCACCCCATCTGTGAGGTCTCCAAAGTGGCCAGCCACCTAGAAGTGAACTGTGACAAGAGGAATCTGACAGCGCTGCCTCCAGACCTGCCGAAAGACACAACCATCCTCCACCTGAGTGAGAACCTCCTGTACACCTTCTCCCTGGCAACCCTGATGCCTTACACTCGCCTCACTCAGCTGAACCTAGATAGGTGCGAGCTCACCAAGCTCCAGGTCGATGGGACGCTGCCAGTGCTGGGGACCCTGGATCTATCCCACAATCAGCTGCAAAGCCTGCCCTTGCTAGGGCAGACACTGCCTGCTCTCACCGTCCTGGACGTCTCCTTCAACCGGCTGACCTCGCTGCCTCTTGGTGCCCTGCGTGGTCTTGGCGAACTCCAAGAGCTCTACCTGAAAGGCAATGAGCTGAAGACCCTGCCCCCAGGGCTCCTGACGCCCACACCCAAGCTGGAGAAGCTCAGTCTGGCTAACAACAACTTGACTGAGCTCCCCGCTGGGCTCCTGAATGGGCTGGAGAATCTCGACACCCTTCTCCTCCAAGAGAACTCGCTGTATACAATACCAAAGGGCTTTTTTGGGTCCCACCTCCTGCCTTTTGCTTTTCTCCACGGGAACCCCTGGTTATGCAACTGTGAGATCCTCTATTTTCGTCGCTGGCTGCAGGACAATGCTGAAAATGTCTACGTATGGAAGCAAGGTGTGGACGTCAAGGCCATGACCTCTAACGTGGCCAGTGTGCAGTGTGACAATTCAGACAAGTTTCCCGTCTACAAATACCCAGGAAAGGGGTGCCCCACCCTTGGTGATGAAGGTGACACAGACCTATATGATTACTACCCAGAAGAGGACACTGAGGGCGATAAGGTGCGTGCCACAAGGACTGTGGTCAAGTTCCCCACCAAAGCCCATACAACCCCCTGGGGTCTATTCTACTCATGGTCCACTGCTTCTCTAGACAGCCAAATGCCCTCCTCCTTGCATCCAACACAAGAATCCACTAAGGAGCAGACCACATTCCCACCTAGATGGACCCCAAATTTCACACTTCACATGGAATCCATCACATTCTCCAAAACTCCAAAATCCACTACTGAACCAACCCCAAGCCCGACCACCTCAGAGCCCGTCCCGGAGCCCGCCCCAAACATGACCACCCTGGAGCCCACTCCAAGCCCGACCACCCCAGAGCCCACCTCAGAGCCCGCCCCCAGCCCGACCACCCCGGAGCCCACCTCAGAGCCCGCCCCCAGCCCGACCACCCCAGAGCCCACCTCAGAGCCCGCCCCCAGCCCGACCACCCCGGAGCCCACCCCAATCCCGACCATCGCCACAAGCCCGACCATCCTGGTGTCTGCCACAAGCCTGATCACTCCAAAAAGCACATTTTTAACTACCACAAAACCCGTATCACTCTTAGAATCCACCAAAAAAACCATCCCTGAACTTGATCAGCCACCAAAGCTCCGTGGGGTGCTCCAAGGGCATTTGGAGAGCTCCAGAAATGACCCTTTTCTCCACCCCGACTTTTGCTGCCTCCTCCCCCTGGGCTTCTATGTCTTGGGTCTCTTCTGGCTGCTCTTTGCCTCTGTGGTCCTCATCCTGCTGCTGAGCTGGGTTGGGCATGTGAAACCACAGGCCCTGGACTCTGGCCAAGGTGCTGCTCTGACCACAGCCACACAAACCACACACCTGGAGCTGCAGAGGGGACGGCAAGTGACAGTGCCCCGGGCCTGGCTGCTCTTCCTTCGAGGTTCGCTTCCCACTTTCCGCTCCAGCCTCTTCCTGTGGGTACGGCCTAATGGCCGTGTGGGGCCTCTAGTGGCAGGAAGGAGGCCCTCAGCTCTGAGTCAGGGTCGTGGTCAGGACCTGCTGAGCACAGTGAGCATTAGGTACTCTGGCCACAGCCTCTGA

GP IX序列(534 nt):

ATGCCTGCCTGGGGAGCCCTGTTCCTGCTCTGGGCCACAGCAGAGGCCACCAAGGACTGCCCCAGCCCATGTACCTGCCGCGCCCTGGAAACCATGGGGCTGTGGGTGGACTGCAGGGGCCACGGACTCACGGCCCTGCCTGCCCTGCCGGCCCGCACCCGCCACCTTCTGCTGGCCAACAACAGCCTTCAGTCCGTGCCCCCGGGAGCCTTTGACCACCTGCCCCAGCTGCAGACCCTCGATGTGACGCAGAACCCCTGGCACTGTGACTGCAGCCTCACCTATCTGCGCCTCTGGCTGGAGGACCGCACGCCCGAGGCCCTGCTGCAGGTCCGCTGTGCCAGCCCCAGCCTCGCTGCCCATGGCCCGCTGGGCCGGCTGACAGGCTACCAGCTGGGCAGCTGTGGCTGGCAGCTGCAGGCGTCCTGGGTGCGCCCGGGGGTCTTGTGGGACGTGGCGCTGGTCGCCGTGGCCGCGCTGGGCCTGGCTCTTCTGGCTGGCCTGCTGTGTGCCACCACAGAGGCCCTGGATTGA

GP IIIa序列 (2367 nt):

