CN113881701B - 一种阳性转染细胞亲和分选方法及试剂盒 - Google Patents

一种阳性转染细胞亲和分选方法及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN113881701B
CN113881701B CN202111049960.3A CN202111049960A CN113881701B CN 113881701 B CN113881701 B CN 113881701B CN 202111049960 A CN202111049960 A CN 202111049960A CN 113881701 B CN113881701 B CN 113881701B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
sorting
cell
affinity
transfected
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202111049960.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113881701A (zh
Inventor
黄启来
杨乐乐
马树敏
左晴晴
崔莉方
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong University
Original Assignee
Shandong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong University filed Critical Shandong University
Priority to CN202111049960.3A priority Critical patent/CN113881701B/zh
Publication of CN113881701A publication Critical patent/CN113881701A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113881701B publication Critical patent/CN113881701B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C12N5/0683—Cells of the male genital tract, e.g. prostate, epididymis; Non-germinal cells from testis, e.g. Leydig cells, Sertoli cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
    • C12N5/0686—Kidney cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C12N5/0694—Cells of blood, e.g. leukemia cells, myeloma cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种阳性转染细胞亲和分选试剂盒及方法。为了克服难转染细胞中基因递送效率低的难题，本发明提供了一种亲和细胞分选系统，可有效分选转染阳性细胞。本发明构建了一系列可靶向定位细胞膜外表面的细胞亲和纯化标签，在转染阳性的细胞中表达带有亲和标签的EGFP荧光蛋白，并在GPI膜定位信号的作用下定位到细胞膜表面，基于亲和标签和配体之间的高亲合性相互作用，通过配体偶联的磁珠将转染阳性的细胞分离进行检测和定量。该分选方法在操作简单、分选获得的细胞损伤较小，对基因表达和功能具有较小的干扰，可继续培养或直接用于下游实验，尤其适合在难转染细胞中解决转染效率低的难题。

Description

一种阳性转染细胞亲和分选方法及试剂盒
技术领域
本发明属于阳性转染细胞分选技术领域，具体涉及一种表达框、包含所述表达框的表达载体、试剂盒，以及一种基于细胞膜表面定位荧光蛋白标签阳性转染细胞分选方法及应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
近年来，体外基因传递研究取得了重大进展。不管是病毒介导还是非病毒介导的基因传递，对于大多数细胞都可以得到较高的转染效率，然而在难以转染的细胞比如淋巴瘤/白血病细胞以及原代细胞中的转染效率却依旧不如人意。如何在难转染细胞中进一步提高阳性率成为以这些细胞为基础的功能研究的关键问题。
在转染效率无法进一步提高的情况下，通过细胞分选从转染的细胞混合物中富集阳性细胞是一种有效的提高阳性细胞比例的策略。现有的方法主要包括抗生素药物筛选，流式细胞荧光分选(FACS)和磁性细胞分选(MACS)等方法。由于不需要特殊的设备，用带有编码抗药性基因的质粒载体实现耐药性阳性细胞筛选的方法在细胞生物学和基因功能研究中得到了广泛的应用。然而，一方面筛选药物的毒性可能会对研究结果带来不可预知的影响，另一方面，该方法更适合用于贴壁细胞的筛选，在悬浮细胞中因为难以分离死亡与存活的细胞而受到限制。并且，由于每种细胞株对药物的敏感性存在较大的差异，在实际应用中需要设计预实验来探索合适的抗生素浓度，使其仅杀死未发生转染的阴性细胞，让具有耐药性的转染阳性细胞存活下来，因此，存在操作复杂以及实验周期较长的问题。FACS方法通过在质粒载体上引入荧光蛋白的表达框，如EGFP,mCherry,RFP,YFP,BFP等，依据转染阳性细胞具有的荧光特性在流式细胞仪上实现阳性细胞的分选。该方法需要有分选功能的流式细胞仪，仪器价格昂贵，实验成本高，通量小，受限于仪器的分选速度，且耗时长。MACS方法则借助磁性微球偶联蛋白抗体和靶细胞表面标记蛋白的相互作用，使转染阳性细胞在外部磁场中实现分离。比如，通过质粒载体在细胞表面表达小鼠H-2Kk16、LNGFR17等分子，然后用可与H-2Kk亲和结合的磁珠、或者与LNGFR分子的融合标签亲和结合的磁珠孵育，可实现转染阳性细胞的分选。然而这些分子本身具有重要的生物学功能，在细胞表面过量表达这些分子可能会严重干扰细胞的基因表达和表型，给实验研究带来潜在的不可预知的影响。
因此目前本领域仍缺少一种操作快速、简单，成本低，适用性广，并且对细胞干扰较小的富集转染阳性细胞的方法。
发明内容
为了克服现有转染阳性细胞分选系统的局限性，本发明构建了一种新的基于磁珠亲和分选的细胞分离系统，可快速、高效的富集转染阳性细胞。
具体的，本发明提供以下技术方案：
本发明主要的技术贡献在于，构建了一种可高效分选转染阳性细胞的亲和分选系统，通过在表达载体上编码融合了膜定位信号、亲和标签标记的荧光蛋白，荧光蛋白和膜定位信号在转染阳性的细胞融合表达。基于该亲和分选系统，膜定位信号将荧光蛋白定位到细胞膜外表面，确保技术人员可以直观的通过流式细胞仪或者荧光显微镜来评估转染阳性细胞比例，另一方面，荧光蛋白上融合的亲和标签让技术人员可以通过磁珠分选的方式来快速高效的分离转染阳性细胞。
此外，荧光蛋白的表达还允许在实验过程中通过荧光显微镜评估转染或者病毒感染的效率，以及通过流式细胞仪评估分选前后细胞的阳性率。该转染阳性细胞分选方法操作简单、方便快捷、成本低，适用各种细胞类型，易于通过并行操作扩大细胞分选的通量和规模。将该分选标签的表达框插入到其他类型的载体上，即可将该转染阳性细胞的分选方法应用于各种类型的实验研究，包括基因过表达分析，基因敲降分析，报告基因分析、基因编辑分析以及相关的细胞功能研究实验等。
针对上述技术构思进行优化的方案中，本发明所述荧光蛋白优选绿色荧光蛋白(EGFP)。使用EGFP荧光蛋白作为标签可直观的确定转染阳性细胞的比例，大大便利了细胞分选效果的监测和评估；并且，使用EGFP作为分选标签，可以避免如报道中使用功能性分子作为标签可能对细胞功能和基因表达带来的潜在影响。
本发明还评估了两类共六种不同的膜定位信号将分选标志物定位到细胞膜外表面，实现亲和细胞分选的能力，从中选出了最为有效的GPI膜锚定信号，可实现更加高效的阳性细胞分选。相对的，已有的磁性分选方法都是基于膜定位能力相对较差的跨膜结构域类型的膜定位信号，本发明的分选方法具有更大的优势。
在该体系中，本发明还在增强型绿色荧光蛋白EGFP的N端融合一个Twin-Strep-tag(TST)标签，通过膜定位信号将其定位到细胞膜外表面，使用可与TST高亲和力结合的Magrose Strep-Tactin磁珠，可一步实现分选标签质粒转染阳性细胞的分选，获得纯度高、活性好的目标细胞，可用于继续细胞培养或直接用于下游实验。亲和标签是实现蛋白质高效纯化的工具，并且短肽亲和标签已经成为蛋白质-蛋白质相互作用研究中不可或缺的一部分。目前常用的纯化标记主要有His-Tag、Flag-Tag、HA-Tag和TAP-Tag等，它们在分子大小、和配体之间的结合力常数、pH依赖的净电荷、相似内源性多肽序列或配体的干扰、洗脱液的不利影响以及使用成本等方面都各有所长。
Strep-tag/Strep-Tactin是新发展起来的一种蛋白质表达和纯化系统，具有高达nM级别的结合能力，更重要的是这种亲和标签系统不涉及抗体，不仅大大降低了使用成本，还可以在相对温和的条件下用生物素或者脱硫生物素溶液进行目标分子和细胞的洗脱，在细胞亲和分选中具有无可比拟的优点。因此，本发明在一种具体的亲和纯化系统中使用了这种大小仅为3kDa的Twin-Strep-Tag作为亲和标签。
