CN109477838A - 利用受体协同活性的nk细胞的活性检查方法及利用其的与nk细胞的活性关联的疾病的诊断方法 - Google Patents

利用受体协同活性的nk细胞的活性检查方法及利用其的与nk细胞的活性关联的疾病的诊断方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109477838A
CN109477838A CN201780042132.2A CN201780042132A CN109477838A CN 109477838 A CN109477838 A CN 109477838A CN 201780042132 A CN201780042132 A CN 201780042132A CN 109477838 A CN109477838 A CN 109477838A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
factor
kinds
active
activity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201780042132.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109477838B (zh
Inventor
金宪湜
明承在
金松铁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Asan Foundation
University of Ulsan Foundation for Industry Cooperation
Original Assignee
Asan Foundation
University of Ulsan Foundation for Industry Cooperation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Asan Foundation, University of Ulsan Foundation for Industry Cooperation filed Critical Asan Foundation
Priority claimed from PCT/KR2017/002870 external-priority patent/WO2017204446A2/ko
Publication of CN109477838A publication Critical patent/CN109477838A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109477838B publication Critical patent/CN109477838B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56972—White blood cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G01N2333/70507—C2D
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G01N2333/70535—Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64 (CD2314/705F)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
    • G01N2800/042—Disorders of carbohydrate metabolism, e.g. diabetes, glucose metabolism
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/24—Immunology or allergic disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/26—Infectious diseases, e.g. generalised sepsis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/50—Determining the risk of developing a disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
    • G01N2800/7057—(Intracellular) signaling and trafficking pathways

Abstract

本发明涉及NK细胞的活性检查方法，其包括：特异性地刺激样品内的NK细胞上的可区别的2种以上的因子的步骤；测定所述NK细胞的协同活化程度的步骤；及对正常NK细胞对比所述NK细胞的协同活化程度进行比较的步骤，及NK细胞的活性检查用组合物。另外，本发明涉及与NK细胞的协同活性关联的疾病的诊断用试剂盒，其包含所述组合物。

Description

利用受体协同活性的NK细胞的活性检查方法及利用其的与NK 细胞的活性关联的疾病的诊断方法
【技术领域】
本发明涉及利用NK细胞的受体协同活性来检查NK细胞的活性的方法及利用其诊断与NK细胞的活性关联的疾病的方法。
【背景技术】
NK细胞(natural killer cell)是对于先天性免疫及后天性(adaptive)免疫系统重要的细胞毒性淋巴细胞的1种。NK细胞与病毒感染的细胞或癌细胞反应，典型地感知细胞表面上MHC(major histocompatibility complex)的异常现象。这样的NK细胞分泌穿孔素(perforin)而在感染细胞或癌细胞的细胞膜上穿孔，经此释放粒酶(granzyme)而具有杀灭2种细胞的细胞毒性。在B细胞淋巴瘤及多数癌患者的情况中，NK细胞的数或抗癌活性中发现缺陷，NK细胞的功能异常已知与这样的癌的发生具有密切的关联(Annu.Rev.Immunol.2013；31:227-258)。
NK细胞的活性与多样的活化及阻碍性受体关联(engage)。被看作支配性的受体中有和与免疫受体酪氨酸-平台活性基序(immunoreceptor tyrosine-based activationmotif：ITAM)-关联信号传递分子(例如，FcRγ链或TCRζ链)关联的NKp46及与信号传递分子DAP10关联的受体NKG2D(EMBO J.2004；23:255.-9,Annu.Rev.Immunol.2005；23:225-74)关联的。作为被看作共同刺激性的受体，不仅包括如2B4(CD244)一样的信号传递淋巴细胞活化分子(signaling lymphocytic activation molecule：SLAM)家族的诸成员，还包含如DNAM-1(CD226)，CD2，及NKp80(KLRF1基因产物)的一样多样的受体。
ITAM-关联分子贡献于由NK细胞的诸别的活化受体的信号传递，在自然细胞毒性受体(natural cytotoxicity receptor：NCR)中，NKp46及NKp30与FcRγ及/或TCRζ关联，反面，NKp44与信号适配体(adaptor)DAP12关联(EMBO J.2004；23:255-9)。
血细胞吞噬性淋巴组织细胞增生症(Hemophagocytic lymphohistiocytosis：HLH)是呈现单核细胞(monocyte)或巨噬细胞(macrophage)的增殖的疾病，呈现不受调节的血细胞吞噬和炎症性细胞因子(cytokine)的过分泌现象。其中，尤其是，免疫缺陷性X-关联淋巴增殖综合征1(immunodeficiency X-linked lymphoproliferative disease 1：XLP1)是呈现如HLH一样的症状的疾病，被爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV：Epstein-Barr virus)感染而发病，或在先天性XLP1的情况中，产生SAP蛋白的SH2D1A的突变形成XLP1的遗传性平台.(Annu.Rev.Immunol.2007；25:337-79,Annu.Rev.Immunol.2011；29:665-705)。
2B4在细胞质性末端(tail)含有ITSM基序，传递通过小型适配体SAP及SAP-关联酪氨酸激酶Fyn的募集的活化信号(J.Exp.Med.202,181-192(2005),Immunity 36,974-985(2012))。2B4的信号传递导致Vav1，p38MAPK，Erk，及PLC-g2活化(Nat.Immunol.9,495-502(2008))。需注意的点是，在从功能性的SAP表达不足的先天性XLP1患者得到的NK细胞中，2B4不活化，代之以可传递抑制性信号(Annu.Rev.Immunol.25,337-379(2007))。这样的NK细胞缺陷被认为贡献于如以下一样的临床性的XLP1的征兆：爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)-感染的B细胞的杀伤缺陷，IFN-g生产缺陷，暴发性单核细胞增多症(fulminantmononucleosis)及B-细胞淋巴瘤。