ATGCGAGCGCGGCCGCGGCCCCGGCCGCTCTGGGCGACTGTGCTGGCGCTGGGGGCGCTGGCGGGCGTTGGCGTAGGAGGGCCCAACATCTGTACCACGCGAGGTGTGAGCTCCTGCCAGCAGTGCCTGGCTGTGAGCCCCATGTGTGCCTGGTGCTCTGATGAGGCCCTGCCTCTGGGCTCACCTCGCTGTGACCTGAAGGAGAATCTGCTGAAGGATAACTGTGCCCCAGAATCCATCGAGTTCCCAGTGAGTGAGGCCCGAGTACTAGAGGACAGGCCCCTCAGCGACAAGGGCTCTGGAGACAGCTCCCAGGTCACTCAAGTCAGTCCCCAGAGGATTGCACTCCGGCTCCGGCCAGATGATTCGAAGAATTTCTCCATCCAAGTGCGGCAGGTGGAGGATTACCCTGTGGACATCTACTACTTGATGGACCTGTCTTACTCCATGAAGGATGATCTGTGGAGCATCCAGAACCTGGGTACCAAGCTGGCCACCCAGATGCGAAAGCTCACCAGTAACCTGCGGATTGGCTTCGGGGCATTTGTGGACAAGCCTGTGTCACCATACATGTATATCTCCCCACCAGAGGCCCTCGAAAACCCCTGCTATGATATGAAGACCACCTGCTTGCCCATGTTTGGCTACAAACACGTGCTGACGCTAACTGACCAGGTGACCCGCTTCAATGAGGAAGTGAAGAAGCAGAGTGTGTCACGGAACCGAGATGCCCCAGAGGGTGGCTTTGATGCCATCATGCAGGCTACAGTCTGTGATGAAAAGATTGGCTGGAGGAATGATGCATCCCACTTGCTGGTGTTTACCACTGATGCCAAGACTCATATAGCATTGGACGGAAGGCTGGCAGGCATTGTCCAGCCTAATGACGGGCAGTGTCATGTTGGTAGTGACAATCATTACTCTGCCTCCACTACCATGGATTATCCCTCTTTGGGGCTGATGACTGAGAAGCTATCCCAGAAAAACATCAATTTGATCTTTGCAGTGACTGAAAATGTAGTCAATCTCTATCAGAACTATAGTGAGCTCATCCCAGGGACCACAGTTGGGGTTCTGTCCATGGATTCCAGCAATGTCCTCCAGCTCATTGTTGATGCTTATGGGAAAATCCGTTCTAAAGTAGAGCTGGAAGTGCGTGACCTCCCTGAAGAGTTGTCTCTATCCTTCAATGCCACCTGCCTCAACAATGAGGTCATCCCTGGCCTCAAGTCTTGTATGGGACTCAAGATTGGAGACACGGTGAGCTTCAGCATTGAGGCCAAGGTGCGAGGCTGTCCCCAGGAGAAGGAGAAGTCCTTTACCATAAAGCCCGTGGGCTTCAAGGACAGCCTGATCGTCCAGGTCACCTTTGATTGTGACTGTGCCTGCCAGGCCCAAGCTGAACCTAATAGCCATCGCTGCAACAATGGCAATGGGACCTTTGAGTGTGGGGTATGCCGTTGTGGGCCTGGCTGGCTGGGATCCCAGTGTGAGTGCTCAGAGGAGGACTATCGCCCTTCCCAGCAGGACGAATGCAGCCCCCGGGAGGGTCAGCCCGTCTGCAGCCAGCGGGGCGAGTGCCTCTGTGGTCAATGTGTCTGCCACAGCAGTGACTTTGGCAAGATCACGGGCAAGTACTGCGAGTGTGACGACTTCTCCTGTGTCCGCTACAAGGGGGAGATGTGCTCAGGCCATGGCCAGTGCAGCTGTGGGGACTGCCTGTGTGACTCCGACTGGACCGGCTACTACTGCAACTGTACCACGCGTACTGACACCTGCATGTCCAGCAATGGGCTGCTGTGCAGCGGCCGCGGCAAGTGTGAATGTGGCAGCTGTGTCTGTATCCAGCCGGGCTCCTATGGGGACACCTGTGAGAAGTGCCCCACCTGCCCAGATGCCTGCACCTTTAAGAAAGAATGTGTGGAGTGTAAGAAGTTTGACCGGGGAGCCCTACATGACGAAAATACCTGCAACCGTTACTGCCGTGACGAGATTGAGTCAGTGAAAGAGCTTAAGGACACTGGCAAGGATGCAGTGAATTGTACCTATAAGAATGAGGATGACTGTGTCGTCAGATTCCAGTACTATGAAGATTCTAGTGGAAAGTCCATCCTGTATGTGGTAGAAGAGCCAGAGTGTCCCAAGGGCCCTGACATCCTGGTGGTCCTGCTCTCAGTGATGGGGGCCATTCTGCTCATTGGCCTTGCCGCCCTGCTCATCTGGAAACTCCTCATCACCATCCACGACCGAAAAGAATTCGCTAAATTTGAGGAAGAACGCGCCAGAGCAAAATGGGACACAGCCAACAACCCACTGTATAAAGAGGCCACGTCTACCTTCACCAATATCACGTACCGGGGCACTTAA

GPIIb序列(3120 nt):

ATGGCCAGAGCTTTGTGTCCACTGCAAGCCCTCTGGCTTCTGGAGTGGGTGCTGCTGCTCTTGGGACCTTGTGCTGCCCCTCCAGCCTGGGCCTTGAACCTGGACCCAGTGCAGCTCACCTTCTATGCAGGCCCCAATGGCAGCCAGTTTGGATTTTCACTGGACTTCCACAAGGACAGCCATGGGAGAGTGGCCATCGTGGTGGGCGCCCCGCGGACCCTGGGCCCCAGCCAGGAGGAGACGGGCGGCGTGTTCCTGTGCCCCTGGAGGGCCGAGGGCGGCCAGTGCCCCTCGCTGCTCTTTGACCTCCGTGATGAGACCCGAAATGTAGGCTCCCAAACTTTACAAACCTTCAAGGCCCGCCAAGGACTGGGGGCGTCGGTCGTCAGCTGGAGCGACGTCATTGTGGCCTGCGCCCCCTGGCAGCACTGGAACGTCCTAGAAAAGACTGAGGAGGCTGAGAAGACGCCCGTAGGTAGCTGCTTTTTGGCTCAGCCAGAGAGCGGCCGCCGCGCCGAGTACTCCCCCTGTCGCGGGAACACCCTGAGCCGCATTTACGTGGAAAATGATTTTAGCTGGGACAAGCGTTACTGTGAAGCGGGCTTCAGCTCCGTGGTCACTCAGGCCGGAGAGCTGGTGCTTGGGGCTCCTGGCGGCTATTATTTCTTAGGTCTCCTGGCCCAGGCTCCAGTTGCGGATATTTTCTCGAGTTACCGCCCAGGCATCCTTTTGTGGCACGTGTCCTCCCAGAGCCTCTCCTTTGACTCCAGCAACCCAGAGTACTTCGACGGCTACTGGGGGTACTCGGTGGCCGTGGGCGAGTTCGACGGGGATCTCAACACTACAGAATATGTCGTCGGTGCCCCCACTTGGAGCTGGACCCTGGGAGCGGTGGAAATTTTGGATTCCTACTACCAGAGGCTGCATCGGCTGCGCGGAGAGCAGATGGCGTCGTATTTTGGGCATTCAGTGGCTGTCACTGACGTCAACGGGGATGGGAGGCATGATCTGCTGGTGGGCGCTCCACTGTATATGGAGAGCCGGGCAGACCGAAAACTGGCCGAAGTGGGGCGTGTGTATTTGTTCCTGCAGCCGCGAGGCCCCCACGCGCTGGGTGCCCCCAGCCTCCTGCTGACTGGCACACAGCTCTATGGGCGATTCGGCTCTGCCATCGCACCCCTGGGCGACCTCGACCGGGATGGCTACAATGACATTGCAGTGGCTGCCCCCTACGGGGGTCCCAGTGGCCGGGGCCAAGTGCTGGTGTTCCTGGGTCAGAGTGAGGGGCTGAGGTCACGTCCCTCCCAGGTCCTGGACAGCCCCTTCCCCACAGGCTCTGCCTTTGGCTTCTCCCTTCGAGGTGCCGTAGACATCGATGACAACGGATACCCAGACCTGATCGTGGGAGCTTACGGGGCCAACCAGGTGGCTGTGTACAGAGCTCAGCCAGTGGTGAAGGCCTCTGTCCAGCTACTGGTGCAAGATTCACTGAATCCTGCTGTGAAGAGCTGTGTCCTACCTCAGACCAAGACACCCGTGAGCTGCTTCAACATCCAGATGTGTGTTGGAGCCACTGGGCACAACATTCCTCAGAAGCTATCCCTAAATGCCGAGCTGCAGCTGGACCGGCAGAAGCCCCGCCAGGGCCGGCGGGTGCTGCTGCTGGGCTCTCAACAGGCAGGCACCACCCTGAACCTGGATCTGGGCGGAAAGCACAGCCCCATCTGCCACACCACCATGGCCTTCCTTCGAGATGAGGCAGACTTCCGGGACAAGCTGAGCCCCATTGTGCTCAGCCTCAATGTGTCCCTACCGCCCACGGAGGCTGGAATGGCCCCTGCTGTCGTGCTGCATGGAGACACCCATGTGCAGGAGCAGACACGAATCGTCCTGGACTGTGGGGAAGATGACGTATGTGTGCCCCAGCTTCAGCTCACTGCCAGCGTGACGGGCTCCCCGCTCCTAGTTGGGGCAGATAATGTCCTGGAGCTGCAGATGGACGCAGCCAACGAGGGCGAGGGGGCCTATGAAGCAGAGCTGGCCGTGCACCTGCCCCAGGGCGCCCACTACATGCGGGCCCTAAGCAATGTCGAGGGCTTTGAGAGACTCATCTGTAATCAGAAGAAGGAGAATGAGACCAGGGTGGTGCTGTGTGAGCTGGGCAACCCCATGAAGAAGAACGCCCAGATAGGAATCGCGATGTTGGTGAGCGTGGGGAATCTGGAAGAGGCTGGGGAGTCTGTGTCCTTCCAGCTGCAGATACGGAGCAAGAACAGCCAGAATCCAAACAGCAAGATTGTGCTGCTGGACGTGCCGGTCCGGGCAGAGGCCCAAGTGGAGCTGCGAGGGAACTCCTTTCCAGCCTCCCTGGTGGTGGCAGCAGAAGAAGGTGAGAGGGAGCAGAACAGCTTGGACAGCTGGGGACCCAAAGTGGAGCACACCTATGAGCTCCACAACAATGGCCCTGGGACTGTGAATGGTCTTCACCTCAGCATCCACCTTCCGGGACAGTCCCAGCCCTCCGACCTGCTCTACATCCTGGATATACAGCCCCAGGGGGGCCTTCAGTGCTTCCCACAGCCTCCTGTCAACCCTCTCAAGGTGGACTGGGGGCTGCCCATCCCCAGCCCCTCCCCCATTCACCCGGCCCATCACAAGCGGGATCGCAGACAGATCTTCCTGCCAGAGCCCGAGCAGCCCTCGAGGCTTCAGGATCCAGTTCTCGTAAGCTGCGACTCGGCGCCCTGTACTGTGGTGCAGTGTGACCTGCAGGAGATGGCGCGCGGGCAGCGGGCCATGGTCACGGTGCTGGCCTTCCTGTGGCTGCCCAGCCTCTACCAGAGGCCTCTGGATCAGTTTGTGCTGCAGTCGCACGCATGGTTCAACGTGTCCTCCCTCCCCTATGCGGTGCCCCCGCTCAGCCTGCCCCGAGGGGAAGCTCAGGTGTGGACACAGCTGCTCCGGGCCTTGGAGGAGAGGGCCATTCCAATCTGGTGGGTGCTGGTGGGTGTGCTGGGTGGCCTGCTGCTGCTCACCATCCTGGTCCTGGCCATGTGGAAGGTCGGCTTCTTCAAGCGGAACCGGCCACCCCTGGAAGAAGATGATGAAGAGGGGGAGTGA

细胞转染和筛选

CHO细胞培养：用含10%胎牛血清的IMDM培养基培养CHO细胞，取6孔培养板，以3×10⁴/cm²密度铺板，37℃， 5% CO₂培养箱中培养至80%汇合。

转染液制备：在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量) ；A液用100μL不含血清IMDM培养基稀释10μg DNA， B液用100μL不含血清IMDM培养基稀释对应的转染试剂；将A液和B液按1:1混匀，室温静置15分钟。

转染准备：用2mL不含血清IMDM培养基将CHO细胞漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的IMDM培养基。

转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37℃温箱置6小时，吸除无血清转染液，换入含有10%胎牛血清和PS的IMDM培养基继续培养。转染后48小时去掉旧培养基，加入含有G418 (600 μg/ml) 的IMDM培养基培养9天，每三天换液一次。挑选筛选后阳性克隆，置于新的培养瓶加入含有G418 (400 μg/ml) 的IMDM培养基继续培养，等细胞培养至80%汇合时消化下来，分别用抗GP Ibα、GP Ibβ、GP IX、GP IIb和GP IIIa抗体检测细胞表面相应蛋白表达情况。

将pcDNA-GP Ibα、pcDNA-GP Ibβ 和pcDNA-GP IX三种重组质粒转染入CHO细胞，将成功转染上述三种质粒的细胞命名为CHO-IbIX；将pcDNA-GP IIb和pcDNA-GP IIIa两种重组质粒转染入CHO细胞，将成功转染上述两种质粒的细胞命名为CHO-IIbIIIa；将pcDNA-GPIbα、pcDNA-GP Ibβ 、pcDNA-GP IX、pcDNA-GP IIb和pcDNA- GP IIIa转染入CHO细胞，将成功转染上述五种质粒的细胞命名为CHO-123。

细胞分选与蛋白表达

将培养细胞用0.04%乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA2Na）10min，弃去消化液，加PBS液；用吸管将细胞从瓶壁上轻轻吹打下来，并移入离心管中，800prm，5 min；弃上清，加pH7.4的PBS液5ml， 800prm，5 min；重复3次，以去除细胞悬液中的细胞碎片；用PBS重悬细胞，调整细胞浓度至5×10⁶/ml，加入抗GP Ib-IX或GP IIb/IIIa抗体，37℃ 孵育30 min，加入PBS液，800prm，5 min，弃上清。加入PBS液将沉淀细胞轻轻吹打均匀，待分选。采用贝克曼库尔特MoFlo XDP 超速流式分选系统对表达阳性细胞进行分选和收集。分选后的细胞用含10%胎牛血清及PS的IMDM培养基进行培养。待细胞长至培养平中80%汇合消化下来进行下一次分选，总共分选8次，获得了稳定表达细胞株，阳性细胞株分选结果见附图2，采用流式细胞术分选稳定表达GP Ib-IX、GP IIb/IIIa的阳性细胞株，分选后蛋白表达率均达超过90%。

稳定表达细胞株的保存

消化需要固定的细胞，800rpm/min离心5min，加入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液，调整细胞浓度至1×10⁶/ml，4℃固定12h。PBS洗去固定液，加入含10%DMSO的PBS，置于-40 ℃。分别与第12、22、45、90、180天时检测表达。检测前于37 ℃恒温水浴锅快速解冻，洗去冻存液，用流式细胞仪测细胞表面蛋白的表达，阳性细胞株保存结果见附图3，GP Ib-IX和GP IIb/IIIa表达阳性的CHO细胞采用4%甲醛固定，-80℃冻存180天，采用流式细胞术分析细胞表面特异性蛋白表达下降情况。

选择固定后表达稳定的CHO-IbIX、CHO-IIbIIIa和CHO-123细胞与荧光素标记的羊抗人免疫球蛋白多克隆抗体组成检测抗血小板表面受体特异性自身抗体的试剂；再结合PBS缓冲液、含DAPI的封片剂组成检测抗血小板表面受体特异性自身抗体的试剂盒。

实施例二血清中游离血小板表面特异性自身抗体检测

取出50 μl固定后表达稳定的CHO-IbIX、CHO-IIbIIIa和CHO-123细胞，分别加入50 μl预先稀释好的血清样本（用PBS稀释200倍），37℃孵育1h；加入PBS，800rpm/min离心5min；弃上清，加入FITC-羊抗人IgG（荧光素标记的羊抗人免疫球蛋白多克隆抗体），37℃孵育0.5h；加入PBS，800rpm/min离心5min；弃上清。

