CN109666699A

CN109666699A - 一种基于lag-3/mhc ii阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法

Info

Publication number: CN109666699A
Application number: CN201811653923.1A
Authority: CN
Inventors: 范春雷; 吴王亲; 武虎; 匡红; 刘美星; 莫平; 莫一平
Original assignee: Hangzhou Kexing Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Hangzhou Kexing Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-12-29
Filing date: 2018-12-29
Publication date: 2019-04-23
Anticipated expiration: 2038-12-29
Also published as: CN109666699B

Abstract

本发明建立了一种基于LAG‑3/MHC II阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法：将红色荧光蛋白tagRFP偶联于LAG‑3蛋白羧基末端末端(C端)，以及LAG‑3蛋白胞外域(1‑451aa)羧基末端(C端)，分别构建真核表达载体，并制备LAG‑3‑tagRFP及LAG‑3ex‑tagRFP融合蛋白；将人源MHC II蛋白基因构建在CMV启动子下，绿色荧光蛋白EGFP建在人工复合调控元件E‑Box_AP‑1_CRE序列下，并建立新型的稳转细胞系MHC II.E‑Box_AP‑1_CRE‑d2EGFP/A375，以LAG‑3‑tagRFP或LAG‑3ex‑tagRFP与细胞系的亲和进行荧光检测筛选阻断剂。本方法可精确反映抗LAG‑3药的效应，可同时获得阻断功能与LAG‑3/MHC II信号通路的生物学效应数据，构建快速筛选抗LAG‑3药物和评估其生物学效应的实验模型。

Description

一种基于LAG-3/MHC II阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法

技术领域

本发明涉及一种基于Lag-3/MHCII靶点及其生物效应的药物快速筛选方法，属于生物技术领域。

背景技术

淋巴细胞活化基因-3(Lymphocyte activation gene 3，LAG-3)主要表达于活化的 T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)和浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cells，PDCs)，与主要组织相容性复合体II类分子(majorhistocompatibility complex class Il，MHC II)具有高亲和力，通过对T细胞活化的负调控参与免疫调节。

LAG-3显著表达在霍奇金淋巴瘤的里-斯细胞(Hodgkin/Reed-Sternberg cell，HRS)丰富的区域。淋巴细胞浸润的黑素瘤转移淋巴结不仅包含表达LAG-3的T细胞，也包含较高比例的表达LAG-3的NKT和NK细胞。黑素瘤细胞上MHC II能和 T细胞上LAG-3相互作用。LAG-3也可以活化MHC II阳性的黑色素瘤细胞的丝裂素活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(mitogen-activated protein kinase/ extracellular signal regulated kinase，MAPK/Erk)和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶 B(phosphatidylinositol-3-kinase/proteinkinase B，P13K/Akt)信号通路。不论可溶性 LAG-3还是细胞膜上表达的LAG-3，都能保护MHCII阳性的A375黑素瘤细胞不受 Fas介导的凋亡，也保护MHCII阳性的Mell黑素瘤细胞免于化疗药物依托泊苷介导的凋亡，这些保护作用都和MAPK/Erk和P13K/Akt信号通路有关系。黑色素瘤细胞上LAG-3和MHC II的相互作用正调节MAPK/Erk和P13K/Akt信号通路。因而可利用阻止LAG-3与MHc II相互作用形成复合物作为手段来治疗MHCII阳性的黑色素瘤。

基于LAG-3/MHC II阻断功能的抗癌新药，包括抗Lag-3单抗药、小分子阻断剂、多肽阻断剂等的研发已是目前医药领域热点之一。但目前为止尚未见有关基于LAG-3/MHC II阻断功能及其生物效应的新药快速、高效而精准的筛选系统。

发明内容

本发明的目的是建立了一种基于LAG-3/MHC II阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法。

本发明构思如下：

采用红色荧光蛋白tagRFP偶联于LAG-3蛋白胞外域羧基末端(L451)，将该荧光蛋白标记基因构建载体并在细胞内表达，制备融合蛋白。LAG-3/MHCII的结合可以激活细胞(如黑色素瘤细胞)内的MAPK/Erk信号通路，该通路可通过磷酸化CREB转录因子使其进入细胞核内作用于CRE元件而调控下游基因的表达。AP-1 可作用于靶基因启动子上的AP-1结合位点，而AP-1的活性同样可由MAPK信号转导通路的磷酸化调控。E-Box是一种DNA序列，通常位于在一个启动子区域的基因的上游，它是一种转录因子结合位点，可以绑定到它来帮助启动基因的转录的蛋白质的特定序列的DNA。由此，我们设计了E-Box_AP-1_CRE人工复合调控元件，并将绿色荧光蛋白基因d2EGFP构建在其下游，实时应答LAG-3/MHC II的结合情况。另外，将人源MHC II基因克隆到真核表达载体CMV启动子下，两个基因质粒共转染细胞，建立稳转细胞系。将抗Lag-3的单抗药、小分子、或多肽阻断剂等新药与Lag-3ex-tagRFP融合蛋白共孵育后再与稳转细胞一起共孵育，清洗非特异性结合后检测荧光值。通过检测红色荧光蛋白tagRFP荧光值判断该抗 Lag-3药具有Lag-3/MHC II阻断功能；通过检测绿色荧光蛋白d2EGFP荧光值并与对照组比较，判断抗Lag-3药具有Lag-3/MHCII阻断功能。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种基于LAG-3/MHCII阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法，包括以下步骤：

1)将第一荧光蛋白与LAG-3蛋白胞外域羧基末端(L451)连接，构建重组 Lag-3ex-第一荧光蛋白融合蛋白；

2)将第二荧光蛋白构建在E-Box_AP-1_CRE人工复合调控元件的下游，构建调控表达质粒；在CMV启动子下连接人源MHC II基因，构建表达质粒；

3)将表达E-Box_AP-1_CRE-第二荧光蛋白质粒和CMV-MHC II基因共转染到黑素瘤细胞中，建立稳转细胞系；

4)抗Lag-3的单抗药、小分子、或多肽阻断剂等新药与重组Lag-3ex-第一荧光蛋白融合蛋白共孵育后，与稳转细胞孵育，清洗非特异性结合；

5)分别检测第一、第二荧光蛋白荧光值，并判断新药对Lag-3/MHCII信号通路的阻断功能。

进一步地，第一荧光蛋白是tagRFP红色荧光蛋白；第二荧光蛋白是绿色荧光蛋白d2EGFP基因。

进一步地，步骤1)中，将红色荧光蛋白tagRFP基因与LAG-3蛋白胞外域羧基末端(L451)基因构建在同一个读码框使红色荧光蛋白tagRFP接或LAG-3蛋白胞外域C端(L451)形成所述Lag-3ex-tagRFP融合蛋白，同时在tagRFP的C端接上6个组氨酸His标签。

进一步地，步骤1)中，将Lag-3ex-tagRFP基因克隆至真核高表达载体CMV 启动子下游，并转染至人胚肾细胞293，筛选克隆获得高表达Lag-3ex-tagRFP融合蛋白的Lag-3ex-tagRFP/293细胞系；扩增该Lag-3ex-tagRFP/293细胞，裂解后用His亲和法制备纯化含重组Lag-3ex-tagRFP融合蛋白。

进一步地，步骤2)中，通过连接肽序列T2A将人源MHCII基因的α亚基与β亚基前后连接在同一个读码框里，并将复合基因通过EcoR I/Not I亚克隆到慢病毒表达载体pLV-puro的CMV启动子下，构建表达质粒pCMV-MHCII。

进一步地，步骤2)中，将绿色荧光蛋白d2EGFP构建在E-Box_AP-1_CRE人工复合调控元件下，通过Cla I/Not I双酶切克隆至慢病毒载体pLV-puro，去掉原有的CMV启动子，构建调控表达报告基因质粒pE-Box_AP-1_CRE-d2EGFP

进一步地，步骤2)中，将pCMV-MHC II和pE-Box_AP-1_CRE-d2EGFP分别与慢病毒包装质粒pH1、pH2共转染到慢病毒包装系细胞293V，制备CMV-MHC II和E-Box_AP-1_CRE-d2EGFP慢病毒，并共转染A375细胞，建立稳转细胞系MHC II.E-Box_AP-1_CRE-d2EGFP/A375。

进一步地，步骤3)中，抗Lag-3的单抗药、小分子、或多肽阻断剂等新药与重组Lag-3ex-tagRFP融合蛋白共孵育后，与稳转细胞孵育；同时设立重组 Lag-3ex-tagRFP融合蛋白与MHCII.E-Box_AP-1_CRE-d2EGFP/A375细胞直接共孵育的对照组。

进一步地，步骤4)中，经缓冲液清洗去除非特异性结合后用流式细胞仪、或荧光酶标仪分析细胞表面的红色荧光蛋白tagRFP荧光值以及细胞内的绿色荧光蛋白d2EGFP荧光值。通过药物组荧光值与对照组比较，判断抗Lag-3药对 Lag-3/MHC II阻断功能。

另一方面，本发明提供一种稳转细胞系，其能够筛选对Lag-3/MHC II (MAPK/Erk)信号通路具有阻断功能的药物。

进一步地，该稳转细胞系中包含一个CMV启动高表达的人源MHC II基因和一个由人工复合调控元件E-Box_AP-1_CRE调控的荧光蛋白，当Lag-3/MHC II (MAPK/Erk)信号通路正常连接或被阻断时，能够激发或不激发荧光信号。

另一方面，本发明提供一种基于Lag-3/MHC II阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法，包括以下步骤：

1)将红色荧光蛋白tagRFP偶联于Lag-3蛋白胞外域羧基末端(L451)，制备 Lag-3ex-tagRFP融合蛋白。

2)将人源MHC II基因克隆到真核表达载体CMV启动子下，获得质粒 pCMV-MHC II；将绿色荧光蛋白d2EGFP基因构建在E-Box_AP-1_CRE人工复合调控元件的下游，获得质粒pE-Box_AP-1_CRE-d2EGFP；将CMV-MHC II和 E-Box_AP-1_CRE-d2EGFP基因共转染到A375黑素瘤细胞中，建立MHC II.E-Box_AP-1_CRE-d2EGFP/A375稳转细胞系。

3)将抗Lag-3的单抗药、小分子、或多肽阻断剂等新药与重组Lag-3ex-tagRFP 融合蛋白共孵育后，与稳转细胞孵育；同时设立重组Lag-3ex-tagRFP融合蛋白与 MHC II.E-Box_AP-1_CRE-d2EGFP/A375细胞直接共孵育的对照组。

4)清洗去除非特异性结合后，检测细胞表面的红色荧光蛋白tagRFP荧光值；以及细胞内的绿色荧光蛋白d2EGFP荧光值，并与对照组比较。

5)依据荧光值判断抗Lag-3的新药对Lag-3/MHC II信号通路的阻断作用。

进一步地，编码LAG-3ex-tagRFP融合蛋白的DNA基因序列如SEQ ID NO：1 所示，表达后LAG-3ex-tagRFP融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

编码MHC II的DNA基因序列如SEQ ID NO：3所示，表达后MHC II蛋白序列如 SEQID NO：4所示；

人工复合调控元件E-Box_AP-1_CRE的DNA基因序列(1-135bp)及其调控表达的d2EGFP基因序列(136-981bp)如SEQ ID NO：5所示。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(1)快速简便、低成本，系统除了必要的阻断效应实验步骤外无需另外处理，如用荧光素酶的话需裂解细胞并要用昂贵的荧光素酶试剂盒。本发明的方法可直接用活细胞，即测即得，并可进行动态监测。

(2)可用通用的流式细胞仪、荧光酶标仪等方法测定，适用绝大多数普通实验室。

(3)系统可精确反映抗LAG-3药的效应。

(4)使用活细胞检测，一个样本可同时获得Lag-3/MHc II的阻断功能与 Lag-3/MHc II信号通路的生物学效应数据，为快速筛选抗Lag-3/MHC II药物和评估其生物学效应提供了一个新型强有力的系统和实验模型。

附图说明

图1pCMV-Lag-3extagRFP质粒图谱

图2pCMV-MHC II质粒图谱

图3pCMV-E-Box_AP-1_CRE-d2EGFP质粒图谱。如图所示，将半衰期为2小时的绿色荧光蛋白构建在E-Box_AP-1_CRE人工复合调控元件的下游，使其能实时应答Lag-3/MHC II信号通路的变化。

图4使用快速筛选系统筛选抗Lag-3单抗药。检测数据如图所示，空白组的平均荧光强度MFI(Red)＝7.3；对照组的MFI(Red)＝8120.5，是空白组的1112.4倍；实验组的MFI(Red)各不相等，其中筛选出6个阻断性能优良(MFI(Red)≤500)的抗 LAG-3单抗药，即anti-Lag-3-4_MFI(Red)＝448.2；anti-Lag-3-9_MFI(Red)＝117.6； anti-Lag-3-20_MFI(Red)＝8.4；anti-Lag-3-38_MFI(Red)＝132.6；anti-Lag-3-42_MFI(Red)＝51.5； anti-Lag-3-51_MFI(Red)＝32.6。

图5使用快速筛选系统检测抗Lag-3单抗药的生物学效应。检测数据如图所示，空白组的平均荧光强度MFI(Green)＝7.4；对照组的MFI(Green)＝4344.2，为空白组的587.1倍；实验组的MFI(Green)各不相等，其中可筛选出6个生物效应优良 (MFI(Green)≤300)的抗Lag-3单抗药，即anti-Lag3-3-4_MFI(Green)＝270.2；anti- Lag3-3-9_MFI(Green)＝92.4；anti-Lag3-3-20_MFI(Green)＝33.7；anti-Lag3-3-38_MFI(Green)＝100.5； anti-Lag3-3-42_MFI(Green)＝56.9；anti-Lag3-3-51_MFI(Green)＝46.7。

图6Elisa法筛选抗Lag-3单抗药。检测数据如图所示，空白组的OD＝0.2；对照组的OD＝1.8，是空白组的9倍；实验组的OD值各不相等，其中筛选出19个阻断性能较好(OD≤0.5)的抗MHCII单抗药，即anti-Lag-3-2_OD＝0.3；anti-Lag-3-4_OD＝0.2； anti-Lag-3-9_OD＝0.2；anti-Lag-3-17_OD＝0.3；anti-Lag-3-18_OD＝0.3；anti-Lag-3-19_OD＝0.3； anti-Lag-3-21_OD＝0.3；anti-Lag-3-22_OD＝0.3；anti-Lag-3-23_OD＝0.3；anti-Lag-3-30_OD＝0.2； anti-Lag-3-31_OD＝0.2；anti-Lag-3-35_OD＝0.3；anti-Lag-3-36_OD＝0.3；anti-Lag-3-38_OD＝0.4；anti-Lag-3-39_OD＝0.5；anti-Lag-3-40_OD＝0.3；anti-Lag-3-42_OD＝0.4；anti-Lag-3-47_OD＝0.4；anti-Lag-3-49_OD＝0.4。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。

实施例1重组Lag-3ex-tagRFP融合蛋白的制备

将红色荧光蛋白tagRFP基因与人Lag-3胞外结构域基因构建在同一个读码框使红色荧光蛋白tagRFP接于Lag-3蛋白胞外结构域C端(L451)形成 Lag-3ex-tagRFP融合蛋白，同时在tagRFP的C端接上6个组氨酸His标签。由于Lag-3与MHC II的结合位点在胞外域的N端，故tagRFP接于Lag-3胞外结构域的C端，不影响Lag-3与MHC II的结合。前后两端的限制性内切酶 EcoRI(GAATTC)和SexAI(ACCTGGT)用于基因合成后连接于慢病毒表达载体 pLV-Puro的CMV启动子下游，并去掉了原质粒中的PGK启动子和Puro抗性基因，获得质粒pCMV-Lag-3ex-tagRFP(图1)。末端的6个His标签用于蛋白His 亲和柱纯化以及用His₆抗体鉴定目标蛋白。Flag标签(DYKDDDDK)前面为 Lag-3ex蛋白，后面为tagRFP蛋白；可用Flag抗体鉴定目标蛋白，蛋白纯化后还可以用肠激酶(特异性识别序列DDDDK)将Lag-3ex蛋白与tagRFP蛋白切开。将pCMV-Lag-3ex-tagRFP与质粒pH1、pH2共转染至慢病毒包装系细胞293V，经5代或20天以上培养获得稳定表达目的蛋白细胞后，荧光显微镜下，用50μl 的移液枪挑取高表达Lag-3ex-tagRFP融合蛋白的Lag-3ex-tagRFP/293细胞克隆。 Lag-3ex-tagRFP/293细胞扩增后用293细胞专用无蛋白培养液培养，收集培养液 (Lag-3ex-tagRFP为分泌蛋白)，饱和硫酸铵沉淀目标蛋白，用His结合缓冲液透析后，上Ni²⁺或Co²⁺His亲和法柱制备纯化重组Lag-3ex-tagRFP融合蛋白。

Lag-3ex-tagRFP融合蛋白的制备纯化和鉴定的具体过程包括：

(1)将Lag-3ex-tagRFP/293细胞扩增后用293细胞专用无蛋白培养液培养，收集培养液(Lag-3ex-tagRFP为分泌蛋白)，60-80％饱和度的硫酸铵沉淀目标蛋白；沉淀用结合缓冲液(20mM Tris-HCl(PH8.0)、150mM NaCl、2μg/ml Aprotinin、 2μg/ml Leupeptin、1mM的PMSF、0.1％DNA酶和0.05％RNA酶)、10％(V/V) Glycerol溶解。

(2)用10KD蛋白分子量截留的超滤管离心(6000g、4℃、30min)，浓缩；用结合缓冲液置换3遍，去除硫酸铵。

(3)加入Ni²⁺-NTA-Sepharose亲和柱材料，混匀后，摇床4℃、140rpm震荡 1-2小时。

(4)放入重力柱，先用结合缓冲液洗3遍，弃洗脱液；用清洗缓冲液(含 20-60mM咪唑的结合缓冲液)清洗三遍。

(5)用洗脱液(含200mM咪唑的结合缓冲液)洗脱，收集洗脱液。

(6)用10KD蛋白分子量截留的超滤管离心(6000g、4℃、30min)，浓缩蛋白；用PBSpH7.4置换3遍，收集蛋白液，因为Lag-3ex-tagRFP融合蛋白有红色荧光蛋白标签，纯化后的蛋白液显红色，红色越深目标蛋白浓度越高；蛋白液加 15％甘油，分装于4℃保存。

(7)取2.5μL用BCA法测蛋白质浓度。

(8)取4μg蛋白质样品进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，脱色后观察蛋白质纯度。

(9)Western-blot验证目标蛋白质特异性，包括用His₆抗体、Flag抗体、及Lag-3抗体验证。

如上述步骤中，获得的Lag-3ex-tagRFP融合蛋白的DNA基因序列(7-2100bp) 如SEQ ID NO：1所示，表达后Lag-3ex-tagRFP融合蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。

实施例2质粒pCMV-MHC II的构建

将人源MHC II基因的α亚基与β亚基通过T2A序列 (EGRGSLLTCGDVEENPGP)连接构建在慢病毒表达载体pLV-Puro的CMV启动子下游，通过EcoR I/Not I双酶切克隆至慢病毒表达载体pLV-Puro，获得质粒 pCMV-MHC II(如图2所示)。获得的MHC II的α亚基(7-768bp)-T2A序列 (769-822bp)-β亚基(823-1616bp)的DNA基因序列如SEQ ID NO：3所示，表达后MHC IIα亚基(1-254aa)-T2A(255-272aa)-β亚基(273-535aa)蛋白序列如SEQ ID NO：4所示。

实施例3pE-Box_AP-1_CRE-d2EGFP质粒的构建

将绿色荧光蛋白基因d2EGFP构建在E-Box_AP-1_CRE人工复合调控元件的下游，通过Cla I/Not I双酶切克隆至慢病毒载体pLV-Puro，去掉原有的CMV启动子，获得由E-Box_AP-1_CRE调控表达的质粒pE-Box_AP-1_CRE-d2EGFP(如图3所示)。E-Box_AP-1_CRE人工复合调控元件的DNA基因序列(1-135bp)及其调控表达的d2EGFP基因序列(136-981bp)如SEQID NO：5所示。

实施例4建立MHC II.E-Box_AP-1_CRE-d2EGFP/A375稳转细胞系

将pCMV-MHC II和pE-Box_AP-1_CRE-d2EGFP分别与慢病毒包装质粒pH1、 pH2共转染到慢病毒包装系细胞293V，制备CMV-MHC II和 E-Box_AP-1_CRE-d2EGFP慢病毒，并共转染A375细胞，筛选克隆建立新型的MHC II.E-Box_AP-1_CRE-d2EGFP/A375稳转细胞系。

实施例5基于快筛系统筛选抗Lag-3单抗药

实验组先将2μg/mL的Lag-3ex-tagRFP融合蛋白分别与各1μg/mL的51种待筛选的抗Lag-3单抗药(anti-LAG-3-1～anti-LAG-3-51)分别孵育20分钟。洗去非特异性结合后，再同MHCII.E-Box_AP-1_CRE-d2EGFP/A375细胞共孵育为实验组。同时设立不做任何处理的MHCII.E-Box_AP-1_CRE-d2EGFP/A375细胞为空白组；设立MHCII.E-Box_AP-1_CRE-d2EGFP/A375细胞与各2μg/mL的Lag-3ex-tagRFP融合蛋白直接共孵育为对照组。共孵育至20分钟时，分别从以上组别中取部分细胞，洗去非特异性结合，用流式细胞仪分析细胞表面tagRFP荧光值；待共孵育至4 小时时，分别取以上组别的剩余细胞，洗去非特异性结合后，用流式细胞仪分析细胞内部d2EGFP荧光值。

检测数据如图4所示，本实施例5中空白组的平均荧光强度MFI(Red)＝7.3；对照组的MFI(Red)＝8120.5，是空白组的1112.4倍；实验组的MFI(Red)各不相等，其中筛选出6个阻断性能优良(MFI(Red)≤500)的抗LAG-3单抗药，即 anti-Lag-3-4_MFI(Red)＝448.2；anti-Lag-3-9_MFI(Red)＝117.6；anti-Lag-3-20_MFI(Red)＝8.4； anti-Lag-3-38_MFI(Red)＝132.6；anti-Lag-3-42_MFI(Red)＝51.5；anti-Lag-3-51_MFI(Red)＝32.6。

检测数据又如图5所示，本实施例5中空白组的平均荧光强度 MFI(Green)＝7.4；对照组的MFI(Green)＝4344.2，为空白组的587.1倍；实验组的 MFI(Green)各不相等，其中可筛选出6个生物效应优良(MFI(Green)≤300)的抗Lag-3 单抗药，即anti-Lag3-3-4_MFI(Green)＝270.2；anti-Lag3-3-9_MFI(Green)＝92.4； anti-Lag3-3-20_MFI(Green)＝33.7；anti-Lag3-3-38_MFI(Green)＝100.5； anti-Lag3-3-42_MFI(Green)＝56.9；anti-Lag3-3-51_MFI(Green)＝46.7。

由图4、5检测结果显示，抗Lag-3单抗阻断Lag-3/MHCII结合的能力和生物学效应在本文所述之体系中表现出很好的一致性。

如上所述，使用本文所述之系统从51种待筛选抗Lag-3单抗药中筛选到6种具有较好阻断能力和生物学效应的抗Lag-3单抗药。进一步结合对比例1(具体实施见下文)的数据，证明本系统在反映抗Lag-3单抗药阻断MHCII和Lag-3的结合上，其特异性是高度优于其他系统的。且同时还能体现其生物学效应，即该抗 Lag-3单抗药通过对Lag-3/MHCII的阻断作用抑制了Lag-3/MHCII对MAPK/Erk信号通路的激活作用。

对比例1：Elisa法筛选抗Lag-3单抗药。

先以250ng/mL浓度Lag-3ex-tagRFP融合蛋白过夜包被96孔板。洗板5次尽去非特异性结合后，实验组加入各1μg/mL的51种待筛选抗Lag-3单抗药 (anti-Lag-3-1～anti-Lag-3-51)分别孵育30分钟。洗板5次尽去非特异性结合后，加入生物素标记的MHCII-3蛋白，孵育30分钟；洗板5次尽去非特异性结合。加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的亲合素，孵育30分钟。洗板5次尽去非特异性结合后，加底物TMB显色10分钟，随后加酸终止。同时设立不加任何单抗药和生物素标记的MHCII蛋白，仅显色终止的为空白组；设立仅加辣根过氧化物酶(HRP) 标记的亲合素，随后显色、终止为对照组。最后以上各组用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD)值。

检测数据如图6所示，本对比例1中空白组的OD＝0.2；对照组的OD＝1.8，是空白组的9倍；实验组的OD值各不相等，其中筛选出19个阻断性能较好(OD ≤0.5)的抗MHCII单抗药，即anti-Lag-3-2_OD＝0.3；anti-Lag-3-4_OD＝0.2； anti-Lag-3-9_OD＝0.2；anti-Lag-3-17_OD＝0.3；anti-Lag-3-18_OD＝0.3；anti-Lag-3-19_OD＝0.3；anti-Lag-3-21_OD＝0.3；anti-Lag-3-22_OD＝0.3；anti-Lag-3-23_OD＝0.3；anti-Lag-3-30_OD＝0.2； anti-Lag-3-31_OD＝0.2；anti-Lag-3-35_OD＝0.3；anti-Lag-3-36_OD＝0.3；anti-Lag-3-38_OD＝0.4； anti-Lag-3-39_OD＝0.5；anti-Lag-3-40_OD＝0.3；anti-Lag-3-42_OD＝0.4；anti-Lag-3-47_OD＝0.4； anti-Lag-3-49_OD＝0.4。

对比实施例1，不难发现，以Elisa法筛选抗Lag-3单抗药，其特异性、精确性和识别度不如本文所述之系统，且仅能反映抗Lag-3单抗药对于Lag-3/MHCII 结合的阻断作用，不能获得信号通路应答的生物学效应数据。而且，以Elisa法进行筛选还有操作繁琐、特异性低、误差较大、试剂盒成本较高等缺点。

综上所述，本系统1)快速简便、低成本，系统除了必要的阻断效应实验步骤外无需另外处理，即测即得，并可进行动态监测。2)可用通用的流式细胞仪、荧光酶标仪等多种方法测定，普适性好。3)系统可精确反映抗Lag-3药的效应，稳定性好，精确度高，特异性高。4)一个系统可同时进行单抗、多肽、小分子等多种类型的抗Lag-3药物筛选，简便多用。5)一个样本可同时获得Lag-3/MHC II的阻断功能与MAPK/Erk信号通路的生物学效应数据，为快速筛选抗Lag-3药物和评估其生物学效应提供了一个新型强有力的系统和实验模型。

以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术特点的前体下，还可以做出变化和改进。这些变化和改进均属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州科兴生物科技有限公司

<120> 一种基于Lag-3_MHCII阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法

<130> 1

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2127

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 1

gaattcatgt gggaggccca gttcctgggc ctgctgtttc tgcagccact gtgggtggca 60

ccagtgaagc ctctgcagcc aggagccgag gtgccagtgg tgtgggcaca ggagggcgcc 120

cctgcccagc tgccctgctc ccctaccatc ccactgcagg acctgtctct gctgcggaga 180

gcaggagtga catggcagca ccagccagat tccggaccac ctgctgccgc cccaggacac 240

cctctggccc caggccccca ccctgccgcc ccaagctcct ggggaccaag gcccaggcgc 300

tataccgtgc tgagcgtggg accaggagga ctgcggtccg gcagactgcc actgcagccc 360

cgcgtgcagc tggacgagag gggccgccag aggggcgatt tctccctgtg gctgaggcca 420

gcaaggagag cagacgcagg cgagtacaga gccgccgtgc acctgagaga tagggccctg 480

tcttgcaggc tgaggctgag actgggacag gcctccatga cagcatctcc accaggcagc 540

ctgagagcat ccgactgggt catcctgaac tgtagcttct ccaggcctga tcgcccagcc 600

agcgtgcact ggtttaggaa taggggacag ggaagggtgc cagtgagaga gtctccccac 660

caccacctgg ccgagagctt cctgtttctg ccccaggtgt ctcctatgga cagcggacca 720

tggggatgca tcctgaccta cagggatggc ttcaacgtgt ccatcatgta taatctgaca 780

gtgctgggcc tggagcctcc aacccctctg acagtgtatg caggagcagg ctctagggtg 840

ggactgccat gtaggctgcc agcaggagtg ggaacccgca gcttcctgac cgcaaagtgg 900

acaccacctg gaggaggacc tgacctgctg gtgaccggcg acaacggcga cttcaccctg 960

cggctggagg acgtgagcca ggcacaggca ggaacctaca catgccacat ccacctgcag 1020

gagcagcagc tgaatgccac cgtgacactg gccatcatca ccgtgacacc taagtccttt 1080

ggctctccag gcagcctggg caagctgctg tgcgaggtga ccccagtgag cggccaggag 1140

aggttcgtgt ggtctagcct ggacacacca tcccagcgga gcttcagcgg accatggctg 1200

gaggcacagg aggcacagct gctgagccag ccttggcagt gccagctgta ccagggagag 1260

agactgctgg gagcagccgt gtatttcacc gagctgtcct ctccaggcgc ccagcggtct 1320

ggcagagccc ctggcgccct gccagcagga cacctgctgg actacaagga cgatgacgat 1380

aagctcgaga gcgagctgat caaggagaac atgcacatga agctgtatat ggagggcacc 1440

gtgaacaatc accactttaa gtgtacatct gagggagagg gcaagccata cgagggaacc 1500

cagacaatgc ggatcaaggt ggtggaggga ggacctctgc cattcgcctt tgatatcctg 1560

gccacctcct tcatgtacgg cagccggacc ttcatcaatc acacacaggg catccctgac 1620

ttctttaagc agagcttccc agagggcttt acctgggaga gggtgaccac atatgaggat 1680

ggcggcgtgc tgaccgccac acaggacaca tccctgcagg atggctgtct gatctacaac 1740

gtgaagatcc gcggcgtgaa cttcccctct aatggccctg tgatgcagaa gaagaccctg 1800

ggctgggagg ccaatacaga gatgctgtat cctgcagacg gaggcctgga gggccggagc 1860

gatatggccc tgaagctggt gggaggagga cacctgatct gcaactttaa gaccacatac 1920

agatccaaga agcccgccaa gaatctgaag atgcctggcg tgtactatgt ggaccacagg 1980

ctggagcgca tcaaggaggc cgataaggag acctacgtgg agcagcacga ggtggcagtg 2040

gcaaggtatt gtgacctgcc cagcaagctg ggccacaagc accaccacca ccaccactag 2100

cggccgcatc tagaagatct acctggt 2127

<210> 2

<211> 697

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 2

Met Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp

1 5 10 15

Val Ala Pro Val Lys Pro Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val

20 25 30

Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile

35 40 45

Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln

50 55 60

His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu

65 70 75 80

Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro

85 90 95

Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly

100 105 110

Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln

115 120 125

Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala

130 135 140

Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys

145 150 155 160

Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro

165 170 175

Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser

180 185 190

Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln

195 200 205

Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser

210 215 220

Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly

225 230 235 240

Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn

245 250 255

Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala

260 265 270

Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val

275 280 285

Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly

290 295 300

Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu

305 310 315 320

Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His

325 330 335

Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr

340 345 350

Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu

355 360 365

Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser Ser

370 375 380

Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala

385 390 395 400

Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln

405 410 415

Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser

420 425 430

Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Pro Ala Gly

435 440 445

His Leu Leu Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Leu Glu Ser Glu Leu

450 455 460

Ile Lys Glu Asn Met His Met Lys Leu Tyr Met Glu Gly Thr Val Asn

465 470 475 480

Asn His His Phe Lys Cys Thr Ser Glu Gly Glu Gly Lys Pro Tyr Glu

485 490 495

Gly Thr Gln Thr Met Arg Ile Lys Val Val Glu Gly Gly Pro Leu Pro

500 505 510

Phe Ala Phe Asp Ile Leu Ala Thr Ser Phe Met Tyr Gly Ser Arg Thr

515 520 525

Phe Ile Asn His Thr Gln Gly Ile Pro Asp Phe Phe Lys Gln Ser Phe

530 535 540

Pro Glu Gly Phe Thr Trp Glu Arg Val Thr Thr Tyr Glu Asp Gly Gly

545 550 555 560

Val Leu Thr Ala Thr Gln Asp Thr Ser Leu Gln Asp Gly Cys Leu Ile

565 570 575

Tyr Asn Val Lys Ile Arg Gly Val Asn Phe Pro Ser Asn Gly Pro Val

580 585 590

Met Gln Lys Lys Thr Leu Gly Trp Glu Ala Asn Thr Glu Met Leu Tyr

595 600 605

Pro Ala Asp Gly Gly Leu Glu Gly Arg Ser Asp Met Ala Leu Lys Leu

610 615 620

Val Gly Gly Gly His Leu Ile Cys Asn Phe Lys Thr Thr Tyr Arg Ser

625 630 635 640

Lys Lys Pro Ala Lys Asn Leu Lys Met Pro Gly Val Tyr Tyr Val Asp

645 650 655

His Arg Leu Glu Arg Ile Lys Glu Ala Asp Lys Glu Thr Tyr Val Glu

660 665 670

Gln His Glu Val Ala Val Ala Arg Tyr Cys Asp Leu Pro Ser Lys Leu

675 680 685

Gly His Lys His His His His His His

690 695

<210> 3

<211> 1623

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 3

gaattcatga tcctgaacaa ggccctgctg ctgggcgccc tggccctgac cacagtgatg 60

tctccttgcg gaggagagga catcgtggca gatcacgtgg ccagctacgg cgtgaatctg 120

taccagagct atggcccatc cggccagtac acccacgagt tcgacggcga tgagcagttt 180

tatgtggacc tgggccgcaa ggagacagtg tggtgtctgc ccgtgctgag gcagttccgc 240

tttgatcctc agttcgccct gaccaacatc gccgtgacaa agcacaacct gaatatcctg 300

atcaagcgga gcaactccac cgccgccaca aatgaggtgc cagaggtgac cgtgttctct 360

aagagccctg tgaccctggg ccagccaaac acactgatct gcctggtgga caatatcttt 420

ccccctgtgg tgaacatcac ctggctgtct aatggacaca gcgtgaccga gggcgtgtcc 480

gagacatctt tcctgtccaa gtctgaccac tctttcttta agatcagcta cctgaccttt 540

ctgcccagcg ccgacgagat ctatgattgc aaggtggagc actggggcct ggatgagcca 600

ctgctgaagc actgggagcc cgagatccct gccccaatga gcgagctgac cgagacagtg 660

gtgtgcgcac tgggactgtc cgtgggactg gtgggaatcg tggtgggcac cgtgttcatc 720

atcaggggac tgagatccgt gggagcctct agacaccagg gaccactgga gggaagggga 780

tccctgctga catgcggcga tgtggaggag aatcccggcc ctatgtcttg gaagaaggcc 840

ctgcgcatcc ctggaggact gagggcagca accgtgacac tgatgctggc catgctgtcc 900

acccctatgg cagagggaag ggactctcca gaggatttcg tgtaccagtt taaggccatg 960

tgctatatca ccaacggcac agagaggctg cgctacgtga cccggtacat ctataataga 1020

gaggagtacg ccaggtttga cagcgatgtg gaggtgtata gagcagtgac acctctggga 1080

ccaccagacg cagagtactg gaactcccag aaggaggtgc tggagcggac cagagccgag 1140

ctggatacag tgtgccgcca caattatcag ctggagctgc ggaccacact gcagcggaga 1200

gtggagccca ccgtgacaat cagcccttcc agaaccgagg ccctgaacca ccacaatctg 1260

ctggtgtgct ctgtgacaga cttctacccc gcccagatca aggtgaggtg gtttcgcaac 1320

gatcaggagg agaccacagg cgtggtgtcc accccactga tcaggaatgg cgactggaca 1380

tttcagatcc tggtcatgct ggagatgacc ccccagcacg gcgacgtgta cacatgtcac 1440

gtggagcacc caagcctgca gaaccccatc accgtggagt ggagagccca gtctgagagc 1500

gcccagagca agatgctgtc cggaatcgga ggattcgtgc tgggcctgat ctttctgggc 1560

ctgggcctga tcatccacca caggtcccag aagggcctgc tgcacgacta taatagcggc 1620

cgc 1623

<210> 4

<211> 535

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 4

Met Ile Leu Asn Lys Ala Leu Leu Leu Gly Ala Leu Ala Leu Thr Thr

1 5 10 15

Val Met Ser Pro Cys Gly Gly Glu Asp Ile Val Ala Asp His Val Ala

20 25 30

Ser Tyr Gly Val Asn Leu Tyr Gln Ser Tyr Gly Pro Ser Gly Gln Tyr

35 40 45

Thr His Glu Phe Asp Gly Asp Glu Gln Phe Tyr Val Asp Leu Gly Arg

50 55 60

Lys Glu Thr Val Trp Cys Leu Pro Val Leu Arg Gln Phe Arg Phe Asp

65 70 75 80

Pro Gln Phe Ala Leu Thr Asn Ile Ala Val Thr Lys His Asn Leu Asn

85 90 95

Ile Leu Ile Lys Arg Ser Asn Ser Thr Ala Ala Thr Asn Glu Val Pro

100 105 110

Glu Val Thr Val Phe Ser Lys Ser Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Asn

115 120 125

Thr Leu Ile Cys Leu Val Asp Asn Ile Phe Pro Pro Val Val Asn Ile

130 135 140

Thr Trp Leu Ser Asn Gly His Ser Val Thr Glu Gly Val Ser Glu Thr

145 150 155 160

Ser Phe Leu Ser Lys Ser Asp His Ser Phe Phe Lys Ile Ser Tyr Leu

165 170 175

Thr Phe Leu Pro Ser Ala Asp Glu Ile Tyr Asp Cys Lys Val Glu His

180 185 190

Trp Gly Leu Asp Glu Pro Leu Leu Lys His Trp Glu Pro Glu Ile Pro

195 200 205

Ala Pro Met Ser Glu Leu Thr Glu Thr Val Val Cys Ala Leu Gly Leu

210 215 220

Ser Val Gly Leu Val Gly Ile Val Val Gly Thr Val Phe Ile Ile Arg

225 230 235 240

Gly Leu Arg Ser Val Gly Ala Ser Arg His Gln Gly Pro Leu Glu Gly

245 250 255

Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro

260 265 270

Met Ser Trp Lys Lys Ala Leu Arg Ile Pro Gly Gly Leu Arg Ala Ala

275 280 285

Thr Val Thr Leu Met Leu Ala Met Leu Ser Thr Pro Met Ala Glu Gly

290 295 300

Arg Asp Ser Pro Glu Asp Phe Val Tyr Gln Phe Lys Ala Met Cys Tyr

305 310 315 320

Ile Thr Asn Gly Thr Glu Arg Leu Arg Tyr Val Thr Arg Tyr Ile Tyr

325 330 335

Asn Arg Glu Glu Tyr Ala Arg Phe Asp Ser Asp Val Glu Val Tyr Arg

340 345 350

Ala Val Thr Pro Leu Gly Pro Pro Asp Ala Glu Tyr Trp Asn Ser Gln

355 360 365

Lys Glu Val Leu Glu Arg Thr Arg Ala Glu Leu Asp Thr Val Cys Arg

370 375 380

His Asn Tyr Gln Leu Glu Leu Arg Thr Thr Leu Gln Arg Arg Val Glu

385 390 395 400

Pro Thr Val Thr Ile Ser Pro Ser Arg Thr Glu Ala Leu Asn His His

405 410 415

Asn Leu Leu Val Cys Ser Val Thr Asp Phe Tyr Pro Ala Gln Ile Lys

420 425 430

Val Arg Trp Phe Arg Asn Asp Gln Glu Glu Thr Thr Gly Val Val Ser

435 440 445

Thr Pro Leu Ile Arg Asn Gly Asp Trp Thr Phe Gln Ile Leu Val Met

450 455 460

Leu Glu Met Thr Pro Gln His Gly Asp Val Tyr Thr Cys His Val Glu

465 470 475 480

His Pro Ser Leu Gln Asn Pro Ile Thr Val Glu Trp Arg Ala Gln Ser

485 490 495

Glu Ser Ala Gln Ser Lys Met Leu Ser Gly Ile Gly Gly Phe Val Leu

500 505 510

Gly Leu Ile Phe Leu Gly Leu Gly Leu Ile Ile His His Arg Ser Gln

515 520 525

Lys Gly Leu Leu His Asp Tyr

530 535

<210> 5

<211> 981

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> misc_feature

<222> (126)..(127)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (132)..(133)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 5

gcaccagaca gtgacgtcag ctgccagatc ccatggccgt catactgtga cgtctttcag 60

acaccccatt gacgtcaatg ggagaactcg acgtgactca gcgcgcatcg tgactcagcg 120

cgccanntgc anntgatggt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc 180

ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag 240

ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc 300

gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac 360

cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag 420

gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc 480

gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc 540

aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc 600

gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc 660

agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg 720

ctgcccgaca accactacct gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag 780

cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac 840

gagctgtaca agaagcttag ccatggcttc ccgccggagg tggaggagca ggatgatggc 900

acgctgccca tgtcttgtgc ccaggagagc gggatggacc gtcaccctgc agcctgtgct 960

tctgctagga tcaatgtgta g 981

Claims

1.一种基于LAG-3/MHC II阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法，包括以下步骤：

1)将第一荧光蛋白与LAG-3蛋白胞外域羧基末端连接，构建重组LAG-3ex-第一荧光蛋白融合蛋白；在第一荧光蛋白的C端连接6个组氨酸His标签；

2)通过连接肽序列将人源MHC II基因的α亚基与β亚基前后连接在同一个读码框里，并将复合基因亚克隆到真核表达载体CMV启动子下，构建表达质粒；在E-Box_AP-1_CRE人工复合调控元件下连接第二荧光蛋白，构建调控表达报告基因质粒；将E-Box_AP-1_CRE-第二荧光蛋白和CMV-MHC II基因共转染到A375黑素瘤细胞，建立稳转细胞系；

3)将抗Lag-3的单抗药、小分子、或多肽阻断剂等新药与重组LAG-3ex-第一荧光蛋白融合蛋白共孵育后再与稳转细胞一起共孵育；同时设立稳转细胞与重组LAG-3ex-第一荧光蛋白融合蛋白直接共孵育的对照组；

4)清洗非特异性结合后，分别检测第一、第二荧光蛋白荧光值，并判断新药对Lag-3/MHC II信号通路的阻断功能；

所述连接肽序列为T2A序列，其蛋白序列为EGRGSLLTCGDVEENPGP。

2.根据权利要求1的药物快速筛选方法，其中第一荧光蛋白是tagRFP红色荧光蛋白；第二荧光蛋白是绿色荧光蛋白d2EGFP。

3.根据权利要求2的药物快速筛选方法，其中步骤1)中，将红色荧光蛋白tagRFP基因与人LAG-3基因胞外域构建在同一个读码框使红色荧光蛋白tagRFP接于LAG-3蛋白胞外域C端形成所述LAG-3ex-tagRFP融合蛋白基因，同时在tagRFP的C端接上6个组氨酸His标签。

4.根据权利要求3的药物快速筛选方法，其中步骤1)中，将LAG-3ex-tagRFP融合蛋白基因通过EcoR I/SeXA I亚克隆到慢病毒表达载体pLV-puro的CMV启动子下，分别与慢病毒包装质粒pH1、pH2共转染到慢病毒包装系细胞293V，制备CMV-LAG-3ex-tagRFP慢病毒，并转染至人胚肾细胞293，筛选获得高表达LAG-3ex-tagRFP融合蛋白的LAG-3ex-tagRFP/293细胞系；扩增该LAG-3ex-tagRFP/293细胞，裂解后用His亲和法制备纯化含可溶性重组LAG-3ex-tagRFP融合蛋白。

5.根据权利要求4的药物快速筛选方法，其中步骤2)中，通过连接肽序列T2A将人源MHCII基因的α亚基与β亚基前后连接在同一个读码框里，并将复合基因通过EcoR I/Not I亚克隆到慢病毒表达载体pLV-puro的CMV启动子下，构建表达质粒pCMV-MHC II；将绿色荧光蛋白d2EGFP构建在E-Box_AP-1_CRE人工复合调控元件下，通过Cla I/Not I双酶切克隆至慢病毒载体pLV-puro，去掉原有的CMV启动子，构建调控表达报告基因质粒pE-Box_AP-1_CRE-d2EGFP；将pCMV-MHC II和pE-Box_AP-1_CRE-d2EGFP分别与慢病毒包装质粒pH1、pH2共转染到慢病毒包装系细胞293V，制备CMV-MHC II和E-Box_AP-1_CRE-d2EGFP慢病毒，并共转染A375细胞，建立稳转细胞系MHC II.E-Box_AP-1_CRE-d2EGFP/A375；

其中编码LAG-3ex-tagRFP融合蛋白的DNA基因序列如SEQ ID NO：1所示，表达后LAG-3ex-tagRFP融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

编码MHCII蛋白的DNA基因序列如SEQ ID NO：3所示，表达后MHC II蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；

人工复合调控元件E-Box_AP-1_CRE的DNA基因序列如SEQ ID NO：5中1-135bp所示。

6.根据权利要求5的药物快速筛选方法，其中步骤3)中，将抗Lag-3的单抗药、小分子、或多肽阻断剂等新药与LAG-3ex-tagRFP融合蛋白共孵育后，与MHC II.E-Box_AP-1_CRE-d2EGFP/A375细胞再一起共孵育；同时设立MHC II.E-Box_AP-1_CRE-d2EGFP/A375细胞与LAG-3ex-tagRFP融合蛋白直接共孵育的对照组。

7.根据权利要求6的药物快速筛选方法，其中步骤4)中，经缓冲液清洗去除非特异性结合后用流式细胞仪、或荧光酶标仪分析细胞表面的红色荧光蛋白tagRFP荧光值；以及细胞内的绿色荧光蛋白d2EGFP荧光值；

通过药物组荧光值与对照组比较，判断抗Lag-3药对Lag-3/MHC II阻断功能，以及对MAPK/Erk信号通路产生的生物学效应。

8.一种如权利要求5的药物快速筛选方法中构建的稳转细胞系，其能够筛选对Lag-3/MHCII相互作用具有阻断功能的药物，其是MHC II.E-Box_AP-1_CRE-d2EGFP/A375稳转细胞系。