另一方面，癌患者的NK细胞中观察到通过作为抗癌受体的NKG2D(J.Immunol.175,5541-5550(2005),Cancer Res.69,7775-7783(2009),J.Immunol.189,1360-1371(2012))，DNAM-1(Immunol.Cell Biol.90,109-115(2012))的NK细胞活化缺陷。另外知，B型肝炎病毒感染患者的NK细胞中NKG2D，2B4的表达和功能也减小(PloS Pathog.8,e1002594(2012))。
从而，不仅是HLH，在癌和病毒感染疾病中也旨在通过NK细胞活性检查来诊断所述疾病，但由于测定NK细胞活性的以往的技术利用放射性同位素，或者，荧光标志探针(probe)，在费用或时间方面不适合于临床适用，从而，可简便且迅速并且显著地测定NK细胞的活性的方法被认为在多样的免疫关联疾病的早期诊断及预后判断中重要。
【发明详述】
【技术课题】
一实施方式提供NK细胞的活性检查方法，其包括：特异性地刺激样品内的NK细胞上的可区别的2种以上的因子的步骤；测定因对所述2种以上的因子的刺激而诱发的所述NK细胞的协同活化程度的步骤；及将正常NK细胞与所述NK细胞的协同活化程度进行比较的步骤。
别的实施方式提供NK细胞的活性检查用组合物，其作为诱发NK细胞的协同活性的刺激物质包含选自下列的一种以上：对所述NK细胞上的可区别的2种以上的因子各自或同时具有特异性的抗体或其片段，诱发所述NK细胞上的可区别的2种以上的因子的特异性的活性的靶细胞或多肽，特异性地诱导所述NK细胞上的可区别的2种以上的因子的活性的组合物，及所述NK细胞上的可区别的2种以上的因子的可逆性或非可逆性的激动剂。
再别的实施方式提供与NK细胞的协同活性关联的疾病的诊断用试剂盒，其作为刺激样品内的NK细胞上的可区别的2种以上的因子而诱发所述NK细胞的协同活性的刺激物质包含：选自下列的一种以上：对所述2种以上的因子各自或同时具有特异性的抗体或其片段，诱发所述2种以上的因子的特异性的活性的靶细胞或多肽，特异性地诱导所述2种以上的因子的活性的组合物，及所述2种以上的因子的可逆性或非可逆性的激动剂；以及检测所述NK细胞相比正常NK细胞而是否存在活化的物质。
【课题解决手段】
一实施方式提供NK细胞的活性检查方法，其包括：特异性地刺激样品内的NK细胞上的可区别的2种以上的因子的步骤；测定因对所述2种以上的因子的刺激而诱发的所述NK细胞的协同活化程度的步骤；及将正常NK细胞与所述NK细胞的协同活化程度进行比较的步骤。
所述样品可为来源于个体，例如，包含人的哺乳类等的生物学样品。另外，所述生物学样品可为从个体分离的，可为血液，全血，血清，血浆，淋巴液，尿，粪便，组织，细胞，器官，骨髓，唾液，痰，脑脊髓液或它们的组合。另外，所述生物学样品可包含：PBMC，纯化的NK细胞或原代休止期的细胞(primary resting cell)(即，直接从血液分离的)。在一具体例中，所述样品是血液。
所述术语“区别”包含在细胞中的位置，结构，及功能等不同的全部情况。具体而言，可表示刺激后使在细胞内诱发的信号传递过程不同，细胞上的位置或因子本身在结构上不同而使刺激手段或方法不同，被单一刺激时细胞内的作用不同或对于效果上有效地诱发活性不足。
所述术语“因子”表示诱发NK细胞的协同活化的全部分子要素。具体而言，所述因子可包含细胞内外的受体，通道(channel)，及能与特异性的配体结合的细胞内外的适配体(adaptor)，蛋白，糖蛋白，肽，及基序。
在一具体例中，所述因子可为受体。所述术语“受体”是指与特定物质结合而使NK细胞的活性变化的全部分子。所述特定物质包含化学组合物，体内来源或人工的特定蛋白，肽，胆甾醇，糖蛋白，别的免疫细胞或NK细胞本身的细胞因子或趋化因子，或者，可包含靶细胞或NK细胞自身的特定受体或膜蛋白。
在一具体例中，所述因子可存在于细胞表面上或细胞内。从而，例如，在所述因子是受体时，不仅包含位于NK细胞的细胞表面而与特定物质结合而向细胞内传递信号而诱发NK细胞的活性的情况，也通过细胞膜而作为在细胞膜内或细胞质中存在的受体而包含与外部特定刺激物质结合而能引发信号传递作用的全部受体。
所述术语“刺激”是指作用于因子而诱发NK细胞内外的特定信号传递。诱发所述刺激的方法可利用对于所述因子的一种以上具有特异性的抗体，其片段，或者，肽，特异性地诱导或抑制所述因子的一种以上的组合物，及所述因子的一种以上的可逆性或非可逆性的激动剂(agonist)或拮抗剂(antagonist)，可包含与包含可刺激NK细胞的多样的标的细胞(例如，K562，721.221，或者，被特定受体刺激抗体包被的P815)的培养物进行培养。
所述术语“协同”是指单一因子各自的效果对于效果上有效地活化NK细胞活性而言不足，但可区别的各因子被同时或依次共同刺激时，相比单一因子被各自刺激，显著地诱发变化，效果上有效地活化NK细胞活性。从而，NK细胞的“协同活性”或“协同活化”是对NK细胞上的可区别的2种以上的因子各自及这些的组合特异性地进行刺激，测定对所述各因子及这些的组合的刺激导致的所述NK细胞的活性，当相对于所述各因子的刺激导致的NK细胞活性程度(优选地相对于所述各因子中被更活化的NK细胞活性程度)而所述各因子的组合的刺激导致的NK细胞活性程度是1.5倍以上，2倍以上，或者，3倍以上时，被确定为协同活性被诱发，优选地2倍以上时可被确定为协同活性被诱发。所述协同活化程度可如本说明书中记载，基于利用流式细胞计量分析，免疫阻断(immunoblotting)等，测定子因子的磷酸化或表达程度，脱颗粒化活性，细胞毒性活性及由NK细胞刺激而导致的细胞因子分泌而数值化，但不限于此。
在本发明的检查NK细胞的活性的方法中，比较正常NK细胞对比所述NK细胞的协同活化的步骤具体而言包括，在以正常的NK细胞作为对照组而与实验组在同等的条件下各自或以特定组合刺激可区别的2种以上的因子时，正常的NK细胞中出现的协同的活化现象在实验组中显著地更高，未出现或其程度显著地少时判断为非正常。另外，包含与刺激单一因子时相比，共同刺激时容易比较而诱发人为的协同活化而对该数据进行比较来进行判断。可由所述步骤判断与非正常的NK细胞的关联的疾病的病理学征兆，病毒感染，癌细胞的存在，及特定癌，对所述诸疾病进行预后预测。所述“正常NK细胞”是指未患疾病的个体所具有的或从那样的个体来源的NK细胞，未患所述疾病的个体至少不具有已知影响NK细胞活性的身体的，遗传的，或者，外来的条件。
在一具体例中，所述方法可还包括所述样品中分离作为目标的NK细胞的步骤。根据需要，可在与别的血细胞或淋巴细胞一起存在下刺激后进行所述步骤，也可为了设为作为淋巴细胞而仅包含NK细胞的样品而在进行所述步骤后进行所述刺激步骤。分离的NK细胞的纯化度及其样品的构成可以对实验必要的程度多样。NK细胞可根据需要原样使用从样品纯化的，也可为了确保适合于实验的条件或细胞量而使增殖后使用。
但是，在特定因子的组合的情况中，由于对于NK细胞具有特异性(实施例6)，在本发明的方法中利用对于所述NK细胞具有特异性的因子的组合时，可不必需分离所述NK细胞的步骤。
在一具体例中，可对所述因子同时或依次实施所述刺激。具体而言，可结构性地与所述因子结合，或改造所述因子(modify)而进行刺激。所述改造可包含如例如磷酸化，泛素化，磺酰化，甲基化(methylation)，PAR化(parylation)或糖化(glycosylation)一样的翻译后改造(post-translation modification)或切断。
在一具体例中，所述因子可选自：含有ITAM的信号传递分子(例如，CD16，NKp46，NKp30或NKp44等)，NKG2D，2B4(CD244)，DNAM-1(CD226)，CD2及NKp80。根据Bryceson Y等(Blood 2006；107:159-166)及Kim HS等(Immunity 2010；32:175-186)，NK细胞协同活化可由以上罗列的诸因子的多样的组合进行，作为所述因子的组合的例，可有2B4及DNAM-1，DNAM-1及NKG2D，2B4及NKG2D，或者，2B4，DNAM-1及NKG2D，但不限于此。
在一具体例中，在所述刺激步骤中，所述刺激可由选自下列的一种以上诱发：对所述2种以上的因子各自或同时具有特异性的抗体或其片段，诱发所述2种以上的因子的特异性的活性的靶细胞或多肽，特异性地诱导或抑制所述2种以上的因子的化合物，及所述2种以上的因子的可逆性或非可逆性的激动剂(agonist)或拮抗剂(antagonist)。对所述因子具有特异性的抗体或其片段包含同种型，也可同时与可区别的2种以上的因子结合。具体而言，作为同时与所述可区别的2种以上的因子结合的例，可有被CD244/2B4或CD226/DNAM-1包被的P815。所述激动剂或拮抗剂可为对于对象因子结构性地具有特异性的性质的化合物，可为以3维结构具有特异性的多肽。
在一具体例中，诱发所述因子的特异性的活性的靶细胞被选自针对NK细胞上的可区别的2种以上的因子的抗体，其片段及这些的组合的一种以上包被可为。所述NK细胞上的可区别的2种以上的因子如上所述。抗体可为针对所述诸因子的同种型的抗体，其片段是抗体的片段，可仅包含对于诱发活性而言充分的所述抗体的特定部分。包被如下实施例中所述，可通过与靶细胞的预温浴来施行，或者，可利用交联(cross-linking)技术而被所述抗体，其片段或其组合包被。
在一具体例中，测定所述活化程度的步骤可包括测定选自下列的一种以上：所述NK细胞上的可区别的2种以上的因子的子因子的磷酸化或表达程度，脱颗粒化(degranulation)活性，细胞毒性(cytotoxicity)活性及由NK细胞刺激而导致的细胞因子分泌。术语“子因子”表示在所述NK细胞上的因子被刺激时受影响而表达增加或被磷酸化的细胞内蛋白或变化的多肽等，尤其是，在关于磷酸化反应时，所述子因子可以与底物(substrate)相同的含义使用。
所述子因子的表达程度可例如，在使被刺激的NK细胞溶解后，使用利用对于作为与NK细胞活化关联的细胞内蛋白之一的Erk或pY174-Vav1具有特异性的抗体的以往已知的免疫阻断(immunoblot)方式进行测定。
所述脱颗粒化活性例如，可表示通过穿孔素(perforin)或粒酶(granzyme)分泌诱导靶细胞的溶解，可将其利用FACS进行分析。具体而言，对从样品分离的PBMC或被纯净分离的NK细胞进行刺激后，可使用利用接合荧光色素的抗体测定与脱颗粒化成比例的CD107a表达的方法。
所述细胞毒性活性例如，可在与包含能活化被铕(europium)荧光染料标记的NK细胞的靶细胞的培养物进行培养后，利用酶标仪(microplate reader)测定通过靶细胞溶解而排出的荧光染料的量。
在一具体例中，所述细胞因子可选自：IFN-γ，TNF-α，TNF-β，MIP-1α，MIP-1β，PANTES，IL-8及IL-10。如上所述的NK细胞的免疫活性因子表达分析可利用FACS，细胞内细胞因子染色或ELISA等进行。具体而言，可使用在利用接合荧光色素的特定抗体而对NK细胞表面进行染色后，使细胞渗透化(permeabilization)，用接合荧光色素的别的特定免疫活性因子(例如，IFN-γ)抗体对所述细胞因子等进行染色而测定NK细胞内的免疫活性因子的表达的方法。
根据本发明的实施例，正常人相比患者，在诱发协同活化时，以2种因子中更高者为基准，在细胞因子分泌量或细胞毒性脱颗粒化程度上显示2倍以上的差异，当诱发NK细胞的协同活化后进行比较时，在协同活化的细胞因子分泌量或细胞毒性脱颗粒化程度的差异上显示2倍以上的差异。
从而，在一具体例中，所述将正常NK细胞与所述NK细胞的协同活化程度进行比较的步骤在所述子因子的磷酸化或表达程度，脱颗粒化活性，细胞毒性活性及由NK细胞刺激而导致的细胞因子分泌分泌量程度的差异是2倍以上，具体而言，以2种因子中更高者为基准而2倍以上时，可判断为所述样品中NK细胞的活性正常。在别的具体例中，在所述NK细胞的协同活化的细胞因子分泌量或细胞毒性脱颗粒化程度的差异是2倍以下，具体而言以正常NK细胞的协同活化的细胞因子分泌量或细胞毒性脱颗粒化程度为基准而2倍以下时，可判断所述样品中的NK细胞的活性非正常。
本发明的NK细胞的活性检查方法可用于提供关于与NK细胞的协同活性关联的疾病的诊断的信息。
本发明人发现，虽然在HLH患者及胰腺癌患者中NK细胞的活化也被诱发，正常人的协同活化程度高，于此相反，所述患者在协同活性上失败或其程度显著地少。尤其是发现，在诱发协同活化而进行比较时，相比简单诱发NK细胞活化而进行比较，诱发协同活化而进行比较的情况对于诊断HLH或胰腺癌而提高显著性，更容易和精确。从而，本发明的NK细胞的活性检查方法区别呈现非正常的NK细胞协同活性的样品，可用于提供关于包含HLH及胰腺癌的与NK细胞的协同活性关联的疾病的诊断的信息。
在一具体例中，所述与NK细胞的协同活性关联的疾病呈现非正常的NK细胞的协同活性，可为例如，过敏性免疫疾病，自身免疫疾病，免疫排斥反应，免疫缺陷疾病，组织细胞增生症，癌，2型糖尿病，寄生虫感染疾病及病毒疾病。所述过敏性免疫疾病是选自哮喘及积脓症的一种以上，或所述自身免疫疾病是选自狼疮，多发性硬化症(multiple sclerosis)，1型糖尿病及类风湿关节炎的一种以上，或者，所述组织细胞增生症可为选自HLH，XLP1，及XLP2的任一种以上。血细胞吞噬性淋巴组织细胞增生症(HLH)可包含第2组郎格尔汉斯细胞组织细胞增生症，红细胞吞噬性淋巴组织细胞增殖症(家族性，散发性)，感染关联性血细胞吞噬综合征，病毒关联性血细胞吞噬综合征，伴随巨大的淋巴结病症的组织细胞增生症，或者，网状组织细胞增生症的含义。所述“癌”包含肿瘤，血液癌或实体癌的含义，损伤个体的NK细胞的协同活性或包含在特定条件下不作为靶细胞而诱发NK细胞的协同活性的。在一具体例中，所述癌可选自：肺癌，肝癌，食管癌，胃癌，结肠癌，小肠癌，胰腺癌，黑色素瘤，乳腺癌，口腔癌，脑肿瘤，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾脏癌，子宫颈部癌，肉瘤，前列腺癌，尿道癌，膀胱癌，睾丸癌，血液癌，淋巴瘤，皮肤癌，银屑病及纤维腺瘤。在一具体例中，所述癌可为胰腺癌或B细胞淋巴瘤(B cell lymphoma)。在一具体例中，所述病毒疾病可为B型肝炎。在一具体例中，所述免疫缺陷疾病可为DiGeorg综合征(DiGeorge synderome)或Chedial-Higashi综合征(Chedial-Higashi syndrome)。
关于与所述NK细胞的活性关联的疾病的信息在检测不到正常NK细胞对比实验组NK细胞的协同活化时，可判断为非正常的NK细胞，或者，在对于特定受体丧失协同活性的NK细胞对靶细胞非正常地诱发或不诱发协同活性时，可判断所述靶细胞与特定的疾病有关联。为了更容易地进行所述特定的疾病的判断，可还包括所述靶细胞被选自针对NK细胞上的可区别的2种以上的因子的抗体，其片段及这些的组合的一种以上包被的步骤。
别的实施方式提供NK细胞的活性检查用组合物，其包含选自下列的一种以上作为诱发NK细胞的协同活性的刺激物质：对所述NK细胞上的可区别的2种以上的因子各自或同时具有特异性的抗体或其片段，诱发所述NK细胞上的可区别的2种以上的因子的特异性的活性的靶细胞或多肽，特异性地诱导所述NK细胞上的可区别的2种以上的因子的活性的化合物，及所述NK细胞上的可区别的2种以上的因子的可逆性或非可逆性的激动剂。
在一具体例中，所述NK细胞上的因子选自：NKG2D，2B4(CD244)，DNAM-1(CD226)，CD2，CD16，NKp30，NKp44，NKp46，及NKp80可为。
在一具体例中，为了检测所述NK细胞相比正常NK细胞而是否存在协同活化，所述组合物可还包括抗体或其片段，所述抗体或其片段用于检测选自下列一种以上：所述因子的子因子的磷酸化或表达程度，脱颗粒化活性，细胞毒性活性及由NK细胞刺激而导致的细胞因子分泌。
在一具体例中，检测所述NK细胞相比正常NK细胞而是否存在协同活化的物质可为选自针对选自穿孔素、粒酶、CD107a、CD107b、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TNF-α、TNF-β、PANTES、IL-8及IL-10中的一种以上的抗体，其片段或这些的组合中的一种以上。
在一具体例中，所述NK细胞的活性检查用组合物作为用于视觉呈现所述NK细胞相比正常NK细胞而是否存在协同活化的检测结果的物质，还可包括染料(dye)，荧光染料，第2抗体，或者，生物学或分子探针(probe)。
如上述组合物中提及的术语或要素中请求的对NK细胞的活性检查方法的说明中提及的，理解为与请求的NK细胞的活性检查方法中提及的相同。
再别的实施方式提供与NK细胞的协同活性关联的疾病的诊断用试剂盒，其作为刺激样品内的NK细胞上的可区别的2种以上的因子而诱发所述NK细胞的协同活性的刺激物质包含：选自下列的一种以上：对所述2种以上的因子各自或同时具有特异性的抗体或其片段，诱发所述2种以上的因子的特异性的活性的靶细胞或多肽，特异性地诱导所述2种以上的因子的活性的化合物，及所述2种以上的因子的可逆性或非可逆性的激动剂；以及检测所述NK细胞相比正常NK细胞而是否存在活化的物质。
在一具体例中，检测所述NK细胞相比正常NK细胞而是否存在协同活化的物质可为选自针对选自穿孔素、粒酶、CD107a、CD107b、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TNF-α、TNF-β、PANTES、IL-8及IL-10中的一种以上的抗体，其片段或这些的组合中的一种以上或荧光染料(dye)。所述抗体，其片段或这些的组合可被荧光探针(probe)标记或不标记。所述荧光染料或荧光探针可根据旨在检测的对象，所述对象的组合或个数，期望的波长，检测器等的条件而多样，可为例如，多甲藻素叶绿素(peridinin chlorophyll；PerCP)，藻红蛋白(phycoerythrin；(PE)，异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate；FITC)，或者，铕(europium)，但不限于此。根据本发明的实施例，通过将IFN-γ及TNF-α用作为荧光探针的FITC标记，无需2次处理，即可用流式细胞计量仪直接检测所述IFN-γ及TNF-α。另外，根据本发明的实施例，通过测定由对用荧光染料染色的靶细胞(例如，P815)的NK细胞的活化而所述靶细胞被溶解排出的荧光染料，可测定NK细胞的协同活化程度。从而，作为检测所述NK细胞相比正常NK细胞而是否存在协同活化的物质使用荧光染料特别有利于测定细胞毒性。
