CN106191113A

CN106191113A - 一种mc3r基因敲除猪的制备方法

Info

Publication number: CN106191113A
Application number: CN201610614586.XA
Authority: CN
Inventors: 李秋艳; 徐邢宾; 郝海阳; 张瑾; 李志远; 罗洁
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2016-07-29
Filing date: 2016-07-29
Publication date: 2016-12-07
Anticipated expiration: 2036-07-29
Also published as: CN106191113B

Abstract

本发明公开了一种MC3R基因敲除猪的制备方法。本发明公开的MC3R基因敲除猪的制备方法采用CRISPR/Cas9系统进行，CRISPR/Cas9系统中包含gRNA1的编码基因和gRNA2的编码基因，gRNA1识别MC3R基因的靶序列为序列表中序列1；所述gRNA2识别MC3R基因的靶序列为序列表中序列2。实验证明，利用本发明的MC3R基因敲除猪的制备方法敲除MC3R基因的效率达到29.16％，并且本发明的方法能够快速高效的将目的基因大片段敲除，并且不留下外源基因片段，不仅可以用来研究MC3R基因的作用机制和机理，还可以用于动物育种。

Description

一种MC3R基因敲除猪的制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域中一种MC3R基因敲除猪的制备方法。

背景技术

黑素皮质素受体(Melanocortin Receptors，MCRs)是位于哺乳动物细胞表面的受体，属于G-蛋白偶联受体家族，迄今为止共发现五个成员。MCRs在黑素皮质素(Melanocortin，MC)刺激下，通过结合激活型Gs蛋白来增加胞内第二信使cAMP的浓度，启动胞内信号通路。MCRs各成员间生理作用迥异，MC1R由皮肤黑色素细胞表达，在决定皮肤和头发色素沉着上起着关键作用。MC2R在肾上腺皮质中表达，调节肾上腺甾体合成和细胞增殖。MC5R分布广泛，可能与外分泌功能有关。MC3R和MC4R被认为参与机体能量平衡的调节。近年来MC4R相关研究较多，发现其通过介导瘦素蛋白(Leptin)来调控动物采食和能量平衡。MC3R的研究相对较少，它是由319个氨基酸残基组成，主要表达于下丘脑，属于自身受体(autoreceptor)。研究证明MC3R参与机体能量代谢的调节，目前认为MC3R可与其内源性配体黑素皮质素激素(melanocortin，MC)或刺鼠色蛋白(agouti protein)和agouti相关蛋白(agouti related protein，AGRP)相结合，从而抑制摄食，进而导致血糖、胰岛素和瘦素水平降低，从而减少体脂积累，降低体重。

通常建立基因敲除动物模型，是通过基于同源重组的敲除载体来实现的。这种打靶载体构建繁琐，周期长，费用高，而且效率极低。而且mark基因删除是个麻烦的问题，即使mark-free后也会留下loxp或者flt的基因片段。

基于CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats)/Cas9系统介导的基因组编辑技术，是继锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases,ZFNs)和类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activa-tor-like effectornuclease,TALEN)后的第三代基因组编辑技术，是基于细菌的获得性免疫系统改造而成。CRISPR/Cas9是基于细菌或古细菌规律成簇的间隔短回文重复CRISPR(clusteredregularly interspaced short palindromic repeats)介导的获得性免疫系统衍生而来的基因编辑技术。该技术通过RNA碱基互补配对识别DNA，指导Cas9核酸酶切割识别的双链DNA，诱发同源重组(HDR，homologous directed repair)或非同源末端链接(NHEJ，non-homologous end-joining)，进而实现目的DNA编辑。该技术的基本要求之一就是受体细胞内表达单分子识别RNA(sgRNA,single guiding RNA)，该分子负责识别特异性的基因编辑位点。然后介导结合Cas9蛋白行使DNA酶切活性，在设计的位点引入DNA双链断裂损伤，通过胞内的NHEJ或HDR修复途径引入突变。因此，sgRNA的表达是该技术的重要组成部分。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何采用CRISPR/Cas9技术制备MC3R基因敲除细胞系和MC3R基因敲除猪。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了敲除动物细胞中MC3R基因的方法。

本发明所提供的敲除动物细胞中MC3R基因的方法，所述方法采用CRISPR/Cas9系统进行，所述CRISPR/Cas9系统中包含gRNA1的编码基因和/或gRNA2的编码基因，所述gRNA1识别MC3R基因的靶序列为靶序列1；所述gRNA2识别MC3R基因的靶序列为靶序列2；

所述靶序列1为如下A1)、A2)或A3)：

A1)序列表中序列1的核苷酸序列；

A2)与A1)限定的DNA序列具有75％或75％以上同一性的由A1)衍生的DNA序列；

A3)在严格条件下与A1)限定的DNA序列杂交的由A1)衍生的DNA序列；

所述靶序列2为如下B1)、B2)或B3)：

B1)序列表中序列2的核苷酸序列；

B2)与B1)限定的DNA序列具有75％或75％以上同一性的由B1)衍生的DNA序列；

B3)在严格条件下与B1)限定的DNA序列杂交的由B1)衍生的DNA序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的序列1或序列2的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述敲除动物细胞中MC3R基因的方法中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述敲除动物细胞中MC3R基因的方法可包括向动物细胞中导入所述gRNA1的编码基因和/或所述gRNA2的编码基因，得到敲除MC3R基因的动物细胞。

上述敲除动物细胞中MC3R基因的方法中，所述gRNA1的编码基因可通过含有所述gRNA1的编码基因的表达盒导入所述动物细胞中。所述gRNA2的编码基因可通过含有所述gRNA2的编码基因的表达盒导入所述动物细胞中。所述CRISPR/Cas9系统还包括Cas9的编码基因，所述Cas9的编码基因可通过含有所述Cas9的编码基因的表达盒导入所述动物细胞中。

所述gRNA1和所述Cas9的编码基因可通过含有所述gRNA1的编码基因的表达盒和所述Cas9的编码基因的表达盒的表达载体导入所述动物细胞中。在本发明的一个实施例中，所述表达载体为pX330-target1，pX330-target1为在pX330载体的BbsI的识别序列中插入所述gRNA1的靶序列(即所述靶序列1)得到的重组载体，pX330-target1可表达所述gRNA1和Cas9。

所述gRNA2和所述Cas9的编码基因可通过含有所述gRNA2的编码基因的表达盒和所述Cas9的编码基因的表达盒的表达载体导入所述动物细胞中。在本发明的一个实施例中，所述表达载体为pX330-target2，pX330-target2为在pX330载体的BbsI的识别序列中插入所述gRNA2的靶序列(即所述靶序列2)得到的重组载体，pX330-target2可表达所述gRNA2和Cas9。

上述敲除动物细胞中MC3R基因的方法中，所述动物细胞可为下述H1或H2：

H1、哺乳动物细胞；

H2、猪细胞。

为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一产品：

P1、成套RNA，由所述gRNA1和所述gRNA2组成；

P2、成套基因，由所述gRNA1的编码基因和所述gRNA2的编码基因组成；

P3、成套表达盒，由含有所述gRNA1的编码基因的表达盒和含有所述gRNA2的编码基因的表达盒组成；

P4、成套载体，由含有所述gRNA1的编码基因的重组载体和含有所述gRNA2的编码基因的重组载体组成；

P5、含有所述gRNA1的编码基因和所述gRNA2的编码基因的重组载体；

P6、敲除MC3R基因的成套试剂，由P1-P5中的任一种和下述P6a-P6c中的任一种组成：

P6a、Cas9的编码基因；

P6b、含有Cas9的编码基因的表达盒；

P6c、含有Cas9的编码基因的表达载体；

P7、敲除MC3R基因的重组载体，含有所述gRNA1的编码基因、所述gRNA2的编码基因以及Cas9的编码基因。

上述产品可用于MC3R基因敲除动物细胞或动物模型。

为解决上述技术问题，本发明还提供了制备MC3R基因敲除动物模型的方法。

本发明所提供的制备MC3R基因敲除动物模型的方法，包括：利用所述敲除动物细胞中MC3R基因的方法制备敲除MC3R基因的动物细胞，利用所述敲除MC3R基因的动物细胞制备MC3R基因敲除动物模型。

上述制备MC3R基因敲除动物模型的方法中，所述动物可为哺乳动物。所述哺乳动物可为猪。所述动物细胞可为哺乳动物细胞。所述哺乳动物细胞具体可为猪细胞。

为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一应用：

X1、所述产品在敲除MC3R基因中的应用；

X2、所述产品在制备MC3R基因敲除动物模型中的应用；

X3、所述产品在动物育种中的应用；

X4、所述敲除动物细胞中MC3R基因的方法在制备MC3R基因敲除动物模型中的应用；

X5、所述敲除动物细胞中MC3R基因的方法在动物育种中的应用。

上述应用中，所述动物可为哺乳动物。所述哺乳动物可为猪。

本发明中，所述猪细胞具体可为猪成纤维细胞，如猪胎儿成纤维细胞。在本发明的实施例中，所述猪胎儿成纤维细胞为中国实验用小型猪胎儿成纤维细胞。

本文采用新型基因组编辑技术CRISPR/Cas9系统，在中国实验用小型猪(ChineseExperimental Mini pig,CEMP)MC3R基因上及其附近设计敲除靶位点，利用构建好的MC3R基因敲除载体，通过电击法转染猪胎儿成纤维细胞，筛选获得MC3R基因敲除的猪成纤维细胞共72个克隆，其中MC3R敲除纯合子克隆10个，杂合子克隆11个，敲除效率达到29.16％。用筛选得到的MC3R缺失细胞系，通过体细胞核移植获得MC3R基因敲除猪1头。并且本发明利用CRISPR/Cas9系统能够快速高效的将目的基因大片段敲除，并且不留下外源基因片段。本研究利用CRISPR/Cas9系统快速高效的构建了MC3R基因敲除猪模型，为研究MC3R基因的生理作用和分子机制提供了材料，通过观察MC3R基因敲除猪的生理生化指标，以及转录组分析等都可以更深入的研究MC3R基因的作用机制和机理。同时MC3R调控采食和能量分配，还可以评估其在猪分子育种中的价值。

附图说明

图1为中国实验用小型猪MC3R基因序列和GenBank中猪的MC3R基因序列比对结果。其中，Sus为GenBank中猪的MC3R基因序列，CEMP为中国实验用小型猪MC3R基因序列，Pr为氨基酸序列；箭头表示基因起止方向。

图2为猪胎儿成纤维细胞系。

图3为绿色荧光观察电击转染效率。

图4为T7EN1酶切检测靶点切割效率。①表示pX330-target1，②表示pX330-target2，③表示pX330-target3，④表示pX330-target4，━表示pX330。

图5为MC3R基因敲除胎儿成纤维细胞系鉴定结果。其中，A与B为12CEPEF2♂PCR鉴定结果，C与D为H4♀PCR鉴定结果，A-D中，a为纯合子，b为杂合子，1、2、3分别为阳性对照、阴性对照和水；E为阳性片段测序结果，E中下滑线为起始密码子和终止密码子。

图6为MC3R基因敲除猪鉴定结果。其中，A为基因敲除猪PCR鉴定结果，1-4为阴性猪；B为19501的仔猪的PCR产物中的小片段与MC3R基因及其附近序列比对结果；C为19501的仔猪的PCR产物中的较大片段编码的氨基酸序列与MC3R蛋白质序列的比对结果，红框标注为翻译终止位点。

图7为出生50天的19501的仔猪。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的peGFP载体为Addgene公司产品。

下述实施例中的pL425(Neo抗性)为Addgene公司产品。

实施例1、采用CRISPR/Cas9技术制备MC3R基因敲除细胞系和MC3R基因敲除猪

猪种不同可能导致MC3R基因序列的存在差异，为了为避免核苷酸序列差异引起切割效率下降，本发明首先对中国实验用小型猪MC3R基因组序列进行了测定并与NCBI中的MC3R基因序列进行序列比对，结果表明，中国实验用小型猪(Chinese Experimental Minipig,CEMP)MC3R基因序列和NCBI中GenBank的MC3R基因序列有7个单核苷酸差异，氨基酸序列无差异(图1)。本申请设计了四个Cas9切割靶序列(靶序列1、靶序列2、靶序列3和靶序列4)对MC3R基因进行敲除，具体实验步骤如下：

一、表达载体构建

所用骨架载体为pX330载体(Addgene产品)，gRNA表达载体具体构建过程如下：

将表1中每个靶序列的两条寡核苷酸片段稀释到200mM后混合，退火形成双链，连接到经BbsI酶(NEB(USA)公司)酶切后得到的pX330骨架载体上，并测序验证得到序列正确的四个重组载体，将得到的含有靶序列1、靶序列2、靶序列3和靶序列4的重组载体分别命名为pX330-target1、pX330-target2、pX330-target3和pX330-target4，将pX330-target1表达的gRNA命名为gRNA1，将pX330-target2表达的gRNA命名为gRNA2。

表1、引物序列

二、原代细胞分离

将CEMP 30天胎猪从子宫中取出，超净台内用镊子剥去胎衣，将胎猪在体积百分比浓度为75％的乙醇水溶液中洗去血块，再用含有双抗(青霉素和链霉素)的PBS清洗两遍。取背部皮肤组织，剪成小碎块后滴加少量FBS，均匀的铺到T75培养瓶中，加入10％DMEM(含双抗)培养基，37℃，5％CO₂倒置培养2小时。待组织块贴壁后再反转培养瓶，正置培养3-4天(Svetlana,G.and A.L.Osterman,Cell Biology Protocols.John Wiley Professio,2007(2).)，即得到猪胎儿成纤维细胞系(图2)，细胞呈放射状生长，形态细长饱满，表明细胞状态较好，生长旺盛。收集细胞并冻存。共得到两种类型CEMP猪胎儿成纤维细胞系，即雌性和雄性，将雄性猪胎儿成纤维细胞系记为12CEPEF2，将雌性猪胎儿成纤维细胞系记为H4。

三、载体效率验证

通过电击法将构建好四个重组载体pX330-target1-4载体分别和peGFP载体共转入步骤二得到的猪胎儿成纤维细胞(12CEPEF2)中，检验各载体的靶点相对切割效率，实验重复三次。

30小时后观察，根据带荧光信号细胞比例估算电击转染效率，用荧光倒置显微镜观察带荧光信号细胞的比例(图3)，四种转染的转染效率均约有40％左右。

48小时后收集细胞，提取基因组，用引物(表2)XL1-F和XL1-R扩增靶序列1和靶序列2，用引物XL2-F和XL2-R扩增靶序列3和靶序列4。利用Surveyor法(错配酶法)——T7ENI酶(NEB(USA)公司)酶切验证，根据电泳图中切割条带(小片段)与未切割条带(大片段)的亮度比例，推测各载体的靶点相对切割效率(图4)(Peter Qiu,H.S.J.M.and A.G.F.Gerard,Mutation detection using Surveyor nuclease.BioTechniques,2004(36):p.702-707.)。

根据未切割的大片段条带和切割后的小片段条带亮度可知，四个重组载体均成功实现了对靶点位置的切割，其中pX330-target2和pX330-target4切割效率最高，pX330-target1次之，pX330-target3最低。基于以上数据，pX330-target1虽然切割效率略低于pX330-target2，但推测其与pX330-target4组合，能够敲除MC3R基因的整个片段，令该基因功能完全丧失。所以，选用pX330-target1和与pX330-target4组合，构建MC3R缺失细胞株。

表2、效率验证引物

四、MC3R基因敲除细胞系的获得和分析

对步骤二得到的12CEPEF2和H4分别进行MC3R基因敲除实验，实验重复三次，具体步骤如下：

将猪胎儿成纤维细胞接种于到6孔板培养，待单孔细胞汇合度达到90％，进行电击转染(电转仪型号Lonza AAD-1001S，电转液longza VPI-1002，电转参数A-024)，转染的载体为pX330-target1(1μg)、pX330-target4(1μg)和以及带有pL425(Neo抗性)(辅助筛选)(1μg)。电转后分到15个10cm细胞培养皿中，放入37℃，5％CO₂培养。在细胞贴壁生长后(第二天)，开始加G418进行筛选，直到细胞大量死亡(约第5天)进行换液。待克隆点长大，挑取单克隆，传代培养至48孔板，待48孔板细胞长满，提取细胞基因组用CX-F1和CX-R3组成的引物对进行PCR鉴定，结果如图5中A-D所示，所用引物序列如下：

CX-F1：atctctcaaggggtgtctcccg

CX-R3：tgttctcaggtgaccgcatgac

结果表明，利用CRISPR/Cas9系统，在72个单克隆中，快速高效的获得了MC3R基因敲除猪成纤维细胞阳性克隆共21个，其中雄性12CEPEF2♂的纯合子5个、杂合子4个；雌性H4♀的纯合子6个、杂合子6个，阳性克隆率(即MC3R基因的敲除效率)为29.16％。

将阳性克隆的PCR产物进行测序，结果发现，所有的阳性克隆中的MC3R基因均有整个基因片段的缺失或部分片段的缺失(纯合子的两条染色体均缺失，杂合子的一条染色体缺失)，其中一个阳性克隆的PCR产物序列与CEMP的MC3R基因极其附近的序列比对结果如图5中E所示，该克隆为MC3R基因整个基因片段的缺失。

将阳性克隆对应的细胞进行冻存，在体细胞核移植中将作为核供体细胞，用于构建MC3R基因敲除猪模型。

五、体细胞核移植和胚胎移植以及克隆猪鉴定

采用徒手克隆策略(Polejaeva,I.A.,et al.,Cloned pigs produced bynuclear transfer from adult somatic cells.Nature,2000.407(6800):p.86-90.)，，通过体细胞核移植方法来构建基因敲除猪。步骤如下：

以步骤四得到的MC3R基因敲除纯合子细胞克隆与杂合子细胞克隆混合为核供体细胞，将核供体细胞生长接触抑制1-2d；采集CEMP卵母细胞并体外成熟培养，然后，在装有显微操作仪的倒置显微镜下去细胞核，然后与一个生长接触抑制1-2d的核供体细胞进行重构，制备重构胚胎。再经过融合和辅助激活后，将重构胚胎放入PZM3培养基(Gibco(GrandIsland，USA))中继续培养，培养条件为39℃、5％O₂、5％CO₂、90％N₂和饱和湿度。重构胚胎培养12-48h后，进行手术法胚胎移植CEMP，每头受体猪移植重构胚胎300—400枚，共移植8头母猪。胚胎移植后第30天，对未返情的受体母猪进行首次超声波妊娠检测。之后定期跟踪胎儿发育情况，调整饲养管理，直至受体母猪分娩(Luo,Y.,et al.,High efficiency ofBRCA1knockout using rAAV-mediated gene targeting:developing a pig model forbreast cancer.Transgenic Research,2011.20(5):p.975-988.；卫恒习等,胚胎移植方法和受体母猪因素对克隆猪生产效率的影响.中国农业科学,2012(15):第3147-3153页.)。母猪产仔后，取耳组织进行利用CX-F1和CX-R3组成的引物对进行PCR和测序鉴定。

受体母猪怀孕114天，产仔六头，其中一头为畸形，畸形猪三天后死亡。仔猪鉴定结果如图6中A，编号为19501的仔猪和畸形猪是阳性猪，其余四头为阴性猪。经过PCR和测序分析可知，编号为19501的仔猪的PCR产物中，小片段中不含有MC3R基因的任何片段，较大片段经过测序并将其翻译为氨基酸序列可知，较大片段编码的氨基酸序列与MC3R蛋白质序列的相似性只有58.93％，并且提前终止翻译(共编码240个氨基酸)，使其没有第6和第7跨膜结构域，也能导致MC3R基因功能的丧失。由此得出编号为19501的仔猪为一头MC3R基因功能缺失猪，出生50天的19501的仔猪如图7所示。畸形猪的PCR产物共有两条带，并且这两条带均小于野生型的CEMP的PCR产物，小片段中不含有MC3R基因的任何片段，较大片段缺失MC3R基因的部分片段，并且也导致了MC3R基因功能的丧失。而移植的这8头母猪中的其他7头猪，不是没怀孕，就是流产了。

Claims

1.敲除动物细胞中MC3R基因的方法，其特征在于：所述方法采用CRISPR/Cas9系统进行，所述CRISPR/Cas9系统中包含gRNA1的编码基因和/或gRNA2的编码基因，所述gRNA1识别MC3R基因的靶序列为靶序列1；所述gRNA2识别MC3R基因的靶序列为靶序列2；

所述靶序列1为如下A1)、A2)或A3)：

A1)序列表中序列1的核苷酸序列；

所述靶序列2为如下B1)、B2)或B3)：

B1)序列表中序列2的核苷酸序列；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括向动物细胞中导入所述gRNA1的编码基因和/或所述gRNA2的编码基因，得到敲除MC3R基因的动物细胞。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述gRNA1的编码基因通过含有所述gRNA1的编码基因的表达盒导入所述动物细胞中；所述gRNA2的编码基因通过含有所述gRNA2的编码基因的表达盒导入所述动物细胞中；所述CRISPR/Cas9系统还包括Cas9的编码基因，所述Cas9的编码基因通过含有所述Cas9的编码基因的表达盒导入所述动物细胞中。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述动物细胞为哺乳动物细胞。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述动物细胞为猪细胞。

6.下述任一产品：

P1、成套RNA，由权利要求1-4中任一所述gRNA1和所述gRNA2组成；

P2、成套基因，由权利要求1-4中任一所述gRNA1的编码基因和所述gRNA2的编码基因组成；

P3、成套表达盒，由含有权利要求1-4中任一所述gRNA1的编码基因的表达盒和含有权利要求1-4中任一所述gRNA2的编码基因的表达盒组成；

P4、成套载体，由含有权利要求1-4中任一所述gRNA1的编码基因的重组载体和含有权利要求1-4中任一所述gRNA2的编码基因的重组载体组成；

P5、含有权利要求1-4中任一所述gRNA1的编码基因和所述gRNA2的编码基因的重组载体；

P6a、Cas9的编码基因；

P6b、含有Cas9的编码基因的表达盒；

P6c、含有Cas9的编码基因的表达载体；

P7、敲除MC3R基因的重组载体，含有权利要求1-4中任一所述gRNA1的编码基因、所述gRNA2的编码基因以及Cas9的编码基因。

7.制备MC3R基因敲除动物模型的方法，包括：利用权利要求1-5中任一所述的方法制备敲除MC3R基因的动物细胞，利用所述敲除MC3R基因的动物细胞制备MC3R基因敲除动物模型。

8.下述任一应用：

X1、权利要求6所述产品在敲除MC3R基因中的应用；

X2、权利要求6所述产品在制备MC3R基因敲除动物模型中的应用；

X3、权利要求6所述产品在动物育种中的应用；

X4、权利要求1-5中任一所述的方法在制备MC3R基因敲除动物模型中的应用；

X5、权利要求1-5中任一所述的方法在动物育种中的应用。

9.根据权利要求7所述的方法或权利要求8所述的应用，其特征在于：所述动物为哺乳动物；所述动物细胞为哺乳动物细胞。

10.根据权利要求9所述的方法或应用，其特征在于：所述哺乳动物为猪；所述哺乳动物细胞为猪细胞。