CN108424461A

CN108424461A - Cd47-car-t细胞

Info

Publication number: CN108424461A
Application number: CN201810142198.5A
Authority: CN
Inventors: 曹卫
Original assignee: Hei Biotech (shanghai) Co Ltd
Current assignee: Hei Biotech (shanghai) Co Ltd
Priority date: 2017-02-14
Filing date: 2018-02-11
Publication date: 2018-08-21
Anticipated expiration: 2038-02-11
Also published as: CN108424461B

Abstract

本发明涉及一种嵌合抗原受体融合蛋白，其从N端到C端包含：(i)包含V_H和V_L的单链可变区片段(scFv)，其中scFv针对CD47肿瘤抗原，(ii)跨膜结构域，(iii)CD28、GITR或4‑1BB的共刺激结构域和(iv)CD3激活域。

Description

CD47-CAR-T细胞

技术领域

本发明涉及肿瘤的过继免疫基因治疗领域，更具体地涉及一种CD47CAR-T细胞，其过表达CD47肿瘤抗原，有效攻击肿瘤细胞。

背景技术

免疫治疗是一种新兴的非常有前景的治疗癌症的方法。T细胞或T淋巴细胞是免疫系统的有效武器，它们能够持续性地搜寻外来抗原并从正常细胞中区分非正常细胞，如癌症或被感染的细胞。基因修饰的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)是设计肿瘤特异性T细胞的常见方案。将靶向肿瘤相关抗原(TAA)的CAR-T细胞输入患者(称为过继细胞转移或ACT)，代表了一种有效的免疫治疗方法。与化疗或抗体技术相比，CAR-T技术的优点在于重编程的工程化T细胞可以在患者体内增殖并持续存在(“活的药物”)。

CAR(嵌合抗原受体)通常是由一个单克隆抗体衍生的单链可变区片段(scFv)通过铰链和跨膜结构域连接到可变数目的胞内信号共刺激结构域：(i)CD28，CD137(4-1BB)，GITR或其他共刺激结构域；和(ii)共刺激结构域之后的单个细胞活化的CD3-zeta结构域组成(图1)。CAR的发展从第一代(没有共刺激域)到第二代(具有一个共刺激域)到第三代CAR(具有多个共刺激域)。生成的具有多个共刺激域的CAR(即所谓的第三代CAR)会使细胞溶解活性增强，并显着改善CAR-T细胞的持续性，表现出增强的抗肿瘤活性。

然而，目前嵌合抗原受体的研究还有很多不足，还存在复发率高、安全性低等问题。因此，本领域迫切需要开发特异性好、疗效稳定、副作用小的嵌合抗原受体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种CD47CAR-T细胞及其制法和应用。

在本发明的第一方面，提供了一种嵌合抗原受体融合蛋白，所述的融合蛋白从N-末端到C-末端包含：

(i)包含V_H和V_L的单链可变片段(scFv)，其中scFv针对CD47肿瘤抗原，

(ii)跨膜结构域，

(iii)CD28共刺激结构域，

(iv)激活域。

在另一优选例中，所述的scFv来源于6BH12抗体，并具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，或其至少90％的序列同一性。

在另一优选例中，所述激活结构域是CD3zeta。

在另一优选例中，所述的融合蛋白具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的scFv是鼠源、人源的、嵌合的、全人源的、或全人抗体，较佳地为人源的。

在另一优选例中，所述的CAR具有下式I结构：

L-scFv-H-TM-C-CD3ζ(I)

式中，

各“-”独立地为连接肽或肽键；

L为任选的信号肽序列；

scFv为针对CD47肿瘤抗原的单链抗体；

H为任选的铰链区；

TM为跨膜结构域；

C为共刺激结构域；

CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。

在另一优选例中，所述的scFv具有来源于6BH12抗体，并具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：4至少90％的序列同一性。

在另一优选例中，所述的scFv具有来源于6BH12抗体并且与6BH12抗体的CDR区相同的或基本相同的CDR区(即VH的CDR1、CDR2和CDR3以及与VL的CDR1、CDR2和CDR3)。

在另一优选例中，所述的scFv从N端到C端具有以下结构：

VH-接头-VL。

在另一优选例中，所述的scFv从N端到C端具有以下结构：

VL-接头-VH。

在另一优选例中，所述的接头如SEQ ID NO.:4所示序列的第131-145位所示(G4S×3)。

在另一优选例中，所述的L为选自下组的蛋白的信号肽：CD8、GM-CSF、CD4、CD137、或其组合。

在另一优选例中，所述的L为CD8来源的信号肽。

在另一优选例中，所述的H为选自下组的蛋白的铰链区：CD8、CD28、CD137、或其组合。

在另一优选例中，所述的H为CD8来源的铰链区。

在另一优选例中，所述的TM为选自下组的蛋白的跨膜区：CD28、CD3epsilon、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、或其组合。

在另一优选例中，TM包括CD8来源的跨膜区，和/或CD28来源的跨膜区。

在本发明的第二方面，提供了一种核酸分子，所述的核酸分子编码本发明第一方面所述的融合蛋白。

在另一优选例中，所述核酸序列具有SEQ ID NO：1的序列。

在本发明的第三方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第二方面所述的核酸分子。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、或其组合。

在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体。

在另一优选例中，所述核酸分子位于慢病毒载体的Xba I和EcoR I慢病毒位点中。

在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体或染色体中整合有外源的本发明第二方面所述的核酸分子或表达本发明第一方面所述的CAR。

在另一优选例中，所述细胞为分离的细胞，和/或所述细胞为基因工程化的细胞。

在另一优选例中，所述细胞为哺乳动物细胞。

在另一优选例中，所述细胞为T细胞。

在本发明的第五方面，提供了一种制备工程化免疫细胞的方法，所述的工程化免疫细胞表达本发明第一方面所述的CAR，包括以下步骤：将本发明第二方面所述的核酸分子或本发明第三方面所述的载体转导入T细胞或NK细胞内，从而获得所述工程化免疫细胞。

在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的工程化免疫细胞进行功能和有效性检测的步骤。

在本发明的第六方面，提供了一种制剂，所述制剂含有本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、或本发明第四方面所述的细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在另一优选例中，所述制剂为液态制剂。

在另一优选例中，所述制剂的剂型为注射剂。

在另一优选例中，所述制剂中所述CAR-T细胞的浓度为1×10³-1×10⁸个细胞/ml，较佳地1×10⁴-1×10⁷个细胞/ml。

在本发明的第七方面，提供了一种本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、或本发明第四方面所述的细胞的用途，用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。

在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：血液肿瘤、实体瘤、或其组合。

在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性髓细胞白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、或其组合。

在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、脑胶质瘤、子宫内膜癌、睾丸癌、结直肠癌、尿路肿瘤、甲状腺癌、或其组合。

在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：卵巢癌、间皮瘤、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、子宫内膜癌、或其组合。

在本发明的第八方面，提供了一种用于制备本发明第四方面所述细胞的试剂盒，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的本发明第二方面所述的核酸分子、或本发明第三方面所述的载体。

在本发明的第九方面，提供了一种本发明第四方面所述细胞、或本发明第六方面所述的制剂的用途，用于预防和/或治疗癌症或肿瘤。

在本发明的第十方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用适量的本发明第四方面所述的细胞、或本发明第六方面所述的制剂。

在另一优选例中，所述疾病为癌症或肿瘤。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了CAR的结构。左边是第一代CAR(没有共刺激域)，中间是第二代CAR(一个共刺激结构域CD28或者4-BB)，右边是第三代CAR(两个或多个共刺激结构域)。

图2显示了CD47-CAR构建体的结构。其使用第二代CAR-T构建体。来自B6H12抗体的scFv为：VH-(G4Sx3接头)-VL。共刺激结构域是CD28，激活域为CD3。

图3显示了CD47scFv结合CD47抗原。其中，来自实施例13的细胞外结构域序列的CD47抗原氨基酸包括人CD47-人源Fc。利用CD47scFv一抗(泳道1-3)或不用一抗(泳道4和5)进行蛋白质印迹实验。二抗为抗小鼠IgG，泳道1-3,5；和抗人IgG，泳道4。CD47scFv-0-mFc与CD47结合(泳道1)，而其他CD47scFv-2和-4与CD47抗原不结合。

图4显示了CD47-CD28-CD3zeta CAR-T细胞对不同类型的癌细胞具有高度细胞毒性。

图5显示了CD47-CAR-T细胞分泌IL-2，针对SKOV-3，A375，HepG2癌细胞系。

术语

为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。

术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。

术语“给予”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将本发明的产品物理引入受试者，包括静脉内，肌内，皮下，腹膜内，脊髓或其它肠胃外给药途径，例如通过注射或输注。

术语“抗体”(Ab)应包括但不限于免疫球蛋白，其特异性结合抗原并包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链，或其抗原结合部分。每条H链包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个恒定结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个恒定结构域CL。VH和VL区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其散布有更保守的称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL包含三个CDR和四个FR，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。

如本文所用，“嵌合抗原受体(CAR)”是一种融合蛋白，其包含能够结合抗原的胞外结构域，与胞外结构域衍生自不同多肽的跨膜结构域，以及至少一个胞内结构域。“嵌合抗原受体(CAR)”也称为“嵌合受体”、“T-body”或“嵌合免疫受体(CIR)”。所述的“能够结合抗原的胞外结构域”是指能够结合某一抗原的任何寡肽或多肽。“胞内结构域”是指已知的作为传递信号以激活或抑制细胞内生物过程的结构域起作用的任何寡肽或多肽。

如本文所用，“域”或“结构域”是指多肽中独立于其它区域且折叠成特异结构的区域。

如本文所用，“单链可变区片段(scFv)”是指源自抗体的单链多肽，其保留了结合抗原的能力。scFv的实例包括通过重组DNA技术形成的抗体多肽，其中免疫球蛋白重链(H链)和轻链(L链)片段的Fv区经由间隔序列连接。制备scFv的各种方法是本领域技术人员所熟知的。

如本文所用，“肿瘤抗原”是指具有抗原性的生物分子，其表达导致癌症。

CD47

CD47(也称为整合素相关蛋白，IAP)是在许多类型的肿瘤，特别是在癌症干细胞中高度过表达的肿瘤相关抗原。CD47在肿瘤转移、侵袭和肿瘤微环境中发挥作用。CD47被鉴定为卵巢癌中过表达的肿瘤抗原，随后在ALL，AML，NHL，膀胱癌和其他类型的癌症中发现。用抗体阻断CD47，使得CD47向巨噬细胞的“不要吃我”的信号关闭，并导致吞噬作用。

CD47结构

CD47是属于免疫球蛋白超家族的糖蛋白，由胞外IgV样N端结构域，5个跨膜疏水片段和一个C端胞浆结构域组成。CD47结合信号调节蛋白α，SIRP-α。

CD47信号

CD47与巨噬细胞上的抑制性免疫应答蛋白SIRT-α结合，诱导“不要吃我”的信号。它还结合TPS1，血小板反应蛋白，控制炎症。此外，CD47在癌症干细胞中过度表达，表明其在肿瘤发生中的重要作用。CD47是CD47抗体免疫疗法的靶点。

嵌合抗原受体

本发明的嵌合抗原受体(CAR)包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域。胞外结构域包括靶-特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。

在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入接头。如本文所用的，术语“接头”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。

在本发明的一个较佳的实施方式中，本发明提供的CAR的胞外结构域包括靶向CD47的抗原结合结构域。本发明的CAR当在T细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性进行抗原识别。当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，导致肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，并导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合结构域与4-1BB信号传导结构域、和CD3ζ信号结构域组合的细胞内结构域融合。

如本文所用，“抗原结合结构域”“单链抗体片段”均指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)₂片段，或单一Fv片段。Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。抗原结合结构域通常是scFv(single-chain variable fragment)。scFv的大小一般是一个完整抗体的1/6。单链抗体优选是由一条核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。作为本发明的优选方式，所述scFv包含特异性识别肿瘤高表达CD47抗原的抗体，较佳地为单链抗体。

对于绞链区和跨膜区(跨膜结构域)，CAR可被设计以包括融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。

具体地，本发明提供了靶向CD47肿瘤抗原的CAR-T细胞，CD47在许多类型的癌症例如卵巢癌、膀胱癌、白血病和淋巴瘤中高度过表达。本发明人使用(i)特异性识别人CD47的CD47B6H12抗体制备scFv，和(ii)CD28作为共激活结构域，CD3作为激活结构域，以产生第二代CD47-Cd28-CD3-CAR-T细胞。本发明的CD47-CAR-T细胞对几种癌细胞(胰腺癌、卵巢癌、黑素瘤、肺癌、肝癌细胞系)具有高度的细胞毒性。

本发明展示了CD47-CD28-CD3zeta慢病毒和CD47-CAR-T细胞的构建；CD47-CAR-T细胞可以有效杀死癌细胞并分泌对抗癌细胞的细胞因子。

本发明涉及一种嵌合抗原受体融合蛋白，其从N端到C端包含：(i)包含V_H和V_L的单链可变区片段(scFv)，其中scFv对CD47具有高亲和力，(ii)跨膜结构域，(iii)CD28共刺激结构域，和(iv)激活域。

抗CD47的鼠CD47scFv用于本发明。

CAR构建体(图2)含有CD8信号肽，CD47scFv：来自CD47B6H12抗体的VH-(重链可变区)-接头3x(GGGGS)-VL(轻链可变区)，CD8铰链区，CD28跨膜结构域和CD3ζ活化结构域。

CAR-T细胞

本发明人制备了针对癌细胞系，例如卵巢癌、胰腺癌、肺癌、黑素瘤、肝癌等的CD47-ScFv-CD28-CD3ζ-CAR-T细胞。本发明人提供了数据证明培养的CD47-CAR-T细胞可以有效杀死癌细胞。

CD47scFv-(CD28、41BB或GITR)-CD3zeta CAR-T可以与不同的化学疗法(检查点抑制剂)、靶向治疗、小分子抑制剂和抗体联合使用。

CD47-CAR-T细胞可以生产用于临床用途。

Tag-(Beacon标签或其他)缀合的CD47scFv可以用于CAR的生产。

对于CAR内部相同的CD47-scFv，可以使用第三代CAR-T或其他共激活信号域。

靶向CD47-和其他抗原(EGFR、HER-2、VEGFR、NGFR)的双特异性CAR-T细胞可用于免疫治疗。双特异性CAR-T细胞构建体含有针对CD47的第一scFv和针对第二肿瘤抗原的第二scFv。具有双特异性抗体的CAR-T细胞可更有效和特异性地靶向过表达两种肿瘤抗原的癌细胞。

CD47-CAR-T与靶向其他肿瘤抗原或肿瘤微环境(VEGFR-1-3)的CAR-T的组合(dualCAR-T)，可用于增强CD47-CAR单药治疗的活性。

CD47-CAR-T细胞可用于激活吞噬作用并阻断“不要吃我”的信号。

载体

编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。

本发明也提供了其中插入本发明的表达盒的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。

简单概括，通常可操作地连接本发明的表达盒或核酸序列至启动子，并将其并入表达载体。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。

本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。

该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。

进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。

已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。

额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。

合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。

报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白的基因(例如，Ui-Tei等，2000FEBS Letters479:79-82)。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。

将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。

将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。

将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。

将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(del ivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。

在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。

在本发明的一个优选地实施方式中，所述载体为慢病毒载体。

制剂

本发明提供了一种含有本发明第一方面所述的CAR-T细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一个实施方式中，所述制剂为液态制剂。优选地，所述制剂为注射剂。优选地，所述制剂中所述CAR-T细胞的浓度为1×10³-1×10⁸个细胞/ml，更优地1×10⁴-1×10⁷个细胞/ml。

在一个实施方式中，所述制剂可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的制剂优选配制用于静脉内施用。

治疗性应用

本发明包括用编码本发明表达盒的慢病毒载体(LV)转导的细胞(例如，T细胞)进行的治疗性应用。转导的T细胞可靶向肿瘤细胞的标志物CD47，协同激活T细胞，引起T细胞免疫应答，从而显著提高其对肿瘤细胞的杀伤效率。

因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：给哺乳动物施用本发明的CAR-T细胞。

在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，分离病人自体T细胞(或者异源供体)，激活并进行基因改造产生CAR-T细胞，随后注入同一病人体内。这种方式患移植物抗宿主病概率极低，抗原被T细胞以无MHC限制方式识别。此外，一种CAR-T就可以治疗表达该抗原的所有癌症。不像抗体疗法，CAR-T细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。

在一个实施方式中，本发明的CAR-T细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并可持续延长的时间量。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-修饰T细胞诱导对CAR中的抗原结合结构域特异性的免疫应答。例如，抗CD47的CAR-T细胞引起抗表达CD47的细胞的特异性免疫应答。

尽管本文公开的数据具体公开了包括抗-CD47scFv、铰链和跨膜区、和4-1BB和CD3ζ信号传导结构域的慢病毒载体，但本发明应被解释为包括对构建体组成部分中的每一个的任何数量的变化。

可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。

血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。

实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌卵巢癌、。

本发明的CAR-修饰T细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。

对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i)扩增细胞，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。

离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的CAR的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。CAR-修饰的细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，和CAR-修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。

除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。

本发明提供了治疗肿瘤的方法，其包括施用给需要其的对象治疗有效量的本发明的CAR-修饰的T细胞。

本发明的CAR-修饰的T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如IL-2、IL-17或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。

本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。

当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以10⁴至10⁹个细胞/kg体重的剂量，优选10⁵至10⁶个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，NewEng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。

对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的T细胞组合物优选通过i.v.注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置。

在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将T细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ARA-C)或对MS患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对PML患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的T细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。

施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1×10⁶个至1×10¹⁰个本发明经修饰的T细胞(如，CAR-T20细胞)，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

在本发明的实施例中，发明人示例性地将CD47-CAR构建体克隆至慢病毒载体的Xba I和EcoR I位点，从而在慢病毒载体内产生CD47-CAR构建体。pCD510-FMC63-28z慢病毒CAR构建体包含在Xba I和EcoR I克隆位点之间的CD8信号肽-CD47scFv-CD8铰链区-CD28跨膜结构域-CD28共刺激结构域-CD3zeta插入物。

利用293T细胞生产慢病毒，通过RT-PCR建立效价。随后，如实施例所述，利用相同剂量的慢病毒转导T细胞。本发明使用CAR慢病毒转导T细胞，并且还利用未转导的T细胞对照来检测CAR-T细胞对多种不同类型的癌细胞系的毒性。

实施例1CAR慢病毒的生产

慢病毒通过以下步骤制备：

第1天：

1.将5×10⁶HEK293FT细胞接种到100毫米直径的培养皿；

第2天：

2.检查以确保70％-90％的细胞融合；

3.为每个100毫米直径的培养皿准备转染复合物，流程如下：

a.在1.5ml管A中：将2.5μg CAR(嵌合抗原受体)DNA质粒(plasmid)和20μL慢病毒包装组合(ALSTEM,产品目录号VP100；见Appendix B3)稀释到0.5ml DMEM或Opti-MEM无血清培养基中，轻轻混合；

b.在1.5ml管B中：将30μL Nanofect转染试剂(ALSTEM,产品目录号NF100)稀释到0.5ml DMEM或Opti-MEM无血清培养基中，轻轻混合；

c.将管B中的NanoFect/DMEM加入到DNA/DMEM溶液(管A)中，涡旋5-10秒，将DMEM-plasmid-NanoFect混合物在室温下孵育15分钟；

4.将步骤3获得的全部转染复合物逐滴滴加到细胞板上，将板来回旋转使得转染复合物均匀地分散在板上；

5.37℃加湿5％CO₂培养箱中过夜培养该细胞；

第3天：

6.用10mL新鲜培养基替换上述转染复合物的上清液，并补充20μL ViralBoost(500X,ALSTEM,产品目录号VB100)；

7.37℃培育24小时；

第4天：

8.将含有慢病毒的培养液上清收集到50mL无菌有盖锥形离心管中，并放置于冰上；

9.上清液在4℃3000转条件下离心15分钟，以沉淀细胞碎片；

10.利用0.45μm的低蛋白结合无菌过滤器过滤澄清后的上清液；

11.通过定量RT-PCR测定慢病毒的浓度/滴度，利用Lenti-X qRT-PCR滴定试剂盒(Clontech；产品目录号631235)，测定上清液中HEK293的病毒浓度(通过DNaseI预处理去除任何可能残留的质粒DNA)；

12.上述病毒可以用于感染、纯化，或作为病毒原液存储于‐80℃备用，优选为小份单独存储，以减少反复冻融带来的病毒滴度损失。

实施例2慢病毒包装系统

产品说明

产品名称：SuperLenti^TM Lentivirus Packaging System

说明书：

对于慢病毒颗粒的生产，通常需要三种成分：1)含有目标外源基因的慢病毒载体，2)包含所有必需的病毒结构蛋白的包装载体，3)表达水泡性口炎病毒(VSV)糖蛋白(G)的包膜载体。第三代慢病毒包装系统提供了最大的生物安全性，因为慢病毒Rev基因是作为相对其他结构基因的独立载体提供，进一步消除了将载体逆向重组到有复制能力的病毒颗粒中的可能性。第三代慢病毒包装混合物仅支持嵌合5’LTR的慢病毒表达载体，其中HIV启动子被CMV或RSV替代，因此使其独立于TAT。

SuperLenti慢病毒包装混合物是一种基于HIV的即用型第三代慢病毒包装系统，其中质粒表达慢病毒生产所需的元件，其允许创建基于HIV-1的复制无效的慢病毒，在分裂或非分裂哺乳动物细胞中递送并表达目标外源基因。

产品目录号：VP 100；

规格：200μL；

运输：室温；

储存和安全性：-20℃储存，该产品可以在-20℃稳定储存6个月。应该分装成一次使用的剂量，以便尽量避免反复冻融。使用前-20℃冰箱小份储存。

使用方法：

对于100mm培养皿的慢病毒包装，用20μl慢病毒包装混合物混合2.5μg慢病毒表达载体。

对于150mm培养皿的慢病毒包装，用40μL慢病毒包装混合物混合5μg慢病毒表达载体。

质量控制：在转染实验条件下，通过使用人类胚胎肾293细胞对每批次的慢病毒包装混合物进行测试。

仅供研究使用。不用于诊断或治疗过程。

SuperLenti慢病毒包装混合物

产品目录号：VP 100

实施例3全血中外周血单核细胞(PBMC)的分离

全血(斯坦福大学医院血液中心，斯坦福，加州)采集自单个个体或多个个体(取决于所需血的量)，并置于10mL的Heparin vacutainers(Becton Dickinson公司)中。

注：应该在采血后的两小时内处理血液，以确保细胞产量最大。血液可以在室温下(室内)储存过夜，用于第二天的处理；然而，细胞产量会有一些损失。血液不应在4℃下储存在空管中。在50ml锥形离心管中，将约10ml抗凝全血与无菌磷酸盐缓冲液(PBS)混合，总体积为20ml(PBS，pH7/4，不含Ca²⁺/Mg²⁺)。

在另一单独的，无菌50mL锥形离心管中，移液管移入15mL Ficoll-Paque PLUS(GEHealthcare，17-1440-03)。非常轻柔地将20ml的血液/PBS层压到Ficoll的表面，并在室温下以400xg离心样品30-40min，无需制动。

小心吸取稀释血浆和Ficoll分界处的包含外周血单核细胞(PBMC)的细胞层，避免吸入Ficol l。为了确保完全去除Ficoll，血小板和血浆蛋白，用总体积为40ml的PBS洗涤PBMC两次，并在室温下以200xg离心10分钟。然后用血细胞计数器计数细胞。如果洗涤的PBMC立即使用，则用CAR-T培养基(AIM V-AlbuMAX(BSA)(生命科技)洗涤一次，含有5％AB血清和1.25μg/mL两性霉素B(Gemini Bioproducts，伍德兰，CA)，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)。如果要将PBMC冷冻，则在转移绝缘小瓶中重悬洗涤细胞，-80℃，保持24小时，然后储存在液氮中。

实施例4外周血单核细胞T细胞活化

如果使用新鲜分离的PBMC，分离的细胞(用1xPBS(pH7.4)洗涤，无Ca²⁺/Mg²⁺)用CAR-T培养基(AIM V-AlbuMAX(BSA)(生命科技)，含有5％AB血清和1.25μg/mL两性霉素B(Gemini Bioproducts，伍德兰，CA)，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)洗涤一次，不使用人白细胞介素-2(huIL-2)(Invitrogen)，浓度为5×10⁵个细胞/mL。在不含huIL-2的CAR-T培养基中洗涤一次，最后用含30U/mL huIL2(1000×stock；Invitrogen)的CAR-T培养基重悬浮至终浓度为5×10⁵个细胞/mL。

如果使用冷冻的PBMC，在9mL预热(37℃)的DMEM培养基(生命科技)中，在10％FBS，100u/mL青霉素和100μg/mL链霉素存在下，以5×10⁵个细胞/mL的浓度，解冻并重悬细胞(1×10⁷细胞/mL)。300xg离心细胞5分钟，然后用不含huIL-2的CAR-T培养基洗涤一次，最后用含300U/mL huIL2的CAR-T培养基重悬浮至终浓度为5×10⁵个细胞/mL。

在活化之前，将缀合抗人CD28和CD3抗体的磁珠(Invitrogen)用1mL无菌1xPBS(pH7.4)(使用磁性架从溶液中分离珠子)洗涤三次，然后重悬于CAR-T培养基中(300U/mLhuIL-2)，终浓度为2×10⁷珠/mL。

然后将25uL的磁珠添加到1mL的PBMC中，以1:1的磁珠细胞比混合PBMC和磁珠。

将所需数量的等分试样加到12孔低附着或未处理细胞培养板的各个孔中，并在37℃下CO₂存在下培养24小时，然后进行病毒转导。

实施例5T细胞转导和扩增

PBMC活化后，将细胞在37℃，5％CO₂下培养24小时。

冰上解冻慢病毒。每孔1x10⁶个细胞并添加5×10⁶个慢病毒和2μL/mL Transplus培养基(Alstem，Richmond，CA)(最终稀释1:500)。细胞额外培养24小时后重复添加病毒。

然后将细胞在持续存在300U/ml IL-2的新鲜培养基中培养12-14天(总培养时间取决于所需CAR-T细胞的最终数量)。

每隔2-3天分析细胞浓度，分析时添加培养基稀释细胞悬浮液至1×10⁶细胞/mL。

实施例6细胞毒性试验(实时ACEA)

根据制造商的方案使用ACEA仪器进行细胞毒性试验。

实时细胞试验(RTCA)方案

第1天：

A.制备(贴壁)靶细胞：

1.从培养瓶中吸去旧的培养基。

2.加入5-10mL常规培养基(无血清)到培养瓶中，冲洗掉血清残留物。然后，吸入培养基。

3.向培养瓶中加入0.5mL-1mL的0.05％胰蛋白酶-EDTA以分离细胞。

4.将4.5mL-9.5mL培养基(含FBS)加入培养瓶中，上下吸取培养基至烧瓶底部，将细胞分散成单细胞溶液。

5.将悬浮的细胞悬液转移到15mL管中。

6.取出10μL细胞悬液并用血细胞计数器计数，测定细胞浓度。

7.在25℃下以1000rpm(或300xg)离心细胞悬液5分钟。

8.离心后，吸去上清液，将细胞沉淀重新悬浮于含有FBS的培养基中，直到浓度达到1×10⁵个细胞/mL。

B.制备RTCA板：

1.只将50uL培养基(与用于细胞悬液的培养基相同)加入到待检测的孔中。

2.将E-板(ACEA生物科学，Inc，产品编号：JL-10-156010-1A)放回台上。

3.启动RTCA 2.0软件

a.输入版面信息：

i.至少，选择所有的孔，然后点击“应用”。这激活了孔。

b.输入计划：

i.步骤1＝背景测量。不要改变。

ii.步骤2＝监测细胞

iii.步骤3＝短期细胞毒性

iv.步骤4＝长期细胞毒性(点击“自动”框)

^**可以更改每个步骤的循环次数和每个循环之间的间隔^**

4.单击“步骤1”，然后按开始命名实验，并测量培养基的背景。

5.“步骤1”完成后，从台上取下E-板。

6.将A部分的100μL细胞悬液加入孔中(不要移除先前的培养基，每个孔中最终总计150uL)。

7.让细胞在通风橱中静置5分钟。

8.将E-板放回台上。

9.点击“步骤2”，然后按开始恢复记录。

第2天-处理：

A.制备CAR-T效应细胞：

1.从6孔板中取出所有悬浮的CAR-T细胞并充分混合。

2.取10μL细胞悬液，用血细胞计数器测定细胞浓度。

3.在25℃下以1000rpm(或300xg)离心细胞悬液5分钟。

4.吸出上清液，并将细胞沉淀重悬于2mL细胞毒性缓冲液(RPMI 1640无苯酚(Invitrogen)+1％P/S(Invitrogen)+5％人AB血清(Gemini Bioproducts；100-318)。

5.重复步骤3。

6.吸出上清液并将细胞沉淀重悬于细胞毒性培养基(无酚红RPMI 1640(Invitrogen)加5％AB血清(Gemini Bioproducts；100-318))中以获得1×10⁶细胞/mL的终浓度。

B.制备RTCA板：

1.A部分完成后，按快进至步骤3。

2.从台上取下E-板。

3.从每个孔小心地吸去上清液。

4.向每个孔中加入100μL的细胞毒性培养基。

5.重复步骤3。

6.向每个孔中加入50μL的细胞毒性培养基。

7.将100μl来自A部分的CAR-T细胞悬液(1×10⁵个细胞)分配至每个设计的所需孔中。

8.将E-板放回到台上。

9.点击“步骤3”，然后按开始恢复记录。

实施例7CD47-CD28-CD3ζCAR的序列

实施例7的CAR结构：人CD8信号肽，衍生自抗体的鼠scFv(V_H-接头3x(4GS)-V_L)(接头序列如SEQ ID NO.:4所示序列的第131-145位所示)，CD8铰链，CD28跨膜，共激活结构域，CD3ζ激活结构域(图2)。EcoR1和XhoI位点之间插入CAR构建体的慢病毒载体的序列如下所示。scFv的旁侧为NheI和XhoI位点，以便有可能重新克隆到其他构建体。

CD47-CD28-CD3的核苷酸序列，

SEQ ID NO:1.

ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGgctagc

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGACTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGGCTATGGCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGACAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTACTAGTGGTGGTACTTACACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATAGACAGTCTGAAGTCTGAGGATACAGCCATATATTTCTGTGCAAGATCCCTCGCGGGAAATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGGACCAGCGTCACCGTCTCCTCA GGTGGCGGTGGTTCTGGTGGCGGTGGTTCT GGTGGCGGTGGTTCT

gatattgtgatgactcagtctccagccaccctgtctgtgactccaggagatagagtctctctttcctgcagggccagccagactattagcgactacttacactggtatcaacaaaaatcacatgagtctccaaggcttctcatcaaatttgcttcccaatccatttctggaatcccctccaggttcagtggcagtggatcaggctcagatttcactctcagtatcaacagtgtggaacctgaagatgttggagtgtattactgtcaaaatggtcacggctttcctcggacgttcggtggagggaccaagctggaaataaaa

ctcgagAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGAGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCAGTGATaagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA(SEQ ID NO.:1)

SEQ ID NO:2是SEQ ID NO:1的氨基酸序列(SEQ ID NO:1的翻译，

CD47-CD28-CD3zeta CAR):

M A L P V T A L L L P L AL L L H A A R P A S E V Q L V E S G G D L VK P G G S L K L S C A A S G F T F S G Y G M S W V R Q T P D K R L E W V A T IT S G G T Y T Y Y P D S V K G R F T I S R D N A K N T L Y L Q I D S L K S E DT A I Y F C A R S L A G N A M D Y W G Q G T S V T V S S G G G G S G G G G S GG G G S D I V M T Q S P A T L S V T P G D R V S L S C R A S Q T I S D Y L H WY Q Q KS H E S P RL L I KF A S Q S I S G I P S RF S G S G S G S D F T L S I NS V E P E D V G V Y Y C Q N G H G F P R T F G G G T KL E I KL E KP T T T P AP RP P T P A P T I A S Q P L S L R P E A S R P A A G G A V H T R G L D F A SD K P F W V L V V V G G V L A C Y S L L V T V A F I I F WV R S K R S R L L HS D Y M N M T P R R P G P T R KH Y Q P Y A P P RD F A A Y R SRV KF S R S A DA P A Y Q Q G Q N Q L Y N E L N L G R RE E Y D V L D KR R G RD P E M G G KP QR R KN P Q E G L Y N E L Q KD KM A E A Y S E I G M KG E R RR G KG H D G L Y QG L S T AT KD T Y D A L H M Q A L P P R(SEQ ID NO.:2)

CAR构建体的组成如下所示，其显示了SEQ ID NO:1所示序列的亚结构域：

<huCD8信号肽>为SEQ ID NO:1所示序列的1-63位。

<CD47 scFv>为SEQ ID NO:1所示序列的70-789位。

<CD8>为SEQ ID NO:1所示序列的796-942位。

<CD28 TM/激活域>为SEQ ID NO:1所示序列的943-1146位。

<CD3zeta>为SEQ ID NO:1所示序列的1147-1488位。

实施例8 CD47 scFv-0的序列

SEQ ID NO.:3所示序列起始于信号肽(下划线)，随后是斜体所示的鼠scFv，随后是粗体所示的鼠Fc(其被用作蛋白分离的标签，用于提高蛋白稳定性)：

来自B6H12抗体的scFv序列与人CD47结合，并与鼠Fc连接：

ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGCGCCGCTAGC

TCTAGAGAAAACCTGTATTTTCAGGGC

SEQ ID NO:4:翻译序列，其中CDR序列用下划线标记.

METDTLLLWVLLLWVPGSTGAASDIVMTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQTISDYLHWYQQKSHESPRLLIKFASQSISGIPSRFSGSGSGSDFTLSINSVEPEDVGVYYCQNGHGFPRTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSGYGMSWVRQTPDKRLEWVATITSGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQIDSLKSEDTAIYFCARSLAGNAMDYWGQGTSVTVSSSRENLYFQGGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK(SEQ ID NO.:4)

实施例9 CD47 scFV-2的序列

对来自B6H12抗体的CD47 scFv进行人源化(斜体)，其具有鼠Fc(粗体)，人源化后即为突变体2。信号肽如下划线所示。

SEQ ID NO:5

ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGCGCCGCTAGC

TCTAGAGAAAACCTGTATTTTCAGGGC

SEQ ID NO:6:(SEQ ID NO:5的翻译序列，其中CDR序列用下划线标记)

METDTLLLWVLLLWVPGSTGAASEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISDYLHWYQQKPGQAPRLLIYFASQRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQGHGFPRTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYGMSWVRQAPGKGLEWVSTITSGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSLAGNAMDYWGQGTLVTVSSSRENLYFQGGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK(SEQ ID NO.:6)

实施例10 CD47 scFv-4的序列

与来自B6H12抗体的CD47 scFv相似，对来自B6H12抗体的scFv进行人源化(斜体)，其具有鼠Fc(粗体)，人源化后即为突变体4。信号肽如下划线所示。

SEQID NO:7

ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGCGCCGCTAGC

GGTGGCGGTGGTTCT GGTGGCGGTGGTTCT GGTGGCGGTGGTTCT

TCTAGAGAAAACCTGTATTTTCAGGGC

SEQID NO:8(SEQ ID NO 7的翻译序列，其中CDR序列用下划线标记):

METDTLLLWVLLLWVPGSTGAASEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISDYLHWYQQKPGQAPRLLIYFASQRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQGHGFPRTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYGMSWVRQAPGKGLEWVATITSGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSLAGNAMDYWGQGTLVTVSSSRENLYFQGGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK:(SEQ ID NO.:8)

实施例11 CD47肿瘤抗原序列

将人CD47抗原的氨基酸序列(胞外19-141 aa),Gene ID:961；Genbank:

NM_001777.3，与人Fc(标签)融合。

SEQ ID NO:9

DNA:369 nt

SEQ ID NO:10(SEQ ID NO 9的翻译序列)：

蛋白：123aa/14kD

QLLFNKTKSVEFTFCNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVSWFSPNE(SEQ ID NO.:10)SEQ ID NO:11:pYD5载体内的N末端具有人Fc(下划线)的人CD47抗原的核苷酸序列(斜体)：

ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGCGCCGGATCAACT CACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGA CACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGT TCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGT GTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCT CCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCC GGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGG GAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAG CAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACC ACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCCGGGAAAGCTAGCGGAGCCGGAAGCACAACCGAAAACCTGTATTTTCAG GGCGGATC

载体序列:

SEQ ID NO:12(SEQ ID NO 11的翻译序列)(pYD5载体内具有人Fc的CD47肿瘤抗原的氨基酸序列:

METDTLLLWVLLLWVPGSTGAGSTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKASGAGSTTENLYFQGGSQLLFNKTKSVEFTFCNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVSWFSPNE KLDI.(SEQ ID NO.:12)

MW:43.8kD

实施例12结合CD47肿瘤抗原的来自B6H12抗体的CD47scFv

用CD47scFv-0(鼠源)和变体CD47svFv-2,4(人源)，以及CD47肿瘤抗原进行结合测定。结合测定显示，来自小鼠B6H12的CD47scFv(CD47-0，SEQ ID NO：4)与CD47肿瘤抗原结合(图3，泳道1)，而与B6H12序列相似的人源化序列(CD47scFv-2，SEQ ID NO：6和CD47scFv-4，SEQ ID：8)与CD47肿瘤抗原不结合(图3，泳道2,3)。

ELISA测定获得了鼠CD47 scFv与CD47肿瘤抗原结合的相同结果。ELISA证明与scFv-0(SEQ ID NO：4)结合，但不与scFV-2(SEQ ID NO：6)和scFV-4(SEQ ID NO：8)结合。

ELISA数据如下所示：

CD47-0，-2和-4在不同稀释度下的结合如下所示：

1.抗原包被

抗原1：CD47(m1)-hFc蛋白，在50mM Na₂CO₃-NaHCO₃中，10.0μg/ml；

包被量：100μL/孔，4℃过夜；

2.阻断：1％BSA/PBS，200μL/孔，4℃过夜

3.一抗：CD47(m1)-Mfc scFv抗体。100μL/孔，37℃，1h

4.二抗：

HRP标记的抗IgG：SIGMA，货号：A0168，批号：097K4831；

稀释：1：9,000,50μL/孔，37℃，1h；

5.底物溶液：TMB，100μL/孔，37℃10min，450nm处OD读数；

6.OD读数结果(双孔)：

实施例13CD47-CD28-CD3zeta CAR对不同类型的癌细胞表现出高细胞毒性

实时细胞毒性测定显示，CD47-CD28-CD3zeta-CAR细胞对癌细胞具有高细胞毒性(图4)。CD47-CAR-T细胞对SKOV-3、A1847卵巢癌细胞，BxPC-3、PANC-1胰腺癌细胞和A549肺癌细胞，A375黑素瘤细胞具有高度的细胞毒性。

实施例14通过细胞毒性RTCA测定CD47CAR-T细胞针对癌细胞阳性分泌的IL-2

用CD47CAR-T细胞和几种癌细胞系进行ELISA IL-2测定，其通过RTCA细胞毒性显示为阳性(实施例13)。图5显示CD47CAR-T细胞对SKOV-3、A375、A549和Hep3B(只)分泌IL-2，而对照T细胞和模拟CAR-T细胞不分泌IL-2。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 曹卫

<120> CD47-CAR-T细胞

<130> P2017-2167

<150> US 62/458,773

<151> 2017-02-14

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1488

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccggctagcg aggtgcagct ggtggagtct gggggagact tagtgaagcc tggagggtcc 120

ctgaaactct cctgtgcagc ctctggattc actttcagtg gctatggcat gtcttgggtt 180

cgccagactc cagacaagag gctggagtgg gtcgcaacca ttactagtgg tggtacttac 240

acctactatc cagacagtgt gaaggggcga ttcaccatct ccagagacaa tgccaagaac 300

accctgtacc tgcaaataga cagtctgaag tctgaggata cagccatata tttctgtgca 360

agatccctcg cgggaaatgc tatggactac tggggtcaag ggaccagcgt caccgtctcc 420

tcaggtggcg gtggttctgg tggcggtggt tctggtggcg gtggttctga tattgtgatg 480

actcagtctc cagccaccct gtctgtgact ccaggagata gagtctctct ttcctgcagg 540

gccagccaga ctattagcga ctacttacac tggtatcaac aaaaatcaca tgagtctcca 600

aggcttctca tcaaatttgc ttcccaatcc atttctggaa tcccctccag gttcagtggc 660

agtggatcag gctcagattt cactctcagt atcaacagtg tggaacctga agatgttgga 720

gtgtattact gtcaaaatgg tcacggcttt cctcggacgt tcggtggagg gaccaagctg 780

gaaataaaac tcgagaagcc caccacgacg ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc 840

accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc ccagaggcga gccggccagc ggcggggggc 900

gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc agtgataagc ccttttgggt gctggtggtg 960

gttggtggag tcctggcttg ctatagcttg ctagtaacag tggcctttat tattttctgg 1020

gtgaggagta agaggagcag gctcctgcac agtgactaca tgaacatgac tccccgccgc 1080

cccgggccca cccgcaagca ttaccagccc tatgccccac cacgcgactt cgcagcctat 1140

cgctccagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac 1200

cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 1260

cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgcagagaa ggaagaaccc tcaggaaggc 1320

ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa 1380

ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc 1440

aaggacacct acgacgccct tcacatgcag gccctgcccc ctcgctaa 1488

<210> 2

<211> 495

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Ala Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly

20 25 30

Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser

35 40 45

Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro

50 55 60

Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp

85 90 95

Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Ile Asp Ser Leu Lys Ser Glu

100 105 110

Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Leu Ala Gly Asn Ala Met

115 120 125

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met

145 150 155 160

Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly Asp Arg Val Ser

165 170 175

Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr Leu His Trp Tyr

180 185 190

Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Phe Ala Ser

195 200 205

Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

210 215 220

Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro Glu Asp Val Gly

225 230 235 240

Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Gly Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly

245 250 255

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Leu Glu Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala

260 265 270

Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser

275 280 285

Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr

290 295 300

Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val

305 310 315 320

Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe

325 330 335

Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp

340 345 350

Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr

355 360 365

Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val

370 375 380

Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn

385 390 395 400

Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val

405 410 415

Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln

420 425 430

Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp

435 440 445

Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg

450 455 460

Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr

465 470 475 480

Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485 490 495

<210> 3

<211> 1509

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggc 60

gccgctagcg atattgtgat gacccagagc ccggcgaccc tgagcgtgac cccgggcgat 120

cgcgtgagcc tgagctgccg cgcgagccag accattagcg attatctgca ttggtatcag 180

cagaaaagcc atgaaagccc gcgcctgctg attaaatttg cgagccagag cattagcggc 240

attccgagcc gctttagcgg cagcggcagc ggcagcgatt ttaccctgag cattaacagc 300

gtggaaccgg aagatgtggg cgtgtattat tgccagaacg gccatggctt tccgcgcacc 360

tttggcggcg gcaccaaact ggaaattaaa ggtggcggtg gttctggtgg cggtggttct 420

ggtggcggtg gttctgaagt gcagctggtg gaaagcggcg gcgatctggt gaaaccgggc 480

ggcagcctga aactgagctg cgcggcgagc ggctttacct ttagcggcta tggcatgagc 540

tgggtgcgcc agaccccgga taaacgcctg gaatgggtgg cgaccattac cagcggcggc 600

acctatacct attatccgga tagcgtgaaa ggccgcttta ccattagccg cgataacgcg 660

aaaaacaccc tgtatctgca gattgatagc ctgaaaagcg aagataccgc gatttatttt 720

tgcgcgcgca gcctggcggg caacgcgatg gattattggg gccagggcac cagcgtgacc 780

gtgagcagct ctagagaaaa cctgtatttt cagggcgggc ccacaatcaa gccctgtcct 840

ccatgcaaat gcccagcacc taacctcttg ggtggaccat ccgtcttcat cttccctcca 900

aagatcaagg atgtactcat gatctccctg agccccatag tcacatgtgt ggtggtggat 960

gtgagcgagg atgacccaga tgtccagatc agctggtttg tgaacaacgt ggaagtacac 1020

acagctcaga cacaaaccca tagagaggat tacaacagta ctctccgggt ggtcagtgcc 1080

ctccccatcc agcaccagga ctggatgagt ggcaaggagt tcaaatgcaa ggtcaacaac 1140

aaagacctcc cagcgcccat cgagagaacc atctcaaaac ccaaagggtc agtaagagct 1200

ccacaggtat atgtcttgcc tccaccagaa gaagagatga ctaagaaaca ggtcactctg 1260

acctgcatgg tcacagactt catgcctgaa gacatttacg tggagtggac caacaacggg 1320

aaaacagagc taaactacaa gaacactgaa ccagtcctgg actctgatgg ttcttacttc 1380

atgtacagca agctgagagt ggaaaagaag aactgggtgg aaagaaatag ctactcctgt 1440

tcagtggtcc acgagggtct gcacaatcac cacacgacta agagcttctc ccggactccg 1500

ggtaaatga 1509

<210> 4

<211> 502

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Ala Ala Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala

20 25 30

Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala

35 40 45

Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His

50 55 60

Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly

65 70 75 80

Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu

85 90 95

Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln

100 105 110

Asn Gly His Gly Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu

115 120 125

Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly

145 150 155 160

Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly

165 170 175

Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp

180 185 190

Val Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser

195 200 205

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu

210 215 220

Tyr Leu Gln Ile Asp Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe

225 230 235 240

Cys Ala Arg Ser Leu Ala Gly Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ser Arg Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly

260 265 270

Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn

275 280 285

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp

290 295 300

Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp

305 310 315 320

Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn

325 330 335

Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn

340 345 350

Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp

355 360 365

Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro

370 375 380

Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala

385 390 395 400

Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys

405 410 415

Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile

420 425 430

Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn

435 440 445

Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys

450 455 460

Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys

465 470 475 480

Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe

485 490 495

Ser Arg Thr Pro Gly Lys

500

<210> 5

<211> 1509

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggc 60

gccgctagcg aaattgtgct gacccagagc ccggcgaccc tgagcctgag cccgggcgaa 120

cgcgcgaccc tgagctgccg cgcgagccag agcattagcg attatctgca ttggtatcag 180

cagaaaccgg gccaggcgcc gcgcctgctg atttattttg cgagccagcg cgcgaccggc 240

attccggcgc gctttagcgg cagcggcagc ggcaccgatt ttaccctgac cattagcagc 300

ctggaaccgg aagattttgc ggtgtattat tgccagcagg gccatggctt tccgcgcacc 360

tttggcggcg gcaccaaagt ggaaattaaa ggtggcggtg gttctggtgg cggtggttct 420

ggtggcggtg gttctgaagt gcagctgctg gaaagcggcg gcggcctggt gcagccgggc 480

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tgggtgcgcc aggcgccggg caaaggcctg gaatgggtga gcaccattac cagcggcggc 600

acctatacct attatccgga tagcgtgaaa ggccgcttta ccattagccg cgataacagc 660

aaaaacaccc tgtatctgca gatgaacagc ctgcgcgcgg aagataccgc ggtgtattat 720

tgcgcgaaaa gcctggcggg caacgcgatg gattattggg gccagggcac cctggtgacc 780

gtgagcagct ctagagaaaa cctgtatttt cagggcgggc ccacaatcaa gccctgtcct 840

ccatgcaaat gcccagcacc taacctcttg ggtggaccat ccgtcttcat cttccctcca 900

aagatcaagg atgtactcat gatctccctg agccccatag tcacatgtgt ggtggtggat 960

gtgagcgagg atgacccaga tgtccagatc agctggtttg tgaacaacgt ggaagtacac 1020

acagctcaga cacaaaccca tagagaggat tacaacagta ctctccgggt ggtcagtgcc 1080

ctccccatcc agcaccagga ctggatgagt ggcaaggagt tcaaatgcaa ggtcaacaac 1140

aaagacctcc cagcgcccat cgagagaacc atctcaaaac ccaaagggtc agtaagagct 1200

ccacaggtat atgtcttgcc tccaccagaa gaagagatga ctaagaaaca ggtcactctg 1260

acctgcatgg tcacagactt catgcctgaa gacatttacg tggagtggac caacaacggg 1320

aaaacagagc taaactacaa gaacactgaa ccagtcctgg actctgatgg ttcttacttc 1380

atgtacagca agctgagagt ggaaaagaag aactgggtgg aaagaaatag ctactcctgt 1440

tcagtggtcc acgagggtct gcacaatcac cacacgacta agagcttctc ccggactccg 1500

ggtaaatga 1509

<210> 6

<211> 502

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Ala Ala Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala

20 25 30

Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala

35 40 45

Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

50 55 60

Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Ser Gln Arg Ala Thr Gly

65 70 75 80

Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

85 90 95

Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln

100 105 110

Gln Gly His Gly Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu

115 120 125

Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

145 150 155 160

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly

165 170 175

Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

180 185 190

Val Ser Thr Ile Thr Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser

195 200 205

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu

210 215 220

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Ala Lys Ser Leu Ala Gly Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ser Arg Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly

260 265 270

Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn

275 280 285

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp

290 295 300

Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp

305 310 315 320

Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn

325 330 335

Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn

340 345 350

Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp

355 360 365

Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro

370 375 380

Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala

385 390 395 400

Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys

405 410 415

Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile

420 425 430

Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn

435 440 445

Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys

450 455 460

Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys

465 470 475 480

Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe

485 490 495

Ser Arg Thr Pro Gly Lys

500

<210> 7

<211> 1509

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggc 60

gccgctagcg aaattgtgct gacccagagc ccggcgaccc tgagcctgag cccgggcgaa 120

cgcgcgaccc tgagctgccg cgcgagccag agcattagcg attatctgca ttggtatcag 180

cagaaaccgg gccaggcgcc gcgcctgctg atttattttg cgagccagcg cgcgaccggc 240

attccggcgc gctttagcgg cagcggcagc ggcaccgatt ttaccctgac cattagcagc 300

ctggaaccgg aagattttgc ggtgtattat tgccagcagg gccatggctt tccgcgcacc 360

tttggcggcg gcaccaaagt ggaaattaaa ggtggcggtg gttctggtgg cggtggttct 420

ggtggcggtg gttctgaagt gcagctggtg gaaagcggcg gcggcctggt gcagccgggc 480

ggcagcctgc gcctgagctg cgcggcgagc ggctttacct ttagcggcta tggcatgagc 540

tgggtgcgcc aggcgccggg caaaggcctg gaatgggtgg cgaccattac cagcggcggc 600

acctatacct attatccgga tagcgtgaaa ggccgcttta ccattagccg cgataacgcg 660

aaaaacagcc tgtatctgca gatgaacagc ctgcgcgcgg aagataccgc ggtgtattat 720

tgcgcgcgca gcctggcggg caacgcgatg gattattggg gccagggcac cctggtgacc 780

gtgagcagct ctagagaaaa cctgtatttt cagggcgggc ccacaatcaa gccctgtcct 840

ccatgcaaat gcccagcacc taacctcttg ggtggaccat ccgtcttcat cttccctcca 900

aagatcaagg atgtactcat gatctccctg agccccatag tcacatgtgt ggtggtggat 960

gtgagcgagg atgacccaga tgtccagatc agctggtttg tgaacaacgt ggaagtacac 1020

acagctcaga cacaaaccca tagagaggat tacaacagta ctctccgggt ggtcagtgcc 1080

ctccccatcc agcaccagga ctggatgagt ggcaaggagt tcaaatgcaa ggtcaacaac 1140

aaagacctcc cagcgcccat cgagagaacc atctcaaaac ccaaagggtc agtaagagct 1200

ccacaggtat atgtcttgcc tccaccagaa gaagagatga ctaagaaaca ggtcactctg 1260

acctgcatgg tcacagactt catgcctgaa gacatttacg tggagtggac caacaacggg 1320

aaaacagagc taaactacaa gaacactgaa ccagtcctgg actctgatgg ttcttacttc 1380

atgtacagca agctgagagt ggaaaagaag aactgggtgg aaagaaatag ctactcctgt 1440

tcagtggtcc acgagggtct gcacaatcac cacacgacta agagcttctc ccggactccg 1500

ggtaaatga 1509

<210> 8

<211> 502

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Ala Ala Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala

20 25 30

Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala

35 40 45

Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

50 55 60

Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Ser Gln Arg Ala Thr Gly

65 70 75 80

Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

85 90 95

Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln

100 105 110

Gln Gly His Gly Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu

115 120 125

Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

145 150 155 160

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly

165 170 175

Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

180 185 190

Val Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser

195 200 205

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu

210 215 220

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Ala Arg Ser Leu Ala Gly Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ser Arg Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly

260 265 270

Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn

275 280 285

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp

290 295 300

Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp

305 310 315 320

Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn

325 330 335

Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn

340 345 350

Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp

355 360 365

Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro

370 375 380

Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala

385 390 395 400

Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys

405 410 415

Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile

420 425 430

Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn

435 440 445

Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys

450 455 460

Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys

465 470 475 480

Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe

485 490 495

Ser Arg Thr Pro Gly Lys

500

<210> 9

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cagctactat ttaataaaac aaaatctgta gaattcacgt tttgtaatga cactgtcgtc 60

attccatgct ttgttactaa tatggaggca caaaacacta ctgaagtata cgtaaagtgg 120

aaatttaaag gaagagatat ttacaccttt gatggagctc taaacaagtc cactgtcccc 180

actgacttta gtagtgcaaa aattgaagtc tcacaattac taaaaggaga tgcctctttg 240

aagatggata agagtgatgc tgtctcacac acaggaaact acacttgtga agtaacagaa 300

ttaaccagag aaggtgaaac gatcatcgag ctaaaatatc gtgttgtttc atggttttct 360

ccaaatgaa 369

<210> 10

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe Cys Asn

1 5 10 15

Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala Gln Asn

20 25 30

Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp Ile Tyr

35 40 45

Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp Phe Ser

50 55 60

Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala Ser Leu

65 70 75 80

Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr Thr Cys

85 90 95

Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu Leu Lys

100 105 110

Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu

115 120

<210> 11

<211> 1164

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggc 60

gccggatcaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 120

gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 180

acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 240

gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 300

taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 360

aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 420

aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 480

aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 540

gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 600

tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 660

gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 720

agcctctccc tgtctcccgg gaaagctagc ggagccggaa gcacaaccga aaacctgtat 780

tttcagggcg gatcccagct actatttaat aaaacaaaat ctgtagaatt cacgttttgt 840

aatgacactg tcgtcattcc atgctttgtt actaatatgg aggcacaaaa cactactgaa 900

gtatacgtaa agtggaaatt taaaggaaga gatatttaca cctttgatgg agctctaaac 960

aagtccactg tccccactga ctttagtagt gcaaaaattg aagtctcaca attactaaaa 1020

ggagatgcct ctttgaagat ggataagagt gatgctgtct cacacacagg aaactacact 1080

tgtgaagtaa cagaattaac cagagaaggt gaaacgatca tcgagctaaa atatcgtgtt 1140

gtttcatggt tttctccaaa tgaa 1164

<210> 12

<211> 392

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Ala Gly Ser Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

20 25 30

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

35 40 45

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

50 55 60

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

65 70 75 80

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

85 90 95

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

100 105 110

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

115 120 125

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

130 135 140

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

145 150 155 160

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

165 170 175

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

180 185 190

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

195 200 205

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

210 215 220

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

225 230 235 240

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ala Ser Gly Ala Gly Ser Thr Thr

245 250 255

Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr

260 265 270

Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys

275 280 285

Phe Val Thr Asn Met Glu Ala Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys

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Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn

305 310 315 320

Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser

325 330 335

Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala

340 345 350

Val Ser His Thr Gly Asn Tyr Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg

355 360 365

Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe

370 375 380

Ser Pro Asn Glu Lys Leu Asp Ile

385 390

Claims

1.一种嵌合抗原受体融合蛋白，所述的融合蛋白从N-末端到C-末端包含：

(ii)跨膜结构域，

(iii)CD28共刺激结构域，

(iv)激活域。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的scFv来源于6BH12抗体，并具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，或其至少90％的序列同一性。

3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述激活结构域是CD3zeta。

4.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

5.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的scFv是鼠源的、人源的、嵌合的、全人源的、或全人抗体。

6.一种编码权利要求1所述的融合蛋白的核酸分子。

7.如权利要求6所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子具有SEQ ID NO：1的序列。

8.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求6所述的核酸分子。

9.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求8所述的载体或染色体中整合有外源的权利要求6所述的核酸分子或表达权利要求1所述的CAR。

10.一种权利要求1所述的嵌合抗原受体、权利要求6所述的核酸分子、权利要求8所述的载体、或权利要求9所述的细胞的用途，用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。