在一具体例中，诱发所述NK细胞上的因子的特异性的活性的靶细胞被选自针对NK细胞上的可区别的2种以上的因子的抗体，其片段及这些的组合的一种以上包被可为。
在一具体例中，所述NK细胞的活性检查用试剂盒作为用于视觉呈现所述NK细胞相比正常NK细胞而是否存在协同活化的检测结果的物质，还可包括染料，荧光染料，第2抗体，或者，生物学或分子探针。
在一具体例中，所述与NK细胞的协同活性关联的疾病可选自：过敏性免疫疾病，自身免疫疾病，免疫排斥反应，组织细胞增生症，癌，2型糖尿病，寄生虫感染疾病及病毒感染疾病。
如所述试剂盒中提及的术语或要素中请求的对NK细胞的活性检查方法或NK细胞的活性检查用组合物的说明中提及的，理解为与所述请求的方法或组合物中提及的相同。
【发明效果】
通过利用根据一实施方式的包括特异性地刺激样品内的NK细胞上的可区别的2种以上的因子的步骤；测定所述NK细胞的协同活化程度的步骤；及将正常NK细胞与所述NK细胞的协同活化程度进行比较的步骤的NK细胞的活性检查方法，可相比以往已知的技术，简便、迅速且显著性地检查NK细胞的活性，可容易地早期诊断及预后判断与NK细胞的活性关联的疾病。
通过利用根据别的实施方式的作为诱发NK细胞的协同活性的刺激物质包含选自对所述NK细胞上的可区别的2种以上的因子各自或同时具有特异性的抗体或其片段，诱发所述NK细胞上的可区别的2种以上的因子的特异性的活性的靶细胞或多肽，特异性地诱导所述NK细胞上的可区别的2种以上的因子的活性的组合物，及所述NK细胞上的可区别的2种以上的因子的可逆性或非可逆性的激动剂中的一种以上的NK细胞的活性检查用组合物，可容易地施行用于与NK细胞的活性关联的疾病的早期诊断，预后判断等的方法，可容易地制造或利用试剂盒。
通过利用再别的实施方式的作为刺激样品内的NK细胞上的可区别的2种以上的因子而诱发所述NK细胞的协同活性的刺激物质包含选自对所述2种以上的因子各自或同时具有特异性的抗体或其片段，诱发所述2种以上的因子的特异性的活性的靶细胞或多肽，特异性地诱导所述2种以上的因子的活性的组合物，及所述2种以上的因子的可逆性或非可逆性的激动剂中的一种以上；以及检测所述NK细胞相比正常NK细胞而是否存在活化的物质的与NK细胞的协同活性关联的疾病的诊断用试剂盒，可相比以往已知的技术，可简便、迅速且显著性地对与NK细胞的活性关联的疾病进行早期诊断或预后判断。
【附图简述】
图1显示在特异性地刺激可区别的因子NKG2D及/或2B4时对NF-κB p65亚基的磷酸化程度的流式细胞计量分析结果。
图2显示在特异性地刺激可区别的因子NKG2D及/或2B4时对表达IFN-γ或TNF-α的细胞的频度的流式细胞计量分析结果。
图3是单一或共同刺激特定受体时将NK细胞的协同活性确认为细胞毒性的图。
图4显示将从正常或XLP1患者供予者获得的NK细胞用可区别的因子NKG2D及/或2B4刺激时的与NK细胞活化关联的因子的表达程度。
图5中，(A)显示将从正常或XLP1患者供予者获得的NK细胞用可区别的因子NKG2D及/或2B4刺激时，由流式细胞计量仪分析IFN-γ表达程度，(B)显示不对NK细胞施加刺激的情况(ΔIFN-γ+细胞)对比施加刺激的情况中，表达(IFN-γ+NK细胞)IFN-γ的NK细胞增加百分率。
图6显示对共同活化的XLP1NK细胞的缺陷性细胞毒性脱颗粒化，其中(A)显示将从正常或XLP1供予者获得的NK细胞用可区别的因子NKG2D及/或2B4刺激时，由流式细胞计量仪分析CD107a的表达程度；(B)显示不对NK细胞施加刺激的情况(ΔCD107a+细胞)对比施加刺激的情况(CD107a+NK细胞)中CD107a+NK细胞的增加百分率。
图7显示对多样的血细胞细胞中NKG2D/2B4组合的刺激导致的活性程度的流式细胞计量分析结果。
图8显示对NK细胞中NKG2D/2B4组合的刺激导致的活性程度的流式细胞计量分析结果。
【实施方式】
以下由实施例进一步详细地说明本发明。但是，这些实施例仅为例示性地说明本发明，本发明的范围不被这些实施例限制。
【实施例1.作为可区别的因子的NKG2D及2B4的共同活化导致的正常NK细胞中的协同活性存在与否确认】
【1-1.NK细胞的获得】
根据牙山医疗中心，UCL Istitute of Child Health，及费城小儿医院的器官审议委员会承认的流程，基于告知，从健康的供予者及XLP1供予者，以研究人血液样品作为目的而采集血液。利用密度梯度离心机(利用淋巴细胞分离培养基(lymphocyte separationmedium：LSM)(MP Biomedicals))将末梢血液单核细胞(Peripheral blood mononuclearcells：PBMCs)从血液样品分离，在进行此过程期间低温保存(cryopreserved)。将人NK细胞如以往所知(Sci.Signal.5,ra49(2012))，利用NK细胞分离试剂盒(StemCellTechnologies)而由阴性选择(negative selection)从PBMC纯化。这些细胞经由流式细胞计量法评价，是97～99％的CD3-CD56+。将作为人NK细胞系的NKL(M.Robertson的捐赠)在补充了10％FBS，1mM丙酮酸钠，及200U/ml重组IL-2(rIL-2)的RPMI1640中进行培养。将NKL细胞在无rIL-2的情况下，在补充了5％FBS及0.5mM丙酮酸钠的RPMI1640中休止24小时。
【1-2.作为NKG2D及2B4的共同活化导致的NK细胞的协同活性的指标的NF-κB p65亚基的磷酸化】
NK-κB在先天性及后天性免疫反应中，作为调节者，作为重要的转录因子，NK-κB亚基p65Ser536残基被磷酸化时，NK细胞的活性增加(Front Immunol.2014；5:662)。从而，作为NK细胞的活性因子，在原代休止期的NK细胞中测定NF-κB p65亚基的磷酸化。
为了刺激诱发NK细胞的活化的特定因子而实施如下受体交联。
将纯化的人原代NK或NKL细胞在冰上与对NKG2D及/或2B4(NK受体(总共10μg/ml))具有特异性的mAb或同种型对照组mAb(cIgG1)预温浴(preincubation)30分钟。用培养基洗涤后，将NK细胞用山羊抗-小鼠F(ab')2第2Ab于37℃进行受体交联5分钟而进行刺激。将细胞用DPBS洗涤，用4％多聚甲醛于37℃固定10分钟。然后，将固定的细胞用90％甲醇在冰上渗透化(permeabilize)30分钟，用0.5％BSA于室温阻断10分钟。将细胞用接合了AlexaFluor 488的抗-pS536p65Ab(93H1)或同种型对照组兔IgG(DA1E)(Cell Signaling)染色后，利用流式细胞仪对p65磷酸化进行分析。
结果，如图1所示，反应的细胞的比率随原代NK细胞的NKG2D及2B4组合刺激而协同增加，反面，对受体单独的反应比被共同活化的情况显著少。
【1-3.作为NKG2D及2B4的共同活化导致的NK细胞的协同活性的指标的免疫活性因子测定】
NK细胞被活化时，分泌作为免疫活性因子(或者，细胞因子)的IFN-γ或TNF-α等。从而，测试因可区别的特定因子的共同活化而细胞因子的分泌量是否协同增加。
如上所述，采集NK细胞，用经对NKG2D及/或2B4具有特异性的mAb或同种型对照组mAb预温浴的P815细胞(American Type Culture Collection)刺激PBMC。此后，温浴6小时，将细胞表面标志物用CD3及CD56进行染色。通过用流式细胞计量仪测定CD3-CD56+NK细胞中IFN-γ或TNF-α的细胞内表达来鉴定NK细胞导致的细胞因子生产。具体而言，将PBMC或原代休止期的NK细胞用相同的数的指定的标志细胞于37℃刺激1小时。然后，添加布雷菲德菌素A(brefeldin A)(GolgiPlug；BD Bioscience)，在总6小时后追加进行5小时的温浴。然后，对于细胞在4℃暗室，用抗-CD56-PE及/或抗-CD3-PerCP mAbs就表面标志物进行30分钟染色。用FACS缓冲液将细胞洗涤2次后，将这些在BD Cytofix/Cytoperm溶液(BD Bioscience)中在暗室于4℃温浴20分钟。在4℃暗室中用抗-IFN-γ-FITC或抗-TNF-α-FITC mAb细胞内染色30分钟前后，将细胞用BD Perm/Wash缓冲液(BD Bioscience)洗涤2次。然后，将细胞就NK细胞进行选通而由流式细胞计量仪进行分析。
结果，如图2所示，看到NKG2D及2B4的共同关联(coengagement)以表达作为免疫活性因子的IFN-γ或TNF-α的NK细胞的比率诱发协同的增加。
综上，这样的结果表明，NKG2D及2B4各自的单一的刺激不足以对于NK细胞活性有效地刺激NF-κB活化，在施加NKG2D及2B4共同活化时，克服对于NF-κB活化的临界点(threshold)，诱发NK细胞导致的协同的细胞因子生成。
各图由3次以上的独立实验制作。结果以平均值±SD表示。利用GraphPad Prism软件，由两侧Student t-检定(two-tailed student's t-test)施行统计学分析。
【实施例2.作为可区别的诸因子的共同活化导致的NK细胞的协同活性的指标的细胞毒性测定】
如观察到由所述NKG2D及2B4的共同活化而以表达作为免疫活性因子的IFN-γ或TNF-α的NK细胞的比率诱发协同的增加，作为测定协同活性的一种方法而测试了是否也诱发细胞毒性的协同的增加。
将P815细胞与对CD56，CD16及NKG2D及/或2B4，DNAM-1及/或2B4具有特异性的mAb或同种型对照组mAb预温浴，将被所述NK细胞特定受体刺激抗体包被的P815用铕(europium)荧光染料(dye)标记。如下文所述，将原代休止期NK细胞与所述P815细胞一同培养而进行刺激。此后通过离心回收培养液，通过作为细胞毒性的一个指标的靶细胞溶解(lysis)测定排出的荧光染料量。由酶标仪分析所述培养液中的荧光程度。
结果，如图3所示表明，CD16例外地单一地诱发强的细胞毒性，但相比各自刺激的情况，被NKG2D+2B4及DNAM-1+2B4刺激的情况诱导协同的细胞毒性。虽然会有例外的情况，但由于这可通过特定受体刺激(例如，如上所述，特定受体刺激抗体的利用)排除，将可区别的2种因子特异性地刺激而不仅可实现协同活性测定，相比单一刺激的情况，同时刺激而诱发的协同活性对于比较NK活性而言具有显著的差异，从而确认可容易区别。
【实施例3.利用正常及XLP1患者的NKG2D及2B4的共同活化导致的特定因子表达的协同的差异的NK细胞活性比较】
确认可将可区别的因子NKG2D及2B4特异性地共同活化而诱发NK细胞的协同活性。从而，为了确认是否可利用这样的协同活性存在与否来诊断作为HLH疾病的XLP1患者，施行可观察特定因子表达的协同的差异的蛋白印迹(western blot)。
【3-1.XLP1患者的NK细胞获得】
如上所述，从XLP1的患者得到NK细胞。在这里，作为先天性XLP1的对象，包含遗传性SH2D1A基因突变患者。因患者NK细胞的供给局限，为了研究对NF-κB活化及效应子(effector)功能的分子信号传递而如上所述增殖XLP1患者的NK细胞。也增殖正常的供予者的NK细胞，经休止期后，用NKG2D及2B4刺激而再现效应子功能及信号传递中的协同的增加。
为了确定XLP1患者的NK细胞是否可成为疾病的指标而施行蛋白印迹。根据以往已知(Nat.Rev.Immunol.6,56-66(2006))，SAP包含2B4，是发送免疫刺激导致的活化信号所要求的受体适配体蛋白，已知在诸XLP1患者的情况中，NK细胞内SAP表达量枯竭或减小。将从正常或XLP1患者供予者增殖的原代NK细胞的总溶解物对SAP及肌动蛋白进行蛋白印迹，而了解其表达量的结果，在实验的4名XLP1患者中，3名患者具有诱发SAP表达的完全的损失的SH2D1A基因的宏观缺失(macrodeletion)，一名患者的SAP表达减小，考虑到未完全消失，确认具有错义(missense)突变。
【3-2.Erk及磷酸化的p65的协同的表达程度的比较】
利用蛋白印迹比较正常NK细胞和XLP1患者的NK细胞中活性差异。具体而言，将从正常或XLP1患者供予者增殖后的原代休止期NK细胞与对指定的受体具有特异性的mAb或同种型对照组mAb(cIgG1)一起预温浴。将受体交联2分钟(p-Akt及p-Erk1/2)及5分钟(pS536-p65及pS276-p65)后，将溶解物用指定的磷酸化免疫阻断。结果，如图4所示，在NKG2D及2B4被各自刺激时，虽然也观察到作为NK细胞的活性指标的NF-κB活化导致的p65的磷酸化，其程度相比NKG2D及2B4的共同活化导致的协同磷酸化不显著区别。反面确认，NKG2D及2B4的共同活化导致的p65的丝氨酸536及276协同磷酸化可在XLP1NK细胞中显著减小。这在由共同活化诱导的Erk的协同的磷酸化中也一样出现，见到XLP1NK细胞中比正常显著减小。从而，对于诊断XLP1而言，由于相比刺激各自的可区别的因子而测定NK细胞的活性，在共同活化的情况中显著观察到其差异，这提示，基于通过共同活化NK细胞的可区别的因子而诱发的协同活性而可有效诊断XLP1。
【实施例4.利用正常及XLP1患者的NKG2D及2B4的共同活化导致的IFN-γ表达量中的协同的差异的NK细胞活性比较】
为了比较可区别的2种因子的刺激导致的协同活性对于XLP1诊断是否更有利，施行了比较作为免疫活性因子之一的IFN-γ的表达量的试验。具体而言，将从正常或XLP1患者供予者增殖后的原代休止期NK细胞和与对指定的受体具有特异性的mAb预温浴的P815细胞混合。温浴6小时后，用针对CD56的接合荧光色素的mAb染色，用IFN-γ进行细胞内染色后如上所述由流式细胞计量仪进行分析。
结果，如图5所示，尽管CD16刺激在XLP1中的NK细胞活化中不具有意义，见到因NKG2D及2B4的组合刺激而表达IFN-γ的NK细胞的比率在XLP1NK细胞中显著地减小。此差异如图5B所示，相对于非刺激的细胞(ΔIFN-γ+细胞)而用指定的受体刺激后，测定为来自各自的正常或XLP1患者供予者的IFN-γ+NK细胞的增加百分率。观察到，相比将NKG2D及2B4各自单一地刺激，NKG2D及2B4的共同组合刺激导致的协同活性更显著且明显地呈现差异。这还证实，相比在单一的刺激后进行比较，引发协同的活化后进行比较可更显著地进行判断。
总的而言，所述结果证明正常及XLP1患者的NK细胞中的遗传性及分子性差异与共同活化刺激的结果一致，表明判断适用于所述实验的因子等的动态对于XLP1的诊断具有充分的根据，表明对于诊断而言，相比刺激单一因子，通过刺激可诱发协同的活化的2种以上的因子，比较因其导致的协同活性可成为可更显著地诊断XLP1的方法。不仅如此，其中可见的仅特定因子(Erk)中出现的协同的磷酸化，特定受体组合(NKG2D及2B4)导致的协同的活化结果证明通过特定受体的特异性的共同活化，适合于诊断至少XLP1及关联临床预后预测。
各图由3次以上的独立的实验制作。结果以平均值±SD表示。利用GraphPad Prism软件，由两侧Student t-检定施行统计学分析。
【实施例5.利用正常及XLP1患者的NKG2D及2B4的共同活化导致的脱颗粒化中的协同的差异的NK细胞活性比较】
探讨是否可通过测定与作为NK细胞的活性指标之一的脱颗粒化成比例的NK细胞表面上的CD107a的表达程度，以因可区别的2种因子的刺激而发生的协同的效果的差异来诊断XLP1。
由细胞表面的CD107a表达及粒酶B释放(BioLegend)评价NK细胞的脱颗粒化(degranulation)。简言之，如上所述，使正常及XLP1患者的原代休止期NK细胞增殖后，在接合荧光色素的抗-CD107a mAb存在下和与对指定的受体具有特异性的mAb预温浴的P815混合。此后，温浴2小时后，将细胞利用流式细胞计量仪进行分析。具体而言，以30×g离心沉降3分钟，于37℃温浴2小时，再次离心沉降。将细胞颗粒(pellet)在FACS缓冲液(包含2％FBS的PBS)中重悬浮，用抗-CD56-PE，于4℃在暗室染色30分钟。将淋巴细胞用前方散射(forward scatter)/侧方散射(side scatter)选通(gate)，用流式细胞计量仪及FlowJo软件分析NK细胞中CD107a表达。
结果，如图6A所示，虽然在刺激CD16时，在作为协同活性的1个侧面的脱颗粒化中观察不到与正常NK细胞有显著的差异，可观察到因NKG2D及2B4的组合刺激而见到显著的差异的脱颗粒化被诱导。其中，也与测定作为所述免疫活性因子的IFN-γ的情况一样地可得知，与将NKG2D及2B4各自单一地刺激而进行比较相比，诱发由共同活化的协同活性后判断其显著的差异的存在与否作为诊断方法而更显著地具有意义。这可在显示作为非刺激的细胞的ΔCD107a+细胞对比CD107a+NK细胞的百分率的图6B图中更明显地确认。
【实施例6.NKG2D及2B4的共同活化导致的NK细胞活性的特异性评价】
为了确认利用NKG2D/2B4组合的协同测定是否在别的细胞中也仅对NK细胞具有特异性，测定了与作为NK细胞的活性指标之一的脱颗粒化成比例的NK细胞表面上的CD107a的表达程度。
具体而言，将正常人的单核细胞(PBMC)在接合荧光色素的抗-CD107a mAb存在下与表达对于指定的受体具有特异性的配体(对于NKG2D是ULBP1，及对于2B4是CD48)的P815细胞混合。此后，如实施例5所述，收获各细胞颗粒而重悬浮，用抗-CD3-PerCP，抗-CD56-PE于4℃在暗室内染色30分钟。将淋巴细胞用前方散射/侧方散射选通，用流式细胞计量仪及FlowJo软件分析NK细胞(CD3-CD56+)，NKT细胞(CD3+CD56+)，T细胞(CD3+CD56-)，其余细胞(CD3-CD56-)的CD107a表达。
结果，如图7所示，在将NKG2D及2B4各自单一地刺激时，包含NK细胞的别的细胞均未观察到脱颗粒化，但由NKG2D及2B4的组合刺激而可观察到NK细胞特异性地呈现显著的差异的脱颗粒化被诱导。从而，与将NKG2D及2B4各自单一地刺激而进行比较相比，通过诱发共同活化导致的协同活性，即可诱导NK细胞特异性活化，从而可作为诊断方法更显著地具有意义。
【实施例7.癌患者中NKG2D及2B4的共同活化导致的NK细胞协同活性比较】
为了探讨利用NKG2D/2B4组合的协同测定是否可适用于癌诊断，利用胰腺癌患者样品而测定了与作为NK细胞的活性指标之一的脱颗粒化成比例的NK细胞表面上的CD107a的表达程度。
具体而言，将正常及胰腺癌患者的单核细胞(PBMC)在接合荧光色素的抗-CD107amAb存在下，与表达对于指定的受体具有特异性的配体(对于NKG2D是ULBP1，及对于2B4是CD48)的P815细胞混合。作为比较组，使用适用于NK细胞活性测定的作为血液癌细胞系的K562。此后，如实施例5所述，收获各细胞颗粒而重悬浮，用抗-CD3-PerCP，抗-CD56-PE，于4℃在暗室染色30分钟。将淋巴细胞用前方散射/侧方散射而选通，用流式细胞计量仪及FlowJo软件分析NK细胞(CD3-CD56+)中的CD107a表达。
结果，如图8所示，可观察到由NKG2D及2B4的组合刺激而诱导了在正常人和胰腺癌患者之间见到显著的差异的NK细胞的脱颗粒化，从而可知，利用NKG2D/2B4组合的协同测定也可适用于癌诊断。
特别地得知，在用作为比较组的K562刺激NK细胞时，与特异性地刺激NKG2D及2B4的情况不同，在正常人和胰腺癌患者之间，在NK细胞的脱颗粒化诱导上没什么差异。从而得知，如NKG2D及2B4的组合刺激一样，由NK细胞上的特异性的因子的刺激导致的协同活化相比使用K562，作为NK细胞活性诊断方法更显著地具有意义。

Claims (19)

1.NK细胞的活性检查方法，其包括下列步骤：
特异性地刺激样品内的NK细胞上的可区别的2种以上的因子；
测定因对所述2种以上的因子的刺激而诱发的所述NK细胞的协同活化程度；及
将正常NK细胞与所述NK细胞的协同活化程度进行比较。
2.权利要求1所述的NK细胞的活性检查方法，其中所述方法还包括分离所述样品中作为目标的NK细胞的步骤。
3.权利要求1所述的NK细胞的活性检查方法，其中所述因子存在于细胞表面上或细胞内。
4.权利要求3所述的NK细胞的活性检查方法，其中所述因子选自：NKG2D，2B4(CD244)，DNAM-1(CD226)，CD2，CD16，NKp30，NKp44，NKp46，及NKp80。
5.权利要求1所述的NK细胞的活性检查方法，其中对所述因子同时或依次实施所述刺激。
6.权利要求1所述的NK细胞的活性检查方法，其中所述刺激由选自下列的一种以上实施：对所述因子各自或同时具有特异性的抗体或其片段，诱发所述因子的特异性的活性的靶细胞或多肽，特异性地诱导所述因子的活性的化合物，及所述因子的可逆性或非可逆性的激动剂(agonist)。
7.权利要求6所述的NK细胞的活性检查方法，其中诱发所述因子的特异性的活性的靶细胞被选自针对NK细胞上的可区别的2种以上的因子的抗体，其片段及这些的组合的一种以上包被。
8.权利要求1所述的NK细胞的活性检查方法，其中测定所述活化程度的步骤包含测定选自下列的一种以上：所述因子的子因子的磷酸化或表达程度，脱颗粒化活性，细胞毒性活性及由NK细胞刺激而导致的细胞因子分泌。
9.权利要求8所述的NK细胞的活性检查方法，其中所述细胞因子选自：IFN-γ，TNF-α，TNF-β，MIP-1α，MIP-1β，PANTES，IL-8及IL-10。
10.权利要求1所述的NK细胞的活性检查方法，其中所述方法旨在提供关于与NK细胞的协同活性关联的疾病的诊断的信息。
11.权利要求10所述的方法，其中所述与NK细胞的协同活性关联的疾病选自：过敏性免疫疾病，自身免疫疾病，免疫缺陷疾病，免疫排斥反应，组织细胞增生症，癌，2型糖尿病，寄生虫感染疾病及病毒感染疾病。
12.NK细胞的活性检查用组合物，其包含选自下列的一种以上作为诱发NK细胞的协同活性的刺激物质：对所述NK细胞上的可区别的2种以上的因子各自或同时具有特异性的抗体或其片段，诱发所述NK细胞上的可区别的2种以上的因子的特异性的活性的靶细胞或多肽，特异性地诱导所述NK细胞上的可区别的2种以上的因子的活性的化合物，及所述NK细胞上的可区别的2种以上的因子的可逆性或非可逆性的激动剂。
13.权利要求12所述的组合物，其中所述因子选自：NKG2D，2B4(CD244)，DNAM-1(CD226)，CD2，CD16，NKp30，NKp44，NKp46，及NKp80。
14.权利要求12所述的组合物，其中还包括抗体或其片段作为检测所述NK细胞相比正常NK细胞而是否存在协同活化的物质，所述抗体或其片段用于检测选自下列一种以上：所述因子的子因子的磷酸化或表达程度，脱颗粒化活性，细胞毒性活性及由NK细胞刺激而导致的细胞因子分泌。
15.权利要求14所述的组合物，其中检测所述NK细胞相比正常NK细胞而是否存在协同活化的物质包含选自下列中的一种以上：针对选自穿孔素、粒酶、CD107a、CD107b、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TNF-α、TNF-β、PANTES、IL-8及IL-10中的一种以上的抗体，其片段或这些的组合。
16.与NK细胞的协同活性关联的疾病的诊断用试剂盒，其
作为刺激样品内的NK细胞上的可区别的2种以上的因子而诱发所述NK细胞的协同活性的刺激物质包含选自下列的一种以上：对所述2种以上的因子各自或同时具有特异性的抗体或其片段，诱发所述2种以上的因子的特异性的活性的靶细胞或多肽，特异性地诱导所述2种以上的因子的活性的化合物，及所述2种以上的因子的可逆性或非可逆性的激动剂；以及
包含检测所述NK细胞相比正常NK细胞而是否存在活化的物质。
17.权利要求16所述的诊断用试剂盒，检测所述NK细胞相比正常NK细胞而是否存在协同活化的物质是包含选自下列中的一种以上：针对选自穿孔素、粒酶、CD107a、CD107b、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TNF-α、TNF-β、PANTES、IL-8及IL-10中的一种以上的抗体，其片段或这些的组合或荧光染料(dye)。
18.权利要求16所述的诊断用试剂盒，诱发所述因子的特异性的活性的靶细胞被选自针对NK细胞上的可区别的2种以上的因子的抗体，其片段及这些的组合的一种以上包被。
19.权利要求16所述的诊断用试剂盒，其中与NK细胞的协同活性关联的疾病选自：过敏性免疫疾病，自身免疫疾病，免疫缺陷疾病，免疫排斥反应，组织细胞增生症，癌，2型糖尿病，寄生虫感染疾病及病毒感染疾病。
CN201780042132.2A 2016-05-24 2017-03-17 利用受体协同活性的nk细胞的活性检查方法及利用其的诊断方法 Active CN109477838B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2016-0063735 2016-05-24
KR20160063735 2016-05-24
KR1020170033207A KR101926166B1 (ko) 2016-05-24 2017-03-16 수용체 시너지 활성을 이용한 nk 세포의 활성도 검사 방법 및 이를 이용한 nk 세포의 활성도가 관련된 질환의 진단 방법
KR10-2017-0033207 2017-03-16
PCT/KR2017/002870 WO2017204446A2 (ko) 2016-05-24 2017-03-17 수용체 시너지 활성을 이용한 nk 세포의 활성도 검사 방법 및 이를 이용한 nk 세포의 활성도가 관련된 질환의 진단 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109477838A true CN109477838A (zh) 2019-03-15
CN109477838B CN109477838B (zh) 2022-06-07

Family

ID=60921489

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780042132.2A Active CN109477838B (zh) 2016-05-24 2017-03-17 利用受体协同活性的nk细胞的活性检查方法及利用其的诊断方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20190302116A1 (zh)
EP (1) EP3467507B1 (zh)
JP (1) JP6784833B2 (zh)
KR (1) KR101926166B1 (zh)
CN (1) CN109477838B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102210455B1 (ko) * 2019-02-28 2021-02-02 사회복지법인 삼성생명공익재단 자연살해세포 활성 검출용 미세입자 및 이를 이용한 검출 방법
KR102415341B1 (ko) * 2019-10-11 2022-07-01 재단법인 아산사회복지재단 이중특이성항체를 이용한 nk 세포 활성도 검사 방법 및 이와 관련된 질환의 진단 방법

Citations (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1219637A1 (en) * 2000-12-27 2002-07-03 Innate Pharma Polypeptides having a triggering NK activity and biological applications
CN1422905A (zh) * 2001-12-05 2003-06-11 叶科尼亚有限责任公司 可生物降解的成形品的制作方法
CN1440424A (zh) * 2000-05-02 2003-09-03 Uab研究基金会 对于肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体受体选择性的抗体及其应用
WO2006122401A1 (en) * 2005-05-16 2006-11-23 Institut De Recherches Cliniques De Montreal/I.R.C.M. Negative regulation of nk cell functions by eat-2, a sap-related adaptor expressed in innate immune cells
CN1942482A (zh) * 2004-02-17 2007-04-04 剑桥大学技术服务有限公司 Nkg2d和ul16受体的蛋白质配体及其用途
CN101035807A (zh) * 2004-06-09 2007-09-12 泰勒公司 Siglec－6相关疾病的诊断和治疗
CN101421298A (zh) * 2004-11-12 2009-04-29 健泰科生物技术公司 用于治疗免疫相关疾病的新组合物和方法
US20090123442A1 (en) * 2007-11-09 2009-05-14 Avaris Ab Expanded nk cells
CN101490085A (zh) * 2006-06-12 2009-07-22 特鲁比昂药品公司 具有效应功能的单链多价结合蛋白
WO2009125408A1 (en) * 2008-04-07 2009-10-15 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem, Ltd. A kit for diagnosis, prognosis, and monitoring the immune status, of patients with chronic inflammatory diseases
CN102906277A (zh) * 2010-03-22 2013-01-30 蔚山大学校产学协力团 用于肝细胞癌预后的单核苷酸多态性
CN103167879A (zh) * 2010-07-09 2013-06-19 Abbvie公司 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
CN103370622A (zh) * 2011-02-14 2013-10-23 埃特根有限公司 使用nk细胞活性的测量值的诊断癌症的方法和诊断试剂盒
US20130295044A1 (en) * 2012-04-18 2013-11-07 Board Of Trustees Of Michigan State University Natural killer cells with enhanced immune response
CN103635487A (zh) * 2011-06-17 2014-03-12 诺沃—诺迪斯克有限公司 选择性消除侵蚀性细胞
CN103712967A (zh) * 2013-12-27 2014-04-09 首都医科大学附属北京友谊医院 检测nk细胞活性的方法
WO2014089029A1 (en) * 2012-12-03 2014-06-12 Ohio State Innovation Foundation Activation of innate immunity by mirna for cancer and infection treatment
WO2014165707A2 (en) * 2013-04-03 2014-10-09 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Effective generation of tumor-targeted t-cells derived from pluripotent stem cells
WO2015142675A2 (en) * 2014-03-15 2015-09-24 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
CN105001333A (zh) * 2007-12-14 2015-10-28 诺沃—诺迪斯克有限公司 抗人nkg2d抗体及其用途
CN105008516A (zh) * 2012-08-13 2015-10-28 人类起源公司 自然杀伤细胞及其用途
CN105264127A (zh) * 2013-03-15 2016-01-20 Gpb科学有限责任公司 颗粒的片上微流体处理

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA035033B1 (ru) * 2010-11-22 2020-04-20 Иннейт Фарма Са Способ лечения гематологического предракового или гематологического ракового заболеваний

Patent Citations (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1440424A (zh) * 2000-05-02 2003-09-03 Uab研究基金会 对于肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体受体选择性的抗体及其应用
EP1219637A1 (en) * 2000-12-27 2002-07-03 Innate Pharma Polypeptides having a triggering NK activity and biological applications
CN1422905A (zh) * 2001-12-05 2003-06-11 叶科尼亚有限责任公司 可生物降解的成形品的制作方法
CN1942482A (zh) * 2004-02-17 2007-04-04 剑桥大学技术服务有限公司 Nkg2d和ul16受体的蛋白质配体及其用途
CN101035807A (zh) * 2004-06-09 2007-09-12 泰勒公司 Siglec－6相关疾病的诊断和治疗
CN101421298A (zh) * 2004-11-12 2009-04-29 健泰科生物技术公司 用于治疗免疫相关疾病的新组合物和方法
WO2006122401A1 (en) * 2005-05-16 2006-11-23 Institut De Recherches Cliniques De Montreal/I.R.C.M. Negative regulation of nk cell functions by eat-2, a sap-related adaptor expressed in innate immune cells
CN101490085A (zh) * 2006-06-12 2009-07-22 特鲁比昂药品公司 具有效应功能的单链多价结合蛋白
US20090123442A1 (en) * 2007-11-09 2009-05-14 Avaris Ab Expanded nk cells
CN105001333A (zh) * 2007-12-14 2015-10-28 诺沃—诺迪斯克有限公司 抗人nkg2d抗体及其用途
WO2009125408A1 (en) * 2008-04-07 2009-10-15 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem, Ltd. A kit for diagnosis, prognosis, and monitoring the immune status, of patients with chronic inflammatory diseases
CN102906277A (zh) * 2010-03-22 2013-01-30 蔚山大学校产学协力团 用于肝细胞癌预后的单核苷酸多态性
CN103167879A (zh) * 2010-07-09 2013-06-19 Abbvie公司 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
CN103370622A (zh) * 2011-02-14 2013-10-23 埃特根有限公司 使用nk细胞活性的测量值的诊断癌症的方法和诊断试剂盒
CN103635487A (zh) * 2011-06-17 2014-03-12 诺沃—诺迪斯克有限公司 选择性消除侵蚀性细胞
US20130295044A1 (en) * 2012-04-18 2013-11-07 Board Of Trustees Of Michigan State University Natural killer cells with enhanced immune response
CN105008516A (zh) * 2012-08-13 2015-10-28 人类起源公司 自然杀伤细胞及其用途
WO2014089029A1 (en) * 2012-12-03 2014-06-12 Ohio State Innovation Foundation Activation of innate immunity by mirna for cancer and infection treatment
CN105264127A (zh) * 2013-03-15 2016-01-20 Gpb科学有限责任公司 颗粒的片上微流体处理
WO2014165707A2 (en) * 2013-04-03 2014-10-09 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Effective generation of tumor-targeted t-cells derived from pluripotent stem cells
CN103712967A (zh) * 2013-12-27 2014-04-09 首都医科大学附属北京友谊医院 检测nk细胞活性的方法
WO2015142675A2 (en) * 2014-03-15 2015-09-24 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HIDEO NAKAJIMA等: ""Patients with X-linked lymphoproliferative disease have a defect in 2B4 receptor-mediated NK cell cytotoxicity"", 《EUROPEAN JOURNAL OF IMMUNOLOGY》 *
HUN SIK KIM 等: ""Synergistic Signals for Natural Cytotoxicity Are Required to Overcome Inhibition by c-Cbl Ubiquitin Ligase"", 《IMMUNITY》 *
HYUNG-JOON KWON 等: ""Signaling for Synergistic Activation of Natural Killer Cells"", 《IMMUNE NETWORK 》 *
YENAN T. BRYCESON 等: ""Synergy among receptors on resting NK cells for the activation of natural cytotoxicity and cytokine secretion"", 《BLOOD》 *
Z.B. AL-HUBESHY 等: ""A rapid method for assessment of natural killer cell function after multiple receptor cross - linking"", 《JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS》 *
刘丹等: "NK细胞表面活化性受体的研究进展", 《国际免疫学杂志》 *
孙成: ""TGF-β1下调NK细胞双信号分子NKG2D/DAP10和2B4/SAP介导HBV持续性感染"", 《万方数据博士学位论文》 *
江希明 等: "《肿瘤生物学》", 31 December 1990 *
赵平森等: "NK细胞在肿瘤过继性免疫治疗中的临床应用与研究进展", 《中华肿瘤防治杂志》 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2019518226A (ja) 2019-06-27
CN109477838B (zh) 2022-06-07
EP3467507A2 (en) 2019-04-10
KR20170132659A (ko) 2017-12-04
EP3467507A4 (en) 2019-04-10
KR101926166B1 (ko) 2018-12-06
JP6784833B2 (ja) 2020-11-11
US20190302116A1 (en) 2019-10-03
EP3467507B1 (en) 2022-02-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107860924B (zh) 新型γδT细胞在制备评估AML疗效试剂盒中的应用
CN114019156A (zh) 免疫突触的质量预测了嵌合抗原受体（car）t细胞的效能
EP3947741A1 (en) Cancer biomarkers for durable clinical benefit
Zhang et al. Circulating level of Th17 cells is associated with sensitivity to glucocorticoids in patients with immune thrombocytopenia
Chan et al. Visualization and quantification of NK cell-mediated cytotoxicity over extended time periods by image cytometry
CN109477838A (zh) 利用受体协同活性的nk细胞的活性检查方法及利用其的与nk细胞的活性关联的疾病的诊断方法
CN110244048A (zh) Serping1蛋白作为标志物在开发诊断活动性结核病的试剂中的应用
KR102197723B1 (ko) 림프구의 종양 반응성 예측용 마커 및 이의 용도
WO2018224506A2 (en) Auto immune diagnosis using t cell populations
WO2015169781A1 (en) Predictive markers for successful cancer immunotherapy
US20120040864A1 (en) Method for Determining the Cbl-b Expression
AU2015263482B2 (en) Diagnostic of chronic myelomonocytic leukemia (CMML) by flow cytometry
US20130337474A1 (en) Detection of acute myeloid leukaemia
CN113167786A (zh) 免疫细胞的分析方法及细胞分析装置
WO2017204446A2 (ko) 수용체 시너지 활성을 이용한 nk 세포의 활성도 검사 방법 및 이를 이용한 nk 세포의 활성도가 관련된 질환의 진단 방법
CN110286231A (zh) 用于检测cd160蛋白的物质在制备用于诊断活动性结核病的产品中的应用
KR102415341B1 (ko) 이중특이성항체를 이용한 nk 세포 활성도 검사 방법 및 이와 관련된 질환의 진단 방법
CN109187987A (zh) Ms4a3蛋白作为标志物在诊断活动性结核病中的应用
US20220251652A1 (en) Marker for predicting tumor reactivity of lymphocytes, and use thereof
US20180188253A1 (en) Cancer Diagnostic
Al-Hraishawi et al. Evaluation some immune aspects in Iraqi women patients with breast cancer
Parrish Immune Dysfunction in Myeloma: Characterisation and Generation of IL-17-secreting Lymphocytes and Immune Manipulation using Oncolytic Virotherapy
Melnikov et al. D1 Receptor Blockade Suppresses the Function of Th-17 Cells in Multiple Sclerosis
WO2011024458A1 (ja) 宿主対移植片疾患の検査方法
ALPAR et al. EVOLUTIONARY SEQUENCE OF CYTOGENETIC ABERRATIONS DURING THE ONCOGENESIS OF PLASMA CELL DISORDERS. DIRECT EVIDENCE AT SINGLE CELL LEVEL

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant