JP2022530776A - リジルオキシダーゼのペプチドを含む組成物及びその使用 - Google Patents

Abstract

線維症の処置を必要とする被験体における線維症の処置方法を提供する。該方法は、リジルオキシダーゼ（ＬＯＸ）のプロペプチドを含むポリペプチドであって、該ポリペプチドはＬＯＸ触媒活性を欠き、該ポリペプチドを被験体に投与することで被験体において線維症を処置することを含む方法であって、該方法はＤ－ペニシラミンの投与を含まない。処置に使用されるポリペプチド組成物も提供される。【選択図】なし

Description

関連出願

本出願は、２０２０年２月１８日に出願された米国特許出願第６２／９７７，７９２号及び２０１９年５月２日に出願されたイスラエル特許出願第２６６４３３号の優先権の利益を主張し、これらの各々は、その全体が参照により組み込まれる。

配列表の記載

本出願の出願と同時に提出された、２８，１０６バイトを含む、２０２０年４月３０日に作成された８２３１０ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという表題のＡＳＣＩＩファイルは、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、そのいくつかの実施形態において、リジルオキシダーゼ（ＬＯＸ）のプロペプチドを含む組成物及びその使用に関する。

ＤＭＤは、ｘ連鎖ジストロフィン遺伝子の変異によって引き起こされる筋ジストロフィーのファミリーの最も一般的で重度の小児期の形態である。その結果、ＥＣＭへの筋線維の固定が失われ、繰り返される筋収縮が筋線維の機械的破壊をもたらす。ＤＭＤは、骨格筋及び心筋の進行性の衰弱及び喪失（萎縮）を引き起こす［１］。ＤＭＤの初期の徴候には、座る、立つ、又は歩く能力の遅延、及び発話の学習困難が含まれ得る。筋力低下は、通常、３歳又は４歳までに顕著であり、臀部、骨盤領域、下腿及び肩に始まる。損傷した線維は、サテライト細胞（ＳＣ）の活性化及び筋再生を誘導する［２］。ＧＩ管を整列させる平滑筋等の平滑筋も疾患に著しく影響され、患者は腸不全麻痺に罹患することが多い［３］。

「筋肉再生プログラム」は、多段階プロセスである。最初に、一過性の炎症反応が起こり、その間、成長因子及びサイトカインが損傷領域に放出されて、筋肉残屑を処分し、ＥＣＭを敷設するマクロファージ及び線維芽細胞の増殖及び動員を可能にする。筋線維の形成は、ＳＣの活性化から始まり、その後、増殖、分化及び新規又は存在する筋細胞への融合が続く［２、４］。組織創傷治癒及び線維症の強力な調節因子であるＴＧＦβ１は、損傷後の骨格筋においてアップレギュレートされ、おそらく一過性炎症応答に関与する。しかしながら、ＤＭＤ等のジストロフィー疾患では、絶えず続く筋損傷の結果として、持続的な炎症反応が起こる。炎症細胞によって産生される高レベルの炎症促進性サイトカイン、成長因子、一酸化窒素及びＴＧＦβは、ＳＣと線維芽細胞との間の均衡に影響を及ぼす負荷の多い環境を作り出す［５］。その結果、結合組織（ＥＣＭ及び線維芽細胞）と筋組織の間の均衡に変化が生じる。コラーゲン及びフィブリノーゲン等のＥＣＭの過剰な成分は、高度に線維性の組織を形成する筋肉を犠牲にして沈着する［５］。注目すべきことに、そのようなＥＣＭ調節不全プロセスは、ジストロフィンの欠如のみによって直接引き起こされるのではなく、筋線維及びＳＣとＥＣＭとの複雑な相互作用にも起因するＤＭＤの病理学的特徴の多くをもたらす。したがって、線維性筋肉は、筋肉の修復及び再生を遅延させ、炎症を増強し、疾患の進行を悪化させる。全体として、再生能力及び線維症の喪失は、筋肉機能不全と並んでＤＭＤ及び他の関連する筋ジストロフィーの致死的な表現型の主な原因である［６］。

遺伝子編集及び細胞移植が、ＤＭＤを処置するための新規アプローチとして示唆されている。しかしながら、これらの有望なアプローチは、壊死の波が筋線維の喪失、脂肪及び線維症による組織の置換をもたらす前の幼い時期の介入に依存するか、又は線維化反応に取り組む集学的治療に依存する［７、８］。さらに、平衡の問題及び嘔吐等の主な副作用が、これらの処置様式に関連する。これらのアプローチはジストロフィン産生を増加させ、筋機能の改善を予測するであろうが、これはまだ示されていない。したがって、物理的組織損傷に関連する遺伝子の同定、並びに望ましくないＥＣＭリモデリングに対処するための処置の開発は、ＤＭＤにおける満たされていない必要性を概説する。

ＤＭＤの致死表現型の根底にある遺伝子を同定する試みにおいて、多数のヒトＤＭＤ患者及びｍｄｘマウスに由来する大規模遺伝子発現分析を行った。マウスモデル系及びヒト患者において有意にアップレギュレート又はダウンレギュレートされる遺伝子は、ＤＭＤコア遺伝子とみなされる。これらの分析において、ＤＭＤで高度に過剰発現されると特定された遺伝子の１つはＬＯＸである。その発現上昇は、ＤＭＤのイヌモデルであるゴールデンレトリバー筋ジストロフィー（ＧＲＭＤ）においても、ウエスタンブロット及び免疫組織化学分析を用いて更に確認された［９、１０］。

ＬＯＸは、コラーゲン及びエラスチン分子の共有結合性架橋を開始する細胞外酵素として主に同定された。ＬＯＸは、これらの翻訳後修飾を開始するそのファミリーの最も豊富なファミリーメンバーである［ＬＯＸ、ＬＯＸ様（ＬＯＸＬ）１～４］。その活性は、骨格系、肺系及び心血管系における結合組織の引張特性及び弾性特性を維持するために重要である［１１～１４］。ＬＯＸは、５０ｋＤａの不活性なプロ酵素として合成されて分泌され、これは、ＢＭＰ－１による１８ｋＤａのプロドメインの機能的な３２ｋＤａ酵素（ＬＯＸ）へのタンパク質分解的切断によってプロセシングされる。したがって、Ｌｏｘ変異マウス（Ｌｏｘ^－／－）は、マトリクス組織化欠陥によって引き起こされる大動脈瘤及び横隔膜の破裂に起因して出生時に死亡する［１５－１７］［１８］。最近の研究では、ＬＯＸ活性が、線維症、神経変性及び癌を含めて、いくつかのヒト病理に直接的に関連づけられている（例えば、［１２、１３、１１］）。証拠の蓄積は、それらの古典的な細胞外活性とは別に、ＬＯＸファミリーのメンバーが細胞質及び核内の細胞内にも見出されることを示唆している（例えば、［１９～２１］）。これらの細胞内ＬＯＸ活性は、細胞運動性及び遊走の調節、遺伝子転写、並びに分化に関連している［１２、２２～２６］。まとめると、結果は、ＬＯＸが細胞内及びＥＣＭの両方において複数の独立した役割を果たすことを実証している。最近、Ｌｏｘ変異マウスは重度の骨格筋欠損を示すことが示された［２７］。これらのマウスでは、筋線維の量は有意に減少するが、ＥＣＭ及び線維芽細胞の過剰な沈着を示す。さらに、これらのＬｏｘ－筋肉関連表現型は、ＴＧＦβシグナル伝達の阻害により救済され、したがって、Ｌｏｘ－ＴＧＦβフィードバックループが、筋肉の量と結合組織の量との間の均衡を調節することを実証している。

更なる背景技術として、以下を挙げる：
非特許文献１、
非特許文献２、
非特許文献３、
特許文献１、
特許文献２。

米国特許出願公開第２００８０２６１８７０号 米国特許出願公開第２０１７０３６０７３２号

Ｔｈｏｍａｓｓｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００５ Ｄｅｃ ３０；２８０（５２）：４２８４８－５５．Ｅｐｕｂ ２００５ Ｏｃｔ ２６． Ｇｒｉｍｓｂｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｕｔｈｏｒ ｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ；ａｖａｉｌａｂｌｅ ｉｎ ＰＭＣ ２０１３ Ｄｅｃ １１． Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００９ Ｊａｎ １６；２８４（３）：１３８５－１３９３．

本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、ヒトリジルオキシダーゼ（ＬＯＸ）のプロペプチドを含む合成ポリペプチドであって、ＬＯＸ触媒活性を欠き、該ポリペプチドに、生理学的条件下で、修飾を含まない上記ポリペプチドの天然型と比較して強化された安定性を付与する修飾を含む、合成ポリペプチドが提供される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記修飾は、タンパク質性修飾を含む。

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記タンパク質性修飾は、免疫グロブリン、ヒト血清アルブミン及びトランスフェリンからなる群から選択される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記免疫グロブリンはＦｃドメインを含む。

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ポリペプチドはキメラポリペプチドである。

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記修飾は化学修飾を含む。

本発明のいくつかの実施形態によれば、化学修飾はポリマーである。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ポリマーは、ポリカチオン性ポリマー、非イオン性水溶性ポリマー、ポリエーテルポリマー及び生体適合性ポリマーからなる群から選択される。

本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、線維症の処置を必要とする被験体において線維症を処置する方法であって、リジルオキシダーゼ（ＬＯＸ）のプロペプチドを含むポリペプチドであって、ＬＯＸ触媒活性を欠くポリペプチドを該被験体に投与し、それにより該被験体において線維症を処置することを含み、Ｄ－ペニシラミンの投与を含まない、方法が提供される。

本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の処置を必要とする被験体においてＤＭＤを処置する方法であって、リジルオキシダーゼ（ＬＯＸ）のプロペプチドを含むポリペプチドであって、ＬＯＸ触媒活性を欠くポリペプチドを該被験体に投与し、それにより該被験体においてＤＭＤを処置することを含む方法が提供される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ポリペプチドは、配列番号１のＮ８１、Ｎ９７及びＮ１４４のうち少なくとも１つにおいてグリコシル化される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ポリペプチドは、配列番号１のＮ８１、Ｎ９７及びＮ１４４のうち少なくとも２つにおいてグリコシル化される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ポリペプチドは、配列番号１のＮ８１、Ｎ９７及びＮ１４４においてグリコシル化される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ポリペプチドは、配列番号１のＮ８１、Ｎ９７及びＮ１４４においてグリコシル化されていない。

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ポリペプチドは、ＥＬＩＳＡアッセイによって決定される場合、１０～５００ｎＭのＥＣ５０を特徴とする。

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ポリペプチドは、マイクロスケール熱泳動によって決定される場合、１０～１００ｎＭのＫＤを特徴とする。

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ポリペプチドは、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）によって決定される場合、２０～７０℃の遷移中点を特徴とする。

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ポリペプチドは、ＳＨＧ顕微鏡法によって判断される場合、線維性コラーゲン及び架橋コラーゲンのうち少なくとも１つを減少させることができる。

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ポリペプチドは、ＳＨＧ顕微鏡法によって判断される場合、コラーゲン線維の配向を変化させることができる。

本発明のいくつかの実施形態によれば、線維症は、Ｒａｓシグナル伝達依存性ではない。
本発明のいくつかの実施形態によれば、線維症は、癌又は骨疾患に関連しない。

本発明のいくつかの実施形態によれば、リジルオキシダーゼ（ＬＯＸ）のプロペプチドはヒトＬＯＸのものである。

本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、ＬＯＸの酵素活性を阻害する方法であって、ＬＯＸを本明細書中に記載されるポリペプチドと接触させ、それによりＬＯＸの酵素活性を阻害することを含む方法が提供される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はｉｎ－ｖｉｖｏで行われる。

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はｉｎ－ｖｉｔｒｏで行われる。

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はｅｘ－ｖｉｖｏで行われる。

本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、本明細書中に記載されるポリペプチドを製造する方法であって、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞において発現させること、及び必要に応じて化学修飾により該ポリペプチドを修飾し、それにより、該ポリペプチドを製造することを含む方法が提供される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法は更に、上記ポリペプチドを宿主細胞から単離することを含む。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ポリペプチドは、配列番号１又は５に示される通りである。

本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、本明細書中に記載されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。

特定の実施形態によれば、使用はＤ－ペニシラミンを含まない。

別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び／又は科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと同様又は同等の方法及び材料を本発明の実施形態の実施又は試験に使用することができるが、例示的な方法及び／又は材料を以下に説明する。矛盾する場合は、定義を含む特許明細書が優先される。更に、材料、方法、及び例は例示にすぎず、必ずしも限定することを意図するものではない。
多角的な視点からの図面の簡単な説明

添付の図面を参照して、本発明のいくつかの実施形態を例としてのみ本明細書に記載する。ここで詳細に図面を具体的に参照すると、示される詳細は、例として、本発明の実施形態の例示的な議論を目的とすることが強調される。これに関して、図面と共に考慮される説明によれば、本発明の実施形態がどのように実施され得るかは当業者に明らかとなろう。

融合タンパク質Ｆｃ－ＬＰＤの設計及び生化学的特性を示す。抗体様ＬＯＸ阻害剤Ｆｃ－ＬＰＤの設計及び作製。 融合タンパク質Ｆｃ－ＬＰＤの設計及び生化学的特性を示す。抗体様ＬＯＸ阻害剤Ｆｃ－ＬＰＤの設計及び作製。 融合タンパク質Ｆｃ－ＬＰＤの設計及び生化学的特性を示す。ＬＯＸ触媒ドメインに対するＦｃ－ＬＰＤ及びＦｃ－ＬＰＤ Ｎ３４６、３６２、４０９Ｑの結合親和性、ＥＣ_５０。 融合タンパク質Ｆｃ－ＬＰＤの設計及び生化学的特性を示す。その折り畳み状態の尺度としてＦｃ－ＬＰＤの内在蛍光シグナルをモニタリングするＦｃ－ＬＰＤの遷移中点Ｋ_Ｄの測定。 融合タンパク質Ｆｃ－ＬＰＤの設計及び生化学的特性を示す。その折り畳み状態の尺度としてＦｃ－ＬＰＤの内在蛍光シグナルをモニタリングするＦｃ－ＬＰＤの遷移中点Ｋ_Ｄの測定。 融合タンパク質Ｆｃ－ＬＰＤの設計及び生化学的特性を示す。Ｆｃ－ＬＰＤの蛍光シグナルのレシオメトリック測定値を、化学変性剤の温度上昇に対してプロットして、タンパク質のＴ_ｍを決定する。 融合タンパク質Ｆｃ－ＬＰＤの設計及び生化学的特性を示す。Ｆｃ－ＬＰＤの蛍光シグナルのレシオメトリック測定値を、化学変性剤の温度上昇に対してプロットして、タンパク質のＴ_ｍを決定する。 ＳＨＧ顕微鏡法によって決定されるＥＣＭ集合の妨害を示す。ＨＧ顕微鏡法を使用して、ＨＤＦ細胞によって分泌されたコラーゲン集合の種々の段階をモニタリングするための実験設定を例示するスキーム。 ＳＨＧ顕微鏡法によって決定されるＥＣＭ集合の妨害を示す。ＥＣＭアライメントを妨害するＦｃ－ＬＰＤの代表的なＳＨＧ画像。特定の配向の線維の頻度を示す各ＳＨＧ画像に対する代表的な線維方向性分析。 ＳＨＧ顕微鏡法によって決定されるＥＣＭ集合の妨害を示す。ＥＣＭアラインメントを妨害するＦｃ－ＬＰＤ＆Ｆｃ－ＬＰＤ Ｎ３４６、３６２、４０９Ｑの代表的なＳＨＧ画像をＦｃと比較する。ＥＣＭグラフの平均エントロピー及び厚さ。 ＳＨＧ顕微鏡法によって決定されるＥＣＭ集合の妨害を示す。ＥＣＭグラフの平均エントロピー及び厚さ。 ＳＨＧ顕微鏡法によって決定されるＥＣＭ集合の妨害を示す。 異なるＦｃ－ＬＰＤグリコシル化形態とＨＤＦ細胞から放出されたＥＣＭタンパク質との相互作用を示す。４５ｋＤａ Ｆｃ－ＬＰＤ及び６０ｋＤａ Ｆｃ－ＬＰＤの半分離。 異なるＦｃ－ＬＰＤグリコシル化形態とＨＤＦ細胞から放出されたＥＣＭタンパク質との相互作用を示す。４５ｋＤａ Ｆｃ－ＬＰＤ及び６０ｋＤａ Ｆｃ－ＬＰＤの免疫沈降。 異なるＦｃ－ＬＰＤグリコシル化形態とＨＤＦ細胞から放出されたＥＣＭタンパク質との相互作用を示す。免疫沈降（Ｉ．Ｐ）後のＬＯＸ触媒ドメインとＦｃ－ＬＰＤとの相互作用。 異なるＦｃ－ＬＰＤグリコシル化形態とＨＤＦ細胞から放出されたＥＣＭタンパク質との相互作用を示す。ＨＳＰ７０に対するＦｃ－ＬＰＤ及びＦｃ－ＬＰＤ Ｎ３４６、３６２、４０９Ｑの結合親和性、ＥＣ_５０。 異なるＦｃ－ＬＰＤグリコシル化形態とＨＤＦ細胞から放出されたＥＣＭタンパク質との相互作用を示す。酵母表面ディスプレイを使用することによるＬＰＤへのＨＳＰ７０の結合。 Ｆｃ－ＬＰＤ及びＦｃ－ＬＰＤ Ｎ３４６、３６２、４０９Ｑによる処置後のＤＭＤ横隔膜及び腓腹筋の線維症の初期段階のｉｎ ｖｉｖｏ評価を示す。実験の概略図である。 Ｆｃ－ＬＰＤ及びＦｃ－ＬＰＤ Ｎ３４６、３６２、４０９Ｑによる処置後のＤＭＤ横隔膜及び腓腹筋の線維症の初期段階のｉｎ ｖｉｖｏ評価を示す。ロータロッド走行アッセイの結果を示す。 Ｆｃ－ＬＰＤ及びＦｃ－ＬＰＤ Ｎ３４６、３６２、４０９Ｑによる処置後のＤＭＤ横隔膜及び腓腹筋の線維症の初期段階のｉｎ ｖｉｖｏ評価を示す。マウス横隔膜のＨ＆Ｅ及びシリウスレッドを示す。 Ｆｃ－ＬＰＤ及びＦｃ－ＬＰＤ Ｎ３４６、３６２、４０９Ｑによる処置後のＤＭＤ横隔膜及び腓腹筋の線維症の初期段階のｉｎ ｖｉｖｏ評価を示す。 Ｆｃ－ＬＰＤ及びＦｃ－ＬＰＤ Ｎ３４６、３６２、４０９Ｑによる処置後のＤＭＤ横隔膜及び腓腹筋の線維症の初期段階のｉｎ ｖｉｖｏ評価を示す。マウス横隔膜のシリウスレッドの定量化。 Ｆｃ－ＬＰＤ及びＦｃ－ＬＰＤ Ｎ３４６、３６２、４０９Ｑによる処置後のＤＭＤ横隔膜及び腓腹筋の線維症の初期段階のｉｎ ｖｉｖｏ評価を示す。マウス腓腹筋のＨ＆Ｅ及びシリウスレッドを示す。 Ｆｃ－ＬＰＤ及びＦｃ－ＬＰＤ Ｎ３４６、３６２、４０９Ｑによる処置後のＤＭＤ横隔膜及び腓腹筋の線維症の初期段階のｉｎ ｖｉｖｏ評価を示す。マウス腓腹筋のＨ＆Ｅ及びシリウスレッドを示す。 Ｆｃ－ＬＰＤ及びＦｃ－ＬＰＤ Ｎ３４６、３６２、４０９Ｑによる処置後のＤＭＤ横隔膜及び腓腹筋の線維症の初期段階のｉｎ ｖｉｖｏ評価を示す。マウス腓腹筋のシリウスレッドの定量化。 Ｆｃ－ＬＰＤ及びＦｃ－ＬＰＤ Ｎ３４６、３６２、４０９Ｑによる処置後のＤＭＤ四頭筋及び前脛骨筋の線維症の初期段階のｉｎ ｖｉｖｏ評価を示す。Ｆｃ、Ｆｃ－ＬＰＤ及びＦｃ－ＬＰＤ Ｎ３４６、３６２、４０９Ｑ処置後のＤＭＤマウスの四頭筋におけるＨ＆Ｅ及びシリウスレッドの代表的画像を示す。 Ｆｃ－ＬＰＤ及びＦｃ－ＬＰＤ Ｎ３４６、３６２、４０９Ｑによる処置後のＤＭＤ四頭筋及び前脛骨筋の線維症の初期段階のｉｎ ｖｉｖｏ評価を示す。Ｆｃ、Ｆｃ－ＬＰＤ及びＦｃ－ＬＰＤ Ｎ３４６、３６２、４０９Ｑ処置後のＤＭＤマウスの四頭筋におけるＨ＆Ｅ及びシリウスレッドの代表的画像を示す。 Ｆｃ－ＬＰＤ及びＦｃ－ＬＰＤ Ｎ３４６、３６２、４０９Ｑによる処置後のＤＭＤ四頭筋及び前脛骨筋の線維症の初期段階のｉｎ ｖｉｖｏ評価を示す。マウス四頭筋のシリウスレッドの定量化。 Ｆｃ－ＬＰＤ及びＦｃ－ＬＰＤ Ｎ３４６、３６２、４０９Ｑによる処置後のＤＭＤ四頭筋及び前脛骨筋の線維症の初期段階のｉｎ ｖｉｖｏ評価を示す。それぞれマウス四頭筋組織及び四頭筋内膜からの２光子ＳＨＧの代表的画像を示す。 Ｆｃ－ＬＰＤ及びＦｃ－ＬＰＤ Ｎ３４６、３６２、４０９Ｑによる処置後のＤＭＤ四頭筋及び前脛骨筋の線維症の初期段階のｉｎ ｖｉｖｏ評価を示す。それぞれマウス四頭筋組織及び四頭筋内膜からの２光子ＳＨＧの代表的画像を示す。マウス四頭筋の２光子ＳＨＧ画像の定量化。 Ｆｃ－ＬＰＤ及びＦｃ－ＬＰＤ Ｎ３４６、３６２、４０９Ｑによる処置後のＤＭＤ四頭筋及び前脛骨筋の線維症の初期段階のｉｎ ｖｉｖｏ評価を示す。それぞれマウス四頭筋組織及び四頭筋内膜からの２光子ＳＨＧの代表的画像を示す。 Ｆｃ－ＬＰＤ及びＦｃ－ＬＰＤ Ｎ３４６、３６２、４０９Ｑによる処置後のＤＭＤ四頭筋及び前脛骨筋の線維症の初期段階のｉｎ ｖｉｖｏ評価を示す。マウス四頭筋の２光子ＳＨＧ画像の定量化。 Ｆｃ－ＬＰＤ及びＦｃ－ＬＰＤ Ｎ３４６、３６２、４０９Ｑによる処置後のＤＭＤ四頭筋及び前脛骨筋の線維症の初期段階のｉｎ ｖｉｖｏ評価を示す。マウス前脛骨筋の２光子ＳＨＧの代表的画像、及びマウス前脛骨筋の２光子ＳＨＧ画像の定量化を示す。 Ｆｃ－ＬＰＤ及びＦｃ－ＬＰＤ Ｎ３４６、３６２、４０９Ｑによる処置後のＤＭＤ四頭筋及び前脛骨筋の線維症の初期段階のｉｎ ｖｉｖｏ評価を示す。マウス前脛骨筋の２光子ＳＨＧの代表的画像、及びマウス前脛骨筋の２光子ＳＨＧ画像の定量化を示す。 Ｆｃ－ＬＰＤによる処置後のＤＭＤ筋線維症のｉｎ ｖｉｖｏ評価を示す。実験の概略図。 Ｆｃ－ＬＰＤによる処置後のＤＭＤ筋線維症のｉｎ ｖｉｖｏ評価を示す。ロータロッド走行グアッセイの結果を示す。 Ｆｃ－ＬＰＤによる処置後のＤＭＤ筋線維症のｉｎ ｖｉｖｏ評価を示す。ぶら下がり試験アッセイの結果を示す。 Ｆｃ－ＬＰＤによる処置後のＤＭＤ筋線維症のｉｎ ｖｉｖｏ評価を示す。マウス前脛骨筋からのＨ＆Ｅ、シリウスレッド及びＳＨＧの代表的画像を示す。 Ｆｃ－ＬＰＤによる処置後のＤＭＤ筋線維症のｉｎ ｖｉｖｏ評価を示す。マウス前脛骨筋（ＴＡ）からの面積当たりのシリウスレッド及び線維の定量化。 Ｆｃ－ＬＰＤによる処置後のＤＭＤ筋線維症のｉｎ ｖｉｖｏ評価を示す。マウス前脛骨筋（ＴＡ）からの面積当たりのシリウスレッド及び線維の定量化。 Ｆｃ－ＬＰＤによる処置後のＤＭＤ筋線維症のｉｎ ｖｉｖｏ評価を示す。前脛骨筋組織の半定性的組織学的評価分析を示す。 Ｆｃ－ＬＰＤによる処置後のＤＭＤ筋線維症のｉｎ ｖｉｖｏ評価を示す。マウスＴＡからの各ＳＨＧ画像に対する代表的な線維方向性分析を示す。 横隔膜及び心臓におけるＦｃ－ＬＰＤによる処置後のＤＭＤ筋線維症のｉｎ ｖｉｖｏ評価を示す。Ｆｃ及びＦｃ－ＬＰＤ処置後のＤＭＤマウスの横隔膜及び心臓におけるＨ＆Ｅ及びシリウスレッドの代表的画像を示す。 横隔膜及び心臓におけるＦｃ－ＬＰＤによる処置後のＤＭＤ筋線維症のｉｎ ｖｉｖｏ評価を示す。横隔膜組織の半定性的な組織学的評価を示す。 横隔膜及び心臓におけるＦｃ－ＬＰＤによる処置後のＤＭＤ筋線維症のｉｎ ｖｉｖｏ評価を示す。横隔膜及び心臓のシリウスレッド染色の定量化を示す。 横隔膜及び心臓におけるＦｃ－ＬＰＤによる処置後のＤＭＤ筋線維症のｉｎ ｖｉｖｏ評価を示す。Ｆｃ及びＦｃ－ＬＰＤ処置後のＤＭＤマウスの横隔膜及び心臓におけるＨ＆Ｅ及びシリウスレッドの代表的画像を示す。 横隔膜及び心臓におけるＦｃ－ＬＰＤによる処置後のＤＭＤ筋線維症のｉｎ ｖｉｖｏ評価を示す。横隔膜及び心臓のシリウスレッド染色の定量化を示す。

本発明は、そのいくつかの実施形態において、リジルオキシダーゼ（ＬＯＸ）のプロペプチドを含む組成物及びその使用に関する。

本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、以下の説明に記載されるか、又は実施例によって例示される詳細に必ずしも限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であるか、又は様々な方法で実施又は実行され得る。

本発明の実施形態は、内因性ＬＯＸの細胞外レベルのレベルを活用するタンパク質阻害剤の開発に関する。タンパク質工学を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでＬＯＸを特異的に阻害するＦｃ抗体断片（Ｆｃ－ＬＰＤ）に融合した安定な形態のリジルオキシダーゼプロドメインを生成した。Ｆｃ－ＬＰＤ親和性及び安定性の測定をＬＯＸに対して行い、結合親和性（ＥＣ_５０＝４３ｎＭ）及び解離定数（Ｋｄ＝３２ｎＭ）を決定した。ｍｄｘマウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ研究は、ロータロッド走行及びぶら下がり試験等の機能試験の改善、並びに線維症蓄積の阻害及び正常なコラーゲン組織化の促進を示した。本結果は、Ｆｃ－ＬＰＤによるＬＯＸの阻害が非常に特異的であり、ＤＭＤの線維症及び副作用を効率的に最小化することを実証する。

したがって、本発明の態様によれば、線維症の処置を必要とする被験体において線維症を処置する方法であって、リジルオキシダーゼ（ＬＯＸ）のプロペプチドを含むポリペプチドであって、ＬＯＸ触媒活性を欠くポリペプチドを該被験体に投与し、それにより該被験体において線維症を処置することを含み、Ｄ－ペニシラミンの投与を含まない、方法が提供される。

別の態様によれば、線維症の処置を必要とする被験体における線維症の処置に使用されるリジルオキシダーゼ（ＬＯＸ）のプロペプチドを含むポリペプチドであって、該ポリペプチドがＬＯＸ触媒活性を欠き、該使用がＤ－ペニシラミンの投与を含まない、ポリペプチドが提供される。

本発明の別の態様によれば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の処置を必要とする被験体においてＤＭＤを処置する方法であって、リジルオキシダーゼ（ＬＯＸ）のプロペプチドを含むポリペプチドであって、ＬＯＸ触媒活性を欠くポリペプチドを該被験体に投与し、それにより該被験体においてＤＭＤを処置することを含む方法が提供される。

本明細書で使用される場合、「線維症」は、外傷、炎症、組織修復、免疫学的反応、細胞過形成、及び新生物の後に起こる細胞外マトリクス成分の蓄積を指す。組織線維症の例としては、肺線維症、腎線維症、心線維症、肝硬変及び肝臓の線維症、皮膚瘢痕及びケロイド、癒着、線維腫症、アテローム性動脈硬化症及びアミロイドーシスが挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、線維性状態は原発性線維症である。いくつかの実施形態では、線維性状態は特発性である。いくつかの実施形態では、線維性状態は、疾患（例えば、感染性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、悪性若しくは癌性疾患、及び／又は結合性疾患）；毒素；傷害（例えば、環境上の危険（例えば、アスベスト、石炭粉、多環芳香族炭化水素）、喫煙、創傷）；医療処置（例えば、外科的切開、化学療法又は放射線）、又はそれらの組合せに関連する（例えば、それに続発する）。

いくつかの実施形態では、線維性状態は、肺の線維性状態、肝臓の線維性状態、心臓又は血管系の線維性状態、腎臓の線維性状態、皮膚の線維性状態、消化管の線維性状態、骨髄又は造血組織の線維性状態、神経系の線維性状態、又はそれらの組合せである。いくつかの実施形態では、線維性状態は、筋肉、腱、軟骨、皮膚（例えば、皮膚表皮又は内皮）、心臓組織、血管組織（例えば、動脈、静脈）、膵臓組織、肺組織、肝臓組織、腎臓組織、子宮組織、卵巣組織、神経組織、精巣組織、腹膜組織、結腸、小腸、胆道、腸、骨髄、又は造血組織の１つ以上から選択される組織に影響を及ぼす。

いくつかの実施形態では、線維性状態は肺の線維性状態である。いくつかの実施形態では、肺の線維性状態は、肺線維症、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、通常間質性肺炎（ＵＩＰ）、間質性肺疾患、原因不明の線維化性胞隔炎（ＣＦＡ）、閉塞性細気管支炎、又は気管支拡張症の１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、肺の線維症は、疾患、毒素、傷害、医学的処置、又はそれらの組合せに続いて起こる。いくつかの実施形態では、肺の線維症は、石綿肺及び珪肺等の疾患プロセス；職業上の危険；環境汚染物質；喫煙；自己免疫性結合組織障害（例えば、関節リウマチ、強皮症及び全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ））；サルコイドーシス等の結合組織障害；感染症等の感染性疾患、特に慢性感染症；放射線療法及び薬物療法、例えば化学療法（例えば、ブレオマイシン、メトトレキサート、アミオダロン、ブスルファン及び／又はニトロフラントインによる処置）を含むがこれらに限定されない医学的処置の１つ以上に関連する。いくつかの実施形態では、本発明の方法で治療される肺の線維性状態は、癌処置、例えば癌（例えば、扁平上皮癌、精巣癌、ブレオマイシンによるホジキン病）の処置に関連する（例えば、それらの処置に続発する）。いくつかの実施形態では、線維性状態は肝臓の線維性状態である。特定の実施形態では、肝臓の線維性状態は、脂肪肝疾患、脂肪肝（例えば、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、胆汁うっ滞性肝疾患（例えば、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、肝硬変、アルコール誘発性肝線維症、胆管損傷、胆管線維症、胆汁うっ滞又は胆管症の１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、肝線維症又は肝線維症としては、アルコール依存症、ウイルス感染症、例えば肝炎（例えば、Ｃ型、Ｂ型又はＤ型肝炎）、自己免疫性肝炎、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、進行性塊状線維症、毒素又は刺激物への曝露（例えば、アルコール、医薬品及び環境毒素）に関連する肝線維症が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、線維性状態は心臓の線維性状態である。特定の実施形態では、心臓の線維性状態は心筋線維症（例えば、放射線心筋炎に関連する心筋線維症、外科手技合併症（例えば、心筋術後線維化）、感染症（例えば、シャーガス病、細菌性、旋毛虫性又は真菌性の心筋炎））；肉芽腫性代謝蓄積障害（例えば、心筋症、ヘモクロマトーシス）；発達障害（例えば、心内膜線維弾性症）；動脈硬化性、又は毒素若しくは刺激物への曝露（例えば、薬物誘発性心筋症、薬物誘発性心毒性、アルコール性心筋症、コバルトの中毒又は曝露）である。いくつかの実施形態では、心筋線維症は、心臓組織の炎症性障害（例えば、心筋サルコイドーシス）に関連する。

いくつかの実施形態では、線維性状態は腎臓の線維性状態である。いくつかの実施形態では、腎臓の線維性状態は、以下の１つ以上から選択される：腎線維症（例えば、慢性腎線維症）、傷害／線維症に関連する腎症（例えば、糖尿病に関連する慢性腎症（例えば、糖尿病性腎症））、ループス、腎臓の強皮症、糸球体腎炎、巣状分節性糸球体硬化症、ヒト慢性腎疾患（ＣＫＤ）に関連するＩｇＡ腎症腎線維症、慢性進行性腎症（ＣＰＮ）、尿細管間質性線維症、尿管閉塞、慢性尿毒症、慢性間質性腎炎、放射線腎症、糸球体硬化症、進行性糸球体腎症（ＰＧＮ）、内皮／血栓性微小血管症の傷害、ＨＩＶ関連腎症、又は毒素、刺激物若しくは化学療法剤への曝露に関連する線維症。

いくつかの実施形態では、線維性状態は皮膚の線維性状態である。いくつかの実施形態では、皮膚の線維性状態は、皮膚線維症、強皮症、腎性全身性線維症（例えば、重度の腎不全患者においてＭＲＩの造影物質として頻繁に使用されるガドリニウムへの曝露後に生じる）、瘢痕化及びケロイドの１つ以上から選択される。

いくつかの実施形態では、線維性状態は消化管の線維性状態である。いくつかの実施形態では、線維性状態は、強皮症に関連する線維症；放射線誘発腸線維症；バレット食道及び慢性胃炎等の前腸炎症性障害に関連する線維症、及び／又は炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎及びクローン病等の後腸炎症性障害に関連する線維症の１つ以上から選択される。

いくつかの実施形態では、線維性状態は癒着である。いくつかの実施形態では、癒着は、腹部癒着、腹膜癒着、骨盤癒着、心膜癒着、硬膜外癒着、腱周囲又は癒着性関節包炎の１つ以上から選択される。

いくつかの実施形態では、線維性状態は、眼の線維性状態である。いくつかの実施形態では、眼の線維性状態は、緑内障及び角膜混濁等の眼の前眼部の疾患を含み、いくつかの実施形態では、眼の線維性状態は、加齢黄斑変性、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症及び血管新生緑内障等の眼の後部の疾患を含み；いくつかの実施形態では、眼の線維性状態は、眼手術後の線維症に起因する。

いくつかの実施形態では、線維性状態は、骨髄又は造血組織の線維性状態である。いくつかの実施形態では、骨髄の線維性状態は、原発性骨髄線維症（本明細書では血管新生性骨髄化生（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｍｙｅｌｏｉｄ ｍｅｔａｐｌａｓｉａ）又は慢性特発性骨髄線維症とも呼ばれる）等の骨髄の慢性骨髄増殖性新生物の固有の特徴である。いくつかの態様では、骨髄線維症は、悪性状態又はクローン増殖性疾患によって引き起こされる状態に関連する（例えば、それに続発する）。いくつかの実施形態では、骨髄線維症は、血液学的障害（例えば、真性赤血球増加症、本態性血小板血症、骨髄異形成、有毛細胞白血病、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫又は非ホジキンリンパ腫）、多発性骨髄腫又は慢性骨髄性白血病（ＣＩＶＩＬ）の１つ以上から選択される血液学的障害）に関連する。いくつかの実施形態では、骨髄線維症は、非血液学的障害（例えば、骨髄への固形腫瘍転移から選択される非血液学的障害、自己免疫障害（例えば、全身性エリテマトーデス、強皮症、混合性結合組織障害、又は多発性筋炎）、感染症（例えば、結核）、又はビタミンＤ欠乏症に関連する二次性副甲状腺機能亢進症に関連する（例えば、それに続発する）。

いくつかの実施形態において、線維症は、細胞形質転換のためのＲａｓシグナル伝達に関連しない。そのような状態の例としては、癌、例えば結腸癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌、腎臓、心血管系及び免疫系の障害、骨疾患、例えば骨減少状態、例えば骨粗鬆症が挙げられる。

特定の実施形態によれば、線維性状態は筋肉のものである。

動物の横紋筋及び平滑筋には２つの主要なタイプの筋組織がある。

筋肉はまた、位置又は機能によってグループ化され得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、対象となる被験体の組織、例えば、顔の１つ以上の筋肉、咀嚼のための１つ以上の筋肉、舌及び首の１つ以上の筋肉、胸郭の１つ以上の筋肉、胸帯及び腕の１つ以上の筋肉、腕及び肩の１つ以上の筋肉、１つ以上の腹側及び背側前腕の筋肉、手の１つ以上の筋肉、脊柱起立筋の１つ以上の筋肉、腰帯及び脚の１つ以上の筋肉、及び／又は前肢及び脚の１つ以上の筋肉を標的とし得る。

いくつかの実施形態では、顔の筋肉としては、毛様体、虹彩拡張器、虹彩括約筋等の眼内筋肉、耳介、側頭筋、アブミ骨筋、鼓膜張筋等の耳の筋肉；鼻根筋、鼻筋、鼻孔開大筋、鼻中隔下制筋、上唇鼻翼挙筋等の鼻の筋肉；口角挙筋、口角下制筋、口輪筋、頬筋、大頬骨筋及び小頬骨筋、広頸筋、上唇挙筋、下唇下制筋、笑筋、オトガイ筋、及び／又は皺眉筋等の口の筋肉が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、咀嚼筋としては、咬筋、側頭筋、内側翼突筋、外側翼状筋が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、舌および首の筋肉としては、頤舌筋、茎突舌筋、口蓋舌筋、舌骨舌筋、顎二腹筋、茎突舌骨筋、顎舌骨、オトガイ舌筋、肩甲舌骨筋、胸骨舌骨筋、胸骨甲状筋、甲状舌骨筋、胸鎖乳突筋、前斜角筋、中斜角筋および／または後斜角筋が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、胸郭、胸帯、及び腕の筋肉としては、鎖骨下大胸筋、小胸筋、腹直筋、外腹斜筋、内腹斜筋、腹横筋、横隔膜、外肋間筋、内肋間筋、前鋸筋、僧帽筋、肩甲挙筋、大菱形筋、小菱形筋、広背筋、三角筋、肩甲下筋、棘上筋、棘下筋、大円筋、小円筋、及び／又は烏口腕筋が含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、腕及び肩の筋肉にとしては、上腕二頭筋長頭、上腕二頭筋短頭、上腕三頭筋長頭、上腕三頭筋外側頭、上腕三頭筋内側頭、肘筋、円回内筋、回外筋、及び／又は上腕筋が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、腹側前腕及び背側前腕の筋肉としては、腕橈骨筋、橈側手根屈筋、尺側手根屈筋、長掌筋、尺側手根伸筋、橈側手根伸筋、短橈側手根伸筋、指伸筋、小指伸筋が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、手の固有の筋肉としては、母指球、短母指外転筋、短母指屈筋、母指対立筋、小指球、小指外転筋、短小指屈筋、小指対立筋、掌側骨間筋、背側骨間筋及び／又は中様筋等の手の固有筋が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、脊柱起立筋の筋肉としては、頸部筋肉、棘筋、最長筋、及び／又は腸肋筋が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、骨盤帯および脚の筋肉としては、大腰筋、腸骨筋、大腿四頭筋、長内転筋、短内転筋、大内転筋、薄筋、縫工筋、大腿直筋等の大腿四頭筋、外側広筋、内側広筋、中間広筋、腓腹筋、長腓側（腓骨）筋、ヒラメ筋、大殿筋、中殿筋、小殿筋、ハムストリングス：大腿二頭筋：長頭、ハムストリングス：大腿二頭筋：短頭、ハムストリングス：半腱様筋、ハムストリングス：半膜様筋、大腿筋膜張筋、恥骨筋、および／または前脛骨筋が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、前肢及び脚の筋肉としては、長指伸筋、長母指伸筋、短腓骨筋、足底筋、後脛骨筋、長母指屈筋、短指伸筋、短母指伸筋、母指外転筋、短母指屈筋、小指外転筋、短小指屈筋、小指対立筋、短指伸筋、足の虫様筋、足底方形筋（Ｑｕａｄｒａｔｕｓ ｐｌａｎｔａｅ）又は足底方形筋（ｆｌｅｘｏｒ ａｃｃｅｓｓｏｒｉｕｓ）、短指屈筋、背側骨間筋、及び／又は足底骨間筋が挙げられるが、これらに限定されない。

筋ジストロフィーは、筋肉の変性を引き起こし、運動の低下及び運動障害をもたらす一群の遺伝性障害である。全ての筋ジストロフィーの中心的な特徴は、それらが本質的に進行性であることである。筋ジストロフィーとしては、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、並びに先天型の筋緊張性ジストロフィー１型を含む筋緊張性ジストロフィー１型及び２型が挙げられるが、これらに限定されない。症状は、一部又は全部の筋肉が罹患している筋ジストロフィーのタイプによって異なり得る。筋ジストロフィーの例示的な症状としては、筋運動技能の発達遅延、１つ以上の筋肉群の使用困難、嚥下困難、発話困難又は摂食困難、流涙、眼瞼下垂、頻繁な転倒、成人の筋肉又は筋肉群の強度の喪失、筋肉サイズの喪失、身体の衰弱又は生体力学の変化による歩行の問題、筋肉肥大、筋肉偽肥大、筋肉の脂肪浸潤、筋肉の非収縮性組織による置換（例えば、筋線維症）、筋肉壊死、及び／又は認知若しくは行動障害／精神遅滞が挙げられる。

筋ジストロフィーの治療法は知られていないが、対症療法及び疾患修飾療法の両方を含むいくつかの支持処置が使用されている。コルチコステロイド、理学療法、整形器具、車椅子、又はＡＤＬ及び肺機能のための他の補助医療器具が、筋ジストロフィーにおいて一般的に使用されている。心臓ペースメーカーは、筋緊張性ジストロフィーにおける心不整脈による突然死を予防するために使用される。筋緊張症（弛緩不能）の症状を改善する抗筋緊張剤としては、メキシリチン、場合によってはフェニトイン、プロカインアミド及びキニーネが挙げられる。これらは、本発明のいくつかの実施形態のポリペプチドによる処置と組み合わせることができる。

デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、近位筋の脱力、異常な歩行、腓腹筋（ふくらはぎ）の偽肥大、及びクレアチンキナーゼ（ＣＫ）の上昇を特徴とする。多くのＤＭＤ患者は、典型的には、症状／徴候がより明白になる５歳前後に診断される。罹患者は、典型的には１０～１３歳頃に歩行を停止し、心肺機能不全のために２０歳中期又は後期に死亡する。

障害ＤＭＤは、細胞膜のジストログリカン複合体（ＤＧＣ）に構造安定性を提供する筋肉組織内の重要な構造成分であるタンパク質ジストロフィンをコードする、ヒトＸ染色体上に位置するジストロフィン遺伝子の変異によって引き起こされる。ジストロフィンは、内部細胞質アクチンフィラメントネットワークと細胞外マトリクスを連結し、筋線維に物理的強度を提供する。したがって、ジストロフィンの変化又は非存在は、筋線維の異常な筋線維しょう膜の断裂及び壊死をもたらす。両方の性別で変異を保有し得るが、女性が疾患の重篤な徴候を示すことはまれである。

ＤＭＤの主な症状は筋消耗に関連する筋力低下であり、典型的には随意筋が最初に冒され、特に臀部、骨盤領域、大腿、肩及びふくらはぎの筋肉が冒される。筋力低下は、腕、首、及び他の領域にも生じる。ふくらはぎは、しばしば肥大する。徴候及び症状は、通常、６歳前に現れ、乳児期という早い時期に現れ得る。その他の身体的症状としては、独立して歩く能力の遅延、歩行、足踏みまたはランニングの進行性の困難、および最終的な歩行能力の喪失（通常は１５歳まで）、頻繁な転倒；倦怠感；運動技能（ランニング、ホッピング、ジャンピング）の困難；股関節屈筋の短縮につながる腰椎前彎の増加；筋線維が短くなり、結合組織で線維症が発生するため、機能を損なうアキレス腱及びハムストリングの拘縮；筋線維の変形；筋肉組織が脂肪および結合組織に置き換わることによって引き起こされる、舌およびふくらはぎの筋肉の偽肥大（拡張）；神経行動障害（例えば、ＡＤＨＤ）、学習障害（失読症）のより高いリスク、及び特定の認知スキル（特に短期記憶）の非進行性の低下；骨格の変形（場合によっては脊柱側弯症を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「処置する」とは、状態の進行を無効にする、実質的に阻害する、遅らせる若しくは逆転させる、状態の臨床的若しくは審美的症状を実質的に改善する、又は状態の臨床的若しくは審美的症状の出現を実質的に防止することを指す。

本明細書で使用される場合、「被験体」は、線維症と診断された、又は線維症のリスクがある被験体を指す。

本明細書で使用される場合、「合成ポリペプチド」は、その天然環境、例えばヒト若しくは動物の体から単離されているため、又は野生型形態に対して変異しているため、又は異種部分、例えばタンパク質若しくは化学物質に結合して修飾されているため、天然には存在しないタンパク質を指す。

本明細書で使用される場合、「リジルオキシダーゼ」又は「ＬＯＸ」は、ＬＯＸ遺伝子のタンパク質産物を指す。ヒトでは、ＬＯＸ遺伝子は染色体５ｑ２３．３－３１．２上に位置する。ＬＯＸタンパク質の一次配列は、哺乳動物において高度に保存されている。ヒトＬＯＸは、４１７アミノ酸のプレ－プロタンパク質（プレ－プロＬＯＸ）として合成される（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２８３００、これは小胞体（ＥＲ）内でのいくつかの翻訳後修飾、例えば、下記に記載されるようなグリコシル化を受ける）。２１アミノ酸シグナル配列の切断後、１４７アミノ酸残基を含むＮ末端プロペプチドがＮ－グリコシル化され、２４９アミノ酸残基の成熟タンパク質を含むＣ末端配列（本明細書ではＬＯＸ触媒活性を含む部分とも呼ばれる）が特徴的に折り畳まれて少なくとも３つのジスルフィド結合を得る。銅は、機能性触媒の補因子であり、ＥＲ内の新生酵素に組み込まれる。酵素はまた、リジン３２０とチロシン３５５の銅依存性酸化生成物との間の分子内架橋によって生成されるペプチジル有機補因子リジルチロシンキノン（ＬＴＱ）を含有する。

「ＬＯＸ－プロペプチド」（ＬＯＸ－ＰＰ）又は「ＬＯＸ－プロドメイン」（ＬＰＤ）は、配列番号３のアミノ酸残基２２～１６８に対応するＮ末端プロペプチドであり、細胞外空間へのプロＬＯＸの分泌後、プロコラーゲン－Ｃ－プロテイナーゼ（ＢＭＰ－１）又はＢＭＰ－１関連メタロプロテイナーゼによって切断されて、遊離プロペプチド（ＬＰＤ）及び触媒活性ＬＯＸを生成する。

ＬＯＸ－ＰＰ（ＬＰＤ）の重要な細胞内機能は、おそらく、分泌経路内の不活性状態のリジルオキシダーゼの維持である。プロペプチドはまた、分子内シャペロンとして機能して、これらのタンパク質の正しい折り畳み及び最終的な目的地への標的化を促進し得る。実際、以下の表１及び２に示す質量分析は、ＬＰＤがシャペロンタンパク質、例えば熱ショックタンパク質と共免疫沈降することを示す。

ＬＯＸ－ＰＰは、ＬＯＸタンパク質配列の残基８１、９７及び１４４に３つのコンセンサスＮ－グリコシル化部位を含む。

本発明の教示は、一実施形態において、グリコシル化ＬＰＤを企図する。

一実施形態によれば、ポリペプチドは、配列番号１のＮ８１、Ｎ９７及びＮ１４４の少なくとも１つでグリコシル化されている。グリコシル化部位に言及する場合、示される残基は、配列番号１に対応する残基である。

一実施形態によれば、ポリペプチドは、ＬＰＤの１つのグリコシル化部位、すなわち配列番号１のＮ８１においてグリコシル化される。

一実施形態によれば、ポリペプチドは、ＬＰＤの１つのグリコシル化部位、すなわち配列番号１のＮ９７においてグリコシル化される。

一実施形態によれば、ポリペプチドは、ＬＰＤの１つのグリコシル化部位、すなわち配列番号１のＮ１４４においてグリコシル化される。

一実施形態によれば、ポリペプチドは、配列番号１のＮ８１、Ｎ９７及びＮ１４４のうち少なくとも２つでグリコシル化されている。

一実施形態によれば、ポリペプチドは、ＬＰＤの２つのグリコシル化部位、例えば配列番号１のＮ８１＋Ｎ９７、例えば配列番号１のＮ８１＋Ｎ１４４、例えば配列番号１のＮ９７＋Ｎ１４４においてグリコシル化される。

一実施形態によれば、ポリペプチドは、配列番号１のＮ８１、Ｎ９７及びＮ１４４でグリコシル化されている。

別の実施形態によれば、ポリペプチドは、配列番号１のＮ８１、Ｎ９７及びＮ１４４上でグリコシル化されていない。

グリコシル化の変化は、当技術分野で周知の方法、例えば、適切な発現系（例えば、原核生物対真核生物）の選択、非グリコシル化形態からのグリコシル化の分離、グリコシル化部位での部位特異的突然変異誘発、及び／又は酵素的修飾の使用によって達成され得る。

本発明者らは、グリコシル化形態及び非グリコシル化形態に異なる特性を付与されることを示した（実施例５を参照されたい）。例えば、非グリコシル化形態は、免疫沈降実験、引き続いて質量分析によって決定されるように、ＨＳＰ７０に対してより高い結合比を有する。

本発明のいくつかの実施形態のポリペプチドは、いくつかの生物学的活性を有する。

具体的な一実施形態によれば、上記タンパク質は、ＬＯＸをｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで阻害する。Ｆｃ－ＬＰＤ親和性及び安定性の測定をＬＯＸに対して行い、結合親和性（ＥＣ_５０＝４３ｎＭ）及び解離定数（Ｋｄ＝３２ｎＭ）を決定した。ｍｄｘマウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ研究は、ロータロッド走行及びぶら下がり試験等の機能試験の改善、並びに線維症蓄積の阻害及び正常なコラーゲン組織化の促進を示した。本結果は、Ｆｃ－ＬＰＤによるＬＯＸの阻害が非常に特異的であり、ＤＭＤの線維症及び副作用を効率的に最小化することを実証する。

具体的な一実施形態によれば、ポリペプチドは、ＥＬＩＳＡアッセイによって（例えば、図１Ｃのアッセイ条件に従って）決定される場合、約１０～２０００ｎＭ、約１０～５００ｎＭ、例えば、約４３ｎＭのＥＣ５０を特徴とする。

特定の実施形態によれば、ポリペプチドは、マイクロスケール熱泳動によって（例えば、図１Ｄのアッセイ条件に従って）決定される場合、約１０～１００ｎＭ、例えば、約３２ｎＭのＫ_Ｄを特徴とする。

特定の実施形態によれば、ポリペプチドは、本明細書中下記の実施例の節において更に記載されるｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ系においてコラーゲンの架橋をダウンレギュレーションすることができる。本発明のいくつかの実施形態のポリペプチドは、コラーゲン架橋を妨害することができることから、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の構造を変化させ、コラーゲン線維を弛緩させ、それらを規則正しい配向からよりランダムな配向に変化させる。したがって、本発明のいくつかの実施形態のポリペプチドは、コラーゲンの細線維化（したがって、コラーゲンの強度）を変化させ、コラーゲンの厚さに影響を及ぼす。

コラーゲン構造を分析する方法は当技術分野で公知であり、例えば、第二高調波発生（ＳＨＧ）顕微鏡法（例えば、図２Ａ～Ｂ～Ｃ～Ｄを参照されたい）、電子顕微鏡法イメージング及びラマン顕微鏡法を含む。

したがって、本発明の実施形態によれば、上記ポリペプチドは、ＳＨＧ顕微鏡法によって判断される場合、線維性コラーゲン（例えば、Ｉ型）及び架橋コラーゲンのうち少なくとも１つを低減させることができる。

「低減する」とは、原線維／架橋コラーゲンの量が、ポリペプチドの非存在下での量と比較して、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％又は９８％少ないことを意味することを意図する。

本発明の実施形態によれば、上記ポリペプチドは、ＳＨＧ顕微鏡法によって判断される場合、コラーゲン線維の配向を変化させることができる。

一実施形態によれば、ＬＰＤは、ヒトＬＯＸに由来する（ヒトＬＯＸから採取される又はそれを起源とする）が、ＬＯＸの他の哺乳動物配列もまた企図される。

ホモサピエンスＬＯＸのｍＲＮＡ及びアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ２８３００．２（タンパク質アクセッション番号）、ＡＦ０３９２９１．１（ｍＲＮＡアクセッション番号）、ＮＣ＿０００００５（ゲノムアクセッション）の下で見出すことができる。

述べられたように、ポリペプチドはＬＯＸ触媒活性を欠いている。

本明細書で使用される場合、「ＬＯＸ触媒活性」は、典型的には配列番号３のアミノ酸座標１６９～４１７の間のドメイン（例えば、配列番号９）に起因する酵素のリジルオキシダーゼ活性を指す。具体的な一実施形態によれば、触媒活性が配列番号９（アミノ酸配列）及び１０（核酸配列）に示される。

ＬＯＸの触媒活性を、ＳＨＧ顕微鏡法（下記の実施例の節において詳しく記載される）によってｉｎ ｖｉｔｒｏで求めることができる。

配列番号１又は５の活性／安定性とほぼ同じ又は更に高い活性／安定性を有する、ＬＰＤの機能的等価物も企図される。

特定の実施形態によれば、ＬＰＤ配列は、デフォルトパラメータを使用してＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＰソフトウェアを使用して決定された配列番号１又は５に記載のＬＰＤ配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９１％、少なくとも９３％、少なくとも９５％又はそれ以上、例えば１００％同一であり、上記の生物学的機能のいずれかが可能である。ペプチドとより大きなサイズのタンパク質との間の相同性を測定する場合、相同性は、対応する領域においてのみ測定され、すなわち、タンパク質は、ギャップ及び挿入を可能にする、ペプチドと同じ一般的な長さのみを有すると見なされる。

ホモログはまた、欠失、挿入又は置換変異体（そのアミノ酸置換を含む）、及びその生物学的に活性なポリペプチド断片を指す場合がある。

更なる修飾及び変化を、本開示の主題のポリペプチドのＬＰＤ部分の構造において行うことができ、それでもＬＯＸを阻害することができる分子を得ることができる。例えば、特定のアミノ酸は、ペプチド活性の明らかな喪失を伴わずに配列中の他のアミノ酸で置換され得る。そのポリペプチドの生物学的機能活性を規定するのはポリペプチドの相互作用能力及び性質であるので、特定のアミノ酸配列置換をポリペプチド配列（又は、もちろん、その基礎となるＤＮＡコード配列）において行うことができ、それにもかかわらず、同様の特性を有するポリペプチドを得ることができる。

そのような変更を行う際、アミノ酸のヒドロパシー指標を考慮することができる。ポリペプチドに相互作用的な生物学的機能を付与する際のヒドロパシーアミノ酸インデックス（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｉｎｄｅｘ）の重要性は、当技術分野で一般的に理解されている。特定のアミノ酸は、類似のヒドロパシーインデックス又はスコアを有する他のアミノ酸の代わりに使用することができ、それでもなお類似の生物学的活性を有するポリペプチドをもたらすことができることが知られている。各アミノ酸には、その疎水性及び電荷特性に基づいてヒドロパシー指標が割り当てられている。これらの指標は以下の通りである：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（－０．４）；トレオニン（－０．７）；セリン（－０．８）；トリプトファン（－０．９）；チロシン（－１．３）；プロリン（－１．６）；ヒスチジン（－３．２）；グルタメート（－３．５）；グルタミン（－３．５）；アスパラギン酸（－３．５）；アスパラギン（－３．５）；リジン（－３．９）；及びアルギニン（－４．５）。

アミノ酸の相対的なヒドロパシー特性が、結果として生じるポリペプチドの二次構造を決定し、それが、ポリペプチドと他の分子（例えば、酵素、基質、受容体、抗体、抗原等）との相互作用を規定すると考えられる。アミノ酸は、類似のヒドロパシー指標を有する別のアミノ酸で置換されても、機能的に等価なポリペプチドを得ることができることが当技術分野で公知である。かかる変化において、ヒドロパシー指標が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、±０．５以内であるアミノ酸の置換がさらに特に好ましい。

同様のアミノ酸の置換を、特に、それによって作成された生物学的機能的同等のポリペプチド又はペプチドが免疫学的実施形態での使用を意図している場合、親水性に基づいて行うこともできる。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，５５４，１０１号は、隣接するアミノ酸の親水性によって支配されるポリペプチドの最大の局所平均親水性が、その免疫原性および抗原性、すなわちポリペプチドの生物学的特性と相関すると述べている。米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されているように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０．＋－．１）；グルタメート（＋３．０．＋－．１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；プロリン（－０．５．＋－．１）；トレオニン（－０．４）；アラニン（－０．５）；ヒスチジン（－０．５）；システイン（－１．０）；メチオニン（－１．３）；バリン（－１．５）；ロイシン（－１．８）；イソロイシン（－１．８）；チロシン（－２．３）；フェニルアラニン（－２．５）；トリプトファン（－３．４）。アミノ酸は、同様の親水性値を有する別のものに置換されても、生物学的に等価な、特に免疫学的に等価なポリペプチドを得ることができると理解される。かかる変化において、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、±０．５以内であるアミノ酸の置換が更に特に好ましい。

したがって、上記で概説したように、アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズ等に基づく。様々な前述の特徴を考慮する例示的な置換は、当業者によく知られており、アルギニン及びリジン；グルタメート及びアスパルテート；セリン及びトレオニン；グルタミン及びアスパラギン；バリン、ロイシン及びイソロイシンを含む。したがって、本開示の主題は、上記のポリペプチド又はそのＬＰＤ部分の機能的又は生物学的等価物を企図する。

ポリペプチドの生物学的又は機能的等価物は、当技術分野で周知の手順に従って部位特異的突然変異誘発を使用して調製することができる。したがって、ペプチドの機能性を変更することなく、標準的な分子生物学的技術を使用して、本明細書に開示する主題のＬＰＤにアミノ酸残基を付加又は欠失させることができる。

一実施形態によれば、ＬＰＤのアミノ酸配列は、その安定性、バイオアベイラビリティ及び／又は薬理学的有効性を増加させるように修飾される。

したがって、本発明の態様によれば、ヒトリジルオキシダーゼ（ＬＯＸ）のプロペプチドを含む合成ポリペプチドであって、当該ポリペプチドがＬＯＸ触媒活性を欠き、当該ポリペプチドに、生理学的条件下で、修飾を含まない上記ポリペプチドの天然型と比較して強化された安定性を付与する修飾を含む、合成ポリペプチドが提供される。

安定性を決定する方法は、当技術分野でよく知られている。

本明細書で使用される場合、「安定性」は、少なくとも熱安定性を指す。この方法は、内在トリプトファン又はチロシン蛍光発光を使用して超高分解能タンパク質安定性を測定することに基づく。

本明細書で使用される場合、「増強された」又は「増加した」とは、天然のＬＰＤに対して少なくとも１０％、２０％、３０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上、例えば１００％の増加を指す。

具体的な一実施形態によれば、ポリペプチドは、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）によって求められる場合、２０～９５℃の遷移中点（例えば、Ｔｍ約７０℃）を特徴とする。

したがって、ＬＰＤの安定性／活性を改善するために、ポリペプチドを修飾する。

特定の実施形態によれば、修飾はタンパク質性修飾を含む。

タンパク質性修飾は、化学的結合（リンカー及び／又は活性基の使用等による融合ポリペプチド）又は組換えＤＮＡ技術によってポリペプチドに結合することができ、合成ポリペプチドはキメラポリペプチドである。

したがって、ポリペプチドは、ＬＰＤである第１の部分と、異種のペプチド又はタンパク質、すなわちタンパク質性修飾である第２の部分とを有する。融合／キメラ（又は集合的に「融合」）は、タンパク質性部分（本明細書では「異種ポリペプチド」とも呼ばれる）に対するＬＰＤのＮからＣ又はＣからＮへの配向を有するものであり得る。融合タンパク質は、ｍｙｃ、ＨＡ、又はＨｉｓ６のタグを含み得る。融合タンパク質は、ヒトＩｇＧのＦｃドメインに融合したＬＰＤ（本明細書において一実施形態ではＦｃ－ＬＰＤと呼ばれる）を更に含む。特定の態様では、免疫グロブリン融合物は、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。具体的な実施形態によれば、Ｆｃは、配列番号７に示される通りである。免疫グロブリン融合物の生成については、米国特許第５，４２８，１３０号も参照されたい。Ｆｃ部分は、マウスＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ２_Ｍ４に由来し得る。ヒトＩｇＧ２_Ｍ４（米国特許出願公開第２００７０１４８１６７号及び米国特許出願公開第２００６０２２８３４９号を参照されたい）は、抗体が正常な薬物動態プロファイルを維持するが、任意の既知のエフェクター機能を有さない変異を有するＩｇＧ２由来の抗体である。

Ｆｃドメインに融合されたＬＰＤの例示的なアミノ酸配列は、配列番号５（アミノ酸）及び配列番号６（核酸）に示されている。

融合タンパク質は、ヒト血清アルブミン、トランスフェリン又は抗体に融合したＬＰＤを更に含む。

更なる態様では、ＬＰＤは、ヒト血清アルブミン、トランスフェリン、又は抗体分子等の担体タンパク質にコンジュゲートされる。

本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、天然又は合成アミノ酸のポリマーを指し、天然ペプチド（切断産物、合成的に合成されたポリペプチド又は組換えポリペプチドのいずれか）及びペプチド模倣物（典型的には、合成的に合成されたペプチド）、並びにポリペプチド類縁体であるペプトイド及びセミペプトイドを包含し、これらは、例えば、体内にある間ポリペプチドをさらにより安定にするか、又は細胞によりしやすくする修飾を有し得る。

そのような修飾には、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ポリペプチド結合修飾（ＣＨ２－ＮＨ、ＣＨ２－Ｓ、ＣＨ２－Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ－ＮＨ、ＣＨ２－Ｏ、ＣＨ２－ＣＨ２、Ｓ＝Ｃ－ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨ又はＣＦ＝ＣＨが含まれるが、これらに限定されない）、骨格修飾及び残基修飾が含まれるが、これらに限定されない。ペプチド模倣化合物を調製するための方法は、当技術分野でよく知られており、例えば、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｃ．Ａ．Ｒａｍｓｄｅｎ Ｇｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １７．２，Ｆ．Ｃｈｏｐｌｉｎ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）に記載され、参照により本明細書に完全に記載されているかのように組み込まれる。この点に関する更なる詳細を以下に提供する。

ポリペプチド内のポリペプチド結合（－ＣＯ－ＮＨ－）は、例えば、Ｎ－メチル化結合（－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＯ－）、エステル結合（－Ｃ（Ｒ）Ｈ－Ｃ－Ｏ－Ｏ－Ｃ（Ｒ）－Ｎ－）、ケトメチレン結合（－ＣＯ－ＣＨ２－）、α－アザ結合（－ＮＨ－Ｎ（Ｒ）－ＣＯ－）で置換されていてもよく、式中、Ｒは任意のアルキル、例えば、メチル、カルバ結合（－ＣＨ２－ＮＨ－）、ヒドロキシエチレン結合（－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－）、チオアミド結合（－ＣＳ－ＮＨ－）、オレフィン性二重結合（－ＣＨ＝ＣＨ－）、レトロアミド結合（－ＮＨ－ＣＯ－）、ポリペプチド誘導体（－Ｎ（Ｒ）－ＣＨ２－ＣＯ－）であり、Ｒは炭素原子上に天然に存在する「正常」側鎖である。

これらの修飾は、ポリペプチド鎖に沿った結合のいずれかで、さらにはいくつか（２～３）で同時に起こり得る。

天然芳香族アミノ酸Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＰｈｅは、フェニルグリシン、ＴＩＣ、ナフチルアラニン（Ｎｏｌ）、Ｐｈｅの環メチル化誘導体、Ｐｈｅのハロゲン化誘導体、又はｏ－メチル－Ｔｙｒ等の合成非天然酸で置換されてもよい。

上記に加えて、本発明のポリペプチドは、１つ以上の修飾アミノ酸又は１つ以上の非アミノ酸モノマー（例えば、脂肪酸、複合多糖等）も含み得る。

本明細書及び以下の特許請求の範囲の項で使用される場合、「アミノ酸」又は「アミノ酸（複数）」という用語は、２０個の天然に存在するアミノ酸；例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリン及びホスホトレオニンを含む、ｉｎ ｖｉｖｏで翻訳後に修飾されることが多いアミノ酸；並びに２－アミノアジピン酸、ヒドロキシリジン、イソデスモシン、ノル－バリン、ノル－ロイシン及びオルニチンを含むがこれらに限定されない他の異常なアミノ酸を含むと理解される。さらに、「アミノ酸」という用語は、Ｄ－アミノ酸及びＬ－アミノ酸の両方（立体異性体）を含む。

以下の表Ａ及びＢは、本発明と共に使用することができる天然に存在するアミノ酸（表Ａ）及び非従来型アミノ酸又は修飾アミノ酸（表Ｂ）を列挙する。

組換え技術は、典型的には、本発明のポリペプチド（又はそのＬＰＤ部分のみ）を作製するために使用される。そのような組換え技術は、Ｂｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６－５４４、Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：６０－８９、Ｂｒｉｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１０：５１１－５１４、Ｔａｋａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：３０７－３１１、Ｃｏｒｕｚｚｉ ｅｔ ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：１６７１－１６８０、及びＢｒｏｇｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：８３８－８４３、Ｇｕｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：５５９－５６５、及びＷｅｉｓｓｂａｃｈ＆Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，１９８８，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｓｅｃｔｉｏｎ ＶＩＩＩ，ｐｐ ４２１－４６３に記載されている。

組換え技術を用いて本発明のポリペプチドを産生するために、本発明のポリペプチド、例えば配列番号２又は６をコードするポリヌクレオチドを、宿主細胞において本発明のポリペプチドの構成的転写、組織特異的又は誘導性転写を指令するのに適したシス調節配列（例えば、プロモーター配列）の転写制御下にあるポリヌクレオチド配列を含む核酸発現ベクターにライゲーションする。

「単離ポリヌクレオチド」という句は、単離され、ＲＮＡ配列、相補的ポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ）、ゲノムポリヌクレオチド配列及び／又は複合ポリヌクレオチド配列（例えば、上記の組合せ）の形態で提供される一本鎖又は二本鎖核酸配列を指す。

本明細書で使用される場合、「相補的ポリヌクレオチド配列」という表現は、逆転写酵素又は任意の他のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用するメッセンジャーＲＮＡの逆転写から生じる配列を示す。そのような配列は、その後、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用してｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで増幅することができる。

本明細書で使用される場合、「ゲノムポリヌクレオチド配列」という句は、染色体に由来する（単離された）配列のことを指し、したがって、それは、染色体の連続した部分を表す。

本明細書で使用される場合、「複合ポリヌクレオチド配列」という句は、少なくとも部分的に相補的であり、少なくとも部分的にゲノムである配列のことを指す。複合配列は、本発明のポリペプチドをコードするのに必要ないくつかのエクソン配列、並びにそれらの間に介在するいくつかのイントロン配列を含み得る。イントロン配列は、他の遺伝子を含む任意の供給源であってもよく、典型的には保存されたスプライシングシグナル配列を含む。そのようなイントロン配列は、シス作用発現調節エレメントを更に含み得る。

本明細書において上で述べられたように、本発明のポリヌクレオチド配列は、組換えポリペプチドの発現を可能にするために発現ベクター（すなわち、核酸コンストラクト）に挿入される。本発明の発現ベクターは、このベクターを原核生物、真核生物、又は好ましくはその両方における複製及び組込みに適したものにする更なる配列を含み得る（例えば、シャトルベクター）。典型的なクローニングベクターは、転写及び翻訳開始配列（例えば、プロモーター、エンハンサー）並びに転写及び翻訳ターミネーター（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む。発現ベクターはまた、本発明の核標的化ペプチドに転写的に連結された他のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み得ることが理解されるであろう。そのようなポリペプチドは、本明細書において以下に更に記載される。

発現ベクターに使用されるプロモータは、構成的又は誘導性であり得る。組織特異的プロモータも企図される。

種々の原核細胞又は真核細胞（例えば、ＨＥＫ２９３－６Ｅ）を、本発明のペプチドを発現させるための宿主発現系として使用することができる。これらとして、ポリペプチドコード配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌等の微生物；ポリペプチドコード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染させた植物細胞系、又はポリペプチドコード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター、例えばＴｉプラスミドで形質転換した植物細胞系が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明のこの態様のこの実施形態によれば、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、発現系における発現レベルを更に改善するために変更され得る。したがって、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、細菌又は特定の哺乳動物の発現のための好ましいコドン使用頻度に従って修飾され得る。

「コドン最適化」という句は、関連する系内のコドン使用頻度に近い構造遺伝子又はその断片内で使用するための適切なＤＮＡヌクレオチドの選択を指す。

本発明のポリペプチドを発現するために使用され得るポリヌクレオチド配列の例は、配列番号２及び６に提供されている。

本発明のポリヌクレオチドはまた、被験体において直接発現され得る（すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子治療）か、又は細胞系においてｅｘ ｖｉｖｏで発現され得（自家又は非自家）、次いで被験体に投与され得ることが理解されるであろう。

挿入されたコード配列（ポリペプチドをコードする）の転写及び翻訳に必要なエレメントを含有すること以外に、本発明の発現コンストラクトは、発現されたペプチドの安定性、産生、精製、収率又は活性を最適化するように操作された配列も含み得る。

本発明の発現ベクターを宿主細胞系に導入するために、様々な方法を用いることができる。そのような方法は、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９，１９９２）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．（１９８９）、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｍａｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，Ｍｉｃｈ．（１９９５）、Ｖｅｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ Ｍｉｃｈ．（１９９５）、Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ Ｍａｓｓ．（１９８８）、及びＧｉｌｂｏａ ｅｔ ａｔ．［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４（６）：５０４－５１２，１９８６］に記載され、例えば、安定なトランスフェクション又は一過性のトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション及び組換えウイルスベクターによる感染が挙げられる。さらに、陽性－陰性選択方法については、米国特許第５，４６４，７６４号及び第５，４８７，９９２号を参照されたい。

形質転換された細胞を、大量の組換えポリペプチドの発現を可能にする有効な条件下で培養する。有効な培養条件としては、タンパク質産生を可能にする有効な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨ及び酸素条件が挙げられるが、これらに限定されない。有効な培地とは、細胞を培養して本発明の組換えポリペプチドを産生する任意の培地を指す。そのような培地は、典型的には、同化可能な炭素、窒素及びリン酸塩源、並びに適切な塩、鉱物、金属及びビタミン等の他の栄養素を有する水溶液を含む。本発明の細胞は、従来の発酵バイオリアクター、振盪フラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュ及びペトリ皿で培養することができる。培養は、組換え細胞に適した温度、ｐＨ及び酸素含有量で行うことができる。そのような培養条件は、当業者の専門知識の範囲内である。

産生に使用されるベクター及び宿主系に応じて、本発明の得られたポリペプチドは、組換え細胞内に留まるか、発酵培地に分泌されるか、２つの細胞膜の間の空間、例えば大腸菌のペリプラズム空間に分泌され得か、又は細胞若しくはウイルス膜の外面に保持される。

培養中の所定時間後、組換えポリペプチドの回収が影響を受ける。

本明細書で使用される場合、「組換えポリペプチドの回収」という句は、ポリペプチドを含有する発酵培地全体を収集することを指し、分離又は精製の追加の工程を意味する必要はない。

回収はまた、「単離すること」又は「精製すること」という用語によって包含され、これは宿主細胞からであってもよい。

したがって、本発明のポリペプチドは、限定されないが、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、濾過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンＡクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング及び吸収率較差溶解度ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）等の様々な標準的なタンパク質精製技術を使用して精製することができる。

回収を容易にするため、発現したコード配列を、本発明のポリペプチド及び融合切断可能部分をコードするように操作することができる。そのような融合タンパク質は、ポリペプチドがアフィニティークロマトグラフィーによって、例えば、切断可能な部分に特異的なカラムへの固定化によって、容易に単離され得るように設計され得る。切断部位がポリペプチドと切断可能部分との間で操作される場合、ポリペプチドは、この部位で融合タンパク質を特異的に切断する適切な酵素又は薬剤［例えば、Ｂｏｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１９：６５－７０（１９８８）；及びＧａｒｄｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１５８５４－１５８５９（１９９０）を参照されたい］による処置によってクロマトグラフィーカラムから放出され得る。

本発明の目的のための例示的な精製タグとしては、ポリヒスチジン、Ｖ５、ｍｙｃ、プロテインＡ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）及びセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）［Ｓａｓｓｅｎｆｅｌｄ，１９９０，ＴＩＢＴＥＣＨ，８，８８－９］が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明のポリペプチドは、好ましくは「実質的に純粋」な形態で回収される。

本明細書で使用される場合、「実質的に純粋」という表現は、本明細書中に記載される適用におけるタンパク質の効果的な使用を可能にする純度を示す。

本発明のいくつかの実施形態のＬＰＤ又はポリペプチド（例えば、Ｆｃ部分を含む、）は、バイオアベイラビリティを高めるために発現後に化学修飾によって化学的に修飾され得る。

したがって、例えば、本発明は、ポリペプチドがポリマーに連結される修飾を企図する。選択されるポリマーは、通常、アシル化のための活性エステル又はアルキル化のためのアルデヒド等の単一の反応性基を有するように修飾され、その結果、修飾の程度を制御することができる。ポリマーの範囲内には、ポリマーの混合物が含まれる。好ましくは、最終製品調製物の治療的使用のために、ポリマーは薬学的に許容され得る。

ポリマー又はその混合物は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシ－ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、又は他の炭水化物系ポリマー、ポリ－（Ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、及びポリビニルアルコールからなる群から選択されてもよい。

更なる実施形態では、ポリペプチドは、ＰＥＧ化、ＨＥＳ化ＣＴＰ（Ｃ末端ペプチド）、アルブミンへの架橋、カプセル化、多糖による修飾及び多糖の変化によって修飾される。修飾は、ポリペプチド中の任意のアミノ酸残基に対するものであり得る。

一実施形態によれば、修飾は、ＬＰＤのＮ又はＣ末端アミノ酸に対するものである。これは、直接、又はＮ若しくはＣ末端に付加されたシステイン残基のチオール基又はＮ若しくはＣ末端に付加されたリンカー、例えばＴｔｄｓとのカップリングによって影響を受け得る。更なる実施形態では、ポリペプチドのＮ又はＣ末端は、保護基がシステイン残基のＮ末端アミノ基に結合しているシステイン残基を含み、システインチオレート基は、Ｎ－エチルマレイミド、ＰＥＧ基、ＨＥＳ化ＣＴＰ等の官能基で誘導体化されている。

特定のタンパク質の特性は、タンパク質の流体力学的体積を増加させ、それによって腎臓濾過によるそのクリアランスを遅くするポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーの結合で調節できることが良く知られている（例えば、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２１９６９－２１９７７（１９９６）を参照されたい。したがって、コアペプチド残基をＰＥＧ化して、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期を延長することによる有効性の増加等の治療上の利点を高めることができることが想定される。したがって、ポリペプチドのＰＥＧ化は、ポリペプチドのプロペプチドドメインの薬物動態及び薬力学を改善するであろう。

ＰＥＧ化方法は文献においてよく知られており、以下の参考文献に記載され、その各々は参照により本明細書に組み込まれる：Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．４３：１２７－３８（１９９４）；Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．６：１４０－６（１９９３）；Ｆｅｌｉｘ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．４６：２５３－６４（１９９５）；Ｇａｅｒｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．７：３８－４４（１９９６）；Ｔｓｕｔｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７７：１６８－７３（１９９７）；Ｆｒａｎｃｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．６８：１－１８（１９９８）；Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８７：１４４０－４５（１９９８）；及びＴａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１２：４５－５２（１９９８）。ポリエチレングリコール又はＰＥＧは、モノ－（Ｃ．ｓｕｂ．１～１０）アルコキシ又はアリールオキシ－ポリエチレングリコールを含むがこれらに限定されない他のタンパク質を誘導体かするために使用されたいずれかのＰＥＧの形態を包含することを意味する。適切なＰＥＧ部分としては、例えば、４０ｋＤａメトキシポリ（エチレングリコール）プロピオンアルデヒド（Ｄｏｗ、ミシガン州ミッドランド）；６０ｋＤａメトキシポリ（エチレングリコール）プロピオンアルデヒド（Ｄｏｗ、ミシガン州ミッドランド）；４０ｋＤａメトキシポリ（エチレングリコール）マレイミド－プロピオンアミド（Ｄｏｗ、ミシガン州ミッドランド）；３１ｋＤａアルファ－メチル－ｗ－（３－オキソプロポキシ）、ポリオキシエチレン（ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、東京）；ｍＰＥＧ．ｓｕｂ．２－ＮＨＳ－４０ｋ（Ｎｅｋｔａｒ）；ｍＰＥＧ_２－ＭＡＬ－４０ｋ（Ｎｅｋｔａｒ）、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＬ２－４００ＭＡ（（ＰＥＧ）．ｓｕｂ．２４０ｋＤａ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、東京）、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥ－２００ＭＡ（ＰＥＧ２０ｋＤａ）（ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、東京）が挙げられる。ＰＥＧ基は、一般に、アシル化、アミド化、チオエーテル化、またはＰＥＧ部分の反応性基（例えば、アルデヒド、アミノ、カルボキシルまたはチオール基）によるポリペプチドの反応性基（例えば、アルデヒド、アミノ、カルボキシルまたはチオール基）に対する還元的アルキル化を介してＬＰＤポリペプチドに結合される。

ＰＥＧ分子は、ポリペプチド中の任意の位置の任意のＬｙｓ又はＣｙｓ残基に共有結合していてもよい。使用することができる他のアミノ酸は、Ｔｙｒ及びＨｉｓである。任意には、カルボン酸側鎖を有するアミノ酸でもある。本明細書に記載のポリペプチドを、Ｎ末端アミノ基を介してＮ末端の任意のアミノ酸に直接ＰＥＧ化することができる。ＰＥＧ化を促進するために、「リンカーアーム」をポリペプチドに添加することができる。システインのチオール側鎖におけるＰＥＧ化は、広く報告されている（例えば、Ｃａｌｉｃｅｔｉ＆Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５５：１２６１－７７（２００３）を参照されたい）。ポリペプチド中にシステイン残基が存在しない場合、システイン残基は、置換によって、又はＮ末端アミノ酸にシステインを付加することによって導入することができる。他の選択肢としては、チオールをポリペプチドに付加する試薬、例えばＴｒａｕｔの試薬（Ｔｒａｕｔ’ｓ ｒｅａｇｅｎｔ）及びＳＡＴＡが挙げられる。

特定の態様では、ＰＥＧ分子は分岐しているが、他の態様では、ＰＥＧ分子は直鎖状であってもよい。特定の態様では、ＰＥＧ分子は分子量が１ｋＤａ～１５０ｋＤａである。より具体的には、ＰＥＧ分子は、分子量が１ｋＤａ～１００ｋＤａである。更なる態様では、ＰＥＧ分子は、５、１０、２０、３０、４０、５０及び６０ｋＤａから選択される。

ポリペプチドのＰＥＧ化のための有用な戦略は、溶液中でコンジュゲート結合を形成することにより、ペプチドとＰＥＧ部分とを組み合わせることからなり、それぞれが互いに反応性である特別な官能性を有する。ポリペプチドは、上記のような組換え手段によって容易に調製され得る。

一実施形態では、ＰＥＧは、ポリペプチドに結合する前に「予備活性化」されている。例えば、カルボキシル末端ＰＥＧを活性化のためにＮＨＳエステルに変換して、リジン及びＮ末端に対してより反応性にすることができる。

別の実施形態によれば、ポリペプチドは、特定の部位で適切な官能基により「予備活性化」されている。ポリペプチドとＰＥＧとのコンジュゲーションは、水相又は有機共溶媒中で行われ得、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、ＳＥＣ及び質量分析によって容易にモニターすることができる。次いで、ＰＥＧ化ポリペプチドを精製する。小さいＰＥＧは、限外濾過によって除去することができる。より大きなＰＥＧは、典型的には、アニオンクロマトグラフィー、カチオンクロマトグラフィー又はアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製される。ＰＥＧ化ポリペプチドの特性評価は、分析ＨＰＬＣ、アミノ酸分析、ＩＥＦ、酵素活性の分析、電気泳動、ＰＥＧ：タンパク質比の分析、レーザー脱離質量分析及びエレクトロスプレー質量分析によって行うことができる。

過剰な遊離ＰＥＧの除去は、カラム（Ｔｒｉｃｏｒｎ Ｅｍｐｔｙ Ｈｉｇｈ－Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｃｏｌｕｍｎｓ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をＰＯＲＯＳ ５０ ＨＱ支持体（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でパッキングし、その後、カラムを平衡化緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．２）で平衡化することによって実施することができる。ＰＥＧ化ポリペプチドを平衡化カラムにロードし、その後、カラムを５ＣＶの平衡化緩衝液で洗浄する。これらの条件下で、ポリペプチドはカラムに結合する。ＰＥＧ化ポリペプチドを溶出緩衝液によって次の工程で溶出し、短期間２～８℃で保存するか、又は長期間保存のために－２０℃で凍結する。

得られたポリペプチドは、（上記の）修飾が付加されているかどうか及び（上記の）グリコシル化状態に応じて、４０～１００ＫＤａの間のいずれかであり得る。

例えば、Ｆｃ融合の場合：
具体的な実施形態によれば、ポリペプチドは４０～７０ＫＤａである。
具体的な実施形態によれば、ポリペプチドは４５～６５ＫＤａである。
具体的な実施形態によれば、ポリペプチドは５０～７０ＫＤａである。
具体的な実施形態によれば、ポリペプチドは４５ＫＤａである。
具体的な実施形態によれば、ポリペプチドは６５ＫＤａである。

具体的な一実施形態によれば、ＬＯＸ触媒活性を欠くＬＯＸのポリペプチドドメインは、４００アミノ酸未満、例えば、１００～２００、１００～１５０、１００～３００アミノ酸長である。

合成ポリペプチドを、ＬＯＸを修飾を含む合成ポリペプチドと単に接触させることによって、ＬＯＸの触媒作用（酵素活性）を阻害する任意の方法において使用することができる。そのような方法は、ｉｎ－ｖｉｔｒｏ、ｉｎ－ｖｉｖｏ又はｅｘ－ｖｉｖｏで実施することができる。

本発明のいくつかの実施形態のポリペプチドは、本明細書中上記で言及されるような線維症又は線維性状態を処置する際に使用され得る。

具体的な実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態のポリペプチドは、Ｄ－ペニシラミンによる処置を含むレジメンの一部として使用されない（又は投与されない）。

本発明のポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチドは、処置された被験体（すなわち哺乳動物）に対して、それ自体で（例えば、精製されるか、又は発現系の一部として直接的に）提供することができ、又は本発明のポリペプチドを含む医薬組成物中に提供することができる。本明細書で使用される場合、「医薬組成物」は、生理学的に適切な担体及び賦形剤等の他の化学成分を用いた、本明細書に記載の活性成分の１つ以上の調製物を指す。医薬組成物の目的は、生物への化合物の投与を容易にすることである。

本明細書において、「有効成分」という用語は、生物学的効果について説明可能な本発明のポリペプチド（又はそれをコードするポリヌクレオチド）を指す。

以下、同じ意味で使用され得る「生理学的に許容され得る担体」及び「薬学的に許容され得る担体」という句は、生物に重大な刺激を引き起こさず、投与された化合物の生物学的活性及び特性を無効にしない担体又は希釈剤を指す。これらの句にはアジュバントが含まれる。

本明細書では、「賦形剤」という用語は、有効成分の投与を更に容易にするために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。賦形剤の例としては、限定されるものではないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖及び様々な種類のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、並びにポリエチレングリコールが挙げられる。

薬物の処方及び投与のための技術は、‘‘Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，’’Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡの最新版に見出すことができ、これは参照により本明細書に組み込まれる。

適切な末梢投与経路としては、例えば、経口、直腸、経粘膜、特に経鼻、腸管内又は非経口送達（筋肉内、皮下及び静脈内、腹腔内、鼻腔内又は眼内注射を含む）が挙げられ得る。

本発明の医薬組成物は、当該技術分野で周知のプロセスによって、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠形成、研和（ｌｅｖｉｇａｔｉｎｇ）、乳化、カプセル化、封入又は凍結乾燥のプロセスによって製造され得る。

そのため、本発明に従って使用するための医薬組成物は、有効成分を薬学的に使用できる調製物に加工することを容易にする賦形剤及び助剤を含む１つ以上の生理学的に許容され得る担体を使用して従来の方法で製剤化され得る。適切な製剤は、選択される投与経路によって異なる。

注射の場合、医薬組成物の有効成分は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩水等の生理学的に適合性のあるバッファーにおいて製剤化され得る。経粘膜投与では、浸透するバリアに適した浸透剤を製剤化において使用する。そのような浸透剤は、当該技術分野で一般的に知られている。

経口投与の場合、医薬組成物は、活性化合物を当該技術分野で周知の薬学的に許容され得る担体と組み合わせることによって容易に製剤化することができる。そのような担体は、患者による経口摂取のために、医薬組成物を錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として製剤化することを可能にする。経口使用のための薬理学的調製物は、固体賦形剤を使用して作製でき、任意に、得られた混合物を粉砕し、必要に応じて適切な助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して、錠剤又は糖衣錠コアを得ることができる。適切な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトール、又はソルビトールを含む糖；例えば、トウモロコシ澱粉、小麦澱粉、米澱粉、馬鈴薯澱粉、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロース等のセルロース調製物；及び／又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）等の生理学的に許容され得るポリマー等の充填剤である。必要に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、若しくはアルギン酸等の崩壊剤、又はアルギン酸ナトリウム等のそれらの塩を添加することができる。

糖衣錠コアには適切なコーティングが施されている。この目的のために、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液、及び適切な有機溶媒又は溶媒混合物を任意に含み得る濃縮糖溶液を使用することができる。染料又は顔料は、識別のために、又は活性化合物の用量の異なる組み合わせを特徴づけるために、錠剤又は糖衣錠コーティングに添加され得る。

経口的に使用できる医薬組成物には、ゼラチンで作られたプッシュフィットカプセルと並んで、ゼラチン、及びグリセロール又はソルビトール等の可塑剤で作られた柔らかく密封されたカプセルが含まれる。プッシュフィットカプセルは、ラクトース等の充填剤、デンプン等の結合剤、タルク又はステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤、及び任意に安定剤と混合した有効成分を含み得る。ソフトカプセルでは、有効成分は、脂肪油、流動パラフィン、又は液体ポリエチレングリコール等の適切な液体に溶解又は懸濁され得る。更に、安定剤を加えることができる。経口投与用のすべての製剤は、選択した投与経路に適した投与量でなければならない。

頬側投与の場合、組成物は、従来の方法で処方された錠剤又はトローチの形態をとることができる。

経鼻吸入による投与の場合、本発明による使用のための有効成分は、適切な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン又は二酸化炭素を使用した、加圧パック又はネブライザーからのエアロゾルスプレー提示の形態で簡便に送達される。加圧エアロゾルの場合、投与単位は、計量された量を送達するためのバルブを提供することによって決定することができる。ディスペンサーで使用するための例えばゼラチンのカプセル及びカートリッジは、化合物の粉末混合物、及びラクトース又はデンプン等の適切な粉末ベースを含むように処方することができる。

本明細書に記載の医薬組成物は、例えば、ボーラス注射又は連続注入による非経口投与用に処方することができる。注射用製剤は、単位剤形で、例えば、アンプルで、又は任意に防腐剤を添加した複数回投与容器で提示することができる。組成物は、油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又は乳濁液であり得、そして懸濁剤、安定剤及び／又は分散剤等の配合剤を含み得る。

非経口投与用の医薬組成物には、水溶性形態の活性製剤の水溶液が含まれる。更に、有効成分の懸濁液は、適切な油性又は水ベースの注射懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒又はビヒクルには、ゴマ油等の脂肪油、又はオレイン酸エチル、トリグリセリド若しくはリポソーム等の合成脂肪酸エステルが含まれる。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール又はデキストラン等の懸濁液の粘度を増加させる物質を含み得る。必要に応じて、懸濁液はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために有効成分の溶解度を増加させる適切な安定剤又は薬剤を含み得る。

或いは、有効成分は、使用前に、適切なビヒクル、例えば、無菌のパイロジェンフリーの水ベースの溶液により構成するための粉末形態であり得る。

本発明の医薬組成物はまた、例えば、カカオバター又は他のグリセリド等の従来の坐剤ベースを使用して、坐剤又は保持浣腸等の直腸組成物に処方され得る。

本発明の状況での使用に適した医薬組成物には、有効成分が意図された目的を達成するのに有効な量で含まれる組成物が含まれる。より具体的には、治療有効量とは、障害（例えば、虚血）の症候を予防、緩和若しくは改善するか、又は処置される被験体の生存を延長するのに有効な有効成分（核酸コンストラクト）の量を意味する。

治療有効量の決定は、特に本明細書で提供される詳細な開示に照らして、当業者の能力の範囲内である。

本発明の方法で使用される任意の調製物について、治療有効量又は用量は、最初にｉｎ ｖｉｔｒｏ及び細胞培養アッセイから推定することができる。例えば、用量は、所望の濃度又は力価を達成するために動物モデルで処方することができる。このような情報をヒトの有用な用量をより正確に決定するために使用できる。

本明細書に記載の有効成分の毒性及び治療効果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、細胞培養又は実験動物における標準的な製薬手順によって決定することができる。これらのｉｎ ｖｉｔｒｏ及び細胞培養アッセイ、並びに動物実験から得られたデータは、ヒトで使用するための投与量の範囲を策定する際に使用することができる。投与量は、使用される剤形及び利用される投与経路に応じて変化し得る。正確な処方、投与経路、及び投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師が選択することができる。（例えば、Ｆｉｎｇｌ，ｅｔ ａｌ．，１９７５，‘‘Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ’’，Ｃｈ．１ ｐ．１を参照されたい）。

以下の実施例の節では、ＤＭＤの動物モデル及び有効性を決定するための標準的な試験を詳細に記載する。

他の線維性状態の動物モデルは当技術分野で周知であり、例えば、肝線維症モデルはＤｅｌｉｒｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｈｅｐａｔｏｌ．２０１５ Ｍａｒ；３（１）：５３－６６に記載され、Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌは線維性肺疾患の動物モデルを記載し、Ｒａｉ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１７ Ｊａｎ；４２４（１－２）：１２３－１４５．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１１０１０－０１６－２８４９－０．は心筋線維化の動物モデルを記載する。

投与量及び間隔は、生物学的効果（最小有効濃度、ＭＥＣ）を誘導又は抑制するのに十分な有効成分の血漿又は脳レベルを提供するように個別に調整され得る。ＭＥＣは調製ごとに異なるが、ｉｎ ｖｉｔｒｏデータから推定できる。ＭＥＣするために必要な投与量は、個々の特性及び経路によって異なる。血漿濃度を決定するために検出アッセイを使用することができる。

処置される状態の重症度及び応答性に応じて、投薬は、単回又は複数回の投与であり得、一連の処置は、数日から数週間、又は治癒が影響を受けるまで、若しくは病状の減少が達成されるまで続く。

投与される組成物の量は、もちろん、処置される被験体、苦痛の重症度、投与の方法、処方する医師の判断等に依存するであろう。

本発明の組成物は、必要に応じて、有効成分を含む１つ以上の単位剤形を含み得る、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）承認キット等のパック又はディスペンサーデバイスで提示され得る。パックは、例えば、ブリスターパック等の金属又はプラスチック箔を含み得る。パック又はディスペンサーデバイスには、投与手順が添付されている場合がある。パック又はディスペンサーは、医薬品の製造、使用、又は販売を規制する政府機関によって規定された形式の容器に関連する通知によって適応させることもでき、この通知は、組成物、又はヒト若しくは動物用の投与の形態の機関による承認を反映している。このような通知は、例えば、処方薬について米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されたラベル、又は承認された製品挿入物に関するものである可能性がある。適合性のある薬学的担体に配合された本発明の調製物を含む組成物もまた、上で更に詳述したように、調製され、適切な容器に入れられ、指定の状態の処置用に標識され得る。

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、±１０％を指す。

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語及びそれらの複合体は、「含むがこれらに限定されない」を意味する。

「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語は、「含む、及び限定される」ことを意味する。

「本質的にからなる」という用語は、組成物、方法又は構造が追加の成分、工程及び／又は部品を含み得るが、追加の成分、工程及び／又は部品が特許請求の範囲の組成物、方法、若しくは構造の基本的及び新規の特性を実質的に変更しない場合に限り、を意味する。

本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、複数の参照を含む。例えば、「化合物」又は「少なくとも１つの化合物」という用語は、それらの混合物を含む複数の化合物を含み得る。

本出願を通して、本発明の様々な実施形態は、範囲形式で提示され得る。範囲形式での説明は、単に便宜上及び簡潔にするためのものであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、その範囲内の個々の数値だけでなく、すべての可能なサブレンジを具体的に開示していると見なされるべきである。例えば、１～６等の範囲の記述は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６等と並んで、その範囲内の個々の番号、例えば１、２、３、４、５、及び６等のサブレンジを具体的に開示していると見なされるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。

本明細書で数値範囲が示されるときはいつでも、示された範囲内の引用された数字（分数又は整数）を含むことを意味する。第１の表示番号と第２の表示番号との間の「範囲／その間の範囲」及び第１の表示番号から第２の表示番号までの「範囲／その範囲」という句は、本明細書では同じ意味で使用され、第１及び第２の表示番号、並びにそれらの間のすべての分数及び整数を含むことを意味する。

本明細書で使用される場合、「方法」という用語は、所与のタスクを達成するための様式、手段、手法及び手順を指し、限定されるものではないが、化学、薬理学、生物学、生化学及び医学の専門家に知られているか、又は彼らによって既知の様式、手段、手法及び手順から容易に開発されるそれらの様式、手段、手法及び手順を含む。

本明細書で使用される場合、「処置する」という用語は、状態の進行を無効にする、実質的に阻害する、遅らせる若しくは逆転させる、状態の臨床的若しくは審美的症状を実質的に改善する、又は状態の臨床的若しくは審美的症状の出現を実質的に防止することを含む。

特定の配列表を参照する場合、そのような参照は、例えば、配列決定エラー、クローニングエラー、又は塩基置換、塩基欠失若しくは塩基付加をもたらす他の変更に起因するマイナーな配列変異を含むものとして、その相補的配列に実質的に対応する配列も包含すると理解されるものとするが、ただし、そのような変異の頻度は、５０ヌクレオチドに１未満、あるいは１００ヌクレオチドに１未満、あるいは２００ヌクレオチドに１未満、あるいは５００ヌクレオチドに１未満、あるいは、１０００ヌクレオチドに１未満、あるいは５，０００ヌクレオチドに１未満、あるいは１０，０００ヌクレオチドに１未満である。

本出願に開示される任意の配列識別番号（配列番号）は、その配列番号が言及される文脈に応じて、たとえその配列番号がＤＮＡ配列形式又はＲＮＡ配列形式でのみ発現される場合であっても、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列のいずれかを指すことができることが理解される。

明確にするために、別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴もまた、単一の実施形態で組み合わせて提供され得ることが理解される。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈で説明される本発明の様々な特徴はまた、別個に、又は任意の適切なサブコンビネーションで、又は本発明の他の任意の説明された実施形態に適したものとして提供され得る。様々な実施形態の文脈で説明される特定の特徴は、実施形態がそれらの要素なしでは動作しない場合を除いて、それらの実施形態の本質的な特徴と見なされるべきではない。

上記に描写され、以下の特許請求の範囲に記載されている本発明の様々な実施形態及び態様は、以下の実施例において実験的裏付けを見出す。
実施例

ここで、以下の実施例を参照すれば、これらの実施例は、上記の説明と共に、本発明のいくつかの実施形態を非限定的な方法で示している。

一般に、本明細書で使用される命名法及び本発明で利用される実験手順には、分子的、生化学的、微生物学的及び組換えＤＮＡ技術が含まれる。このような手法は、文献で詳しく説明されている。例えば、‘‘Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ’’Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）；‘‘Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ’’Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，‘‘Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ’’，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，‘‘Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ’’，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，‘‘Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ’’，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）‘‘Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ’’，Ｖｏｌｓ．１－４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８０１，５３１号、同第５，１９２，６５９号、及び同第５，２７２，０５７号に記載される方法論；‘‘Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ’’，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；‘‘Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ－Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ’’ｂｙ Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４），Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ；‘‘Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ’’Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），‘‘Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ’’（８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ ａｎｄ Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ），‘‘Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ’’，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）；利用可能な免疫アッセイは、特許及び科学文献に広範に記載さており、例えば、米国特許第３，７９１，９３２号、同第３，８３９，１５３号、同第３，８５０，７５２号、同第３，８５０，５７８号、同第３，８５３，９８７号、同第３，８６７，５１７号、同第３，８７９，２６２号、同第３，９０１，６５４号、同第３，９３５，０７４号、同第３，９８４，５３３号、同第３，９９６，３４５号、同第４，０３４，０７４号、同第４，０９８，８７６号、同第４，８７９，２１９号、同第５，０１１，７７１号、及び同第５，２８１，５２１号；‘‘Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ’’Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．，ｅｄ．（１９８４）；‘‘Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ’’Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８５）；‘‘Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ’’Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８４）；‘‘Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ’’Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，ｅｄ．（１９８６）；‘‘Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ’’ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；‘‘Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ’’Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，（１９８４）ａｎｄ‘‘Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ’’ Ｖｏｌ．１－３１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；‘‘ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ’’，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．，‘‘Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ’’ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照されたい。これらは全て本明細書に完全に記載されているかのように参照することによって組み込まれる。その他の一般的な参照が、この文書全体で提供されている。その中の手順は当該技術分野でよく知られていると考えられており、読者の便宜のために提供されている。そこに含まれるすべての情報は、参照により本明細書に組み込まれる。
材料及び方法
Ｆｃ－ＬＰＤの発現及び精製

ヒトＬＯＸ（２２－１６８）のプロドメインドメイン（配列番号１）をｐＹＤ５哺乳動物発現ベクターにクローニングし、ＤＮＡ－ＰＥＩ比１：２のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）トランスフェクション試薬を用いて、指数増殖期にプラスミドをコンピテントＨＥＫ ２９３－６Ｅ細胞に形質転換した。１２０時間のインキュベーション後、細胞を採取し、上清をＨｉＴｒａｐプロテインＡカラムで精製し、１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８）で平衡化し、溶出を１００ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ３～４．５）によって実施した。
ＬＯＸ触媒ドメインの発現及び精製

配列番号３のヒトＬＯＸ（１６９－４１７）の触媒ドメイン、すなわち配列番号１０を、ｐＥＴ２８発現ベクターにクローニングし、コンピテント大腸菌ＢＬ２１ ＳＨｕｆｆｌｅ株に形質転換した。単一コロニーを、抗生物質を添加した１０ｍｌの液体培地に再懸濁した。１０ｍｌの培養物を使用して、１Ｌの液体培地に接種した。Ｏ．Ｄ_６００が０．４～０．８に達するまで培養物を３０℃でインキュベートし、その後、０．４ｍＭ ＩＰＴＧ誘導剤を添加した。培養物を１６℃、２５０ｒｐｍで一晩インキュベートした。培地を４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。ペレット化した画分を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）、２００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭイミダゾール、リゾチーム、タンパク質阻害剤及びＤＮａｓｅを含有する溶解緩衝液と氷上でインキュベートした後、３０分間凍結した。溶液を超音波処理し、２４，０００ｒｐｍで４０分間遠心分離した。懸濁液を０．２２μＭフィルタで精製し、以下の緩衝液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８，２００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭイミダゾールで予備平衡化したＨｉｓＴｒａｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。タンパク質を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８、２００ｍＭ ＮａＣｌ、４００ｍＭイミダゾールで溶出した。酵素を、ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用するサイズ排除クロマトグラフィーによって精製し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８、２００ｍＭ ＮａＣｌで溶出した。
コラーゲン集合アッセイ

ＨＤＦ細胞をＤＭＥＭ １０％ＦＣＳ培地中３５ｍｍディッシュに播種した。翌日、細胞培養培地に、細胞外マトリクス発現の誘導のため、次の因子、５ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、５ｕｇ／ｍＬのインスリン及び１５０ｕｇ／ｍＬのＬ－アスコルビン酸を、第１の実験ではＦｃ－ＬＰＤの存在下（１ｕＭ及び１０ｕＭ）又は非存在下、そして第２の実験ではＦｃ、Ｆｃ－ＬＰＤ及びＦｃ－ＬＰＤ Ｎ３４６、３６２、４０９Ｑ（５ｕＭ）の存在下で、添加した。ＥＣＭ形成を、２光子顕微鏡法及び第二高調波発生（図２Ｂ～Ｃ）を用いて１～２週間監視した（下記参照）。
ＥＬＩＳＡ結合アッセイ

９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）を、１０μｇ／ｍＬのＬＯＸ触媒ドメイン、ＨＳＰ７０又はＢＳＡでコーティングした。ＰＢＳ中２％ＢＳＡでブロッキングした後、プレートをＦｃ及びＦｃ－ＬＰＤと共に３７℃で１時間インキュベートした。結合した抗体をペルオキシダーゼ結合抗体ヤギ抗ヒト（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）によって検出した。ＥＣ_５０を、Ｆｉｎｄ ＥＣａｎｙｔｈｉｎｇカーブフィッティング分析からＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて計算した。
マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）

ＮＴ－６４７ ｄｙｅ（ＲＥＤ－ｔｒｉｓ－ＮＴＡ）を用いて、ＬＯＸ（２００ｎＭ）（配列番号９）をＭｏｎｏｌｉｔｈ Ｈｉｓ－ｔａｇ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔで標識し、３０分間インキュベートした。Ｆｃ及びＦｃ－ＬＰＤの濃度を増加させ、５０％Ｌａｓｅｒ－ｐｏｗｅｒ、レーザーオン時間３５秒及び４０％ＬＥＤ－ｐｏｗｅｒを有するＭｏｎｏｌｉｔｈ ＮＴ．１１５（Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ、ドイツ）を使用して試料を測定した。
示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）

ＮａｎｏＤＳＦ Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＮＴ．４８は、２０～９５℃の範囲で１℃／分の調節可能な加熱速度で試料を連続的に加熱することによって、内在トリプトファン又はチロシン蛍光を使用してＬＯＸタンパク質安定性の超高解像度を測定し、蛍光及び反射シグナルの両方を同時に読み取る。
免疫沈降

Ｆｃ－ＬＰＤを、製造者の説明書（ＧＥ Ｉ．Ｐビーズ）に従ってプロテインＧビーズ（ＧＥ）上に共有結合的にコーティングした。コーティングしたビーズを、ＨＤＦ細胞の１０ｃｍ^２ディッシュ培養物からの濃縮上清と共に４℃で一晩インキュベートした。ペレットビーズを遠心分離（約５００×ｇ、５分間、４℃）によって得て、ビーズを初期ビーズ体積の少なくとも５倍の体積のＰＢＳで洗浄した。次いで、ビーズペレットを収集カラムに入れ、これを１０ｕｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．９０μｌの溶出緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むエッペンドルフチューブに挿入し、５分間のインキュベーション後に遠心分離によって溶出を行った。最後の工程を４回繰り返した。
Ｆｃ－ＬＰＤの特性評価のための質量分析

ゲルバンドをゲル内トリプシン消化に供し、続いて脱塩工程に供した。得られたペプチドを、高分解能、高質量精度質量分析（Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ）に連結されたナノフロー液体クロマトグラフィー（ｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ）を使用し、ＥＴｈｃＤ断片化を使用してグリカン及びペプチドの両方の断片化を生成して分析した。各試料を発見モードでランダムな順序で別々に分析した。データは、Ｂｙｏｎｉｃ ｖ２．１５．８９で処理した。これは、そのようなデータを処理し、グリカンを識別することができる独自のソフトウェアである。検索は、Ｕｎｉｐｒｏｔヒトデータベースに対して行われ、以下の修飾が可能になった：固定修飾としてのＣのカルバミドメチル化、Ｎ末端、Ｈ又はＫのカルバミドメチル化、Ｎ又はＱ、Ｇｌｕ若しくはＧｌｎのピロ－Ｇｌｕへの脱アミド化、アンモニア喪失、Ｎ－末端アセチル化、ＳＴＫのホルミル化、ＳＴの脱水及び可変的なものとしてのＮ－グリコシル化。データをフィルタリングして、最大１％の誤発見率（ＦＤＲ）を可能にした。
Ｆｃ－ＬＰＤのＩ．Ｐからのゲルバンドを識別するための質量分析

ゲルバンドをゲル内トリプシン消化に供し、続いて脱塩工程に供した。得られたペプチドを、高分解能、高質量精度質量分析（Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ）に連結されたナノフロー液体クロマトグラフィー（ｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ）を使用して分析した。各試料を、発見モードでランダムな順序で別々に装置で分析した。Ｕｎｉｐｒｏｔヒトタンパク質データベースに対して検索されたＰｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒバージョン２．２．０．３８８を使用してデータを処理し、一般的な実験室汚染物質の一覧を追加した。検索は、２つの検索アルゴリズム、すなわちＳｅｑｕｅｓｔＨＴ及びＭａｓｃｏｔを用いて行った。
２光子顕微鏡法及び第二高調波発生

試料の画像を、広帯域Ｍａｉ Ｔａｉ－ＨＰ－フェムト秒単一ボックス調整可能Ｔｉ－サファイア発振器を備えた２ＰＭ：Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ５１０ ＭＥＴＡ ＮＬＯ顕微鏡を使用して撮影し、２０倍及び２５倍の対物レンズを備えた８５５ｎｍ波長（４００ｎｍでの検出）を使用して、Ｓｐｅｃｔｒａ－Ｐｈｙｓｉｃｓから７００ｎｍ～１，０２０ｎｍの自動広帯域波長調整を行った。ＥＣＭの厚さは、ｚスタック（ｕｍ）に基づいて計算した。
画像解析

画像解析を、Ｆｉｊｉ ｐａｃｋａｇｅ［２８］によって行った。Ｆｉｊｉの指示に従って、Ｊｅａｎ－Ｙｖｅｓ Ｔｉｎｅｖｅｚ（ｐａｃｉｆｉｃｄｏｔｍｐｉ－ｃｂｇｄｏｔｄｅ／ｗｉｋｉ／ｉｎｄｅｘｄｏｔｐｈｐ／Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）によって作成されたＦｉｊｉプラグイン「方向性」を使用し、方向性のフーリエ成分分析をデータに対して実施した。エントロピー計算のため、Ｆｉｊｉ ｍａｃｒｏ ＣＤＳ．ｉｊｍを使用して配向分析ファイルを作成し、その後、Ｏ．Ｇｏｌａｎｉ及びＧ．Ｍｏｌｏｄｉｊによって開発され、Ｅ．Ｓｈｉｍｓｈｏｎｉによって修正されたｍａｔｌａｂスクリプトによって平均エントロピーを計算した。
動物実験

初期段階の実験のため、およそ８週齢の雄Ｍｄｘマウス（８匹／群）を使用した。週に１回腹腔内注射により、１つの群を５ｍｇ／ｋｇのＦｃで処置し、第２の群を５ｍｇ／ｋｇのＦｃ－ＬＰＤで処置し、第３の群を５ｍｇ／ｋｇのＦｃ－ＬＰＤ Ｎ３４６、３６２、４０９Ｑで処置した。２週間ごとに、マウスをロータロッドアッセイで試験した。マウスを３ヶ月後に犠牲にし、心臓、横隔膜、前脛骨筋、四頭筋及び腓腹筋を直ちに固定するか又はＯＴＣ中で凍結した。

後期実験のため、約２３～２５週齢の雄Ｍｄｘマウス（１群あたり４匹）を使用した。週に１回腹腔内注射により、１つの群を５ｍｇ／ｋｇのＦｃで処置し、もう１つの群を５ｍｇ／ｋｇのＦｃ－ＬＰＤで処置した。２週間ごとに、マウスをロータロッドアッセイで試験し、１週間おきに、四肢のぶら下がり試験で試験した。マウスを３ヶ月後に犠牲にし、心臓、横隔膜、前脛骨筋及び腓腹筋を直ちに固定するか、又はＯＴＣ中で凍結した。
ロータロッドランニング

ロータロッドランニングアッセイのため、筋力、協調、バランス、及び状態を判断した。マウスを、ロータロッドが５ｒｐｍの遅い定常速度で回転しているときにロータロッドのチューブ上に置いた。マウスを位置決めした後、最初の１５秒間に速度を５から４５ｒｐｍに加速し、次いでその速度を維持した。走行時間をソフトウェアによって連続的に記録し、マウスがチューブから落ちたときに自動的に停止した。走行中にマウスがチューブ上で反対方向を向いた場合、チューブの回転を止めることなく再配置を行った。
ぶら下がり試験

ぶら下がり試験により、バランス、協調及び筋肉状態を評価することができる。この試験は、マウスが消耗するまでワイヤ又はグリッドにぶら下がったままでいたいという知識に基づいていた。具体的には、ラット用の大きなケージの蓋を使用した。尾を持って（ｔａｉｌ ｈａｎｄｌｉｎｇ）マウスをグリッドに近づけた。マウスに４本の足でグリッドを掴ませた。マウスがぶら下がるようにグリッドを反転させ、直接タイマーを開始した。マウスがワイヤから落ちた後、タイマーを止め、ぶら下がった時間の記録に印をつけた。
組織化学

以前に記載されるように（Ｒｏｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，２００８）、２つの異なる組織調製プロトコル（パラフィン包埋及びミクロトーム凍結切片）を適用した。スライドをヘキスト染色（１：４，０００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｐｒｏｂｅｓ）に１分間曝露した。シリウスレッド染色を行って、Ｉ型及びＩＩＩ型のコラーゲンを標識し、ＩＩＩ型コラーゲンについてはレティキュリン染色し、周囲の結合組織から細胞を区別するためのマッソントリクローム染色を行った。顕微鏡分析には、Ｎｉｋｏｎデジタルカメラ（ＤＳ－Ｒｉ１）を備えたＮｉｋｏｎ光学顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ８００）を使用した。
酵母表面ディスプレイ発現

コンストラクトを増幅し、ＡＧＡ２遺伝子、Ｎ末端ＨＡタグ及びＣ末端ＭｙｃタグとインフレームでｐＥＴＣＯＮ（ＬＰＤ）プラスミドにクローニングした。次いで、コンストラクトをＥＢＹ１００（サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））株に形質転換し、選択のためＳＤ－Ｔｒｐプレートに播種した。３０℃で４８時間インキュベートした後、単一コロニーをコロニーＰＣＲに供した。予想されるバンドサイズを満たす断片をＰＣＲ精製し、配列決定した。

コンストラクトをＳＤ－ＣＡＡ^１４３培地中で３０℃、最大０．８ ＯＤ_６００まで培養し、その時点で細胞をペレット化し、新鮮なＳＧ－ＣＡＡ^１４３培地中で１５℃で３８時間誘導した。ディスプレイされたタンパク質発現を、２つの相補的分析：フローサイトメトリー及び活性アッセイ（ｗｔコンストラクトについて）で測定した。

３×１０^７個の完全に誘導された細胞をペレット化し、２回の連続洗浄で洗浄した。各洗浄は、０．８ｍｌのＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ緩衝液（洗浄緩衝液）への再懸濁、３０秒間の遠心分離及び１３ｋＲＰＭからなる。洗浄した細胞を、２００μｌの洗浄緩衝液中でα－ｃ－Ｍｙｃ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ９ｅ１０、１：５０希釈）と共に室温で４５分間インキュベートし、２回洗浄した。細胞を二次ヤギαマウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的）－ＦＩＴＣ抗体（Ｓｉｇｍａ Ｆ４１４３、１：５０希釈）で更に３０分間、２００μｌ、４℃で標識した。

発現及びα－ｃ－Ｍｙｃ／ＦＩＴＣ標識後、３．３×１０^６個のＥＢＹ１００細胞を２回洗浄し、ビオチン化ペプチド（３０～１００μＭ）を含む２００μｌの洗浄緩衝液を補充し、室温で２時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄緩衝液で２回洗浄し、１００μｌの洗浄緩衝液中の１：１００希釈ストレプトアビジン－ＡＰＣ（アロフィコシアニン－ストレプトアビジン、０．５ｍｇ／ｍｌ、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と共に氷上で更に３０分間インキュベートした。ＬＰＤ－ＨＳＰ７０相互作用のため、細胞を、Ａｔｔｏ ６３３色素（Ｓｉｇｍａ ５１２５３）で標識したＨＳＰ７０と共にＲＴで３０分間インキュベートした。最後に、細胞を２回洗浄し、７０μｍメッシュナイロンストレーナーで濾過し、１．６ｍｌの洗浄緩衝液で希釈した。これらの後にフローサイトメトリー分析を行い、データをＦｌｏｗ Ｊｏソフトウェアによって分析した。
統計学的分析

全ての分析を少なくとも３回行った。統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７を使用して行った。

グリコシル化変異体の場合の材料及び方法。
実施例１
Ｆｃ－ＬＰＤの発現及び特性評価

ＤＭＤにおける細胞外ＬＯＸ活性を分析し、疾患進行中の線維化を明らかにするため、ＬＯＸの内因性阻害剤を用いてタンパク質操作された阻害剤を開発した。具体的には、自己阻害性ＬＰＤ（配列番号２に示されるヌクレオチド配列によってコードされる配列番号１）を選択して、ＬＯＸの活性化形態を阻害した（図１Ａ）。プロドメインが安定でなく、それらの産生が困難に直面するという事実に基づいて、Ｆｃタグに融合したＬＰＤ（配列番号８に示されるヌクレオチド配列によってコードされる配列番号７）を、機能性を高めるために作製した。重要なことに、Ｆｃ－ＬＰＤ（配列番号６に示されるヌクレオチド配列によってコードされる配列番号５）は二量体形成で発現され、およそ９５ｋＤａの分子サイズの最小化された抗体様阻害剤を作り出す（図１Ｂ）。哺乳動物細胞、ＨＥＫ２９３－６Ｅでの発現後、細胞培養培地をプロテインＡカラムによって精製し、機能アッセイの評価を開始する前に、純粋なＦｃ－ＬＰＤをＰＢＳ中で透析した。

Ｆｃ－ＬＰＤの結合親和性及び阻害活性の評価を、ＥＣ_５０及び解離定数（Ｋ_Ｄ）をそれぞれ測定することによって結合親和性を推定して行った。生成されたＦｃ－ＬＰＤ阻害剤のＥＣ_５０を、ＬＯＸ触媒ドメインに対して１０ｎＭ～２０００ｎＭの範囲のＥＬＩＳＡ（図１Ｃ）によって測定した（ＥＣ_５０＝４３ｎｍｏｌ／Ｌ）。Ｆｃ－ＬＰＤ（２７ｎｍｏｌ／Ｌ）の解離定数（Ｋ_Ｄ）をマイクロスケール熱泳動によって決定したが（図１Ｄ）、阻害剤のＦｃ領域で相互作用は検出されなかった。Ｆｃ－ＬＰＤの超高分解能安定性を示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）で測定し、遷移中点を７０℃で特定し、Ｆｃ－ＬＰＤが溶液中で安定であることを示した（図１Ｆ、１Ｇ）。

Ｆｃ－ＬＰＤの精製後、還元状態又は非還元状態の試料のＳＤＳ－ｐａｇｅ分析は、混合物集団を示した。ＬＰＤは３つの異なるＮ－グリコシル化部位について知られており、発現が哺乳動物発現系で行われたため、異なるサイズバンド（４５ｋＤａ及び６０ｋＤａ）をＭＳによって分析した。結果は、Ｎ８１－グリコシル化（本発明のコンストラクトのＮ３４６）が、４５ｋＤａのＦｃ－ＬＰＤ及び６０ｋＤａのバンド（図１Ａ）において２０３～２７９０Ｄａの範囲の複数のグリコフォームを有する両方のバンドにおいて検出されたが、６０ｋＤａバンドの場合はより頻度が高かったことを示した。Ｎ１４４－グリコシル化（コンストラクト中のＮ４０９）部位は、４５及び６０ｋＤａのＦｃ－ＬＰＤの両方で再び検出され、グリカンの範囲は２０３～３８０９Ｄａであった。Ｎ９７－グリコシル化部位（コンストラクト中のＮ３６２）は、４５ｋＤａのＦｃ－ＬＰＤ及び６０ｋＤａのバンドにおいて２０３～２４９９Ｄａの範囲のα－溶解性プロテアーゼ（Ｓｉｇｍａ Ａ６３６２）による消化後にのみ、４５及び６０ｋＤａバンドの両方で検出された。最後に、両方のバンドのＦｃ領域におけるもう１つのグリコシル化部位が特定され、１３００～１８００Ｄａのサイズのいくつかのグリコフォームを有する。図１Ａでは、Ｆｃ（配列番号５）の存在のために、アミノ酸位置がシフトしてＮ８１、９７、１４４がＮ３４６、３６２、４０９になっている。
実施例２
コラーゲン線維集合体を妨害するＦｃ－ＬＰＤ能力の特定

ＬＯＸの酵素活性に対するＦｃ－ＬＰＤの効果を、活性化ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ系で調べた。詳細には、高度な顕微鏡ツールによってコラーゲン架橋反応の特定の事象及び段階をモニターするためのスクリーニングシステムを開発した（図２Ａ）。ＨＤＦ細胞を、ＥＧＦ、インスリン及びＬ－アスコルビン酸を含有する活性化培地と共に培養し、ＥＣＭ分子、主にコラーゲンの発現を誘導した。Ｆｃ－ＬＰＤの有無にかかわらず、二光子ＳＨＧ顕微鏡法による原線維性コラーゲンの集合をモニタリングすると、新たに設計されたＦｃ－ＬＰＤはコラーゲン架橋及び集合の進行段階を標的とすることが特定された。これらの結果は、Ｆｃ－ＬＰＤによるＬＯＸ媒介性コラーゲン架橋の阻害が、天然の線維芽細胞由来３Ｄマトリクス足場におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでの正常なコラーゲン原線維アライメントの配向を変化させることを実証している（図２Ｂ）。

さらに、ＨＤＦ細胞を、Ｆｃ、Ｆｃ－ＬＰＤ及びＦｃ－ＬＰＤ Ｎ３４６、３６２、４０９Ｑ（５ｕＭ）の存在下でＥＣＭ活性化培地と共に培養した。培養の７日後、コラーゲン線維を二光子ＳＨＧ顕微鏡でモニターし、線維配向の破壊を観察した（図２Ｃ）。Ｆｃ－ＬＰＤ Ｎ３４６、３６２、４０９Ｑを含有する系におけるエントロピーの有意な増加が実証された（図２Ｄ）。さらに、ＥＣＭ厚さ（ｚスタック）の測定は、Ｆｃ－ＬＰＤ－及びＦｃ－ＬＰＤ Ｎ３４６、３６２、４０９Ｑ－処置細胞におけるＥＣＭ産生の有意な減少を強調した（図２Ｅ）。
実施例３
種々のＦｃ－ＬＰＤグリコシル化形態の相互作用

Ｆｃ－ＬＰＤとＨＤＦによって分泌されたタンパク質との相互作用を、ＨＤＦ細胞からの上清を用いた免疫沈降実験によって調べた。この目的のため、ＨＤＦ細胞を、１０ｍｌの無血清及び無フェノールレッド培地中、６０ｃｍ^２ディッシュで３日間培養した。培地を収集し、１０ｋＤａカットオフのｖｉｖａｓｐｉｎフィルタを使用して濃縮し、４５ｋＤａのＦｃ－ＬＰＤ及び６０ｋＤａのＦｃ－ＬＰＤと別々にインキュベートし、これを予めゲル濾過によって半分離し、プロテインＧビーズとインキュベートした（図３Ａ）。試料をＳＤＳ－ｐａｇｅ及びウエスタンブロットによって分析した。２つの試料のＳＤＳページ分析では、２つの高分子量バンドが検出され、ＭＳによって分析されたが（図３Ｂ）、ウエスタンブロット実験ではＬＯＸ（３０ｋＤａ）が検出され、ｉｎ ｖｉｔｒｏの生理学的条件でＬＯＸに結合するＦｃ－ＬＰＤの能力を強調した（図３Ｃ）。ＭＳデータの分析は、両方のＦｃ－ＬＰＤ形態と、コアマトリソーム又はマトリソーム関連のいずれかの部分であるＥＣＭ分子との相互作用を示した。具体的には、共免疫沈降タンパク質の中には、ＥＣＭ糖タンパク質（フィブロネクチン及びトロンボスポンジン－１）、ＥＣＭ調節因子（セルピンＢ１２、Ａ２－マクログロブリン）、分泌因子（フィラグリン－２、ホルネリン）、細胞外領域又は分泌タンパク質（ＨＳＰ７０、ａ２－ＨＳ－糖タンパク質等）及び他のタンパク質があった（以下の表１）。これらの相互作用は、Ｆｃ－ＬＰＤとの直接的な相互作用である。ＨＳＰ７０は重要な相互作用因子として特定されたため、ＥＣ_５０を測定することによって結合親和性を推定することによって、Ｆｃ－ＬＰＤ及びＦｃ－ＬＰＤ Ｎ３４６、３６２、４０９Ｑの結合親和性の評価を行った。生成されたＦｃ－ＬＰＤ及びＦｃ－ＬＰＤ Ｎ３４６、３６２、４０９Ｑ阻害剤のＥＣ_５０を、ＨＳＰ７０に対して１０～２０００ｎＭの範囲のＥＬＩＳＡ（図３Ｄ）によって測定した（ＥＣ_５０＝４１ｎｍｏｌ／Ｌ）。さらに、この相互作用の直接的な結合及び高い親和性は、酵母表面ディスプレイで証明された。酵母細胞は細胞表面にＬＰＤを発現し、標識ＨＳＰ７０を溶液に添加した。ＲＴでの３０分間のインキュベーション後、相互作用をフローサイトメトリーによって測定し、ＬＰＤ陽性細胞のかなりの集団がＨＳＰ７０への結合について陽性であった（図３Ｅ）。

実施例４
Ｆｃ－ＬＰＤ及びＦｃ－ＬＰＤ Ｎ３４６、３６２、４０９Ｑによる処置後のＤＭＤ筋線維症のｉｎ ｖｉｖｏ評価

ＬＯＸ阻害剤がＤＭＤバックグラウンドにおいてｉｎ ｖｉｖｏで筋線維症を減弱させることができるかどうか、したがって、それがＤＭＤ又は他の線維性疾患を処置するための新規な経路として使用され得るかどうかを試験するため、ｍｄｘマウスを用いた２つの実験を行った。

初期段階のモデルでは、２月齢の雄ｍｄｘマウスに、５ｍｇ／ｋｇのＬＯＸ阻害剤（Ｆｃ－ＬＰＤ＆Ｆｃ－ＬＰＤ Ｎ３４６、３６２、４０９Ｑ）又は対照抗体（Ｆｃ）を週に１回注射した（各群ｎ＝８）（図４Ａ）。処置中、ロータロッド走行等の機能的筋肉アッセイを行ったが、Ｆｃ－ＬＰＤ及びＦｃ－ＬＰＤ Ｎ３４６、３６２、４０９Ｑによる処置後に有意な改善は観察されなかった（図４Ｂ）。処置を開始してから３ヶ月後（合計１１回の抗ＬＯＸ注射）、マウスを回収し、筋線維症の組織学的分析（心臓、四頭筋、腓腹筋、前脛骨筋及び横隔膜）を、シリウスレッド染色及び二光子第二高調波発生顕微鏡法を使用して行い、生来のコラーゲン線維をモニターした。

具体的には、横隔膜組織のＨ＆Ｅ染色は、Ｆｃ－ＬＰＤ及びＦｃ－ＬＰＤ Ｎ３４６、３６２、４０９Ｑによる処置後に、ＤＭＤ病理組織で観察される中心核病理学的表現型の有意な改善を示した（図４Ｃ）。さらに、横隔膜のシリウスレッド染色は、Ｆｃ－ＬＰＤ及びＦｃ－ＬＰＤ Ｎ３４６、３６２、４０９Ｑマウスにおいて線維性コラーゲン沈着の約１５％及び約２０％の有意な減少をそれぞれ示した（図４Ｄ～Ｅ）。興味深いことに、腓腹筋の場合、有意に少ない中心有核筋線維が観察された（図４Ｆ）。シリウスレッドで染色した後のコラーゲン沈着は、Ｆｃ対照と比較してＦｃ－ＬＰＤ＆Ｆｃ－ＬＰＤ Ｎ３４６、３６２、４０９Ｑの場合に約４５％の減少を示した（図４Ｇ～Ｈ）。四頭筋組織を調べることによって、抗ＬＯＸ処置マウスとＦｃ処置マウスとの間でコラーゲン沈着量の有意な減少は観察されなかった（図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ）。しかしながら、Ｆｃ－ＬＰＤ Ｎ３４６、３６２、４０９Ｑで処置した後の二光子ＳＨＧ顕微鏡法による四頭筋組織の線維性コラーゲンの更なるモニタリングは、コラーゲン線維シグナルの有意な減少（約２６％）を示した。Ｆｃ－ＬＰＤ Ｎ３４６、３６２、４０９Ｑ処置マウスにおけるコラーゲン線維の減少は、四頭筋の筋内膜のみで分析を行った場合に有意であった（約３４％）。最後の組織を、前脛骨筋の２光子ＳＨＧ分析による初期段階のモデルで分析した。コラーゲン線維は、対照Ｆｃと比較して、Ｆｃ－ＬＰＤ処置マウスでは約５３％、Ｆｃ－ＬＰＤ Ｎ３４６、３６２、４０９Ｑ処置マウスでは約７６％減少した。

後期段階では、６月齢の雄ｍｄｘマウスに、５ｍｇ／ｋｇのＬＯＸ阻害剤（Ｆｃ－ＬＰＤ）又は対照抗体（Ｆｃ）（各群についてｎ＝４）を週に１回注射した（図６Ａ）。処置中に、ロータロッド走行及びぶら下がり試験等の機能的筋肉アッセイを実施したところ、Ｆｃ－ＬＰＤ処置後に有意な改善が観察された（図６Ｂ、６Ｃ）。処置を開始してから２ヶ月後（合計８回の抗ＬＯＸ注射）、マウスを回収し、筋線維症の組織学的分析（心臓、前脛骨筋及び横隔膜）を、シリウスレッド染色及び二光子第二高調波発生顕微鏡法を使用して行い、生来のコラーゲン線維をモニターした。最後に、筋組織切片の組織病理学的分析を行って、炎症、壊死及び筋線維成熟度の読み出しとしての平均線維直径をモニターした。

具体的には、前脛骨筋（ＴＡ）のシリウスレッド染色は、ＬＯＸ阻害マウスにおける原線維コラーゲン沈着の５０％の減少を実証した（図６Ｄ_{ｉｉｉ、ｉｖ}、６Ｅ、６Ｇ）。この染色により、結合組織（主にコラーゲン線維）が対照筋肉に拡散していることが更に明らかになった。対照的に、Ｆｃ－ＬＰＤで処置されたものはより鋭く、より明確であり、真円度比によってモニターされるように筋肉がより良好に組織化された（図６Ｆ）。ｍｄｘマウスの前脛骨組織の組織学的評価は、炎症グレード（約２５％）及び線維症スコア（約５０％）の低下を示した。二光子ＳＨＧ顕微鏡法によってその天然の非標識状態の原線維コラーゲンの集合をモニターすると、Ｆｃ－ＬＰＤで処置した後、より直線的な方向を有するより少ないコラーゲン線維シグナルが観察された。方向性繊維配向の変化を定量化するために、ＳＨＧによって得られた代表的な画像に対する方向性についてのフーリエ成分分析を適用した（図６Ｄ_ｖ、ｖｉ、６Ｈ）。さらに、２光子ＳＨＧ画像は、Ｆｃ処置組織には存在しないＦｃ－ＬＰＤ処置組織の太い線維束を示した。まとめると、これらの結果は、マウスをこの抗ＬＯＸ分子で処置することにより、ＤＭＤバックグラウンドにおける線維症の蓄積が阻害されることを実証している。

心臓組織を検査することにより、Ｆｃで処置されたマウスと比較した場合、Ｆｃ－ＬＰＤ処置マウスにおいて心臓コラーゲン沈着量の有意な約５０％の減少が観察された（図７Ｄ、７Ｅ）。実験の開始時（６～７月齢のｍｄｘマウス）では、心筋及びＴＡ筋は高度に線維化していなかったが、横隔膜は著しく影響を受けたため、抗ＬＯＸ処置が既に線維化した組織の緩和を促進できるかどうかを試験するためのモデルとして役立つ。採取したマウスの横隔膜のシリウスレッド染色は、心筋及びＴＡ筋で観察されたものと同様のパターンを示し、コラーゲン沈着量の減少が観察された（図７Ａ、７Ｃ）。同様に、実施された病理学者の報告は、線維症スコアの約２０％の低下を示唆した（Ｆｃ処置で２５％対Ｆｃ－ＬＰＤ処置で２１％）。（図７Ｂ）。
実施例５
ＬＰＤ活性に対するグリコシル化部位の有意性の分析
クローニング及び特性評価

ｐＹＤ５－Ｆｃ－ＬＰＤプラスミドをテンプレートとして使用して、ＬＰＤの３つのＮ－グリコシル化部位Ｎ８１、９７、１４４に点変異を作製した（これらは、Ｑ配列番号１１を有する本発明者らのＦｃ－ＬＰＤコンストラクトにおけるＮ３４６、３６２、４０９である）。キット製造業者の説明書に従って部位特異的突然変異誘発を用いて突然変異を実施した。作製されたＦｃ－ＬＰＤ Ｎ３４６、３６２、４０９Ｑ阻害剤のＥＣ_５０を、ＬＯＸ触媒ドメインに対して１０～２０００ｎＭの範囲のＥＬＩＳＡ（図１Ｃ）によって測定した（ＥＣ_５０＝５８ｎｍｏｌ／Ｌ）。
免疫沈降

Ｆｃ－ＬＰＤを製造業者の説明書に従って磁性プロテインＧビーズ（ＧＥ）上にコーティングした。コーティングしたビーズを、ＨＤＦ細胞の１０ｃｍ^２ディッシュ培養物からの濃縮上清と共に４℃で一晩インキュベートした。ペレットビーズを遠心分離（約５００ｇ、５分間、４℃）によって得て、ビーズを初期ビーズ体積の少なくとも５倍の体積のＰＢＳで洗浄した。次いで、ビーズペレットを収集カラムに入れ、これを１０ｕｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．９０ｕｌの溶出緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むエッペンドルフチューブに挿入し、５分間のインキュベーション後に遠心分離によって溶出を行った。最後の工程を４回繰り返した。
Ｆｃ－ＬＰＤのＩ．Ｐからのゲルバンドを識別するための質量分析

試料を５％ＳＤＳで溶出し、Ｓトラップを用いてトリプシン消化した。得られたペプチドを、高分解能、高質量精度質量分析（Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦＸ）に連結されたナノフロー液体クロマトグラフィー（ｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ）を使用して分析した。各試料をＭａｘＱｕａｎｔ ｖ１．６．０．１６で処理した。共通の実験タンパク質夾雑物及び以下の修飾：固定修飾としてのＣのカルバミドメチル化並びに可変修飾としてのＭの酸化及びタンパク質Ｎ末端アセチル化が付加されたヒトプロテオームデータベースに対して、Ａｎｄｒｏｍｅｄａ検索エンジンを用いてデータを検索した。ＬＦＱ強度（無標識定量）を計算し、Ｐｅｒｓｅｕｓ ｖ１．６．０７を使用して更なる計算に使用した。デコイヒット、並びに修飾ペプチドのみに基づいて同定されたタンパク質を除外した。ＬＦＱ強度を対数変換し、少なくとも１つの実験群において少なくとも２つの有効値を有するタンパク質のみを保持した。ＧＯアノテーションを追加した。
結果

Ｆｃ－ＬＰＤは３つのグリコシル化部位を有し、グリコシル化の重要性を調べるために、新たなコンストラクトＦｃ－ＬＰＤ－Ｎ３４６、３６２、４０９Ｑを作製した。Ｆｃ（対照として）を含むこれらの２つのタンパク質を使用して、実施例３のように、ＨＤＦ細胞の上清中のＥＣＭタンパク質とのＬＰＤの相互作用を明らかにした。この目的のため、ＨＤＦ細胞を、１０ｍｌの無血清及び無フェノールレッド培地中、６０ｃｍ^２ディッシュで３日間培養した。培地を収集し、１０ｋＤａカットオフのｖｉｖａｓｐｉｎフィルタを用いて濃縮し、Ｆｃ、Ｆｃ－ＬＰＤ及びＦｃ－ＬＰＤ－Ｎ３４６、３６２、４０９Ｑとインキュベートし、これを磁性プロテインＧビーズ中でプレインキュベートした。免疫沈降溶出液を質量分析によって分析し、ＭＳデータの分析は、両方のＦｃ－ＬＰＤ形態と、コアマトリソーム又はマトリソーム関連のいずれかの部分であるＥＣＭ分子との相互作用を示した。具体的には、共免疫沈降タンパク質の中には、ＥＣＭ糖タンパク質（ナイドジェン－１）、分泌因子（フィラグリン－２、ホルネリン）、細胞外領域又は分泌タンパク質（ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ６０）があった。Ｆｃ－ＬＰＤとＦｃ－ＬＰＤ－Ｎ３４６、３６２、４０９Ｑとの間の定量化された比が異なるタンパク質間で区別されたことは注目に値する。例えば、グリコシル化されていない形態とＦｃ対照との比は、グリコシル化Ｆｃ－ＬＰＤとＦｃとの比と比較して、Ｎｉｄｏｇｅｎ－１及びＨＳＰ７０で有意に高かった。（以下の表２）：

本発明をその特定の実施形態と併せて説明してきたが、多くの代替形態、修正形態及び変形形態が当業者には明らかであることは明らかである。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲の趣旨及び広い範囲内にあるすべてのそのような代替形態、修正形態及び変形形態を包含することが意図されている。

本明細書で言及されるすべての刊行物、特許及び特許出願は、個々の刊行物、特許又は特許出願が参照により本明細書に組み込まれることが具体的かつ個別に示された場合と同程度に、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。更に、本出願における参考文献の引用又は識別は、そのような参考文献が本発明の先行技術として利用可能であることを認めるものと解釈されるべきではない。欄の見出しが使用されている限り、それらは必ずしも限定的であると解釈されるべきではない。更に、本出願の優先権書類（複数可）は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
参考文献
（他の参考文献が本出願において引用される）

REFERENCES
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Claims (32)

1. ヒトリジルオキシダーゼ（ＬＯＸ）のプロペプチドを含む合成ポリペプチドであって、前記ポリペプチドがＬＯＸ触媒活性を欠き、前記合成ポリペプチドに、生理学的条件下で、前記修飾を含まない前記ポリペプチドの天然型と比較して強化された安定性を付与する修飾を含む、合成ポリペプチド。
2. 前記修飾がタンパク質性修飾を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
3. 前記タンパク質性修飾が、免疫グロブリン、ヒト血清アルブミン及びトランスフェリンからなる群から選択される、請求項２に記載のポリペプチド。
4. 前記免疫グロブリンがＦｃドメインを含む、請求項３に記載のポリペプチド。
5. キメラポリペプチドである、請求項２、３又は４に記載のポリペプチド。
6. 前記修飾が化学修飾を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
7. 前記化学修飾がポリマーである、請求項６に記載のポリペプチド。
8. 前記ポリマーが、ポリカチオン性ポリマー、非イオン性水溶性ポリマー、ポリエーテルポリマー及び生体適合性ポリマーからなる群から選択される、請求項７に記載のポリペプチド。
9. リジルオキシダーゼ（ＬＯＸ）のプロペプチドを含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドがＬＯＸ触媒活性を欠き、線維症の処置を必要とする被験体における線維症の処置に使用され、前記使用がＤ－ペニシラミンの投与を含まない、ポリペプチド。
10. リジルオキシダーゼ（ＬＯＸ）のプロペプチドを含むポリペプチドであって、ＬＯＸ触媒活性を欠き、ＤＭＤの処置を必要とする被験体におけるＤＭＤの処置に使用される、ポリペプチド。
11. 前記ポリペプチドが、配列番号１のＮ８１、Ｎ９７及びＮ１４４の少なくとも１つにおいてグリコシル化されている、請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
12. 前記ポリペプチドが、配列番号１のＮ８１、Ｎ９７及びＮ１４４のうち少なくとも２つにおいてグリコシル化されている、請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリペプチド又は使用のためのポリペプチド。
13. 前記ポリペプチドが、配列番号１のＮ８１、Ｎ９７及びＮ１４４においてグリコシル化されている、請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリペプチド又は使用のためのポリペプチド。
14. 前記ポリペプチドが、配列番号１のＮ８１、Ｎ９７及びＮ１４４においてグリコシル化されていない、請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリペプチド又は使用のためのポリペプチド。
15. 前記ポリペプチドが、ＥＬＩＳＡアッセイによって決定される場合、１００～５００ｎＭのＥＣ５０を特徴とする、請求項１～１３のいずれか一項に記載のポリペプチド又は使用のためのポリペプチド。
16. 前記ポリペプチドが、マイクロスケール熱泳動によって決定される場合、１０～１００ｎＭのＫＤを特徴とする、請求項１～１５のいずれか一項に記載のポリペプチド又は使用のためのポリペプチド。
17. 前記ポリペプチドが、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）によって決定される場合、２０～７０℃の遷移中点を特徴とする、請求項１～１６のいずれか一項に記載のポリペプチド又は使用のためのポリペプチド。
18. 前記ポリペプチドが、ＳＨＧ顕微鏡法によって決定される場合、線維性コラーゲン及び架橋コラーゲンのうち少なくとも１つを減少させることができる、請求項１～１７のいずれか一項に記載のポリペプチド又は使用のためのポリペプチド。
19. 前記ポリペプチドが、ＳＨＧ顕微鏡法によって決定される場合、コラーゲン線維の配向を変化させることができる、請求項１～１８のいずれか一項に記載のポリペプチド又は使用のためのポリペプチド。
20. 前記線維症がＲａｓシグナル伝達依存性ではない、請求項９～１９のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
21. 前記線維症が癌又は骨疾患に関連していない、請求項２０に記載の使用のためのポリペプチド。
22. 前記リジルオキシダーゼ（ＬＯＸ）のプロペプチドがヒトＬＯＸのものである、請求項９～２１のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
23. 前記ポリペプチドが、請求項１～８及び１１～１９のいずれか一項に記載のものである、請求項９～２２のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
24. 前記使用がＤ－ペニシラミンを含まない、請求項９～２３のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
25. ＬＯＸの酵素活性を阻害する方法であって、前記ＬＯＸを請求項１～８及び１１～１９のいずれか一項に記載のポリペプチドと接触させ、それにより、前記ＬＯＸの酵素活性を阻害することを含む、方法。
26. ｉｎ－ｖｉｖｏで実施される、請求項２５に記載の方法。
27. ｉｎ－ｖｉｔｒｏで実施される、請求項２５に記載の方法。
28. ｅｘ－ｖｉｖｏで実施される、請求項２５に記載の方法。
29. 請求項１～８、１１～１９のいずれか一項に記載のポリペプチドを製造する方法であって、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞において発現させ、必要に応じて前記化学修飾により前記ポリペプチドを修飾し、それにより前記ポリペプチドを製造することを含む、方法。
30. 前記宿主細胞から前記ポリペプチドを単離することを更に含む、請求項２９に記載の方法。
31. 前記ポリペプチドが、配列番号１又は５に示される通りである、請求項１～２８のいずれか一項に記載のポリペプチド又は方法。
32. 請求項１～８及び１１～１９のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。

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