本发明还提供另外一种也可高效分选阳性细胞的亲和纯化系统，选用GST作为亲和分选标签，使用GSH偶联的磁珠，利用GST和GSH之间的高亲和力实现转染阳性细胞的分选。该方法不仅可以有效分选阳性细胞，使用到的GSH偶联磁珠更是具有成倍降低的价格，与此同时GSH为共价结合的三肽结构，具有无可比拟的稳定性和可重复使用性，大大降低了阳性细胞分选的成本。更重要的是，将GST分选标签质粒和TST分选标签质粒联用，通过两次分选操作即可获得同时转染了两种质粒，或者感染了两种病毒载体的阳性细胞。
以上一个或多个技术方案的有益效果是：
1、流式分选法(FACS)依靠质粒载体上编码的荧光蛋白使阳性细胞在不同参数下实现分离。该方法需要昂贵的分选型流式细胞仪，尚未在大部分实验室普及开来，实验成本高，而且分选通量较小，由于分选速度较慢，分选过程耗时长。本发明开发的阳性细胞分选系统不需要额外的实验仪器，实验成本低，且操作简便，通过调整磁珠的使用量即可在同一时间和批次处理不同数量级的细胞样品，省时省力，且通量几乎不受限制。
2、另外，对于基于药物或抗生素耐药性基因的抗生素耐药性筛选方法，药物处理的过程通常需要数天时间，并且，由于每个细胞系对药物敏感性的各异，在实际应用中需要针对不同细胞系设计预实验来探索合适的抗生素浓度，进一步延长了实验周期，提高了方法的复杂性。再加上筛选药物和抗生素对细胞的毒性较大，以及仅适用于贴壁细胞等缺点，大大限制了该方法的应用范围。
相比之下，本发明的阳性细胞亲和分选系统不仅适用于悬浮细胞，也能较好的应用于贴壁生长的细胞，具有广泛的普适性。尤其突出的是，本发明的亲和分选过程耗时短，无需复杂的预实验摸索条件，仅一步操作就可以高效、快速的实现转染阳性细胞的分选。
3、本发明提供的阳性细胞亲和分选方法，其应用领域并不局限于基因敲低、基因过表达以及基因编辑的应用及效果评价，还可根据具体的个性化需求，将分选标签，比如TST-EGFP-GPIBY55的编码序列插入到其他感兴趣的载体中，即可构建出特定应用场景的细胞分离载体，应用于CRISPR/Cas9基因编辑系统及其衍生技术如CRISPRa、CRISPRi，PrimeEditor等，解决研究中遇到的基因转染或者转导效率低的瓶颈问题。
4、本领域未见将该亲和分选标签在细胞膜进行表达的报道，本发明比较了各种膜定位信号，选出了比对比文件所载跨膜结构域性能更好的GPI膜锚定方式，应用于细胞分选具有非常优秀的阳性细胞分选效率。并且亲和分选标签与磁珠具有非常强的亲和相互作用，其结合能力由于在磁珠表面标记单抗等方式，并且对溶剂体系要求低，洗脱也更容易，提高了技术的适用范围和便捷程度。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明阳性转染细胞分离策略示意图；
图示为糖基化磷脂酰肌醇(GPI)和跨膜结构域(TM)两种膜定位方式以及TST与Strep-Tactin的亲和作用示意图。
图2为实施例1中所述六种分选标签的细胞膜定位；
(a)pEGFP-C2质粒转染细胞的荧光照片；(b)三种基于GPI膜锚定信号的分选标签分子的膜定位荧光照片；(c)三种基于跨膜结构域的分选标签分子的膜定位荧光照片。
图3为亲和细胞分选的FACS分析；
(a)流式细胞分析柱状图的"归一化"重叠分析，X轴坐标表示参数的信号强度，Y轴坐标显示为百分比值，柱状图曲线上每一个点的Y轴坐标值表示它占图层柱状图最大值的百分比；(b)流式细胞术分析荧光阳性细胞比例数据统计，数值来自3次独立的生物学重复；(c)六种不同分选标签在K-562、Lenti-X 293T和22Rv1三种细胞系中进行亲和细胞分选后阳性细胞的富集倍数，数据来自三次独立的生物学重复；(d)K-562细胞转染TST-EGFP-GPIBY55分选标签质粒，使用优化的条件进行亲和细胞分选，借助流式细胞仪检测阳性细胞比例；峰图代表GFP阳性细胞比例，灰色、蓝色和黄色曲线分别代表阴性对照细胞、分选前和分选后细胞。柱状图数据来自三次生物重复的流式分析定量结果。
图4为通过基因表达水平的富集表征细胞亲和分选。
图5为亲和细胞分选提高了基因过表达水平。
图6为亲和细胞分选提高了shRNA敲除以及CRISPR/pecas9编辑的效率；
(a)用带有TST-EGFP-GPIBY55分选标签的pLKO.1载体在K-562细胞中表达靶向ABL基因的shRNA，进行阳性细胞分选之后通过RT-qPCR检测敲低ABL的效果，灰色显示的是空载质粒转染的K-562细胞；(b)用CCK-8试剂盒测定shRNA敲低ABL基因后K-562细胞的增殖能力；(c)用带有TST-EGFP-GPIBY55分选标签的CRISPR/Cas基因编辑载体对SNP rs1388941进行编辑，进行亲和细胞分选之后通过getPCR技术检测基因编辑效率；结果以平均值(Mean)±标准偏差(SD)表示，双尾t检验，*代表p<0.05，**代表p<0.01，***代表p<0.001，****代表p<0.0001。
图7为亲和细胞分选的FACS分析；
(a)流式细胞分析的直方图分析，已进行"归一化"，X轴坐标表示参数的信号强度，Y轴坐标显示为百分比值，柱状图曲线上每一个点的Y轴坐标值表示它占图层柱状图最大值的百分比；(b)流式细胞术分析的定量结果，来自3次独立的生物学重复；(c)经过亲和分选，三种分选标签在Jurkat细胞中阳性细胞比例富集的倍数，来自三次独立生物学重复；(d)通过RT-qPCR分析亲和分选前后细胞中EGFP基因表达水平的富集倍数。
图8为不同载体TST-EGFP-GPIBY55分选标签膜定位的荧光显微镜观察；
携带TST-EGFP-GPIBY55分选标签表达框的(a)pLKO.1、(b)pcDNA3.1和(c)CRISPR/pecas9载体质粒分别转染Lenti X-293T细胞，48h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的细胞膜定位。
图9为细胞分选相关的载体质粒图谱；
其中，(a)六种分选标签序列构建到pEGFP-C2载体的示意图；带有TST-EGFP-GPIBY55分选标签表达框的pcDNA3.1(b)、pLKO.1(c)、CRISPR/Cas9(d)载体的示意图。
图10为GST亲和分选标签分子的膜定位状态；
Lenti-X 293T细胞中分别转染六种分选标签质粒GST-EGFP-GPIDAF、GST-EGFP-GPIBY55、GST-EGFP-GPICEAM7、GST-EGFP-TMDITB3、GST-EGFP-TMDITAV和GST-EGFP-TMDITA5，48h后用DAPI染色细胞核，通过激共聚焦进行观察。
图11为流式细胞分析评估阳性细胞分选效率；
(a)Lenti-X 293T和K-562细胞分别转染六种分选标签质粒，30h后进行亲和磁性分选，借助流式细胞仪检测阳性细胞比例。蓝色(分选前)和黄色(分选后)，灰色(阴性对照细胞)。(b)柱状图为三次亲和分选分离前后阳性细胞比例的定量结果。双尾t检验，结果以平均值(Mean)±标准偏差(SD)表示，ns代表统计学差异不显著，*代表p<0.05，**代表p<0.01，**代表p<0.001。(c)K-562细胞转染GST-EGFP-GPIDAF和GST-EGFP-GPIBY55变体，30h后进行亲和磁性分选，借助流式细胞仪检测阳性细胞富集效果。蓝色(分选前)和黄色(分选后)，灰色(阴性对照细胞)。柱状图为三次生物学重复的定量结果。双尾t检验，结果以平均值(Mean)±标准偏差(SD)表示，***代表p<0.001。
图12为亲和分选细胞的基因表达富集检测；
Lenti-X 293T(a)和K-562(b)细胞分别转染六种分选标签变体，30h后进行亲和分选，通过RT-qPCR技术检测分选前后细胞中GST基因表达水平。双尾t检验，结果以平均值(Mean)±标准偏差(SD)表示，*代表p<0.05，**代表p<0.01，**代表p<0.001。
图13为亲和细胞分选提高基因敲低效率；
(a)ATG10 shRNA敲低的分选载体示意图。我们将分选标签GST-EGFP-GPIDAF的编码区插入pLKO.1载体，替代嘌呤霉素抗性基因。(b)用ATG10 shRNA质粒转染K-562细胞，亲和分选转染阳性细胞，通过qPCR检测亲和分选前后EGFP和ATG10的表达水平。双尾t检验，结果以平均值(Mean)±标准偏差(SD)表示，*代表p<0.05，**代表p<0.01，**代表p<0.001。
图14为亲和细胞分选用于基因过表达分析；
(a)ATP6AP1L基因过表达载体示意图，GST-EGFP-GPIDAF和GST-EGFP-GPICEAM7分选标签的编码区分别插入pcDNA3.1载体中，替换NeoR/KanR抗性基因。(b，c)qPCR检测分选前后细胞ATP6AP1L和GFP表达水平。(d)CCK-8比色法测定各时间点的细胞数目，以450nm处吸光度表示。双尾t检验，结果以平均值(Mean)±标准偏差(SD)表示，*代表p<0.05，**代表p<0.01，**代表p<0.001。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，现有技术中转染阳性细胞的筛选具有周期长、设备贵、筛选效果不理想等的缺陷。为了解决如上的技术问题，本发明目的在于提供一种操作快速、简单，成本低的转染阳性细胞的富集方法。
本发明第一方面，提供一种表达框，所述表达框中包括膜定位信号肽、荧光蛋白(EGFP)及亲和分选标签的编码序列。
优选的，所述膜定位信号肽包括GPI类型的膜外定位信号及跨膜结构域等；其中，膜外定位信号肽包括但不限于BY55,DAF,CEAM7中的一种；所述跨膜结构域包括但不限于ITB3,ITA5,ITAV中的一种。
进一步优选的，所述膜定位信号肽为膜外定位信号肽，所述膜外定位信号肽通过糖基磷脂酰肌醇分子(GPI)锚定于细胞膜脂质双分子层的外层。
