CN108949904A

CN108949904A - 一种测定lag3蛋白结合分子生物学活性的方法

Info

Publication number: CN108949904A
Application number: CN201810836118.6A
Authority: CN
Inventors: 康小强; 赖寿鹏; 张鹏; 黄潇; 管静
Original assignee: Nanjing Wei Li Zhi Bo Biotechnology Co ltd
Current assignee: Nanjing Wei Li Zhi Bo Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-07-26
Filing date: 2018-07-26
Publication date: 2018-12-07
Anticipated expiration: 2038-07-26
Also published as: CN108949904B

Abstract

本发明公开了一种测定LAG3蛋白结合分子生物学活性的方法。包括共表达NFAT报告元件和人LAG3蛋白的Jurkat细胞在SED和Raji细胞并存的条件下检测抗人LAG3抗体活性的方法。此发明方法能快速准确地检测结合人LAG3蛋白的分子的活性。

Description

一种测定LAG3蛋白结合分子生物学活性的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种测定LAG3蛋白结合分子生物学活性的方法。

背景技术

LAG3(Lymphocyte Activation Gene-3，淋巴细胞活化基因3)是一种免疫检查点蛋白，包含4个Ig样的区域，结构与CD4分子类似，能与MHC-Ⅱ(主要组织相容性复合体)分子结合。现已证实，LAG3能负向调节T细胞的活化和增殖，通常表达在肿瘤组织浸润的T细胞表面，是T细胞能力衰竭的标志。通过影响LAG3的功能可以改善人体在病毒感染或自身免疫疾病以及恶性肿瘤所带来的免疫系统的功能紊乱，改善疾病的预后。

随着免疫检查点抗体药物在肿瘤治疗中发挥着越来越重要的作用，多种的LAG3相关药物处于临床和临床前研究中。由于LAG3负向调节T细胞的活性，所以能抑制T细胞表面的LAG3 分子功能就可以增强T细胞的抗肿瘤能力。目前也有多家制药公司都在研发针对抗人LAG3的单克隆抗体。抗人LAG3抗体通过特异性结合LAG3分子来抑制LAG3的功能，达到增强T细胞的抗肿瘤效力，从而最大化动员患者自身的免疫系统反应杀伤肿瘤细胞达到治疗肿瘤的目的。所以探究一种快速而准确的检测这些抗体药物对激活T细胞作用的方法是十分必要的。

荧光素酶报告基因是一种常用于哺乳动物细胞的报告基因，随着具有膜通透性和光裂解作用的萤火虫荧光素酶的应用，无需裂解细胞即可催化荧光底物发光而检测酶活性。由于具有没有放射性、比其他报告基因速度快、且半衰期较短不会在效应细胞中积累的优点，荧光素酶报告基因已经用于检测多种药物的活性。

目前已有通过利用传统检测PBMC或T细胞因子释放的方法来反映抗LAG3抗体的生物活性，但只能进行相对比较，不能具体量化。传统因子检测方法易受PBMC或T细胞个体差异的影响，重复性不好，工作量较大且拖延的时间较长(至少需要3天以上)。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供一种快速准确的测定LAG3蛋白结合分子生物学活性的方法。

本发明的另一目的是提供一种用于测定LAG3蛋白结合分子生物学活性的Jurkat细胞。

本发明的又一目的是提供一种用于测定LAG3蛋白结合分子生物学活性的试剂盒。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

本发明原理：本发明利用稳定转染表达了NFAT报告原件和人LAG3蛋白的Jurkat细胞和表达MHC-Ⅱ的递呈细胞组成的检测系统来检测人LAG3蛋白结合分子的活性。本发明通过测定 Jurkat-NFAT-LAG3细胞的荧光素酶催化化学底物发光的强度或Jurkat-NFAT-LAG3细胞分泌的IL2因子的量来判断结合人LAG3蛋白的分子活性高低。Jurkat-NFAT在超抗原(如肠毒素亚型D Staphylococcal Enterotoxin D，简称SED)和具有MHC-Ⅱ表达的递呈细胞(如Raji细胞)同时存在的条件下，递呈细胞表面的MHC-Ⅱ分子会通过结合Jurkat细胞表面的TCR受体，激活 NFAT报告元件和IL2表达通路，产生正信号包括发光信号和细胞因子(如IL2)分泌。当 Jurkat-NFAT上稳定转染表达LAG3分子后，LAG3分子会与具有递呈细胞的MHC-Ⅱ结合，抑制正信号包括发光信号和IL2因子分泌。在LAG3蛋白结合分子如LAG3抗体存在下，会抑制LAG3 分子与MHC-Ⅱ的结合，正信号得到恢复。此发明方法能快速准确地检测LAG3蛋白结合分子的生物学活性。

本发明所述的LAG3蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种测定LAG3蛋白结合分子的生物学活性的方法，其特征在于包括在共表达NFAT报告元件和人LAG3蛋白的Jurkat细胞、超抗原和表达MHC-Ⅱ的递呈细胞并存的条件下，加入LAG3 蛋白结合分子，LAG3蛋白结合分子与Jurkat细胞表达的LAG3蛋白特异性结合，使TCR通路保持激活状态，从而使NFAT报告元件表达荧光素酶，催化化学底物发光以及Jurkat细胞分泌细胞因子；通过测定发光强度或分泌细胞因子的量实现对LAG3蛋白结合分子生物活性的定量检测。

所述的LAG3蛋白结合分子为LAG3的特异性抗体或其他能够与LAG3蛋白特异性结合的生物大分子。所述的LAG3抗体选自relatlimab(百时美施贵宝)、LAG525(诺华)、REGN3767 (再生元)、MK-4280(Merk公司)、MGD013(MacroGenics)、Sym022(Fstar)、FS118(Symphogen)、 GSK2831781(葛兰素史克)中的任意一种。

所述的具有MHC-Ⅱ表达的递呈细胞优选Raji细胞或Daudi细胞(人Burkitt's淋巴瘤细胞)。更优的是用Raji细胞，Raji细胞高表达MHC-Ⅱ分子。

所述的Jurkat-NFAT-LAG3的细胞数优选1×10⁵个/well(96孔板)；所述的Raji细胞数为共表达NFAT报告元件和人LAG3蛋白的Jurkat细胞数的1/10-1/2。

所述的Raji细胞数优选共表达NFAT和人LAG3蛋白的Jurkat细胞数的1/2、1/4、1/6、 1/8或1/10。

所述的共表达NFAT和人LAG3蛋白的Jurkat细胞通过如下方法构建：将包含NFAT报告元件的质粒和包含人LAG3全长的质粒通过电转染的方式转染到Jurkat细胞中，并通过加入潮霉素和嘌呤霉素加压筛选稳定表达NFAT报告元件和人LAG3蛋白的Jurkat细胞。

所述的超抗原选自SEA、SEB、SED、SEE中的任意一种，优选SED(即肠毒素亚型D)。

所述的超抗原的浓度优选25-200ng/mL。

所述的细胞因子选自干扰素γ、IL2、IL8、肿瘤坏死因子α中的任意一种，优选IL2。

一种用于测定LAG3蛋白结合分子生物学活性的Jurkat细胞Jurkat-NFAT-LAG3，该细胞为共表达NFAT报告元件和人LAG3蛋白的Jurkat细胞，通过以下方法构建：

将包含NFAT报告元件的质粒和包含人LAG3全长序列的质粒通过电转染的方式转染到 Jurkat细胞中，并通过加入潮霉素和嘌呤霉素加压筛选稳定表达NFAT报告元件和人LAG3蛋白的Jurkat细胞。

所述的共表达NFAT报告元件和人LAG3蛋白的Jurkat细胞为人T淋巴细胞白血病细胞 JNL-35B8，2018年6月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：2018130。

本发明所述的Jurkat细胞在测定LAG3蛋白结合分子生物学活性中的应用。

本发明所述的Jurkat细胞在制备LAG3蛋白结合分子生物学活性的试剂盒中的应用。

用于测定LAG3蛋白结合分子生物学活性的试剂盒，包括共表达NFAT报告元件和人LAG3 蛋白的Jurkat细胞、超抗原、Raji细胞、具有浓度梯度的LAG3蛋白结合分子的稀释液以及荧光素酶底物。

所述的LAG3蛋白结合分子优选LAG3的特异性抗体或其他能够与LAG3蛋白特异性结合的生物大分子；所述的超抗原优选SED，SED的浓度优选25-200ng/ml；所述的具有MHC-Ⅱ表达的递呈细胞优选Raji细胞或Daudi细胞，进一步优选Raji细胞。

所述的试剂盒还可以优选包含细胞因子检测试剂；所述的细胞因子检测试剂优选检测干扰素γ、IL2、IL8、肿瘤坏死因子α中的任意一种的试剂，进一步优选IL2检测试剂。

有益效果：

本发明提供了一种测定LAG3蛋白结合分子的生物活性方法，其关键点在于：

a、具有一种共表达NFAT报告元件及人LAG3蛋白的Jurkat细胞

b、一定细胞配比的Jurkat-NFAT-LAG3细胞和具有MHC-Ⅱ表达的递呈细胞

c、一定浓度的超抗原

d、具有浓度梯度的抗LAG3抗体的稀释液。

本发明所述的Jurkat-NFAT-LAG3细胞上同时可以表达NFAT报告元件和人LAG3蛋白。 Jurkat是T淋巴细胞白血病细胞，具有T细胞的特征，具有TCR受体，可在超抗原和具有MHC- Ⅱ表达的递呈细胞存在的条件下激活TCR通路，引起细胞的激活，可使转染的NFAT报告元件表达荧光素酶，可催化化学底物发光。Jurkat细胞上转染表达的的人LAG3分子可与MHC-Ⅱ分子结合，从而抑制TCR通路，降低NFAT报告元件表达荧光素酶，从而降低发光信号。在加入 LAG3蛋白结合分子后，LAG3蛋白结合分子与LAG3蛋白特异性结合，从而使TCR通路保持激活状态，从而使发光信号得以恢复。同样本发明中，LAG3蛋白结合分子的加入能使Jurkat细胞分泌的细胞因子(如IL2)增加。根据细胞催化化学底物发出光信号的强弱或分泌细胞因子(如 IL2)的量的多少随人LAG3蛋白结合分子浓度变化反映了人LAG3蛋白结合分子的活性强弱。此发明方法能快速准确地检测人LAG3蛋白结合分子的生物学活性。

本发明所需的Jurkat-NFAT-LAG3细胞筛选出后在一定时间内均可以保持信号的稳定性，所需的Raji细胞也是一种永生细胞，在一定传代代次里均可以用于该发明的方法中。本发明需要一定细胞配比的Jurkat-NFAT-LAG3和Raji细胞在一定浓度的SED下，与有浓度梯度的人 LAG3蛋白结合分子的稀释液混合反应16-18h，根据催化化学底物发光或分泌的IL2来反映抗体活性强弱。与传统测定PBMC或T细胞释放细胞因子的方法相比，本发明只需要18-20h就能显示量化的结果，且结果稳定可重复。

附图说明

图1是检测Jurkat-NFAT-LAG3细胞上人LAG3蛋白的表达

图2是Jurkat-NFAT-LAG3-35B8克隆+Raji细胞测定加入抗体和发光信号量效关系实验结果。

图3是Jurkat-NFAT-LAG3-35B8克隆+Raji细胞测定加入抗体和IL2因子分泌的量效关系实验结果。

图4是SED浓度分别为100ng/mL(A图)和150ng/mL(B图)时，不同细胞配比的条件对报告基因结果的影响。

图5是细胞配比在4:1(A图)、6:1(B图)和8:1(C图)时，不同SED浓度对报告基因结果的影响

生物材料保藏信息

人T淋巴细胞白血病细胞JNL-35B8，2018年6月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：2018130。

具体实施方式

实施例1、Jurkat-NFAT-LAG3细胞克隆的筛选

1、原始细胞

本发明涉及的原始Jurkat细胞(Clone E6-1)购于中国科学院上海细胞库，在本实验室内传代培养保存。细胞使用的细胞活率95％以上。

Jurkat细胞克隆用OPTI-MEM(GIBCO，31985062)培养基重悬，转移至电转仪(Bio-Rad， Gene Pulser Xcell)配套的电击杯内，添加质粒轻柔混匀后电击操作，然后将所有细胞悬液转移至洁净的六孔板(Costar，3516)内的完全培养基(90％1640+10％FBS)中，37℃培养箱(Thermo，BB150I)内静置培养24h。

2.质粒

带有NFAT报告元件的质粒pGL4.30[luc2P/NFAT-RE/Hygro](Promega，E848A)，和包含人LAG3全产基因的pIRES-puro3质粒(Clontech，631619)在本实验分别转化到大肠杆菌内，大量扩增摇菌后提取质粒，用于Jurkat细胞的转染。

3、Jurkat-NFAT-LAG3细胞的筛选

细胞电击24h后，用完全培养基稀释活细胞，加入500μg/mL的潮霉素B(HygromycinB，GIBCO，10687010)，加入0.25μg/mL的嘌呤霉素(Puromycin Dihydrochloride，GIBCO，A11138-03)。200μL/well，接种到96孔细胞培养板(Costar，3599)，于37℃培养箱内静置培养2-3周至长出细胞群落。将有细胞群落的96孔板内细胞挑出扩繁培养。

4、Jurkat-NFAT-LAG3细胞克隆表达LAG3的鉴定

Jurkat-NFAT-LAG3细胞克隆培养至细胞活率＞90％以上，取细胞进行流式检测。细胞用含0.5％BSA(生工，A500023-0025)的PBS(Hyclone，SH30256.01)(下同)洗去培养基后，加入2μg/mlLAG3.5抗体(US_9505839_B2)，4℃孵育30min。PBS洗去一抗后，加入PE- 羊抗人FC IgG(1:100)荧光二抗(Jackson，109-116-098)，4℃避光孵育30min。PBS洗去荧光抗体后，用适量PBS重悬，流式细胞仪(BD Accuri C5)检测LAG3表达阳性率，如图 1所示，Jurkat细胞转染LAG3基因后，较显著地在细胞上表达LAG3蛋白。

5、Jurkat-NFAT-LAG3细胞克隆表达NFAT报告元件的鉴定

Jurkat-NFAT-LAG3细胞克隆培养至细胞活率＞90％以上，将细胞铺在预包被抗人CD3抗体(BD Pharmingen，555329)的细胞培养板中，通过检测CD3抗体激活的发光信号强弱来选择高表达NFAT报告元件的LAG3细胞，检测试剂盒为Bright-glo(Promega，E2620)。

表1本发明实施例1中筛选出的Jurkat-NFAT的细胞克隆，通过包被在板上的抗人CD3抗体刺激后对比空白细胞有较大的发光信号窗口。

	23#	8F5	35B8	25#	37#	38D3
							BLANK	1062.25	1203.5	931	256.25	265.25	339.5
CD3	36812.75	26831	23491.25	7775.75	10489.75	24976
							CD3/BLANK	34.66	22.29	25.23	30.34	39.55	73.57

表2是本发明实施例1中筛选Jurkat-NFAT-LAG3细胞克隆的通过加入LAG3.5抗体(US_9505839_B2)和阴性对照IgG4(Biolegend，403702)检测发光信号的结果，根据信噪比的(P/N)选择克隆35B8作为后续方法建立的细胞，并将该克隆送交CCTCC保藏，保藏编号为CCTCC NO：C2018130。

实施例2、报告基因实验方法

1、细胞复苏

本发明涉及的细胞克隆为本实验室转染筛选鉴定后的Jurkat-NFAT-LAG3细胞克隆，克隆号为35B8。经验证为NFAT报告元件和LAG3蛋白高表达的细胞克隆。本发明涉及的Raji细胞是人Burkitt's淋巴瘤细胞，购于中国科学院上海细胞库，于本实验室传代培养保存。细胞从液氮罐里取出后立即放入37℃水浴中解冻至剩小块冰，用完全培养基(90％1640+10％FBS) 稀释后转移至洁净15mL离心管(Corning，430791)内，400×g离心弃上清，用合适体积的完全培养基重悬细胞并接种细胞于细胞培养皿，调节细胞密度为5-8×10⁵个/mL，37℃培养箱内静置培养。

2、完全培养基和Assay Buffer的配制

本发明涉及的完全培养基为RPMI 1640Medium,HEPES(GIBCO，22400-089)补加10％的胎牛血清(Fetal Bovine Serum，GIBCO，10099-141)，混匀后4℃保存备用，适用于细胞传代培养。

本发明涉及的Assay Buffer为RPMI 1640Medium,HEPES(GIBCO，22400-089)补加1％的胎牛血清(Fetal Bovine Serum，GIBCO，10099-141)，混匀后4℃保存备用，适用于报告基因实验。

3、SED的配制

本发明涉及的SED(ToxinTechnology，DP303)为引起葡萄球菌食物中毒的致病物质，根据抗原性为D的血清型。SED根据说明书，用1mL无菌水溶解为浓度为1mg/mL的母液，0.22 μm滤膜过滤除菌后，按实验需要进行分装，保存于-80℃冰箱备用。

4、细胞计数取样

Jurkat-NFAT-LAG3细胞悬液用血球计数板计数，取5×10⁶个细胞，350×g室温离心5min 弃上清，用Assay Buffer重悬细胞沉淀。

Raji细胞悬液用血球计数板计数，取6×10⁵个细胞，350×g室温离心5min弃上清，用 Assay Buffer重悬细胞。

5、抗体及梯度抗体稀释液

本实施例涉及抗体来自专利US_9505839_B2(已公开)中的LAG3.5抗体，合成后在本实验室用ExpiCHO系统(ThermoFisher，A29133)瞬转表达，经0.22μm滤膜过滤除菌及通过内毒素检测合格。

将LAG3.5抗体三倍梯度稀释。

6、混合加样

将Raji细胞悬液和SED工作液混匀，混合液接种到96孔检测白板(Costar，3917)40个实验孔，20μL/well加样。Jurkat-NFAT-LAG3-35B8细胞悬液接种所有实验孔，20μL/well加样。梯度抗体稀释液加样，20μL/well，空白对照组加20μL/well的Assay Buffer。96 孔板周围的空白孔，补加60μL Assay Buffer。

7、反应

整板用微孔板快速振荡器室温振荡混匀5-10min，置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱中孵育过夜(16-18h)。

9、检测结果

发光信号检测：整板用微孔板快速振荡器室温振荡混匀5min，每孔加入60μLBright-Glo^TM Luciferase Assay Reagent(Promega，E2620)混匀，室温下用多功能酶标仪(Tecan，F200pro)的荧光检测模块，选择96孔检测白板(Costar，3917)，然后读数检测发光信号。

IL2检测：取细胞上清用Human IL-2DuoSet ELISA(R&Dsysetems,DY202)检测IL2含量。

10、数据处理和分析

将读取发光信号值(如图2所示的RLUs)或IL2检测值(如图3所示的pg/mL)分别录入 Graphpad Prism软件计算并作图。

Jurkat-NFAT-LAG3-35B8克隆+Raji细胞测定加入抗体和发光信号量效关系实验结果如图 2所示，Jurkat-NFAT-LAG3-35B8克隆+Raji细胞测定加入抗体和IL2因子分泌的量效关系实验结果如图3所示。可见，LAG3抗体的加入能使Jurkat细胞分泌的细胞因子(如IL2)增加。根据细胞催化化学底物发出光信号的强弱或分泌细胞因子(如IL2)的量的多少随人LAG3蛋白结合分子浓度变化反映了人LAG3蛋白结合分子的活性强弱。此发明方法能快速准确地检测人LAG3蛋白结合分子的生物学活性。

实施例4、报告基因实验优化

1、Jurkat-NFAT-LAG3和Raji细胞比例关系

本发明涉及的细胞为Jurkat-NFAT-LAG3细胞克隆和Raji细胞。细胞取样时，Jurkat-NFAT-LAG3的细胞数为固定1×10⁵个/well，Raji细胞分别取样为Jurkat-NFAT-LAG3 细胞数的1/4、1/6和1/8。然后固定SED浓度在100ng/mL和150ng/mL条件下进行报告基因实验，选择对发光强度和信号窗口均比较良好的细胞数配比条件。不同细胞配比的条件对报告基因结果的影响如图4所示，在两个SED浓度条件下，不同细胞配比均可作出发光信号强度随抗体浓度变大而升高，以细胞配比4:1和8:1较优。

2、SED使用浓度

本发明涉及的SED的浓度为整板操作孔的均一浓度，可以选择100ng/ml和150ng/ml。然后在不同细胞配比4:1、6:1和8:1条件下进行报告基因实验，选择对发光强度和信号窗口均比较良好的SED浓度条件。不同SED浓度对报告基因结果的影响如图5所示，在三种细胞配比条件下，两种SED浓度均可作出发光信号强度随抗体浓度变大而升高，在SED浓度为150 ng/mL下，曲线更完整，优选150ng/mL。

本发明的保护范围不局限于上述实施例所述的具体技术方案，凡采用等同替换形成的技术方案均为本发明要求的保护范围。

序列表

<110> 南京维立志博生物科技有限公司

<120> 一种测定LAG3蛋白结合分子生物学活性的方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 521

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp

1 5 10 15

Val Ala Pro Val Lys Pro Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val

20 25 30

Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile

35 40 45

Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln

50 55 60

His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu

65 70 75 80

Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro

85 90 95

Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly

100 105 110

Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Arg

115 120 125

Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala Gly

130 135 140

Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys Arg

145 150 155 160

Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro Gly

165 170 175

Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser Arg

180 185 190

Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln Gly

195 200 205

Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser Phe

210 215 220

Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly Cys

225 230 235 240

Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Leu Thr

245 250 255

Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala Gly Ala

260 265 270

Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val Gly Thr

275 280 285

Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly Pro Asp

290 295 300

Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu Glu Asp

305 310 315 320

Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His Leu Gln

325 330 335

Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr Val Thr

340 345 350

Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu Cys Glu

355 360 365

Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser Leu Asp Thr

370 375 380

Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala Gln Glu Ala

385 390 395 400

Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln Gly Glu Arg

405 410 415

Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser Pro Gly Ala

420 425 430

Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Pro Ala Gly His Leu Leu

435 440 445

Leu Phe Leu Ile Leu Gly Val Leu Ser Leu Leu Leu Leu Val Thr Gly

450 455 460

Ala Phe Gly Phe His Leu Trp Arg Arg Gln Trp Arg Pro Arg Arg Phe

465 470 475 480

Ser Ala Leu Glu Gln Gly Ile His Pro Pro Gln Ala Gln Ser Lys Ile

485 490 495

Glu Glu Leu Glu Gln Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Glu Pro Glu Pro

500 505 510

Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Gln Leu

515 520

Claims

1.一种测定LAG3蛋白结合分子的生物学活性的方法，其特征在于包括在共表达NFAT报告元件和人LAG3蛋白的Jurkat细胞、超抗原和表达MHC-Ⅱ的递呈细胞并存的条件下，加入LAG3蛋白结合分子，LAG3蛋白结合分子与Jurkat细胞表达的LAG3蛋白特异性结合，使TCR通路保持激活状态，从而使NFAT报告元件表达荧光素酶，催化化学底物发光以及Jurkat细胞分泌细胞因子；通过测定发光强度或分泌细胞因子的量实现对LAG3蛋白结合分子生物活性的定量检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的LAG3蛋白结合分子为LAG3的特异性抗体或其他能够与LAG3蛋白特异性结合的生物大分子；所述的LAG3的特异性抗体选自relatlimab、LAG525、REGN3767、MK-4280、MGD013、Sym022、FS118、GSK2831781中的任意一种。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的具有MHC-Ⅱ表达的递呈细胞为Raji细胞或Daudi细胞，优选Raji细胞。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于Raji细胞数为共表达NFAT报告元件和人LAG3蛋白的Jurkat细胞数的1/10～1/2。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于Raji细胞数为共表达NFAT报告元件和人LAG3蛋白的Jurkat细胞数的1/2、1/4、1/6、1/8或1/10。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的共表达NFAT报告元件和人LAG3蛋白的Jurkat细胞通过如下方法构建：将包含NFAT报告元件的质粒和包含人LAG3全长的质粒通过电转染的方式转染到Jurkat细胞中，并通过加入潮霉素和嘌呤霉素加压筛选稳定表达NFAT报告元件和人LAG3蛋白的Jurkat细胞。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的超抗原选自SEA、SEB、SED、SEE中的任意一种，优选SED。

8.根据权利要求7述的方法，其特征在于所述的SED的浓度为25-200ng/ml。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的细胞因子选自干扰素γ、IL2、IL8、肿瘤坏死因子α中的任意一种，优选IL2。

10.一种用于测定LAG3蛋白结合分子生物学活性的Jurkat细胞，其特征在于该细胞为共表达NFAT报告元件和人LAG3蛋白的Jurkat细胞，通过以下方法构建：将包含NFAT报告元件的质粒和包含人LAG3全长序列的质粒通过电转染的方式转染到Jurkat细胞中，并通过加入潮霉素和嘌呤霉素加压筛选稳定表达NFAT报告元件和人LAG3蛋白的Jurkat细胞。

11.根据权利要求10所述的细胞，其特征在于所述的共表达NFAT报告元件和人LAG3蛋白的Jurkat细胞为人T淋巴细胞白血病细胞JNL-35B8，2018年6月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：2018130。

12.权利要求10或11所述的Jurkat细胞在测定LAG3蛋白结合分子生物学活性中的应用。

13.权利要求10或11所述的Jurkat细胞在制备检测LAG3蛋白结合分子生物学活性的试剂盒中的应用。

14.用于测定LAG3蛋白结合分子生物学活性的试剂盒，其特征在于包括权利要求10或11所述的共表达NFAT报告元件和人LAG3蛋白的Jurkat细胞、超抗原、具有MHC-Ⅱ表达的递呈细胞、具有浓度梯度的LAG3蛋白结合分子的稀释液、荧光素酶底物。

15.根据权利要求14所述的试剂盒，其特征在于所述的LAG3蛋白结合分子为LAG3的特异性抗体或其他能够与LAG3蛋白特异性结合的生物大分子；所述的超抗原为SED，SED的浓度优选25-200ng/ml；所述的具有MHC-Ⅱ表达的递呈细胞为Raji细胞或Daudi细胞，优选Raji细胞。

16.根据权利要求14所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒中还包括细胞因子检测试剂；所述的细胞因子检测试剂选自检测干扰素γ、IL2、IL8、肿瘤坏死因子α中的任意一种的试剂，优选IL2检测试剂。