CN114375333A - 包含赖氨酰氧化酶的前肽的组合物及其用途 - Google Patents

Abstract

提供了治疗有需要的受试者中的纤维化的方法。该方法包括向受试者施用包含赖氨酰氧化酶(LOX)的前肽的多肽，所述多肽缺乏LOX催化活性，从而治疗受试者的纤维化，其中所述方法不包括D‑青霉胺的施用。还提供了用于疗法中的多肽组合物。

Description

包含赖氨酰氧化酶的前肽的组合物及其用途

相关申请

本申请要求于2020年2月18日提交的美国专利申请号62/977,792、以及于2019年5月2日提交的以色列专利申请号266433的优先权利益，所述专利申请各自整体引入作为参考。

序列表声明

与本申请的提交同时提交、于2020年4月30日创建、标题为82310SequenceListing.txt、包含28,106字节的ASCII文件引入本文作为参考。

技术领域

在其一些实施方案中，本发明涉及包含赖氨酰氧化酶(LOX)的前肽的组合物及其用途。

背景技术

DMD是由X连锁肌营养不良蛋白基因中的突变引起的肌营养不良家族中最常见和最严重的儿童期形式。因而，肌纤维对ECM的锚定丧失，并且重复的肌肉收缩导致肌纤维的机械断裂。DMD导致骨骼肌和心肌的进行性虚弱和丧失(萎缩) [1]。DMD的早期体征可能包括坐、站立或行走的能力延迟以及学习说话困难。肌无力通常在3或4岁时显而易见，并且从臀部、骨盆区域、大腿和肩部开始。受损纤维诱导卫星细胞(SC)激活和肌肉再生[2]。平滑肌，例如对齐GI道的那些平滑肌，在该疾病中也显著受影响，且患者经常患有肠麻痹[3]。

‘肌肉再生计划’是多步过程。最初，发生瞬时炎症应答，在此期间生长因子和细胞因子被释放到受伤区域，以允许巨噬细胞和成纤维细胞的增殖和募集，所述巨噬细胞和成纤维细胞处置肌肉碎片并铺设ECM。肌纤维的形成始于SC的激活，随后为增殖、分化和融合至新的或现有的肌细胞[2,4]。TGFβ1，组织伤口愈合和纤维化的有力调节剂，在受伤后在骨骼肌中上调，且据推测参与瞬时炎症应答。然而，在营养不良性疾病如DMD中，作为持续的肌损伤的后果，发生持续的炎症应答。由炎症细胞产生的高水平的促炎细胞因子、生长因子、一氧化氮和TGFβ造成应激环境，影响SC和成纤维细胞之间的平衡[5]。结果，结缔组织(ECM和成纤维细胞)和肌肉组织之间的平衡发生转变。ECM的过量组分，如胶原和纤维蛋白原，以肌肉形成高度纤维化组织为代价而沉积[5]。值得注意的是，此类ECM失调过程导致DMD的许多病理特征，所述病理特征不仅直接由肌营养不良蛋白的缺乏引起，而且还由于肌纤维和SC与ECM的复杂相互作用。因此，纤维化肌肉延迟肌肉修复和再生，增强炎症并加剧疾病进展。总之，再生能力的丧失和纤维化是肌肉功能障碍以及DMD和其它有关的肌营养不良的致死表型的主要原因[6]。

基因编辑和细胞移植已被建议作为用于治疗DMD的新方法。然而，这些有前景的方法或者依赖在导致肌纤维丧失的坏死波、组织由脂肪和纤维化替换之前的早期干预、或者依赖处理纤维化反应的多模式疗法[7,8]。此外，主要副作用，例如平衡问题和呕吐，与这些治疗模式相关。尽管这些方法增加肌营养不良蛋白的产生，其将预测肌肉功能的改善，但这尚未得到证实。因此，与物理组织损害相关的基因的鉴定、以及应对不希望有的ECM重塑的治疗的开发，概述了DMD中未满足的需求。

在鉴定DMD致死表型的潜在基因的尝试中，进行了衍生自众多人DMD患者和mdx小鼠的大规模基因表达分析。在鼠模型系统和人患者中显著上调或下调的基因被视为DMD核心基因。在这些分析中鉴定为在DMD中高度过表达的基因之一是LOX。还在金毛犬肌营养不良(golden retriever muscular dystrophy) (GRMD) (DMD的犬模型)中，使用蛋白质印迹和免疫组织化学分析进一步确认了它的升高表达[9,10]。

LOX最初被鉴定为细胞外酶，其启动胶原和弹性蛋白分子的共价交联。LOX是其家族[LOX，LOX-样(LOXL) 1-4]中最丰富的家族成员，其启动这些翻译后修饰。它的活性对于维持骨骼、肺和心血管系统中结缔组织的拉伸和弹性特征至关重要[11-14]。LOX作为50-kDa无活性酶原被合成且分泌，所述酶原通过18-kDa前结构域经由BMP-1的蛋白酶解切割而加工为功能性32-kDa酶(LOX)。相应地，由于主动脉瘤以及通过基质组构缺陷[18]引起的其膈膜破裂[15-17]，Lox突变小鼠(Lox ^-/- )在出生时死亡。最近的工作已将LOX活性与许多人病理病况直接联系起来，所述病理病况包括纤维化、神经变性和癌症(例如，[12,13,11])。累积的证据提示了，除去其经典的细胞外活性，LOX家族的成员还在细胞内的细胞质和核内发现(例如，[19-21])。这些细胞内LOX活性已与细胞运动和迁移、基因转录和分化的调控相关[12,22-26]。总之，结果证实了LOX既在细胞内又在ECM中发挥多重独立的作用。最近，显示了Lox突变小鼠展示严重的骨骼肌缺陷[27]。在这些小鼠中，肌纤维的量显著减少，它们还展示ECM和成纤维细胞的过度沉积。此外，这些Lox肌肉有关表型在TGFβ信号传导的抑制后得到拯救，因此证实了Lox-TGFβ反馈环调控肌肉的量相对于结缔组织的量之间的平衡。

另外的背景技术包括：

Thomassin等人J Biol Chem. 2005 Dec 30；280(52):42848-55. Epub 2005 Oct26.

Grimsby等人J Cell Biochem. Author manuscript；在PMC 2013 Dec 11中可获得。

Zhao等人J Biol Chem. 2009 Jan 16；284(3): 1385–1393.

美国公开号20080261870。

美国公开号20170360732。

发明内容

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了包含人赖氨酰氧化酶(LOX)的前肽的合成多肽，该多肽缺乏LOX催化活性，该合成多肽包含修饰，与不包含修饰的多肽的天然形式相比，所述修饰赋予多肽在生理条件下增强的稳定性。

根据本发明的一些实施方案，修饰包含蛋白质修饰。

根据本发明的一些实施方案，蛋白质修饰选自免疫球蛋白、人血清白蛋白和转铁蛋白。

根据本发明的一些实施方案，免疫球蛋白包含Fc结构域。

根据本发明的一些实施方案，该多肽是嵌合多肽。

根据本发明的一些实施方案，修饰包含化学修饰。

根据本发明的一些实施方案，化学修饰是聚合物。

根据本发明的一些实施方案，聚合物选自聚阳离子聚合物、非离子水溶性聚合物、聚醚聚合物和生物相容性聚合物。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了治疗有需要的受试者中的纤维化的方法，该方法包括向受试者施用包含赖氨酰氧化酶(LOX)的前肽的多肽，该多肽缺乏LOX催化活性，从而治疗受试者中的纤维化，其中该方法不包括D-青霉胺的施用。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了治疗有需要的受试者中的杜氏肌营养不良(DMD)的方法，该方法包括向受试者施用包含赖氨酰氧化酶(LOX)的前肽的多肽，该多肽缺乏LOX催化活性，从而治疗受试者中的DMD。

根据本发明的一些实施方案，该多肽在SEQ ID NO: 1的N81、N97和N144中的至少一个上被糖基化。

根据本发明的一些实施方案，该多肽在SEQ ID NO: 1的N81、N97和N144中的至少两个上被糖基化。

根据本发明的一些实施方案，该多肽在SEQ ID NO: 1的N81、N97和N144上被糖基化。

根据本发明的一些实施方案，该多肽在SEQ ID NO: 1的N81、N97和N144上未被糖基化。

根据本发明的一些实施方案，该多肽的特征在于10-500 nM的EC50，如通过ELISA测定法确定的。

根据本发明的一些实施方案，该多肽的特征在于10-100 nM的KD，如通过微量热泳动确定的。

根据本发明的一些实施方案，该多肽的特征在于20 – 70℃的转变中点，如通过差示扫描荧光法(DSF)确定的。

根据本发明的一些实施方案，该多肽能够减少纤维胶原和交联胶原中的至少一种，如通过SHG显微术确定的。

根据本发明的一些实施方案，该多肽能够改变胶原纤维取向，如通过SHG显微术确定的。

根据本发明的一些实施方案，纤维化不是Ras信号传导依赖性的。

根据本发明的一些实施方案，纤维化与癌症或骨病无关。

根据本发明的一些实施方案，赖氨酰氧化酶(LOX)的前肽是人LOX的前肽。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了抑制LOX的酶促活性的方法，该方法包括使LOX与如本文所述的多肽接触，从而抑制LOX的酶促活性。

根据本发明的一些实施方案，该方法在体内执行。

根据本发明的一些实施方案，该方法在体外执行。

根据本发明的一些实施方案，该方法离体执行。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了产生如本文所述的多肽的方法，该方法包括在宿主细胞中表达编码多肽的多核苷酸，并且在必要时，用化学修饰来修饰多肽，从而产生多肽。

根据本发明的一些实施方案，该方法进一步包括从宿主细胞中分离多肽。

根据本发明的一些实施方案，该多肽如SEQ ID NO: 1或5中所示。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了编码如本文所述的多肽的多核苷酸。

根据一个具体实施方案，该应用不包含D-青霉胺。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。尽管下文描述了示例性的方法和/或材料，但与本文描述的那些类似或等价的方法和材料，可以用于本发明的实施方案的实践或测试中。在冲突的情况下，以专利说明书包括定义为准。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的，并不预期必然是限制性的。

附图说明

参考附图，仅作为示例，在本文中描述了本发明的一些实施方案。现在详细地具体参考附图，要强调的是，所示出的细节是作为示例并且用于本发明的实施方案的说明性讨论的目的。在这方面，结合附图进行的描述使得对于本领域技术人员而言显而易见的是，可以如何实践本发明的实施方案。

在附图中：

图1A-G显示了融合蛋白Fc-LPD的设计和生物化学性质。图1A、1B，抗体样LOX抑制剂Fc-LPD的设计和生成。图1C，Fc-LPD和Fc-LPD N346、362、409Q对LOX催化结构域的结合亲和力，EC₅₀。图1D、1E，Fc-LPD的转变中点的测量，监测Fc-LPD的固有荧光信号作为其折叠状态的量度，K_D。图1F、1G，Fc-LPD的荧光信号的比率测量针对化学变性剂的渐增温度进行标绘，以确定蛋白质的T_m 。

图2A-E显示了ECM组装的干扰，如通过SHG显微术确定的。图2A，示出了使用SHG显微术用于监测通过HDF细胞分泌的胶原组装中的不同阶段的实验设置的方案，图2B，干扰ECM排列的Fc-LPD的代表性SHG图像。每个SHG图像上的代表性纤维方向性分析描绘了特定取向中的纤维频率。图2C，与Fc比较，干扰ECM排列的Fc-LPD和Fc-LPD N346、362、409Q的代表性SHG图像。图2C、2D，ECM图的平均熵和厚度。

图3A-E显示了不同Fc-LPD糖基化形式与从HDF细胞中释放的ECM蛋白的相互作用。图3A，45 kDa Fc-LPD和60 kDa Fc-LPD的半分离。图3B，45 kDa Fc-LPD和60 kDa Fc-LPD的免疫沉淀。图3C，在免疫沉淀(I.P)后，LOX催化结构域与Fc-LPD的相互作用。图3D，Fc-LPD和Fc-LPD N346、362、409Q针对HSP70的结合亲和力，EC₅₀。图3E，通过使用酵母表面展示，HSP70与LPD的结合。

图4A-H显示了在用Fc-LPD和Fc-LPD N346、362、409Q治疗后，DMD膈膜和腓肠肌纤维化的早期体内评估。图4A，实验的示意图。图4B，显示了转棒跑步测定法的结果。图4C，显示了小鼠膈膜的H&E和天狼星红。图4E，小鼠膈膜的天狼星红的定量。图4F、4G，显示了小鼠腓肠肌的H&E和天狼星红。图4H，小鼠腓肠肌的天狼星红的定量。

图5A-I显示了在用Fc-LPD和Fc-LPD N346、362、409Q治疗后，DMD股四头肌和胫骨前肌纤维化的早期体内评估。图5A、B，显示了在Fc、Fc-LPD和Fc-LPD N346、362、409Q治疗后，DMD小鼠的股四头肌中的H&E和天狼星红代表性图像。图5C，小鼠股四头肌的天狼星红的定量。图5D-F，分别显示了来自小鼠股四头肌组织和股四头肌内膜的双光子SHG代表性图像。图5E、5G，小鼠股四头肌的双光子SHG图像的定量。图5H、5I，分别显示了来自小鼠胫骨前肌的双光子SHG代表性图像和小鼠胫骨前肌的双光子SHG图像的定量。

6A-H显示了在用Fc-LPD治疗后，DMD肌纤维化的体内评估。图6A，实验的示意图。图6B，显示了转棒跑步测定法的结果，图6C显示了悬挂测试测定法的结果。图6D，显示了来自小鼠胫骨前肌的H&E、天狼星红和SHG代表性图像。图6E、6F，来自小鼠胫骨前肌(TA)的每个区域的天狼星红和纤维的定量。图6G，显示了关于胫骨前肌组织的半定性组织学评估分析。图6H显示了对来自小鼠TA的每个SHG图像的代表性纤维方向性分析。

图7A-E显示了在用Fc-LPD治疗后，膈膜和心脏中的DMD肌纤维化的体内评估。图7A、7D，分别显示了在Fc和Fc-LPD治疗后，DMD小鼠的膈膜和心脏中的H&E和天狼星红代表性图像。图7B，显示了关于膈膜组织的半定性组织学评估。图7C和7E显示了膈膜和心脏天狼星红染色的定量。

具体实施方式

在其一些实施方案中，本发明涉及包含赖氨酰氧化酶(LOX)的前肽的组合物及其用途。

在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，应理解，本发明在其应用中并不一定限于下述描述中阐述的或由实施例例示的细节。本发明能够具有其它实施方案，或者能够以各种方式进行实践或执行。

本发明的实施方案涉及蛋白质抑制剂的开发，所述蛋白质抑制剂利用内源性LOX的细胞外水平的水平。伴随蛋白质工程的使用，生成了与Fc抗体片段融合的赖氨酰氧化酶前结构域(Fc-LPD)的稳定形式，其在体外和体内特异性抑制LOX。针对LOX执行Fc-LPD亲和力和稳定性测量，确定结合亲和力(EC₅₀= 43nM)和解离常数(Kd=32nM)。mdx小鼠中的体内研究显示了功能测试例如转棒跑步和悬挂测试中的改善，以及纤维化累积的抑制和正常胶原组构的促进。本文的结果证实了，Fc-LPD对LOX的抑制是高度特异性的，并且有效地使DMD的纤维化和副作用降到最低。

因此，根据本发明的一个方面，提供了治疗有需要的受试者中的纤维化的方法，该方法包括向受试者施用包含赖氨酰氧化酶(LOX)的前肽的多肽，该多肽缺乏LOX催化活性，从而治疗受试者中的纤维化，其中该方法不包括D-青霉胺的施用。

根据另一个方面，提供了包含赖氨酰氧化酶(LOX)的前肽的多肽，其用于治疗有需要的受试者中的纤维化，该多肽缺乏LOX催化活性，其中该应用不包含D-青霉胺的施用。

根据本发明的另一个方面，提供了治疗有需要的受试者中的杜氏肌营养不良(DMD)的方法，该方法包括向受试者施用包含赖氨酰氧化酶(LOX)的前肽的多肽，该多肽缺乏LOX催化活性，从而治疗受试者中的DMD。

如本文使用的，“纤维化”指在创伤、炎症、组织修复、免疫反应、细胞增生和瘤形成之后发生的细胞外基质组成成分的累积。组织纤维化的实例包括但不限于肺纤维化、肾纤维化、心脏纤维化、肝硬化和肝纤维化、皮肤疤痕和瘢痕疙瘩、粘连、纤维瘤病、动脉粥样硬化和淀粉样变性。

在一些实施方案中，纤维化病况是原发性纤维化。在一些实施方案中，纤维化病况是特发性的。在一些实施方案中，纤维化病况与以下相关(例如，继发于以下)：疾病(例如，传染病、炎性疾病、自身免疫性疾病、恶性或癌性疾病和/或结缔组织病)；毒素；损伤(例如，环境危害(例如，石棉、煤尘、多环芳香烃)、吸烟、伤口)；医学治疗(例如，手术切口、化学疗法或放射)或其组合。

在一些实施方案中，纤维化病况是肺的纤维化病况、肝的纤维化病况、心脏或脉管系统的纤维化病况、肾的纤维化病况、皮肤的纤维化病况、胃肠道的纤维化病况、骨髓或造血组织的纤维化病况、神经系统的纤维化病况或其组合。在一些实施方案中，纤维化病况影响选自以下中的一种或多种的组织：肌肉、肌腱、软骨、皮肤(例如，皮肤表皮或内皮)、心脏组织、血管组织(例如，动脉、静脉)、胰腺组织、肺组织、肝组织、肾组织、子宫组织、卵巢组织、神经组织、睾丸组织、腹膜组织、结肠、小肠、胆道、肠、骨髓或造血组织。

在一些实施方案中，纤维化病况是肺的纤维化病况。在一些实施方案中，肺的纤维化病况选自以下中的一种或多种：肺纤维化、特发性肺纤维化(IPF)、常见间质性肺炎(UIP)、间质性肺病、隐源性纤维化肺泡炎(CFA)、闭塞性细支气管炎或支气管扩张。在一些实施方案中，肺的纤维化继发于疾病、毒素、损伤、医学治疗或其组合。在一些实施方案中，肺的纤维化与以下中的一种或多种相关：疾病过程，例如石棉肺和矽肺；职业危害；环境污染物；吸烟；自身免疫性结缔组织病症(例如，类风湿性关节炎、硬皮病和系统性红斑狼疮(SLE))；结缔组织病症，例如结节病；传染病，例如感染，特别是慢性感染；医学治疗，包括但不限于放射疗法和药物疗法，例如化学疗法(例如，用博来霉素、氨甲蝶呤、胺碘酮、白消安和/或呋喃妥因的治疗)。在一些实施方案中，用本发明的方法治疗的肺的纤维化病况与以下相关(例如继发于以下)：癌症治疗，例如癌症的治疗(例如鳞状细胞癌、睾丸癌、何杰金氏病，用博来霉素治疗)。在一些实施方案中，纤维化病况是肝的纤维化病况。在某些实施方案中，肝的纤维化病况选自以下中的一种或多种：脂肪肝病、脂肪变性(例如非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、胆汁淤积性肝病(例如原发性胆汁性肝硬化(PBC)、肝硬化、酒精诱发性肝纤维化、胆管损伤、胆管纤维化、胆汁淤积或胆管病变。在一些实施方案中，肝脏纤维化或肝纤维化包括但不限于与以下相关的肝脏纤维化：酒精中毒、病毒感染例如肝炎(例如丙型肝炎、乙型肝炎或丁型肝炎)、自身免疫性肝炎、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、进行性大量纤维化、暴露于毒素或刺激物(例如酒精、药物和环境毒素)。

在一些实施方案中，纤维化病况是心脏的纤维化病况。在某些实施方案中，心脏的纤维化病况是心肌纤维化(例如，与放射性心肌炎相关的心肌纤维化、外科手术并发症(例如，心肌术后纤维化)、传染病(例如，恰加斯病、细菌性、旋毛虫病或真菌性心肌炎))；肉芽肿性代谢性贮积症(例如心肌病、血色病)；发育障碍(例如，心内膜弹力纤维增生症)；动脉硬化，或者暴露于毒素或刺激物(例如，药物诱发性心肌病、药物诱发性心脏毒性、酒精性心肌病、钴中毒或暴露)。在一些实施方案中，心肌纤维化与心脏组织的炎性病症(例如，心肌结节病)相关。

在一些实施方案中，纤维化病况是肾的纤维化病况。在一些实施方案中，肾的纤维化病况选自以下中的一种或多种：肾纤维化(例如，慢性肾纤维化)，与损伤/纤维化相关的肾病变(例如，与糖尿病相关的慢性肾病变(例如，糖尿病肾病变))，狼疮，肾硬皮病，肾小球肾炎，局灶节段性肾小球硬化，IgA肾病变，与人慢性肾病(CKD)相关的肾纤维化，慢性进行性肾病变(CPN)，肾小管间质纤维化，输尿管梗阻，慢性尿毒症，慢性间质性肾炎，放射性肾病变，肾小球硬化，进行性肾小球肾炎(PGN)，内皮/血栓性微血管病变损伤，HIV相关肾病变，或者与暴露于毒素、刺激物或化学治疗剂相关的纤维化。

在一些实施方案中，纤维化病况是皮肤的纤维化病况。在一些实施方案中，皮肤的纤维化病况选自以下中的一种或多种：皮肤纤维化、硬皮病、肾源性系统性纤维化(例如，在暴露于钆后产生，所述钆频繁用作患有严重肾衰竭的患者中的MRI的造影物质)、结疤和瘢痕疙瘩。

在一些实施方案中，纤维化病况是胃肠道的纤维化病况。在一些实施方案中，纤维化病况选自以下中的一种或多种：与硬皮病相关的纤维化；辐射诱发性肠道纤维化；与前肠炎性病症如巴雷特食管和慢性胃炎相关的纤维化，和/或与后肠炎性病症如炎性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎和克罗恩氏病相关的纤维化。

在一些实施方案中，纤维化病况是粘连。在一些实施方案中，粘连选自以下中的一种或多种：腹部粘连、腹膜粘连、骨盆粘连、心包粘连、硬膜外粘连、腱周或粘连性关节囊炎。

在一些实施方案中，纤维化病况是眼的纤维化病况。在一些实施方案中，眼的纤维化病况涉及眼前段的疾病，例如青光眼和角膜混浊；在一些实施方案中，眼的纤维化病况涉及眼后段的疾病，例如年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病变和新生血管性青光眼；在一些实施方案中，眼的纤维化病况起因于眼科手术之后的纤维化。

在一些实施方案中，纤维化病况是骨髓或造血组织的纤维化病况。在一些实施方案中，骨髓的纤维化病况是骨髓的慢性骨髓增生性肿瘤的内在特征，例如原发性骨髓纤维化(在本文中也称为血管生成性髓样化生或慢性特发性骨髓纤维化)。在一些实施方案中，骨髓纤维化与恶性病况或由克隆增殖性疾病引起的病况相关(例如，继发于所述病况)。在一些实施方案中，骨髓纤维化与血液病症(例如，选自以下中的一种或多种的血液病症：真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、骨髓发育不良、毛细胞白血病、淋巴瘤(例如何杰金淋巴瘤或非何杰金淋巴瘤)、多发性骨髓瘤或慢性粒细胞性白血病(CIVIL))相关。在一些实施方案中，骨髓纤维化与以下相关(例如，继发于以下)：非血液病症(例如，选自以下的非血液病症：实体瘤骨髓转移、自身免疫性病症(例如，系统性红斑狼疮、硬皮病、混合性结缔组织病症或多发性肌炎)、感染(例如，肺结核)、或与维生素D缺乏相关的继发性甲状旁腺功能亢进。

在一些实施方案中，纤维化与用于细胞转化的Ras信号传导无关。此类病况的实例包括癌症例如结肠癌、乳腺癌、肺癌或前列腺癌，肾、心血管系统和免疫系统的病症，骨病例如骨质减少病况如骨质疏松症。

根据一个具体实施方案，纤维化病况是肌肉的纤维化病况。

在动物中存在两种主要类型的肌肉组织 - 横纹肌和平滑肌。

肌肉也可以按位置或功能进行分组。在一些实施方案中，多肽可以靶向目的组织，例如，面部的一种或多种肌肉、用于咀嚼的一种或多种肌肉、舌和颈部的一种或多种肌肉、胸部的一种或多种肌肉、肩带和手臂的一种或多种肌肉、手臂和肩部的一种或多种肌肉、一种或多种前臂腹侧和背侧肌肉、手部的一种或多种肌肉、竖脊肌的一种或多种肌肉、骨盆带和腿部的一种或多种肌肉、和/或前腿和足部的一种或多种肌肉。

在一些实施方案中，面部的肌肉包括但不限于眼内肌如睫状肌、虹膜扩张肌、虹膜括约肌，耳的肌肉如耳肌、颞顶肌、镫骨肌、鼓膜张肌；鼻的肌肉如降眉间肌、鼻肌、鼻张肌、降鼻中隔肌、提上唇鼻翼肌；口的肌肉，例如提口角肌、降口角肌、口轮匝肌、颊肌、颧大肌和颧小肌、颈阔肌、提上唇肌、降下唇肌、笑肌、颏肌和/或皱眉肌。

在一些实施方案中，咀嚼肌包括但不限于咬肌、颞肌、内翼肌、外翼肌。在一些实施方案中，舌和颈部的肌肉包括但不限于颏舌肌、茎突舌肌、腭舌肌、舌骨舌肌、二腹肌、茎舌骨肌、下颌舌骨肌、颏舌骨肌、肩胛舌骨肌、胸骨舌骨肌、胸骨甲状肌、甲状舌骨肌、胸锁乳突肌、前斜角肌、中斜角肌和/或后斜角肌。

在一些实施方案中，胸部、肩带和手臂的肌肉包括但不限于锁骨下肌、胸大肌、胸小肌、腹直肌、腹外斜肌、腹内斜肌、腹横肌、膈肌、外肋间肌、内肋间肌、前锯肌、斜方肌、肩胛提肌、大菱形肌、小菱形肌、背阔肌、三角肌、肩胛下肌、冈上肌、冈下肌、大圆肌、小圆肌和/或喙肱肌。

在一些实施方案中，手臂和肩部的肌肉包括但不限于肱二头肌-长头、肱二头肌-短头、肱三头肌-长头、肱三头肌-外侧头、肱三头肌-内侧头、肘肌、旋前圆肌、旋后肌和/或肱肌。

在一些实施方案中，前臂腹侧和背侧的肌肉包括但不限于肱桡肌、桡侧腕屈肌、尺侧腕屈肌、掌长肌、尺侧腕伸肌、桡侧伸腕长肌、桡侧伸腕短肌、指伸肌、小指伸肌。

在一些实施方案中，手部的肌肉包括但不限于手部的内在肌，例如大鱼际肌、拇短展肌、拇短屈肌、拇对掌肌、小鱼际肌、小指展肌、小指短屈肌、小指对掌肌、骨间掌侧肌、骨间背侧肌和/或蚓状肌。

在一些实施方案中，竖脊肌的肌肉包括但不限于颈肌、棘肌、最长肌和/或髂肋肌。

在一些实施方案中，骨盆带和腿部的肌肉包括但不限于

腰大肌、髂肌、股方肌、长收肌、短收肌、大收肌、股薄肌、缝匠肌、股四头肌例如股直肌、股外侧肌、股内侧肌、股中间肌、腓肠肌、腓骨(Fibularis) (腓骨(Peroneus))长肌、比目鱼肌、臀大肌、臀中肌、臀小肌、腘绳肌：股二头肌：长头、腘绳肌：股二头肌：短头、腘绳肌：半腱肌、腘绳肌、半膜肌、阔筋膜张肌、耻骨肌和/或胫骨前肌。

在一些实施方案中，前腿和足部的肌肉包括但不限于趾长伸肌、拇长伸肌、腓骨短肌、跖肌、胫骨后肌、拇长屈肌、趾短伸肌、拇短伸肌、拇外展肌、拇短屈肌、小指展肌、小指屈肌、小指对掌肌、趾短伸肌、足蚓状肌、足底方肌或副屈肌、趾短屈肌、骨间背侧肌和/或骨间足底肌。

肌营养不良是一组遗传性病症，其引起肌肉退化，导致运动无力和受损。所有肌营养不良的中心特征在于它们在本质上是进行性的。肌营养不良包括但不限于：杜氏肌营养不良(DMD)、贝克型肌营养不良、埃-德型肌营养不良(Emery-Dreifuss musculardystrophy)、面肩肱型肌营养不良、肢带型肌营养不良、以及肌强直性肌营养不良1型和2型，包括先天形式的强直性肌营养不良1型。症状可能因肌营养不良的类型而异，其中一些或全部肌肉受到影响。肌营养不良的示例性症状包括肌肉运动技能发育延迟，使用一个或多个肌群困难，吞咽、说话或进食困难，流涎，眼睑下垂，频繁跌倒，成年后肌肉或肌群的力量丧失，肌肉尺寸的丧失，由于虚弱或机体的生物力学改变的行走问题，肌肉肥大，肌肉假性肥大，肌肉的脂肪浸润，肌肉由非收缩组织的替换(例如肌纤维化)，肌肉坏死和/或认知或行为损伤/智力迟钝。

虽然不存在用于肌营养不良的已知治愈方法，但使用了几种支持性治疗，其包括对症疗法和疾病缓解疗法两种。皮质类固醇、物理疗法、矫正装置、轮椅或用于ADL和肺功能的其它辅助医疗装置通常用于肌营养不良中。心脏起搏器用于预防因强直性营养不良中的心律失常的猝死。改善肌强直(无法放松)症状的抗肌强直剂包括美西律，以及在一些情况下的苯妥英、普鲁卡因胺和奎宁。这些可以与用本发明的一些实施方案的多肽的治疗相组合。

杜氏肌营养不良(DMD)的特征在于近端肌无力、步态异常、腓肠肌(小腿)中的假性肥大和肌酸激酶(CK)升高。许多DMD患者在5岁左右被诊断出来，此时症状/体征通常变得更加明显。受影响的个体通常在10-13岁左右停止行走，并且在其20多岁中后期或之前，由于心肺功能障碍而死亡。

病症DMD由位于人X染色体上的肌营养不良蛋白基因中的突变引起，所述基因编码蛋白质肌营养不良蛋白，这是肌肉组织内的重要结构组分，其对细胞膜的肌营养不良蛋白聚糖复合物(DGC)提供了结构稳定性。肌营养不良蛋白将内部细胞质肌动蛋白丝网络和细胞外基质联系起来，对肌纤维提供了物理强度。相应地，肌营养不良蛋白的改变或不存在导致异常肌膜撕裂和肌纤维的坏死。虽然两个性别的个人均可以携带该突变，但女性很少显示出该疾病的严重体征。

DMD的主要症状是与肌萎缩相关的肌无力，其中随意肌通常首先受到影响，尤其是影响臀部、骨盆区域、大腿、肩部肌肉和小腿肌肉。肌无力也在手臂、颈部和其它区域中出现。小腿经常变大。体征和症状通常在6岁之前出现，并且可能早在婴儿期就出现。其它身体症状包括但不限于独立行走的能力延迟，行走、踏步或跑步中的进行性困难，以及行走能力的最终丧失(通常到15岁)；经常跌倒；疲劳；对于运动技能(跑步、跳动、跳跃)有困难；腰椎前凸增加，导致髋屈肌的缩短；损害功能性的跟腱和腘绳肌挛缩，因为肌纤维缩短，且纤维化在结缔组织中发生；肌纤维畸形；脂肪和结缔组织替换肌肉组织引起的舌和小腿肌肉的假性肥大(增大)；神经行为障碍(例如ADHD)、学习障碍(阅读障碍)和特定认知技能(特别是短期语言记忆)的非渐进性虚弱的高风险；骨骼畸形(在一些情况下，包括脊柱侧凸)。

如本文使用的，“治疗”指取消、基本上抑制、减慢或逆转病况的进展，基本上改善病况的临床或美学症状，或者基本上预防病况的临床或美学症状的出现。

如本文使用的，“受试者”指被诊断有纤维化或处于纤维化的风险中的受试者。

如本文使用的，“合成多肽”指自然界中不存在的蛋白质，或者因为它从其天然环境例如人体或动物体中分离，或者因为它就野生型形式而言是突变的，或者因为它是修饰的，例如附着至异源部分，例如蛋白质或化学制品。

如本文使用的，“赖氨酰氧化酶”或“LOX”指LOX基因的蛋白质产物。在人中，LOX基因位于染色体5q23.3-31.2上。LOX蛋白的一级序列在哺乳动物中是高度保守的。人LOX合成为417个氨基酸的前原蛋白(前原LOX) (UniProtKB-P28300，其经历了在内质网(ER)内和ER后的许多翻译后修饰，例如，如下文所述的糖基化。在21个氨基酸的信号序列的切割后，包含147个氨基酸残基的N末端前肽被N-糖基化，且含有249个氨基酸残基的成熟蛋白C末端序列，其在本文中也称为包含LOX催化活性的部分，独特地折叠以获得至少三个二硫键。铜是功能催化剂的辅因子，掺入ER内的新生酶内。该酶还含有肽基有机辅因子，通过赖氨酸320和酪氨酸355的铜依赖性氧化产物之间的分子内交联生成的赖氨酰酪氨酸醌(LTQ)。

“LOX-前肽”(LOX-PP)或“LOX-前结构域”(LPD)是对应于SEQ ID NO: 3的氨基酸残基22-168的N末端前肽，在前LOX分泌到细胞外空间之后，所述N末端前肽被前胶原-C-蛋白酶(BMP-1)或BMP-1相关金属蛋白酶切割，以生成游离前肽(LPD)和催化活性的LOX。

LOX-PP (LPD)的关键细胞内功能很可能是在分泌途径内将赖氨酰氧化酶维持在非活性状态。前肽也可以充当分子内伴侣，以促进这些蛋白质的正确折叠和最终靶向其目的地。实际上，下表1和2中显示的质谱法显示了LPD与伴侣蛋白例如热休克蛋白免疫共沉淀。

LOX-PP包含在LOX蛋白序列的残基81、97和144处的三个共有的N-糖基化位点。

在一个实施方案中，本教导考虑了糖基化的LPD。

根据一个实施方案，该多肽在SEQ ID NO: 1的N81、N97和N144中的至少一个上被糖基化。当提及糖基化位点时，所指示的残基是对应于SEQ ID NO: 1的那些残基。

根据一个实施方案，该多肽在LPD的一个糖基化位点，即SEQ ID NO: 1的N81上被糖基化。

根据一个实施方案，该多肽在LPD的一个糖基化位点，即SEQ ID NO: 1的N97上被糖基化。

根据一个实施方案，该多肽在LPD的一个糖基化位点，即SEQ ID NO: 1的N144上被糖基化。

根据一个实施方案，该多肽在SEQ ID NO: 1的N81、N97和N144中的至少两个上被糖基化。

根据一个实施方案，该多肽在LPD的两个糖基化位点上被糖基化，所述两个糖基化位点例如SEQ ID NO: 1的N81+N97，例如SEQ ID NO: 1的N81+N144，例如SEQ ID NO: 1的N97+N144。

根据一个实施方案，该多肽在SEQ ID NO: 1的N81、N97和N144上被糖基化。

根据一个替代实施方案，该多肽在SEQ ID NO: 1的N81、N97和N144上未被糖基化。

糖基化的改变可以通过本领域众所周知的方法来实现，所述方法例如选择适当的表达系统(例如原核相对于真核)、糖基化形式与非糖基化形式的分开、在糖基化位点处的定点诱变和/或使用酶促修饰中的任一种。

本发明人已显示了糖基化形式和非糖基化形式被赋予不同的性质，参见实施例5。例如，非糖基化形式具有针对HSP70的更高结合率，如通过免疫沉淀实验随后为质谱法确定的。

本发明一些实施方案的多肽被赋予多种生物活性。

根据一个具体实施方案，该蛋白质在体外和体内抑制LOX。针对LOX执行Fc-LPD亲和力和稳定性测量，确定结合亲和力(EC₅₀= 43nM)和解离常数(Kd=32nM)。mdx小鼠中的体内研究显示了功能测试例如转棒跑步和悬挂测试中的改善，以及纤维化累积的抑制和正常胶原组构的促进。本文的结果证实Fc-LPD对LOX的抑制是高度特异性的，并且有效地使DMD的纤维化和副作用降到最低。

根据一个具体实施方案，该多肽的特征在于约10-2000 nM、约10-500 nM例如约43nM的EC50，如通过ELISA测定法(例如，根据图1C的测定法条件)确定的。

根据一个具体实施方案，该多肽的特征在于约10-100 nM，例如约32 nM的K_D，如通过微量热泳动(例如，根据图1D的测定法条件)确定的。

根据一个特定实施方案，该多肽能够在体外测定法系统中下调胶原的交联，如下文实施例部分中进一步描述的。由于本发明的一些实施方案的多肽能够干扰胶原交联，因此它改变细胞外基质(ECM)的结构，使胶原纤维松弛，将它们从有序取向改变为更随机的取向。因此，本发明的一些实施方案的多肽改变胶原的原纤维化(以及相应地胶原的强度)，并影响胶原的厚度。

分析胶原体系结构的方法是本领域已知的，并且包括例如二次谐波发生(SHG)显微术(参见例如图2A-B-C-D)、电子显微术成像和拉曼显微术。

因此，根据本发明的一个实施方案，该多肽能够减少纤维胶原(例如I型)和交联胶原中的至少一种，如通过SHG显微术确定的。

“减少”预期意指相对于不存在多肽时的量，原纤维/交联胶原的量少了5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%。

根据本发明的一个实施方案，多肽能够改变胶原纤维取向，如通过SHG显微术确定的。

根据一个实施方案，LPD衍生自(取自或来源于)人LOX，尽管还考虑了LOX的其它哺乳动物序列。

关于智人(Homo sapiens) LOX的mRNA和氨基酸序列可以在GenBank登录号P28300.2 (蛋白质登录号)、AF039291.1 (mRNA登录号)、NC_000005 (基因组登录号)下找到。

如提到的，该多肽缺乏LOX催化活性。

如本文使用的，“LOX催化活性”指酶的赖氨酰氧化酶活性，其通常归于SEQ ID NO:3的氨基酸坐标169-417之间的结构域(例如，SEQ ID NO: 9)。根据一个具体实施方案，催化活性在SEQ ID NO: 9 (氨基酸序列)和10 (核酸序列)中阐述。

LOX的催化活性可以通过SHG显微术(在下述实施例部分中详细描述)在体外进行确定。

还考虑了LPD的功能等价物，其具有与SEQ ID NO: 1或5的活性/稳定性大约相同或甚至更高的活性/稳定性。

根据一个特定实施方案，LPD序列与SEQ ID NO: 1或5中描述的LPD序列至少80%、至少85%、至少87%、至少89%、至少91%、至少93%、至少95%或更多，比如说100%等同，如使用美国国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information) (NCBI)的BlastP软件使用默认参数确定的，并且能够具有上述生物学功能中的任一种。在测量肽和更大尺寸的蛋白质之间的同源性时，同源性仅在相应区域中进行测量；也就是说，蛋白质被视为仅具有与肽相同的一般长度，允许间隙和插入。

同源物还可以指其缺失、插入或取代变体，包括其氨基酸取代，及其生物活性多肽片段。

可以在本文公开主题的多肽的LPD部分的结构中进行另外的修饰和改变，并且仍获得能够抑制LOX的分子。例如，某些氨基酸可以取代序列中的其它氨基酸，而无肽活性的明显丧失。因为多肽的相互作用能力和性质决定了该多肽的生物学功能活性，所以可以在多肽序列(或者，当然，其潜在的DNA编码序列)中进行某些氨基酸序列取代，且仍然获得具有类似性质的多肽。

在进行此类改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数在对多肽赋予相互作用生物功能方面的重要性是本领域一般理解的。已知某些氨基酸可以取代具有相似亲水指数或评分的其它氨基酸，并且仍导致具有相似生物活性的多肽。每种氨基酸已基于其疏水性和电荷特性指定了亲水指数。这些指数是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(−0.4)；苏氨酸(−0.7)；丝氨酸(−0.8)；色氨酸(−0.9)；酪氨酸(−1.3)；脯氨酸(−1.6)；组氨酸(−3.2)；谷氨酸(−3.5)；谷氨酰胺(−3.5)；天冬氨酸(−3.5)；天冬酰胺(−3.5)；赖氨酸(−3.9)；和精氨酸(−4.5)。

认为氨基酸的相对亲水特性决定了所得多肽的二级结构，其依次又决定了多肽与其它分子的相互作用，所述其它分子例如酶、底物、受体、抗体、抗原等等。本领域已知氨基酸可以被具有相似亲水指数的另一种氨基酸取代，并且仍获得功能上等价的多肽。在此类改变中，其亲水指数在±2内的氨基酸的取代是优选的，在±1内的氨基酸的取代是特别优选的，并且在±0.5内的氨基酸的取代是甚至更特别优选的。

还可以基于亲水性制备类似氨基酸的取代，特别是在由此产生的生物学功能等价的多肽或肽预期用于免疫学实施方案的情况下。引入本文作为参考的美国专利号4,554,101，陈述了如通过其相邻氨基酸的亲水性支配的，多肽的最大局部平均亲水性与其免疫原性和抗原性相关联，即与多肽的生物学性质相关联。如美国专利号4,554,101中详述的，下述亲水性值已分配给氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0.+−.1)；谷氨酸(+3.0.+−.1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；脯氨酸(−0.5.+−.1)；苏氨酸(−0.4)；丙氨酸(−0.5)；组氨酸(−0.5)；半胱氨酸(−1.0)；甲硫氨酸(−1.3)；缬氨酸(−1.5)；亮氨酸(−1.8)；异亮氨酸(−1.8)；酪氨酸(−2.3)；苯丙氨酸(−2.5)；色氨酸(−3.4)。应理解氨基酸可以被具有相似亲水性值的另一种氨基酸取代，并且仍获得生物学等价的，且特别是免疫学等价的多肽。在此类改变中，其亲水性值在±2内的氨基酸的取代是优选的，在±1内的氨基酸的取代是特别优选的，并且在±0.5内的氨基酸的取代是甚至更特别优选的。

如上文概述的，氨基酸取代因此一般基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，其疏水性、亲水性、电荷、大小等等。考虑到各种前述特性的示例性取代是本领域技术人员众所周知的，并且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。因此，本文公开的主题考虑了如上文阐述的多肽或其LPD部分的功能等价物或生物学等价物。

多肽的生物学等价物或功能等价物可以根据本领域众所周知的程序使用定点诱变来制备。相应地，可以通过使用标准分子生物学技术，将氨基酸残基加入本文公开的主题的LPD中或从其中缺失，而不改变肽的功能性。

根据一个实施方案，LPD的氨基酸序列这样进行修饰，以便增加其稳定性、生物利用度和/或药理学功效。

因此，根据本发明的一个方面，提供了包含人赖氨酰氧化酶(LOX)的前肽的合成多肽，所述多肽缺乏LOX催化活性，所述合成多肽包含修饰，与不包含所述修饰的所述多肽的天然形式相比，所述修饰赋予所述多肽在生理条件下增强的稳定性。

确定稳定性的方法是本领域众所周知的。

如本文使用的，“稳定性”至少指热稳定性。该方法基于使用内在色氨酸或酪氨酸荧光，测量超高分辨率的蛋白质稳定性。

如本文使用的，“增强的”或“增加的”指就天然LPD而言，至少10%、20%、30%、50%、60%、70%、80%、90%或更多，比如说100%的增加。

根据一个具体实施方案，该多肽的特征在于20 – 95℃的转变中点，例如，约70℃的Tm，如通过差示扫描荧光法(DSF)确定的。

因此，为了改善LPD的稳定性/活性，该多肽是修饰的。

根据一个具体实施方案，修饰包含蛋白质修饰。

蛋白质修饰可以通过化学附着的方式(融合多肽，例如通过使用接头和/或活性基团)、或通过重组DNA技术与多肽附着，由此合成多肽是嵌合多肽。

因此，多肽具有作为LPD的第一部分、以及作为异源肽或蛋白质(即蛋白质修饰)的第二部分。融合物/嵌合体(或统称为“融合物”)可以是LPD相对于蛋白质部分(在本文中也称为“异源多肽”)的N至C或C至N取向。融合蛋白可能包括myc、HA或His6标签。融合蛋白进一步包括与人IgG的Fc结构域融合的LPD (如本文在一个实施方案中提及的Fc-LPD)。在特定方面，免疫球蛋白融合物包括IgG1分子的铰链、CH2和CH3，或铰链、CH1、CH2和CH3区。根据一个具体实施方案，Fc如SEQ ID NO: 7中所示。对于免疫球蛋白融合物的产生，还参见美国专利号5,428,130。Fc部分可以衍生自小鼠IgG1或人IgG2_M4。人IgG2_M4 (参见美国公开申请号20070148167和美国公开申请号20060228349)是来自IgG2的具有突变的抗体，采用所述突变，所述抗体维持正常的药代动力学概况，但不具有任何已知的效应子功能。

与Fc结构域融合的LPD的示例性氨基酸序列在SEQ ID NO: 5 (氨基酸)和SEQ IDNO: 6 (核酸)中阐述。

融合蛋白进一步包括与人血清白蛋白、转铁蛋白或抗体融合的LPD。

在更进一步的方面，LPD与载体蛋白例如人血清白蛋白、转铁蛋白或抗体分子缀合。

如本文使用的，术语“多肽”指天然或合成氨基酸的聚合物，包括天然肽(截短产物、合成地合成多肽或重组多肽)和拟肽(通常为合成地合成肽)，以及作为多肽类似物的类肽和半类肽，其可能具有例如致使多肽在体内时甚至更稳定或更能够渗透到细胞内的修饰。

此类修饰包含但不限于N末端修饰、C末端修饰、多肽键修饰(包括但不限于CH2-NH、CH2-S、CH2-S=O、O=C-NH、CH2-O、CH2-CH2、S=C-NH、CH=CH或CF=CH)、主链修饰和残基修饰。用于制备拟肽化合物的方法是本领域众所周知的，并且例如在Quantitative DrugDesign，C.A. Ramsden Gd.第17.2章，F. Choplin Pergamon Press (1992)中指定，所述参考文献引入作为参考，如同在本文中完整阐述一样。在这方面的进一步细节在下文提供。

多肽内的多肽键(-CO-NH-)可以被例如以下取代：N-甲基化键(-N(CH3)-CO-)、酯键(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)、酮亚甲基键(-CO-CH2-)、其中R是任何烷基例如甲基的α-氮杂键(-NH-N(R)-CO-)、carba键(-CH2-NH-)、羟基亚乙基键(-CH(OH)-CH2-)、硫代酰胺键(-CS-NH-)、烯烃双键(-CH=CH-)、逆酰胺键(-NH-CO-)、多肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-)，其中R是天然存在于碳原子上的“正常”侧链。

这些修饰可以在沿着多肽链的任何键处发生，且甚至同时在几个(2-3个)键处发生。

天然芳香族氨基酸Trp、Tyr和Phe可以取代合成的非天然酸，例如苯基甘氨酸、TIC、萘基丙氨酸(Nol)、Phe的环甲基化衍生物、Phe的卤代衍生物或邻甲基-Tyr。

除上述之外，本发明的多肽还可以包括一种或多种修饰的氨基酸、或者一种或多种非氨基酸单体(例如脂肪酸、复合碳水化合物等)。

如本文在说明书和所附权利要求书部分中使用的，术语“氨基酸(amino acid)”或“氨基酸(amino acid)”应理解为包括20种天然存在的氨基酸；经常在体内进行翻译后修饰的那些氨基酸，包括例如羟脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸；以及其它罕见氨基酸，包括但不限于2-氨基己二酸、羟赖氨酸、异锁链素、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸。此外，术语“氨基酸”包括D-氨基酸和L-氨基酸(立体异构体)两者。

下表A和B列出了可以用于本发明的天然存在的氨基酸(表A)和非常规或修饰的氨基酸(表B)。

表A

氨基酸	三字母缩写	单字母符号
			丙氨酸	Ala	A
精氨酸	Arg	R
			天冬酰胺	Asn	N
天冬氨酸	Asp	D
			半胱氨酸	Cys	C
谷氨酰胺	Gln	Q
			谷氨酸	Glu	E
甘氨酸	Gly	G
			组氨酸	His	H
异亮氨酸	Iie	I
			亮氨酸	Leu	L
赖氨酸	Lys	K
			甲硫氨酸	Met	M
苯丙氨酸	Phe	F
			脯氨酸	Pro	P
丝氨酸	Ser	S
			苏氨酸	Thr	T
色氨酸	Trp	W
			酪氨酸	Tyr	Y
缬氨酸	Val	V
			如上文的任何氨基酸	Xaa	X

表B

非常规氨基酸	代码	非常规氨基酸	代码
				α-氨基丁酸	Abu	L-N-甲基丙氨酸	Nmala
α -氨基- α -丁酸甲酯	Mgabu	L-N-甲基精氨酸	Nmarg
				氨基环丙烷-	Cpro	L-N-甲基天冬酰胺	Nmasn
羧酸盐		L-N-甲基天冬氨酸	Nmasp
				氨基异丁酸	Aib	L-N-甲基半胱氨酸	Nmcys
氨基降冰片基-	Norb	L-N-甲基谷氨酰胺	Nmgin
				羧酸盐		L-N-甲基谷氨酸	Nmglu
环己基丙氨酸	Chexa	L-N-甲基组氨酸	Nmhis
				环戊基丙氨酸	Cpen	L-N-甲基异亮氨酸	Nmile
D-丙氨酸	Dal	L-N-甲基亮氨酸	Nmleu
				D-精氨酸	Darg	L-N-甲基赖氨酸	Nmlys
D-天冬氨酸	Dasp	L-N-甲基甲硫氨酸	Nmmet
				D-半胱氨酸	Dcys	L-N-甲基正亮氨酸	Nmnle
D-谷氨酰胺	Dgln	L-N-甲基正缬氨酸	Nmnva
				D-谷氨酸	Dglu	L-N-甲基鸟氨酸	Nmorn
D-组氨酸	Dhis	L-N-甲基苯丙氨酸	Nmphe
				D-异亮氨酸	Dile	L-N-甲基脯氨酸	Nmpro
D-亮氨酸	Dleu	L-N-甲基丝氨酸	Nmser
				D-赖氨酸	Dlys	L-N-甲基苏氨酸	Nmthr
D-甲硫氨酸	Dmet	L-N-甲基色氨酸	Nmtrp
				D-鸟氨酸	Dorn	L-N-甲基酪氨酸	Nmtyr
D-苯丙氨酸	Dphe	L-N-甲基缬氨酸	Nmval
				D-脯氨酸	Dpro	L-N-甲基乙基甘氨酸	Nmetg
D-丝氨酸	Dser	L-N-甲基-叔丁基甘氨酸	Nmtbug
				D-苏氨酸	Dthr	L-正亮氨酸	Nle
D-色氨酸	Dtrp	L-正缬氨酸	Nva
				D-酪氨酸	Dtyr	α -甲基-氨基异丁酸	Maib
D-缬氨酸	Dval	α -甲基-γ-氨基丁酸	Mgabu
				D- α –甲基丙氨酸	Dmala	α乙基环己基丙氨酸	Mchexa
D- α –甲基精氨酸	Dmarg	α -甲基环戊基丙氨酸	Mcpen
				D- α –甲基天冬酰胺	Dmasn	α -甲基- α -萘基丙氨酸	Manap
D- α –甲基天冬氨酸	Dmasp	α -甲基青霉胺	Mpen
				D- α –甲基半胱氨酸	Dmcys	N-(4-氨基丁基)甘氨酸	Nglu
D- α –甲基谷氨酸	Dmgln	N-(2-氨基乙基)甘氨酸	Naeg
				D- α –甲基组氨酸	Dmhis	N-(3-氨基丙基)甘氨酸	Norn
D- α –甲基异亮氨酸	Dmile	N- 氨基- α -甲基丁酸	Nmaabu
				D- α –甲基亮氨酸	Dmleu	α –萘基丙氨酸	Anap
D- α –甲基赖氨酸	Dmlys	N-苄基甘氨酸	Nphe
				D- α –甲基甲硫氨酸	Dmmet	N-(2-氨基甲酰乙基)甘氨酸	Ngln
D- α –甲基鸟氨酸	Dmorn	N-(氨基甲酰甲基)甘氨酸	Nasn
				D- α –甲基苯丙氨酸	Dmphe	N-(2-羧乙基)甘氨酸	Nglu
D- α –甲基脯氨酸	Dmpro	N-(羧甲基)甘氨酸	Nasp
				D- α –甲基丝氨酸	Dmser	N-环丁基甘氨酸	Ncbut
D- α –甲基苏氨酸	Dmthr	N-环庚基甘氨酸	Nchep
				D- α –甲基色氨酸	Dmtrp	N-环己基甘氨酸	Nchex
D- α –甲基酪氨酸	Dmty	N-环癸基甘氨酸	Ncdec
				D- α –甲基缬氨酸	Dmval	N-环十二烷基甘氨酸	Ncdod
D- α –甲基丙氨酸	Dnmala	N-环辛基甘氨酸	Ncoct
				D- α –甲基精氨酸	Dnmarg	N-环丙基甘氨酸	Ncpro
D- α –甲基天冬酰胺	Dnmasn	N-环十一烷基甘氨酸	Ncund
				D- α –甲基天冬氨酸	Dnmasp	N-(2,2-二苯乙基)甘氨酸	Nbhm
D- α –甲基半胱氨酸	Dnmcys	N-(3,3-二苯丙基)甘氨酸	Nbhe
				D-N-甲基亮氨酸	Dnmleu	N-(3-吲哚乙基)甘氨酸	Nhtrp
D-N-甲基赖氨酸	Dnmlys	N-甲基-γ-氨基丁酸	Nmgabu
				N-甲基环己基丙氨酸	Nmchexa	D-N-甲基甲硫氨酸	Dnmmet
D-N-甲基鸟氨酸	Dnmorn	N-甲基环戊基丙氨酸	Nmcpen
				N-甲基甘氨酸	Nala	D-N-甲基苯丙氨酸	Dnmphe
N-甲基氨基异丁酸	Nmaib	D-N-甲基脯氨酸	Dnmpro
				N-(1-甲基丙基)甘氨酸	Nile	D-N-甲基丝氨酸	Dnmser
N-(2-甲基丙基)甘氨酸	Nile	D-N-甲基丝氨酸	Dnmser
				N-(2-甲基丙基)甘氨酸	Nleu	D-N-甲基苏氨酸	Dnmthr
D-N-甲基色氨酸	Dnmtrp	N-(1-甲基乙基)甘氨酸	Nva
				D-N-甲基酪氨酸	Dnmtyr	N-甲基a-萘基丙氨酸	Nmanap
D-N-甲基缬氨酸	Dnmval	N-甲基青霉胺	Nmpen
				γ-氨基丁酸	Gabu	N-(对羟苯基)甘氨酸	Nhtyr
L-叔丁基甘氨酸	Tbug	N-(硫甲基)甘氨酸	Ncys
				L-乙基甘氨酸	Etg	青霉胺	Pen
L-高苯丙氨酸	Hphe	L- α –甲基丙氨酸	Mala
				L- α –甲基精氨酸	Marg	L- α -甲基天冬酰胺	Masn
L- α –甲基天冬氨酸	Masp	L- α -甲基-叔丁基甘氨酸	Mtbug
				L- α –甲基半胱氨酸	Mcys	L-甲基乙基甘氨酸	Metg
L-α –甲基谷氨酰胺(thylglutamine)	Mgln	L- α -甲基谷氨酸盐	Mglu
				L- α –甲基组氨酸	Mhis	L- α -甲基高苯丙氨酸	Mhphe
L- α –甲基异亮氨酸	Mile	N-(2-甲基硫乙基)甘氨酸	Nmet
				D-N-甲基谷氨酰胺	Dnmgln	N-(3-胍丙基)甘氨酸	Narg
D-N-甲基谷氨酸	Dnmglu	N-(1-羟乙基)甘氨酸	Nthr
				D-N-甲基组氨酸	Dnmhis	N-(羟乙基)甘氨酸	Nser
D-N-甲基异亮氨酸	Dnmile	N-(咪唑基乙基)甘氨酸	Nhis
				D-N-甲基亮氨酸	Dnmleu	N-(3-吲哚基乙基)甘氨酸	Nhtrp
D-N-甲基赖氨酸	Dnmlys	N-甲基-γ-氨基丁酸	Nmgabu
				N-甲基环己基丙氨酸	Nmchexa	D-N-甲基甲硫氨酸	Dnmmet
D-N-甲基鸟氨酸	Dnmorn	N-甲基环戊基丙氨酸	Nmcpen
				N-甲基甘氨酸	Nala	D-N-甲基苯丙氨酸	Dnmphe
N-甲基氨基异丁酸	Nmaib	D-N-甲基脯氨酸	Dnmpro
				N-(1-甲基丙基)甘氨酸	Nile	D-N-甲基丝氨酸	Dnmser
N-(2-甲基丙基)甘氨酸	Nleu	D-N-甲基苏氨酸	Dnmthr
				D-N-甲基色氨酸	Dnmtrp	N-(1-甲基乙基)甘氨酸	Nval
D-N-甲基酪氨酸	Dnmtyr	N-甲基a-萘基丙氨酸	Nmanap
				D-N-甲基缬氨酸	Dnmval	N-甲基青霉胺	Nmpen
γ-氨基丁酸	Gabu	N-(对羟苯基)甘氨酸	Nhtyr
				L-叔丁基甘氨酸	Tbug	N-(硫甲基)甘氨酸	Ncys
L-乙基甘氨酸	Etg	青霉胺	Pen
				L-高苯丙氨酸	Hphe	L- α –甲基丙氨酸	Mala
L- α –甲基精氨酸	Marg	L- α -甲基天冬酰胺	Masn
				L- α –甲基天冬氨酸	Masp	L- α -甲基-叔丁基甘氨酸	Mtbug
L- α –甲基半胱氨酸	Mcys	L-甲基乙基甘氨酸	Metg
				L- α –甲基谷氨酰胺	Mgln	L- α -甲基谷氨酸盐	Mglu
L- α乙基组氨酸	Mhis	L- α -甲基高苯丙氨酸	Mhphe
				L- α甲基异亮氨酸(thylisoleucine)	Mile	N-(2-甲基硫乙基)甘氨酸	Nmet
L- α –甲基亮氨酸	Mleu	L- α –甲基赖氨酸	Mlys
				L- α –甲基甲硫氨酸	Mmet	L- α -甲基正亮氨酸	Mnle
L- α –甲基正缬氨酸	Mnva	L- α -甲基鸟氨酸	Morn
				L- α –甲基苯丙氨酸	Mphe	L- α –甲基脯氨酸	Mpro
L- α –甲基丝氨酸	Mser	L- α -甲基苏氨酸	Mthr
				L- α乙基缬氨酸	Mtrp	L- α -甲基酪氨酸	Mtyr
L- α –甲基亮氨酸	Mval Nnbhm	L-N-甲基高苯丙氨酸	Nmhphe
				N-(N-(2,2-二苯乙基)		N-(N-(3,3-二苯丙基)
氨基甲酰甲基甘氨酸	Nnbhm	氨基甲酰甲基(1)甘氨酸	Nnbhe
				1-羧基-1-(2,2-二苯基乙氨基)环丙烷	Nmbc

表B续

重组技术通常用于生成本发明的多肽(或仅其LPD部分)。此类重组技术由以下进行描述：Bitter等人，(1987) Methods in Enzymol. 153:516-544，Studier等人(1990)Methods in Enzymol. 185:60-89，Brisson等人(1984) Nature 310:511-514，Takamatsu等人(1987) EMBO J. 6:307-311，Coruzzi等人(1984) EMBO J. 3:1671-1680和Brogli等人，(1984) Science 224:838-843，Gurley等人(1986) Mol. Cell. Biol. 6:559-565，以及Weissbach & Weissbach，1988，Methods for Plant Molecular Biology，AcademicPress，NY，Section VIII，第421-463页。

为了使用重组技术生产本发明的多肽，将编码本发明的多肽的多核苷酸，例如SEQID NO: 2或6连接到核酸表达载体内，所述核酸表达载体包含在顺式调控序列(例如，启动子序列)的转录控制下的多核苷酸序列，所述顺式调控序列适合于指导本发明的多肽在宿主细胞中的组成型、组织特异性或诱导型转录。

短语“分离的多核苷酸”指单链或双链核酸序列，其是分离的并且以RNA序列、互补多核苷酸序列(cDNA)、基因组多核苷酸序列和/或复合多核苷酸序列(例如，上述的组合)的形式提供。

如本文使用的，短语“互补多核苷酸序列”指这样的序列，其起因于使用逆转录酶或任何其它RNA依赖性DNA聚合酶的信使RNA的逆转录。此类序列随后可以使用DNA依赖性DNA聚合酶在体内或体外进行扩增。

如本文使用的，短语“基因组多核苷酸序列”指衍生自(分离自)染色体的序列，并且因此它代表染色体的邻接部分。

如本文使用的，短语“复合多核苷酸序列”指至少部分互补且至少部分基因组的序列。复合序列可以包括编码本发明的多肽所需的一些外显子序列，以及插入其间的一些内含子序列。内含子序列可以具有任何来源，包括其它基因，且通常包括保守的剪接信号序列。此类内含子序列可以进一步包括顺式作用表达调控元件。

如上文提到的，将本发明的多核苷酸序列插入表达载体(即核酸构建体)内，以允许重组多肽的表达。本发明的表达载体可以包括另外的序列，其致使该载体适合于原核生物、真核生物或优选地两者(例如，穿梭载体)中的复制和整合。通常的克隆载体含有转录和翻译起始序列(例如，启动子、增强子)，以及转录和翻译终止子(例如，聚腺苷酸化信号)。应了解，表达载体还可以包含编码其它多肽的多核苷酸序列，所述其它多肽与本发明的核靶向肽经转录连接。此类多肽在本文下文进一步描述。

表达载体中使用的启动子可以是组成型或诱导型的。还考虑了组织特异性启动子。

各种原核或真核细胞(例如，HEK293-6E)可以用作宿主表达系统，以表达本发明的肽。这些包括但不限于微生物，例如用含有多肽编码序列的重组细菌噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用含有多肽编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母；用含有多肽编码序列的重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染、或用含有多肽编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统。

根据本发明的这个方面的这个实施方案，可以改变编码本发明的多肽的核酸序列，以进一步改善表达系统中的表达水平。因此，可以根据用于细菌或某些哺乳动物表达的优选密码子使用，来修饰编码多肽的多核苷酸序列。

短语“密码子优化”指选择适当的DNA核苷酸用于结构基因或其片段内，其接近有关系统内的密码子使用。

可以用于表达本发明的多肽的多核苷酸序列的实例在SEQ ID NO: 2和6中提供。

应了解，本发明的多核苷酸还可以直接在受试者中表达(即体内基因疗法)，或可以在细胞系统(自体或非自体)中离体表达，然后施用于受试者。

除含有用于所插入的编码序列(编码多肽)的转录和翻译的必需元件外，本发明的表达构建体还可以包括被改造为优化所表达的肽的稳定性、生产、纯化、产率或活性的序列。

各种方法可以用于将本发明的表达载体引入宿主细胞系统内。此类方法一般在以下中进行描述：Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold SpringsHarbor Laboratory，New York (1989，1992)，Ausubel等人，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley and Sons，Baltimore，Md. (1989)，Chang等人，SomaticGene Therapy，CRC Press，Ann Arbor，Mich. (1995)，Vega等人，Gene Targeting，CRCPress，Ann Arbor Mich. (1995)，Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectorsand Their Uses，Butterworths，Boston Mass. (1988)以及Gilboa等人[Biotechniques 4(6): 504-512，1986]，并且包括例如稳定或瞬时转染、脂转染、电穿孔和用重组病毒载体感染。另外，关于阳性-阴性选择方法，参见美国专利号5,464,764和5,487,992。

转化细胞在允许大量重组多肽表达的有效条件下进行培养。有效的培养条件包括但不限于允许蛋白质生产的有效培养基、生物反应器、温度、pH和氧条件。有效培养基指其中培养细胞以产生本发明的重组多肽的任何培养基。此类培养基通常包括水溶液，其具有可同化的碳源、氮源和磷酸盐源，以及适当的盐、矿物质、金属和其它营养物例如维生素。本发明的细胞可以在常规发酵生物反应器、摇瓶、试管、微量滴定盘和培养皿中培养。培养可以在适合于重组细胞的温度、pH和氧含量下进行。此类培养条件在本领域普通技术人员的专业知识内。

取决于用于生产的载体和宿主系统，本发明的所得多肽可以保留在重组细胞内、分泌到发酵培养基内、分泌到两个细胞膜之间的空间例如大肠杆菌中的周质空间内；或保留在细胞或病毒膜的外表面上。

在培养中的预定时间之后，实现重组多肽的回收。

本文使用的短语“回收重组多肽”指收集含有多肽的完整发酵培养基，并不一定暗示另外的分离或纯化步骤。

回收也由术语“分离”或“纯化”涵盖，其也可以来自宿主细胞。

因此，可以使用各种标准蛋白质纯化技术来纯化本发明的多肽，所述蛋白质纯化技术例如但不限于亲和层析、离子交换层析、过滤、电泳、疏水作用层析、凝胶过滤层析、反相层析、刀豆球蛋白A层析、层析聚焦和差异溶解。

为了促进回收，所表达的编码序列可以进行改造，以编码本发明的多肽和融合的可切割部分。可以这样设计此类融合蛋白，使得可以通过亲和层析容易地分离多肽；例如，通过固定在对于可切割部分特异性的柱上。当在多肽和可切割部分之间改造切割位点时，多肽可以通过用适当的酶或试剂处理从层析柱中释放，所述酶或试剂在该位点处特异性切割融合蛋白[例如，参见Booth等人，Immunol. Lett. 19:65-70 (1988)；以及Gardella等人，J. Biol. Chem. 265:15854-15859 (1990)]。

用于本发明的目的的示例性纯化标签包括但不限于多组氨酸、V5、myc、蛋白A、谷胱甘肽-S-转移酶、麦芽糖结合蛋白(MBP)和纤维素结合结构域(CBD) [Sassenfeld，1990，TIBTECH，8，88-9]。

本发明的多肽优选以“基本上纯的”形式回收。

如本文使用的，短语“基本上纯的”指允许蛋白质在本文所述的应用中的有效使用的纯度。

本发明的一些实施方案的LPD或多肽(包括例如Fc部分)可以在表达之后用化学修饰进行化学修饰，用于增加生物利用度。

因此，例如，本发明考虑了其中多肽与聚合物连接的修饰。所选择的聚合物通常被修饰为具有单一的反应基团，例如用于酰化的活性酯或用于烷基化的醛，使得可以控制修饰程度。在聚合物的范围内包括的是聚合物的混合物。优选地，对于最终产物制剂的治疗用途，聚合物将是药学上可接受的。

聚合物或其混合物可以选自例如聚乙二醇(PEG)、单甲氧基聚乙二醇、葡聚糖、纤维素或其它基于碳水化合物的聚合物、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)和聚乙烯醇。

在更进一步的实施方案中，多肽通过PEG化、HES化CTP (C末端肽)、与白蛋白交联、包封、用多糖修饰和多糖改变进行修饰。修饰可以针对多肽中的任何氨基酸残基。

根据一个实施方案，修饰是针对LPD的N或C末端氨基酸。这可以直接或通过与以下偶联来实现：加入N或C末端的半胱氨酸残基的硫醇基、或者加入N或C末端的接头如Ttds。在进一步的实施方案中，多肽的N或C末端包含半胱氨酸残基，保护基团与所述半胱氨酸残基的N末端氨基偶联，并且半胱氨酸硫醇基用官能团如N-乙基马来酰亚胺、PEG基团、HES化CTP进行衍生。

众所周知，某些蛋白质的性质可以通过聚乙二醇(PEG)聚合物的附着进行调节，所述聚乙二醇(PEG)聚合物增加蛋白质的流体力学体积，且从而减慢其通过肾过滤的清除率。(参见例如，Clark等人，J. Biol. Chem. 271: 21969-21977 (1996)。因此，设想了核心肽残基可以是PEG化的，以提供增强的治疗益处，例如，通过延长体内半衰期增加的功效。因此，使多肽PEG化将改善多肽的前肽结构域的药代动力学和药效学。

PEG化方法是文献中众所周知的，并且在下述参考文献中进行描述，所述参考文献各自引入本文作为参考：Lu等人，Int. J. Pept. Protein Res. 43: 127-38 (1994)；Lu等人，Pept. Res. 6: 140-6 (1993)；Felix等人，Int. J. Pept. Protein Res. 46: 253-64(1995)；Gaertner等人，Bioconjug. Chem. 7: 38-44 (1996)；Tsutsumi等人，Thromb.Haemost. 77: 168-73 (1997)；Francis等人，Int. J. Hematol. 68: 1-18 (1998)；Roberts等人，J. Pharm. Sci. 87: 1440-45 (1998)；以及Tan等人，Protein Expr.Purif. 12: 45-52 (1998)。聚乙二醇或PEG意欲包含已用于衍生其它蛋白质的任何形式的PEG，包括但不限于单-(C_1-10)烷氧基或芳氧基-聚乙二醇。合适的PEG部分包括例如40 kDa甲氧基聚(乙二醇)丙醛(Dow，Midland，Mich.)；60 kDa甲氧基聚(乙二醇)丙醛(Dow，Midland，Mich.)；40 kDa甲氧基聚(乙二醇)马来酰亚胺基-丙酰胺(Dow，Midland，Mich.)；31 kDa α-甲基-w-(3-氧代丙氧基)，聚氧乙烯(NOF Corporation，Tokyo)；mPEG₂-NHS-40k(Nektar)；mPEG₂-MAL-40k (Nektar)、SUNBRIGHT GL2-400MA ((PEG)₂240 kDa) (NOFCorporation，Tokyo)、SUNBRIGHT ME-200MA (PEG20 kDa) (NOF Corporation，Tokyo)。PEG基团一般通过PEG部分上的反应基团(例如醛基、氨基、羧基或硫醇基)与LPD多肽上的反应基团(例如醛基、氨基、羧基或硫醇基团)的酰化、酰胺化、硫醚化或还原烷基化而附着至LPD多肽。

PEG分子可以共价附着至多肽中的任何位置处的任何Lys或Cys残基。可以使用的其它氨基酸是Tyr和His。任选的还有具有羧基侧链的氨基酸。本文所述的多肽可以经由N末端氨基，直接对N末端处的任何氨基酸进行PEG化。可以将“接头臂”加入多肽中，以促进PEG化。在半胱氨酸的硫醇侧链处的PEG化已得到广泛报道(参见例如，Caliceti & Veronese，Adv. Drug Deliv. Rev. 55: 1261-77 (2003))。如果多肽中不存在半胱氨酸残基，则可以经由取代或通过对N末端氨基酸添加半胱氨酸来引入半胱氨酸残基。其它选项包括向多肽添加硫醇的试剂，如Traut氏试剂和SATA。

在特定方面，PEG分子是支化的，而在其它方面，PEG分子可以是线性的。在特定方面，PEG分子的分子量为1 kDa至150 kDa。更特别地，PEG分子的分子量为1 kDa至100 kDa。在进一步的方面，PEG分子选自5、10、20、30、40、50和60 kDa。

用于多肽的PEG化的有用策略由以下组成：通过在溶液中形成缀合连接，将肽和PEG部分组合，各自具有针对彼此相互反应的特殊功能性。多肽可以通过如上文所述的重组手段容易地制备。

根据一个实施方案，PEG在附着至多肽之前被“预活化”。例如，羧基封端的PEG可以转化为NHS酯用于活化，使得它们针对赖氨酸和N末端更具反应性。

根据另一个实施方案，该多肽在特异性位点处用适当的官能团“预活化”。多肽与PEG的缀合可以在水相或有机共溶剂中进行，并且可以通过SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、SEC和质谱法容易地监测。然后纯化PEG化多肽。小PEG可以通过超滤去除。较大的PEG通常使用阴离子层析、阳离子层析或亲和层析进行纯化。PEG化多肽的表征可以通过分析型HPLC、氨基酸分析、IEF、酶促活性的分析、电泳、PEG:蛋白质比率分析、激光解吸质谱法和电喷雾质谱法来进行。

可以通过用POROS 50 HQ支持物(Applied Biosystems)填充柱(Tricorn EmptyHigh-Performance Columns，GE Healthcare)来执行过量的游离PEG的去除，这之后用平衡缓冲液(25 mM Tris-HCl缓冲液，pH 8.2)来平衡柱。将PEG化多肽加载到平衡柱上，并且其后用5CV的平衡缓冲液洗涤柱。在这些条件下，多肽与柱结合。PEG化多肽在下一步通过洗脱缓冲液进行洗脱，并且在2-8ºC下用于短期贮存，或在-20ºC下冷冻用于长期贮存。

所得多肽可以为40-100 KDa之间的任何大小，取决于是否已添加修饰(如上文所述)和糖基化状态(如上文所述)。

例如，在Fc融合物的情况下：

根据一个具体实施方案，该多肽是40-70 KDa。

根据一个具体实施方案，该多肽是45-65 KDa。

根据一个具体实施方案，该多肽是50-70 KDa。

根据一个具体实施方案，该多肽是45 KDa。

根据一个具体实施方案，该多肽是65 KDa。

根据一个具体实施方案，缺乏LOX催化活性的LOX的多肽结构域少于400个氨基酸，例如100-200、100-150、100-300个氨基酸长度。

通过仅使LOX与包含修饰的合成多肽接触，合成多肽可以用于抑制LOX的催化(酶促活性)的任何方法中。此类方法可以在体外、体内或离体执行。

本发明的一些实施方案的多肽可以用于治疗上文提到的纤维化或纤维化病况。

根据一个具体实施方案，本发明的一些实施方案的多肽并不作为方案的部分使用(或施用)，所述方案包括用D-青霉胺的治疗。

本发明的多肽或编码其的多核苷酸可以本身(例如，纯化的或直接作为表达系统的部分)提供给所治疗的受试者(即哺乳动物)，或者可以在包含本发明的多肽的药物组合物中提供。如本文使用的，“药物组合物”指本文所述的一种或多种活性成分与其它化学组分，如生理学上合适的载体和赋形剂的制剂。药物组合物的目的是促进化合物对生物体的施用。

在本文中，术语“活性成分”指可导致生物效应的本发明的多肽(或编码其的多核苷酸)。

在下文中，可以互换使用的短语“生理学上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”指这样的载体或稀释剂，其不引起对生物体的明显刺激，并且不取消所施用化合物的生物活性和特性。佐剂包括在这些短语下。

在本文中，术语“赋形剂”指加入药物组合物中，以进一步促进活性成分的施用的惰性物质。赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种类型的糖和淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。

关于药物配制和施用的技术可以在“Remington’s Pharmaceutical Sciences,”Mack Publishing Co.，Easton，PA，最新版本中找到，所述参考文献引入本文作为参考。

合适的外周施用途径可以例如包括经口，直肠，经粘膜，尤其是经鼻、肠或肠胃外递送，包括肌内、皮下和静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。

本发明的药物组合物可以通过本领域众所周知的工艺来制造，例如，借助于常规混合、溶解、制粒、糖衣丸制备、水飞、乳化、包囊、包埋或冻干工艺。

因此，用于根据本发明使用的药物组合物可以以常规方式进行配制，使用包含赋形剂和助剂的一种或多种生理学上可接受的载体，其促进活性成分加工成可以在药学上使用的制剂。适当的制剂取决于选择的施用途径。

对于注射，药物组合物的活性成分可以在水溶液中进行配制，优选在生理学相容的缓冲液中，例如汉克氏溶液、林格氏溶液或生理盐缓冲液。对于经粘膜施用，在制剂中使用对于待渗透的屏障适当的渗透剂。此类渗透剂是本领域一般已知的。

对于经口施用，可以通过将活性化合物与本领域众所周知的药学上可接受的载体组合，来容易地配制药物组合物。此类载体使得药物组合物能够被配制为片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆剂、浆料、悬浮液等等，用于被患者经口摄取。用于经口使用的药物制剂可以通过以下进行制备：使用固体赋形剂，任选地研磨所得到的混合物，并且在需要时加入合适的助剂后，加工颗粒的混合物，以获得片剂或糖衣丸芯。合适的赋形剂特别是填料，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素制剂，例如玉蜀黍淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍树胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；和/或生理学上可接受的聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。需要时，可以加入崩解剂，例如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐例如海藻酸钠。

糖衣丸芯提供有合适的包衣。为此，可以使用浓缩的糖溶液，其可以任选地含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以将染料或色素加入片剂或糖衣丸包衣中，用于鉴定或表征活性化合物剂量的不同组合。

可以经口使用的药物组合物包括由明胶制成的推入配合胶囊，以及由明胶和增塑剂如甘油或山梨糖醇制成的密封软胶囊。推入配合胶囊可以含有与填料如乳糖、粘合剂如淀粉、润滑剂如滑石或硬脂酸镁以及任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性成分可以溶解或悬浮于合适的液体中，所述液体例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。另外，可以添加稳定剂。用于经口施用的所有制剂应该为适合于选择的施用途径的剂量。

对于颊部施用，组合物可以采取以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。

对于通过鼻吸入的施用，用于根据本发明使用的活性成分，以来自加压包装或喷雾器的气溶胶喷雾呈现的形式方便地递送，其中使用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供阀门以递送计量的量来确定。可以配制用于分配器中的例如明胶的胶囊和药液筒，其含有化合物和合适的粉末基质例如乳糖或淀粉的粉末混合物。

本文所述的药物组合物可以配制用于肠胃外施用，例如通过推注或连续输注。用于注射的制剂可以以单位剂型存在于例如安瓿或多剂量容器中，具有任选添加的防腐剂。组合物可以是在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳剂，并且可以含有配制试剂例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。

用于肠胃外施用的药物组合物包括以水溶性形式的活性制剂的水溶液。另外，可以将活性成分的悬浮液制备为适当地基于油或水的注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油例如芝麻油，或者合成脂肪酸酯例如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。水性注射悬浮液可以含有增加悬浮液的粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，悬浮液还可以含有合适的稳定剂或增加活性成分的溶解度的试剂，以允许制备高度浓缩的溶液。

可替代地，活性成分可以是粉末形式，用于在使用前由合适的媒介物例如无菌、无热原的水基溶液构造。

本发明的药物组合物也可以使用例如常规的栓剂基质，例如可可脂或其它甘油酯配制成直肠组合物，例如栓剂或保留灌肠剂。

适用于本发明的背景下的药物组合物包括这样的组合物，其中活性成分以有效达到预期目的的量包含。更具体而言，治疗有效量意指这样的活性成分(例如核酸构建体)的量，其有效预防、减轻或改善病症(例如，局部缺血)的症状，或者延长待治疗受试者的存活。

治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力内，尤其是根据本文提供的详细公开内容。

对于本发明的方法中使用的任何制剂，治疗有效量或剂量可以最初从体外和细胞培养测定进行估计。例如，可以在动物模型中制定剂量，以达到所需的浓度或滴度。此类信息可以用于更准确地确定在人中的有用剂量。

本文所述的活性成分的毒性和治疗功效可以通过在体外、细胞培养或实验动物中的标准药学程序来确定。从这些体外和细胞培养测定以及动物研究中获得的数据可以用于制定用于在人中使用的剂量范围。剂量可以根据采用的剂型和利用的施用途径而变。确切的制剂、施用途径和剂量可以由各个医生考虑到患者的状况加以选择。(参见例如，Fingl等人，1975，于"The Pharmacological Basis of Therapeutics"，第1章，第1页)。

下述的实施例部分详细描述了关于DMD的动物模型以及确定功效的标准测试。

关于其它纤维化病况的动物模型是本领域众所周知的，参见例如，Delire等人 JClin Transl Hepatol. 2015 Mar；3(1): 53–66中描述的肝纤维化模型；Moore等人描述了关于纤维化肺病的动物模型；并且Rai等人Mol Cell Biochem. 2017 Jan；424(1-2):123-145. doi: 10.1007/s11010-016-2849-0描述了关于心脏纤维化的动物模型。

剂量的量和间隔可以个别地调整，以提供活性成分的血浆或脑水平，其足以诱导或压制生物效应(最小有效浓度，MEC)。MEC对于每种制剂不同，但可以从体外数据进行估计。达到MEC必需的剂量取决于个体特征和施用途径。检测测定可以用于确定血浆浓度。

取决于待治疗病况的严重性和响应性，给药可以是单次施用或多次施用，其中治疗过程持续数天至数周，或者直至实现治愈或达到疾病状态的减轻。

当然，待施用的组合物的量取决于待治疗的受试者、病痛的严重性、施用方式、开处方医生的判断等。

需要时，本发明的组合物可以存在于包装或分配器装置，例如美国食物药品监督管理局(U.S. Food and Drug Administration) (FDA)批准的试剂盒中，其可以包含含有活性成分的一个或多个单位剂型。包装可以例如包含金属箔或塑料箔，例如泡罩包装。包装或分配器装置可能伴随有施用说明书。包装或分配器也可以容纳伴随容器的通告，所述通告为由管理药品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式，所述通告反映了该机构对于组合物的形式或者人或兽医学施用的批准。例如，此类通告可以是由美国食物药品监督管理局(FDA)批准用于处方药的标签，或者批准的产品插页。如上文进一步详述的，还可以制备包含在相容的药物载体中配制的本发明的制剂的组合物，置于适当的容器中，并且标记用于治疗指示的病况。

如本文使用的，术语“约”指±10%。

术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有”及其词形变化意指“包括但不限于”。

术语“由……组成”意指“包括并限于”。

术语“基本上由……组成”意指组合物、方法或结构可以包括另外的成分、步骤和/或部分，但仅在另外的成分、步骤和/或部分不会实质上改变所请求保护的组合物、方法或结构的基础和新型特征的情况下。

如本文使用的，单数形式的“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指示物，除非上下文另外明确指出。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括其混合物。

本申请自始至终，本发明的各个实施方案可以以范围形式呈现。应该理解，以范围形式的描述仅是为了方便和简洁起见，而不应该被解释为对本发明的范围的硬性限制。相应地，范围的描述应该被视为已具体地公开了所有可能的子范围、以及在该范围内的各个数值。例如，范围如从1到6的描述应该被视为已具体地公开了子范围，例如从1到3、从1到4、从1到5、从2到4、从2到6、从3到6等，以及在该范围内的各个数字，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的广度如何，这都适用。

每当在本文中指示数值范围时，它意欲包括在指示范围内的任何引用数字(分数或整数)。短语“范围为第一指示数目至第二指示数目之间/范围在第一指示数目和第二指示数目之间”、以及“范围为第一指示数目到第二指示数目/范围从第一指示数目到第二指示数目”在本文中可互换使用，并且意欲包括第一指示数目和第二指示数目、以及其间的所有分数和整数。

如本文使用的，术语“方法”指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业人员已知的，或者从已知的方式、手段、技术和程序容易开发的那些方式、手段、技术和程序。

如本文使用的，术语“治疗”包括取消、基本上抑制、减慢或逆转病况的进展，基本上改善病况的临床或美学症状，或者基本上预防病况的临床或美学症状的出现。

当提及特定序列表时，此类提及应理解为还包括与其互补序列基本上对应的序列，所述序列包括微小序列变异，其起因于例如测序错误，克隆错误或者导致碱基取代、碱基缺失或碱基添加的其它改变，条件是此类变异的频率小于50个核苷酸中的1个，可替代地，小于100个核苷酸中的1个，可替代地，小于200个核苷酸中的1个，可替代地，小于500个核苷酸中的1个，可替代地，小于1000个核苷酸中的1个，可替代地，小于5,000个核苷酸中的1个，可替代地，小于10,000个核苷酸中的1个。

应理解，本申请中公开的任何序列标识号(SEQ ID NO)可以指DNA序列或RNA序列，取决于其中提到该SEQ ID NO的上下文，即使该SEQ ID NO仅以DNA序列形式或RNA序列形式表述。

应了解，为了清楚起见，在分开的实施方案的背景下描述的本发明的某些特征，也可以在单个实施方案中组合提供。相反，为了简洁起见，在单个实施方案的背景下描述的本发明的各种特征，也可以分开地或以任何合适的子组合或如本发明的任何其它所述实施方案中合适地提供。在各个实施方案的背景下描述的某些特征，不应被视为那些实施方案的必要特征，除非该实施方案没有那些要素是不可操作的。

如上文描绘的以及如所附权利要求部分中请求保护的，本发明的各个实施方案和方面在下述实施例中找到实验支持。

实施例

现在参考下述实施例，其连同上文说明书一起，以非限制性方式示出了本发明的一些实施方案。

一般地，本文使用的命名法和本发明中利用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。此类技术在文献中得到详尽解释。参见例如，"Molecular Cloning:A laboratory Manual" Sambrook等人，(1989)；"Current Protocols in MolecularBiology"第I-III卷Ausubel，R. M.编辑(1994)；Ausubel等人，"Current Protocols inMolecular Biology"，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，"APractical Guide to Molecular Cloning"，John Wiley & Sons，New York(1988)；Watson等人，"Recombinant DNA"，Scientific American Books，New York；Birren等人(编辑)"Genome Analysis: A Laboratory Manual Series"，第1-4卷，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York(1998)；如美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中所示的方法学；"Cell Biology: A Laboratory Handbook"，第I-III卷Cellis，J. E.编辑(1994)；"Culture of Animal Cells - A Manual of BasicTechnique" by Freshney，Wiley-Liss，N. Y.(1994)，第三版；"Current Protocols inImmunology"第I-III卷Coligan J. E.编辑(1994)；Stites等人(编辑)，"Basic andClinical Immunology"(第8版)，Appleton & Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell和Shiigi(编辑)，"Selected Methods in Cellular Immunology"，W. H. Freeman and Co.，NewYork(1980)；可用的免疫测定在专利和科学文献中得到广泛描述，参见例如美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；"Oligonucleotide Synthesis" Gait，M. J.编辑(1984)；“Nucleic AcidHybridization" Hames，B. D.和Higgins S. J.编辑(1985)；"Transcription andTranslation" Hames，B. D.和Higgins S. J.编辑(1984)；"Animal Cell Culture"Freshney，R. I.编辑(1986)；"Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press,(1986)；"APractical Guide to Molecular Cloning" Perbal，B.,(1984)，以及"Methods inEnzymology"第1-317卷，Academic Press；"PCR Protocols: A Guide To Methods AndApplications"，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Marshak等人，"Strategies forProtein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHLPress(1996)；所有这些都引入作为参考，如同它在本文中充分阐述一样。本文件自始至终提供了其它一般参考文献。其中的程序被认为是本领域众所周知的，并且为了读者的方便而提供。其中包含的所有信息都引入本文作为参考。

材料与方法

Fc-LPD表达和纯化

将人LOX (22–168) SEQ ID NO: 1的前结构域克隆到pYD5哺乳动物表达载体内，并且用聚乙烯亚胺(PEI)转染试剂，以1:2的DNA-PEI比，将质粒转化到处于指数生长期的感受态HEK293-6E细胞内。在120小时温育后，收获细胞并且在HiTrap蛋白A柱上纯化上清液，用100 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 8)平衡，并且通过100 mmol/L柠檬酸盐缓冲液(pH 3-4.5)执行洗脱。

LOX催化结构域表达和纯化

将SEQ ID NO: 3的人LOX (169-417)的催化结构域，即SEQ ID NO: 10克隆到pET28表达载体内，并且转化到感受态大肠杆菌BL21 SHuffle菌株内。将单个菌落重悬浮于补充有抗生素的10 ml液体培养基中。10 ml培养物用于接种1 L液体培养基。使培养物在30℃下温育，直到O.D₆₀₀达到0.4-0.8，这之后加入0.4 mM IPTG诱导物。使培养物在16℃、250rpm下温育过夜。将培养基以4000 rpm离心15分钟。与含有50mM Tris-HCl (pH 8)、200mMNaCl、40mM咪唑、溶菌酶、蛋白质抑制剂和DNA酶的裂解缓冲液一起在冰上温育之后，使沉淀的级分冷冻30分钟。将溶液超声处理并以24,000 rpm离心40分钟。悬浮液用0.22 µM过滤器纯化并且加载到HisTrap柱(GE Healthcare)上，所述柱用下述缓冲液进行预平衡：50 mMTris-HCl pH 8、200 mM NaCl、40 mM咪唑。用50 mM Tris-HCl pH 8、200 mM NaCl、400 mM咪唑来洗脱蛋白质。酶通过使用HiLoad 16/60 Superdex 75 (Amersham Biosciences)的尺寸排阻层析进行纯化，并且用50 mM Tris-HCl pH 8、200 mM NaCl进行洗脱。

胶原组装测定法

使HDF细胞在35 mm皿中的DMEM 10% FCS培养基中铺平板。在细胞培养基中的第二天，加入下述因子用于诱导细胞外基质表达：5 ng/mL EGF、5 ug/mL胰岛素和150 ug/mL L-抗坏血酸，在第一个实验中，在Fc-LPD的存在(1uM和10uM)或不存在下，并且对于第二个实验，在Fc，Fc-LPD和Fc-LPD N346、362、409Q (5uM)的存在下。用双光子显微术和二次谐波发生(图2B-C) (参见下文)，从1到2周监测ECM形成。

ELISA结合测定法

96孔板(Nunc)用LOX催化结构域、HSP70或BSA以10 μg/mL进行包被。在用2% BSA的PBS溶液封闭后，使板与Fc和Fc-LPD一起在37℃下温育1小时。通过过氧化物酶缀合的山羊抗人抗体(Jackson ImmunoResearch)来检测结合的抗体。用GraphPad Prism从FindECanything曲线拟合分析计算EC₅₀。

微量热泳动(MST)

使用NT-647染料(RED-tris-NTA)，用Monolith His-tag Labeling Kit标记LOX(200 nM) (SEQ ID NO: 9)，并且温育30分钟。增加Fc和Fc-LPD的浓度，并且使用MonolithNT.115 (Nanotemper，德国)，以50%激光功率、35秒的激光开启时间和40% LED功率测量样品。

差示扫描荧光法(DSF)

NanoDSF Prometheus NT.48通过在20 - 95℃的范围内用1℃/分钟的可调加热速率连续加热样品，使用内在色氨酸或酪氨酸荧光，测量超高分辨率的LOX蛋白质稳定性，并且同时读取荧光信号和反向反射信号两者。

免疫沉淀

根据制造商的说明书(GE I.P珠)，将Fc-LPD共价包被到蛋白G珠(GE)上。使包被的珠与来自HDF细胞的10 cm²皿培养物的浓缩上清液一起在4℃下温育过夜。通过离心(~500x g，共5分钟，4℃)获得沉淀珠，并且用体积为初始珠体积至少5倍的PBS洗涤珠。然后将珠沉淀置于收集柱中，将所述收集柱插入含有10ul 1M Tris-HCl pH 8的eppendorf管中。将90 µl洗脱缓冲液(Thermo-Scientific)加入珠中，并且在温育5分钟后，通过离心机执行洗脱。将最后一步重复四次。

用于表征Fc-LPD的质谱法

使凝胶条带经受凝胶内胰蛋白酶消化，随后为脱盐步骤。使用与高分辨率、高质量准确度质谱法(Fusion Lumos)偶联的纳流液相层析(nanoAcquity)，来分析所得到的肽，使用EThcD片段化以生成聚糖和肽两者的片段化。在发现模式下，以随机次序分别分析每个样品。数据在Byonic v2.15.89中处理。这是独特的软件，其可以处理此类数据并鉴定聚糖。搜索针对uniprot人数据库来完成，并且允许下述修饰：C的脲甲基化作为固定修饰，N末端、H或K的脲甲基化，N或Q、Glu或Gln至焦-Glu的脱酰胺，氨损失，N末端乙酰化、STK的甲酰化、ST的脱水和N-糖基化作为可变修饰。过滤数据以允许最大1%的错误发现率(FDR)。

用于鉴定来自Fc-LPD的I.P的凝胶条带的质谱法

使凝胶条带经受凝胶内胰蛋白酶消化，随后为脱盐步骤。使用与高分辨率、高质量准确度质谱法(Q Exactive Plus)偶联的纳流液相层析(nanoAcquity)，来分析所得到的肽。在发现模式下，以随机次序分别在仪器上分析每个样品。数据使用ProteomeDiscoverer版本2.2.0.388进行处理，针对Uniprot人蛋白质数据库进行搜索，在所述数据库中添加了常见实验室污染物的列表。搜索用两种搜索算法完成 - SequestHT和Mascot。

双光子显微术和二次谐波发生

样品的图像使用2PM: Zeiss LSM 510 META NLO显微镜来获取，所述显微镜配备有宽带Mai Tai-HP-飞秒单盒可调谐Ti-蓝宝石振荡器，具有使用855-nm波长(在400 nm处检测)从Spectra-Physics自动调谐700至1,020 nm的宽带波长，以及20x和25x物镜。ECM的厚度以um基于z-堆叠进行计算。

图像分析

成像分析通过Fiji包[28]完成。使用由Jean-Yves Tinevez (pacificdotmpi-cbgdotde/wiki/indexdotphp/Directionality)创建的Fiji插件“Directionality”，并且遵循Fiji的说明书，对数据执行关于方向性的傅立叶成分分析。对于熵计算，使用Fijimacro CDS.ijm以创建取向分析文件，然后通过经由O. Golani & G. Molodij开发并由E.Shimshoni修改的matlab脚本来计算平均熵。

动物实验

对于早期实验，使用大约8周龄的雄性Mdx小鼠(每组8只)。一组用5mg/kg Fc治疗，第二组用5mg/kg Fc-LPD治疗，而第三组用5mg/kg Fc-LPD N346、362、409Q治疗，每周一次，使用腹膜内注射。每两周，小鼠在转棒测定法中进行测试。在3个月后处死小鼠，并且将心脏、膈膜、胫骨前肌、股四头肌和腓肠肌立即固定或在OTC中冷冻。

对于晚期实验，使用大约23-25周龄的雄性Mdx小鼠(每组4只)。一组用5mg/kg Fc治疗，而另一组用5mg/kg Fc-LPD治疗，每周一次，使用腹膜内注射。每两周，小鼠在转棒测定法中进行测试，并且每隔一周，它们用四肢悬挂测试进行测试。在3个月后处死小鼠，并且将心脏、膈膜、胫骨前肌和腓肠肌立即固定或在OTC中冷冻。

转棒跑步

对于转棒跑步测定法，确定了肌肉力量、协调性、平衡性和状况。当转棒以5 rpm的缓慢稳定速度旋转时，将小鼠置于转棒的管上。在小鼠定位后，前15秒的速度从5加速到45rpm，然后维持在该速度下。跑步时间由软件连续记录，并且当小鼠从管跌落时自动停止。如果小鼠在跑步时转向面对管上的相反方向，则执行重新定位，而不停止管的旋转。

悬挂测试

使用悬挂测试，可以评价平衡性、协调性和肌肉状况。这个测试基于小鼠渴望保持悬挂在线或网格上直到筋疲力尽的了解。具体而言，使用了用于大鼠的大笼子的盖子。将经由尾部处理的小鼠带到网格附近。让小鼠用四只爪子抓住网格。将网格倒置，使得小鼠悬挂并直接启动计时器。在小鼠从线跌落后，停止计时器并且标记悬挂时间的记录。

组织化学

如先前所述(Rolls等人，2008)，应用了两种不同的组织制备方案(石蜡包埋和显微切片的(microtomed)冷冻切片)。将载玻片暴露于Hoechst染剂(1:4,000；InvitrogenProbes) 1分钟。执行标记I型和III型胶原的天狼星红染色，用于III型胶原的网硬蛋白染色，以及用于区分细胞与周围结缔组织的Masson氏三色染色。对于显微镜分析，使用配备有Nikon数码相机(DS-Ri1)的Nikon光学显微镜(Eclipse E800)。

酵母表面展示表达

将构建体扩增并克隆到pETCON (LPD)质粒内，与AGA2 基因、N末端HA标签和C末端Myc标签符合读框。然后将构建体转化到EBY100 (酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))菌株内，并且在SD-Trp板上铺平板用于选择。在30℃温育48小时后，使单个菌落经受菌落PCR。符合预计条带大小的片段进行PCR纯化且测序。

构建体在SD-CAA¹⁴³培养基中在30℃下培养，直至0.8 OD₆₀₀，此时使细胞沉淀，并且在新鲜的SG-CAA¹⁴³ 培养基中在15℃下诱导38小时。展示的蛋白质表达用两种互补分析进行测量：流式细胞术和活性测定法(对于wt构建体)。

使3 x 10⁷ 个完全诱导的细胞沉淀并连续洗涤两次。每次洗涤由以下组成：在0.8ml PBS + 0.5% BSA缓冲液(洗涤缓冲液)中重悬浮、离心30秒和13kRPM。使洗涤的细胞与α-c-Myc抗体(Santa Cruz 9e10，1:50稀释)一起在200μl洗涤缓冲液中在RT下温育45分钟，然后洗涤两次。细胞在4℃下在200µl中用第二山羊α小鼠– IgG (Fc特异性)–FITC抗体(Sigma F4143，1:50稀释)进一步标记另外30分钟。

在表达和α-c-Myc/FITC标记后，将3.3 x 10⁶个EBY100细胞在200μl洗涤缓冲液中洗涤两次，补充有生物素化肽(30-100μM)，并且在RT下温育2小时。在温育之后，将细胞用洗涤缓冲液洗涤两次，并且在冰上与100μl洗涤缓冲液中1:100稀释的链霉抗生物素蛋白-APC(别藻蓝蛋白-链霉抗生物素蛋白，0.5mg/ml，Jackson ImmunoResearch)一起温育另外30分钟。对于LPD-HSP70相互作用，使细胞在RT下与用Atto 633染料(Sigma 51253)标记的HSP70一起温育30分钟。最后，将细胞洗涤两次，通过70 μm网眼尼龙滤网过滤，并且在1.6ml洗涤缓冲液中稀释。这些随后为流式细胞术分析，并且通过Flow Jo软件分析数据。

统计分析

所有分析执行至少三次。使用GraphPad Prism 7执行统计分析。

用于糖基化突变体的材料和方法。

实施例1

Fc-LPD的表达和表征

为了剖析DMD中的细胞外LOX活性并且阐明在疾病进展过程中的纤维化，开发了用LOX的内源性抑制剂改造的的蛋白质抑制剂。具体而言，选择自抑制性LPD (由SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列编码的SEQ ID NO: 1)，以抑制LOX的活化形式(图1A)。基于前结构域不稳定且它们的生产面临困难的事实，生成与Fc-标签融合的LPD (由SEQ ID NO: 8中所示的核苷酸序列编码的SEQ ID NO: 7)，以便增加功能性。重要的是，Fc-LPD (由SEQ ID NO:6中所示的核苷酸序列编码的SEQ ID NO: 5)以二聚体形式表达，产生最小化的大约95 kDa分子大小的抗体样抑制剂(图1B)。在哺乳动物细胞HEK293-6E中表达后，细胞培养基通过蛋白A柱进行纯化，并且纯Fc-LPD在PBS中透析，然后开始功能测定法的评估。

通过经由分别测量EC₅₀和解离常数(K_D)估计结合亲和力，来执行Fc-LPD的结合亲和力和抑制活性的评估。生成的Fc-LPD抑制剂的EC₅₀通过ELISA (图1C)进行测量，针对LOX催化结构域范围为10至2000 nM (EC₅₀=43 nmol/L)。Fc-LPD (27 nmol/L)的解离常数(K_D)通过微量热泳动进行确定(图1D)，而对抑制剂的Fc区域未检测到相互作用。Fc-LPD的超高分辨率稳定性用差示扫描荧光法(DSF)进行测量，并且转变中点鉴定为70℃，指示了Fc-LPD在溶液中是稳定的(图1F、1G)。

在Fc-LPD的纯化后，无论是在还原条件还是非还原条件下的样品的SDS-page分析，指示了混合物群体。LPD已知有三个不同的N-糖基化位点，并且由于表达在哺乳动物表达系统中执行，因此通过MS分析了不同大小的条带(45 kDa和60 kDa)。结果显示了在两个条带中均检测到N81-糖基化(本文构建体中的N346)，具有在45 kDa Fc-LPD和60 kDa条带中范围为203-2790Da的多重糖型(图1A)，但在60 kDa条带的情况下具有更高的频率。在45和60 kDa Fc-LPD两者中再次检测到N144-糖基化(构建体中的N409)位点，具有范围为203-3809Da的聚糖。仅在用α-裂解性蛋白酶(Sigma A6362)消化后，才在45和60 kDa条带两者中检测到N97-糖基化位点(构建体中的N362)，在45 kDa Fc-LPD和60 kDa条带中范围为203-2499Da。最后，鉴定了在两个条带的Fc区域中的又一个糖基化位点，荷有大小为1300-1800Da的少数糖型。在图1A中，由于Fc (SEQ ID NO: 5)的存在，氨基酸位置已转变，N81、97、144现在是N346、362、409。

实施例2

Fc-LPD干扰胶原纤维组装能力的鉴定

使用活化的人真皮成纤维细胞(HDF)，在体外系统中检查了Fc-LPD对LOX的酶促活性的作用。详细地，开发了筛选系统，以通过先进的显微镜工具来监测胶原交联反应的特异性事件和阶段(图2A)。用含有EGF、胰岛素和L-抗坏血酸的活化培养基培养HDF细胞，并且诱导ECM分子(主要是胶原)的表达。通过双光子SHG显微术监测纤维胶原的组装，伴随和不伴随Fc-LPD，鉴定了新近设计的Fc-LPD靶向胶原交联和组装的晚期阶段。这些结果证实了通过Fc-LPD抑制LOX介导的胶原交联，改变了体外天然成纤维细胞衍生的3D基质支架中的正常胶原原纤维排列的取向(图2B)。

此外，在Fc，Fc-LPD和Fc-LPD N346、362、409Q (5uM)的存在下，用ECM激活培养基培养HDF细胞。在培养7天后，用双光子SHG显微术监测胶原纤维，并且观察到纤维取向的中断(图2C)。证实了含有Fc-LPD N346、362、409Q的系统中显著的熵增加(图2D)。此外，ECM厚度(z-堆叠)的测量突出显示了Fc-LPD和Fc-LPD N346、362、409Q治疗的细胞中ECM产生的显著减少(图2E)。

实施例3

不同Fc-LPD糖基化形式的相互作用

通过使用来自HDF细胞的上清液的免疫沉淀实验，检查Fc-LPD与由HDF分泌的蛋白质的相互作用。为此，将HDF细胞在60 cm²皿中的10 ml无血清和无酚红培养基中培养3天。收集培养基并且使用10kDa截断vivaspin过滤器浓缩，并且分别与45 kDa Fc-LPD和60 kDaFc-LPD一起温育，所述Fc-LPD先前通过凝胶过滤进行半分离，并且与蛋白G珠一起温育(图3A)。通过SDS-page和蛋白质印迹分析样品。在两种样品的SDS-page分析中，检测到两个高分子量条带并且通过MS进行分析(图3B)，而在蛋白质印迹实验中，检测到LOX (30 kDa)，突出显示了Fc-LPD在体外生理条件下结合LOX的能力(图3C)。MS数据的分析显示了两种Fc-LPD形式与ECM分子的相互作用，所述ECM分子或是核心基质组(matrisome)的部分、或与基质组关联。具体而言，在免疫共沉淀蛋白中有ECM糖蛋白(纤连蛋白和血小板反应蛋白-1)、ECM调节剂(SerpinB12、A2-巨球蛋白)、分泌因子(丝聚蛋白-2、角蛋白(hornerin))、细胞外区域或分泌蛋白(HSP70、a2-HS-糖蛋白等)和其它蛋白质(下表1)。这些相互作用是与Fc-LPD的直接相互作用。由于HSP70被确定为重要的相互作用物，因此通过经由测量EC₅₀估计结合亲和力，来执行Fc-LPD和Fc-LPD N346、362、409Q的结合亲和力的评估。所生成的Fc-LPD和Fc-LPD N346、362、409Q抑制剂的EC₅₀通过ELISA (图3D)进行测量，针对HSP70范围为10至2000 nM (EC₅₀=41 nmol/L)。此外，用酵母表面展示证明了这种相互作用的直接结合和高亲和力。酵母细胞在细胞表面上表达LPD，并且将标记的HSP70加入溶液中。在RT下温育30分钟后，通过流式细胞术测量相互作用，并且显著的LPD阳性细胞群体对于与HSP70的结合呈阳性(图3E)。

表1. 通过质谱法鉴定的蛋白质的概括

实施例4

在用Fc-LPD和Fc-LPD N346、362、409Q治疗后，DMD肌纤维化的体内评估

为了测试LOX抑制剂是否可以在DMD背景下减轻体内肌纤维化，并且因此它是否可以用作治疗DMD或其它纤维化疾病的新途径，用mdx小鼠进行了两个实验。

对于早期模型，2月龄的雄性mdx小鼠用5mg/kg的LOX抑制剂(Fc-LPD和Fc-LPDN346、362、409Q)或对照抗体(Fc) (对于每组，n=8)每周注射一次(图4A)。在治疗期间执行功能性肌肉测定法，例如转棒跑步，但在用Fc-LPD和Fc-LPD N346、362、409Q治疗后，没有观察到显著改善(图4B)。在治疗已开始三个月后(总共11次抗LOX注射)，收获小鼠，并且使用天狼星红染色和双光子二次谐波发生显微术(其监测天然胶原纤维)，进行肌纤维化(心脏、股四头肌、腓肠肌、胫骨前肌和膈膜)的组织学分析。

具体而言，在用Fc-LPD和Fc-LPD N346、362、409Q治疗后，膈膜组织中的H&E染色显示了中央核病理表型的显著改善，所述中央核病理表型在DMD病理组织中观察到(图4C)。此外，膈膜的天狼星红染色分别显示了Fc-LPD和Fc-LPD N346、362、409Q小鼠中的纤维胶原沉积的~15%和~20%显著减少(图4D-E)。有趣的是，在腓肠肌的情况下，观察到显著更少的中央有核肌纤维(图4F)。与Fc对照相比，在Fc-LPD和Fc-LPD N346、362、409Q的情况下，用天狼星红染色后的胶原沉积显示约45%的减少(图4G-H)。通过检查股四头肌组织，未观察到抗LOX治疗的小鼠和Fc治疗的小鼠之间的胶原沉积量的显著减少(图5A、5B、5C)。然而，在用Fc-LPD N346、362、409Q治疗后，通过双光子SHG显微术进一步监测股四头肌组织的纤维胶原，显示了胶原纤维信号的显著减少(~26%)。当仅对股四头肌的肌内膜进行分析时，Fc-LPDN346、362、409Q治疗的小鼠中的胶原纤维减少是显著的(~34%)。在早期模型中通过双光子SHG分析进行分析的最后一种组织是胫骨前肌。与对照Fc相比，胶原纤维对于Fc-LPD治疗的小鼠减少了~53%，并且对于Fc-LPD N346、362、409Q治疗的小鼠减少了~76%。

对于晚期，6月龄的雄性mdx小鼠用5mg/kg的LOX抑制剂(Fc-LPD)或对照抗体(Fc)(对于每组，n=4)每周注射一次(图6A)。在治疗期间执行功能性肌肉测定法，例如转棒跑步和悬挂测试，并且在Fc-LPD治疗后，观察到显著改善(图6B、6C)。在治疗已开始两个月后(总共8次抗LOX注射)，收获小鼠，并且使用天狼星红染色和双光子二次谐波发生显微术(其监测天然胶原纤维)，进行肌纤维化(心脏、胫骨前肌和膈膜)的组织学分析。最后，进行肌肉组织切片的组织病理学分析，以监测炎症、坏死和平均纤维直径，作为肌纤维成熟度的读出。

具体而言，胫骨前肌(TA)的天狼星红染色证实了LOX抑制的小鼠中的纤维胶原沉积的50%减少(图6D_iii,iv、6E、6G)。这种染色进一步揭示了结缔组织(主要是胶原纤维)在对照肌肉中扩散。相比之下，Fc-LPD治疗的组织更明显且更独特，并且肌肉组构得更好，如通过圆形比监测的(图6F)。mdx小鼠胫骨前肌组织的组织学评估显示了炎症等级(~25%)和纤维化评分(~50%)的减少。通过双光子SHG显微术监测纤维胶原在其天然、未标记状态下的组装，在用Fc-LPD治疗后，观察到具有更多线性方向的更少的胶原纤维信号。为了定量定向纤维取向的变化，应用了对于通过SHG获得的代表性图像的方向性的傅立叶组分分析(图6D_v，vi、6H)。此外，双光子SHG图像显示了Fc治疗的组织中的粗纤维束，其在Fc-LPD治疗的组织中不存在。总之，这些结果证实了，用这种抗LOX分子治疗小鼠抑制了DMD背景中的纤维化累积。

通过检查心脏组织，当与用Fc治疗的小鼠相比时，在Fc-LPD治疗的小鼠中，观察到心脏胶原沉积量显著减少~50%(图7D、7E)。虽然在实验开始时(6-7月龄的mdx小鼠)，心脏和TA肌肉并非高度纤维化的，但膈膜受到显著影响，因此它充当用于测试抗LOX治疗是否可以促进已经纤维化的组织的减轻的模型。收获小鼠的膈膜的天狼星红染色证实了，与其中观察到胶原沉积量减少的心脏和TA肌肉中观察到的相似的模式(图7A、7C)。同样地，进行的病理学家报告提示了纤维化评分的~20%减少(Fc治疗中的25%相对于Fc-LPD治疗中的21%；(图7B)。

实施例5

分析糖基化位点对LPD活性的重要性

克隆和表征

pYD5-Fc-LPD质粒用作模板，以便在LPD中的三个N-糖基化位点N81、97、144 (其是我们具有Q SEQ ID NO: 11的Fc-LPD构建体中的N346、362、409)中产生点突变。根据试剂盒制造商的说明书，用定点诱变执行突变。所生成的Fc-LPD N346、362、409Q抑制剂的EC50通过EC₅₀ (图1C)进行测量，针对LOX催化结构域范围为10至2000 nM (EC₅₀=58 nmol/L)。

免疫沉淀

根据制造商的说明书，将Fc-LPD包被到磁性蛋白G珠(GE)上。使包被的珠与来自HDF细胞的10cm²皿培养物的浓缩上清液一起在4℃下温育过夜。通过离心(~500g，共5分钟，4℃)获得沉淀珠，并且用体积为初始珠体积至少5倍的PBS洗涤珠。然后将珠沉淀置于收集柱中，将所述收集柱插入含有10ul 1M Tris-HCl pH 8的eppendorf管中。将90µl洗脱缓冲液(Thermo-Scientific)加入珠中，并且在温育5分钟后，通过离心机执行洗脱。将最后一步重复四次。

用于鉴定来自Fc-LPD的I.P的凝胶条带的质谱法

样品用5% SDS进行洗脱，并且经受使用S-trap的胰蛋白酶消化。使用与高分辨率、高质量准确度质谱法(Q Exactive HFX)偶联的纳流液相层析(nanoAcquity)，来分析所得到的肽。每个样品用MaxQuant v1.6.0.16进行处理。用Andromeda搜索引擎针对人蛋白质组数据库搜索数据，所述数据库附有常见的实验室蛋白质污染物和下述修饰：C的脲甲基化作为固定修饰，以及M的氧化和蛋白质N末端乙酰化作为可变修饰。使用Perseus v1.6.07计算LFQ强度(无标记定量)并用于进一步计算。过滤掉诱饵命中，以及仅基于修饰肽鉴定的蛋白质。LFQ强度进行对数转换，并且仅保留在至少一个实验组中具有至少2个有效值的蛋白质。添加了GO注释。

结果

Fc-LPD具有三个糖基化位点，为了调查糖基化的重要性，产生了新构建体Fc-LPD-N346、362、409Q。这两种蛋白质包括Fc (作为对照)用于阐明LPD与HDF细胞的上清液中的ECM蛋白质的相互作用，如实施例3中。为此，将HDF细胞在60 cm²皿中的10 ml无血清和无酚红培养基中培养3天。收集培养基并且使用10 kDa截断vivaspin过滤器浓缩，并且与Fc，Fc-LPD和Fc-LPD-N346、362、409Q (其在磁性蛋白G珠中预温育)一起温育。通过质谱法分析免疫沉淀洗脱，并且MS数据的分析显示了两种Fc-LPD形式与ECM分子的相互作用，所述ECM分子或是核心基质组的部分、或与基质组关联。具体而言，在免疫共沉淀蛋白中有ECM糖蛋白(巢蛋白-1)、分泌因子(丝聚蛋白-2、角蛋白)、细胞外区域或分泌蛋白(HSP70、HSP90、HSP60)。值得一提的是，Fc-LPD和Fc-LPD-N346、362、409Q之间的定量比率在不同的蛋白质中是有区别的。例如，与糖基化Fc-LPD与Fc的比率相比，非糖基化形式与Fc对照之间的比率对于巢蛋白-1和HSP70显著更高。(下表2)：

尽管本发明已与其具体实施方案结合进行描述，但很明显，许多替代、修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。相应地，预期涵盖落入所附权利要求的精神和广泛范围内的所有此类替代、修改和变化。

本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都在本文中整体引入说明书内作为参考，其程度与每个个别出版物、专利或专利申请具体地且个别地指示引入本文作为参考相同。另外，在本申请中的任何参考文献的引用或鉴定，不应解释为承认此类参考文献可用作本发明的现有技术。就使用节段标题而言，它们不应被解释为必然的限制。另外，本申请的任何优先权文件通过引用以其整体并入本文。

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(本申请中引用了其它参考文献)

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Claims (32)

1.一种包含人赖氨酰氧化酶(LOX)的前肽的合成多肽，所述多肽缺乏LOX催化活性，所述合成多肽包含修饰，与不包含所述修饰的所述多肽的天然形式相比，所述修饰赋予所述多肽在生理条件下增强的稳定性。

2.权利要求1的多肽，其中所述修饰包含蛋白质修饰。

3.权利要求2的多肽，其中所述蛋白质修饰选自免疫球蛋白、人血清白蛋白和转铁蛋白。

4.权利要求3的多肽，其中所述免疫球蛋白包含Fc结构域。

5.权利要求2、3或4的多肽，其是嵌合多肽。

6.权利要求1的多肽，其中所述修饰包含化学修饰。

7.权利要求6的多肽，其中所述化学修饰是聚合物。

8.权利要求7的多肽，其中所述聚合物选自聚阳离子聚合物、非离子水溶性聚合物、聚醚聚合物和生物相容性聚合物。

9.一种包含赖氨酰氧化酶(LOX)的前肽的多肽，所述多肽缺乏LOX催化活性，其用于治疗有需要的受试者中的纤维化，其中所述应用不包含D-青霉胺的施用。

10.一种包含赖氨酰氧化酶(LOX)的前肽的多肽，所述多肽缺乏LOX催化活性，其用于治疗有需要的受试者中的DMD。

11. 权利要求1-10中任一项的多肽，其中所述多肽在SEQ ID NO: 1的N81、N97和N144中的至少一个上被糖基化。

12. 权利要求1-10中任一项的多肽或应用的多肽，其中所述多肽在SEQ ID NO: 1的N81、N97和N144中的至少两个上被糖基化。

13. 权利要求1-10中任一项的多肽或应用的多肽，其中所述多肽在SEQ ID NO: 1的N81、N97和N144上被糖基化。

14. 权利要求1-10中任一项的多肽或应用的多肽，其中所述多肽在SEQ ID NO: 1的N81、N97和N144上未被糖基化。

15. 权利要求1-13中任一项的多肽或应用的多肽，其中所述多肽的特征在于100-500nM的EC50，如通过ELISA测定法确定的。

16. 权利要求1-15中任一项的多肽或应用的多肽，其中所述多肽的特征在于10-100nM的KD，如通过微量热泳动确定的。

17. 权利要求1-16中任一项的多肽或应用的多肽，其中所述多肽的特征在于20 – 70℃的转变中点，如通过差示扫描荧光法(DSF)确定的。

18.权利要求1-17中任一项的多肽或应用的多肽，其中所述多肽能够减少纤维胶原和交联胶原中的至少一种，如通过SHG显微术确定的。

19.权利要求1-18中任一项的多肽或应用的多肽，其中所述多肽能够改变胶原纤维取向，如通过SHG显微术确定的。

20.权利要求9-19中任一项应用的多肽，其中所述纤维化不是Ras信号传导依赖性的。

21.权利要求20应用的多肽，其中所述纤维化与癌症或骨病无关。

22.权利要求9-21中任一项应用的多肽，其中所述赖氨酰氧化酶(LOX)的前肽是人LOX的前肽。

23.权利要求9-22中任一项应用的多肽，其中所述多肽是权利要求1-8和11-19中任一项的多肽。

24.权利要求9-23中任一项应用的多肽，其中所述应用不包含D-青霉胺。

25.一种抑制LOX的酶促活性的方法，所述方法包括使LOX与权利要求1-8和11-19中任一项的多肽接触，从而抑制LOX的酶促活性。

26.权利要求25的方法，其在体内执行。

27.权利要求25的方法，其在体外执行。

28.权利要求25的方法，其离体执行。

29.一种产生权利要求1-8、11-19中任一项的多肽的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达编码所述多肽的多核苷酸，并且在必要时用所述化学修饰来修饰多肽，从而产生所述多肽。

30.权利要求29的方法，其进一步包括从宿主细胞中分离所述多肽。

31. 权利要求1-28中任一项的多肽或方法，其中所述多肽如SEQ ID NO: 1或5中所示。

32.一种多核苷酸，其编码权利要求1-8和11-19中任一项的多肽。

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