本发明研究发现，将蛋白跨膜结构域作为定位信号进行转染同样能够在转染后的细胞中进行表达，但是宿主细胞存活状态受到明显的影响，为了降低采用跨膜结构域作为定位信号对细胞活性的影响，本发明对跨膜结构域C端参与信号转导的氨基酸进行了敲除。因此，所述表达框进一步优选的方案中，所述跨膜结构域C端参与信号转导氨基酸的编码序列缺失。
优选的，所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白(EGFP)、mCherry，dsRed，RFP，YFP或BFP中的一种。
进一步优选的，所述荧光蛋白为EGFP。
优选的，所述亲和分选标签位于荧光蛋白的N端。
由于N端是一个疏水的可切割的信号肽序列，能被信号识别颗粒识别，在翻译进行的同时通过Sec61转运子复合体引导蛋白质进入粗面内质网的管腔。因此，本发明所述亲和分选标签设置于荧光蛋白的N端，而膜定位信号肽则位于荧光蛋白的C端。
进一步的，所述亲和分选标签为CBP(钙调蛋白结合肽)，MBP(麦芽糖结合蛋白)、HIS-Tag蛋白标签，或Twin-Strep-tag(TST)、GST(glutathione S-transferase)中的一种
本发明效果较好的一种实施方式中，所述表达框中，包括膜外定位信号、绿色荧光蛋白(EGFR)和Twin-Strep-tag(TST)的编码序列。
本发明又一种效果较好的实施方式中，所述表达框中包括膜外定位信号肽、绿色荧光蛋白(EGFR)和GST(glutathione S-transferase)的编码序列。
本发明第二方面，提供一种表达载体，所述表达载体中包括第一方面所述表达框。
上述表达载体中，第一方面所述表达框可插入表达载体并在宿主细胞中进行表达，所述表达载体的具体实例如细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒等，可在宿主内进行稳定复制的系统均可在本发明所述“表达载体”的定义之下。
所述表达载体的实例包括天然或重组质粒、黏粒、病毒和噬菌体。例如，pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、卡隆4A和卡隆21A可以用作噬菌体载体或黏粒载体。作为质粒载体，可使用pBR型、pUC型、pBluescriptII型、pGEM型、pTZ型、pCL型和pET型。本发明中可使用的载体不具体地限制，并且可以使用任何已知的表达载体。优选地，可以使用pEGFP-C2、pLKO.1、pcDNA、pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118或pCC1BAC载体。
基于所述表达载体功能的实现，本领域通常认为所述表达载体中还应当包括复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件；所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
优选的，所述表达载体的构建可基于本领域目前熟知的方法，包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。
一种具体的实施方式中，所述表达载体为质粒载体，所述质粒载体的制备方法如下：通过全基因合成的方式获得所述膜定位信号肽的编码序列，使用多重PCR将其与编码绿色荧光蛋白的阅读框融合，并通过Age I/BglII酶切连接的方式克隆到pEGFP-C2载体中。
本发明第三方面，提供一种转染阳性细胞的亲和分选试剂盒，所述试剂盒中包括第二方面所述表达载体、磁珠及宿主细胞。
优选的，所述宿主细胞为真核细胞，包括贴壁细胞及悬浮细胞；所述贴壁细胞包括Lenti-X293T细胞及前列腺癌细胞22Rv1；所述悬浮细胞包括白血病细胞K-562及Jurkat细胞。
进一步优选的，所述宿主细胞为K-562细胞。
优选的，所述磁珠表面具有亲和分选标签的配体蛋白修饰；具体的实例中，所述亲和分选标签为Twin-Strep-tag，所述磁珠为Magrose Strep-Tactin磁珠。
本发明第四方面，提供一种转染阳性细胞分选方法，所述分选方法包括将目的基因导入第一方面所述表达框或第二方面所述表达载体，并在宿主细胞中进行DNA转染，通过磁珠分离转染阳性细胞。
优选的，分选方法具体步骤如下：将目的基因导入第二方面所述表达载体，将表达载体转入宿主细胞进行DNA转染，所述转染时间为36-48小时，收集细胞并洗涤，将洗涤后的细胞与含有磁珠的缓冲液混合，孵育一段时间后形成磁珠-细胞复合物，固定所述磁珠-细胞复合物，移除体系中的缓冲液再加入洗脱液进行洗脱，洗脱完成后收集，即获得含有阳性转染细胞的洗脱液。
上述优选方案中，所述磁珠-细胞复合物的固定方式包括通过外加磁场进行固定和自然沉降两种方式。
传统的磁珠分离技术，通常需要外加磁场对体系中的磁珠样品进行固定和分离，事实上，磁珠-细胞复合物在上述缓冲体系中能够自然沉降于容器底部，本发明针对这两种方式的细胞回收率进行了考察(图3d所示)，可以看出，自然沉降方式获得的阳性回收细胞更多。
进一步优选的，所述DNA转染方法包括磷酸钙共沉淀法，转染试剂转染，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
进一步优选的，所述细胞为贴壁细胞时，需要采用胰酶进行消化。
进一步优选的，所述洗涤后的细胞加入含有磁珠的缓冲液后，在室温条件下孵育10～20min。
进一步优选的，所述分选方法中，清洗和孵育使用的缓冲液为含有0.05～0.15％BSA的DPBS溶液。
优选的，所述分选方法还包括对阳性转染细胞进行定量的方法，所述定量方法的一种实施方式中，通过检测荧光蛋白的荧光强度进行定量；具体的实例中，通过流式细胞仪进行定量。
本发明第五方面，提供第一方面所述表达框、第二方面所述表达载体、第三方面所述阳性转染细胞亲和分选方法在基因组编辑评价领域的应用。
优选的，所述基因编辑评价包括但不限于基因过表达分析、基因敲降分析、报告基因分析、基因编辑分析以及相关的细胞功能研究实验。
进一步的，所述基因敲低为shRNA基因敲低，所述基因组编辑为CRISPR/Cas9基因组编辑。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
材料和方法
质粒构建和基因克隆
通过全基因合成的方式(金唯智)获得插入到pUC57a载体上的信号肽及六种上膜信号的编码序列，通过重叠延伸拼接PCR(SOE PCR)将其分别与绿色荧光蛋白的编码序列拼接在一起获得六种分选标志物的编码序列。首先从pEGFP-C2质粒载体中扩增出EGFP编码序列(包括N端MCS)，然后通过引物自聚合酶链式反应(Self-PCR)获得包含30个氨基酸残基的双链标签(Twin-Strep-Tag，TST)(WSHPQFEK-GGGSGGGSGGS-SAWSHPQFEK)序列，进而使用特异性引物，通过PCR从pUC57a载体上分别获得不同变体的N-端信号肽和其变体相应的GPI/TMDs序列。将上述4个PCR产物按分子量为1：1：1：1的比例混合后，进行SOE PCR得到各变体的N-端信号肽-TST-EGFP-GPI/TM序列。SOE PCR产物经FastDigest AgeI和FastDigestBglII(Thermo Fisher)酶切处理回收后直接插入到同样双酶切的pEGFP-C2载体中，取代原有的EGFP序列，构建得到六种亲和分选载体(图9a)。
将GST-EGFP-GPIDAF和GST-EGFP-GPICEAM7分选标签的表达框通过体外重组的克隆方式插入到pcDNA3.1载体中，构建了用于基因过表达的亲和分选标签质粒。使用T47D的cDNA样本进行扩增获取ATP6AP1L基因的编码区序列，通过酶切连接插入到KpnI/XbaI线性化的pcDNA3.1载体中。
对于基因过表达、基因敲低实验以及基因编辑实验中使用的分选载体，本实施例通过PCR技术从pEGFP-BY55载体中扩增出N-sig-TST-EGFP-GPIBY55编码序列，用FastDigestBamH1和Kpn1(Thermo Fisher)双酶切处理回收后通过T4 DNA Ligase(EL0011,ThermoFisher)直接连接到同样双酶切处理的pLKO.1(Sigma)载体上，获得用于U6-shRNA表达的亲和分选载体(图9b)或用体外同源重组克隆试剂盒(ClonExpress II One-Step CloningKit，C112,Vazyme)替换pcDNATM3.1/V5-His A(Invitrogen)载体的新霉素序列，获得用于基因过表达的亲和分选载体(图9c)。同样通过同源重组的方式将CMV enhancer/promoter-Nsig-TST-EGFP-GPIBY55-SV40 Poly(A)序列完整的插入到NotI酶切的CRISPR/pecas9(Plasmid#42230)载体中ecas9(R661A,Q695A,Q926A,D1135E)蛋白下游构建得到用于基因编辑实验的亲和分选载体(图9d)。
进一步，将针对靶基因的shRNA序列合成的寡核苷酸片段，退火后直接插入FastDigest Age1/EcoR1(Thermo Fisher)双酶切的pLKO.1-BY55载体中。从人cDNA样本中扩增出CEBPB和CTCF基因序列，经FastDigest HindIII和Xba1(Thermo Fisher)双酶切处理回收后构建到同样双酶切处理的pcDNA3.1-BY55载体。靶位点的single guide RNA(sgRNA)的序列通过CRISPRdirect网站数据获得，合成的单核苷酸片段退火后可直接连接到Bbs1酶切处理回收后的CRISPR/cas9-BY55载体的gRNA scaffold区。所有转染细胞的质粒均用去内毒素质粒纯化试剂盒(OMEGA)提取，并进行乙醇沉淀进行无菌处理。
细胞培养和转染
Lenti-X 293T细胞购自Clontech(#632180)并培养于DMEM(Gibco)培养基，22Rv1细胞购自ATCC(CRL-2505)并培养于RPMI1640(Gibco)培养基，K-562细胞购自ATCC(CCL-243)培养于IMDM(Gibco)培养基。所有培养基均添加1％抗生素(青霉素和链霉素，Sigma)和10％胎牛血清(Gibco)。细胞系在37℃、95％湿度、5％CO2条件下培养，一般每2-3天传代一次。所有细胞系均定期检测支原体(mycoplasma Detector,D101-02,Vazyme)，保证没有支原体污染。
在转染前一天，Lenti-X 293T细胞和22Rv1细胞接种于6孔板，并在完全培养基中生长，使其在转染时达到50-70％的密度。K-562细胞转染前先进行细胞计数，以每个孔3.5×105个细胞的量接种于6孔板。Lenti-X 293T细胞转染使用聚乙烯亚胺试剂(PEI，#408727，Sigma)，DNA:PEI的比例为1:1.5，转染之前换上不含胎牛血清的DMEM培养基，并在转染4-8小时后替换成DMEM完全培养基。22Rv1细胞和K-562细胞转染使用Lipofectamine2000(11668-019，Invitgen)转染试剂，按照说明书进行操作，DNA和Lipofectamine 2000比例为1:3。
亲和细胞分选
细胞转染36-48小时后进行细胞分选实验。对于贴壁细胞如Lenti-X 293T细胞和22Rv1细胞，需要通过胰酶(T3924，Sigma)消化将细胞分散成单个细胞悬液，而对于悬浮细胞如K-562细胞可以直接离心收取细胞。然后用1×PBS溶液清洗细胞两次，取出1/5作为细胞分离前的样品，剩余细胞用250μl室温孵育缓冲液(IMDM with 2％FBS)重悬，并将其与洗涤两次并重悬在250μl孵育缓冲液中的磁珠混合，颠倒混匀后将其置于旋转混匀仪上，以转速10rpm室温孵育15分钟。然后将装有细胞-磁珠复合物的EP管置于磁力架上，静置2分钟直到所有的磁珠-细胞复合物都被吸附固定，弃掉上清后用清洗缓冲液(IMDM无FBS)轻柔冲洗，重复此步骤两次，注意此过程不要触碰到磁珠。最后在磁珠中加入300μL完全培养基，置于混匀仪上在15rpm转速下室温洗脱5min，然后置于磁力架上静置，收集含有阳性细胞的上清液。
为了提高该亲和分选系统的分选效果，本实施例对分选步骤进行了优化。用含有0.1％BSA的DPBS溶液作为孵育和清洗的缓冲液，在孵育和清洗时将溶液体积扩大为1.5mL，同时整个分选过程中不再使用磁力架，而是借助重力使磁珠-细胞复合体自然沉降，依靠磁珠与细胞的密度差，即可将磁珠及其结合的阳性细胞从细胞悬液中分离出来，实现更好的分选效果。
Lenti-X 293T细胞爬片制作和激光共聚焦显微镜拍照
在生物安全柜中将爬片置于24孔板中，转染前一天将Lenti-X 293T细胞接种爬片上使其在转染时达到50-70％的密度。将pEGFP-C2，pEGFP-GPIBY55、pEGFP-GPIDAF、pEGFP-GPICEAM7、pEGFP-TMITB3、pEGFP-TMITA5以及pEGFP-TMITAV质粒用1×PEI试剂分别转染Lenti-X293T细胞，48小时后去除培养基，用1×PBS清洗两遍，再用4％多聚甲醛室温下避光固定10-15分钟，然后再用1×PBS轻柔的冲洗两遍，最后用10μg/mL浓度DAPI试剂染细胞核，并用防猝灭封片剂封片，于避光湿盒中保存。最后使用超高分辨率激光共聚焦显微镜LSM900(蔡司)观察不同分选标签TST-EGFP蛋白的膜定位情况。
流式细胞术
收集经过转染的K-562细胞以及用细胞消化液(Sigma)处理的转染后的Lenti-X293T和22Rv1细胞，以及经过亲和分选的细胞，将分离前后的样品以及未转染的阴性对照细胞置于冰上，使用流式细胞仪NovoCyte(ACEA Biosciences)或guava easyCyte(MERCK)进行分析。FSC和SSC的探测器增益设定为默认值，而FITC的探测器增益需要根据不同细胞系进行调整，一般把阴性对照细胞的FITC-H主峰调整位于102-103之间。采集停止条件设置为事件限制，每次分析至少记录10000个事件，样本流速设置为低速，阈值设置FSC高度或SSC高度的阈值大于10000。因为本实施例是单荧光通道检测绿色荧光，所以不需要进行荧光补偿。在此实验中本实施例选择了双参数的散点图和单参数的直方图。同时在直方图中进行了同组实验中不同样品图层的叠加(归一化处理)，来更加直观的观察亲和分选前后的样品中阳性细胞的比例变化。
RNA提取和反转录
用GeneJET RNA纯化试剂盒根据说明书(GeneJET RNA Purification Kit,K0732,Thermo Scientific)从细胞中制备RNA样本，然后用DNaseI置于37℃处理1h，通过试剂盒(RapidOut DNA Removal Kit,K2981,Thermo Scientific)去除残留的基因组DNA。按照cDNA逆转录试剂盒(High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit,4368813,AppliedBiosystems)的使用手册使用随机引物将RNA逆转录成cDNA。程序设置为25℃10min，37℃120min然后85℃5min。反转录得到的cDNA直接用于后续实验或者存放于在-80℃冰箱。
RT-qPCR和getPCR
采用RT-qPCR对pEGFP-C2、pEGFP-GPIBY55、pEGFP-GPIDAF、pEGFP-GPICEAM7、pEGFP-TMITB3、pEGFP-TMITA5、pEGFP-TMITAV转染细胞分选前后样品中EGFP基因表达水平进行分析，通过基因表达水平的富集倍数来表征各分选标签富集阳性细胞的能力。对于基因的敲低或过表达的mRNA基因表达分析，用内源性ACTB(β-actin)基因表达水平进行归一化处理，并将转染空载体的细胞作为阴性对照。每个基因的表达定量结果来自三次定量PCR分析。
本实施例采用getPCR方法进行基因编辑效率检测。使用TIANamp基因组DNA试剂盒(天根生物科技)根据试剂盒说明书的指引提取细胞基因组DNA。严格依据该技术的要求设计基因编辑检测引物并进行退火温度检测以选择合适的引物退火温度。定量RT-PCR和getPCR使用qPCR/>Green Master Mix(#Q111-03，Vazyme)产品，在QIAGEN Q-rex机器上进行。每对PCR引物均进行特异性和扩增效率检测，选择特异性和扩增效率较好的引物进行PCR定量分析。
细胞增殖实验
使用Lipo2000试剂将shRNA表达的分选质粒转染K-562细胞，48h后进行亲和细胞分选。将分选前、后的细胞和仅转染空载质粒的阴性对照细胞计数后按每孔1000个细胞接种于96孔板。分别在培养24h、48h、72h和96h后按照药物与培养基1:10的比例加入CCK-8试剂(Cell Counting Kit-8,MA0218,Meilun)，培养3h后用酶标仪测定在450nm处的吸光度值，以600nm作为参比波长，绘制细胞增殖曲线，每个数值来自三个重复孔的细胞。统计学处理采用双尾t检验。
转染阳性细胞亲和分离策略及分选标志物的构建
合适的亲和标签对于阳性细胞分选的效果起着关键作用，不仅要求与配体有较强的相互作用力，更重要的是不会对细胞中正常基因的表达、功能及细胞活性带来潜在的影响。Strep-Tag系统是模拟链霉亲和素-生物素系统的新型蛋白纯化系统，Twin-Strep-tag(TST)是Strep-tagII的二聚体版本，对Strep-Tactin蛋白具有更高的亲和力，是一种理想的亲和标签短肽。本实施例将其融合到绿色荧光蛋白分子的N端，作为亲和分选标签分子。进一步，为了有效地将亲和分选标签定位于细胞膜外表面，本实施例选择了六种膜定位信号进行了比较分析，其中来自BY55,DAF,CEAM7分子的三种膜定位信号可通过糖基磷脂酰肌醇分子(GPI)使蛋白质锚定在脂质双分子层的外层，而来自ITB3,ITA5,ITAV分子的三种膜定位信号则属于跨膜结构域(TM)，可通过一种独特的跨膜结构域(TMD)穿过真核细胞的细胞膜，将蛋白分子锚定在细胞膜上。本实施例使用SignalP-5.0Server在线分析获取了对应的信号肽序列以及信号肽剪切位点。同时，为了避免跨膜结构域的膜内氨基酸与胞内细胞骨架之间的潜在相互作用，防止干扰细胞正常基因表达和功能，本实施例将跨膜结构域中C端参与信号转导的氨基酸移除并进行密码子优化(表1和2)。
表1
表2
上述表2中，所述GST编码序列对应的氨基酸的序列同GenBank:AAA57089.1。
本实施例通过全基因合成的方式获得这些膜定位信号的编码序列，使用多重PCR将其与编码EGFP的阅读框融合，并通过Age I/BglII酶切连接的方式克隆到pEGFP-C2载体中，构建得到六种带有不同分选标签的质粒。将这些质粒转染细胞，即可在细胞中驱动分选标签的表达并定位到细胞膜表面，使用Strep-Tactin磁珠可选择性结合转染阳性的细胞，富集的阳性细胞可进一步通过温和的洗脱缓冲液从磁珠上释放出来，实现阳性细胞的亲和分选(图1)。
分选标签的细胞膜定位
为了直观的检测不同分选标签在细胞膜外层的定位情况，本实施例将这六种质粒分别转染Lenti-X 293T细胞，制作细胞爬片后通过激光共聚焦荧光显微镜进行观察。本实施例发现这6种基于TST-EGFP的分选标签分子都可以高水平的表达并且有效的定位到细胞膜上(图2)，其中三种GPI膜锚定类型的分选标签不仅具有良好的膜定位效果，并且细胞拥有正常的形态(图2b)，但是，属于跨膜蛋白类型(TM)的三种分选标签虽然也可以显著定位到细胞膜上，但是细胞形态有变圆的趋势(图2c)。推测这可能是由于来自于整合素家族的跨膜结构域影响了细胞的形态。
