CN111019972A - 一种cd27人源化小鼠模型的构建方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种制备CD27基因人源化动物的方法，该方法通过同源重组将动物来源的CD27基因编码的胞外替换为人源CD27基因编码的胞外区，保留动物来源CD27基因的胞内区，该方法成功构建了人源化CD27动物模型，该模型能够用于CD27靶向药物或评价CD27靶向药物和其他药物联用的疗效评价。

Description

一种CD27人源化小鼠模型的构建方法及其应用
技术领域
本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及基于基因编辑技术的CD27基因修饰人源化动物模型的构建方法。
背景技术
在近几十年里，肿瘤免疫疗法的发展，特别是免疫检查点分子的发现及应用，颠覆了传统肿瘤治疗。免疫检查点分子是一类表达在免疫细胞表面，可以激活或抑制免疫细胞的功能。利用免疫检测点治疗肿瘤就是通过抗体刺激或抑制免疫检查点蛋白的信号传导，最终是激活免疫细胞对肿瘤细胞的免疫反应。其中抑制性分子细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)和程序性细胞死亡受体1(PD-1)是目前研究最多的两个免疫检查点分子。在此基础上，又挖掘出更多新的免疫检查点分子进入临床试验阶段，包括CD27、CD40、OX40、TIM3、GITR、ICOS等，都成为肿瘤免疫药物研究的标靶。
CD27是TNF受体超家族中的一员，主要表达在T细胞、B细胞及NK细胞表面。当CD27与它的配体CD70结合后，可活化T、B细胞并促进其增殖，也可增强NK细胞的活化和功能。临床前研究发现，CD27激活型抗体能够有效激活免疫细胞对淋巴癌和B16黑色素瘤的抗肿瘤免疫效应，为肿瘤免疫疗法提供了新靶点。目前已有2个抗体进入临床阶段，分别抗体药Cusatuzumab和Varlilumab。
免疫检查点药物的筛选及临床前试验需要在动物模型上进行评价，啮齿类动物作为应用最广泛的实验小动物模型，已成为人类肿瘤治疗研究中不可或缺的替代模型。但由于种属性的差异，在小鼠上筛选的免疫检查点抗体并不完全试用于人类。
为了解决该问题，我们通过基因修饰的方法，将人类的编码基因替换小鼠相应的基因，制备的免疫检查点人源化小鼠模型，具有人类的功能性基因，可用来筛选评价人类的免疫检查点药物。CD27人源化小鼠是指利用基因修饰的方法，在免疫系统健全的小鼠上，将鼠源CD27的胞外区编码基因替换为人源CD27胞外区编码基因，构建能与抗人源CD27抗体相互作用又对内部信号转导不会产生影响的小鼠模型。该模型与普通小鼠相比，实现了关键靶分子的人源化改造，并且保留了完整的免疫系统，可用于筛选和评价针对人类基因的药物，是非常理想的临床前药物测试模型。同时我们将自主研发的PD1人源化小鼠与CD27人源化小鼠配繁，获得PD1与CD27均人源化小鼠模型，能够用于评价人类PD1抗体，CD27抗体以及两者联合使用的肿瘤抑制效果及药物的安全性评价，为临床实验提供更有效的用药策略。
在CD27人源化小鼠的过程中，我们对于基因编辑技术中用到的各个原件和步骤包括人源化区域的选择、同源重组过程中的同源臂的设计、打靶载体的构建、转染、阳新克隆筛选、囊胚注射、受体移植等各项都进行了优化和调整，保证了采用该技术制备CD27人源化动物模型的高成功率和高准确率。
发明内容
本发明提供了一种制备CD27基因人源化动物的方法，其特征在于，包括将动物来源的CD27基因编码的胞外替换为人源CD27基因编码的胞外区，保留动物来源CD27基因的胞内区，所述人源CD27基因编码的胞外区氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。
优选地，利用同源重组将人源CD27基因编码的胞外区替换动物源CD27基因编码的胞外区，打靶成功的CD27嵌合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。
优选地，该方法具体包括如下步骤：
1)打靶载体的构建：利用同源重组原理进行打靶载体设计，所述打靶载体包含a)与待改变的动物源基因区5’端同源的DNA片段，即5’同源臂，b)插入的人源DNA序列；和c)与待改变的动物源基因区3’端同源的第二个DNA片段，即3’同源臂；
2)将打靶载体转染到ES细胞，筛选阳性克隆注射到囊胚，移植到受体动物；
3)从移植受体生产CD27基因人源化动物。
优选地，其中步骤(1)中所述5’同源臂的长度4992bp，序列如SEQ ID NO：3所示；所述3’同源臂长度4996bp，序列如SEQ ID NO：4所示。
优选地，其中所述打靶载体包含SEQ ID NO：5所示的序列。
优选地，其中步骤(2)具体包括如下步骤：
i.电转细胞准备：液氮中取动物的ES细胞，复苏换液，经过第2次传代后，于传代后第二天进行打靶载体的电转，电转后的细胞铺到含有相应抗性的饲养层细胞上；
ii.阳性克隆的筛选鉴定：通过载体上携带的抗性标签进行筛选，挑取药筛单克隆进行基因型鉴定，检测通过的克隆安排囊胚注射；
iii.阳性克隆的囊胚注射：
a.将鉴定正确的阳性ES细胞克隆消化成单细胞送至注射组；
b.注射用囊胚准备：挑选合适周龄雌性动物进行注射PMSG、HCG的超级排卵操作，并于注射HCG后当天下午与单放雄性动物合笼，取见栓2.5天雌性动物的输卵管及子宫，将8细胞期的胚胎挑选出来，清洗干净后转移到提前制备好的培养皿内，放入37℃、5％CO2培养箱培养过夜；
c.注射：在注射当天，用注射针挑选一些小而亮且边缘比较光滑的ES细胞10-15个，选择高质量的囊胚来注射；用注射针转动胚胎，寻找细胞间隙处进针，注射针进入囊腔后轻轻将ES细胞吹入囊腔，将注射ES细胞的囊胚移入培养基培养，恢复3-4小时；
d.胚胎移植：见栓2.5天受体动物称重、腹腔注射麻醉剂；待其进入深度麻醉后，剔除脊柱中下缘2cm处的毛发并消毒，借用手术器械，将输卵管暴露于体腔外，并在输卵管的膨大部前端开一个小口，将吸取已注射样品的胚胎的移植管插入开口处，轻轻吹入胚胎，保证胚胎吹入输卵管膨大部。将子宫、输卵管、卵巢等放回体腔，缝合线缝合肌肉层；创口夹缝合皮肤层，70％酒精消毒伤口处皮肤；将做完移植手术的动物放在干净笼内，37℃热台上保温直到苏醒，苏醒后转移入相应的动物饲养房，等待生仔。
优选地，其中步骤(3)具体包括：
1)后代繁育；
2)鉴定：建系过程中产生的所有后代均进行基因型鉴定，以保证基因的遗传稳定性。
优选地，该方法包括对出生的F1代基因型鉴定：对获得的F1代的基因组DNA分别使用两对引物进行中靶后的两端PCR鉴定，其中一对引物分别位于5’同源臂外及打靶载体的人源片段内，如该对引物扩增产生PCR产物，说明目标载体在小鼠基因组5’进行了有效插入；另一对引物分别位于打靶载体的人源片段内及3’同源臂外，如该对引物扩增产生PCR产物，说明目标载体在小鼠基因组3’进行了有效插入。
优选地，两对引物分别为：
Figure BDA0002346331650000051
。
优选地，所述的方法进一步包括将所述人源化动物与其他基因人源化的动物杂交，优选地与PD1人源化动物配繁获得双靶点人源化动物。
优选地，所述动物为小鼠，尤其是BALB/c或C57BL/6小鼠。
本发明还提供了上述方法在制备筛选CD27靶向药物的动物模型中的应用。
本发明还提供了上述方法在制备评价CD27靶向药物或评价CD27靶向药物和其他药物联用的疗效的动物模型中的应用。
本发明还提供了一种CD27嵌合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明具有以下积极效果：
1、本申请与现有技术中制备CD27人源化动物模型的人源化区段的选择不同，本发明通过选择人源CD27基因的特定片段替换了鼠源CD27的特定片段，该特定人源化区域是发明人经过大量实验确定的、实现小鼠CD27人源化的最优片段，
2、本申请与现有技术中制备CD27人源化动物模型的手段、具体操作均不同。实现了在免疫系统健全的小鼠上，将鼠源的CD27基因片段替换为人源基因片段，构建能与抗人源CD27单抗相互作用的小鼠模型。该模型与普通小鼠相比，实现了关键靶分子的人源化改造，并且保留了完整的免疫系统，可用于筛选和评价针对人类基因的药物，是非常理想的临床前药物测试模型。
3.本发明提供了优化的制备人源化CD27动物模型的具体操作方法，该方法中优化了同源重组的各个步骤和参数。尤其是，通过大量的创造性劳动，获得了效果最优的打靶载体中同源臂、插入片段的设计。此外，制备流程中的转染、阳性克隆的获得、囊胚注射、移植受体、生产配繁等均是申请人付出创造性劳动确定的，这些都确保了动物模型制备的高成功率。
附图说明
图1为CD27-KI-target 5端与3端鉴定电泳图。
图2为C57BL/6-hPD1/hCD27鼠与C57BL/6背景鼠中的CD27及PD1的表达。
图3为C57BL/6-hPD1/hCD27小鼠T/B/NK细胞比例检测。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
实施例1：CD27人源化小鼠模型建立
我们使用同源重组与胚胎干细胞技术在C57BL/6背景和BALB/c背景的小鼠ES细胞上将人类CD27替换鼠的Cd27基因，从而构建可以表达人源CD27的小鼠模型。并通过与自主产权的PD1人源化鼠配繁，获得可以表达人源CD27和PD1的双人源小鼠模型。
1、确定人源片段替换区域及插入的人源序列
根据人源CD27的结构及功能，我们选取人源CD27基因编码的胞外区替换鼠源Cd27基因编码的胞外区，保留小鼠的胞内区，选取的人源CD27基因编码的胞外区氨基酸序列(Aa：1-191)为SEQ ID No：1所示。
MARPHPWWLCVLGTLVGLSATPAPKSCPERHYWAQGKLCCQMCEPGTFLVKDCDQHRKAAQCDPCIPGVSFSPDHHTRPHCESCRHCNSGLLVRNCTITANAECACRNGWQCRDKECTECDPLPNPSLTARSSQALSPHPQPTHLPYVSEMLEARTAGHMQTLADFRQLPARTLSTHWPPQRSLCSSDFIR
2、人源化CD27的拼接序列确定
利用同源重组将人源CD27基因编码的胞外区替换BALB/c和C57BL/6鼠源Cd27基因编码的胞外区，保留BALB/c和C57BL/6小鼠的胞内区序列,打靶成功的CD27人源化小鼠的氨基酸序列为SEQ ID No：2所示(下划线斜体字体为鼠源氨基酸序列，其他为人源氨基酸序列)。
SEQ ID No.2：
Figure BDA0002346331650000081
3、电转注射获得阳性鼠
1)打靶载体、鉴定方案设计，载体构建；
根据需求制定模型制作方案，以非替换区作为同源臂，利用同源重组原理进行打靶载体及鉴定方案的设计；根据打靶载体方案启动载体构建。所述打靶载体包含a)与待改变的小鼠基因区5’端同源的DNA片段，即5’同源臂，长度4992bp，序列如SEQ ID NO：3所示；b)插入的人源DNA序列；和c)与待改变的小鼠基因区3’端同源的第二个DNA片段，即3’同源臂，长度4996bp，序列如SEQ ID NO：4所示。(a)、(b)、(c)三部分构成的序列如SEQ ID NO：5所示。
2)ES电转及阳性克隆的囊胚注射；
i.电转细胞准备：液氮中取一支小鼠ES细胞，复苏换液，经过第2次传代后，于传代后第二天进行打靶载体的电转，电转后的细胞铺到含有相应抗性的饲养层细胞上。
ii.阳性克隆的筛选鉴定：通过载体上携带的抗性标签进行筛选，挑取药筛单克隆进行基因型鉴定，检测通过的克隆安排囊胚注射。
iii.阳性克隆的囊胚注射：
a.将鉴定正确的阳性ES细胞克隆消化成单细胞送至注射组。
b.注射用囊胚准备：挑选合适周龄雌鼠进行超级排卵操作(注射PMSG、HCG)，并于注射HCG后当天下午与单放雄鼠合笼，取见栓2.5天雌鼠的输卵管及子宫，将8细胞期的胚胎挑选出来，清洗干净后转移到提前1小时制备好的M16液滴的培养皿内，放入37℃、5％CO2培养箱培养过夜。
c.注射：在注射当天，用注射针挑选一些小而亮且边缘比较光滑的ES细胞10-15个，选择高质量的囊胚来注射。用注射针转动胚胎，寻找细胞间隙处进针，注射针进入囊腔后轻轻将ES细胞吹入囊腔，将注射ES细胞的囊胚移入ES-mediun中培养，恢复3-4小时。
d.胚胎移植：见栓2.5天受体鼠称重、腹腔注射麻醉剂。待小鼠进入深度麻醉后，剔除脊柱中下缘2cm处(手术区域)的毛发并消毒，借用手术器械，将输卵管暴露于体腔外，并在输卵管的膨大部前端开一个小口，将吸取已注射样品的胚胎的移植管插入开口处，轻轻吹入胚胎，保证胚胎吹入输卵管膨大部。将子宫、输卵管、卵巢等放回体腔，缝合线缝合肌肉层。创口夹缝合皮肤层，70％酒精消毒伤口处皮肤。将做完移植手术的小鼠放在干净鼠笼内，37℃热台上保温直到小鼠苏醒。将苏醒后的小鼠转移入相应的动物饲养房，等待生仔。
3)小鼠繁育：
移植受体生出的小鼠为嵌合鼠，对毛色嵌合率高于50％的雄鼠进行配繁，后代小鼠标记为F1。按照繁育目标，制定繁育计划，将3-5只基因型符合要求的F1按照计划进行繁育，建系。并通过与PD1人源化鼠配繁获得双靶点人源化鼠。
4)鉴定：
所有F1小鼠出生后1周内进行剪尾，鉴定基因型；建系过程中产生的所有小鼠进行基因型鉴定，以保证小鼠基因的遗传稳定性。
人源化小鼠F1代基因型鉴定：对获得的F1小鼠的鼠尾基因组DNA分别使用两对引物进行中靶后的两端PCR鉴定，引物YF000168-hCD27-TF1/YF000168-hCD27-TR1分别位于5’同源臂外及打靶载体的人源片段内，如该对引物扩增产生PCR产物，说明目标载体在小鼠基因组5’进行了有效插入；YF000168-hCD27-TF3/YF000168-hCD27-TR3分别位于打靶载体的人源片段内及3’同源臂外，如该对引物扩增产生PCR产物，说明目标载体在小鼠基因组3’进行了有效插入。
表3 F1鉴定CD27引物
Figure BDA0002346331650000111
注：KI为中靶基因型；WT为野生型；
PCR反应体系以及反应条件如下表所示：
表4 PCR反应体系
Figure BDA0002346331650000112
Figure BDA0002346331650000121
表5 PCR反应条件
Figure BDA0002346331650000122
对两端PCR鉴定阳性的小鼠克隆进行测序验证，打靶载体在小鼠基因组中替换编码区后，测序正确的克隆经鉴定为阳性F1小鼠。
结果：B6背景获得4只阳性F1小鼠。如图1所示，hCD27 F1鼠尾DNA鉴定电泳图，5’及3’鉴定有目的条带的均为阳性，表明小鼠为正确进行基因重组的阳性小鼠；其余鉴定无条带的均为阴性，小鼠处理。图1中，阴性对照为B6基因组DNA；N为空白对照,无模板的对照；P为阳性对照；TRANS 2K PLUS II条带：8000bp\5000bp\3000bp\2000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp。107#，108#，110#，112#小鼠的人源CD27基因5’及3’鉴定均为阳性，表明小鼠为正确进行基因重组的阳性小鼠。F1大量扩繁后可与自主产权PD1人源化小鼠配繁，获得CD27与PD1双人源化小鼠纯合子小鼠，简称B6-hPD1/hCD27。
实施例2：C57BL/6-hPD1/hCD27小鼠中人源CD27表达及免疫系统验证
通过流式细胞术分析CD27纯合小鼠的表达情况并对免疫细胞类群进行检查，经分析能够成功表达人源化基因，且未造成免疫系统明显异常的小鼠可供肿瘤药效实验。
1.蛋白表达检测
选取CD27主要表达组织胸腺或脾脏，检测组织中CD27蛋白的表达。
检测结果：使用人源抗CD27和PD1抗体及鼠源抗CD27和PD1抗体，通过流式细胞仪检测C57BL/6-hPD1/hCD27鼠与B6背景鼠中表达人源和鼠源CD27与PD1表达情况，背景鼠中未检测到人源CD27表达，而C57BL/6-hPD1/hCD27小鼠中能检测到人源CD27表达；背景鼠中未检测到人源PD1表达，而C57BL/6-hPD1/hCD27小鼠中能检测到人源PD1表达(见图2)。
2.免疫系统验证
选取小鼠的主要免疫器官胸腺或脾脏，剪取C57BL/6-hPD1/hCD27纯合小鼠和C57BL/6背景鼠胸腺或脾脏，将组织研磨消化成单个细胞，用鼠源T\B\NK表面抗体对组织细胞胞外蛋白进行染色，用PBS清洗细胞后，进行流式细胞检测T(CD4+、CD8+)、B、NK细胞数量。
检测结果：C57BL/6-hPD1/hCD27纯合小鼠各T、B、NK免疫细胞数量与C57BL/6背景鼠基本无差别。以上数据表明人源CD27参与到了小鼠的免疫应答过程，人源化小鼠免疫系统正常，与普通背景鼠相较无差异，可用于CD27靶向药物，PD1靶向药及联合用药评价。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (14)

1.一种制备CD27基因人源化动物的方法，其特征在于，包括将动物来源的CD27基因编码的胞外替换为人源CD27基因编码的胞外区，保留动物来源CD27基因的胞内区，所述人源CD27基因编码的胞外区氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：利用同源重组将人源CD27基因编码的胞外区替换动物源CD27基因编码的胞外区，打靶成功的CD27嵌合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo：2所示。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于该方法具体包括如下步骤：
1)打靶载体的构建：利用同源重组原理进行打靶载体设计，所述打靶载体包含a)与待改变的动物源基因区5’端同源的DNA片段，即5’同源臂，b)插入的人源DNA序列；和c)与待改变的动物源基因区3’端同源的第二个DNA片段，即3’同源臂；
2)将打靶载体转染到ES细胞，筛选阳性克隆注射到囊胚，移植到受体动物；
3)从移植受体生产CD27基因人源化动物。
4.根据权利要求3所述的方法，其中步骤(1)中所述5’同源臂的长度4992bp，序列如SEQID NO：3所示；所述3’同源臂长度4996bp，序列如SEQ ID NO：4所示。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述打靶载体包含SEQ ID NO：5所示的序列。
6.根据权利要求3所述的方法，其中步骤(2)具体包括如下步骤：
i.电转细胞准备：液氮中取动物的ES细胞，复苏换液，经过第2次传代后，于传代后第二天进行打靶载体的电转，电转后的细胞铺到含有相应抗性的饲养层细胞上；
ii.阳性克隆的筛选鉴定：通过载体上携带的抗性标签进行筛选，挑取药筛单克隆进行基因型鉴定，检测通过的克隆安排囊胚注射；
iii.阳性克隆的囊胚注射：
a.将鉴定正确的阳性ES细胞克隆消化成单细胞送至注射组；
b.注射用囊胚准备：挑选合适周龄雌性动物进行注射PMSG、HCG的超级排卵操作，并于注射HCG后当天下午与单放雄性动物合笼，取见栓2.5天雌性动物的输卵管及子宫，将8细胞期的胚胎挑选出来，清洗干净后转移到提前制备好的培养皿内，放入37℃、5％CO2培养箱培养过夜；
c.注射：在注射当天，用注射针挑选一些小而亮且边缘比较光滑的ES细胞10-15个，选择高质量的囊胚来注射；用注射针转动胚胎，寻找细胞间隙处进针，注射针进入囊腔后轻轻将ES细胞吹入囊腔，将注射ES细胞的囊胚移入培养基培养，恢复3-4小时；
d.胚胎移植：见栓2.5天受体动物称重、腹腔注射麻醉剂；待其进入深度麻醉后，剔除脊柱中下缘2cm处的毛发并消毒，借用手术器械，将输卵管暴露于体腔外，并在输卵管的膨大部前端开一个小口，将吸取已注射样品的胚胎的移植管插入开口处，轻轻吹入胚胎，保证胚胎吹入输卵管膨大部。将子宫、输卵管、卵巢等放回体腔，缝合线缝合肌肉层；创口夹缝合皮肤层，70％酒精消毒伤口处皮肤；将做完移植手术的动物放在干净笼内，37℃热台上保温直到苏醒，苏醒后转移入相应的动物饲养房，等待生仔。
7.根据权利要求3所述的方法，其中步骤(3)具体包括：
1)后代繁育；
2)鉴定：建系过程中产生的所有后代均进行基因型鉴定，以保证基因的遗传稳定性。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：包括对出生的F1代基因型鉴定：对获得的F1代的基因组DNA分别使用两对引物进行中靶后的两端PCR鉴定，其中一对引物分别位于5’同源臂外及打靶载体的人源片段内，如该对引物扩增产生PCR产物，说明目标载体在小鼠基因组5’进行了有效插入；另一对引物分别位于打靶载体的人源片段内及3’同源臂外，如该对引物扩增产生PCR产物，说明目标载体在小鼠基因组3’进行了有效插入。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：两对引物分别为：
Figure FDA0002346331640000031
Figure FDA0002346331640000041
。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，进一步包括将所述人源化动物与其他基因人源化的动物杂交，优选地与PD1人源化动物配繁获得双靶点人源化动物。
11.根据权利要求1-10任一项所述的方法，其特征在于：所述动物为小鼠，尤其是BALB/c或C57BL/6小鼠。
12.权利要求1-11任一项所述的方法在制备筛选CD27靶向药物的动物模型中的应用。
13.权利要求1-11任一项所述的方法在制备评价CD27靶向药物或评价CD27靶向药物和其他药物联用的疗效的动物模型中的应用。
14.一种CD27嵌合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
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