采用荧光法如下操作：加入PBS重悬细胞，取10 μl细胞悬液（含1×10⁴个细胞）加入10μl含DAPI的封片剂，滴于玻片上，加盖玻片。在荧光显微镜下直接观察，若细胞膜显示绿色荧光，则为阳性，反之为阴性。

图4为临床确诊为ITP病人的血清样本（采用间接免疫荧光法检测了ITP患者和正常人血清中抗GP Ib/IX、GP IIb-IIIa抗体水平）、正常人血清样本以及CHO细胞的荧光图，ITP病人上述抗体显示阳性，正常人和CHO细胞显示阴性；与临床检测符合率达90%以上。

采用流式细胞术如下操作：细胞悬液中加入400 μl PBS上机检测，根据同型对照调节补偿，若荧光强度超过临界值cut-off值则判定为阳性，反之为阴性；与临床检测符合率达90%以上。

通过流式细胞术分析临床102例ITP病人和104例正常人血清中抗GP Ib-IX和抗GPIIb/IIIa抗体的水平，采用ROC曲线确定了该检测方法的曲线面积、cut-off值以及相应的特异性和敏感性；见附图5以及表1；图6为流式细胞学方法检测结果图。

表1 ROC曲线表征结果

抗体类型	曲线面积	临界值	特异性	敏感性
					抗IbIX	0.93	1.96	90.4	85.2
抗IIbIIIa	0.98	1.66	95.2	91.3
					抗IbIX+抗IIbIIIa	0.97	1.78	95.2	86.3

利用磁珠法进行验证，结果见表2。

表2流式细胞学方法与临床符合率的比较

抗体类型	样本例数	阳性符合率	阴性符合率	总符合率
					抗IbIX	170	83.8（55/66）	90.4（94/104）	87.6（149/170）
抗IIbIIIa	185	92.6（75/81）	95.2（99/104）	94.1（174/185）
					抗IbIX+抗IIb/IIIa	202	86.7（85/98）	95.2（99/104）	91.1（184/202）

本发明采用基因重组和转染的方法促使CHO（中国地鼠卵巢细胞）表达人血小板特异性糖蛋白GP Ib/IX和/或GP IIb-IIIa。将特异性膜糖蛋白表达阳性CHO与待测血清共孵育，最后加入荧光素标记的羊抗人免疫球蛋白多克隆抗体（二抗）结合。若血清中存在抗血小板特异性抗体则形成“CHO-膜糖蛋白特异性抗体-异硫氰酸荧光素标记的羊抗人免疫球蛋白多克隆抗体”复合物结构，表现为CHO细胞绿色荧光强度增高或者荧光强度超过临界值。

序列表

<110> 苏州大学

<120> 检测抗血小板表面受体特异性自身抗体的试剂及其制备方法与应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 621

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 1

atgggctccg ggccgcgcgg ggcgctgagc ttactgctcc tgctgctggc cccgccgagc 60

cgcccggccg caggttgccc ggcgccctgt agctgcgcgg ggacgctcgt ggactgcggg 120

cgccgcgggc tgacttgggc ctcgctgccg accgccttcc ctgtcgacac aaccgagctg 180

gtgctgaccg gcaacaacct gacggcgctg ccgccggggc tgctggacgc gctgcccgcg 240

ctgcgcaccg cacacctggg cgccaacccc tggcgctgcg actgccgcct tgtgccgctg 300

cgcgcctggc tggccggccg ccccgagcgt gcgccctacc gcgacctgcg ttgcgtggcg 360

cccccagcgc tgcgcggccg cctgctgccc tatctggccg aggacgagct gcgcgccgct 420

tgcgctcccg gcccgctctg ctggggggcg ctggcggcgc agcttgcgct gctgggcctt 480

gggctgctgc acgcgttgct gctggtgctg ctgctgtgcc gcctgcggag gctgcgggcc 540

cgggcccgcg ctcgcgccgc agcccggctg tcgctgaccg acccgctggt ggccgagcga 600

gccggaaccg acgagtcctg a 621

<210> 2

<211> 1959

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

atgcctctcc tcctcttgct gctcctgctg ccaagcccct tacaccccca ccccatctgt 60

gaggtctcca aagtggccag ccacctagaa gtgaactgtg acaagaggaa tctgacagcg 120

ctgcctccag acctgccgaa agacacaacc atcctccacc tgagtgagaa cctcctgtac 180

accttctccc tggcaaccct gatgccttac actcgcctca ctcagctgaa cctagatagg 240

tgcgagctca ccaagctcca ggtcgatggg acgctgccag tgctggggac cctggatcta 300

tcccacaatc agctgcaaag cctgcccttg ctagggcaga cactgcctgc tctcaccgtc 360

ctggacgtct ccttcaaccg gctgacctcg ctgcctcttg gtgccctgcg tggtcttggc 420

gaactccaag agctctacct gaaaggcaat gagctgaaga ccctgccccc agggctcctg 480

acgcccacac ccaagctgga gaagctcagt ctggctaaca acaacttgac tgagctcccc 540

gctgggctcc tgaatgggct ggagaatctc gacacccttc tcctccaaga gaactcgctg 600

tatacaatac caaagggctt ttttgggtcc cacctcctgc cttttgcttt tctccacggg 660

aacccctggt tatgcaactg tgagatcctc tattttcgtc gctggctgca ggacaatgct 720

gaaaatgtct acgtatggaa gcaaggtgtg gacgtcaagg ccatgacctc taacgtggcc 780

agtgtgcagt gtgacaattc agacaagttt cccgtctaca aatacccagg aaaggggtgc 840

cccacccttg gtgatgaagg tgacacagac ctatatgatt actacccaga agaggacact 900

gagggcgata aggtgcgtgc cacaaggact gtggtcaagt tccccaccaa agcccataca 960

accccctggg gtctattcta ctcatggtcc actgcttctc tagacagcca aatgccctcc 1020

tccttgcatc caacacaaga atccactaag gagcagacca cattcccacc tagatggacc 1080

ccaaatttca cacttcacat ggaatccatc acattctcca aaactccaaa atccactact 1140

gaaccaaccc caagcccgac cacctcagag cccgtcccgg agcccgcccc aaacatgacc 1200

accctggagc ccactccaag cccgaccacc ccagagccca cctcagagcc cgcccccagc 1260

ccgaccaccc cggagcccac ctcagagccc gcccccagcc cgaccacccc agagcccacc 1320

tcagagcccg cccccagccc gaccaccccg gagcccaccc caatcccgac catcgccaca 1380

agcccgacca tcctggtgtc tgccacaagc ctgatcactc caaaaagcac atttttaact 1440

accacaaaac ccgtatcact cttagaatcc accaaaaaaa ccatccctga acttgatcag 1500

ccaccaaagc tccgtggggt gctccaaggg catttggaga gctccagaaa tgaccctttt 1560

ctccaccccg acttttgctg cctcctcccc ctgggcttct atgtcttggg tctcttctgg 1620

ctgctctttg cctctgtggt cctcatcctg ctgctgagct gggttgggca tgtgaaacca 1680

caggccctgg actctggcca aggtgctgct ctgaccacag ccacacaaac cacacacctg 1740

gagctgcaga ggggacggca agtgacagtg ccccgggcct ggctgctctt ccttcgaggt 1800

tcgcttccca ctttccgctc cagcctcttc ctgtgggtac ggcctaatgg ccgtgtgggg 1860

cctctagtgg caggaaggag gccctcagct ctgagtcagg gtcgtggtca ggacctgctg 1920

agcacagtga gcattaggta ctctggccac agcctctga 1959

<210> 3

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

atgcctgcct ggggagccct gttcctgctc tgggccacag cagaggccac caaggactgc 60

cccagcccat gtacctgccg cgccctggaa accatggggc tgtgggtgga ctgcaggggc 120

cacggactca cggccctgcc tgccctgccg gcccgcaccc gccaccttct gctggccaac 180

aacagccttc agtccgtgcc cccgggagcc tttgaccacc tgccccagct gcagaccctc 240

gatgtgacgc agaacccctg gcactgtgac tgcagcctca cctatctgcg cctctggctg 300

gaggaccgca cgcccgaggc cctgctgcag gtccgctgtg ccagccccag cctcgctgcc 360

catggcccgc tgggccggct gacaggctac cagctgggca gctgtggctg gcagctgcag 420

gcgtcctggg tgcgcccggg ggtcttgtgg gacgtggcgc tggtcgccgt ggccgcgctg 480

ggcctggctc ttctggctgg cctgctgtgt gccaccacag aggccctgga ttga 534

<210> 4

<211> 2367

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

atgcgagcgc ggccgcggcc ccggccgctc tgggcgactg tgctggcgct gggggcgctg 60

gcgggcgttg gcgtaggagg gcccaacatc tgtaccacgc gaggtgtgag ctcctgccag 120

cagtgcctgg ctgtgagccc catgtgtgcc tggtgctctg atgaggccct gcctctgggc 180

tcacctcgct gtgacctgaa ggagaatctg ctgaaggata actgtgcccc agaatccatc 240

gagttcccag tgagtgaggc ccgagtacta gaggacaggc ccctcagcga caagggctct 300

ggagacagct cccaggtcac tcaagtcagt ccccagagga ttgcactccg gctccggcca 360

gatgattcga agaatttctc catccaagtg cggcaggtgg aggattaccc tgtggacatc 420

tactacttga tggacctgtc ttactccatg aaggatgatc tgtggagcat ccagaacctg 480

ggtaccaagc tggccaccca gatgcgaaag ctcaccagta acctgcggat tggcttcggg 540

gcatttgtgg acaagcctgt gtcaccatac atgtatatct ccccaccaga ggccctcgaa 600

aacccctgct atgatatgaa gaccacctgc ttgcccatgt ttggctacaa acacgtgctg 660

acgctaactg accaggtgac ccgcttcaat gaggaagtga agaagcagag tgtgtcacgg 720

aaccgagatg ccccagaggg tggctttgat gccatcatgc aggctacagt ctgtgatgaa 780

aagattggct ggaggaatga tgcatcccac ttgctggtgt ttaccactga tgccaagact 840

catatagcat tggacggaag gctggcaggc attgtccagc ctaatgacgg gcagtgtcat 900

gttggtagtg acaatcatta ctctgcctcc actaccatgg attatccctc tttggggctg 960

atgactgaga agctatccca gaaaaacatc aatttgatct ttgcagtgac tgaaaatgta 1020

gtcaatctct atcagaacta tagtgagctc atcccaggga ccacagttgg ggttctgtcc 1080

atggattcca gcaatgtcct ccagctcatt gttgatgctt atgggaaaat ccgttctaaa 1140

gtagagctgg aagtgcgtga cctccctgaa gagttgtctc tatccttcaa tgccacctgc 1200

ctcaacaatg aggtcatccc tggcctcaag tcttgtatgg gactcaagat tggagacacg 1260

gtgagcttca gcattgaggc caaggtgcga ggctgtcccc aggagaagga gaagtccttt 1320

accataaagc ccgtgggctt caaggacagc ctgatcgtcc aggtcacctt tgattgtgac 1380

tgtgcctgcc aggcccaagc tgaacctaat agccatcgct gcaacaatgg caatgggacc 1440

tttgagtgtg gggtatgccg ttgtgggcct ggctggctgg gatcccagtg tgagtgctca 1500

gaggaggact atcgcccttc ccagcaggac gaatgcagcc cccgggaggg tcagcccgtc 1560

tgcagccagc ggggcgagtg cctctgtggt caatgtgtct gccacagcag tgactttggc 1620

aagatcacgg gcaagtactg cgagtgtgac gacttctcct gtgtccgcta caagggggag 1680

atgtgctcag gccatggcca gtgcagctgt ggggactgcc tgtgtgactc cgactggacc 1740

ggctactact gcaactgtac cacgcgtact gacacctgca tgtccagcaa tgggctgctg 1800

tgcagcggcc gcggcaagtg tgaatgtggc agctgtgtct gtatccagcc gggctcctat 1860

ggggacacct gtgagaagtg ccccacctgc ccagatgcct gcacctttaa gaaagaatgt 1920

gtggagtgta agaagtttga ccggggagcc ctacatgacg aaaatacctg caaccgttac 1980

tgccgtgacg agattgagtc agtgaaagag cttaaggaca ctggcaagga tgcagtgaat 2040

tgtacctata agaatgagga tgactgtgtc gtcagattcc agtactatga agattctagt 2100

ggaaagtcca tcctgtatgt ggtagaagag ccagagtgtc ccaagggccc tgacatcctg 2160

gtggtcctgc tctcagtgat gggggccatt ctgctcattg gccttgccgc cctgctcatc 2220

tggaaactcc tcatcaccat ccacgaccga aaagaattcg ctaaatttga ggaagaacgc 2280

gccagagcaa aatgggacac agccaacaac ccactgtata aagaggccac gtctaccttc 2340

accaatatca cgtaccgggg cacttaa 2367

<210> 5

<211> 3120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 5

atggccagag ctttgtgtcc actgcaagcc ctctggcttc tggagtgggt gctgctgctc 60

ttgggacctt gtgctgcccc tccagcctgg gccttgaacc tggacccagt gcagctcacc 120

ttctatgcag gccccaatgg cagccagttt ggattttcac tggacttcca caaggacagc 180

catgggagag tggccatcgt ggtgggcgcc ccgcggaccc tgggccccag ccaggaggag 240

acgggcggcg tgttcctgtg cccctggagg gccgagggcg gccagtgccc ctcgctgctc 300

tttgacctcc gtgatgagac ccgaaatgta ggctcccaaa ctttacaaac cttcaaggcc 360

cgccaaggac tgggggcgtc ggtcgtcagc tggagcgacg tcattgtggc ctgcgccccc 420

tggcagcact ggaacgtcct agaaaagact gaggaggctg agaagacgcc cgtaggtagc 480

tgctttttgg ctcagccaga gagcggccgc cgcgccgagt actccccctg tcgcgggaac 540

accctgagcc gcatttacgt ggaaaatgat tttagctggg acaagcgtta ctgtgaagcg 600

ggcttcagct ccgtggtcac tcaggccgga gagctggtgc ttggggctcc tggcggctat 660

tatttcttag gtctcctggc ccaggctcca gttgcggata ttttctcgag ttaccgccca 720

ggcatccttt tgtggcacgt gtcctcccag agcctctcct ttgactccag caacccagag 780

tacttcgacg gctactgggg gtactcggtg gccgtgggcg agttcgacgg ggatctcaac 840

actacagaat atgtcgtcgg tgcccccact tggagctgga ccctgggagc ggtggaaatt 900

ttggattcct actaccagag gctgcatcgg ctgcgcggag agcagatggc gtcgtatttt 960

gggcattcag tggctgtcac tgacgtcaac ggggatggga ggcatgatct gctggtgggc 1020

gctccactgt atatggagag ccgggcagac cgaaaactgg ccgaagtggg gcgtgtgtat 1080

ttgttcctgc agccgcgagg cccccacgcg ctgggtgccc ccagcctcct gctgactggc 1140

acacagctct atgggcgatt cggctctgcc atcgcacccc tgggcgacct cgaccgggat 1200

ggctacaatg acattgcagt ggctgccccc tacgggggtc ccagtggccg gggccaagtg 1260

ctggtgttcc tgggtcagag tgaggggctg aggtcacgtc cctcccaggt cctggacagc 1320

cccttcccca caggctctgc ctttggcttc tcccttcgag gtgccgtaga catcgatgac 1380

aacggatacc cagacctgat cgtgggagct tacggggcca accaggtggc tgtgtacaga 1440

gctcagccag tggtgaaggc ctctgtccag ctactggtgc aagattcact gaatcctgct 1500

gtgaagagct gtgtcctacc tcagaccaag acacccgtga gctgcttcaa catccagatg 1560

tgtgttggag ccactgggca caacattcct cagaagctat ccctaaatgc cgagctgcag 1620

ctggaccggc agaagccccg ccagggccgg cgggtgctgc tgctgggctc tcaacaggca 1680

ggcaccaccc tgaacctgga tctgggcgga aagcacagcc ccatctgcca caccaccatg 1740

gccttccttc gagatgaggc agacttccgg gacaagctga gccccattgt gctcagcctc 1800

aatgtgtccc taccgcccac ggaggctgga atggcccctg ctgtcgtgct gcatggagac 1860

acccatgtgc aggagcagac acgaatcgtc ctggactgtg gggaagatga cgtatgtgtg 1920

ccccagcttc agctcactgc cagcgtgacg ggctccccgc tcctagttgg ggcagataat 1980

gtcctggagc tgcagatgga cgcagccaac gagggcgagg gggcctatga agcagagctg 2040

gccgtgcacc tgccccaggg cgcccactac atgcgggccc taagcaatgt cgagggcttt 2100

gagagactca tctgtaatca gaagaaggag aatgagacca gggtggtgct gtgtgagctg 2160

ggcaacccca tgaagaagaa cgcccagata ggaatcgcga tgttggtgag cgtggggaat 2220

ctggaagagg ctggggagtc tgtgtccttc cagctgcaga tacggagcaa gaacagccag 2280

aatccaaaca gcaagattgt gctgctggac gtgccggtcc gggcagaggc ccaagtggag 2340

ctgcgaggga actcctttcc agcctccctg gtggtggcag cagaagaagg tgagagggag 2400

cagaacagct tggacagctg gggacccaaa gtggagcaca cctatgagct ccacaacaat 2460

ggccctggga ctgtgaatgg tcttcacctc agcatccacc ttccgggaca gtcccagccc 2520

tccgacctgc tctacatcct ggatatacag ccccaggggg gccttcagtg cttcccacag 2580

cctcctgtca accctctcaa ggtggactgg gggctgccca tccccagccc ctcccccatt 2640

cacccggccc atcacaagcg ggatcgcaga cagatcttcc tgccagagcc cgagcagccc 2700

tcgaggcttc aggatccagt tctcgtaagc tgcgactcgg cgccctgtac tgtggtgcag 2760

tgtgacctgc aggagatggc gcgcgggcag cgggccatgg tcacggtgct ggccttcctg 2820

tggctgccca gcctctacca gaggcctctg gatcagtttg tgctgcagtc gcacgcatgg 2880

ttcaacgtgt cctccctccc ctatgcggtg cccccgctca gcctgccccg aggggaagct 2940

caggtgtgga cacagctgct ccgggccttg gaggagaggg ccattccaat ctggtgggtg 3000

ctggtgggtg tgctgggtgg cctgctgctg ctcaccatcc tggtcctggc catgtggaag 3060

gtcggcttct tcaagcggaa ccggccaccc ctggaagaag atgatgaaga gggggagtga 3120

Claims

1.检测抗血小板表面受体特异性自身抗体的试剂，其特征在于，所述检测抗血小板表面受体特异性自身抗体的试剂包括表达人血小板特异性受体膜糖蛋白的细胞以及荧光素标记的抗体。

2. 根据权利要求1所述检测抗血小板表面受体特异性自身抗体的试剂，其特征在于，所述人血小板特异性受体膜糖蛋白包括GP Ib-IX和/或GP IIb/IIIa；所述细胞包括中国地鼠卵巢细胞；所述荧光素包括异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明或藻红蛋白；所述荧光素标记的抗体包括荧光素标记的羊抗人、鼠抗人或者兔抗人免疫球蛋白单克隆或者多克隆抗体。

3.根据权利要求1所述检测抗血小板表面受体特异性自身抗体的试剂，其特征在于，所述表达人血小板特异性受体膜糖蛋白的细胞的制备方法为，将编码人血小板特异性受体膜糖蛋白的基因片段克隆进质粒载体得到重组质粒；然后将重组质粒转染细胞，得到转染细胞株；然后经过分选与培养得到表达人血小板特异性受体膜糖蛋白的细胞。

4. 根据权利要求3所述检测抗血小板表面受体特异性自身抗体的试剂，其特征在于，所述编码人血小板特异性受体膜糖蛋白的基因片段包括人血小板膜蛋白GP Ibα亚基基因序列、人血小板膜蛋白GP Ibβ亚基基因序列、人血小板膜蛋白GP IX亚基基因序列、人血小板膜蛋白GP IIb亚基基因序列以及人血小板膜蛋白GP IIIa亚基基因序列中的一种或几种；所述质粒载体包括pcDNA3.3质粒载体。

5.检测抗血小板表面受体特异性自身抗体的试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将编码人血小板特异性受体膜糖蛋白的基因片段克隆进质粒载体得到重组质粒；

（2）将重组质粒转染细胞，得到转染细胞株；

（3）将转染细胞株经过分选与培养得到表达人血小板特异性受体膜糖蛋白的细胞；

（4）表达人血小板特异性受体膜糖蛋白的细胞与荧光素标记的抗体组成检测抗血小板表面受体特异性自身抗体的试剂。

6. 根据权利要求5所述检测抗血小板表面受体特异性自身抗体的试剂的制备方法，其特征在于，所述编码人血小板特异性受体膜糖蛋白的基因序列包括人血小板膜蛋白GP Ibα亚基基因序列、人血小板膜蛋白GP Ibβ亚基基因序列、人血小板膜蛋白GP IX亚基基因序列、人血小板膜蛋白GPIIb亚基基因序列、人血小板膜蛋白GPIIIa亚基基因序列中的一种或几种；所述质粒载体包括pcDNA3.3质粒载体。

7.权利要求1所述检测抗血小板表面受体特异性自身抗体的试剂在检测抗血小板表面受体特异性自身抗体中的应用，或者权利要求1所述检测抗血小板表面受体特异性自身抗体的试剂在制备检测血小板表面特异性自身抗体制剂中的应用。

8.检测抗血小板表面受体特异性自身抗体的试剂盒，其特征在于，所述检测抗血小板表面受体特异性自身抗体的试剂盒包括表达人血小板特异性受体膜糖蛋白的细胞、荧光素标记的抗体、缓冲液、封片剂。

9.利用权利要求1所述检测抗血小板表面受体特异性自身抗体的试剂检测血小板表面受体特异性自身抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤，将待测样本与表达人血小板特异性受体膜糖蛋白的细胞孵育，然后加入荧光素标记的抗体孵育；然后通过检测完成血小板表面受体特异性自身抗体的检测。

10.表达人血小板特异性受体膜糖蛋白的细胞在制备检测抗血小板表面受体特异性自身抗体试剂中的应用。