转染阳性细胞的亲和分选
进一步，本实施例将这六种分选标签质粒转染到三种细胞中，包括悬浮生长的白血病细胞K-562，贴壁生长的Lenti-X 293T细胞和前列腺癌细胞22Rv1，使用Strep-Tactin磁珠分选阳性细胞并通过流式细胞术测定不同变体对阳性细胞的分选效率。结果表明，这6种分选标签在K-562细胞中均达到了非常显著的富集效果，尤其是TST-EGFP-GPIBY55，TST-EGFP-GPIDAF，TST-EGFP-GPICEAM7三种基于GPI膜锚定的分选标签，经过亲和分选，阳性细胞比例分别从分选之前的15％，16％和16％提到高到86％，87％和88％，而三种基于跨膜结构域的分选标签TST-EGFP-TMITB3，TST-EGFP-TMITA5，TST-EGFP-TMITAV，也能够使阳性细胞比例从分选之前的28％，24％，35％分别提高到78％,68％和82％(图3a,b)。在贴壁细胞Lenti-X293T中本实施例也获得了高效的亲和细胞分选效果，同样的，也是TST-EGFP-GPIBY55，TST-EGFP-GPIDAF，TST-EGFP-GPICEAM7三种分选标签表现出了较好的分选能力，阳性细胞比例从分选之前的19％分别提高到77％，74％和76％，而分选标签TST-EGFP-TMITB3，TST-EGFP-TMITA5，TST-EGFP-TMITAV则仅能将阳性细胞比例从18％分别提升到64％，56％和66％。在前列腺癌细胞22Rv1中，六种分选标签也都表现出了有效的富集转染阳性细胞的能力，类似的，TST-EGFP-GPIBY55，TST-EGFP-GPIDAF，TST-EGFP-GPICEAM7三种分选标签表现出了较好的分选能力，经过分选，阳性细胞率分别从分选之前的16％，17％和19％提到高到75％，78％和59％(图3a,b)。本实施例发现，在这三种不同细胞系中进行的阳性细胞分选实验中，GPI膜锚定类型的3个分选标签富集阳性细胞的能力均高于另外三个基于跨膜结构域的分选标签(图3a)。并且，在悬浮生长的K-562细胞中表现出来的分离效果略好于两种贴壁细胞细胞。
进一步，本实施例在另外一种难转染的T细胞来源的Jurkat白血病细胞中对三种基于GPI膜锚定分选标签进行了转染阳性细胞分选实验，结果表明，这三种分选标签也表现出了高效的阳性细胞分离能力(图7a,b,c)，经过分选，TST-EGFP-GPIBY55，TST-EGFP-GPIDAF，和TST-EGFP-GPICEAM7三种分选标签可将阳性细胞比例从13％分别提到67％，77％和63％。通过计算细胞分选后阳性细胞富集的倍数，可以更加直观的看出这三个基于GPI膜锚定的分选标签具有较好的分选能力，并且在悬浮生长细胞K-562和Jurkat细胞中具有更高的富集效果(图3c，图7a,b,c)。为了验证本分选系统的分选效果能否达到更高的富集，本实施例将细胞分选操作流程进行优化，通过自然沉降的方式而不是依赖外部磁场的作用的方式分离结合了细胞的磁珠，发现在K-562细胞中经过TST-EGFP-GPIBY55分选标签富集之后，转染阳性细胞的比例达到95％以上(图3d)。
此外，本实施例还从分离的细胞中提取RNA，通过RT-qPCR技术检测EGFP的基因表达水平，以此来评估阳性细胞分选的效果。结果表明，经过细胞分选，这六种分选标志物均能高效富集阳性细胞，提高目标细胞中EGFP基因的表达水平。与流式细胞仪分析的阳性细胞比例结果类似，TST-EGFP-GPIBY55，TST-EGFP-GPIDAF和TST-EGFP-GPICEAM7三种分选标签均比基于跨膜结构域的三种分选标签有更高的富集倍数(图4a,b,c)。三种基于GPI膜锚定信号的分选标签在K-562细胞中均获得了超过10倍的富集倍数，其中TST-EGFP-GPICEAM7在K-562细胞中的富集倍数更是高达15倍(图4a)。从总体水平来看，Lenti-X 293T和22Rv1细胞中各个分选标签通过基因表达水平表征的富集程度都低于在K-562细胞中的分离效果(图4b,c)。同样也是悬浮生长的Jurkat细胞中三个基于GPI膜锚定的分选标签富集倍数也均达到9倍以上(图7d)。通过基因表达水平确定的富集效果与流式细胞术的检测结果高度一致，但是，由于分选标签表达水平较高的细胞更容易被分选出来，因此，经过细胞分选，基因表达水平的富集倍数略高于流式细胞术确定的阳性细胞富集倍数。
综上所述，在质粒上引入膜锚定TST标签荧光蛋白的表达单元，可使用Strep-Tactin磁珠高效实现转染阳性细胞的亲和分选，其中三种基于GPI膜锚定的分选标签具有更好的分离能力，本研究后续选择其中一种分选标签TST-EGFP-GPIBY55作为代表在多种目的的实验中进行了应用。
亲和细胞分选用于基因过表达分析
本实施例将TST-EGFP-GPIBY55分选标签的表达框克隆到pcDNA3.1载体中，替换掉其中的新霉素抗性基因表达框，获得了pcDNA3.1-TST-EGFP-GPIBY55基因过表达亲和分选载体(图8a,3b)。在此基础上，本实施例选择了两个常见的转录因子CEBPB和CTCF基因，通过逆转录获得基因编码区，并分别构建到该分选载体中。将其转染K-562细胞，48小时后进行亲和细胞分选，提取RNA后通过RT-qPCR检测亲和分选细胞中目的基因的表达水平。结果表明，细胞转染可以使CEBPB在细胞中的表达水平提高10倍左右，而经过亲和分选获得的阳性细胞中CEBPB的表达水平进一步提高到58倍左右(图5b)。类似的，细胞转染可以将CTCF基因的表达水平提高到内源基因表达的14倍，而经过细胞亲和分选获得的阳性细胞中，基因表达水平则进一步提高到了27倍(图5b)。这些结果表明，基于膜锚定荧光蛋白的亲和分选标签系统，可有效用于基因过表达研究。
亲和细胞分选用于shRNA基因敲低实验
进一步，本实施例将TST-EGFP-GPIBY55分选标签的编码序列克隆到pLKO.1载体中，替换嘌呤霉素抗性基因，构建了可应用于基因敲低实验的亲和分选系统。荧光显微镜观察发现，该亲和分选载体可有效表达TST-EGFP荧光分选标签，并使其定位到细胞膜上(图8b,3c)。在此基础上，本实施例构建了针对BCR-ABL融合基因的shRNA表达质粒，这是一种常见的由费城染色体易位导致的白血病融合基因，具有持续激活的酪氨酸激酶活性，可使细胞生长调控发生紊乱进而导致过度增殖，是慢性粒细胞白血病(CML)的重要标志分子。K-562是一种CML细胞，高水平表达内源性BCR-ABL融合基因。本实施例发现，将BCR-ABL基因的两个shRNA质粒sh-ABL1和sh-ABL2分别转染K-562细胞，均可在一定程度上下调ABL基因的表达水平，敲低效率分别为15％和12％。而在经过亲和分选得到的细胞中，sh-ABL1和sh-ABL2的敲低效率则分别达到了51％和53％(图6a，b)。大量研究表明BCR-ABL融合基因的表达水平和白血病细胞的增殖能力高度相关，降低BCR-ABL的表达可抑制白血病细胞的增殖。因此，本实施例使用CCK-8试剂盒对细胞的增殖能力进行了评估。结果表明，sh-ABL1和sh-ABL2转染介导的RNA干扰均可以显著抑制细胞的增殖能力，而在经过亲和分选之后的阳性细胞中则可以观察到更加显著的抑制作用(图6c)。这些结果表明，基于膜锚定荧光蛋白的亲和分选标签系统，可有效用于基因敲低实验研究。
亲和细胞分选用于基因编辑实验
近年来，基因编辑技术得到了迅速的发展，在基因功能研究和遗传疾病的治疗等领域得到了广泛的应用。本实施例将TST-EGFP-GPIBY55分选标签的表达单元克隆到高保真型eCas9的表达载体中，构建了可亲和分选的基因编辑载体。荧光显微镜观察发现，该亲和分选载体可有效表达TST-EGFP荧光分选标签，并使其定位到细胞膜上(图8c,3d)。疾病风险相关SNP的功能和机制研究已经成为疾病遗传和病理研究的热点，通过基因编辑技术对风险SNP位点进行修饰，获得基因编辑的细胞材料是相关研究的重要环节。然而，尽管基因编辑技术已经得到了迅猛的发展和广泛的应用，由于转染效率的限制，在多种特定疾病类型中的研究受到了严重的制约，比如白血病风险相关SNP的研究。针对这一难题，本实施例评估了转染阳性细胞亲和分选系统在这一领域的应用潜力。rs1388941是已报道的通过GWAS分析发现的白血病风险相关的SNP位点，在K-562细胞中的基因型为A/G杂合。本实施例在亲和分选载体的基础上构建了靶向rs1388941位点临近区域的质粒，转染K-562细胞并在48小时后进行亲和细胞分选，从细胞中提取基因组DNA，利用getPCR技术检测该位点上每个等位基因发生基因编辑的效率。结果表明，在亲和分选之前，两个等位基因上的编辑效率均仅为7％左右，而在亲和分选出的阳性细胞中，两个等位基因发生编辑的比例提高到30％和25％左右，提高了4倍左右(图6c)。以上结果表明，基于膜锚定荧光蛋白的亲和分选标签系统，可有效用于基因编辑实验研究。
实施例2
设计膜定位GST-EGFP融合蛋白
本实施例使用GST分子作为亲和分选的标签。本实施例结合SignalP网站和Uniprot数据库中膜蛋白的注释信息对信号肽剪切位点及所在位置进行了预测，选择了评分较高的来自于DAF、BY55和CEAM7的GPI锚定蛋白序列以及来自ITAV、ITA5和ITB3的三种跨膜蛋白结构域，将其插入到GST-EGFP融合阅读框，构建了六种含有不同膜定位信号序列的分选标志物变体的表达质粒。
分选标志物的膜定位分析
为了确定分选标志物是否具有良好的膜定位能力，本实施例将这六种分选标签变体质粒分别转染Lenti-X 293T细胞，经过DAPI染色后使用激光共聚焦显微镜观察(图10)。结果表明，GPI锚定类型的分选变体GST-EGFP-GPIDAF、GST-EGFP-GPIBY55、GST-EGFP-GPICEAM7不仅可以高效定位到细胞膜上，细胞也保持了正常的形态。而属于跨膜结构域类型的三种变体GST-EGFP-TMDITB3、GST-EGFP-TMDITAV、GST-EGFP-TMDITA5则表现出较差的上膜能力，大部分分选标志物位于细胞质中，并且细胞形态有变圆的趋势。我们猜测，可能是融合蛋白的结构影响了其膜定位能力，导致三个基于跨膜结构域的GST-EGFP无法有效上膜。另外，细胞形态变圆可能是因为ITB3、ITAV和ITA5膜蛋白属于整合素家族有关，此类分子主要介导细胞与细胞外基质的黏附，从而使细胞得以附着，带有跨膜结构域的GST-EGFP可能干扰了细胞内正常整合素的生物学功能。
亲和细胞分选效率检测
进一步，为了评估这六种膜定位GST-EGFP变体在亲和细胞分选中的表现，本实施例将这六种变体分别转染贴壁细胞Lenti-X 293T和悬浮细胞系K-562。在转染后30小时用GSH标记的磁珠进行分选，然后将分选出来的细胞通过FACS分析荧光阳性细胞的比例，或者通过RT-qPCR检测GST-EGFP的RNA水平来评估细胞亲和分选的富集倍数。流式分析结果显示，不管是在贴壁的Lenti-X 293T细胞中还是悬浮的K-562细胞中，GST-EGFP-GPIDAF、GST-EGFP-GPIBY55和GST-EGFP-GPICEAM7这三种基于GPI膜锚定的分选标志物均能大幅度提高GFP阳性细胞的比例。其中，分选标签GST-EGFP-GPIDAF可在K-562细胞中将阳性细胞比例从20％提高到81％，在Lenti-X 293T细胞中则能将阳性细胞率从14％提高到71％。而三个基于跨膜结构域的分选标志物GST-EGFP-TMDITB3、GST-EGFP-TMDITAV和GST-EGFP-TMDITA5则未能在K-562细胞中显著提高EGFP阳性细胞比例(图11a,b)。这三种分选标签变体在Lenti-X 293T中虽然表现出一定程度的富集效果，但是提高幅度远不及GPI膜锚定方式的三个变体。有趣的是，当我们进一步优化细胞亲和分选的条件，用磁珠自然沉降的方式代替磁铁磁场的磁力来分离磁珠及其结合的阳性细胞，GST-EGFP-GPIDAF、GST-EGFP-GPIBY55分选标志物均能将阳性细胞比例从20％左右提高到95％左右(图11)。为了进一步验证流式细胞分析的结果，综合选出优秀的膜锚定分选标志物，本实施例从分选的细胞中提取RNA，通过RT-qPCR检测分选前后GST基因表达水平的变化来表征阳性细胞的富集效果。结果与细胞流式结果一致，GST-EGFP-GPIDAF、GST-EGFP-GPIBY55和GST-EGFP-GPICEAM7表现出了最好的分选效果(图12a,b)。
亲和细胞分选方法可应用于基因敲低实验
基因敲低实验是常用的研究基因功能的手段。接下来本实施例尝试将亲和分选效果较好的GST-EGFP-GPIDAF变体用于基因敲低实验。我们将分选标志物的表达单元插入到表达靶向ATG10基因shRNA的PLKO.1载体中(图13a)，转染K-562细胞系并使用GSH磁珠进行细胞亲和分选。通过RT-PCR检测分选前后GFP基因表达水平，表明亲和细胞分选过程成功富集了转染阳性细胞。进一步RT-PCR检测ATG10基因的表达水平发现，经过亲和分选之后ATG10基因敲低效率大大提高，从分选前的7％提高到60％。以上实验结果表明，通过亲和细胞分选可以有效提高基因敲低效率(图13b)。
亲和细胞分选方法可应用于基因过表达研究
本实施例进一步将该阳性细胞分选方法在基因过表达研究中进行了应用。本实施例将GST-EGFP-GPIDAF和GST-EGFP-GPICEAM7分选标签的编码区分别插入到过表达ATP6AP1L基因的pcDNA3.1载体中，替换卡那霉素/新霉素的抗性基因(图14a)，将其转染K-562细胞并进行亲和细胞分选。通过RT-qPCR分析表明，这两个分选标志物均能大幅度提高目标细胞中ATP6AP1L基因的表达水平(图14b)，通过检测EGFP基因的表达水平也发现这两种细胞分选标签均表现出了良好的阳性细胞富集效果(图14c)。有研究表明，ATP6AP1L基因的表达产物对质子转运至关重要，并且本实施例期发现在乳腺癌细胞系中过表达ATP6AP1L可以抑制细胞增殖。为了探讨在K-562细胞中是否具有类似的作用，本实施例用经过亲和分选的过表达ATP6AP1L基因的细胞进行了细胞增殖能力分析(图14d)。结果表明，过表达ATP6AP1L对K-562细胞的增殖也有显著的抑制作用，而且与未经过分选的细胞相比，亲和分选出来的高表达ATP6AP1L基因的转染阳性细胞表现出了进一步降低的细胞增殖活性。该结果表明，此亲和分选系统可以提高目标细胞中的基因过表达水平，并大大促进基因生物学功能的研究。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学
<120> 一种阳性转染细胞亲和分选方法及试剂盒
<130> 202125748
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 277
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Pro Val Ala Thr
20 25 30
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
35 40 45
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
50 55 60
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
65 70 75 80
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
85 90 95
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
100 105 110
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
115 120 125
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
130 135 140
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
145 150 155 160
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
165 170 175
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
180 185 190
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
195 200 205
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
210 215 220
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
225 230 235 240
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
245 250 255
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ser
260 265 270
Gly Arg Thr Gln Ile
275
<210> 2
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Thr Val Ala Arg Pro Ser Val Pro Ala Ala Leu Pro Leu Leu Gly
1 5 10 15
Glu Leu Pro Arg Leu Leu Leu Leu Val Leu Leu Cys Leu Pro Ala Val
20 25 30
Trp Gly Thr Ser Thr Glu Gly Phe Pro Ser Arg Thr Thr Lys His Phe
35 40 45
His Glu Thr Thr Pro Asn Lys Gly Ser Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr
50 55 60
Arg Leu Leu Ser Gly His Thr Cys Phe Thr Leu Thr Gly Leu Leu Gly
65 70 75 80
Thr Leu Val Thr Met Gly Leu Leu Thr
85
<210> 3
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Leu Leu Glu Pro Gly Arg Gly Cys Cys Ala Leu Ala Ile Leu Leu
1 5 10 15
Ala Ile Val Asp Ile Gln Ser Gly Gly Thr Ser Thr Glu Gly Phe Pro
20 25 30
Arg Gln His Leu Glu Phe Ser His Asn Glu Gly Thr Leu Ser Ser Gly
35 40 45
Phe Leu Gln Glu Lys Val Trp Val Met Leu Val Thr Ser Leu Val Ala
50 55 60
Leu Gln Ala Leu
65
<210> 4
<211> 84
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Met Gly Ser Pro Ser Ala Cys Pro Tyr Arg Val Cys Ile Pro Trp Gln
1 5 10 15
Gly Leu Leu Leu Thr Ala Ser Leu Leu Thr Phe Trp Asn Leu Pro Asn
20 25 30
Ser Ala Gln Thr Thr Ser Thr Glu Gly Phe Pro Ser Arg Ser Asp Pro
35 40 45
Val Thr Leu Asn Val Arg Tyr Glu Ser Val Gln Ala Ser Ser Pro Asp
50 55 60
Leu Ser Ala Gly Thr Ala Val Ser Ile Met Ile Gly Val Leu Ala Gly
65 70 75 80
Met Ala Leu Ile
<210> 5
<211> 101
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Met Arg Ala Arg Pro Arg Pro Arg Pro Leu Trp Ala Thr Val Leu Ala
1 5 10 15
Leu Gly Ala Leu Ala Gly Val Gly Val Gly Gly Pro Thr Ser Thr Glu
20 25 30
Gly Phe Pro Ile Leu Tyr Val Val Glu Glu Pro Glu Cys Pro Lys Gly
35 40 45
Pro Asp Ile Leu Val Val Leu Leu Ser Val Met Gly Ala Ile Leu Leu
50 55 60
Ile Gly Leu Ala Ala Leu Leu Ile Trp Lys Leu Leu Ile Thr Ile His
65 70 75 80
Ala Arg Lys Glu Phe Ala Lys Phe Glu Glu Glu Arg Ala Arg Ala Lys
85 90 95
Ala Asp Thr Ala Asn
100
<210> 6
<211> 101
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Met Ala Phe Pro Pro Arg Arg Arg Leu Arg Leu Gly Pro Arg Gly Leu
1 5 10 15
Pro Leu Leu Leu Ser Gly Leu Leu Leu Pro Leu Cys Arg Ala Phe Asn
20 25 30
Thr Ser Thr Glu Gly Phe Pro Trp Gly Ile Gln Pro Ala Pro Met Pro
35 40 45
Val Pro Val Trp Val Ile Ile Leu Ala Val Leu Ala Gly Leu Leu Leu
50 55 60
Leu Ala Val Leu Val Phe Val Met Tyr Arg Met Gly Phe Phe Lys Ala
65 70 75 80
Val His Pro Pro Gln Glu Glu Gln Glu Arg Glu Gln Leu Gln Pro His
85 90 95
Glu Asn Gly Glu Gly
100
<210> 7
<211> 675
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atgggctccc ctatactagg ttattggaaa attaagggcc ttgtgcaacc cactcgactt 60
cttttggaat atcttgaaga aaaatatgaa gagcatttgt atgagcgcga tgaaggtgat 120
aaatggcgaa acaaaaagtt tgaattgggt ttggagtttc ccaatcttcc ttattatatt 180
gatggtgatg ttaaattaac acagtctatg gccatcatac gttatatagc tgacaagcac 240
aacatgttgg gtggttgtcc aaaagagcgt gcagagattt caatgcttga aggagcggtt 300
ttggatatta gatacggtgt ttcgagaatt gcatatagta aagactttga aactctcaaa 360
gttgattttc ttagcaagct acctgaaatg ctgaaaatgt tcgaagatcg tttatgtcat 420
aaaacatatt taaatggtga tcatgtaacc catcctgact tcatgttgta tgacgctctt 480
gatgttgttt tatacatgga cccaatgtgc ctggatgcgt tcccaaaatt agtttgtttt 540
aaaaaacgta ttgaagctat cccacaaatt gataagtact tgaaatccag caagtatata 600
gcatggcctt tgcagggctg gcaagccacg tttggtggtg gcgaccatcc tccaaaatcg 660
gatctggttc cgcgt 675

Claims (26)

1.一种表达框，其特征在于，所述表达框中包括膜定位信号肽、荧光蛋白及亲和分选标签的编码序列；
当亲和分选标签为Twin-Strep-tag时，所述膜定位信号肽为BY55、DAF、CEAM7、ITB3、ITA5或ITAV；
或，当亲和分选标签为GST时，所述膜定位信号肽为BY55、DAF或CEAM7。
2.如权利要求1所述表达框，其特征在于，所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白。
3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体中包括权利要求1或2所述表达框。
4.如权利要求3所述表达载体，其特征在于，所述表达载体包括细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒或哺乳动物细胞病毒。
5.如权利要求4所述表达载体，其特征在于，所述表达载体的为天然或重组质粒、黏粒、病毒和噬菌体。
6.如权利要求5所述表达载体，其特征在于，所述噬菌体载体或黏粒载体为pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、卡隆4A和卡隆21A。
7.如权利要求5所述表达载体，其特征在于，所述质粒载体为pBR型、pUC型、pBluescriptII型、pGEM型、pTZ型、pCL型和pET型。
8.一种转染阳性细胞的亲和分选试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求3-7任一项所述表达载体、磁珠及宿主细胞。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述宿主细胞为真核细胞，包括贴壁细胞及悬浮细胞；所述贴壁细胞包括Lenti-X 293T细胞及前列腺癌细胞22Rv1；所述悬浮细胞包括白血病细胞K-562及Jurkat细胞。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述宿主细胞为K-562细胞。
11.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述磁珠表面具有亲和分选标签的配体蛋白修饰。
12.如权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述配体蛋白为Strep-Tactin蛋白。
13.如权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述亲和分选标签为Twin-Strep-tag，所述磁珠为Magrose Strep-Tactin磁珠。
14.一种转染阳性细胞的亲和分选方法，其特征在于，所述分选方法包括将目的基因导入权利要求1或2所述表达框或权利要求3-7任一项所述表达载体，并在宿主细胞中进行DNA转染，通过磁珠分离转染阳性细胞。
15.如权利要求14所述转染阳性细胞的亲和分选方法，其特征在于，分选方法具体步骤如下：将目的基因导入所述表达载体，将表达载体转入宿主细胞进行DNA转染，所述转染时间为36-48小时，收集细胞并洗涤，将洗涤后的细胞与含有磁珠的缓冲液混合，孵育一段时间后形成磁珠-细胞复合物，固定所述磁珠-细胞复合物，移除体系中的缓冲液以及其中未被磁珠结合的细胞，再加入洗脱液进行洗脱，收集洗脱液，即获得转染阳性细胞。
16.如权利要求15所述转染阳性细胞的亲和分选方法，其特征在于，所述磁珠-细胞复合物的固定方式包括通过外加磁场进行固定和自然沉降方式。
17.如权利要求15所述转染阳性细胞的亲和分选方法，其特征在于，所述DNA转染方法包括磷酸钙共沉淀法，转染试剂转染，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装。
18.如权利要求15所述转染阳性细胞的亲和分选方法，其特征在于，所述细胞为贴壁细胞时，需要采用胰酶进行消化。
19.如权利要求15所述转染阳性细胞的亲和分选方法，其特征在于，所述洗涤后的细胞加入含有磁珠的缓冲液后，在室温条件下孵育10～20min。
20.如权利要求15所述转染阳性细胞的亲和分选方法，其特征在于，所述分选方法中，清洗和孵育使用的缓冲液为含有0.05～0.15％BSA的DPBS溶液。
21.如权利要求14所述转染阳性细胞的亲和分选方法，其特征在于，所述分选方法还包括对阳性转染细胞进行定量的方法。
22.如权利要求21所述转染阳性细胞的亲和分选方法，其特征在于，通过检测荧光蛋白的荧光强度进行定量。
23.如权利要求22所述转染阳性细胞的亲和分选方法，其特征在于，通过流式细胞仪进行定量。
24.权利要求1或2所述表达框、权利要求3-7任一项所述表达载体、权利要求14所述阳性转染细胞亲和分选方法在基因组编辑评价领域的应用。
25.如权利要求24所述表达框、表达载体、阳性转染细胞亲和分选方法在基因组编辑评价领域的应用，其特征在于，所述基因组编辑评价包括基因过表达分析、基因敲降分析、报告基因分析、基因编辑分析以及相关的细胞功能研究实验。
26.如权利要求25所述的应用，其特征在于，所述基因敲除为shRNA基因敲除，所述基因组编辑为CRISPR/Cas9基因组编辑。
CN202111049960.3A 2021-09-08 2021-09-08 一种阳性转染细胞亲和分选方法及试剂盒 Active CN113881701B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111049960.3A CN113881701B (zh) 2021-09-08 2021-09-08 一种阳性转染细胞亲和分选方法及试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111049960.3A CN113881701B (zh) 2021-09-08 2021-09-08 一种阳性转染细胞亲和分选方法及试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113881701A CN113881701A (zh) 2022-01-04
CN113881701B true CN113881701B (zh) 2024-04-19

Family

ID=79008578

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111049960.3A Active CN113881701B (zh) 2021-09-08 2021-09-08 一种阳性转染细胞亲和分选方法及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113881701B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114540414A (zh) * 2022-02-14 2022-05-27 山东大学 一种基于通用分选标签质粒的基因转染系统、方法及试剂盒

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106255752A (zh) * 2014-02-28 2016-12-21 格兰马克药品股份有限公司 表达构建体和用于选择表达多肽的宿主细胞的方法
CN110418802A (zh) * 2017-01-20 2019-11-05 朱诺治疗学有限公司 细胞表面缀合物及相关的细胞组合物和方法
CN111826398A (zh) * 2019-04-16 2020-10-27 常州费洛斯药业科技有限公司 用于活细胞间膜蛋白展示和相互作用检测的工程质粒系统

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106255752A (zh) * 2014-02-28 2016-12-21 格兰马克药品股份有限公司 表达构建体和用于选择表达多肽的宿主细胞的方法
CN110418802A (zh) * 2017-01-20 2019-11-05 朱诺治疗学有限公司 细胞表面缀合物及相关的细胞组合物和方法
CN111826398A (zh) * 2019-04-16 2020-10-27 常州费洛斯药业科技有限公司 用于活细胞间膜蛋白展示和相互作用检测的工程质粒系统

Also Published As

Publication number Publication date
CN113881701A (zh) 2022-01-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Corso et al. Systematic characterization of extracellular vesicle sorting domains and quantification at the single molecule–single vesicle level by fluorescence correlation spectroscopy and single particle imaging
Peris et al. Tubulin tyrosination is a major factor affecting the recruitment of CAP-Gly proteins at microtubule plus ends
Faza et al. Sem1 is a functional component of the nuclear pore complex–associated messenger RNA export machinery
Ganguly et al. Functional analysis of the hydrophilic loop in intracellular trafficking of Arabidopsis PIN-FORMED proteins
US10538570B2 (en) Targeted and modular exosome loading system
Jiu et al. Myosin-18B promotes the assembly of myosin II stacks for maturation of contractile actomyosin bundles
Schenkman et al. The role of cell cycle–regulated expression in the localization of spatial landmark proteins in yeast
Stavru et al. Nuclear pore complex assembly and maintenance in POM121-and gp210-deficient cells
JP2001514510A (ja) 細胞表現型に影響を与える因子をコードする核酸配列を同定するための方法
JP2001522587A (ja) 光発出足場上に提示されたペプチドライブラリーのための方法および組成物
CA2189975A1 (en) Peptide-mediated gene transfer
Bear et al. Nuclear poly (A)-binding protein PABPN1 is associated with RNA polymerase II during transcription and accompanies the released transcript to the nuclear pore
US7157571B2 (en) Hepatoma specific chimeric regulatory sequence
CN112041486A (zh) 周质空间中蛋白质的酵母展示
CN113881701B (zh) 一种阳性转染细胞亲和分选方法及试剂盒
JP2023514975A (ja) キメラ小胞局在化部分を含む非天然発生の小胞、その産生方法、およびその使用
CN111569065A (zh) 纳米抗体靶向性泛素化降解细胞内源性Survivin的组合物及其应用
JP2001523442A (ja) 相同組換えにおける陽性−陰性選択
JP4271026B2 (ja) アクチン重合状態の調節剤を含む腫瘍病変の診断、予防又は治療用の薬剤組成物
EP4061834A1 (en) Chemically inducible polypeptide polymerization
Katta et al. Sec66-dependent regulation of yeast spindle-pole body duplication through Pom152
JPH11506939A (ja) 分泌リーダーのトラップクローニング法
Yang et al. A gene transfer-positive cell sorting system utilizing membrane-anchoring affinity tag
Kuzmić et al. Septin-microtubule association requires a MAP-like motif unique to Sept9 isoform 1 embedded into septin octamers
CN114540414A (zh) 一种基于通用分选标签质粒的基因转染系统、方法及试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant