CN112986574A - 一种用于评价lag3抗体的生物学活性的方法及其试剂盒 - Google Patents

一种用于评价lag3抗体的生物学活性的方法及其试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN112986574A
CN112986574A CN201911295821.1A CN201911295821A CN112986574A CN 112986574 A CN112986574 A CN 112986574A CN 201911295821 A CN201911295821 A CN 201911295821A CN 112986574 A CN112986574 A CN 112986574A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lag3
cells
biological activity
lag3 antibody
expressing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201911295821.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112986574B (zh
Inventor
张婵
张先鹏
李凡
施荷
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangdong Fapon Biopharma Inc
Original Assignee
Guangdong Fapon Biopharma Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangdong Fapon Biopharma Inc filed Critical Guangdong Fapon Biopharma Inc
Priority to CN201911295821.1A priority Critical patent/CN112986574B/zh
Publication of CN112986574A publication Critical patent/CN112986574A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112986574B publication Critical patent/CN112986574B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56972—White blood cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56977—HLA or MHC typing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G01N33/6866—Interferon
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G01N33/6869—Interleukin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于评价LAG3抗体的生物学活性的方法及其试剂盒，涉及LAG3抗体活性检测技术领域。具体而言，该用于评价LAG3抗体的生物学活性的方法包括将表达LAG3蛋白的T淋巴瘤细胞和表达MHCII的细胞的混合产物与待评价LAG3抗体共孵育，检测孵育产物中细胞因子的表达量。该方法仅需要构建一种稳定表达LAG3蛋白的细胞株，体系构建时间短且稳定性好，能够有效检测LAG3抗体的活性。

Description

一种用于评价LAG3抗体的生物学活性的方法及其试剂盒
技术领域
本发明涉及LAG3抗体活性检测技术领域，具体而言，涉及一种用于评价LAG3抗体的生物学活性的方法及其试剂盒。
背景技术
LAG3(Lymphocyte Activation Gene-3，淋巴细胞活化基因3，也称作CD223)是一种I型跨膜免疫球蛋白超基因家族成员。其能与MHC II类分子(组织相容性复合物II类分子)结合，负向调节免疫反应。通过研发抑制LAG3与MHC II分子结合的LAG3抗体，可上调免疫反应，增强细胞的抗肿瘤能力。
现有技术多采用超抗原葡萄球菌肠毒素(SEB)刺激健康人PBMC分泌细胞因子，或者通过异体T-DC混合淋巴细胞反应来评价抗人LAG3(hLAG3)抗体的体外生物学活性。但这两种技术均需要采集健康人外周血以用于分离外周血淋巴细胞PBMC，或需要进一步获得诱导分化后的DC细胞及分离高纯度的T细胞，实验材料获取困难，实验流程复杂，并且因供者不同，实验稳定性较差。
目前，还可通过荧光素酶报告基因体系，通过检测LAG3蛋白下游信号途径的活化信号，以评价抗hLAG3抗体介导的MHC II类分子的阻断活性，但该方法需要花费大量的时间以构建两种细胞株，即表达LAG3蛋白的稳定细胞株和包含荧光素酶报告基因的稳定细胞株，构建周期长，过程繁琐。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供了一种用于评价LAG3抗体的生物学活性的方法及其试剂盒，该方法包括将表达LAG3蛋白的T淋巴瘤细胞和表达MHC II的细胞的混合产物与待评价LAG3抗体共孵育，检测孵育产物中细胞因子的表达量。
该试剂盒包括有表达LAG3蛋白的T淋巴瘤细胞和表达MHC II的细胞。
本发明具有以下有益效果：
本发明实施例提供的用于评价LAG3抗体的生物学活性的方法，仅需要构建一种稳定表达LAG3蛋白的细胞株，体系构建时间短且稳定性好，能够有效检测LAG3抗体的活性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1中的Jurkat-hLAG3稳定细胞株上hLAG3/CD3的比值结果；
图2为本发明实施例2中Jurkat-hLAG3和Raji细胞共孵育后IL2的分泌结果；
图3为本发明实施例2中14号克隆上hLAG3和CD3的表达情况；
图4为本发明验证例1中丝裂霉素C处理Raji细胞1～3天后Raji细胞的检测结果，其中，图4A为细胞存活率检测结果，图4B为活细胞密度检测结果；
图5为本发明验证例2中加入不同外源刺激因子后IL2的检测结果；
图6为本发明验证例3中不同Jurkat细胞与Raji细胞混合比例以及不同共孵育时间下IL2的检测结果；
图7为本发明验证例4中不同的抗hLAG3抗体在评价体系中IL-2的表达情况；
图8为本发明验证例5中Jurkat-hLAG3和Raji细胞上表达PD1和PDL1的检测结果；
图9为本发明验证例5中不同抗体作用下IL2的分泌情况。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提供了一种用于评价LAG3抗体的生物学活性的方法，其包括：将表达LAG3蛋白的T淋巴瘤细胞细胞和表达MHC II的细胞的混合产物与待评价LAG3抗体共孵育，检测孵育产物中细胞因子的表达量。
在本发明提供的方法中，表达LAG3蛋白的T淋巴瘤细胞细胞与表达MHC II的细胞共孵育后，T淋巴瘤细胞细胞上的LAG3蛋白与MHC II结合，免疫下调，抑制T淋巴瘤细胞细胞分泌细胞因子；当在共孵育产物中加入抗LAG3抗体后，抗LAG3抗体与LAG3蛋白结合，以阻断LAG3蛋白与MHC II的结合，使T淋巴瘤细胞细胞分泌细胞因子的功能恢复，细胞因子的分泌量增加。
在可选实施方式中，所述表达LAG3蛋白的细胞与所述表达MHC II的细胞的细胞数量比为(5～20)：1。具体地，所述表达LAG3蛋白的细胞与所述表达MHC II的细胞的细胞数量可比为5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1或20:1。
在可选实施方式中，所述共孵育的孵育时间为22～26h。具体地，所述共孵育的孵育时间为22h、23h、24h、25h或26h。在该混合孵育时间下，LAG3蛋白的T淋巴瘤细胞细胞分泌细胞因子的能力较强。
在可选实施方式中，所述表达LAG3蛋白的T淋巴瘤细胞中，hLAG3/hCD3的表达比为0.5～40。在该hLAG3/hCD3的表达比的范围内，人源T淋巴瘤细胞能稳定表达LAG3蛋白，使用于评价LAG3抗体的生物学活性的方法的稳定性更好，检测结果更准确。
在可选实施方式中，所述表达LAG3蛋白的T淋巴瘤细胞中，hLAG3/hCD3的表达比为0.8～1.5。具体地，hLAG3/hCD3的表达比可为0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5。
在可选实施方式中，所述表达LAG3蛋白的细胞为人源T淋巴瘤细胞系。
在可选实施方式中，所述表达LAG3蛋白的细胞为Jurkat细胞。
在可选实施方式中，所述表达MHC II的细胞为Raji细胞。
在可选实施方式中，在共孵育前，所述方法包括采用细胞增殖抑制剂处理Raji细胞1～3天。本发明采用细胞增殖抑制剂处理细胞，能够在维持细胞功能的前提下抑制Raji细胞的增殖，保持反应体系的稳定，增加检测结果的稳定性和准确度。
在可选实施方式中，所述增殖抑制剂为丝裂霉素C。
在可选实施方式中，所述丝裂霉素C的作用浓度为1～10μg/ml。
在可选实施方式中，所述丝裂霉素C的作用浓度为2.5～10μg/ml。具体地，所述丝裂霉素C的作用浓度为2.5μg/ml、3μg/ml、3.5μg/ml、4μg/ml、4.5μg/ml、5μg/ml、5.5μg/ml、6μg/ml、6.5μg/ml、7μg/ml、7.5μg/ml、8μg/ml、8.5μg/ml、9μg/ml、9.5μg/ml或10μg/ml。
在可选实施方式中，所述待评价LAG3抗体包括Relatlimab、LAG525、REGN3767、MK-4280、MGD013、Sym022、FS118和GSK2831781中的任意一种。
在可选实施方式中，细胞因子为IL2或干扰素γ，优选为IL2。
此外，本实施例还提供了用于评价LAG3抗体的生物学活性的试剂盒，其包括有表达LAG3蛋白的T淋巴瘤细胞和表达MHC II的细胞。需要说明的是，表达LAG3蛋白的T淋巴瘤细胞和表达MHC II的细胞同上述实施方式所述，在此不再赘述。
在可选实施方式中，该试剂盒还包括丝裂霉素C和/或细胞因子检测试剂。
在可选实施方式中，所述细胞因子检测试剂为IL2检测试剂。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
构建稳定表达人LAG3的Jurkat稳定细胞株。
Jurkat细胞不表达内源性的人LAG3蛋白(hLAG3)，通过慢病毒体系构建稳定表达hLAG3蛋白(序列如SEQ ID No.1所示)的Jurkat稳定细胞株，即Jurkat-hLAG3，具体如下。
用含10％的DMEM完全培养基将293T细胞按5×10E6接种于100mm平皿中，于37℃、5％CO2培养箱培养过夜。次日，待293T细胞生长至汇合率为80～90％，采用聚乙烯亚胺PEI进行质粒转染，37℃、5％CO2培养箱中静置培养。
次日，将细胞上清完全吸去(第一次病毒上清)，加入新鲜的DMEM完全培养基，在培养箱中继续培养48小时。吸取病毒上清后，加入新鲜的完全培养基继续培养1天后，收集上清，并将收集的上清与第一次病毒上清合并后，于4℃、3000×g离心10min后，通过0.45μm滤膜过滤浓缩。
采用流式细胞仪进行慢病毒滴MOI检测。根据MOI，采用助转剂Polybrene进行Jurkat细胞的慢病毒感染，72小时后，采用有限稀释法进行单克隆的筛选，在96孔板中连续培养15-20天后，光学显微镜下观察细胞克隆化情况，然后转移至24孔板中扩大培养，根据细胞生长情况，挑选单克隆化细胞转移至6孔板中，待单克隆细胞生长3天后，采用流式细胞术检测CD3和LAG3的表达，并对挑选出的部分Jurkat-hLAG3细胞株进行传代稳定性评估。
筛选获得的38株Jurkat-hLAG3稳定细胞株上hLAG3/CD3的比值结果如图1所示，hLAG3/hCD3的表达比例介于0.5～40之间，选取hCD3/hLAG3比值介于0.8～3的克隆。
实施例2
Jurkat-hLAG3稳定细胞株的传代稳定性评估。
为防止外源人LAG3基因整合后的丢失，对实施例1得到的部分Jurkat-hLAG3克隆进行稳定性评估。
通过Jurkat-hLAG3和Raji细胞混合培养体系，检测细胞因子IL2的分泌情况：
将5μg/ml CD3抗体包被于96孔板中，次日，按1×10E4/孔Raji细胞，2×10E5/孔Jurkat-hLAG3细胞进行共孵育，37℃连续培养3天后，采用酶联免疫反应ELISA检测上清中IL2的表达，检测结果如图2所示。
由图2可知，相对#34、#35、#87和#95号克隆外，#14号克隆Jurkat-hLAG3几乎没有IL2的分泌，加入Raji细胞后，IL2的分泌量显著上调，说明#14细胞能够明显的评价LAG3抗体的生物学活性。同时，通过流式细胞仪，检测传代过程中不同代次下#14号克隆上LAG3和CD3的表达情况，如图3所示，不同传代下，#14号克隆Jurkat-hLAG3上LAG3与CD3的表达比例介于0.8～1.5之间。
实施例3
评价LAG3抗体的生物学活性的方法。
用1ml含10％FBS的RPMI 1640完全培养基重悬Raji细胞至活细胞密度为5×10E6/ml，在Raji细胞中加入丝裂霉素C至终浓度为2.5μg/ml，37℃细胞培养箱静置处理30min。补加DPBS至10ml，250×g离心5min后，吸弃上清后，用DPBS再次洗涤细胞一次。
最后，细胞完全培养基重悬Raji细胞至活细胞浓度为2×10E5/ml。取Jurkat-hLAG3#14(实施例2提供的)细胞液，250×g离心5min后，调整活细胞浓度至1×10E6/ml。
将Raji细胞和Jurkat-hLAG3#14细胞按等体积混匀后，按100μL/孔均分至96孔平底板中。用细胞完全培养基稀释抗hLAG3抗体至所需浓度。按100μL/孔均分至96孔平底板中。将96孔板转移至37℃，5％CO2细胞培养箱中，培养1天。
收集细胞上清，用Human IL-2,uncoated ELISA kit(eBioscience，Cat.88-7025)进行IL-2的定量检测。
验证例1
验证丝裂霉素C的浓度对于Raji细胞的影响。
采用实施例3提供的方法，并设置6组试验例(试验例1～6)，试验例1～6分别采用不同作用浓度的丝裂霉素C处理Raji细胞，丝裂霉素C处理浓度分别为10μg/ml、7.5μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1μg/ml以及0μg/ml。丝裂霉素C处理Raji细胞1～3天后，检测细胞活性，检测结果如图4所示。
图4A为不同浓度下，细胞存活率检测结果，图4B为不同浓度下，活细胞密度检测结果。
由图4A和4B可知，当丝裂霉素C的作用浓度为2.5μg/ml时，经处理1～3天后的Raji细胞活率不受影响，同时能以最小丝裂霉素浓度抑制Raji细胞的生长。
验证例2
验证外源刺激因子对评价LAG3抗体的生物学活性的方法的影响。
采用实施例3提供的方法，设置5组试验例(试验例1～5)，试验例1～4的区别条件在于分别依次采用5μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml以及0μg/ml OKT3(外源刺激因子)提前包被平板，试验例5为实验当天加入葡萄球菌肠毒素SEB。
5组试验例均对照设置有人IgG4抗体对照组(human IgG4 iso ctrl组)和空白对照组(Blank ctrl组)，检测各试验例中LAG3抗体Relatlimab促进Jurkat-hLAG3分泌IL2的情况，检测结果如图5所示。
由图5可知，在不进行OKT3或SEB刺激的条件下，Jurkat-hLAG3经Raji细胞处理，并加入抗LAG3抗体Relatlimab后，能恢复分泌相当或更多的细胞因子IL-2，因此，实施例3提供的方法不需要外源刺激因子的加入。
验证例3
验证Jurkat细胞与Raji细胞混合比例以及共孵育时间对评价LAG3抗体的生物学活性的方法的影响。
采用实施例3提供的方法，对照设置5组试验例，5组试验例的区别条件在于Jurkat-hLAG3和Raji细胞的细胞数量比依次为1:40、1:20、1:10、1:5以及1:2，每组试验例对照设置2组对照组(human IgG4 iso ctrl组和Blank ctrl组)。检测Jurkat-hLAG3、Raji细胞以及Relatlimab共孵育1天、2天和3天后评价体系中的IL2分泌结果，检测结果如图6所示。
由图6可知，IL-2在孵育1天后分泌量相对孵育2天或3天较高；当Jurkat-hLAG3细胞和Raji细胞的混合比例为5:1时，相对其他混合比例，IL2分泌量相对较高，同时检测到加入抗LAG3抗体Relatlimab介导的刺激Jurkat-hLAG3恢复IL2分泌的能力显著。
验证例4
验证评价LAG3抗体的生物学活性的方法的可行性。
选择6个抗hLAG3抗体采用实施例3提供的方法进行抗体活性评价，分别检测IL2的表达量，检测结果如图7所示。
由图7可知，不同的抗hLAG3抗体在该体系中IL-2的表达量不同。该体系可用于抗hLAG3抗体体外活性的评价。
验证例5
验证评价LAG3抗体的生物学活性的方法的特异性。
采用流式分析术，检测Jurkat-hLAG3和Raji细胞上PD1和PDL1的表达，结果如图8所示，Jurkat-hLAG3和Raji细胞上均有PD1和PDL1的表达。
本实施例采用实施例3提供的方法，设置8组试验例，8组试验例的区别在于待评价抗体不同，区别如下：
试验例1：10μg/ml人LAG3抗体(Relatlimab)；
试验例2：10μg/ml Opdivo(抗hPD1抗体)；
试验例3：0.1μg/ml Opdivo；
试验例4：10μg/ml hIgG4 iso；
试验例5：No Ab(空白对照)；
试验例6：10μg/ml Relatlimab+1μg/ml Opdivo；
试验例7：10μg/ml hlG4 iso+1μg/ml Opdivo；
试验例8：No Ab+1μg/ml Opdivo；
检测8组试验例的IL-2的分泌情况，检测结果如图9所示。由图9可知，仅用Relatlimab作用时，Jurkat-hLAG3细胞有增加IL-2的分泌量，说明该体系仅适用用于抗hLAG3抗体的体外活性评价。
综上，本发明实施例提供了一种表达LAG3蛋白的细胞和用于评价LAG3抗体活性的试剂盒及其方法，该用于评价LAG3抗体活性的方法包括将上述表达LAG3蛋白的细胞与表达MHC II的细胞混合，作为评价体系，通过检测评价体系中分泌的细胞因子的量来鉴定待评价LAG3抗体的生物学活性，该体系具有稳定性好，构建周期短，过程简单等优点。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市菲鹏生物制药股份有限公司
<120> 一种用于评价LAG3抗体的生物学活性的方法及其试剂盒
<130> 250
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 525
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp
1 5 10 15
Val Ala Pro Val Lys Pro Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val
20 25 30
Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile
35 40 45
Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln
50 55 60
His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu
65 70 75 80
Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro
85 90 95
Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly
100 105 110
Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln
115 120 125
Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala
130 135 140
Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys
145 150 155 160
Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro
165 170 175
Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser
180 185 190
Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln
195 200 205
Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser
210 215 220
Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly
225 230 235 240
Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn
245 250 255
Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala
260 265 270
Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val
275 280 285
Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly
290 295 300
Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu
305 310 315 320
Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His
325 330 335
Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr
340 345 350
Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu
355 360 365
Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser Ser
370 375 380
Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala
385 390 395 400
Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln
405 410 415
Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser
420 425 430
Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Pro Ala Gly
435 440 445
His Leu Leu Leu Phe Leu Ile Leu Gly Val Leu Ser Leu Leu Leu Leu
450 455 460
Val Thr Gly Ala Phe Gly Phe His Leu Trp Arg Arg Gln Trp Arg Pro
465 470 475 480
Arg Arg Phe Ser Ala Leu Glu Gln Gly Ile His Pro Pro Gln Ala Gln
485 490 495
Ser Lys Ile Glu Glu Leu Glu Gln Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro
500 505 510
Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Gln Leu
515 520 525

Claims (10)

1.一种用于评价LAG3抗体的生物学活性的方法，其特征在于，其包括：将表达LAG3蛋白的T淋巴瘤细胞和表达MHC II的细胞的混合产物与待评价LAG3抗体共孵育，检测孵育产物中细胞因子的表达量。
2.根据权利要求1所述的用于评价LAG3抗体的生物学活性的方法，其特征在于，所述表达LAG3蛋白的T淋巴瘤细胞与所述表达MHC II的细胞的细胞数量比为(5～20)：1。
3.根据权利要求2所述的用于评价LAG3抗体的生物学活性的方法，其特征在于，所述共孵育的孵育时间为22～26h。
4.根据权利要求1～3任一项所述的用于评价LAG3抗体的生物学活性的方法，其特征在于，所述表达LAG3蛋白的T淋巴瘤细胞中，hLAG3/hCD3的表达比为0.5～40；
优选地，所述表达LAG3蛋白的T淋巴瘤细胞中，hLAG3/hCD3的表达比为0.8～1.5。
5.根据权利要求4所述的用于评价LAG3抗体的生物学活性的方法，其特征在于，优选地，所述T淋巴瘤细胞为人源T淋巴瘤细胞；
优选地，所述表达LAG3蛋白的细胞为Jurkat细胞。
6.根据权利要求4所述的用于评价LAG3抗体的生物学活性的方法，其特征在于，所述表达MHC II的细胞为Raji细胞。
7.根据权利要求6所述的用于评价LAG3抗体的生物学活性的方法，其特征在于，在共孵育前，所述方法包括采用细胞增殖抑制剂处理Raji细胞1～3天；
优选地，所述增殖抑制剂为丝裂霉素C。
8.根据权利要求7所述的用于评价LAG3抗体的生物学活性的方法，其特征在于，所述丝裂霉素C的作用浓度为1～10μg/ml；
优选地，所述丝裂霉素C的作用浓度为2.5～10μg/ml。
9.根据权利要求1所述的用于评价LAG3抗体的生物学活性的方法，其特征在于，所述待评价LAG3抗体包括Relatlimab、LAG525、REGN3767、MK-4280、MGD013、Sym022、FS118和GSK2831781中的任意一种；
优选地，所述细胞因子包括IL2或干扰素γ。
10.用于评价LAG3抗体的生物学活性的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1～7任一项所述的表达LAG3蛋白的T淋巴瘤细胞和表达MHC II的细胞；
优选地，所述试剂盒还包括丝裂霉素C和/或细胞因子检测试剂；
优选地，所述细胞因子检测试剂为IL2检测试剂。
CN201911295821.1A 2019-12-16 2019-12-16 一种用于评价lag3抗体的生物学活性的方法及其试剂盒 Active CN112986574B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911295821.1A CN112986574B (zh) 2019-12-16 2019-12-16 一种用于评价lag3抗体的生物学活性的方法及其试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911295821.1A CN112986574B (zh) 2019-12-16 2019-12-16 一种用于评价lag3抗体的生物学活性的方法及其试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112986574A true CN112986574A (zh) 2021-06-18
CN112986574B CN112986574B (zh) 2023-05-02

Family

ID=76343408

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911295821.1A Active CN112986574B (zh) 2019-12-16 2019-12-16 一种用于评价lag3抗体的生物学活性的方法及其试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112986574B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108949904A (zh) * 2018-07-26 2018-12-07 南京维立志博生物科技有限公司 一种测定lag3蛋白结合分子生物学活性的方法
CN109666699A (zh) * 2018-12-29 2019-04-23 杭州科兴生物科技有限公司 一种基于lag-3/mhc ii阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108949904A (zh) * 2018-07-26 2018-12-07 南京维立志博生物科技有限公司 一种测定lag3蛋白结合分子生物学活性的方法
CN109666699A (zh) * 2018-12-29 2019-04-23 杭州科兴生物科技有限公司 一种基于lag-3/mhc ii阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BHAQWAT B等: "Establishment of engineered cell-based assays mediating LAG3 and PD1 immune suppression enables potency measurement of blocking antibodies and assessment of signal transduction", 《J IMMUNOL METHODS》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112986574B (zh) 2023-05-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Burgler et al. RORC2 is involved in T cell polarization through interaction with the FOXP3 promoter
Moir et al. Evidence for HIV-associated B cell exhaustion in a dysfunctional memory B cell compartment in HIV-infected viremic individuals
Durali et al. In human B cells, IL-12 triggers a cascade of molecular events similar to Th1 commitment
EP3263595A1 (en) Fusion protein for use in the treatment of hvg disease
Prinzing et al. MyD88/CD40 signaling retains CAR T cells in a less differentiated state
EP3728612B1 (en) Method for nk cell transduction
CN109929039A (zh) 基于cd276抗体的嵌合抗原受体、慢病毒表达载体及其应用
Bhagwat et al. Establishment of engineered cell-based assays mediating LAG3 and PD1 immune suppression enables potency measurement of blocking antibodies and assessment of signal transduction
EP3714944A1 (en) Car for use in the treatment of hvg disease
WO2020216229A1 (zh) 同种异体car-t细胞、其制备及应用
Nagata et al. Fc receptor-like 3 protein expressed on IL-2 nonresponsive subset of human regulatory T cells
Battin et al. BTLA inhibition has a dominant role in the cis-complex of BTLA and HVEM
Souter et al. Characterization of human mucosal‐associated invariant T (MAIT) Cells
Holder et al. Human cytomegalovirus IL-10 augments NK cell cytotoxicity
CN113045675B (zh) 一种抗cd22蛋白分子的抗体及其应用
CN112986574B (zh) 一种用于评价lag3抗体的生物学活性的方法及其试剂盒
Mårtensson et al. Characterization of the human chemerin receptor− ChemR23/CMKLR1− as co-receptor for human and simian immunodeficiency virus infection, and identification of virus-binding receptor domains
CN113045676B (zh) 一种抗cd19蛋白分子的抗体及其应用
Wright et al. Detection of engineered T cells in FFPE tissue by multiplex in situ hybridization and immunohistochemistry
Andersen et al. Transduction with human telomerase reverse transcriptase immortalizes a rhesus macaque CD8+ T cell clone with maintenance of surface marker phenotype and function
CA3200770A1 (en) Methods and reagents for characterizing car t cells for therapies
Patel et al. Using CombiCells, a platform enabling titration and combinatorial display of cell surface ligands, to investigate the sensitivity and costimulatory requirements of TCRs and CARs
Bade-Döding et al. Autocrine GM-CSF transcription in the leukemic progenitor cell line KG1a is mediated by the transcription factor ETS1 and is negatively regulated through SECTM1 mediated ligation of CD7
Libri et al. Jakmip1 is expressed upon T cell differentiation and has an inhibitory function in cytotoxic T lymphocytes
CN110079504A (zh) 一种含有不稳定结构域的car-t细胞及其制备方法和调节car-t细胞功能方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant