CN110499328B

CN110499328B - 一种tim3人源化小鼠模型的构建方法及其应用

Info

Publication number: CN110499328B
Application number: CN201910639039.0A
Authority: CN
Inventors: 高翔; 琚存祥; 赵静; 吴丹; 张明坤; 侯欢欢
Original assignee: Jiangsu Jicui Yaokang Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Jicui Yaokang Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-07-16
Filing date: 2019-07-16
Publication date: 2021-07-27
Anticipated expiration: 2039-07-16
Also published as: CN110499328A

Abstract

本发明基于利用基因修饰的技术提供了一种TIM3人源化动物的制备方法，在免疫系统健全的小鼠上，将鼠源Havcr2基因编码的胞外区和跨膜区替换为人源HAVCR2基因编码的胞外区和跨膜区，保留小鼠Havcr2基因的胞内区，构建能与抗人源TIM3单抗相互作用的小鼠模型。该模型与普通小鼠相比，实现了关键靶分子的人源化改造，并且保留了完整的免疫系统，可用于筛选和评价针对人类基因的药物，是非常理想的临床前药物测试模型。

Description

一种TIM3人源化小鼠模型的构建方法及其应用

技术领域

本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及基于基因编辑技术的TIM3基因修饰人源化动物模型的构建方法。

背景技术

癌症免疫疗法是借助人体自身的免疫系统，去攻击癌细胞的治疗方法。免疫系统和癌细胞之间的抗衡是一个长期博弈的动态过程，既正面交锋也相互交织。健康机体的免疫细胞能够发现和杀灭大部分癌变细胞，但在各种先天或者后天因素的诱导下，免疫系统会失去绝对优势，甚至被癌细胞“策反”，成为癌症发生和发展中关键的一员。

肿瘤免疫治疗的种类众多，但其本质上大多都是通过T细胞发挥抗肿瘤作用，包括细胞因子刺激、小分子药物和最新的免疫检查点疗法等都是间接或者直接的激活人体T细胞来清除肿瘤细胞。癌症在恶化的过程中，肿瘤细胞经常会阻碍T细胞对肿瘤的“免疫监视”作用，从而导致免疫逃逸现象的出现。由于T细胞是免疫检查点疗法的核心力量，因而T细胞活性的阻断势必会影响该疗法的效果。针对免疫检查点的治疗是增强T细胞激活的有效策略之一，也是近些年抗肿瘤药物开发最热门靶点。目前临床研究最为透彻的免疫检查点分子有：细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA-4)、PD-1及PD-L1，除此之外还有TIM3、CD27、ICOS、BTLA、VISTA、GITR等位点。

TIM3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3)是一类T细胞表面抑制性分子，能够在癌症与慢性病毒感染过程中引起T细胞的衰竭，亦与肿瘤和移植排斥反应诱导的免疫耐受密切相关。TIM3是目前研究最多的免疫治疗靶点之一，与其他免疫检查点分子不同的是，TIM3并非在所有T细胞激活后都上调，仅在CD4+辅助T细胞1(Th1)和CD8+细胞毒性T细胞中上调，参与协同抑制作用。在由其配体GALECTIN-9激活后，TIM3会抑制效应T细胞的活性，并引起外周免疫耐受。目前有包括TSR-022和LY-3321367等多个靶向TIM3的药物正处在针对不同肿瘤类型的早期临床试验中。

免疫检查点药物的筛选及临床前试验需要在动物模型上进行评价，啮齿类动物作为应用最广泛的实验小动物模型，已成为人类肿瘤治疗研究中不可或缺的替代模型。但由于种属性的差异，在小鼠上筛选的免疫检查点抗体并不完全试用于人类。因此，构建具有人类免疫检查点的人源化小鼠模型，在筛选评价人类的免疫检查点药物中具有非常高的应用价值。

发明内容

本发明针对现有技术不足，利用基因编辑技术，如ES细胞打靶技术，在免疫系统健全的小鼠上，将鼠源的TIM3基因胞外区和跨膜区替换为人源TIM3基因胞外区和跨膜区，构建了可有效评价抗TIM3抗体的小鼠模型。进一步的，本发明以上述模型建立了一种可用于抗TIM3抗体的临床前筛选的TIM3人源化小鼠药效评价平台，可根据该药效评价平台设计合理的抗TIM3抗体的给药方法，为候选抗TIM3抗体提供更准确的临床前药效评价方法。

本发明具体技术方案如下：

一种TIM3人源化动物细胞的构建方法，利用基因编辑技术将鼠源Havcr2基因编码的胞外区和跨膜区替换为人源HAVCR2基因编码的胞外区和跨膜区，保留小鼠Havcr2基因的胞内区，所述人源HAVCR2基因编码的胞外区和跨膜区氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述鼠源Havcr2基因编码的胞外区和跨膜区氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

优选的，所述基因编辑技术为ES细胞打靶技术。具体包括如下步骤：

(1)选择鼠源HAVCR2基因胞外和跨膜区两端作为打靶位点，以鼠源Havcr2基因非替换区作为同源臂，利用同源重组原理设计包含人源HAVCR2基因胞外区的打靶载体；

(2)取小鼠ES细胞，进行打靶载体的电转，电转后筛选鉴定阳性克隆，得到TIM3人源化ES细胞。

优选的，所述打靶载体的序列如SEQ ID No:4所示。

优选的，所述小鼠为BALB/c或C57BL/6小鼠。

本发明另一目的在于提供一种TIM3人源化动物模型的构建方法，采用上述的方法制备得到的TIM3人源化ES细胞注射入小鼠囊胚，将囊胚移植到代孕母体中，进行饲养，移植受体生出的小鼠为F0代小鼠，优选毛色嵌合率高于50％的雄鼠与同背景野生型动物配繁，获得F1代，经基因型鉴定正确的小鼠即为TIM3人源化动物模型。

本发明另一目的在于提供一种双靶点基因修饰TIM3人源化动物模型的构建方法，采用本发明所述的方法制备得到的TIM3人源化动物与非TIM3的免疫检查点人源化鼠配繁获得双靶点人源化鼠。

所述非TIM3的免疫检查点基因选自CD137、PD-1、PD-L1、OX40、CTLA4、TIGIT、BTLA、LAG3、CD28、CD40、ICOS、CD47、SIRPa或VISTA。

本发明另一目的在于提供本发明所述构建方法制备得到的TIM3人源化动物模型在免疫检查点激活或抑制药物活性筛选及评价中的应用。

本发明优点：

本发明使用同源重组与胚胎干细胞技术在C57BL/6背景和BALB/c背景的小鼠ES细胞上将人类HAVCR2基因胞外区和跨膜区替换鼠的Havcr2基因编码的胞外区和跨膜区，保留小鼠Havcr2基因的胞内区，使其能表达人源TIM3，纯合子中人源TIM3的表达丰度与野生型小鼠中鼠源TIM3的一致,由于完整保留了小鼠TIM3蛋白的胞内部分，保证了正常的胞内信号转导。

本发明构建的TIM3人源化小鼠不仅可以用于抗体肿瘤药效的评估，对验证相关药物、免疫相关药物的开发的临床前效果有着重要的指导意义，为TIM3蛋白在免疫系统的通路及功能研究提供理想的模型，为指导临床给药方案设计提供策略。同时也是抗TIM3抗体药物及TIM3激动剂蛋白安全性评价的理想模型，对TIM3抗体药物的毒理学进行临床前体内评价。本发明进一步将自主研发的PD1人源化小鼠与TIM3人源化小鼠配繁，获得PD1与TIM3均人源化小鼠模型，能够用于评价人类PD1抗体，TIM3抗体以及两者联合使用的肿瘤抑制效果及药物的安全性评价，为临床实验提供更有效的用药策略。

附图说明

图1为BALB/c背景F1鼠尾DNA鉴定电泳图。

图2为C57BL/6背景F1鼠尾DNA鉴定电泳图。

图3为BALB/c-hTIM3杂合和纯合小鼠与BALB/c背景鼠脾脏中TIM3表达检测结果。

图4为B6-hTIM3杂合和纯合小鼠和C57BL/6背景鼠脾脏中TIM3表达检测结果。

图5为BALB/c-hTIM3纯合小鼠和BALB/c背景鼠中的淋巴细胞分群检测结果。

图6为BALB/c-hPD1/hTIM3纯合小鼠和BALB/c背景鼠中的淋巴细胞分群检测结果。

图7为BALB/c-hPD1/hTIM3小鼠进行抗人TIM3抗体和PD1抗体药效验证实验结果。

具体实施方式

以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，该实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

下面结合具体实施例对本发明进一步说明。

实施例1TIM3人源化小鼠模型建立

本发明使用同源重组与胚胎干细胞技术在C57BL/6背景和BALB/c背景的小鼠ES细胞上将人类HAVCR2替换鼠的Havcr2基因，从而构建可以表达人源TIM3的小鼠模型。并通过与自主产权的PD1人源化鼠配繁，获得可以表达人源TIM3和PD1的双人源小鼠模型。

1.确定人源片段替换区域及插入的人源序列

根据人源TIM3的结构及功能，选取人源HAVCR2基因编码的胞外区和跨膜区替换鼠源Havcr2基因编码的胞外区和跨膜区，保留小鼠的胞内区，选取的人源HAVCR2基因编码的胞外区氨基酸序列(Aa：1-225)如SEQ ID No.1所示，被替换的鼠源Havcr2基因编码的胞外区氨基酸序列如SEQ ID No.2所示(Aa：1-216)。

2.人源化TIM3蛋白的拼接序列确定

利用同源重组将人源HAVCR2基因编码的胞外区和跨膜区替换BALB/c和C57BL/6鼠源Havcr2基因编码的胞外区和跨膜区，保留BALB/c和C57BL/6小鼠的胞内区序列,打靶成功的TIM3人源化小鼠的氨基酸序列为SEQ ID No.3所示(下划线部分为人源氨基酸序列，非下划线部分为鼠源氨基酸序列)。

MFSHLPFDCVLLLLLLLLTRSSEVEYRAEVGQNAYLPCFYTPAAPGNLVPVCWGKGACPVFECGNVVLR TDERDVNYWTSRYWLNGDFRKGDVSLTIENVTLADSGIYCCRIQIPGIMNDEKFNLKLVIKPAKVTPAPTRQRDFTA AFPRMLTTRGHGPAETQTLGSLPDINLTQISTLANELRDSRLANDLRDSGATIRIGIYIGAGICAGLALALIFGALI FKWYSCKKKKLSSLSLITLANLPPGGLANAGAVRIRSEENIYTIEENVYEVENSNEYYCYVNSQQPS

3.电转注射获得阳性鼠

分别构建BALB/c和C57BL/6阳性鼠，具体方法如下

1)打靶载体、鉴定方案设计，载体构建；

根据需求制定模型制作方案，以非替换区作为同源臂，替换区为人源HAVCR2基因编码的胞外区和跨膜区的核酸序列，利用同源重组原理进行打靶载体及鉴定方案的设计；根据打靶载体方案启动载体构建，打靶载体序列SEQ ID No.4所示。

2)ES电转及阳性克隆的囊胚注射；

i.电转细胞准备：液氮中取一支小鼠ES细胞，复苏换液，经过第2次传代后，于传代后第二天进行打靶载体的电转，电转后的细胞铺到含有相应抗性的饲养层细胞上。

ii.阳性克隆的筛选鉴定：通过载体上携带的抗性标签进行筛选，挑取药筛单克隆进行基因型鉴定，检测通过的克隆安排囊胚注射。

iii.阳性克隆的囊胚注射：

a.将鉴定正确的阳性ES细胞克隆消化成单细胞送至注射组。

b.注射用囊胚准备：挑选合适周龄雌鼠进行超级排卵操作(注射PMSG、HCG)，并于注射HCG后当天下午与单放雄鼠合笼，取见栓2.5天雌鼠的输卵管及子宫，将8细胞期的胚胎挑选出来，清洗干净后转移到提前1小时制备好的M16液滴的培养皿内，放入37℃、5％CO₂培养箱培养过夜。

c.注射：在注射当天，用注射针挑选一些小而亮且边缘比较光滑的ES细胞10-15个，选择高质量的囊胚来注射。用注射针转动胚胎，寻找细胞间隙处进针，注射针进入囊腔后轻轻将ES细胞吹入囊腔，将注射ES细胞的囊胚移入ES-mediun中培养，恢复3-4小时。

d.胚胎移植：见栓2.5天受体鼠称重、腹腔注射麻醉剂。待小鼠进入深度麻醉后，剔除脊柱中下缘2cm处(手术区域)的毛发并消毒，借用手术器械，将输卵管暴露于体腔外，并在输卵管的膨大部前端开一个小口，将吸取已注射样品的胚胎的移植管插入开口处，轻轻吹入胚胎，保证胚胎吹入输卵管膨大部。将子宫、输卵管、卵巢等放回体腔，缝合线缝合肌肉层。创口夹缝合皮肤层，70％酒精消毒伤口处皮肤。将做完移植手术的小鼠放在干净鼠笼内，37℃热台上保温直到小鼠苏醒。将苏醒后的小鼠转移入相应的动物饲养房，等待生仔。

3)小鼠繁育：

移植受体生出的小鼠为嵌合鼠，对毛色嵌合率高于50％的雄鼠进行配繁，后代小鼠标记为F1。按照繁育目标，制定繁育计划，将3-5只基因型符合要求的F1按照计划进行繁育，建系。并通过与PD1人源化鼠配繁获得双靶点人源化鼠。

4)鉴定：

所有F1小鼠出生后1周内进行剪尾，鉴定基因型；建系过程中产生的所有小鼠进行基因型鉴定，以保证小鼠基因的遗传稳定性。

人源化小鼠F1代基因型鉴定：对获得的F1小鼠的鼠尾基因组DNA分别使用两对引物进行中靶后的两端PCR鉴定，引物YF000063KI-5TF1/YF000063KI-5TR1分别位于5’同源臂外及打靶载体的人源片段内，如该对引物扩增产生PCR产物，说明目标载体在小鼠基因组5’进行了有效插入；YF000063KI-3TF1/YF000063KI-3TR1分别位于打靶载体的人源片段内及3’同源臂外，如该对引物扩增产生PCR产物，说明目标载体在小鼠基因组3’进行了有效插入。

表1 F0及F1鉴定TIM3引物

注：KI为中靶基因型；WT为野生型；KI/KI为纯合子；KI/WT为杂合子

PCR反应体系以及反应条件如下表2和表3所示：

表2 PCR反应体系

试剂(Takara R045)	体积(μl)	规格
			PrimeSTAR Max Premix(2×)	12.5	\
ddH<sub>2</sub>O	9.5	\
			Primer	1	10μM
Primer	1	10μM
			Template	1

表3 PCR反应条件

对两端PCR鉴定阳性的小鼠克隆进行测序验证，打靶载体在小鼠基因组中替换编码区后，测序正确的克隆经鉴定为阳性F1小鼠。

结果：BALB/c背景获得24只阳性F1小鼠。F1代鼠尾进行TIM3基因鉴定，F1代小鼠PCR实验结果如图1所示，(左图为TIM3-KI-target 3’端鉴定电泳图，右图为TIM3-KI-target5’端鉴定电泳图，hTIM3F1鼠尾DNA鉴定电泳图，阴性对照为BALB/c基因组DNA；N为空白对照,无模板的对照；P为阳性对照；TRANS 2K PLUS II条带：

8000bp\5000bp\3000bp\2000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp)10#，13#，32#，33#，50#，5#，7#，8#，9#，12#，14#，23#，28#，30#，37#，44-47#，49#，51#，52#，53#，55#小鼠的人源HAVCR2基因5’及3’鉴定均为阳性，表明小鼠为正确进行基因重组的阳性小鼠，简称为BALB/c-hTIM3，其余鉴定无条带的均为阴性。F1大量扩繁后可进一步与自主产权PD1人源化小鼠配繁，获得TIM3与PD1双人源化小鼠纯合子小鼠，简称BALB/c-hPD1/hTIM3。

C57BL/6背景获得11只阳性F0小鼠。C57BL/6背景F1代鼠尾进行TIM3基因鉴定，F1代小鼠PCR实验结果如图2所示(左图为TIM3-KI-target 5’端鉴定电泳图，右图为TIM3-KI-target 3’端鉴定电泳图，阴性对照为C57BL/6基因组DNA；N为空白对照,无模板的对照；P为阳性对照；TRANS 2K PLUS II条带：8000bp\5000bp\3000bp\2000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp)，470#，472#，478-482#，484#，486#，487#，490#小鼠的人源HAVCR2基因5’及3’鉴定均为阳性，表明小鼠为正确进行基因重组的阳性小鼠，简称为B6-hTIM3，其余鉴定无条带的均为阴性。。F1大量扩繁后可进一步与PD1人源化小鼠配繁(制备方法参考中国专利申请201811179743.4，一种PD1人源化BALB/c小鼠模型的构建方法及其应用)，获得TIM3与PD1双人源化小鼠纯合子小鼠，简称B6-hPD1/hTIM3。

实施例2BALB/c-hTIM3和B6-hTIM3小鼠中人源TIM3表达及免疫系统验证

通过流式细胞术分析TIM3纯合小鼠的表达情况并对免疫细胞类群进行检查，经分析能够成功表达人源化基因，且未造成免疫系统明显异常的小鼠可供肿瘤药效实验。

1.蛋白表达检测

选取TIM3主要表达组织胸腺或脾脏，检测组织中TIM3蛋白的表达。

TIM3蛋白流式检测方法：

a)取材：对B6-hTIM3杂合和纯合小鼠与C57BL/6背景鼠及BALB/c-hTIM3杂合和纯合小鼠与BALB/c背景鼠剪取脾脏，称重，置于C型管。

b)消化：外周血室温避光裂红，用FACS buffer洗涤1次；脾脏与胸腺使用酶消化液(PBS含Ca,Mg+2％CS+10mM HEPES+30ugDNase+1.75mg胶原酶D)，37℃，消化30min。将消化完成的脾脏细胞加300μl 0.1M的EDTA终止消化。取1mL用滤膜过滤，除去未消化完全的组织块，每管加2mL FACS buffer中和EDTA。8℃,400g,离心5min,去上清，脾脏每管加3ml 1×RBC混匀，室温避光裂解红细胞5min，8℃,400g,离心5min,去上清，加1mL FACS buffer重悬，过滤；8℃,400g,离心5min,去上清，加FACS buffer重悬，调整细胞浓度1×10⁷/mL，分到流式管中100μL，准备孵育抗体。

c)封闭：根据实验需要，将100μL(约106个)细胞分到不同的流式管中，加Fc block(CD16/32抗体)每管加1μl CD16/32抗体(1:100稀释)混匀，冰上孵育5min。

d)抗体孵育：根据样品管数目配置抗体混合液(hPD-1，mPD-1，hTIM3，mTIM3，CD3抗体)，按照抗体最佳用量添加，每个样加50μL抗体混合液，涡旋混匀；单染管每管加0.5μl抗体，涡旋混匀；冰上避光孵育1h；

e)清洗：FACS buffer洗涤，加入FACS buffer，上机检测。上样前5min添加Sytoxblue(终浓度1:10000稀释)，区分死活细胞。

检测结果：使用人源抗TIM3抗体及鼠源抗TIM3抗体，通过流式细胞仪检测B6-hTIM3杂合及纯合小鼠和C57BL/6背景鼠以及BALB/c-hTIM3杂合及纯合小鼠和BALB/c背景鼠中表达人源和鼠源TIM3T-cell情况，背景鼠中未检测到人源TIM3表达，而BALB/c-hTIM3杂合及纯合小鼠和B6-hTIM3杂合及纯合小鼠中能检测到人源TIM3表达。(如图3和图4所示)。

2.免疫系统验证

选取小鼠的主要免疫器官胸腺或脾脏，剪取BALB/c-hTIM3纯合小鼠和BALB/c背景鼠及BALB/c-hPD1/hTIM3纯合小鼠和BALB/c背景鼠胸腺或脾脏(小鼠信息如下)，将组织研磨消化成单个细胞，用鼠源T\B\NK表面抗体对组织细胞胞外蛋白进行染色，用PBS清洗细胞后，进行流式细胞检测T(CD4+、CD8+)、B、NK细胞数量。

免疫细胞流式检测方法：

a)取材：剪取BALB/c-hTIM3纯合小鼠和BALB/c背景鼠及BALB/c-hPD1/hTIM3纯合小鼠和BALB/c背景鼠胸腺或脾脏置于C型管。

b)消化：脾脏使用酶消化液(PBS含Ca,Mg+2％CS+10mM HEPES+30ugDNase+1.75mg胶原酶D)，37℃，消化30min。将消化完成的脾脏细胞加300μl 0.1M的EDTA终止消化。取1mL用滤膜过滤，除去未消化完全的组织块，每管加2mL FACS buffer中和EDTA。8℃,400g,离心5min,去上清，脾脏每管加3ml 1×RBC混匀，室温避光裂解红细胞5min，8℃,400g,离心5min,去上清，加1mL FACS buffer重悬，过滤；8℃,400g,离心5min,去上清，加FACS buffer重悬，调整细胞浓度1×10⁷/mL，分到流式管中100μL，准备孵育抗体。

d)抗体孵育：根据样品管数目配置抗体混合液(CD19，CD4，CD8，CD335，CD3抗体)，按照抗体最佳用量添加，每个样加50μL抗体混合液，涡旋混匀；单染管每管加0.5μl抗体，涡旋混匀；冰上避光孵育1h；

检测结果：BALB/c-hTIM3纯合小鼠和BALB/c背景鼠中的淋巴细胞分群检测结果如图5所示，BALB/c-hPD1/hTIM3纯合小鼠和BALB/c背景鼠中的淋巴细胞分群检测结果如图6所示。结果显示：BALB/c-hPD1/hTIM3纯合小鼠各T、B、NK免疫细胞数量与BALB/c背景鼠基本无差别。BALB/c-hTIM3纯合小鼠各T、B、NK免疫细胞数量与BALB/c背景鼠基本无差别。以上数据表明人源TIM3参与到了小鼠的免疫应答过程，人源化小鼠免疫系统正常，与普通背景鼠相较无差异，可用于TIM3靶向药物，PD1靶向药及联合用药评价。

3.体内药效验证

在BALB/c-hPD1/hTIM3小鼠模型皮下接种CT26肿瘤细胞系后测试抗人PD1抗体和TIM3抗体的肿瘤抑制药效

药效验证方法：

a)细胞准备：CT26细胞培养于含10％胎牛血清的PRIM1640培养基中，在含5％CO2的37℃的细胞培养箱中连续培养。待细胞长至对数生长期(汇合率在80％-90％)时，用0.25％胰酶消化，收集细胞，并用无血清的1640洗涤细胞二次，最后用无血清的1640悬浮，细胞计数，调整细胞浓度为0.5×108Cells/ml用于接种。

b)小鼠接种CT26细胞悬液(3×10⁵个)100μl于右肋部皮下，挑选肿瘤细胞长至体积约120-180mm³大小后随机分成4组，每组6-7只，给药当天为第0天。按照下表药物给药方式给药，之后每周测2次瘤体积，称量体重，记录数据。

c)当单只动物瘤体积超过3000mm³或一组动物平均瘤体积超过2000mm³，实验终止，对全部小鼠执行安乐死，结束实验。

d)肿瘤生长检测指标

肿瘤体积(mm³)、体重(g)、TGI(计算公式如下)

V_nt：编号为n的小鼠在第t天的肿瘤体积；

V_n0：编号为n的小鼠在第0天的肿瘤体积；

RTV_n：编号为n的小鼠在第t天的肿瘤相对体积；

mean RTV_treat：给药组RTV平均值；

mean RTV_vehicle：Vehicle组RTV平均值。

e)实验分组说明：

实验结果如图7所示。结果显示：a-PD1组(TGI＝11％)及a-PD1与a-TIM3联合用药组(组3TGI＝68％；组4TGI＝58％)对肿瘤生长均有明显的抑制效果。

结果证明：本发明所述方法构建得到的BALB/c-hPD1/hTIM3小鼠是评估抗人TIM3抗体药效的理想动物模型。

序列表

<110> 江苏集萃药康生物科技有限公司

<120> 一种TIM3人源化小鼠模型的构建方法及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 225

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln

20 25 30

Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu

35 40 45

Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly

50 55 60

Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser

65 70 75 80

Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr

85 90 95

Ile Glu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile

100 105 110

Gln Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val

115 120 125

Ile Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe

130 135 140

Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala

145 150 155 160

Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile

165 170 175

Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu

180 185 190

Arg Asp Ser Gly Ala Thr Ile Arg Ile Gly Ile Tyr Ile Gly Ala Gly

195 200 205

Ile Cys Ala Gly Leu Ala Leu Ala Leu Ile Phe Gly Ala Leu Ile Phe

210 215 220

Lys

225

<210> 2

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Phe Ser Gly Leu Thr Leu Asn Cys Val Leu Leu Leu Leu Gln Leu

1 5 10 15

Leu Leu Ala Arg Ser Leu Glu Asn Ala Tyr Val Phe Glu Val Gly Lys

20 25 30

Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Ser Tyr Thr Leu Ser Thr Pro Gly Ala Leu

35 40 45

Val Pro Met Cys Trp Gly Lys Gly Phe Cys Pro Trp Ser Gln Cys Thr

50 55 60

Asn Glu Leu Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asn Val Thr Tyr Gln Lys Ser

65 70 75 80

Ser Arg Tyr Gln Leu Lys Gly Asp Leu Asn Lys Gly Asp Val Ser Leu

85 90 95

Ile Ile Lys Asn Val Thr Leu Asp Asp His Gly Thr Tyr Cys Cys Arg

100 105 110

Ile Gln Phe Pro Gly Leu Met Asn Asp Lys Lys Leu Glu Leu Lys Leu

115 120 125

Asp Ile Lys Ala Ala Lys Val Thr Pro Ala Gln Thr Ala His Gly Asp

130 135 140

Ser Thr Thr Ala Ser Pro Arg Thr Leu Thr Thr Glu Arg Asn Gly Ser

145 150 155 160

Glu Thr Gln Thr Leu Val Thr Leu His Asn Asn Asn Gly Thr Lys Ile

165 170 175

Ser Thr Trp Ala Asp Glu Ile Lys Asp Ser Gly Glu Thr Ile Arg Thr

180 185 190

Ala Ile His Ile Gly Val Gly Val Ser Ala Gly Leu Thr Leu Ala Leu

195 200 205

Ile Ile Gly Val Leu Ile Leu Lys

210 215

<210> 3

<211> 290

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln

20 25 30

Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu

35 40 45

Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly

50 55 60

Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser

65 70 75 80

Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr

85 90 95

Ile Glu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile

100 105 110

Gln Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val

115 120 125

Ile Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe

130 135 140

Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala

145 150 155 160

Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile

165 170 175

Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu

180 185 190

Arg Asp Ser Gly Ala Thr Ile Arg Ile Gly Ile Tyr Ile Gly Ala Gly

195 200 205

Ile Cys Ala Gly Leu Ala Leu Ala Leu Ile Phe Gly Ala Leu Ile Phe

210 215 220

Lys Trp Tyr Ser Cys Lys Lys Lys Lys Leu Ser Ser Leu Ser Leu Ile

225 230 235 240

Thr Leu Ala Asn Leu Pro Pro Gly Gly Leu Ala Asn Ala Gly Ala Val

245 250 255

Arg Ile Arg Ser Glu Glu Asn Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Asn Val Tyr

260 265 270

Glu Val Glu Asn Ser Asn Glu Tyr Tyr Cys Tyr Val Asn Ser Gln Gln

275 280 285

Pro Ser

290

<210> 4

<211> 30610

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agaacgcaga caaaccagaa tgtagagccg ttcacagaga acggttttat agaaccagca 60

ggtgcccagg aaaggaagca aagactgcca tttattaaga gacgtcgggg tacaacagcc 120

agctgcatgt ctgagtctgg atcaaaacaa atcaattaaa aattactttt gagatagaag 180

aacgtgattg tggtctagta catgaattaa acaggagcat caatagcttt gttttgcgta 240

gtagtggttt catgattata cagcatgatt cccttttctg aagtagaggc atactgaagt 300

ctgcgagagt ggctaacata tctatgactc ttttgaaatt actttagcaa ataaaagaca 360

aaagatggaa taaaaactat atgtggtttg gttatttttg tctaaatggg agaagggggg 420

aggtggctca gtggctcaaa gtatcttctg tgtaagcttg acaattggag tcgaatccct 480

gggacccaca ggcgaaggag atcatcagct cctggaagta tcttctcacc tctgtacatt 540

catgtgttcc tggcccgccc ccatctctgt gtgactctcc ctccttccta tcctctctcc 600

ctttctctct ttctttctgt gtgtctcttg tatctctcta tttttctgtc tctttcttcc 660

cttcatgcac ttaatgatga aattataaaa tgaaaagggg taagattata ttttaccttt 720

tttttttttt ttgtctgttt gttcccagag acttaaggga agtaggagtc taaaatattg 780

ctaggcacgg aggggtggaa acacggttcc taatataaga tttttgttct tgttttttgt 840

tttgttttgt ttttacagca atgcactaag gctgctttta atggtggcac attagagtgt 900

acacggtttc actagcttga gctcatagaa agatgccggt tgactcgagc aaatagcctc 960

aaaatagaaa tatacccaga gccagaccac aggctgtgga gaccgcacag cacacgataa 1020

agatggcctc ttgtattctg tagggtgaat gactgttgac tgacactgat cagagcatgg 1080

gatgaacctt tgtcttcaga tggtctcccc tgtgccttta gttgggtggg agatggggag 1140

aaacgtgctt cctcgagcac ggttttatta atacatgttt tgtttcagta ggacaccaca 1200

cattaagcct gccggagccc tcctgggtat ttctggattg tgttgtgtac atgtgtgctt 1260

gacagcttct cttctcatag ccctgtttgc cttactgttc caattccagc caagtatcct 1320

ttcccacatc ccttgccaac aaactcagta atcctgagtc ccctcagcaa acatccgctt 1380

ttaaaatcta gaaaacagtt ctgaaaggaa aagaagccta cgttgtgaac tctgggcttc 1440

aggacaatag ttctcacgtc acagggctgg cccttccatg ctgtggccct cagaggcggc 1500

catggaaggc actgcgtgtt cactctcttc ctggcatggg cctccttcag actgtcgctg 1560

tatcacacag taacctgctc tggtccaggc ggccctctca gacccttctt actagagcca 1620

ccccgctcct cagcgctgtc acctgtgctg tgtggcctct gagtggggtg cagtgaaggg 1680

gcaggcagga ggctattgct gcacgcttaa ggcacttcct cttcatctac atggcattat 1740

tcaagcttgc ctggctctct actagtatga ccaagtagca taggaacaat gcccaggctc 1800

tctaaataaa tactagcgca ttgtttttcc tagaggtgcc tctgctcgcg tttctacacc 1860

acaccaatct ttccagttcc atgacagaat gtgggccccc ggcagggctg gggtgccgta 1920

ggtgttagca ggcagcctgc acttggtctg cactgaccac tgccttgcct atgggcaccg 1980

caaggagcta gcagttaagc tgttaataca cgagttcata acatttacta gctatttctt 2040

gacttgagaa ctgcgcaatg ttctctatag cgtctggggt acagactaga agaaaataag 2100

atatggaagt gatattctcc ctggaaattc aaatgtaaaa taaagaccgc aacttggaaa 2160

tgtgcttaac gtccctggtc ttccgagtgg acggctgttc tgttccaagg gagagcatcc 2220

catagacaga catctacata ctaagaggta ggacggcagt tagcttcagt gcaacactga 2280

gtcaagcttc ctatatttag ggagaaaact tacaggtccg tccccccccg tggaaactag 2340

atattcttta ctagtttatt gaatttaaaa aaattaagat cccgcatttt taagaggctc 2400

tttacataca gtacagcatc tagttgacag atgtggaaat cggtcagatg agacttcctc 2460

atacactgcc acgacgtaga tctgatgccc tctcttaaaa gaatcctcta aaagaatcct 2520

ataaaaaact gctcccaagc ccctccgaag tcgcaacagt gcagcaaaac cctgagtaag 2580

tagcacctgc tgacccggca ctcacactca aatacagacg gaaaaccgat aggcattttt 2640

ttttcttctg tgtgcaactt ttaaaaacaa atcattaagt tgaaatatcc agtctgcaca 2700

gtgctgtccc ttcacagaag gcaagaaact gccggaggag catcttgtcg gcggctggcc 2760

tcggtgctgt aggctatgaa agtgagcctc cttcagggtc tggttgatgt ggaagtaagg 2820

gccttggcat agtgcagact gctcaggcat cggctggggg gcgtgtgtgt gggggtgctg 2880

gggcaggatc cggggatggt gtggctcagg ctgctctctg gcccactggc cctgtctggg 2940

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caggagtcct ggaagatggg gttcctactg ctccttttgg tctggggagg agggtggttg 3060

tcatcatcac tgccatttct tctccttttt ctggggcgga ggcgctcgct catggcagct 3120

ggtgaaggcg agcgacgcgg cgccaccccg cctcttgttt tgtttttgtt tttatttatt 3180

tctgtaattt ttttacacat ttgaacaggt agctttcttg gatgttgttt gttcttaaat 3240

agactgtgta tttgaaagat gatgagacct tcctgttcgt gaagccaagg gagaaattga 3300

gtaggtctca gggcagacaa tacccttagg ggaactaaaa gtagttactg taggaacttg 3360

aatgagttct tgagagatgg ttgttacaga cagcaagcca ggctctctac ctggctttgg 3420

cttgctgctt cgccatgtga tttctctctc aggcttacct ttcccctatt gtgatgccag 3480

tctccatgag atcctcccag aacttaaccc acactgatgc cttgactcag agactccaaa 3540

acagtgccct ataaaacact tttctttatg ttacctcttc tgagtgtcca tataatagaa 3600

aacggacaag ggccttgcac tgtccaattg acatgagcta gaggagagag agagagacag 3660

agacagagag agagagggag agagagacag agagagacag agagagagac agacacagag 3720

agagacagag agagagagag agggagagag agacagagag agagagagac agacagagag 3780

agagagacag acacagagag agacagagag agagaggcgt caaatgagga aatgtctcca 3840

tgagatccag ctataaagca gtttctctat tagtgatcaa tgggtcaggg ctcaatccat 3900

tgtgggtggt cccatccctg ggctggtggt cctgggttct agaagagagc aggctgagca 3960

agccatgtga ggcaaagcca gtaagcagca cccttctgtg gcctctgcat cagctcctgc 4020

ctccaggatc ctgccctgtt tgagttcctg ccctgacttc cttcagtagt gaacagcaat 4080

gtggaagtgt aagccaaata aaccctttcc tacctagctt gcttttggtc atggtgtttc 4140

aacccagcta tagaaactct aacaaagaca gttctgggag atggctcagt gggtaaagat 4200

aacttaacca tcaaggcaaa aacttgactt tgatccccag gacccacagg tagaaggaga 4260

gagctgacta caagttgtct tctgacatac atgttggtac tctgtaccaa aaaataagtg 4320

actaaaaatt atagcaacaa caataagaag atgaattaaa taacacttca gttttttttt 4380

taaataaatg actcaataaa acactgacta ttgctttagg caatactcat atgtatgggc 4440

aaaaaccctt caaggactgt aattttgaaa ctatgaagta tttccatagt ggggtctatt 4500

tttccccctc gtatgtttat tgctaaatgt tgtcatttat gatgcagatt ctgtgtttta 4560

acatgacaaa aaaacccact aagaagaaaa aaaataagat gaaaaaattc agaactgagt 4620

gcctcacaaa cagaccaagg acgaggtggt ctctatagac tcttccatgg ctgcgcttta 4680

gtaaatttaa aaaaaatcag tgttttacag catttctcac agaaatgggc accgtgggac 4740

atatatataa aatgccagta cttgggcagt agaggcaagg gggatgagaa gtttgaggcc 4800

agcctgggct acataatgaa ttccaggtca gcctaggtta catcagacct catgtcaaac 4860

aaaacagaac caagcaggac atagcaaagc ggtaagagtt ggtttcagca gcaattctag 4920

gtcctgacag taaatgtgac aagacacaga acttcacgct ggtgcactag gaaccacacc 4980

caagagcctt agtcaatatg caaccccccc cccccacaca cacacacttc aggtttaatc 5040

ctctctccat tatacagaaa tgtattttgc aagttgttca tattgatata cgctgacaga 5100

aaagacatta aattcatgca acataattta tagagcaagc ctagggctca ggggacttgt 5160

aattactcta agcacacgcc ttggatctgc cattctcttg agtctctgtt gtctgtagaa 5220

caaggacatt aaataagcat cccttgagta gccctcactc catgattctg tggaagttca 5280

cacactgagc aagttagatg tcttagcagg gtttcccagc agatatttag attaaacaca 5340

tttaaggcat aaagacaagt ggagggggct ctcaggaagg gctgacacag cggaaaccca 5400

ccaggttttc agaaattaca cagcctgggc actgacttcc ctctgtggga aaactttggt 5460

tttgaaggtg tctagataaa tgtcactcgt taatggctga gagtgctaaa gtcttaaatg 5520

gccataaatg tcatggctgg aacttaatgc attctggcga ttcatgttca aagtccccct 5580

tccgtccagg ggaacagagg gaattcctca tgtatatgct atggaatgca acggaataca 5640

gaagtctact cagttctctg tccaaacggt gggccagaag catcgcggca ggaagtatgt 5700

gtttcctaag tagaagattt tgaatgtttg aaggtcaaag tcagaacgac ggcgaagctc 5760

cacatacact actgacacaa cttcttcagt attgttaaca gagaatggca atgtagctca 5820

ggctggcctc atagtcagtg accctcctaa cccagcctcc tgagtgctgg cattgccagt 5880

gtgcacccac cacctgtaat ggtgttttga taatctcctt acttcataat accactataa 5940

acaagaaacg ccagatacag tatcctgata gattacattc taaagtgtat tagaccaggg 6000

atgacagctg agctctcaag ttgtccatag attaaggcta taacaattat cactttatgt 6060

atttactcag ctacctagtt aattagttaa ttttttttcc agacaaggtt tctctgtgga 6120

gcccctgctg ctttggaatt tgctctgtag actaagcctg cctcagagtc agagatctgc 6180

ctgcctctgc ctcccacgtg tctcaatgaa aggtatacac cgccatgctg aacttcactg 6240

atttattctt tagctcccag tccagcgtct ggttcaaagc aggtgcttca agaacattgg 6300

tcacaggcct gattaatgga gagtgacctg actacaccag aacacatgag tgacatgctg 6360

aggattttgt tccctgataa ctggcctggt ctgtacatgg accatctcgg gctattttat 6420

ctgagatcat tggaatactc tctcctcttg ccatgactaa tgcttttcta tctctgaaat 6480

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gtgtgtcatt acacagaact ggaacattct ctgatgtgac tagattaaca gtactaacgt 6600

ggtaatcact ggaggtcaga catcctgggg agcaggctgg cctctgtggg tgtggttagc 6660

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ctatccctac acagagctgt ccttggattt cccctgccaa gtactcatgt tttcacatct 6780

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agtgggtaaa taaatgtgat ataatcatga tacaaacagt gagtctgaca aaacatactg 7020

gtatagaatg tctcaaaatt ataatgttat taaagaaaaa aagttgcaga ataatgcata 7080

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aatgtataag ctctaggaaa aggaaccagg gaatggtaaa gagttgggag agtaaggcat 7200

atttttcttt tcttttcttt cctttttttc tttttctttt ctttcttttt ctttttttca 7260

attgagatgg agtctcactc tattgcccag gctggagtgc agtggtggca ccattttggc 7320

tcactgcaat ctccgcctcc caggttcaag tgattctcct gccttaggca ccggagtagc 7380

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ggttttacca tgttggtcag gctggtctca aactcatggc ctcaagtaat ctgcccatct 7500

cagcctccca aagtgctggg attacaggcg tgacccaccg tgtgcccggc cactttttca 7560

tacacctttg atagtgtttg aatgttttta ctgtagttga gtcatatgaa aacaaagggg 7620

acataaaaaa tcaaaagaaa atatataatg aatgttttat catatataaa atatatatag 7680

ttttttttta atggaattaa ctttgtcatt tgaggaaaat gaggagacaa gtctcaatca 7740

ttttaggaga tttgtttgcc aaagttaagg aggcacctga gagacaggtc tatgactttc 7800

tcagaagatg attttgaggg ctccagattt aaaggggaca aggtgggata ttgagaagca 7860

ctcagttttc acataaaaaa gggggggggg cagaggaaaa atatggggaa tctgcatttt 7920

acattagata acacagacaa aatggggtag ggaaacaatc agataacgca tttgtgtctg 7980

gccagggtga ccgcaccggt aaagatgagc tatcaatctg cattgcacag ctgaccagga 8040

atttccttgt gggcaaaata tgggggaggt atgcagcctt tcatcctgta gccatcttat 8100

tcaggaatca aaaagaggag gcaggtttct gtgacccagt tcccagcttg acttttccct 8160

ttgactgaat gagtttgggg tcccaaaatt taatttcttt tcacaacttt aaaccttaaa 8220

acaactccat gagtagtttc aaatacacaa gatccttatt taaccaaggg tttgtattta 8280

ctgtgcactt gctgcttaaa aagagaagta tgttaggaga gcctcccttt gttgatgaac 8340

aagcaagtag cccagatggg cgggccgttt cctggctgac catgactaat tttctgattg 8400

tctgtttcca tcagccctgt tctcccgtgt tcacagaatt gggccacaat tctctcctag 8460

ggcagtgttt ctgaaagtga ggttctgaga ccagccactt cagcaacact tgagaacttg 8520

ttagaaataa aagttctcag gctctaccac aggccaactg agtcaggaac tctagcagtt 8580

gagcccagca atctgtgttt tcgcaaggct tcccagtgat tctgatggcc ttcacatctg 8640

agaagcattg tcacagcgaa tcatcctcca aacaggactg cagcagtagc ttcctcttta 8700

ttctgtaaga catggcttgc agttttcctg aaatggagta acctcactca ccgcttgagt 8760

cttggctctc cttctctctc tatgcagggt cctcagaagt ggaatacaga gcggaggtcg 8820

gtcagaatgc ctatctgccc tgcttctaca ccccagccgc cccagggaac ctcgtgcccg 8880

tctgctgggg caaaggagcc tgtcctgtgt ttgaatgtgg caacgtggtg ctcaggactg 8940

atgaaaggga tgtgaattat tggacatcca gatactggct aaatggggat ttccgcaaag 9000

gagatgtgtc cctgaccata gagaatgtga ctctagcaga cagtgggatc tactgctgcc 9060

ggatccaaat cccaggcata atgaatgatg aaaaatttaa cctgaagttg gtcatcaaac 9120

caggtgagtg gacatttgca tgccatcttt atgaataaga tttatctgtg gatcatatta 9180

aaggtactga ttgttctcat ctctgacttc cctaattata gccctggagg agggccacta 9240

agacctaaag tttaacaggc cccattggtg atgctcagtg atatttaaca ccttctctct 9300

gttttaaaac tcatgggtgt gcctgggcgt ggtggctcac acctctaatc ccagcacttt 9360

gggaggctga ggccggtgga tcatgaggtc aggaattcga gaccagcctg gccaacatag 9420

taaaaccttg tctccactaa aaatacaaaa aattagccag gcatggttac gggagcctgt 9480

aattctagct acttgggggg ctgaagcagg agaatcactt gaacctggga gtcggaggtt 9540

gtggtaagcc aagatctcgc cattgtactc cagcctggct gacaagggtg aaactctgtc 9600

tcaaaaaaaa aaaaagaaaa gaaaagaaaa gccaaaactc atgggtggaa tgtatagatg 9660

ggatgaaagg cctagatcag tggttagaga ccctgactct cattagaatc acatagagag 9720

tttttaaaca actatagatg ccaggtacag tggctcatgc ctataatccc aatactttga 9780

gaggctgaag caggaggatc acttgaggtc aggagtttga gaccagcctg gctgatatac 9840

tgtggctacc cctatctctt aaaaagcaga agaaaaaacc ccactaccaa aaaccagaga 9900

aatcagcatc tctggaggta gatgctaagc attagctttt tacagagtct acctcaggtg 9960

attttacccc aggtgcagcc agcatggtga actgctgggt tatgcatgta tgctgggagg 10020

tgaacagact taagatttct ataacatgta ctttgtgccc agatagagct gagtttacat 10080

ctaactctgc ctcttactag ctatataatc ctgagcaagt tattgaaacg ctgtgagctc 10140

ctcttctata aaatatgaca ataataccga tcatgtgggc cattagaagg attttatgtg 10200

ataatatttt attaaaagcc tttataggtt gggcatccca aatctgaaaa tctaaaacct 10260

aaaatgcacc aaaatctgaa atgctctaaa atccaaaact ttttggacac tgacatgaca 10320

ttcaaaggaa aagctcattg gaacataagt ataggcagat actaaaaaat aaaaaaataa 10380

aaacatggct gggcgtggtg gctcatgcct ataatcccag cactttggga ggctgaggtg 10440

ggtggatcac ctgaggtcgg gagttcgaga ccagtctgac caacatggag aaaccctgtc 10500

tctactaaaa atacaaaatt agccaggtgt ggttgcacat gcctgtagtc ccagctactc 10560

aggagtctga ggcaggagaa ttgcttgaac ccaggaggcg gaggttgcag tgagccgaga 10620

ttatgccatt gcactccagc ctgggcaaca agagcaaaac tccgtttcaa aaaaaaaaaa 10680

aaaattcaaa atctaaaaca tttctgatct caagcatttc agataaggag tcttcaacct 10740

gtaattatgg ccatttgtgt ggctgttagt tccgctatta ataatcagaa tgtaacaatg 10800

atgactgcat cttacctttg tcaaacattt gaagtgtgtg atacactctc aacgtaggta 10860

tccaggcagg tttggaagct gagggtgtat ttctctttct taattgtctt tcgcattttt 10920

ttcttgctgc ccctttgatt ccctgaaata agctttctgc tctcagataa ttttcatcct 10980

tatgttgttt ctgacattag ccaaggtcac ccctgcaccg actcggcaga gagacttcac 11040

tgcagccttt ccaaggatgc ttaccaccag gggacatggc ccaggtaact atgcatgggg 11100

cagaggaggg aatctttagc tggctctgaa ttcagaggat tttgaatgtg ggaaaaaaag 11160

atgagaaaac agtgtgagag tggaggcatg gatatctccg tgcacctgaa atagtgtttg 11220

aaaagaggga agtggtggag acacacctgt gctgggaaaa agatggtctg gcttaggatt 11280

attttactta aattttaact ggaaaaaagt taataaactt tatagtcttt aattttactt 11340

aaatattaac taaattgaat gaaatgctca ttactttgtc cacattttct gactgaccct 11400

ggactggtga tgtttggtca tgaactggtg tcagtctgtg tttgggaact gacacattgg 11460

attaggtgat ttctaggatg ccttctagct agaataaagc ccatcacctt ccctggattc 11520

cagccacaga aagaatagtt aaattcttca tgtaattcag caaggacgta ctcagggtgc 11580

tccagaagag aacactgggc ataaagcaga agtcaagtca cattgatcat gaaggttaat 11640

tttaaggtat ttcttgtcag tgtcctggtc tcttctaaac tctctggagc tccatttttt 11700

ttttcttctg taaaatgagg ttaataggtg agtcccacct cataatgtca taaatctcat 11760

aaatcacacc ttatgggctt taaataagaa aatgtctaaa acgtttatcc caatgtctga 11820

ccacaatttg tacatgttag ctgttgtcgt taatattata agatcaggag gcacagtgag 11880

attgtggtta aagtacttca gtgacaggtg gaatgggttc taatttcagc tgttcttgat 11940

agctctgtga cctcagtcaa gttgctcaaa ttctctgaag ctcagtttgc tcatctctac 12000

aatgaggata attccagtgc ccatgtcatg aggtggttgt aatgtataaa catgataatg 12060

tatgtaaaat gctcagcata gtacctggcc cataaaaagc actcaactgt ttattattac 12120

tatagttact ggttttagct ctccaaagtt tcagtctttg gttagtcttt agtgattggt 12180

agccaaaggc gcataacgat accacgatat caacaagttt gtacaaaaaa gcaggctggc 12240

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attaattaac ccccccaaaa aaaaggtgcc tatcaccctt ctgcctacct gtgtatcctc 12360

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ggggccagta gcagcaccca cgtccacctt ctgtctagta atgtccaaca cctccctcag 12660

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tgagcagtct gaagatgtgt gcttttcaca gttcaaatcc atgtggctgt ttcacccacc 12900

tgcctggcct tgggttatct atcaggacct agcctagaag caggtgtgtg gcacttaaca 12960

cctaagctga gtgactaact gaacactcaa gtggatgcca tctttgtcac ttcttgactg 13020

tgacacaagc aactcctgat gccaaagccc tgcccacccc tctcatgccc atatttggac 13080

atggtacagg tcctcactgg ccatggtctg tgaggtcctg gtcctctttg acttcataat 13140

tcctaggggc cactagtatc tataagagga agagggtgct ggctcccagg ccacagccca 13200

caaaattcca cctgctcaca ggttggctgg ctcgacccag gtggtgtccc ctgctctgag 13260

ccagctcccg gccaagccag cggcgcgccg ccaccatggg tgctagcgag ctgatcatct 13320

ctggctcctc tggaggattc ctgaggaaca tcggcaagga gtaccaggag gctgctgaga 13380

acttcatgag attcatgaat gaccagggag cctacgcccc taacaccctg agagacctga 13440

ggctggtgtt ccactcctgg gctagatggt gccacgctag acagctggcc tggttcccta 13500

tctctcctga gatggctagg gagtacttcc ttcagctgca cgatgctgac ctggcctcta 13560

ccaccatcga caagcactac gccatgctga acatgctgct gtcccactgt ggcctgcctc 13620

ctctgtctga tgacaagtct gtgagcctgg ccatgaggag aatccggaga gaggctgcca 13680

ccgagaaggg agagagaacc ggccaggcca tccctctgag atgggatgac ctgaagctgc 13740

tggatgtgct gctgtctaga tctgagagac tggtggacct gaggaatagg gccttcctgt 13800

ttgtggccta caacaccctg atgaggatgt ctgagatctc taggatcaga gtgggagacc 13860

tggaccagac cggagacacc gtgaccctgc acatctccca caccaagacc atcaccaccg 13920

ctgctggcct ggacaaagtg ctgtctagga ggaccaccgc tgtgctgaat gactggctgg 13980

atgtgtctgg cctgagagag caccctgacg ctgtgctgtt ccctcctatc caccggagca 14040

acaaggctag gatcaccacc acccctctga ccgcccctgc catggagaag atttttagcg 14100

atgcctgggt gctgctgaac aagagggatg ccacccctaa caagggccgc taccggacct 14160

ggaccggcca ctctgctaga gtgggagctg ccatcgacat ggctgagaag caagtgtcca 14220

tggtggagat catgcaggag ggcacctgga aaaagcctga gacactgatg agatacctga 14280

ggaggggagg agtgtctgtg ggagccaact ctaggctgat ggactccgct agcggcgccg 14340

gtcctaagaa gaagaggaaa gtgtgaggcc acgtaggccc gcgatgaata aatgaaagct 14400

tgcagatctg cgactctaga ggatctgcga ctctagagga tcataatcag ccataccaca 14460

tttgtagagg ttttacttgc tttaaaaaac ctcccacacc tccccctgaa cctgaaacat 14520

aaaatgaatg caattgttgt tgttaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa 14580

agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt 14640

ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat gtctggatct gcgactctag aggatcataa 14700

tcagccatac cacatttgta gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc 14760

tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata 14820

atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc 14880

attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg atctgcgact 14940

ctagaggatc ataatcagcc ataccacatt tgtagaggtt ttacttgctt taaaaaacct 15000

cccacacctc cccctgaacc tgaaacataa aatgaatgca attgttgttg ttaacttgtt 15060

tattgcagct tataatggtt acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc 15120

atttttttca ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat cttatcatgt 15180

ctggatcccc atcaagctga tccggaaccg cttggctgca ggtcgtcgaa attctaccgg 15240

gtaggggagg cgcttttccc aaggcagtct ggagcatgcg ctttagcagc cccgctgggc 15300

acttggcgct acacaagtgg cctctggcct cgcacacatt ccacatccac cggtaggcgc 15360

caaccggctc cgttctttgg tggccccttc gcgccacctt ctactcctcc cctagtcagg 15420

aagttccccc ccgccccgca gctcgcgtcg tgcaggacgt gacaaatgga agtagcacgt 15480

ctcactagtc tcgtgcagat ggacagcacc gctgagcaat ggaagcgggt aggcctttgg 15540

ggcagcggcc aatagcagct ttgctccttc gctttctggg ctcagaggct gggaaggggt 15600

gggtccgggg gcgggctcag gggcgggctc aggggcgggg cgggcgcccg aaggtcctcc 15660

ggaggcccgg cattctgcac gcttcaaaag cgcacgtctg ccgcgctgtt ctcctcttcc 15720

tcatctccgg gcctttcgac ctgcagcctg ttgacaatta atcatcggca tagtatatcg 15780

gcatagtata atacgacaag gtgaggaact aaaccatggg atcggccatt gaacaagatg 15840

gattgcacgc aggttctccg gccgcttggg tggagaggct attcggctat gactgggcac 15900

aacagacaat cggctgctct gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg 15960

ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga actgcaggac gaggcagcgc 16020

ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg 16080

aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc 16140

accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc 16200

ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta 16260

ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg 16320

cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg cgcgcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg 16380

tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat 16440

tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg ttggctaccc 16500

gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta 16560

tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgag 16620

cgggactctg gggttcgaaa tgaccgacca agcgacgccc aacctgccat cacgagattt 16680

cgattccacc gccgccttct atgaaaggtt gggcttcgga atcgttttcc gggacgccgg 16740

ctggatgatc ctccagcgcg gggatctcat gctggagttc ttcgcccacc ccccggatct 16800

aagctctaga taagtaatga tcataatcag ccatatcaca tctgtagagg ttttacttgc 16860

tttaaaaaac ctcccacacc tccccctgaa cctgaaacat aaaatgaatg caattgttgt 16920

tgttaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt 16980

cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt 17040

atcttatcat gtctggatcc ggggcggccg ctaactttaa ataattggca ttatttaaag 17100

ttacacccag ctttcttgta caaagtggtt gatatctcta tagtcgcagt aggcggacat 17160

cttttatgca attagagagg aaactaaata tggtggggac agaaaataat aaagttatac 17220

cagatactta ttgtatgcca ttgttatatt ttaaagaatc ttacaaccat agtgctagaa 17280

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ttttttaatt gagacggagt cttgctctgt cacccagact agagtgcagt ggcgcaatct 17400

cggctcactg caagttccgc ctcctgggtt cacgccattc tcctgcctca gcctcccaag 17460

tagctgggac tacaggcgcc caccatcaag cccagctaat ttttttcttt tttgtatttt 17520

tagtagagac agagtttcac cgtgttagcc aggatggtct ccatctcctg accttgtgat 17580

cctcccgcct cggcctccca aagtgctggg attacacgcg tgagccaccg cgcccggcca 17640

gtacttttta ctacatcacc actgaatggg catttgctgt agacggagtt cactccctgt 17700

cgaggtggtg catttcctta tacttgtctc taccacagac agaagtcttc tttcctttag 17760

tttttctttc cttttttttt ttttttgaga cggagtctca ctctctcacc caggctggag 17820

tgcaatgaca cgatcttggc tcactgcaaa ctctgcctcc caggttcatg ccattctcct 17880

gcctcagcct cccaagtagc tgggattaca gacgcgcgcc accacgcccc gctaattttt 17940

gtatttttat tagagacggg gtttcaccat ggtggccatg ctggtctcga actcctaacc 18000

tcaggtgatc cctctgcctc ggcctcccaa agcgctggga ttacaggtgt aagccaccac 18060

gcccagcctt ccctttagtt tttgtttgtt agttccttcc ctctagggca acaaaaatgg 18120

gaatatagga ataatacctc gaacctctga gcttctcaag ggcctgactg agaaaaaata 18180

ttgaaacaac caaaaatagg tcagtagctc ctaaatagga aaataaaata aaaaattgaa 18240

atgaatgaat atttaatggt ttgtctataa tatgtaacat tatgtaaatt ggctgctggc 18300

aaaccaactc taaatgtggg atgtgggagc atttaatata aaaatggggc tgggcacagt 18360

ggctcacatg tgtaatccca gcactatggg aggccaaggc aggcagatca ctggagctca 18420

ggagttcaag accagcctgg gcaacatggc aaaaccccat ctctactaag aatacaaaaa 18480

attaggctga gtgcagtggc tcacacctgt aatcccagca ctttgggagg ccaaggcaga 18540

tggatcacct gaggtcagga gtttaagcca gcctggccaa gatggtgaaa cccctgtctc 18600

tactaaaaat acaaaaatta gctggtcatg gtggtgcatg cctataattc cagctactca 18660

ggaggctgag gcaggagaat tgtctgagcc tgggaggagt gaaccgagat ctcaccactg 18720

tcctgaagcc tggaaaacag agcgagattc catcccaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaat 18780

agccgggcat ggtggcatgt gcctgtagtc ccagctactt ggcagggctg aggcaggaag 18840

attgcttgaa ctcaggaggt tgaggattca ctgagccgag ttggtgccac tgtactccaa 18900

acctgggcaa cagagcgaga ccctttctca gaaaaaaaaa aaaaaaaaat ggagtagagc 18960

ctttaaaagt aagagatcca agggcctgga atttgaacac agaacaaatg caacttgtct 19020

tctacctgaa ggagtaagga ctgggtcaca ggtgagtcct cagctctaga gtagatctgc 19080

tttaaatcct agctttccca attaatagct gtgtgatctt gggcaaagtg gctctctcag 19140

actcagtatc ttcatctgaa aaatggggaa aatagtagta cctacttatt gtggttgagg 19200

attaaatgag attgtatgta tatggtgcta agcaccatgt ctggcaccta ataagtacca 19260

aatagatggt aactactaaa tttatacact gttaaggcca tcacatctca cctccgctgc 19320

tacctgcccc accaggcaaa tcttggtttc tccagaaaga acattgccac tcccttcaac 19380

tgtcccatcc atcttggttg gtggccaaat ctgtgtgaaa aaaagctgta atgacacaac 19440

agtgcttgat tttactgatc attttcatag caaaatgaag tttttaaaaa gttagtttta 19500

ccatttttat caagaaaaat aattataagg agtctgaaac tggatttaca tttaaaatct 19560

tatgtgcact taagattcat gtttacttag cagttgtact gatgagggtc ttttttttat 19620

ttttttgata tggagtcttg ctctgtcacc aggctggagt gcaatggtgt gatctcggct 19680

cactgcaacc tccacctcct gggttcaagc gattccactg cctcagcctc ctgagtagct 19740

gggactacag gcgtacacca ccacgcccgg ctaatttttt gtattttagt agagatgggg 19800

tttcaccata ttggccagga tggtctcgat ctcctgacct cgtgatctgc ctgccctcgg 19860

cctcccaaag tgctgggatt acaggtgtga gccactgcac caggcctgtg gtttttatat 19920

tttaaatttt tttctggtaa ttagggcaaa agtaattgga acataatctt tttttcttca 19980

ataattttag gctgaggcta tgcctttata atatttaaac tatagtttgc taaaccagca 20040

tttagtcaaa ccctttatac acattaaggc ttccagaagg tgacagtgac atttaagaag 20100

tttcaacatc tctgactcag ccataaaaat gagtaagcat gcttagtttt ccaaaagctg 20160

gcaatgtact tatttttaga attcagtgtt catgaggtca gggcctgtgc ccctcttgtt 20220

tcctgctctg tcccctgtgc ctagagtaag ggcatagtgc atattcatgg aatggatcag 20280

cagatgaaga aataaacaaa tgaacaggaa ggaaagatgg tgagtgggtg gctgggcaac 20340

gtgaccctct tcataatgac agcactgagg taagggctgg tgaaggcagt ataattaaga 20400

atgtgcattt aaggctatgc agacctaaat tggaaggcca ttttgtcatt tgctaagtca 20460

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gactaacagt ctctacttta gaagcgtagt tctaaagtaa gtgcttctaa gtatctctaa 20580

aatgagcttc ttcactgaaa gagtttattt agcacaaggc ctggctccta ttacattgtg 20640

accacagtga ttattttcat ttgttggcaa ccctgtctcc cttctcatga gtaaatgcaa 20700

aacttattta agaaaatgga ggctgggcac ggcacggtgg ctcacgcctg taatcccagc 20760

actttgggag gccgaggcgg gtggatcact tgaggtcagg agttcgagac tagcctggcc 20820

aacatggcga aaccccgtct ctactaaaaa tacaaaaatt agctgtgtgt ggtggtgtgc 20880

ccctgtagtc ccagctacca gggaggctga ggcaggagaa tcgcttgaac tcaggagatg 20940

gaggttgcag tgagcagaga tcatgctact gcactccagc ctgggtgata gagtgagatt 21000

ctgtctcgca aaaagaaaaa aaagaaaaag aacatggagg ttgcagtgag ttgagattgt 21060

gccactgcac tccagcctgg gcaacagagt gagactgtct caaaaaaaca aaaaagaagg 21120

aaatgaattt ttgttgtctt ttaaaatcta attagaatat aatgcctgag gccaagcctg 21180

gtcgttcaca cctgtaatcc cagcattttg ggaggctgag gtgggcagat cacctgaggt 21240

caggagttca caaccagcct ggtcaacatg gcctcgtctc tactaaaaat acaaaaatta 21300

gctgggcgtg gtggtgcatg catgtagtcc cagctacttg ggaggatgag ggatgagaat 21360

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tgggtgacag agtgaaattc tgtgtctaaa taaataaata aataaataat gcctgagtct 21480

tatcaatatt gctagatgtt tgtagaactc attagggtcc tgtgaaaaaa acaaagcaca 21540

tatttaatgt aggacttcct ggcagaagtc tctatttcat aaaacagtac ggttcattat 21600

ctagatgaaa aaatgtggcc atcctaaagt tgattcctgg gtgttcagta aattttgtct 21660

gtctctccat taattattgt gacaagtacg gagtagaatt catttcaaat aggattatag 21720

gcatcattaa gattttttaa aaacttagat aaaagaaaac gttcttaact atactattgg 21780

ctatttttcc tctctctctc tctctctctc tttttatagc agagacacag acactgggga 21840

gcctccctga tataaatcta acagtaagta actttttttg tgagctatgt tgtactcaac 21900

ttggagggga aatcatggct ttagacttcc ttcatgccca ccttgtcctt ggggtaaaaa 21960

gccttaagtt cccttagctt cagattcctg ggctgtaaca tgttgatgat gacagttcta 22020

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ttcttgcttc cattgcaatc ctaatgggaa agagtattta aatttatctc tttaaatatg 22260

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aatgcttgag accaggagtt tgagactagc ctgggccaca tagtgacacc ctgtctctac 23280

aaaaaatatt ttttaaaatt tggccaggca tggtgctgca aacctgtagt tccagctact 23340

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atcatgcccc tgcactccat cctaggtgac agggcaaggc cttgtctcaa aaaaaaaaaa 23460

aaaaaaaaaa ttacttgagg gcatatccag gagcccacat ttatttgact cagtttcttg 23520

cttgtgtatt cacaactgat gctcagcatc ttgtatttgc tccttctctc tttgcaatca 23580

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ggactatagg tgcccgccac cacacctggc taatttttgt atttttagta gagatggggt 24120

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ctctcagtta tcagaaaatc aagttaacta gagcaatagc aataatagct acgattgatt 24360

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tcctgataac tctacaggat tactcagccc ttagtggcag agctgggaat tttttttttt 24480

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tcaactcgag tactccagtc tttgcctcct gggtttaagt gattctcctg cctcagcctc 24600

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cctctggcct ctacttgtga gcagaagtac atgggaaccc ctgacctctc ctgtcttgtc 26220

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tgggcatgca gtgtactttc atagcatgta ggaagctctg gagacccata aaactaggta 26640

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ggataagctt tttccagttt ggttattgta cggagaccat tatcatactt aagatcccaa 27000

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agttgctaaa atatggaatt tccattggta aagatgaaac catctgagaa aaaaaaaaca 27240

ggataaattg atcatgctga ctgtgaactg atgttgctaa gggctttaaa gaggacaggt 27300

tctgtaacta tgatacacaa tatcaaatac actaggtaca actgatactt ggctgggcaa 27360

ccagggtgtt gatgggttga tggtctccaa gtatgttaac caaacagaaa aagcaaaacc 27420

aaaaaccctc ttttctcaag acaggatttc ctgcagctta ccctggcctg gaacatacaa 27480

gtccaaatac atacctatgt gtttgggaac gtgtccaaat tgatggatat aggcattgaa 27540

ataagcctta tttctcccaa ttgttttctg tgccattatt tggtaaatgg gtttttccaa 27600

gaaagaaaca accccataca tactcacaca ggtgtgctca tagactgtat ttaaactctg 27660

gggactgagt acttgaatat gaaatttaga ggccattaga tgatgaaaag agaagtgata 27720

acatgcacta cttttggagg tcttccaaga cctagaagtt aggaattcat gtaaaggata 27780

agaaggaggt aggtattctt cacttagaat cccatcccat gttgggagtt ctttctcttt 27840

ctccctctct ctctttcttt ctttcctttt tccttccttc cttccttcct tccttccttc 27900

cttccttcct tccttccttc cttccttcct ccctccctcc ctccctccct ctctctttct 27960

tcctttttgt cttaaaataa cattcaacga gacagaaaac agacttaaac actataattt 28020

ttttcttcca tcaatttttt tatttattcc ctttacatct caatcacaaa caccccctgc 28080

tcccagtatc ccctcataca gctcttcccc tgccattccc ttctctctga gaaaggggag 28140

ggcctgctgg gcaccaaccc accttgacac atgaagtcac tgcaggacta gacacattct 28200

ctctcactga ggccagacaa ggcatcccat tgaggtgaac aggataccca gaggcaggca 28260

acagagtcag ggacagcccc cagccggttg ttgagggacc tacatgaaga ccaagctaca 28320

cgtctactac atatgcgcag ggtggagtga gggctacatc cagcccatgt atgcttttta 28380

gttggtggtt cagtctctgg gagtccccaa gggtccaggt tagttgactc tgttgttggt 28440

catcctgtgg agtttctatc ccttttagat ccttcaattc ttcccccaac ttttacacaa 28500

gactccccag gctccatctg atgattggct gtgggtctct gcatctgttt tggtcagatg 28560

tttggtggaa cctctcaggg aacatttatt ctaggctcaa gctatgtctg caagcataac 28620

agagtatcat taatattgtc agggattggt tcttgtccat gggatggttc tcaagttagg 28680

cagtcattca ttgaccattc actcagtctc tgctccatct ttgttcctgt actgcttgta 28740

ggcaggacaa attttgggtt aaaagttttg tgggtgggtt ggcatcctta tctttccgtt 28800

gagatttcta cctggaatcc atctacagga ggtgaccact tcaggtttca ctgctaggag 28860

tcttagctag agtcaccctc atagactccc tggagccttc ctcatcccag gtctctggca 28920

tgtcctatgc tcattctaat ctttaaaaga ggcatgggtg aagttcaatt catatatact 28980

gacatctttc aatgcctttc ataagttcta catttatgga ctaaatcata aagccaaaat 29040

aactgaaaat tatttatact taacatgtta catttttaat cccccaaaga aggcagcaga 29100

acaattattt acataggatt tatataatgt ctatcaataa aatgaatggt gtttccaaag 29160

ccaagagaag aacaaagtat ggagttcact taggatatta ttgagattaa ccacaagagc 29220

tatttgtgat tactagtaaa atgggaacga ttttggctta ataaaattta tatctatggt 29280

acttcaagga tagaaaggag atcagcaatt cagaagaaaa ctataaaaga agggatgaag 29340

acttggcaaa ggaaactcac ctttgattct tccttggtta ggagaggacc gaggggagtt 29400

aagcagtggc gaaggatgga tggtcagcta agtcaataga caatcagtag ttagatattt 29460

actcttctga ctattgttta gaagctgtta atccttagga ttagcctttt tctctttggt 29520

aaacattcta gtttataaca tatattctgt ggactcagac attctcttta atcttttcaa 29580

ctcttaaaac gttggtgcag cttgtccccc tgtccagttg atagctccac tttgaaggtt 29640

catagattca catgtcagaa gcaaagctcc tgcatttgta ttccactcac cagcacccaa 29700

ctctcaggct ctggacttct ccatcatttc actctgtctc tctgtttgct tatgccagaa 29760

attcagaaat catctcaaat tgtctttcta atgtcttaat atgtaatcaa cttcagtctc 29820

agtctctgta caaaatacat ctcaaatttc ttcattattc tacatcaaat catcatcctt 29880

atttgtttcg ttatttctcc ttctaatcaa ttctctacgg agtagtcagg ttggaccata 29940

ctgtcattca gcatatagca tacaggtctt cctgtcttac accatctgga ttctttttgt 30000

tgttgtttgg ttggtttgtt ttggtctcat gtgttgcttg cttgcttgct tgctttggac 30060

tcttgatctt cctgccccca gatcccaagg gctgcagtta caggattatg actgagaaag 30120

tctttaggac ccagtctcag cttacctctc agatgttatt ggaggacagc ctcttgttct 30180

agtcatggtt tggttttgac accaacccga tctttaccga gggttctctg tttctgtaac 30240

acccccgccc ccggcagctc ttgatataac tgactcattc ttttctttca gaacagacct 30300

caaatgtcat gtctgaatgt gctctcctaa ccttctctag ttttgtttta gtatgttgct 30360

ggtttctttt gataatggat cacaatttga aactcatttt tgtccctcct tccctccttc 30420

tccccctcca ctcttcatcc ttctttcctc actaggatgt gtgcttcttg gagtcagagc 30480

tcacaactat ccctgtgtgt ccctggtgtc tatcaaactg ctgcacatac agaataagtc 30540

tcgcaatatt tgttaaataa gagctataca ctgatattat ttttaacata gtcataagac 30600

agaactggtc 30610

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcactggagg tcagacatcc 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccctggttcc ttttcctaga gc 22

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tagagtaagc tgccttcccg agg 23

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

caagtagagg ccagaggact g 21

Claims

1.一种 TIM3 人源化动物细胞的构建方法，其特征在于利用基因编辑技术，将鼠源 Havcr2 基因编码的胞外区和跨膜区替换为人源 HAVCR2 基因编码的胞外区和跨膜区，保留小鼠 Havcr2 基因的胞内区，所述人源 HAVCR2 基因编码的胞外区和跨膜区氨基酸序列如 SEQ ID No.1 所示，所述鼠源 Havcr2 基因编码的胞外区和跨膜区氨基酸序列如 SEQID No.2 所示。

2.根据权利要求 1 所述的构建方法，其特征在于所述基因编辑技术为 ES 细胞打靶技术。

3.根据权利要求 2 所述的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）选择鼠源 Havcr2 基因胞外和跨膜区两端作为打靶位点，以鼠源 Havcr2 基因非替换区作为同源臂，利用同源重组原理设计包含人源HAVCR2基因胞外区的打靶载体；

（2）取小鼠 ES 细胞，进行打靶载体的电转，电转后筛选鉴定阳性克隆，得到 TIM3 人源化 ES 细胞。

4.根据权利要求 3 所述的构建方法，其特征在于所述打靶载体的序列如 SEQ ID No:4 所示。

5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于所述小鼠为 BALB/c 或 C57BL/6小鼠。

6.一种TIM3人源化动物模型的构建方法，其特征在于采用权利要求2-5任一项所述的方法制备得到的TIM3人源化ES细胞注射入小鼠囊胚，将囊胚移植到代孕母体中，进行饲养，移植受体生出的小鼠为F0代小鼠，挑选毛色嵌合率高于 50%的性成熟雄鼠与同背景野生型动物配繁获得F1代，经基因型鉴定正确的小鼠即为TIM3人源化动物模型。

7.一种双靶点基因修饰TIM3人源化动物模型的构建方法，其特征在于采用权利要求1-6 任一项所述的方法制备TIM3人源化动物，与非TIM3的免疫检查点人源化鼠配繁获得双靶点人源化鼠。

8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于所述非 TIM3的免疫检查点基因选自CD137、PD-1、PD-L1、OX40、CTLA4、TIGIT、BTLA、LAG3、CD28、CD40、ICOS、CD47、SIRPa 或VISTA。

9.根据权利要求 7 或 8 所述构建方法制备得到的TIM3人源化动物模型在免疫检查点激活或抑制药物活性筛选及评价中的应用。