CN110964745B - 一种检测vegf靶向治疗药物生物学活性的方法 - Google Patents

一种检测vegf靶向治疗药物生物学活性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测VEGF靶向治疗药物生物学活性的方法，其包括以下步骤：构建编码KDR‑NGFR融合蛋白的核苷酸序列，将其进行全长克隆到空白载体中，转染第一细胞，用杀稻瘟菌素杀死未稳定转染的细胞，在杀稻瘟菌素下正常生长的细胞为第二细胞；构建转录因子NF‑kB重组结合序列，然后将其克隆到荧光素酶报告基因载体中，转染第二细胞，用杀稻瘟菌素和嘌呤霉素杀死未稳定转染的细胞，在杀稻瘟菌素和嘌呤霉素下正常生长的细胞为第三细胞；接种第三细胞，加入VEGF靶向治疗药物和VEGF，培养细胞；裂解细胞，加入荧光素酶的底物，检测荧光强度，以确定所述VEGF靶向治疗药物阻断VEGF的生物学活性。本发明的方法能准确、简单易行、快速检测VEGF靶向药物的生物学活性。

Description

一种检测VEGF靶向治疗药物生物学活性的方法
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种检测VEGF靶向治疗药物生物学活性的方法。
背景技术
血管内皮生成因子(VEGF)是高度保守的同源二聚体糖蛋白，两条分子量各为约24kDa的单链以二硫键组成二聚体。由于vegf基因的mRNA不同的剪切方式，分别产生出VEGF-A121和VEGF-A165等至少5种蛋白形式，其中VEGF121、VEGF165是分泌型可溶性蛋白，能直接作用于血管内皮细胞表面的VEGF受体(VEGFR，或称为KDR)促进血管内皮细胞增殖，促进血管生成，增加血管通透性。KDR膜蛋白一般只表达在血管内皮细胞表面。当VEGF与KDR结合后，激活一系列与血管生成相关的转录因子活化和诱导基因转录，这些被诱导转录的基因参与血管生成的细胞学过程，并最终导致新生血管的生产。
转录因子NF-kB是被广泛研究的蛋白，其介导的信号转导已经被证明是参与细胞生理、病理过程的重要的信号转导通路。一系列的细胞外信号，例如生长因子，白介素和细菌毒素等激活的上游通路都可以经过NF-kB信号进行转导，活化的NF-kB转录因子转移入细胞核内介导一系列基因的转录。
治疗有新生血管(湿)年龄相关黄斑变性(AMD)的药物阿柏西普(Aflibercept)为一种靶向VEGF的融合蛋白药物，是由人VEGF受体1和VEGF受体2的胞外区与人体免疫球蛋白G1的可结晶片段(Fc段)融合而成。阿柏西普可以结合VEGF家族各成员(包括VEGF-A121、EGF-A165)及胎盘生长因子(PIGF)从而阻断后者的生物学作用，抑制异常的血管生成及渗漏。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的是提供一种能够准确、简单易行、快速检测VEGF靶向治疗药物生物学活性的方法。
为此，本发明提供了以下技术方案：
一种检测VEGF靶向治疗药物生物学活性的方法，其包括以下步骤：
步骤一：构建编码KDR-NGFR融合蛋白的核苷酸序列，所述KDR-NGFR融合蛋白由KDR蛋白胞外段和NGFR胞内段形成，其中所述KDR蛋白胞外段包括KDR基因的信号肽以及蛋白暴露在细胞外的区域，所述NGFR胞内段包括KDR基因的跨膜区和细胞内序列，然后将所述编码KDR-NGFR融合蛋白的核苷酸序列进行全长克隆到空白载体中，并将构建后的质粒转染第一细胞，用杀稻瘟菌素(Blasticidin，BSD)杀死未稳定转染的细胞，在杀稻瘟菌素下正常生长的细胞为第二细胞(可命名为HEK293KDR)；
步骤二：构建转录因子NF-kB重组结合序列，然后将所述NF-kB重组结合序列克隆到荧光素酶报告基因载体中，将所述NF-kB重组结合序列作为启动子的组成部分，用以引导荧光素酶报告基因的转录，并将构建后的质粒转染所述第二细胞，用杀稻瘟菌素和嘌呤霉素杀死未稳定转染的细胞，在杀稻瘟菌素和嘌呤霉素(Puromycin，Puro)下正常生长的细胞为第三细胞(可命名为HEK293KDR-NF-kB-Luc2P)。
步骤三：接种所述第三细胞，然后加入所述VEGF靶向治疗药物和VEGF，然后培养细胞；
步骤四：裂解细胞，加入荧光素酶的底物，检测荧光强度，以确定所述VEGF靶向治疗药物阻断VEGF的生物学活性。
如果加入VEGF靶向治疗药物和VEGF后测得的荧光强度低于仅加入VEGF后测得的荧光强度，则说明VEGF靶向治疗药物具备阻断VEGF生物学活性的效果。
荧光强度(或相对荧光强度)的越低代表了VEGF靶向治疗药物阻断VEGF的生物学活性越强，荧光强度(或相对荧光强度)越高，则说明检测的VEGF靶向治疗药物的生物学活性越弱。
本文所称的“VEGF靶向治疗药物”是指以对VEGF具有靶向阻断作用的药物，包括但不限于融合蛋白、单克隆抗体、含有单克隆抗体作为活性成分的药物制剂、反义核苷酸、激酶抑制剂、化合物、中药提取物、中药复方提取物、或其组合。优选地，所述VEGF靶向治疗药物包括但不限于阿柏西普、阿帕替尼、阿西替尼、帕唑帕尼、舒尼替尼、索拉非尼、安罗替尼、瑞戈非尼、布立尼布、西地尼布、贝伐珠单抗、雷莫卢单抗、凡德他尼、乐伐替尼、普纳替尼、卡博替尼、呋喹替尼中的任意一种或多种。更优选地，所述VEGF靶向治疗药物为阿柏西普。
优选地，所述荧光素酶报告基因载体包括但不限于pLVX-Luc2P载体。
优选地，所述步骤三中，培养细胞的时间为4-8小时，更优选为6小时。
优选地，所述步骤四中，加入所述荧光素酶的底物之后，静置不超过5分钟即进行检测。
优选地，所述KDR-NGFR融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述NF-kB重组结合序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选地，所述步骤一中，所述空白载体为pLVX-BSD空白载体。
优选地，所述步骤一中，所述第一细胞可以是不表达KDR的人永生化活细胞，包括但不限于HEK293细胞。
优选地，所述VEGF的加入量为50ng/ml
优选地，所述VEGF靶向治疗药物的加入量为1μg/ml。
与现有的检测方法相比，本发明的方法采用能稳定表达KDR蛋白和报告基因(reporter gene)的HEK293细胞检测VEGF的生物学活性、以及VEGF靶向治疗药物(如阿柏西普)阻断VEGF的生物学活性，简单易行，没有繁琐的中间操作过程，可在24小时内简便、准确、快速地检测VEGF靶向治疗药物(特别是阿柏西普)的生物学活性，特别适用于生物制品的质量检测和质量控制。
附图说明
图1是构建HEK293KDR-NF-kB-Luc2P细胞和方法建立示意图。
图2是质粒pLVX-KDR-NGFR-BSD构建示意图。
图3是质粒pLVX-NF-kB-Luc2P构建示意图。
图4是HEK293KDR-NF-kB-Luc2P细胞(克隆号1B5)细胞表达KDR融合蛋白流式细胞仪检测结果和基因组插入NF-kB结合的重组序列测序图。
图5是HEK293KDR-NF-kB-Luc2P细胞(克隆号1B5)在VEGF刺激后荧光素酶转录和荧光强度的检测信号。
图6HEK293KDR-NF-kB-Luc2P细胞(克隆号1B5)对不同浓度阿柏西普拮抗VEGF的生物学活性结果。结果表明，阿柏西普对50ng/ml VEGF的阻断效果呈现浓度依赖性，IC50在5ng/ml左右，1μg/ml可以达到完全抑制效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不对本发明的保护范围构成限制。如未特别指出，以下实施例中所使用的试剂和仪器均可通过商业渠道获得。为简便起见，以下实施例中的部分常规技术操作的细节并未予以描述，但可以理解的是，其属于本领域技术人员可知晓并实施的范围内。基于本发明的检测原理，尽管以下具体实施例中仅使用了阿柏西普为例进行活性检测，但本发明的检测方法仍适用于其他VEGF靶向治疗药物的生物学活性检测。本文所称的“VEGF靶向治疗药物”是指以对VEGF具有靶向阻断作用的药物，包括但不限于融合蛋白、单克隆抗体、含有单克隆抗体作为活性成分的药物制剂、反义核苷酸、激酶抑制剂、化合物、中药提取物、中药复方提取物、或其组合。优选地，所述VEGF靶向治疗药物包括但不限于阿柏西普、阿帕替尼、阿西替尼、帕唑帕尼、舒尼替尼、索拉非尼、安罗替尼、瑞戈非尼、布立尼布、西地尼布、贝伐珠单抗、雷莫卢单抗、凡德他尼、乐伐替尼、普纳替尼、卡博替尼、呋喹替尼中的任意一种或多种。
构建KDR-NGFR融合蛋白，并合成该基因序列
构建HEK293KDR-NF-kB-Luc2P细胞和方法如图1所示。
将KDR胞外段和NGFR胞内段核苷酸序列首尾连接成KDR-NGFR融合蛋白核苷酸序列，KDR-NGFR融合蛋白核苷酸序列如SEQ ID NO.1(2826bp)所示。
合成该序列(由通用生物系统有限公司合成)并克隆到pLVX-BSD空白载体中，该载体为Clontech公司产品(载体示意图如图2所示)。构建后的质粒命名为pLVX-KDR-NGFR-BSD。
构建NF-kB结合序列作为荧光素酶基因的启动子
设计NF-kB重组结合序列的核苷酸序列，如SEQ ID NO.2所示：
GGGAATTTCCGGGAATTTCCGGGAATTTCCGGGAATTTCCGCGCGTAGACACTAGAGGGTATATAATG(SEQ ID NO.2)。
值得注意的是，此处增加至6个结合位点是为了增加NF-kB蛋白的结合域，允许蛋白结合。
合成该序列(由金斯瑞生物科技公司合成)并克隆到荧光素酶报告基因载体pLVX-Luc2P载体中，该载体为Clontech公司产品(载体示意图如图3所示)。通过常规操作将NF-kB结合序列构建到该载体中，序列测序结果如图3所示。得到含有NF-kB结合序列和荧光素酶报告基因的质粒pLVX-NF-κB-Luc2P。
筛选HEK293KDR阳性细胞和HEK293KDR-NF-kB-Luc2P细胞及细胞单克隆化
对转染了pLVX-KDR-NGFR-BSD治疗的HEK293细胞加入2.5ug/ml杀稻瘟菌素进行毒性筛选，待细胞在该霉素中能正常生长后，可以认为该HEK293细胞已经具备抗药性，命名为HEK293KDR阳性细胞。可以用于后续细胞实验。
对转染了pLVX-NF-κB-Luc2P质粒的HEK293KDR细胞进行双药物筛选，同时加入2.5μg/ml杀稻瘟菌素和2.5μg/ml Puro，知道细胞可以在两种抗生素中正常生长，命名为HEK293KDR-NF-kB-Luc2P细胞。
对HEK293KDR-NF-kB-Luc2P细胞进行单可克隆化和功能筛选。首先，对挑选的单克隆细胞进行KDR蛋白表达的检测。用流式细胞技术的方法，对各单克隆细胞加入特异性鼠抗人KDR抗体，再加入荧光素FITC标记的养抗鼠二抗，然后用流式细胞仪检测KDR蛋白的表达。然后提取细胞基因组DNA，设计插入的NF-κB RE序列上下游序列的引物。
上述序列特异性引物如下：
上游引物核苷酸序列如下：ACAGGGACAGCAGAGATCCA(SEQ ID NO.3)；
下游引物核苷酸序列如下：TTCCAGGAACCAGGGCGTAT(SEQ ID NO.4)。
PCR反应条件：95℃15s，58℃30s，72℃30s，30个循环反应。
反应体系如以下表1所示：
表1
物质 体积(μl)，总体积20μl
H2O 12.5
10×反应缓冲液 2
10μM上游引物 2
10μM下向引物 2
Taq酶 0.5
DNA模板 1μg(1μl)
将PCR反应产物进行测序分析。筛选到克隆号1B5细胞株的KDR表达水平与NF-κB测序结果如图4所示。
筛选VEGF刺激诱导荧光素酶报告基因阳性细胞株
对单克隆筛选到的细胞株进行荧光素酶报告基因检测。将HEK293KDR-NF-kB-Luc2P细胞的各单克隆细胞按照空白对照组和VEGF刺激组分成两组，将细胞按照5×104/孔分别种植到各组中。空白对照组加入PBS，VEGF组加入50ng/ml VEGF蛋白，与细胞共孵育6小时，37℃。孵育完成后，分别加入等体积细胞裂解液和荧光素酶底物，室温孵育不超过5分钟。然后将白色细胞培养板置于酶标仪进行化学发光模块检测读数。克隆号1B5荧光读数结果如图5所示。
阿柏西普生物学活性的检测
在进行检测阿柏西普融合蛋白的生物学活性时，将HEK293KDR-NF-kB-Luc2P细胞(克隆号1B5)接种于白色96孔板中，5×104/孔，75μl/孔，每个剂量2个复孔。按实验要求设计阴性对照组、阳性对照组和阿柏西普组。同时按照实验设计加入各处理因素，阴性对照为非特异性IgG抗体(Santa cruz公司，货号：sc-2025)，浓度1μg/ml；阳性对照组为50ng/ml的VEGF(R&D Systems，货号：293-VE-010)；实验组加入50ng/ml的VEGF和阿柏西普(Eylea，批号572A)个浓度梯度(浓度为0.46、1.37、4.12、12.35、37.04、111.11、333.33和1000.00ng/ml，共8个浓度点)。
将细胞与个药物培养板置于37℃、5％CO2、100％湿度细胞培养箱中培养6小时。6小时后，加入等体积细胞裂解液与荧光素酶底物混合物。室温孵育不超过5分钟，然后进行信号检测(BioTek H1仪器)，读数时间为100ms，中间间隔50ms。检测结果如图6所示。
序列表
<110> 佛山安普泽生物医药股份有限公司
<120> 一种检测VEGF靶向治疗药物生物学活性的方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2826
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgcagagca aggtgctgct ggccgtcgcc ctgtggctct gcgtggagac ccgggccgcc 60
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caggccctca agggtgacgg aggcctctac agcagcctgc ccccagccaa gcgggaggag 2580
gtggagaagc ttctcaacgg ctctgcgggg gacacctggc ggcacctggc gggcgagctg 2640
ggctaccagc ccgagcacat agactccttt acccatgagg cctgccccgt tcgcgccctg 2700
cttgcaagct gggccaccca ggacagcgcc acactggacg ccctcctggc cgccctgcgc 2760
cgcatccagc gagccgacct cgtggagagt ctgtgcagtg agtccactgc cacatccccg 2820
gtgtga 2826
<210> 2
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gggaatttcc gggaatttcc gggaatttcc gggaatttcc gcgcgtagac actagagggt 60
atataatg 68
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acagggacag cagagatcca 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttccaggaac cagggcgtat 20

Claims (5)

1.一种检测VEGF靶向治疗药物生物学活性的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一：构建编码KDR-NGFR融合蛋白的核苷酸序列，所述KDR-NGFR融合蛋白由KDR蛋白胞外段和NGFR胞内段形成，其中所述KDR蛋白胞外段包括KDR基因的信号肽以及蛋白暴露在细胞外的区域，所述NGFR胞内段包括KDR基因的跨膜区和细胞内序列，然后将所述编码KDR-NGFR融合蛋白的核苷酸序列进行全长克隆到空白载体中，并将构建后的质粒转染第一细胞，用杀稻瘟菌素杀死未稳定转染的细胞，在杀稻瘟菌素下正常生长的细胞为第二细胞；
步骤二：构建转录因子NF-kB重组结合序列，然后将所述NF-kB重组结合序列克隆到荧光素酶报告基因载体中，将所述NF-kB重组结合序列作为启动子的组成部分，用以引导荧光素酶报告基因的转录，并将构建后的质粒转染所述第二细胞，用杀稻瘟菌素和嘌呤霉素杀死未稳定转染的细胞，在杀稻瘟菌素和嘌呤霉素下正常生长的细胞为第三细胞。
步骤三：接种所述第三细胞，然后加入所述VEGF靶向治疗药物和VEGF，然后培养细胞；
步骤四：裂解细胞，加入荧光素酶的底物，检测荧光强度，以确定所述VEGF靶向治疗药物阻断VEGF的生物学活性；如果同时加入VEGF和所述VEGF靶向治疗药物后测得的荧光强度低于仅加入VEGF后测得的荧光强度，则所述VEGF靶向治疗药物具备生物学活性；
所述荧光素酶报告基因载体为pLVX-Luc2P载体；
所述KDR-NGFR融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述NF-kB重组结合序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述步骤一中，所述空白载体为pLVX-BSD空白载体；
所述步骤一中，所述第一细胞为HEK293细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤三中，培养细胞的时间为4-8小时。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤四中，加入所述荧光素酶的底物之后，静置不超过5分钟即进行检测。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述VEGF靶向治疗药物为阿柏西普。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述VEGF靶向治疗药物为阿帕替尼、阿西替尼、帕唑帕尼、舒尼替尼、索拉非尼、安罗替尼、瑞戈非尼、布立尼布、西地尼布、贝伐珠单抗、雷莫卢单抗、凡德他尼、乐伐替尼、普纳替尼、卡博替尼、呋喹替尼中的任意一种或多种。
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