CN101035807A - Siglec－6相关疾病的诊断和治疗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及特异性结合肥大细胞上SIGLEC－6的激动剂、拮抗剂及其它分子、其在治疗哮喘及其它SIGLEC－6介导的疾病或失调中的作用、诊断这些疾病或失调的方法、及筛选能调节肥大细胞中SIGLEC－6活性的候选化合物的方法。本发明还涉及使用结合和/或调节SIGLEC－6的化合物诊断和治疗B细胞相关疾病。

Description

SIGLEC-6相关疾病的诊断和治疗

本申请的交叉参考

本申请要求申请日为2004年6月9日的美国临时申请60/578,194和申请日为2004年6月17日的美国临时申请60/580,422的优先权，上述两件申请均通过引用以其全文并入本文。

发明领域

本发明涉及在肥大细胞和循环血液单核细胞(CBMC)表面上高度表达的Siglec-6，及其在治疗肥大细胞相关疾病或失调中的应用。本发明还涉及Siglec-6在诊断和治疗B细胞相关疾病和失调如白血病和B细胞淋巴瘤中的应用。

发明背景

在免疫球蛋白样分子的超家族中已经描述了一组唾液酸依赖性粘附分子(Kelm，S.et al.，1998 Eur.J.Biochem 255：663-672)。采用术语“Siglec”描述这个家族(结合唾液酸的Ig相关凝集素(Sialic acid-binding Ig-relatedlectins))。迄今为止，该组成员包括Siglec-1(唾液酸黏附素)、Siglec-2(CD22)、Siglec-3(CD33)、Siglec-4(髓鞘相关糖蛋白或MAG)、Siglec-4b(神经膜细胞髓磷脂蛋白或者SMP)、Siglec-5(OB-BP2)、Siglec-6(OB-BP1，CD33L)、Siglec-7、Siglec-8、Siglec-9、Siglec-10、Siglec-11和Siglec12。

Siglec组的蛋白质成员的生物学活性被认为参与不同的生物学过程，如红细胞生成，神经元发育和免疫性(Vinson，M.et al.，1996，如前)。研究还提示这些蛋白质通过识别唾液酰化的(sialyated)细胞表面聚糖而介导细胞粘附/细胞信号传导(Kelm，S.et al.，1996 Glycoconj.J.13：913-926；Kelin，S.et al.，1998 Eur.J.Biochem.255：663-672；Vinson，M.et al.，1996 J.Biol.Chem.271：9267-9272)。

已知的Siglec蛋白在不同类型的造血细胞中表达，但它们均呈现相似结构，包括一个N末端V-set结构域(膜-远端)，随后是不定数目的胞外C2-set结构域，一个跨膜结构域，及一个短的细胞质尾部。另外，所述末端V-set结构域具有一个不寻常的折叠内(intrasheet)二硫键，其在Ig超家族成员中是独特的(Williams，A.F.and Barclay，A.N.1988 Annu.Rev.Immunol.6：381-405；Williams，A.F.，et al.，1989 Cold Spring HarborSymp.Quant.Biol 54：637-647；Pedraza，L.，et al.，1990 J.Cell.Biol.111：2651-2661)。

不同研究方法的结果，包括截短突变体(Nath，D.，et al.，J.Biol.Chem.270：26184-26191)、定向诱变(Vinson，M.，et al.，1996 J.Biol.Chem.271：9267-9272；Van der Merwe，P.a.，et al.，1996 J.Biol Chem.271：9273-9280)、X射线晶体学和NMR(discussed in：Crocker，P.R.，et al.，1997Glycoconjugate J.14：601-609)的研究结果，表明已知Siglec蛋白的N末端V-set结构域的GFCC′C″面与唾液酸相互作用。因此，V-set结构域通过与唾液酸相互作用而介导细胞与细胞的粘附。

据称已知Siglec蛋白的在其它细胞上的配体是糖蛋白或者糖脂，或者在一些情况中在同样的细胞上包括糖或唾液酸。有大约40种天然发生的唾液酸(Sia)增加细胞表面糖蛋白的结构多样性。最普遍的是在糖蛋白和糖脂上与其它糖如Gal、GalNAc、GlcNAc及Sia自身连接的末端位置发生的NeuSAc、Neu9Ac2和Neu5Gc。推测唾液酸在某些类型细胞中的表达模式是由唾液酸转移酶的特异性表达控制(Paulson，J.C.etal.，1989J.Biol.Chem.264：10931-10934)。Siglec蛋白不仅可以识别末端唾液酸，也可以基于其粘附的末端之前的糖而识别这些成分(Kelm，S.，et al.，1996 Glycoconj.J.13：913-926)。

Siglecs可以通过发挥作为对唾液酸类型及其与接近末端的糖的连接具有不同特异性的唾液酸依赖性凝集素的功能而介导细胞与细胞的粘附(Kelm，S.，1994见上；Powell，L.D.，et al.，1994 J.Biol.Chem.269：10628-10636；sjoberg，E.，et al.，1994 J.Cell Biol.126：549-562；Collins，B.，E.，et al.，1997 J.Biol.Chem.272：1248-1255)。已经分析了唾液酸黏附素与碳水化合物之间的结构相互作用(例如见Collins et al.，J Biol Chem272：16889-95，1997；也见May et al.，Mol.Cell 1：719-28，1998所述)。Siglec通过其同源分子上的特异性唾液酰化的糖缀合物而呈现蛋白质-碳水化合物识别功能，并且其中一些与终止于α-2，3连接的唾液酸的聚糖结合(Kelm et al.，Curr.Biol.4：965-72，1994)。所述唾液酸结合活性通常位于N末端V-set Ig样结构域，也可包含倒数第二个Ig样结构域。据报道该组的一些成员对于唾液酸的类型及其与接近末端的糖的连接均呈现不同的的特异性。

一些Siglec蛋白的胞质尾部氨基酸序列强烈提示它们参与胞内信号传导。例如，Siglec-2在胞质结构域中有6个酪氨酸，其中两个位于介导激活的ITAM(基于免疫酪氨酸的激活基序)基序中，其它四个位于介导抑制的ITIM(基于免疫酪氨酸的抑制基序)基序中(Taylor，V.et al.，1999 J.Biol.Chem.274：11505-11512)。ITAM基序酪氨酸的磷酸化使得Src得以补充，而ITIM基序的磷酸化使得SHP-1和SHP-2得以补充。Siglec-3含有两个ITIM，其基于磷酸化而补充SHP-1和SHP-2(Taylor，V.et al.，1999见上)。Siglec-6在其胞质尾部还具有推定的SLAM样信号传导基序；SLAM是信号传导淋巴细胞激活分子(Signaling Lymphocyte ActivationMolecule)的缩写(Patel，N.et al.，1999 J.Biol.Chem.274：22729-22738)。

越来越多的迹象表明炎症细胞侵润通过破坏组织和释放促炎剂在引起哮喘及其它变态反应疾病的发病机理中起显著作用。激活的嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、肥大细胞和淋巴细胞数目在炎症部位增多，并且每种细胞均能改变整体的炎症应答(Busse，W.W.1998 J.AllergyClin.Immunol.102：S17-22)。在哮喘和变态反应中，嗜酸性粒细胞由于其在变态反应原引起的炎症部位显著出现而被特别关注(Kroegel，C.et al.，1994 Eur.Respir.J.7：519-543；Haczku，A.1998 Acta.Microbiol.Immunol.Hung.45：19-29；Boyce，J.A.1997 Allergy Asthma Proc.18：293-300)。由于毒性颗粒蛋白、促炎脂质介质和细胞因子的释放，暗示嗜酸性粒细胞在哮喘中的呼吸道重塑和过度反应性中起主要作用(Durham，S.R.1998Clin.Exp.Allergy 28 Suppl.2：11-6)。

据报道许多蛋白质含有与抑制效应子功能的转导相关的胞质抑制性信号传导基序，例如“基于免疫受体酪氨酸的抑制基序”或“ITIM”(Renardetal.，Immun Rev 155：205-221，1997)。ITIM具有共有的序列I/VxYxxL/V，并在免疫系统的不同信号传导蛋白质的胞质部分中被发现，所述蛋白质中很大一部分，如siglec，属于Ig超家族或者属于II型二聚体C-凝集素家族(见Renard et al.，1997，如上)。含有ITIM的蛋白质包括“杀伤细胞Ig样受体”或者“KIR”，及白细胞Ig样受体或者“LIR”蛋白质家族的一些成员(Renard et al.，1997，见上；Cosman et al.，Immunity 7：273-82，1997；Borges et al.，J Immunol 159：5192-96，1997)。确信通过ITIM的信号传导下调靶细胞活性，如细胞表面蛋白的表达。Renard等猜想复杂的细胞功能的调节是通过ITIM介导的抑制信号的传导与其它蛋白质上呈递的由一个16-18个氨基酸组成的激活基序(或ITAM序列)的相同功能的激活作用的相互作用而进行精确调整的。

据报道一些siglec在其胞质区含有一或多个ITIM。CD22具有一个以上的ITIM，并已经被鉴定为是B细胞激活的负调节物。据报道CD33和siglec 8在其胞质结构域中也含有ITIM基序(Ulyanova et al.，Eur JImmunol 29：3440-49，1999；Floyd et al.，2000，见上)。ITIM也在p75/AIRM1/siglec7(这是一种在CD8⁺天然杀伤细胞(NK)亚类上显著表达的蛋白质)的胞质尾部呈递(Nicoll et al.，1999，见上)。

Siglec表达高度受限于免疫系统的骨髓细胞，并确信其参与骨髓相互作用的控制，例如抗原呈递细胞(APC)(例如巨噬细胞(包括小胶质细胞)或者树突细胞)与参与细胞介导的免疫的其它细胞如T细胞或天然杀伤细胞之间的附着。这些多肽当在APC上表达时可发挥抗原捕获和摄取功能，并因此提供用于增强基于细胞的肿瘤疫苗的靶位。观测到许多siglec主要在特定类型造血细胞的亚类上表达。CD33表达很大程度受限于骨髓单核细胞系，其在成熟单核细胞和组织巨噬细胞上呈递(Freeman et al.，1995，见上)。CD22主要在B细胞上表达，而siglec-8在嗜酸性粒细胞上特异性表达(Floyd et al.，J.Biol.Chem.275：861-866，2000)。唾液酸黏附素在慢性炎性病变和肿瘤中在巨噬细胞上高水平表达，提示其在宿主防御中的作用，并且能在体外介导特异性细胞-底物及细胞-细胞之间相互作用(Crocker et al.，1994；Crocker et al.，1997，见上)。Umansky等报道了唾液酸黏附素阳性巨噬细胞有助于宿主对肿瘤转移的抗性，这些巨噬细胞可发挥抗原呈递细胞功能，而且唾液酸黏附素(sialoadhesion)表达还与皮质类固醇、淋巴因子和细胞因子相关(Umansky et al.，1996 and 1996)。

与其它已知Siglec家族成员(CD22、CD33、髓鞘相关糖蛋白及唾液酸黏附素)的对比示出，OB-BPl/Siglec-6、OB-BP2/Siglec-5和CD33/Siglec-3组成了具有高水平的整体氨基酸相同性(Siglec-6对Siglec-5(59％)，Siglec-6对CD33(63％)及Siglec-6/Siglec-5对CD33(56％))的独特的相关亚组。所述胞质结构域不是高度保守的，但是展示出是酪氨酸磷酸化的推定位点的新基序，包括免疫受体酪氨酸激酶抑制基序及在SLAM和SLAM-样蛋白中发现的基序。

Siglec-6(OB-BP1)分离自TF-1人红白血病细胞系(Patel，N.，et al.，1999 J.Biol.Chem.274：22729-22738)。除了几个氨基酸不同之外，Siglec-6与CD33-L1基本相同。人体组织示出Siglec-6mRNA在胎盘中高水平表达，在脾、周围血白细胞和小肠中中等程度表达。特异于Siglec-6的单克隆抗体证实在胎盘的细胞滋养层和合胞滋养层中高度表达。在周围血白细胞上使用这种抗体示出在B细胞上的几乎是唯一的表达模式。分析Siglec-6、Siglec-5和CD33/Siglec-3的胞外结构域的重组形式与瘦素(leptin)的特异性结合。Siglec-6表现紧密结合(K(d)91nM)，其它两个示出弱结合，K(d)在1-2μM范围。使用唾液酸化的配体研究提示Siglec-6选择性结合Neu5Acalpha2-6GalNAcalpha(sialyl-Tn)，这使其被正规命名为Siglec-6。由于Siglec-6的受限表达模式，已经提示其可以通过与在特定细胞群上表达的唾液酸化的糖蛋白配体相互作用而介导细胞-细胞识别。

我们发现Siglec-6在肥大细胞上和在B细胞的一小亚群上高度表达，但在初级单核细胞、中性粒细胞或者T淋巴细胞上不表达。因此，SIGLEC-6作为治疗与肥大细胞增殖相关的疾病及抑制导致炎症或者变态反应疾病包括哮喘的肥大细胞介质的特异性和直接靶位可能是有益的。另外，SIGLEC-6作为诊断和治疗B细胞介导的疾病如白血病和B细胞淋巴瘤的特异性和直接靶位可能是有益的。

发明概述

本发明涉及一种调节由表达SIGLEC-6的肥大细胞诱导的免疫应答的方法。本发明包括通过使用SIGLEC-6的激动剂治疗免疫疾病，包括变应性疾病，如哮喘，以及炎性疾病。由于SIGLEC-6含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序ITIM，所以结合SIGLEC-6的一种激动剂分子如抗体将会刺激ITIM以抑制某些肥大细胞功能。这种分子也可以是双特异性分子，其将SIGLEC-6的ITIM与一种ITAM如FceRI交联，因此抑制含有ITAM的受体的作用。

本发明还涉及一种诊断和治疗B细胞相关疾病的方法，其中B细胞在其表面上表达SIGLEC-6。本发明包括B细胞相关疾病如白血病和B细胞淋巴瘤的治疗。由于SIGLEC-6含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序ITIM，所以结合SIGLEC-6的一种激动剂分子如抗体将会刺激ITIM以抑制B细胞功能。这种分子也可以是双特异性分子，其将SIGLEC-6的ITIM与一种ITAM如FceRI交联，因此抑制含有ITAM的受体的作用。

本发明包括特异性结合SIGLEC-6的抗体，包括激动剂抗体、拮抗剂抗体、具有Fc介导的细胞胞毒性(如抗体依赖性细胞介导的胞毒性(ADCC))的抗体、抗体缀合物、阻断与SIGLEC-6结合的抗体、及用于检测和诊断性鉴别表达SIGLEC-6的B细胞的与SIGLEC-6特异性结合的抗体。这些抗体可以是多克隆或者单克隆抗体及其功能性结合片段。抗体也可以是仅具有重链或者轻链的单结构域抗体。单克隆抗体可以是人源化抗体、人抗体、嵌合抗体、双特异性抗体或者缀合抗体。本发明还包括单链抗体。

抗体缀合物可用于消耗肥大细胞或者诱导肥大细胞细胞凋亡。抗体缀合物也可以用于消耗病原性B细胞或者诱导表达SIGLEC-6的B细胞细胞凋亡。缀合的成分包括毒素、放射性同位素、标记物如光反应性成分、或者细胞凋亡诱导成分如选自Bax-a、Bak、Bcl-X、Bad、Bid、Bik、Erk和Bok的Bcl-2家族的促细胞凋亡成员。

本发明包括用于诊断和/或治疗的这些抗SIGLEC-6抗体的组合物。组合物包括抗体与合适的载体、佐剂、稀释剂、赋形剂和/或添加剂的组合。

本发明另一方面涉及鉴别与SIGLEC-6蛋白结合(例如配体)和/或调节其生物学活性的感兴趣的活性物质的筛选方法。由于SIGLEC-6蛋白在肥大细胞中表达，因此这些活性物质可参与调节肥大细胞或其它免疫细胞成熟、迁移、激活或者与其它细胞的通讯。另外，SIGLEC-6在某些B细胞表面上表达，因此这些活性物质可用于消耗或杀死这群B细胞。因此，与SIGLEC-6蛋白结合并调节其生物学活性的活性物质可以有效降低哮喘及其它变应性疾病、白血病的一些症状或者减轻炎症。

本发明还包括使用抗SIGLEC-6抗体诊断肥大细胞介导的疾病和失调的方法。SIGLEC-6对于肥大细胞是高度特异性的，因此可以用针对SIGLEC-6的抗体检测在给定样品如活检组织中的肥大细胞的存在与频率。样品中SIGLEC-6的相对增加可在具有肺平滑肌组织中肥大细胞水平增加的患者中提示例如哮喘。抗SIGLEC-6抗体也可用于检测表达SIGLEC-6的细胞的存在或者增加/降低。

本发明还包括使用抗SIGLEC-6抗体诊断B细胞相关疾病和失调的方法，其中B细胞表达SIGLEC-6。SIGLEC-6可用于检测在给定样品如受影响的患者血样中表达SIGLEC-6的B细胞的存在和频率，使用针对SIGLEC-6的抗体进行。样品中表达SIGLEC-6的B细胞的存在可提示B细胞相关疾病如B细胞淋巴瘤的存在。抗SIGLEC-6抗体也可用于检测表达SIGLEC-6的细胞的存在或者增加/降低。

本发明的抗体可用于检测组织或者体液中表达SIGLEC-6的B细胞的诊断方法中。该方法包括将患者样品暴露于本发明的抗体，以及确定所述抗体是否结合样品中的细胞。可以使用本领域已知的各种诊断方法，例如竞争性结合分析、直接或者间接夹心分析、及在非均匀或者均匀状态进行的免疫沉淀分析。

SIGLEC-6蛋白在体液或组织中的表达可以通过使用抗SIGLEC-6mAb的免疫荧光、FACS染色或者免疫组织化学方法检测。

附图简述

图1示出Siglec-6的核酸序列(SEQ ID NO：1)。

图2示出SIGLEC-6蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，包括信号序列(下划线)及推定的3’区域的ITIM和SLAM区。

图3示出各种组织和细胞系中Siglec-6mRNA的相对表达水平。

图4示出CBMC、LAD2和HMC-1的FACS染色，表明这些细胞表面上的SIGLEC-6表达。

图5示出抗SIGLEC-6通过FcγRI对于CBMC激活的作用。

图6A和6B示出Mab 239-90的轻链和重链可变区的核酸(SEQ IDNO：7和9)和氨基酸序列(SEQ ID NO：8和10)，互补决定区(CDR)用下划线表示。

发明详述

定义

本申请中使用的术语具有本领域技术人员已知的普通和典型含义。然而，申请人希望如下术语具有下文解释的特殊含义。

本文所用术语“活性物质(agent)”是指化学化合物、化学化合物的混合物、生物大分子(如核酸、抗体、蛋白质或其一部分，例如肽)，或者从生物材料如细菌、植物、真菌或者动物(特别是哺乳动物)细胞或组织中获得的提取物。这些活性物质的活性可以使其适于作为“治疗剂”，即在对象局部或者全身发挥作用的生物学、生理学或者药学活性物质。

术语“序列相同性”或者“序列同源性”是指在对序列进行排列及如果需要则导入缺口以达到全部序列最大百分比相同性之后，候选序列中与进行对比的相应序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，任何保守取代均不被认为是序列相同性的一部分。N或C末端延伸或者插入均不应解释为降低相同性或者同源性。进行序列对比的方法和计算机程序为本领域所熟知。序列相同性可以使用序列分析软件测定。

关于抗体链多肽序列使用的短语“基本相同”是指抗体链呈现与参考多肽序列至少70％或者80％或者90％或者95％的序列相同性。

术语“变体”当用于描述多肽序列如抗体序列时，是指与其天然对应物有一或多个氨基酸不同的氨基酸序列，包括修饰、取代、插入和缺失，但是所述氨基酸序列保留与其天然对应物相同或相似的生物学功能。变体包括与其天然对应物具有至少70％、至少85％或者至少95％序列相同性的多肽。变体包括例如具有保守氨基酸取代的多肽。

术语“保守氨基酸取代”是指多肽中的氨基酸由具有相似侧链的氨基酸取代。例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸具有脂肪族侧链；丝氨酸和苏氨酸具有脂肪族-羟基侧链；天冬酰胺和谷氨酰胺具有含有酰胺的侧链；苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸具有芳香族侧链；赖氨酸、精氨酸和组氨酸具有碱性侧链；半胱氨酸和甲硫氨酸具有含硫侧链。优选的保守氨基酸取代是缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸，天冬酰胺-谷氨酰胺。

术语“片段”当用于描述多肽时是指保留其天然对应物的任何生物学活性的其天然对应物的一部分氨基酸序列。片段包括天然序列的至少10-20个连续氨基酸或者至少20-30个连续氨基酸。

术语“激动剂”是指直接或者间接促进、增强或者刺激SIGLEC-6正常功能的任何分子。一种类型的激动剂是以模拟其配体的方式与SIGLEC-6相互作用的分子，包括但非限于抗体或抗体片段。

术语“拮抗剂”是指阻断、阻止、抑制或者中和SIGLEC-6的正常功能的任何分子。一种类型的拮抗剂是干扰SIGLEC-6与其配体之间相互作用的分子，包括但非限于抗体或抗体片段。另一类型的拮抗剂是抑制天然SIGLEC-6正确转录的反义核苷酸或者与其天然转录物结合的siRNA。

如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有与抗原免疫特异性结合的抗原结合位点的分子。本发明的免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或者亚类的免疫球蛋白分子。另外，术语“抗体(Ab)”或者“单克隆抗体(Mab)”包括完整的分子，以及能与蛋白质特异性结合的抗体片段(例如Fab和F(ab′)2片段)。Fab和F(ab′)2片段缺乏完整抗体的Fc片段，更迅速地从动物或者植物的循环中清除，并且与完整抗体相比具有较低的非特异性组织结合(Wahl et al.，J.Nucl.Med.24：316-325(1983))。因此，优选这些片段以及FAB或其它免疫球蛋白表达文库的产物。另外，本发明的抗体包括嵌合抗体、单链抗体和人源化抗体。天然抗体和免疫球蛋白通常是大约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条重链在一个末端均具有一个可变区(V_H)，随后是一些恒定区。每条轻链在一个末端均具有一个可变区(V_L)，在另一末端具有一个恒定区。抗体与SIGLEC-6蛋白的结合亲和性(Kd)可以是至少大约10^-8、10^-9、10^-10、10^-11、10^-12M。本发明的抗体还包括单结构域抗体，其中功能性抗体仅包含一条重链或轻链，如WO04081026和WO04041865所述

描述抗体的可变区中使用的术语“可变”是指不同抗体中可变区的某些部分的序列非常不同，并且用于描述每个特定抗体与其特定靶的结合及特异性。然而，所述可变性在抗体的可变区中不是均匀分布的。其集中在三个节段，即互补决定区(CDR)，在轻链和重链可变区中也称作超变区。可变区的更高度保守的部分称作构架(FR)。天然重链和轻链的每一个可变区均包含四个FR区域，主要是由形成环形连接的三个CDR连接的β折叠构型，在一些情况中形成部分β折叠结构。每条链中的CDR均是通过FR区域与其它链的CDR紧密保持在一起，形成抗体的靶结合位点(见Kabat等所述)。如本文所用，除非特别指出，免疫球蛋白氨基酸残基的编号根据Kabat等(Sequences of Proteins of Immunological Interest，National Institute of Health，Bethesda，Md.1987)的免疫球蛋白氨基酸残基编号系统进行。

术语“抗体片段”是指全长抗体的一部分，通常是靶结合区或者可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)₂和Fv片段。短语抗体的“功能片段”是具有全长抗体的定性的生物学活性的化合物。例如，抗SIGLEC-6抗体的功能片段或类似物是可以以如同天然配体并激活ITIM的方式结合SIGLEC-6并从而抑制肥大细胞功能的抗体。如本文所用，抗体的“功能片段”包括Fv、F(ab)、F(ab′)₂片段。“Fv”片段是含有完整靶识别和结合位点的最小抗体片段。这个区域由一个重链可变区和一个轻链可变区以紧密的非共价方式结合的二聚体(V_H-V_L二聚体)组成。在这种构型中，每个可变区的三个CDR相互作用以限定V_H-V_L二聚体表面上的靶结合位点。总之，六个CDR赋予抗体的靶结合特异性。然而，甚至一个单一的可变区(或者仅包含特异于靶的三个CDR的Fv的一半)即具有识别并结合靶的能力，尽管其结合亲和性较完整的结合位点要低。“单链Fv”或者“sFv”抗体片段包含抗体的V_H和V_L结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链中。通常地，Fv多肽进一步包含在V_H和V_L结构域之间的一个多肽接头，其使得sFv形成对于靶结合所希望的结构。

Fab片段含有轻链的恒定区及重链的第一个恒定区(CH1)。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端添加几个残基，包括来自抗体铰链区的一或多个半胱氨酸。F(ab′)通过裂解在F(ab′)₂消化产物的铰链半胱氨酸之间的二硫键而产生。抗体片段的其它化学连接为本领域技术人员所已知。

如本文所用，术语“单克隆抗体”是指得自一群基本均一的抗体的抗体，即该群体包含的各个抗体除了微量可能天然发生的突变之外是相同的。单克隆抗体对于单一靶位点是高度特异性的，并且针对该位点。另外，与典型的包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物相反，每个单克隆抗体均针对靶上的一个单一决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体的优势是可以通过杂交瘤培养而合成，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示抗体得自基本均一的抗体群的特性，而不应理解为该抗体需要通过任何特殊方法产生。例如，本发明使用的单克隆抗体可以使用熟知技术分离自噬菌体抗体文库。本发明使用的亲代单克隆抗体可以通过首先由Kohler and Milstein，Nature 256，495(1975)描述的杂交瘤方法产生，或者可以通过重组方法产生。

如本文所用，术语“SIGLEC-6-介导的疾病”是指特征在于丧失SIGLEC-6抑制作用和肥大细胞激活、增殖或者组胺释放的病变或疾病。特别包括与过敏性超敏性及特异反应性过敏相关的病变，包括例如哮喘、变应性鼻炎&结膜炎(花粉热)、湿疹、风疹、遗传过敏性皮炎、和食物过敏。由例如蜂蜇伤、蛇咬伤、食物或者药物引起的过敏性休克这样的严重生理学状况也包含在该术语的范围内。

如本文所用，术语“B细胞相关疾病”是指特征在于表达SIGLEC-6及具有异常表达、激活或者细胞因子释放的B细胞的病变或疾病。特别地，该术语包括与病理性B细胞特性相关的病变，如B细胞淋巴瘤。

“SIGLEC-6的生物学活性片段”是指足以介导其至少一种生物学活性如脱粒的SIGLEC-6片段。生物学活性片段优选包含ITIM结构域、任选包含SLAM结构域、包含这两种保守结构域如胞内结构域的部分。SIGLEC-6的生物学活性片段也可包含全部胞外结构域或其片段，也可以包含跨膜结构域。

本发明非限于本文描述的特定方法学、方案、细胞系、载体和试剂，因为这些方面可以变化。另外，本文使用的术语只是为了描述特定的实施方案，并非限制本发明的范围。如本文及所附权利要求书中所用，单数形式的“一个”除非特别指出否则包括复数形式，例如“一个宿主细胞”包括多个这样的宿主细胞。

除非特别指出，则本文所用所有技术和科学术语及任何缩写均具有本领域技术人员通常已知的相同含义。尽管可以使用与本发明所述的那些相似或相等的任何方法、设备和材料实施本发明，但优选本文所述的方法、设备和材料。

本文提及的所有专利和出版物在法律允许下均通过参考并入本文，用以描述和揭示本发明也许应用的蛋白质、酶、载体、宿主细胞和方法学。然而，本文任何内容均不应理解为承认本发明在在先发明意义上不先于这些公开内容。

本发明通过如下详细描述和实施例而更容易理解。发现SIGLEC-6在人初级肥大细胞中的表达与在其它类型细胞中的表达不同，SIGLEC-6也在循环血液单核细胞(CBMC)中表达。因此，SIGLEC-6在刺激呼吸道和/或周围或结缔组织中的引起炎症及变应性应答的肥大细胞活性中可能起重要作用。

因此，SIGLEC-6可用作治疗肥大细胞介导的疾病如变应性和非变应性哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、变应性鼻炎、过敏反应、变应性胃肠道疾病、遗传过敏性皮炎、类风湿性关节炎、系统硬化、及其它变应性、自身免疫性和炎性疾病的治疗靶。对于这种治疗的SIGLEC-6的激活物/抑制物可以是抗体、配体的肽模拟物、小分子、反义或者RNAi。

SIGLEC-6的鉴别

在人肥大细胞中差异表达的基因最初通过使用基因微阵列技术对比肥大细胞(从脐带血CD34+细胞中培养)、PBMC(周围血单核细胞)和THP-1(急性单核细胞白血病；淋巴细胞)中mRNA表达水平而鉴别(见下文实施例所述)。SIGLEC-6在肥大细胞中的差异表达通过使用多种不同类型的细胞和人组织进行定量RT-PCR而进一步证实。

激动剂和拮抗剂

本发明提供了直接或者间接激活或抑制SIGLEC-6的表达或作用，或与之结合以进行检测的激动剂和拮抗剂。激动剂和拮抗剂的类型包括但非限于多肽、蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核苷酸、有机分子、生物有机分子、肽模拟物、药学活性物质及其代谢物，及转录和翻译控制序列。

在一个实施方案中，所述激动剂可以是与SEQ ID NO：2的胞外结构域有效结合的抗体。这些抗体结合SIGLEC-6，激活ITIM，并因此抑制肥大细胞的激活和/或抑制B细胞，减轻B细胞相关的疾病。

所述激动剂也可包括特异性结合SIGLEC-6并影响其生物学作用和功能的抗体，所述功能例如激活或者抑制细胞因子的产生。激动剂抗体可以是多克隆或者单克隆抗体，可以是嵌合抗体、人抗体、人源化抗体或者去免疫(deimmunized)抗体。

激动剂抗体可用于阻止或者治疗特征在于肥大细胞增殖和/或脱粒的疾病。激动剂可用于治疗各种免疫疾病，包括但非限于变应性疾病如哮喘、变应性鼻炎、遗传过敏性皮炎、食物超敏性和风疹；移植相关疾病包括移植排斥和移植物抗宿主疾病；自身免疫或者免疫介导的皮肤病，包括大疱性皮肤病、多形性红斑和接触性皮炎、银屑病；类风湿性关节炎，幼年慢性关节炎；炎性肠病(即溃疡性结肠炎，Crohn′s病)；系统性红斑狼疮；椎关节病(spondyloarthropathies)；系统性硬化(硬皮病)；先天性炎性肌病(皮肌炎，多肌炎)；Sjogren′s综合征；系统性血管炎；结节病；自身免疫性溶血性贫血(免疫性各类血细胞减少症，阵发性夜间血红蛋白尿)，自身免疫性血小板减少(先天性血小板减少性紫癜，免疫介导的血小板减少)；甲状腺炎(Grave′s病，Hashimoto′s甲状腺炎，幼年淋巴细胞性甲状腺炎，萎缩性甲状腺炎)；糖尿病；免疫介导的肾病(肾小球肾炎，肾小管间质肾炎)；中枢和周围神经系统脱髓鞘病如多发性硬化，先天性脱髓鞘多神经病或者Guillain-Barre综合征，及慢性炎性脱髓鞘多神经病；肝胆疾病如传染性肝炎(甲型、乙型、丙型、丁型、戊型肝炎及其它非嗜肝性病毒)，自身免疫性慢性活动性肝炎，原发性胆汁性肝硬化，肉芽肿性肝炎，及硬化性胆管炎；炎性和纤维性肺病如囊性纤维化，麦麸敏感性肠病和Whipple′s病；肺免疫疾病如嗜酸性粒细胞性肺炎，先天性肺纤维化及超敏性肺炎。

本发明的抗体也可用于诊断目的，通过测定患者样品如活检组织或痰液样品中SIGLEC-6的结合而检测肥大细胞的存在和/或水平。

多肽

另一方面，本发明提供了一种应用分离的SIGLEC-6多肽的治疗方法，所述多肽具有SEQ ID NO：2氨基酸序列、SEQ ID NO：2的变体或者SEQ ID NO：2的胞外结构域片段。在一个实施方案中，所述分离的多肽可用于阻断肥大细胞表面上天然配体与SIGLEC-6的结合。为了破坏耐受性，所述肽可以与任何T细胞表位缀合，例如破伤风毒素、白喉毒素或者百日咳毒素。

编码抗体的多核苷酸

本发明进一步提供了包含编码本发明的抗体的核苷酸序列的多核苷酸及其片段。本发明还包含在严格或者较低严格杂交条件下(例如上文所描述的)与编码特异性结合SIGLEC-6的抗体的多核苷酸杂交的多核苷酸，优选地，所述抗体结合具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽、特别是SEQ ID NO：2的胞外结构域。

可以通过本领域已知的常用的核酸测序方法获得所述多核苷酸及确定该多核苷酸的核苷酸序列。如果已知抗体的核苷酸序列，则编码该抗体的多核苷酸可以通过化学合成的寡核苷酸获得(例如Kutmeier et al.，BioTechniques 17：242(1994)所述)，简而言之，包括合成含有编码该抗体的部分序列的重叠寡核苷酸，退火并连接这些寡核苷酸，然后通过PCR扩增连接的寡核苷酸。

或者，编码抗体的多核苷酸可以从合适来源的核酸中产生。如果不可获得含有编码特定抗体的核酸的克隆，但是已知该抗体分子的序列，则编码该免疫球蛋白的核酸可以化学合成，或者通过使用可与所述序列的3’和5’末端杂交的合成引物进行PCR扩增，或者使用特异于所述特定基因序列的寡核苷酸探针进行克隆，而得自合适的来源(例如抗体cDNA文库，或者从表达该抗体的任何组织或者细胞如选择的表达本发明的抗体的杂交瘤细胞中产生的cDNA文库或者分离自其中的核酸、优选聚A+RNA)，以从编码该抗体的cDNA文库中鉴别例如cDNA克隆。然后使用本领域熟知的任何方法将通过PCR产生的扩增的核酸克隆进可复制的克隆载体中。

一旦确定抗体的核苷酸序列及相应的氨基酸序列，则可以使用本领域熟知的操纵核苷酸序列的方法对抗体的核苷酸序列进行处理，例如使用重组DNA技术、定向诱变技术、PCR等等(见例如Sambrook et al.，1990，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2d Ed.，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.和Ausubel et al.，eds.，1998，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY所描述的技术，这两个文献均以其全文并入作参考)，以产生具有不同氨基酸序列的抗体，例如产生氨基酸取代、缺失和/或插入。

在一个特定的实施方案中，可以通过本领域熟知的方法检验重链和/或轻链可变区的氨基酸序列，以鉴别互补决定区(CDR)的序列，所述方法例如与其它已知的重链和轻链可变区的氨基酸序列进行对比以确定序列超可变性的区域。使用常规的重组DNA技术，可以将一或多个CDR插入构架区中，例如插入人构架区中以使得非人抗体人源化，如前所述。所述构架区可以是天然发生的或者是共有的构架区，优选是人构架区(见例如Chothia et al.，J.Mol.Biol.278：457-479(1998)描述的人构架区列表)。优选地，通过将所述构架区与CDR组合产生的多核苷酸编码特异性结合本发明的多肽的抗体。优选地，如前所述，可以在构架区内产生一或多个氨基酸取代，优选所述氨基酸取代改良抗体与其抗原的结合。再者，这些方法可用于使得参与链内二硫键的一或多个可变区半胱氨酸残基产生氨基酸取代或缺失，由此产生缺乏一或多个链内二硫键的抗体分子。本发明也包含多核苷酸的其它改变，这些改变包含在本领域内。

另外，可以使用产生“嵌合抗体”的技术(Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.81：851-855(1984)；Neuberger et al.，Nature 312：604-608(1984)；Takeda et al.，Nature314：452-454(1985))，其通过将具有合适抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与具有合适生物学活性的人抗体分子基因剪接而产生嵌合抗体。如前所述，嵌合抗体是其中不同部分衍生自不同动物物种的分子，如具有衍生自鼠mAb的可变区和人免疫球蛋白恒定区的那些抗体分子，例如人源化抗体。

或者，可以采用产生单链抗体的技术(美国专利No.4,946,778；Bird，Science 242：423-42(1988)；Huston et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879-5883(1988)；及Ward et al.，Nature334：544-54(1989))以产生单链抗体。单链抗体是通过将Fv区域的重链和轻链片段经由氨基酸桥连接而产生一条单链多肽而形成的。也可以使用在大肠杆菌中装配功能性Fv片段的技术(Skerra et al.，Science242：1038-1041(1988))。

载体

另一方面，本发明提供了包含编码本发明的抗SIGLEC-6抗体的核苷酸序列的载体及包含这种载体的宿主细胞。在细菌系统中，根据表达的抗体分子的用途，可以有利地选择多种表达载体。例如，当需要产生大量的这种蛋白质以产生抗体分子的药物组合物时，需要指导高水平表达易于纯化的融合蛋白质产物的载体。这些载体包括但非限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther etal.，EMBO J.2：1791(1983))，其中抗体编码序列可以单独地与lac Z编码区符合读框地连接进载体中，由此产生融合蛋白；pIN载体(Inouye & Inouye，Nucleic Acids Res.13：3101-3109(1985)；Van Heeke & Schuster，J.Biol.Chem.24：5503-5509(1989))等等。同样，也可以使用pGEX载体将外源多肽表达作为谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。通常地，这些融合蛋白是可溶的并且通过吸附及与基质谷胱甘肽-琼脂糖珠结合及随后在存在游离谷胱甘肽的条件下洗脱而可易于从裂解的细胞中纯化。设计pGEX载体以包括凝血酶或者因子Xa蛋白酶裂解位点，由此克隆的靶基因产物可以从GST成分中释放。

在昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californicanuclear polyhedrosis virus，AcNPV)用作载体以表达外源基因。该病毒在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。抗体编码序列可以单独克隆进病毒的非必需区域(例如多角体蛋白基因)中，并且置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制下。

在哺乳动物宿主细胞中，可以利用多种基于病毒的表达系统。在腺病毒用作表达载体的情况中，可以将感兴趣的抗体编码序列与腺病毒转录/翻译控制复合体连接，例如与晚期启动子和三联先导序列(tripartiteleader sequence)连接。然后这种嵌合基因可以通过体外或者体内重组方法插入腺病毒基因组中。插入病毒基因组的非必需区域(例如E1或者E3区)中将产生在感染的宿主中存活并且能表达抗体分子的重组病毒(例如见Logan & Shenk，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：355-359(1984)所述)。可能也需要特异性起始信号以有效翻译插入的抗体编码序列。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。另外，所述起始密码子必须与希望的编码序列的读框同相(in phrase)，以保证全部插入体的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以是各种天然和合成来源的。表达效率可以通过包含适当的转录增强子元件、转录终止子等增强(见Bittner et al.，Methodsin Enzymol.153：51-544(1987)所述)。

为了长期高产量产生重组蛋白质，优选稳定的表达。例如，可以将稳定表达抗体分子的细胞系工程化。除了使用含有病毒复制起点的表达载体之外，可以用合适的表达控制元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)控制的DNA及一种可选择的标记转化宿主细胞。在导入外源DNA之后，可使工程化的细胞在滋养培养基中生长1-2天，然后转入选择培养基。重组质粒中的可选择标记赋予选择抗性并使得细胞将所述质粒稳定整合进其染色体中，并生长形成灶(foci)，然后可以将其克隆并在细胞系中扩增。这种方法可有利地用于使表达抗体分子的细胞系工程化。

可以使用多种选择系统，包括但非限于可分别在tk-、hgprt-或者aprt-细胞中应用的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler et al.，Cell 11：223(1977))、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska & Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48：202(1992))、及腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy et al.，Cell22：817(1980))基因。抗代谢物抗性也可以用作如下基因的选择基础：dhfr，其赋予氨甲喋呤抗性(Wigler etal.，Natl.Acad.Sci.USA 77：357(1980)；O′Hare et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1527(1981))；gpt，其赋予霉酚酸抗性(Mulligan & Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072(1981))；neo，其赋予氨基糖苷G-418抗性(Clinical Pharmacy 12：488-505；Wu and Wu，Biotherapy 3：87-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596(1993)；Mulligan，Science 260：926-932(1993)；及Morgan andAnderson，Ann.Rev.Biochem.62：191-217(1993)；May，1993，TIB TECH11(5)：155-215)；及hygro，其赋予潮霉素抗性(Santerre et al.，Gene 30：147(1984))。通常可应用重组DNA技术领域已知的方法选择希望的重组克隆，这些方法例如Ausubel et al.(eds.)，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，NY(1993)；Kriegler，Gene Transfer andExpression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY(1990)；and inChapters 12 and 13，Dracopoli et al.(eds)，Current Protocols in HumanGenetics，John Wiley & Sons，NY(1994)；Colberre-Garapin et al.，J.Mol.Biol.150：1(1981)所描述，所述文献以其全文并入作参考。

抗体分子的表达水平可以通过载体扩增方法增加(参见Bebbingtonand Hentschel，The use of vectors based on gene amplification for theexpression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning，Vol.3.(Academic Press，New York，1987))。当表达抗体的载体系统中的标记可扩增时，提高宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平将增加标记基因的拷贝数。由于扩增的区域与抗体基因相关，因此抗体的产生也增加(Crouse etal.，Mol.Cell.Biol.3：257(1983))。

宿主细胞可以用本发明的两种表达载体共转染，第一种载体编码重链衍生的多肽，第二种载体编码轻链衍生的多肽。这两种载体可含有相同的选择标记，其使得可以均等表达重链和轻链多肽。或者，可以使用单一载体，其编码并且能表达重链和轻链多肽。在这种情况中，轻链应该置于重链之前以避免过量的有毒游离重链(Proudfoot，Nature 322：52(1986)；Kohler，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：2197(1980))。重链和轻链的编码序列可包含cDNA或者基因组DNA。

另外，编码合适的与SIGLEC-6非天然相关的信号肽的的序列可以掺入表达载体中。例如，信号肽(分泌性前导序列)的核苷酸序列可以符合读框地与多肽序列融合，由此抗-SIGLEC-6抗体最初被翻译为包含所述信号肽的融合蛋白。在指定的宿主细胞中起作用的信号肽增强合适多肽的胞外分泌。所述信号肽在从细胞中分泌时可从所述多肽中切除。

宿主细胞

表达SIGLEC-6和抗-SIGLEC-6多肽的合适宿主细胞包括原核生物、酵母及其它真核细胞。本发明中用作宿主细胞的原核生物包括革兰氏阴性或者革兰氏阳性生物体，如大肠杆菌或芽孢杆菌。在原核宿主细胞中，多肽可包括N末端甲硫氨酸残基以促进重组多肽在所述原核宿主细胞中的表达。N末端Met可以从表达的重组SIGLEC-6受体多肽中切除。通常用于重组原核宿主细胞表达载体的启动子序列包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统。

在本发明中用作宿主细胞的酵母包括酿酒酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、放线菌(K.Actinomycetes)和克鲁维酵母属(Kluyveromyces)的酵母。酵母载体通常含有2μ酵母质粒的复制序列起点、自主复制序列(ARS)、启动子区域、聚腺苷酸化序列、转录终止序列、及可选择的标记基因。酵母载体的合适启动子序列包括但非限于金属硫蛋白启动子、3-磷酸甘油酸激酶启动子(Hitzeman et al.，J.Biol.Chem.255：2073，(1980))或者其它糖酵解酶启动子。本领域熟知其它合适的酵母启动子和载体及酵母转化方案。

本领域熟知的哺乳动物或者昆虫宿主细胞培养系统也可以用于表达重组SIGLEC-6，例如可以使用在昆虫细胞中产生异源蛋白质的杆状病毒(Baculovirus)系统(Luckow and Summers，Bio/Technology 6：47(1988))，或者用于哺乳动物表达的NS0或者中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。用于哺乳动物宿主细胞表达载体的转录和翻译控制序列可以从病毒基因组中切离。常用的启动子序列和增强子序列衍生自多瘤病毒、腺病毒2、猿猴病毒40(SV40)及人巨细胞病毒。

另外，可以选择以希望的特异方式调节插入序列的表达或者修饰和加工基因产物的宿主细胞株。蛋白质产物的这些修饰(例如糖基化)和加工(例如切割)对于蛋白质的功能可能很重要。不同的宿主细胞对于蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰具有特征性和特异性机制。可以选择合适的细胞系或宿主系统以保证表达的外源蛋白质的正确修饰和加工。为此，可以使用具有用于原始转录物正确加工、基因产物糖基化和磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞。这些哺乳动物宿主细胞包括但非限于CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、WI38，特别是乳腺癌细胞系，例如BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D，及正常的乳腺细胞系，例如CRL7030和Hs578Bst。

抗体

本发明提供了结合SIGLEC-6的抗体及产生这种抗体的方法，所述抗体包括发挥天然SIGLEC-6激动剂、拮抗剂或者表面结合剂功能的抗体。本发明的抗体包括但非限于多克隆抗体、单克隆抗体、单价抗体、双特异性抗体、异源缀合抗体、多重特异性抗体、人抗体、人源化抗体或者嵌合抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab′)片段、通过Fab表达文库产生的片段、抗-独特型(抗-Id)抗体(包括例如本发明的抗体的抗-Id抗体)，及任何上述抗体的表位结合片段。

在一个实施方案中，所述方法包括利用已知的产生抗体的方案，使用分离的携带表位的SIGLEC-6多肽或其抗原性片段作为免疫原以产生结合SIGLEC-6的抗体。本领域熟知的方法包括但非限于体内免疫、体外免疫、噬菌体展示方法。见例如Sutcliffe et al.，如前；Wilson et al.，如前，及Bittle et al.，J.Gen.Virol.，66：2347-2354(1985)所述。另外，可以使用SIGLEC-6多肽产生免疫特异性结合SEQ ID NO：2多肽、多肽片段或者其变体和/或表位的抗体，通过分析特异抗体-抗原结合领域熟知的免疫分析确定。

抗体也可以通过淘选结合SIGLEC-6的人scFv文库而选择(Griffithset.al.，EMBO J.12：725-734(1993))。特定克隆的特异性和活性可以使用已知分析方法确定(Griffiths et.al.；Clarkson et.al.，Nature，352：642-648(1991))。在第一个淘选步骤之后，获得含有在噬菌体上展示的具有改良的SIGLEC-6结合性的多个不同单链抗体的噬菌体文库。随后的淘选步骤提供了另外的具有较高结合亲和性的文库。单价展示可以使用噬菌粒和辅助噬菌体完成。合适的噬菌体包括M13、fl和fd丝状噬菌体。也已知与病毒包被蛋白一起展示的融合蛋白并可用于本发明中。

为了筛选结合感兴趣的抗原上特定表位的抗体(例如阻断本发明任何抗体与SIGLEC-6结合的那些抗体)，可以进行常规的交叉阻断分析，如Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，EdHarlow and David Lane(1988)所述。或者可以进行表位作图，例如Champeet al.，J.Biol.Chem.270：1388-1394(1995)所述，以确定所述抗体是否与感兴趣的表位结合。

所述抗体可以是本发明的人抗原结合抗体片段，包括但非限于Fab、Fab′和F(ab′)2、Fd、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连的Fv(sdFv)及包含VL或VH结构域的片段。抗原结合抗体片段，包括单链抗体，可仅包含可变区或者包含与下述全部或者部分组合的可变区：铰链区、CH1、CH2和CH3结构域。本发明还包括包含可变区与铰链区、CH1、CH2和CH3结构域的任何组合的抗原结合片段。

本发明的抗体可以来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。优选地，所述抗体是人、鼠(例如小鼠和大鼠)、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或者鸡抗体。如本文所用，“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，及包括分离自人免疫球蛋白文库或者分离自用一或多个人免疫球蛋白转基因的且不表达内源免疫球蛋白的动物的抗体，如上所述及例如Kucherlapati等的美国专利No.5,939,598所述。

本发明的抗体可以是单特异性、双特异性、三重特异性或者更多重特异性的抗体。多重特异性抗体可以特异于本发明的多肽的不同表位，或者可以特异于本发明的多肽以及一个异源表位，如异源多肽或者固体支持物。见例如PCT出版物WO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO92/05793；Tutt，et al.，J.Immunol.147：60-69(1991)；美国专利Nos.4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,819；Kostelny et al.，J.hnmunol.148：1547-1553(1992)所述。

本发明的抗体可以使用其识别或者特异性结合的本发明的多肽的表位或者一部分而描述或者说明。所述表位或者多肽部分可以通过例如N末端和C末端位置或者通过连续氨基酸残基的大小而说明。

本发明的抗体也可以使用其交叉反应性而描述或说明。本发明包括不结合本发明的多肽的任何其它类似物、直向同源物或同系物的抗体。本发明也包括结合与本发明的多肽具有至少95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％和至少50％相同性(如使用本领域已知及本发明所述的方法计算)的多肽的抗体。

本发明也包括不结合与本发明的多肽具有低于95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％和低于50％相同性(如使用本领域已知及本发明所述的方法计算)的多肽的抗体。在一个特定的实施方案中，上述交叉反应性是针对任何单一特异性抗原性或者免疫原性多肽，或者2、3、4、5或更多本发明揭示的特异性抗原性和/或免疫原性多肽的组合而言的。本发明进一步包括结合由在严格杂交条件(如本文所述)下与本发明的多核苷酸杂交的多核苷酸编码的多肽的抗体。本发明的抗体也可根据其与本发明的多肽的结合亲和性而描述或者说明。优选的结合亲和性为解离常数或Kd在10^-2M至10^-15M范围。

本发明的抗体可以作为SIGLEC-6的激动剂、拮抗剂或者特异性结合剂。例如，本发明包括部分或完全破坏SIGLEC与其配体之间受体/配体相互作用的抗体。受体激活(即信号传导)可以通过本文所述或者本领域已知的技术确定。例如，受体激活可以通过免疫沉淀及随后的Western印迹分析(如前述)来检测受体或其底物的磷酸化(例如酪氨酸或者丝氨酸/苏氨酸)而确定。本发明另外包括激活受体的抗体。这些抗体可作为受体激动剂，即加强或者激活配体介导的受体激活的全部或者部分生物学活性。所述抗体可以描述为包含特异性生物学活性的生物学活性的激动剂、拮抗剂或者反向激动剂。上述抗体激动剂可以使用本领域已知方法产生。见例如PCT出版物WO 96/40281；美国专利No.5,811,097；Deng et al.，Blood 92(6)：1981-1988；Chen et al.，Cancer Res.58(16)：3668-3678(1998)；Harrop et al.，J.Immunol.161(4)：1786-1794(1998)；Zhu et al.，Cancer Res.58(15)：3209-3214 Yoon etal.，J.hnmunol.160(7)：3170-3179(1998)；Prat et al.，J.Cell.Sci.11(Pt2)：237-247(1998)；Pitard et al.，J.hnmunol.Methods 205(2)：177-190(1997)；Liautard et al.，Cytokine 9(4)：233-241 Carlson et al.，J.Biol.Chem.272(17)：11295-11301(1997)；Taryman etal.，Neuron 14(4)：755-762(1995)；Muller et al.，Structure 6(9)：1153-1167(1998)；Bartunek et al，Cytokine 8(1)：14-20(1996)所述，所述文献均以其全文并入作参考)。

如下文更详细的论述，本发明的抗体可以单独使用或者与其它化合物或组合物组合使用。所述抗体可以进一步在N或C末端与异源多肽重组融合，或者与多肽或者其它组合物化学缀合(包括共价和非共价缀合)。例如，本发明的抗体可以与在诊断或者检测分析中用作标记的分子及效应分子如异源多肽、药物、放射性核苷酸或者毒素重组融合或者缀合。见例如PCT出版物WO 92/08495；WO 91/14438；WO 89/12624；美国专利No.5,314,995和EP 396,387所述。

本发明的抗体包括修饰的衍生物，所述修饰例如将任何类型的分子共价附着于抗体，这样的共价附着不阻止所述抗体产生抗独特型应答。例如但非限于所述抗体衍生物包括已经被修饰的抗体，所述修饰例如糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护-阻断基团衍生化、蛋白酶解、与细胞配体或者其它蛋白质如白蛋白连接等。可以通过已知技术进行各种化学修饰，所述技术包括但非限于：特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等等。再者，所述衍生物可含有一或多个非传统氨基酸。

产生SIGLEC-6抗体的方法

本发明的抗体可以通过任何已知方法产生。典型地，SIGLEC-6多肽片段或者蛋白质可以给予各种宿主动物，包括但非限于兔、小鼠、大鼠等，以诱导产生含有特异于SIGLEC-6的多克隆抗体的血清。给予SIGLEC-6多肽可以通过注射一或多次免疫剂以及一种佐剂(如果需要)进行。各种佐剂可依赖于宿主种类而用于增加免疫学应答，所述佐剂包括但非限于：弗氏佐剂(完全和不完全佐剂)、矿物质凝胶如氢氧化铝，表面活性物质如溶血卵磷脂、复合多元醇、聚阴离子、肽、油乳状液、匙孔血蓝蛋白、二硝基酚、及可能有用的人佐剂如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。这些佐剂也为本领域所熟知。对于本发明，除了本文所述的与异源多肽及其它形式多肽的融合体之外，“免疫剂(immunizing agent)”是指本发明的多肽，包括其片段、变体和/或衍生物。

典型地，所述免疫剂和/或佐剂通过多次皮下或者腹膜内注射注入哺乳动物中，尽管其也可以肌内给予和/或IV给予。所述免疫剂可包括SIGLEC-6多肽或其融合蛋白或其变体。根据多肽的性质(即疏水性百分比、亲水性百分比、稳定性、净电荷、等电点等)，可将其用于将免疫剂与已知在被免疫的哺乳动物中是免疫原性的蛋白质缀合。这种缀合包括通过将活性化学功能基团衍生至本发明的多肽和免疫原性蛋白质，由此形成共价键而化学缀合，或者通过基于融合蛋白的方法学或者本领域已知的其它方法进行。这些免疫原性蛋白质例如包括但非限于匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、和大豆胰蛋白酶抑制剂。各种佐剂可根据宿主种类而用于增加免疫学应答，所述佐剂包括但非限于弗氏佐剂(完全和不完全佐剂)，矿物质凝胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、复合多元醇、聚阴离子、肽、油乳状液、匙孔血蓝蛋白、二硝基酚、及可能有用的人佐剂如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌。可以应用的其它佐剂例如包括MPL-TDM佐剂(单磷酰脂质A-合成的海藻糖双棒杆菌分枝菌酸)。

动物可以使用全细胞免疫。通常地，如果需要源自人的细胞则使用周围血淋巴细胞(PBL)，如果需要非人哺乳动物来源则使用脾细胞或者淋巴结细胞。宿主动物也可以使用含有编码希望的免疫原性蛋白质的cDNA的表达载体免疫。免疫方案可以由本领域技术人员不用进行过分的实验而选择。

本发明的抗体可包含单克隆抗体。单克隆抗体可以使用杂交瘤方法制备，如Kohler and Milstein，Nature，256：495(1975)及美国专利No.4,376,110、Harlow，et al.，Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold springHarbor Laboratory Press，2.sup.nd ed.(1988)、Hammerling，et al.，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas(Elsevier，N.Y.，(1981))所述方法，或者本领域已知的其他方法。可用于产生单克隆抗体的其它方法例如包括但非限于人B细胞杂交瘤技术(Kosbor et al.，1983，ImmunologyToday 4：72；Cole et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：2026-2030)，及EBV-杂交瘤技术(Cole et al.，1985，Monoclonal Antibodies And CancerTherapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。这些抗体可以是任何免疫球蛋白类别，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD及其任何亚类。产生本发明的mAb的杂交瘤可以在体外或者体内培养。在体内产生高效价mAb的方法是优选的生产方法。

在杂交瘤方法中，将小鼠、人源化小鼠、具有人免疫系统的小鼠、仓鼠、或者其它合适的宿主动物典型地用免疫剂免疫，以激发产生或者能够产生特异性结合该免疫剂的淋巴细胞。或者，淋巴细胞可以在体外免疫。

然后使用合适的融合剂如聚乙二醇将淋巴细胞与无限增殖的细胞系融合，形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles andPractice，Academic Press，(1986)，pp.59-103)。无限增殖的细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是源自啮齿动物、牛和人的骨髓瘤细胞。通常应用大鼠或者小鼠骨髓瘤细胞系。杂交瘤细胞可以在合适培养基中培养，所述培养基优选含有一或多种抑制未融合的无限增殖的细胞生长或存活的物质。例如，如果亲代细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或者HPRT)，则杂交瘤的培养基典型包括阻止HGPRT-缺陷的细胞生长的物质——次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)。

优选的无限增殖的细胞系是有效融合的、支持选择的产生抗体的细胞稳定高水平表达抗体、并且对培养基如HAT培养基敏感的那些细胞系。更优选的无限增殖的细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，其可以例如得自SalkInstitute Cell Distribution Center，San Diego，Calif.及American TypeCulture Collection，Manassas，Va。如从本说明书中推断的，人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也产生人单克隆抗体(Kozbor，J.hnmunol.，133：3001(1984)；Brodeur et al.，Monoclonal Antibody Production Techniquesand Applications，Marcel Dekker，Inc.，New York，(1987)pp.51-63)。

然后对培养杂交瘤细胞的培养基分析针对本发明的多肽的单克隆抗体的存在。优选地，所述杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或者通过体外结合分析如放射性免疫分析(RIA)或者酶联免疫吸附测定(ELISA)确定。这些技术为本领域及本领域技术人员所已知。单克隆抗体的结合亲和性可例如通过Munson and Pollart，Anal.Biochem.，107：220(1980)的Scatchard分析而确定。

在鉴别希望的杂交瘤细胞后，可以通过限制稀释程序将该克隆亚克隆并通过标准方法生长(Goding，如前述)。为此合适的培养基包括例如Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium和RPMI-1640。或者，可以将杂交瘤细胞在例如哺乳动物腹水中在体内生长。

由亚克隆分泌的单克隆抗体可以通过常规的免疫球蛋白纯化程序如蛋白A-琼脂糖、羟磷灰石层析、凝胶排阻层析、凝胶电泳、透析或者亲和层析分离自或者纯化自培养基或者腹水。

技术人员明白本领域现有多种产生单克隆抗体的方法，因此本发明非限于仅在杂交瘤中产生。例如，单克隆抗体可以通过重组DNA方法产生，如美国专利No.4,816,567所述。在本文中，术语“单克隆抗体”是指衍生自单一真核、噬菌体或者原核克隆的抗体。编码本发明单克隆抗体的DNA可使用常规程序方便地分离和测序(例如使用能特异性结合编码鼠抗体的重链和轻链，或者人、人源化的或其它来源的这样的链的基因的寡核苷酸探针)。本发明的杂交瘤是这种DNA的优选来源。一旦分离，则将该DNA置于表达载体中，然后转化进宿主细胞中，所述宿主细胞例如不另外产生免疫球蛋白的猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或者骨髓瘤细胞，在此重组宿主细胞中合成单克隆抗体。所述DNA也可以通过例如用人重链和轻链恒定区的编码序列取代同源鼠序列而修饰(美国专利No.4,816,567；Morrison et al，如前述)，或者通过将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列与免疫球蛋白编码序列共价结合而修饰。这种非免疫球蛋白多肽可以取代本发明的抗体的恒定区，或者可以取代本发明的抗体的一个抗原组合位点的可变区，产生嵌合的二价抗体。

抗体可以是单价抗体。制备单价抗体的方法为本领域所熟知。例如一种方法包括重组表达免疫球蛋白轻链和修饰的重链。重链通常在Fc区域的任何位点截短，以阻止重链交联。或者，将相关半胱氨酸残基用另一氨基酸残基取代或者缺失以阻止交联。

体外方法也适于制备单价抗体。因此可以使用本领域已知的常规技术消化抗体，产生其片段、特别是Fab片段。单克隆抗体可以使用本领域已知的各种技术制备，包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术，或者这些技术的组合。例如，可以使用杂交瘤技术产生单克隆体，包括本领域已知及例如Harlow et al.，Antibodies：A Laboratory Manual，(ColdSpring Harbor Laboratory Press，2nd ed.1988)；Hammerling，et al.，in：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas563-681(Elsevier，N.Y.，1981)所教导的技术，所述参考文献均以其全文并入作参考。本文所用术语“单克隆抗体”非限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”是指衍生自单一克隆的抗体，包括衍生自任何真核、原核或者噬菌体克隆的抗体，而非是指产生其的方法。

使用杂交瘤技术产生和筛选特异性抗体的方法为本领域所熟知，详见于本发明实施例所讨论。在一个非限制性实施例中，可以将小鼠用本发明的多肽或者表达这种肽的细胞免疫。一旦检测到免疫应答，例如在小鼠血清中检测到特异于所述抗原的抗体，则收获小鼠的脾并分离脾细胞。然后通过熟知的技术将所述脾细胞与任何合适的骨髓瘤细胞例如得自ATCC的细胞系SP20融合。通过限制稀释选择并克隆杂交瘤。然后通过本领域熟知的方法分析杂交瘤克隆中分泌能结合本发明的多肽的抗体的细胞。通常含有高水平抗体的腹水可以通过用阳性杂交瘤克隆免疫小鼠而产生。

在另一个实施方案中，本发明的抗体也可以使用本领域已知的各种噬菌体展示方法产生。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域展示在携带编码其的多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面上。在一特定实施方案中，这种噬菌体可用于展示从全部或者组合抗体文库中(例如人或小鼠)表达的抗原结合结构域。表达结合感兴趣的抗原的抗原结合结构域的噬菌体可以用抗原选择或鉴别，例如使用标记的抗原或者与固体表面或珠结合或被捕获的抗原。这些方法中使用的噬菌体典型是丝状噬菌体，包括fd和M13，与Fab、Fv或被二硫键稳定的Fv抗体结构域一起表达自噬菌体的结合结构域被重组融合至噬菌体基因III或基因VIII蛋白。可用于产生本发明的抗体的噬菌体展示方法例如包括Brinkman et al.，J.Immunol.Methods 182：41-50(1995)；Ames et al.，J.Immunol.Methods 184：177-186(1995)；Kettleborough et al.，Eur.J.Immunol.24：952-958(1994)；Persic et al.，Gene 187 9-18(1997)；Burton et al.，Advances in Immunology57：191-280(1994)；PCT申请No.PCT/GB91/01134；PCT出版物WO90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；及美国专利No.5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108所述方法；所述文献均以其全文并入作参考。

如以上参考文献所述，在噬菌体选择后，可以分离来自噬菌体的抗体编码区并用于产生完整抗体，包括人抗体，或者任何其它希望的抗原结合片段，及在任何希望的宿主中表达，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌，例如下文所详细描述的。例如，也可以使用重组产生Fab、Fab′和F(ab′)2的技术，如PCT出版物WO 92/22324；Mullinaxet al.，BioTechniques 12(6)：864-869(1992)；及Sawai et al.，AJRI 34：26-34(1995)；Better et al.，Science 240：1041-1043(1988)所揭示的技术，所述文献均以其全文并入作参考。可用于产生单链Fv和抗体的技术例如包括美国专利No.4,946,778和5,258,498；Huston et al.，Methods in Enzymology203：46-88(1991)；Shu et al.，PNAS 90：7995-7999(1993)；及Skerra et al.，Science 240：1038-1040(1988)所述那些。

对于一些应用，包括在人体内抗体的应用及在体外检测分析中，优选使用嵌合、人源化或者人抗体。嵌合抗体是其中抗体的不同部分又是不同的动物种类的分子，如具有衍生自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。产生嵌合抗体的方法为本领域所已知。见例如Morrison，Science 229：1202(1985)；Oi et al.，BioTechniques 4：214(1986)；Gillies et al.，(1989)J.Immunol.Methods 125：191-202；美国专利No.5,807,715；4,816,567；和4,816397所述，所述文献均以其全文并入作参考。人源化抗体是结合希望的抗原的来自非人物种抗体的抗体分子，所述希望的抗原具有来自非人物种的一或多个互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的构架区。通常地，人构架区中的构架残基用来自CDR供体抗体的相应残基取代，以改变、优选改良抗原结合。这些构架取代通过本领域熟知的方法鉴别，例如通过构建CDR与构架残基的相互作用的模型以鉴别对于抗原结合重要的构架残基，并进行序列对比以鉴别在特殊位置的非同寻常的构架残基(见例如Queen et al.，美国专利No.5,585,089；Riechmann et al.，Nature 332：323(1988)所述，所述文献以其全文并入作参考)。抗体可以使用本领域已知的各种技术人源化，包括例如CDR-移植(CDR-grafting)(EP 239,400；PCT出版物WO 91/09967；美国专利No.5,225,539；5,530,101；和5,585,089)、表面修饰技术(veneering)或者重新表面化(resurfacing)(EP 592,106；EP 519,596；Padlan，MolecularImmunology 28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka et al.，Protein Engineering 7(6)：805-814 Roguska.et al.，PNAS 91：969-973(1994))，及链转换(chainshuffling)(美国专利No.5,565,332)。通常地，人源化抗体具有从非人来源导入其中的一或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称作“输入”残基，其典型取自“输入”可变区。人源化可以基本根据Winter及其同事的方法进行(Jones et al.，Nature，321：522-525(1986)；Reichmann etal.，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen et al.，Science，239：1534-1536(1988)，通过用啮齿动物CDR或者CDR序列取代人抗体的相应序列而进行。因此，这种“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567)，其中人可变区的基本上全部序列(但少于完整的人可变区)已经由非人物种的相应序列取代。在实践中，人源化抗体典型是其中一些CDR残基及可能的一些FR残基被啮齿动物抗体中相似位点取代的人抗体。

通常地，人源化抗体包含至少一个、典型为两个可变区，其中相应于非人免疫球蛋白的所有或者基本所有CDR区域及所有或基本所有FR区域是人免疫球蛋白共有序列的那些区域。人源化抗体最适地也包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，典型为人免疫球蛋白的恒定区(Jones etal.，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature 332：323-329(1988)及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596(1992)。

本发明优选的抗体的可变区的核酸序列(SEQ ID NO：7和9)和氨基酸序列(SEQ ID NO：8和10)示于图6A和6B。SEQ ID NO：7和8分别是轻链可变区的核酸序列和氨基酸序列，SEQ ID NO：9和10分别是重链可变区的核酸序列和氨基酸序列，这些序列中下划线处是CDR或者互补决定区(高可变区)。

其它本发明优选的本发明的抗体与图6A和6B所示轻链或重链之一或这两者具有充分的序列相同性。更特别地，优选的抗体包括与SEQ IDNO：8和/或10所示序列具有至少70％同源性(序列相同性)的那些抗体，更优选与SEQ ID NO：8和/或10所示序列具有大约80％或更高同源性的那些抗体，更优选与SEQ ID NO：8和/或10具有大约85％、90％或者95％或更高同源性的那些抗体。

本发明优选的本发明的抗体与SEQ ID NO：8和/或10的CDR区(图6b中下划线处)具有高序列相同性。本发明特别优选的本发明的抗体具有与Mab 239-90的轻链可变区的1、2或3个相应CDR高度序列相同(至少90％或者95％序列相同性)或者与其相同的轻链可变区的1、2或3个CDR，如下所示：1)KASQNVDYDGDSYMN(SEQ ID NO：12)；2)AASNLES(SEQ ID NO：14)；和3)QQSNEDPWT(SEQ ID NO：16))。

本发明特别优选的本发明的抗体也具有与Mab 239-90的重链可变区的1、2或3个相应CDR高度序列相同(至少90％或者95％序列相同性)或者与其相同的重链可变区的1、2或3个CDR，如下所示：1)AYTFLTYYMN(SEQ ID NO：18)；2)QIFPASGSTNYNEMFKG(SEQ IDNO：20)；和3)SFGGGFAY(SEQ ID NO：22)。

通常地，本发明优选的核酸表达呈现优选的结合亲和性及本文揭示的其它性质的本发明的抗体。

本发明优选的核酸与图6A所示轻链或重链序列之一或者这两者具有充分的序列相同性。更特别地，优选的核酸包含与SEQ ID NO：7和/或9具有至少大约70％同源(序列相同性)的序列，更优选与SEQ ID NO：7和/或9具有大约80％或更多同源性的序列，更优选与SEQ ID NO：7和/或9具有大约85％、90％或95％或更高同源性的序列。

本发明特别优选的核酸序列与SEQ ID NO：7和/或9的CDR(图6A中下划线处)具有高度序列相同性。特别优选的核酸包括编码抗体轻链可变区、并且具有编码CDR的1、2或3个序列及与编码Mab 239-90的相应CDR(图6中下划线处所示那些高度可变区)的1、2或3个序列高度序列相同(至少90％或者95％序列相同性)或者相同的那些核酸，如下所示：1)aaggccagcc aaaatgttga ttatgatggt gacagttata tgaac(SEQ ID NO：11)；2)gctgcgtcca atctagaatc t(SEQ ID NO：13)；及3)cagcaaagta atgaggatccgtggacg(SEQ ID NO：15))。

特别优选的核酸也编码抗体重链可变区，并且具有编码CDR的1、2或3个序列，及与编码Mab 239-90的相应CDR(图6中下划线处所示那些CDR)的1、2或3个序列高度序列相同(至少90％或者95％序列相同性)或者与其相同，如下所示：1)gcctatacct tcctcaccta ctacatgaac(SEQ IDNO：17)；2)cagatttttc ctgcaagtgg tagtactaac tacaatgaga tgttcaaggg c(SEQ IDNO：19)；及3)tctttcgggg gggggtttgc ttac(SEQ ID NO：21))。

抗体也可包含本文所述的一或多个CDR，其中一或多个氨基酸被取代(例如用保守氨基酸取代)、缺失或者添加。

特别希望完全的人抗体治疗人患者。人抗体可以通过本领域已知的多种方法产生，包括上述使用衍生自人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法。见例如美国专利Nos.4,444,887和4,716,111；及PCT出版物WO 98/46645，WO 98/50433，WO 98/24893，WO 98/16654，WO96/34096，WO 96/33735和WO 91/10741所述；所述文献均以其全部并入作参考。Cole等及Boerder等的技术也可用于制备人单克隆抗体(coleet al.，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Riss，(1985)；及Boemer et al.，J.Immunol.，147(1)：86-95，(1991))。

人抗体也可以使用不能表达功能性内源免疫球蛋白但可以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠产生。例如，可以将人重链和轻链免疫球蛋白基因复合体随机或者通过同源重组导入小鼠胚胎干细胞中。或者，除了人重链和轻链基因之外，也可以将人可变区、恒定区和多样性区导入小鼠胚胎干细胞中。可以通过同源重组将人免疫球蛋白基因座导入而使得小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因单独或者同时成为非功能性的。特别地，JH区的纯合缺失阻止内源抗体产生。扩增修饰的胚胎干细胞并显微注射进胚泡中，产生嵌合小鼠。然后繁殖该嵌合的小鼠，产生表达人抗体的纯合子代。将该转基因小鼠以正常方式用选择的抗原免疫，例如用全部或部分本发明的多肽免疫。针对所述抗原的单克隆抗体可以使用常规杂交瘤技术得自免疫的转基因小鼠。由该转基因小鼠携带的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间重排，随后经历类别转换和体细胞突变。因此，使用这种技术可以产生可用于治疗的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。关于这种产生人抗体的技术的综述见Lonberg and Huszar，Int.Rev.Immunol.13：65-93(1995)所述。关于产生人抗体和人单克隆抗体的技术及产生这些抗体的方案的详细论述见例如PCT出版物WO 98/24893；WO92/01047；WO 96/34096；WO 96/33735；欧洲专利No.0598877；美国专利Nos.5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771和5,939,598所述，所述文献均以其全文并入作参考。另外，Abgenix，Inc.(Freemont，Calif.)、Genpharm(San Jose，Calif.)和Medarex，Inc.(Princeton，N.J.)公司可以提供用与上述方法相似的技术生产的针对选择的抗原的人抗体。相似地，人抗体可以通过将人免疫球蛋白基因座导入转基因动物中而产生，所述转基因动物例如是其中内源免疫球蛋白基因已经部分或全部失活的小鼠。在激发的基础上观查到人抗体产生，其在各个方面都与在人体中观查的结果非常相似，包括基因重排、装配和产生各种抗体。这种方法在例如美国专利Nos.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,106及如下科技出版物中描述：Marks et al.，Biotechnol.，10：779-783(1992)；Lonberg et al.，Nature 368：856-859(1994)；Fishwild et al.，NatureBiotechnol.，14：845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnol.，14：826(1996)；Lonberg and Huszer，Intern.Rev.Immunol.，13：65-93(1995)。

识别选择的表位的完全人抗体可以使用称作“指导选择(guidedselection)”的技术产生。在这种方法中，选择的非人单克隆抗体例如小鼠抗体用于指导识别相同表位的完全人抗体的选择(Jespers et al.，Bio/technology 12：899-903(1988))。

另外，SIGLEC-6的抗体可接下来用于产生“模拟”受体的抗独特型抗体，使用本领域技术人员熟知的技术进行(见例如Greenspan & Bona，FASEB J.7(5)：437-444，(1989)和Nissinoff，J.Immunol.147(8)：2429-2438(1991)所述)。例如，结合并完全抑制多肽多聚体化和/或SIGLEC-6与配体结合的抗体可用于产生“模拟”多肽多聚体化和/或结合结构域并因此结合并中和SIGLEC-6和/或其配体的抗独特型抗体。这种中和抗独特型抗体或者其Fab片段可在治疗方案中使用以中和多肽配体。例如，这种抗独特型抗体可用于结合本发明的多肽和/或结合其配体/受体，并因此阻断其生物学活性。

本发明的抗体可以是双特异性抗体。双特异性抗体是对于至少两种不同的抗原具有结合特异性的单克隆抗体，优选是人或人源化抗体。在本发明中，一种结合特异性可以是针对本发明的多肽，另一种特异性可以是针对任何其它抗原，优选针对细胞表面蛋白、受体、受体亚基、组织特异性抗原、病毒衍生的蛋白质、病毒编码的包膜蛋白、细菌衍生的蛋白质，或者细菌表面蛋白等等。

产生双特异性抗体的方法为本领域所已知。传统上双特异性抗体的重组产生是基于两种免疫球蛋白重链/轻链对的共表达，其中所述两个重链具有不同的特异性(Milstein and Cuello，Nature，305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分类，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadromas))产生十种不同抗体分子的潜在混合物，只有一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化通常通过亲和性层析步骤实现。相似的程序在1993年5月13日公布的WO 93/08829及在Traunecker etal.，EMBOJ.，10：3655-3659(1991)中揭示。

具有希望的结合特异性的抗体可变区(抗体-抗原组合位点)可以与免疫球蛋白恒定区序列融合。所述融合优选是与免疫球蛋白重链恒定区融合，包含至少部分铰链区、CH2和CH3区域。优选在至少一种融合体中具有含有轻链结合必需位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合体的DNA(及如果需要，编码免疫球蛋白轻链的DNA)插入不同的表达载体中，并且共转染进合适的宿主生物体中。关于产生双特异性抗体的详细描述见例如Suresh et al.，Meth.In Enzym.，121：210(1986)所述。

异源缀合的抗体也包含在本发明中。异源缀合的抗体由两个共价结合的抗体组成。例如已经设想将这种抗体用于将免疫系统细胞靶向不需要的细胞(美国专利No.4,676,980)，及用于治疗HIV感染(WO 91/00360；WO 92/20373和EP03089)。预期所述抗体可以使用已知方法在合成蛋白质化学中在体外制备，包括那些涉及交联剂的方法。例如，免疫毒素可以使用二硫键交换反应或者通过形成硫酯键而构建。为此合适的试剂例如包括亚胺基硫醚(iminothiolate)和甲基-4-巯基丁基亚胺酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)及例如美国专利No.4,676,980所述那些试剂。

产生抗体的方法

本发明的抗体可以通过产生或合成抗体领域已知的任何方法产生，特别是通过化学合成方法或者通过重组表达技术产生。

本发明的抗体或其片段、衍生物或类似物(例如本发明的抗体的重链或轻链或者本发明的单链抗体)的重组表达包括含有编码该抗体的多核苷酸的表达载体的构建。一旦已经获得编码本发明的抗体分子或者抗体的重链或轻链的多核苷酸或者其一部分(优选含有重链或轻链可变区)，则可以使用本领域熟知的技术通过重组DNA技术产生用于生产所述抗体分子的载体。因此，本文描述了通过表达含有编码抗体的核苷酸序列的多核苷酸制备蛋白质的方法。本领域技术人员熟知的方法可用于构建含有抗体编码序列及合适的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术及体内遗传重组。本发明因此提供了可复制的载体，其包含与启动子可操纵地连接的编码本发明的抗体分子或其重链或轻链或者重链或轻链可变区的核苷酸序列。这些载体可包括编码抗体分子恒定区的核苷酸序列(见例如PCT出版物WO86/05807；PCT出版物WO 89/01036；和美国专利No.5,122,464所述)，抗体的可变区可以克隆进这种载体中以表达全部的重链或轻链。

通过常规技术将表达载体移至宿主细胞中，然后通过常规技术培养该转染的细胞以产生本发明的抗体。因此，本发明包括含有与异源启动子可操纵地连接的编码本发明的抗体或其重链或轻链或者本发明的单链抗体的多核苷酸的宿主细胞。在表达双链抗体的优选实施方案中，编码重链和轻链的载体可以在宿主细胞中共表达以表达全部的免疫球蛋白分子，如下文详细描述。

可以利用各种宿主表达载体系统表达本发明的抗体分子。这些宿主表达系统代表通过其可以产生及随后纯化感兴趣的编码序列的载体，也代表当用合适的核苷酸编码序列转化或转染时原位表达本发明的抗体分子的细胞。这些包括但非限于微生物如用含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或者粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如大肠杆菌、枯草杆菌(B.subtilis))；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如酿酒酵母、毕赤酵母)；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)感染的或者用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞；或者携带含有衍生自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或者哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如COS、CHO、BHK、293、3T3细胞)。优选地，细菌细胞如大肠杆菌、及更优选的真核细胞，尤其是在表达完整重组抗体分子时，用于表达重组抗体分子。例如，结合载体如人巨细胞病毒的主要立即早期基因启动子元件的哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是抗体的有效表达系统(Foecking et al.，Gene 45：101(1986)；Cockett et al.，Bio/Technology 8：2(1990))。

一旦本发明的抗体分子已经由动物产生、化学合成或者重组表达，其可以通过本领域已知的任何纯化免疫球蛋白分子的方法纯化，例如通过层析(例如离子交换层析、亲和层析、特别是在蛋白A之后对于特异性抗原的亲和层析及体积柱层析)、离心、差异溶解、或者通过纯化蛋白质的任何其它标准技术进行。另外，本发明的抗体或其片段可以与本文所述或者本领域已知的其它异源多肽序列融合以促进纯化。

本发明包含与本发明的多肽(或者其一部分，优选所述多肽的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或者100个氨基酸)重组融合或者化学缀合(包括共价和非共价缀合)的抗体以产生融合蛋白。所述融合不必是直接融合，而可以通过接头序列发生。抗体可以特异于本发明的多肽(或者其一部分，优选所述多肽的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或者100个氨基酸)之外的抗原。例如，通过将本发明的多肽与特异于特定细胞表面受体的抗体融合或者缀合，抗体可用于在体外或体内将本发明的多肽靶向于特定细胞类型。与本发明的多肽融合或缀合的抗体也可以使用本领域已知的方法用于体外免疫分析和纯化方法中。见例如Harbor et al如前及PCT出版物WO 93/21232；EP 439,095；Naramura etal.，hnmunol.Lett.39：91-99(1994)；美国专利No.5,474,981；Gillies et al.，PNAS 89：1428-1432(1992)；Fell et al.，J.Immunol.146：2446-2452(1991)，所述文献均以其全文并入作参考。

本发明进一步包括组合物，其包含与可变区之外的抗体结构域融合或缀合的本发明的多肽。例如，本发明的多肽可以与抗体Fc区域或其一部分融合或缀合。与本发明的多肽融合的抗体部分可包含恒定区、铰链区、CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域，或者全部结构域或其部分的任意组合。所述多肽也可以与上述抗体部分融合或缀合以形成多聚体。例如，与本发明的多肽融合的Fc部分可以通过Fc部分之间的二硫键形成二聚体。较高的多聚体形式可以通过将所述多肽与IgA和IgM的部分融合而产生。将本发明的多肽与抗体部分融合或缀合的方法为本领域所已知。见例如美国专利No.5,336,603；5,622,929；5,359,046；5,349,053；5,447,851；5,112,946；EP 307,434；EP 367,166；PCT出版物WO 96/04388；WO 91/06570；Ashkenazi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：10535-10539(1991)；Zheng et al.，J.Immunol.154：5590-5600(1995)；及Vil et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：11337-11341(1992)所述。(所述参考文献均以其全文并入作参考)。

如前所述，相应于SEQ ID NO：2的多肽、多肽片段或其变体的多肽可以与上述抗体部分融合或缀合以增加所述多肽在体内的半衰期或者用于使用本领域已知的方法的免疫分析中。另外，相应于SEQ ID NO：2的多肽可以与上述抗体部分融合或缀合以促进纯化。一个报道的实施例描述了由人CD4多肽的前两个结构域和哺乳动物免疫球蛋白的重链或轻链的恒定区的各个结构域组成的嵌合蛋白(EP 394,827；Traunecker et al.，Nature 331：84-86(1988))。与具有二硫键连的二聚体结构(由于IgG所致)的抗体融合或缀合的本发明的多肽也可以比单独的单体的分泌的蛋白质或蛋白质片段更有效地结合及中和其它分子(Fountoulakis et al.，J.Biochem.270：3958-3964(1995))。在许多情况中，融合蛋白中的Fc部分在治疗和诊断中是有益的，因此可例如改良药物动力学性质(EP A232,262)。或者，希望在融合蛋白已经被表达、检测和纯化后缺失Fc部分。例如，如果融合蛋白用作免疫抗原，则Fc部分可能阻碍治疗和诊断。在药物研发中，例如已经将人蛋白质如hIL-5与Fc部分融合以进行高产量筛选分析，以鉴别hIL-5的拮抗剂(见Bennett et al.，J.MolecularRecognition 8：52-58(1995)；Johanson et al.，J.Biol.Chem.270：9459-9471(1995)所述)。

另外，本发明的抗体或其片段可以与标记序列如肽融合以促进纯化。在优选的实施方案中，所述标记氨基酸序列是六组氨酸肽，如pQE载体(QIAGEN，Inc.，9259 Eton Avenue，Chatsworth，Calif.，91311)中提供的标记，许多这类载体是可商购的。如Gentz et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：821-824(1989)所述，六组氨酸使得融合蛋白被方便地纯化。可用于纯化的其它肽标记包括但非限于“HA”标记，其相应于衍生自流感血凝素蛋白的表位(Wilson et al.，Cell 37：767(1984))，及flag标记。

本发明进一步包含与诊断剂或治疗剂缀合的抗体或其片段。所述抗体可诊断性用于例如监测肿瘤的发生或发展作为临床测试程序的一部分，以例如确定特定治疗方案的效力。可以将所述抗体与可检测的物质偶联而便于检测。可检测的物质例如包括各种酶、辅基、荧光物、发光物、生物发光物、放射性物质、使用各种正电子成像术的正电子发射金属及非放射性顺磁性金属离子。可以使用本领域已知技术将可检测的物质直接或者通过中间物(例如本领域已知的接头)间接与抗体(或其片段)偶联或缀合。可以与本发明的抗体缀合以用作诊断剂的金属离子参见例如美国专利No.4,741,900所述。合适的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或者乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物例如包括链霉抗生物素蛋白/生物素及抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光物例如包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或者藻红蛋白；发光物例如包括鲁米诺；生物发光物包括荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白；合适的放射性物质例如包括¹²⁵I、¹³¹I、¹¹¹In或者⁹⁹Tc。

另外，抗体或其片段可以与治疗成分如细胞毒素例如抑制细胞生长剂或者杀细胞剂、治疗剂或者放射性金属离子如α射线发射体例如²¹³Bi缀合。细胞毒素或者胞毒剂包括对细胞有害的任何活性物质。例如包括紫杉醇(paclitaxol)、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、表鬼臼毒素吡喃葡糖苷etoposide、鬼臼噻吩甙tenoposide、长春花新碱、长春花碱、秋水仙素、阿霉素、道诺霉素、二羟基炭疽菌素二酮、二羟蒽酮、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、心得安、及嘌呤霉素及其类似物或同系物。治疗剂包括但非限于抗代谢物(例如氨甲喋呤，6-巯基嘌呤，6-硫鸟嘌呤，阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶氮烯咪胺)、烷化剂(例如氮芥、硫二十碳五烯酸苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、美法伦、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安、二溴甘露醇、链屎佐菌素、丝裂霉素C、及二氯二胺顺铂(II)(DDP)顺铂)、氨茴环霉素(例如道诺霉素(先前称作daunomycin)和阿霉素)、抗生素(例如放线菌素(先前称作actinomycin)、博来霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC))及抗有丝分裂剂(例如长春花新碱和长春花碱)。

本发明的缀合物可用于修饰特定的生物学应答，所述治疗剂或药物成分非限于传统的化学治疗剂。例如，所述药物成分可以是具有希望的生物学活性的蛋白质或多肽。这些蛋白质可包括例如毒素如相思豆毒素(abrin)、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素或者白喉毒素；蛋白质如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原激活物、细胞凋亡剂例如TNF-α、TNF-β、AIM I(见国际出版物No.WO 97/33899)，AIM II(见国际出版物No.WO 97/34911)、Fas配体(Takahashi et al.，Int.Immunol.，6：1567-1574(1994))，VEGI(见国际出版物No.WO99/23105)、血栓形成剂或者抗血管发生剂例如制管张素或者内皮抑制素；或者生物学应答修饰物例如淋巴因子、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-6(IL-6)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，或者其它生长因子。

抗体也可以附着于固体支持物，其特别用于免疫分析或者纯化靶抗原。这些固体支持物包括但非限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或者聚丙烯。

将这种治疗成分与抗体缀合的技术是熟知的，见例如Amon et al.，″Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy″，in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld et al.(eds.)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom et al.，″Antibodies For DrugDelivery″，in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.)，Robinson et al.(eds.)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，″Antibody Carriers Of CytotoxicAgents In Cancer Therapy：A Review″，in Monoclonal Antibodies′84：Biological And Clinical Applications，Pinchera et al.(eds.)，pp.475-506(1985)；″Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic UseOf Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy″，in Monoclonal AntibodiesFor Cancer Detection And Therapy，Baldwin et al.(eds.)，pp.303-16(Academic Press 1985)，及Thorpe et al.，″The Preparation And CytotoxicProperties Of Antibody-Toxin Conjugates″，Immunol.Rev.62：119-58(1982)所述。

或者，抗体可以与第二种抗体缀合形成抗体异源缀合物，如Segal在美国专利No.4,676,980中所描述，所述文献以其全文并入作参考。

被单独或者组合细胞毒性因子和/或细胞因子给予的抗体可用作治疗剂，而无论其具有或不具有与其缀合的治疗成分。

本发明还包括产生针对本发明的多肽的合成抗体。合成抗体例如在Radrizzani，M.，et al.，Medicina，(Aires)，59(6)：753-8，(1999))中描述。近年来，描述了一类新的合成抗体并将其称作分子印记聚合物(molecularlyimprinted polymers，MIP)(Semorex，Inc.)。抗体、肽和酶在化学和生物学传感器中通常用作分子识别元件。然而，其缺乏稳定性和信号传导机制限制其用作传感器。分子印记的聚合物(MIP)能模拟生物学受体的功能，但是稳定性约束较低。这种聚合物提供了高度灵敏性和选择性，同时保留极佳的热和机械稳定性。MIP具有与天然抗体相等或者更高的结合小分子及靶分子如有机物和蛋白质的能力。这些“超级”MIP与其靶具有较高的亲和性，并因此需要较低浓度即可有效结合。

在合成期间，MIP被印记以便具有与选择的靶位互补的大小、形状、电荷和功能基团，通过使用靶分子自身(如多肽、抗体等)或者具有极其相似的结构的物质作为其“印记”或者“模板”实现。MIP可以用与提供给抗体的相同的试剂衍生化。例如，荧光“超级”MIP可以包被在珠或孔上，以用于高灵敏性分离或分析中，或者用于蛋白质的高产量筛选中。

另外，基于本发明的多肽的结构的MIP可用于筛选结合本发明的多肽的化合物。这种MIP通过模拟所述多肽的天然结构而作为合成“受体”。事实上，MIP作为合成受体的能力已经针对雌激素受体而论证(Ye，L.，Yu，Y.，Mosbach，K，Analyst.，126(6)：760-5，(2001)；Dickert，F，L.，Hayden，0.，Halikias，K，P，Analyst.，126(6)：766-71，(2001))。合成受体可以被全部模拟(例如作为完整的蛋白质)，或者被相应于所述蛋白质的一系列短肽模拟(Rachkov，A.，Minoura，N，Biochim，Biophys，Acta.，1544(1-2)：255-66，(2001))。这种合成受体MIP可用于本文别处所述的任一或多种筛选方法中。

MIP也可用于“感觉”其模拟的分子的存在(Cheng，Z.，Wang，E.，Yang，X，Biosens，Bioelectron.，16(3)：179-85，(2001)；Jenkins，A，L.，Yin，R.，Jensen，J.L，Analyst.，126(6)：798-802，Jenkins，A，L.，Yin，R.，Jensen，J.L，Analyst.，126(6)：798-802，(2001))。例如，使用本发明的多肽设计的MIP可以用于设计为鉴别并潜在地定量样品中所述多肽水平的分析中。这种MIP可用作本文提供的分析或者试剂盒(例如ELISA等)中描述的任何成分的替代物。

可以应用多种方法产生特异性受体、配体、多肽、肽、有机分子的MIP。一些优选的方法在Esteban et al in J.Anal，Chem.，370(7)：795-802，(2001)中描述，所述文献除了其引用的任何参考文献之外还以其全部并入作参考。其它方法为本领域所已知并包含在本发明中，例如Hart，B，R.，Shea，K，J.J.Am.Chem，Soc.，123(9)：2072-3，及Quaglia，M.，Chenon，K.，Hall，A，J.，De，Lorenzi，E.，Sellergren，B，J.Am.Chem，Soc.，123(10)：2146-54，(2001所述方法，所述文献以其全部并入作参考。

激动剂筛选

另一方面，本发明提供了一种鉴别SIGLEC-6激动剂的筛选方法。所述筛选方法包括将SIGLEC-6暴露于潜在的SIGLEC-6激动剂，并确定所述潜在激动剂是否激活ITIM，从而抑制细胞因子或者组胺从肥大细胞中释放(见实施例11)。如果潜在的激动剂与SIGLEC-6结合，则强烈提示该潜在激动剂当在体内给予患者时会具有实际的激动剂功能。使用这种方法鉴别的SIGLEC-6激动剂可以通过将肥大细胞暴露于该激动剂并测定与在没有该激动剂存在的条件下激活的细胞相对比细胞因子或组胺的释放情况而鉴定为激动剂。激动剂通过激活ITIM而阻止脱粒和/或组胺释放。另一种筛选方法包括用含有SIGLEC-6的报道基因构建体转染细胞。潜在的激动剂可以是有机化合物或者多肽，包括抗体。

高产量筛选方法特别用于检测本文所述的SIGLEC-6的调节物。这种高产量筛选方法典型包括提供含有大量潜在治疗化合物(例如配体或者调节物化合物)的组合的化学或肽文库。然后在一或多个分析中筛选这些组合的化学文库或者配体文库以鉴别展示希望的特征性活性的那些文库成员(例如特定的化学物种类或者亚类)。如此鉴别的化合物可作为常规引导化合物，或者其自身可用作潜在或实际的治疗剂。

组合的化学文库是通过化学合成或者生物学合成方法、通过组合多种化学构件(即试剂如氨基酸)而产生的不同化学化合物的集合。例如，线性组合文库，例如多肽或肽文库，是通过以针对给定的化合物长度(即多肽或肽化合物中氨基酸的数目)的每一种可能的方式组合一系列化学构件而形成的。通过这种化学构件的组合性混和可以合成数百万种化学化合物。

组合的化学文库的制备和筛选为本领域技术人员所熟知。组合的文库包括但非限于肽文库(例如美国专利No.5,010,175；Furka，1991，Int.J.Pept.Prot.Res.，37：487-493；及Houghton et al.，1991，Nature，354：84-88)。也可以使用产生化学多样性文库的其它化学方法。化学多样性文库化学的非限制性实例包括肽(PCT出版物No.WO 91/019735)、编码的肽(PCT出版物No.WO 93/20242)、随机生物寡聚体(PCT出版物No.WO92/00091)、苯二氮类(benzodiazepines)(美国专利No.5,288,514)、diversomers如类海因、苯二氮和二肽(Hobbs et al.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6909-6913)、vinylogous多肽(Hagihara et al.，1992，J.Amer.Chem.Soc.，114：6568)、具有葡萄糖骨架的非肽肽模拟物(Hirschmann et al.，1992，J.Amer.Chem.Soc.，114：9217-9218)、小化合物文库的类似有机合成(Chen et al.，1994，J.Amer.Chem.Soc.，116：2661)、寡聚氨基甲酸盐(Cho et al.，1993，Science，261：1303)和/或肽基磷酸酯(Campbell et al.，1994，J.Org.Chem.，59：658)、核酸文库(见Ausubel，Berger and Sambrook、如前述)、肽核酸文库(美国专利No.5,539,083)、抗体文库(例如Vaughn etal.，1996，Nature Biotechnology，14(3)：309-314)和PCT/US96/10287)、碳水化合物文库(例如Liang et al.，1996，Science，274-1520-1522)和美国专利No.5,593,853)、小有机分子文库(例如benzodiazepines，Baum C&EN，Jan.18，1993，page 33；和美国专利No.5,288,514；类异戊二烯，美国专利No.5,569,588；噻唑啉酮(thiazolidinones)和间噻嗪烷酮(metathiazanones)，美国专利No.5,549,974；吡咯烷，美国专利No.5,525,735和5,519,134；吗啉代化合物，美国专利No.5,506,337；等等)。

制备组合文库的设备可商购(例如357MPS，390MPS，AdvancedChem Tech，Louisville Ky.；Symphony，Rainin，Woburn，Mass.；433AApplied Biosystems，Foster City，Calif.；9050 Plus，Millipore，Bedford，Mass.)。另外，可商购大量组合文库(例如ComGenex，Princeton，N.J.；Asinex，Moscow，Russia；Tripos，Inc.，St.Louis，Mo.；ChemStar，Ltd.，Moscow，Russia；3D Pharmaceuticals，Exton，Pa.；Martek Biosciences，Columbia，Md.等等)。

在一个实施方案中，本发明提供了基于固相的高产量形式体外分析，其中将细胞或组织附着于固相底物。在这种高产量分析中，可以在一天内筛选几千种不同的调节物或者配体。特别地，微滴定平板的每个孔均可以用于进行针对被选择的潜在调节物的单独的分析，或者如果观查到浓度或温育时间效应，则每5-10个孔可以测试一种调节物。因此，一个标准微滴定平板可以分析大约96种调节物。如果使用1536孔平板，则一个平板可以容易地分析大约100-1500种不同化合物。每天可以分析几个不同的平板，因此使用所述整合的系统可以例如分析直至大约6,000-20,000种不同化合物。

另一方面，本发明包含筛选和小分子(例如药物)检测分析，所述分析包括检测或鉴别可以结合SIGLEC-6多肽或肽的小分子。特别优选的是适于高产量筛选方法的分析。

在这种基于结合的检测、鉴别或筛选分析中，功能分析不是典型需要的。在分析中需要的是靶蛋白质，优选基本纯化的蛋白质，及要筛选或分析的结合蛋白质靶的化合物(例如配体、药物、小分子)或生物学实体的文库或组。优选地，结合靶蛋白质的大多数小分子由于优先较高亲和性地结合蛋白质上的功能性区域或位点而以一些方式调节活性。

这种分析例如是基于荧光的热移分析(thermal shift assay)(3-Dimensional Pharmaceuticals，Inc.，3DP，Exton，Pa.)，如Pantoliano等的美国专利No.6,020,141和6,036,920及J.Zimmerman，2000，Gen.Eng.News，20(8))所述。所述分析基于通过分析蛋白质-药物或者配体复合物的热变性曲线确定的结合亲和性而可以检测与表达的、优选纯化的多肽结合的小分子(例如药物，st配体)。如果需要则可以通过例如本文所述那些方法进一步分析通过这种技术确定的药物或者结合分子，以确定所述分子是否影响或者调节靶蛋白质的功能或者活性。

为了纯化SIGLEC-6多肽或肽以测定生物学结合或者配体结合活性，所述来源可以是在存在标准蛋白酶抑制剂的条件下通过连续冷冻-解冻循环(例如1-3次)制备的全细胞裂解物。SIGLEC-6多肽可以通过标准蛋白质纯化方法部分或者完全纯化，例如使用下文所述特异性抗体进行亲和层析，或者也如本文所述通过特异于工程化进重组SIGLEC-6多肽分子中的表位标记的配体进行纯化。然后可以如同所描述的测定结合活性。

根据本发明提供的方法鉴别的、并且调节或者调整本发明的SIGLEC-6多肽生物学活性或者生理学的化合物是本发明的优选实施方案。预期这种调节性化合物可以用于治疗SIGLEC-6多肽介导的病变的方法，所述方法通过给予需要这种治疗的个体一种治疗有效量的通过本发明所述方法鉴别的化合物。

另外，本发明提供了治疗需要这种治疗的个体的方法，所述治疗针对由本发明SIGLEC-6多肽介导的疾病、失调或者病变，包括给予所述个体治疗有效量的通过本发明提供的方法鉴别的调节SIGLEC-6的化合物。

抗体的治疗应用

本发明进一步涉及基于抗体的治疗，包括给予动物、优选哺乳动物、最优选人本发明的抗体，以治疗一或多种所揭示的疾病、失调或者病变。本发明的治疗化合物包括但非限于本发明的抗体(包括如本文所述的其片段、类似物和衍生物)及编码本发明的抗体(包括如本文所述的其片段、类似物和衍生物，以及抗独特型抗体)的核酸。本发明的抗体可用于治疗、抑制或预防与Siglec-6或本发明的多肽的异常表达和/或活性相关的疾病、失调或病变，包括但非限于本文揭示的任一或多种疾病、失调或病变。对与Siglec-6或者本发明的多肽的异常表达和/或活性相关的疾病、失调或者病变的治疗和/或预防包括但非限于减轻与这些疾病、失调或病变相关的症状，消除表达Siglec-6的B细胞群，或者耗竭表达Siglec-6的B细胞。本发明的抗体可以在本领域已知的或者本文描述的药学可接受的组合物中提供。

本发明的抗体可治疗性地应用的方式概括而言包括在机体局部或全身结合Siglec-6或者本发明的多核苷酸或者多肽，或者通过所述抗体的直接细胞毒性进行，所述细胞毒性例如由补体(CDC)或者效应细胞(ADCC)介导。下文更详细描述了一些这样的方法。根据本发明提供的教导，本领域技术人员将获知怎样可以使用本发明的抗体进行诊断、监测或者治疗，而不用过分的实验。

本发明的抗体可以有利地组合其它单克隆或者嵌合抗体或者组合例如增加与所述抗体相互作用的效应细胞的数目或活性的淋巴因子或者造血生长因子(例如IL-2、IL-3和IL-7)而应用。

本发明的抗体可以单独给予或者与其它类型治疗方法(例如放疗、化疗、激素治疗、免疫治疗和抗肿瘤剂)给予组合。通常地，优选给予与患者相同物种的物种起源或者物种反应性(在抗体的情况中)的产物。因此，在优选的实施方案中，给予人类患者人或人源化的抗体、其片段衍生物、类似物或者核酸，以进行治疗或预防。

优选使用针对Siglec-6或本发明的多肽或多核苷酸的高亲和性和/或强力体内抑制和/或中和抗体、其片段或区域，进行针对与Siglec-6或本发明的多核苷酸或多肽、包括其片段相关的疾病的免疫分析及治疗。这些抗体、片段或区域优选具有针对Siglec-6或本发明的多核苷酸或多肽、包括其片段的亲和性。

针对本发明的多肽的抗体可用于抑制动物中的变态反应。例如，通过给予动物治疗可接受剂量的本发明的抗体或者本发明的抗体的混合物或者组合各种来源的其它抗体的本发明的抗体，所述动物对于抗原可不激发变态反应应答。

同样，可以预想克隆编码针对本发明的多肽的抗体的基因，所述多肽具有激发生物体中变态反应和/或免疫应答的潜力，并用所述抗体基因转化该生物体，由此其在生物体中被表达(例如组成型、可诱导型表达)。因此，所述生物体由于摄取或者存在这种免疫/变态反应反应性多肽而有效地成为变态反应抗性的。另外，本发明的抗体的这种应用在预防和/或改善自身免疫疾病和/或失调中可具有特殊用途，因为这种病变典型地是抗内源蛋白质的抗体所致。例如，在本发明的多肽调节对自身抗原的免疫应答的情况中，用除了包含编码针对本发明的多肽的抗体的多核苷酸之外，还包含本发明揭示的或者本领域已知的任何启动子的构建体转化生物体和/或个体，可以有效地抑制该生物体免疫系统激发对自身抗原的免疫应答。关于本发明的治疗和/或基因治疗应用的详细描述在本文别处提供。

或者，本发明的抗体可以在植物中产生(例如克隆针对本发明的多肽的抗体的基因，并用包含所述基因的合适载体转化植物，以在所述植物中组成型表达所述抗体)，随后所述植物由动物摄取，从而赋予该动物对于所述抗体所针对的特异性抗原的暂时免疫性(见例如美国专利No.5,914,123和6,034,298所述)。

基于抗体的基因治疗

在一个特定的实施方案中，给予包含编码抗体或其功能衍生物的序列的核酸以通过基因治疗预防、治疗或者抑制肥大细胞介导的疾病或失调。基因治疗是指通过给予对象表达的或者可表达的核酸而进行的治疗。在本发明的这个实施方案中，所述核酸产生其编码的介导治疗作用的抗体。

在另一个实施方案中，给予包含编码抗体或其功能衍生物的序列的核酸以通过基因治疗预防、治疗或者抑制B细胞介导的疾病或失调，其中所述B细胞是表达型的。

根据本发明可以使用本领域可利用的任何基因治疗方法。所述方法例如下文所述。

关于基因治疗方法的综述见Goldspiel et al.，Clinical Pharmacy 12：488-505(1993)；Wu and Wu，Biotherapy 3：87-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596(1993)；Mulligan，Science 260：926-932(1993)；及Morgan and Anderson，Ann.Rev.Biochem.62：191-217(1993)；May，TIBTECH11(5)：155-215(1993)所述。可以使用的重组DNA技术领域已知的方法在Ausubel et al.(eds.)，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，NY(1993)；及Kriegler，Gene Transfer andExpression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY(1990)中描述。

根据本发明，编码抗体的核酸序列是在合适的宿主中表达所述抗体或其片段或嵌合蛋白质或者重链或轻链的表达载体的一部分。特别地，这些核酸序列具有与抗体编码区可操纵地连接的启动子，所述启动子是可诱导的或者组成型的，任选是组织特异性的。在另一个特定实施方案中，使用如下核酸分子：其中抗体编码序列及其它任何希望的序列侧翼是促进在基因组中所希望的位点进行同源重组的区域，由此提供了编码核酸的抗体的染色体内表达(Koller and Smithies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8932-8935(1989)；Zijlstra et al.，Nature 342：435-438(1989)。在特定的实施方案中，表达的抗体分子是单链抗体；或者，所述核酸序列包括编码抗体的重链和轻链或其片段的序列。

可以直接或者间接将所述核酸输送至患者体内，直接方式是将患者直接暴露于核酸或者携带核酸的载体，间接方式是将细胞首先用核酸在体外转化，然后移植进患者体内。这两种方法分别称作体内或者自体(exvivo)基因治疗。

在一个特定的实施方案中，所述核酸序列是在体内直接给予的，其在体内表达产生编码的产物。这可以通过本领域已知的多种方法实现，例如通过将其构建为适当的核酸表达载体的一部分并给予对象而由此成为细胞内的核酸序列，这可例如通过使用缺陷或弱化的反转录病毒或者其它病毒载体感染实现(见美国专利No.4,980,286所述)，或者通过直接注射裸DNA实现，或者通过使用微粒轰击(例如基因枪；Biolistic，Dupont)实现，或者用脂质或者细胞表面受体或者转染剂包被、内吞入脂质体、微粒或者微囊中实现，或者通过将其与已知进入细胞核的肽以连接的形式给予实现，通过将其与进行受体介导的胞吞的配体以连接的形式给予实现(见例如Wu and Wu，J.Biol.Chem…262：4429-4432(1987))(其可用于靶定特异表达所述受体的细胞类型)等等。在另一个实施方案中，可以形成核酸-配体复合物，其中所述配体包含膜融合病毒肽以破坏内涵体，使得所述核酸免于被溶酶体降解。在另一个实施方案中，所述核酸可以通过靶定特异性受体而在体内被针对细胞特异性摄取和表达而靶定(见例如PCT出版物WO 92/06180；WO 92/22635；W092/20316；W093/14188，WO 93/20221)。或者，所述核酸可以通过同源重组而在细胞内导入并掺入宿主细胞DNA中以进行表达(Koller and Smithies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8932-8935(1989)；Zijlstra et al.，Nature 342：435-438(1989))。

在一个特定的实施方案中，使用含有编码本发明的抗体的核酸序列的病毒载体。例如，可以使用反转录病毒载体(见Miller et al.，Meth.Enzymol.217：581-599(1993))。这些反转录病毒载体含有对于正确包装病毒基因组并整合进宿主细胞DNA中所必需的成分。将编码基因治疗中使用的抗体的核酸序列克隆进一或多个载体中，促进基因输送至患者。关于反转录病毒载体的更详细的描述可见Boesen et al.，Biotherapy 6：291-302(1994)，其描述了使用反转录病毒载体将mdrl基因输送至造血干细胞，以使得所述干细胞对于化疗抗性更强。例证了在基因治疗中使用反转录病毒的其它参考文献是：Clowes et al.，J.Clin.Invest.93：644-651(1994)；Kiem et al.，Blood 83：1467-1473(1994)；Salmons and Gunzberg，Human Gene Therapy 4：129-141(1993)；及Grossman and Wilson，Curr.Opin.in Genetics and Devel.3：110-114(1993)。

腺病毒是可用于基因治疗中的其它病毒载体。腺病毒是将基因输送至呼吸道上皮的特别有利的输送载体。腺病毒天然感染呼吸道上皮，在此导致轻微的疾病。基于腺病毒输送系统的其它靶位是肝、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒的优势是具有能感染非分裂型细胞的能力。Kozarsky and Wilson，Current Opinion in Genetics and Development 3：499-503(1993)介绍了一种基于腺病毒的基因治疗。Bout et al.，HumanGene Therapy 5：3-10(1994)论证了使用腺病毒载体将基因转移至猕猴呼吸道上皮中。在基因治疗中使用腺病毒的其它实例可见于Rosenfeld et al.，Science 252：431-434(1991)；Rosenfeld et al.，Cell 68：143-155(1992)；Mastrangeli et al.，J.Clin.Invest.91：225-234(1993)；PCT出版物W094/12649；及Wang，et al.，Gene Therapy 2：775-783(1995)所述。在优选的实施方案中，使用腺病毒载体。

也已经设想将腺伴随病毒(AAV)用于基因治疗中(Walsh et al.，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204：289-300(1993)；U.S.Pat.No.5,436,146)。

另一种基因治疗方法包括将基因转移至组织培养物中的细胞中，通过如电穿孔、脂转染、磷酸钙介导的转染或者病毒感染等方法进行。通常地，转移方法包括将一种可选择的标记转移至细胞中。然后将所述细胞置于选择条件下以分离已经摄取并表达所述转移的基因的那些细胞。然后将这些细胞给予患者。

在这个实施方案中，将核酸在体内给予所得的重组细胞之前导入细胞中。这种导入可以通过本领域已知的任何方法进行，包括但非限于转染、电穿孔、显微注射、用含有所述核酸序列的病毒或者噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质球融合等等。本领域已知许多将外源基因导入细胞中的技术(见例如Loeffler and Behr，Meth.Enzymol.217：599-618(1993)；Cohen et al.，Meth.Enzymol.217：618-644(1993)；Cline，Pharmac.Ther.29：69-92m(1985)所述)，并且可以根据本发明加以应用，只要受体细胞必需的发育和生理机能不被破坏即可。所述技术应将核酸稳定转移至细胞，以便所述核酸可以由所述细胞表达及优选地可遗传并且可由其后代细胞表达。

所得重组细胞可以通过本领域已知的各种方法给予患者。重组的血细胞(例如造血干细胞或祖细胞)优选经静脉内给予。细胞的用量根据希望的作用、患者状态等确定，可以由本领域技术人员确定。

可以导入核酸以进行基因治疗的细胞包括任何希望的可获得的细胞类型，包括但非限于上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、肌细胞、肝细胞；血细胞如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、粒细胞；各种干细胞或者祖细胞，特别是造血干细胞或祖细胞，例如得自骨髓、脐带血、周围血、胎儿肝脏等的造血干细胞或祖细胞。

在优选的实施方案中，用于基因治疗的细胞是患者自体的。在重组细胞用于基因治疗的实施方案中，将编码抗体的核酸序列导入细胞中，由此它们可以由所述细胞或其后代表达，然后将该重组细胞在体内给予以发挥治疗作用。在一个特定的实施方案中，使用干细胞或者祖细胞。可以在体外分离并维持的任何干细胞和/或祖细胞根据本发明的这个实施方案均可以潜在地应用(见例如PCT出版物WO 94/08598；Stempleand Anderson，Cell71：973-985(1992)；Rheinwald，Meth.Cell Bio.21A：229(1980)；及Pittelkow and Scott，Mayo Clinic Proc.61：771(1986))。

在一个特定的实施方案中，被导入以进行基因治疗的核酸包含与编码区可操纵地连接的可诱导的启动子，由此所述核酸的表达可以通过控制合适的转录诱导物的存在与否而控制。

在一个实施方案中，所述治疗定位于哮喘患者的肺以降低或者消除通过细胞因子诱导和释放导致呼吸道重塑及哮喘症状的肥大细胞。目前用于囊性纤维化患者的基因治疗技术可用于本发明中。

用抗体进行诊断和成像

特异结合SIGLEC-6的标记的抗体及其衍生物和类似物可用于诊断目的，以检测、诊断或者监测与表达Siglec-6的B细胞相关和/或与SIGLEC-6的异常表达和/或活性相关的疾病、失调和/或病变。所述方法包括：(a)使用本发明的一或多种抗体分析个体中细胞或体液中SIGLEC-6的表达，及(b)将该表达水平与标准表达水平相对比，从而被分析的表达水平与标准表达水平相比增加或降低是B细胞介导的疾病或病变和/或异常表达的指征。

本发明提供了一种诊断疾病的诊断方法，包括：(a)使用本发明的一或多种抗体分析个体中细胞或体液中SIGLEC-6的表达，及(b)将该表达水平与标准表达水平相对比，从而被分析的表达水平与标准表达水平相比增加或降低是特定疾病的指征。

本发明的抗体可用于分析生物学样品中蛋白质水平，使用本领域技术人员已知的传统免疫组织学方法进行(例如Jalkanen，et al.，J.Cell.Biol.101：976-985(1985)；Jalkanen，et al.，J.Cell.Biol.105：3087-3096(1987))。可用于检测表达的其它基于抗体的的方法包括免疫分析，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射性免疫测定(RIA)。合适的抗体分析标记为本领域所已知，包括酶标记，如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，如碘(¹²⁵I，¹²¹I)、碳(¹⁴C)、硫(³⁵S)、氚(³H)、铟(¹¹²In)及锝(⁹⁹Tc)；发光标记，如鲁米诺；及荧光标记，如荧光素和罗丹明，及生物素。

本发明的一方面包括体内检测和诊断动物如人体中肥大细胞介导的疾病或失调。在一个实施方案中，诊断包括：a)给予(例如肠道外、皮下或者腹膜内给予)对象有效量的标记的抗-SIGLEC-6抗体，其特异性结合于肥大细胞表面；b)在给予后等待一段时间以使得标记的抗体在对象体内优先积聚在所述多肽表达的部位(及等待未结合的标记的分子被清除至背景水平)；c)确定背景水平；及d)检测对象中标记的分子，由此检测到标记的分子高于背景水平则提示所述对象具有与感兴趣的多肽的异常表达相关的特定疾病或失调。背景水平可以通过各种方法确定，包括将检测的标记分子的量与预先针对特定系统确定的标准值进行对比。

本发明的另一方面包括体内检测和诊断动物如人体中B细胞介导的疾病或失调。在一个实施方案中，诊断包括：a)给予(例如肠道外、皮下或者腹膜内给予)对象有效量的标记的抗-SIGLEC-6抗体，其特异性结合于肥大细胞表面；b)在给予后等待一段时间以使得标记的抗体在对象体内优先积聚在所述多肽表达的部位(及等待未结合的标记的分子被清除至背景水平)；c)确定背景水平；及d)检测对象中标记的分子，由此检测到标记的分子高于背景水平则提示所述对象具有与表达SIGLEC-6的B细胞相关的特定疾病或失调。背景水平可以通过各种方法确定，包括将检测的标记分子的量与预先针对特定系统确定的标准值进行对比。

本领域技术人员理解对象的大小和所用的成像系统将决定需要产生诊断图像的成像成分的量。在放射性同位素成分的情况中，对于人对象而言，注射的放射性物质的量通常为大约5-20毫居里的99mTc。然后标记的抗体或者抗体片段优先积聚在含有特定蛋白质的肥大细胞部位。体内成像在S.W.Burchiel et al.，″Immunopharmacokinetics of RadiolabeledAntibodies and Their Fragments.″(Chapter 13 in Tumor Imaging：TheRadiochemical Detection of Cancer，S.W.Burchiel and B.A.Rhodes，eds.，Masson Publishing Inc.(1982)中描述。

根据一些变量，包括使用的标记的类型和给予模式，给予后使得标记的分子优先在对象体内部位积聚及未结合的标记的分子被清除至背景水平的时间间隔为6-48小时或者6-24小时或者6-12小时。在另一个实施方案中，给予后的时间间隔为5-20天或者5-10天。

在一个实施方案中，疾病或者失调的监测是通过重复诊断疾病的方法进行的，例如在初次诊断后一个月、初次诊断后六个月、初次诊断后一年等重复进行。

患者中标记的抗体的存在可以使用本领域已知的体内扫描方法进行。这些方法根据使用的标记类型而定。技术人员能确定检测特定标记的合适方法。本发明的诊断方法中可以使用的方法和设备包括但非限于计算机层析X射线断层照像术(CT)、整体扫描如正电子成像术(PET)、磁共振成像(MRI)和超声检查。

在一个特定的实施方案中，将分子用放射性同位素标记并使用放射性应答外科器械在患者体内检测(Thurston et al.，美国专利No.5,441,050)。在另一个实施方案中，将抗体用荧光化合物标记并使用荧光应答扫描器械在患者体内检测。在另一个实施方案中，将抗体用正电子发射金属标记并使用正电子成像术在患者体内检测。在另一个实施方案中，将抗体用顺磁性标记物标记并使用磁共振成像术(MRI)在患者体内检测。

疾病倾向诊断

另一方面，本发明提供了一种诊断患者发生B细胞介导的疾病和/或由失调的细胞因子表达导致的疾病的倾向的方法。本发明基于发现某些患者细胞、组织或者体液中SIGLEC-6受体的存在或者量增加也许是某些B细胞介导的或者免疫疾病倾向的指征。

在一个实施方案中，所述方法包括从患者中收集怀疑含有肥大细胞的细胞、组织或者体液样品，分析所述组织或体液的SIGLEC-6被调节的表达，并基于所述组织或者体液中SIGLEC-6受体的表达水平而预测患者发生某些免疫疾病的倾向。

在另一个实施方案中，所述方法包括从患者中收集怀疑含有表达SIGLEC-6的B细胞的细胞、组织或者体液样品，分析所述组织或体液的SIGLEC-6被调节的表达，并基于所述组织或者体液中SIGLEC-6受体的表达水平而预测患者发生某些免疫疾病的倾向。

在另一个实施方案中，所述方法包括从患者中收集已知含有确定水平SIGLEC-6受体的细胞、组织或者体液样品，分析所述组织或体液的SIGLEC-6受体的量，并基于与针对正常细胞、组织或者体液而确定的或测试的水平相对比，所述组织或体液中SIGLEC-6受体的量的改变而预测患者发生某些免疫疾病的倾向。SIGLEC-6受体的确定水平的可以是基于文献数值的已知量，或者可以通过测定正常细胞、组织或体液中的量而预先确定。特别地，某些组织或体液中SIGLEC-6受体水平的确定可以特异性地和较早地，优选在疾病发生之前，检测患者的免疫疾病。可以使用本发明的方法诊断的免疫疾病包括但非限于本文所述的免疫疾病。在优选的实施方案中，所述组织或者体液是周围血、周围血白细胞、活检组织如肺或皮肤活检组织、及滑液和组织。

B细胞和/或SIGLEC-6介导的疾病的预防和治疗

另一方面，本发明提供了一种治疗哺乳动物SIGLEC-6介导的疾病的方法。所述方法包括给予所述哺乳动物疾病治疗量的SIGLEC-6调节化合物，如抗-SIGLEC-6激动剂抗体。所述激动剂抗体结合SIGLEC-6受体并调节细胞因子和/或细胞受体表达，以产生非疾病状态特有的细胞因子水平。SIGLEC-6介导的疾病包括变态反应、哮喘、自身免疫疾病或者其它炎性疾病，以及肥大细胞增生症。

另一方面，本发明提供了一种治疗哺乳动物B细胞介导的疾病的方法。所述方法包括给予所述哺乳动物疾病治疗量的SIGLEC-6调节化合物，如抗-SIGLEC-6激动剂抗体或者模拟SIGLEC-6天然配体的小分子。所述激动剂抗体结合SIGLEC-6受体并调节细胞因子和/或细胞受体表达，以产生非疾病状态特有的细胞因子水平。B细胞介导的疾病包括但非限于白血病和B细胞淋巴瘤。

这些疾病的预防和治疗中使用的抗体也可以工程化，以包含可杀死肥大细胞和/或表达SIGLEC-6的B细胞的效应物功能或者与例如细胞毒素或者细胞凋亡诱导分子缀合。

SIGLEC-6调节化合物的剂量根据特定哺乳动物的年龄、大小和特征以及疾病而变化。技术人员基于这些因素可以确定剂量。可以在治疗方案中给予的SIGLEC-6调节化合物与疾病一致，例如一或几天内给予一或几次以减轻疾病状况，或者一段时间内定期给予以预防变态反应或哮喘。

SIGLEC-6调节化合物可以任何可接受的方式给予哺乳动物，包括口服给予、注射、使用植入体、雾化吸入肺中等。注射和植入可以精确控制给药的时间和剂量水平。SIGLEC-6调节化合物可以肠道外给予。如本文所用，肠道外给予是指通过静脉内、肌内或者腹膜内注射，或者通过皮下植入。

当通过注射给予时，SIGLEC-6调节化合物可以含有任何生物相容的活性物质及生物相容的载体如各种运载体、佐剂、添加剂和稀释剂的可注射配制品形式给予哺乳动物。

治疗/预防性给予及组合物

本发明提供了通过给予对象有效量的化合物或组合物(优选抗体)进行的治疗、抑制和预防方法。所述对象优选是动物，包括但非限于牛、猪、马、鸡、猫、狗等，优选是哺乳动物，最优选是人。

当所述化合物包含核酸或者免疫球蛋白时可以应用的配制品和给予方法如下文所述。

已知各种输送系统可以用于给予本发明的化合物，例如内吞入脂质体中、微粒、微囊、能表达所述化合物的重组细胞、受体介导的胞吞(见例如Wu and Wu，J.Biol.Chem..262：4429-4432(1987))、将核酸构建为反转录病毒或者其它载体的一部分等等。

导入方法包括但非限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。所述化合物或组合物可以通过任何便利途径给予，例如通过注入或者推注、通过经上皮或者粘膜皮肤层(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收、及可以与其它生物活性剂一起给予。可以全身性或者局部给予。另外，也可能希望通过任何合适途径，包括心室内和鞘内注射，将本发明的药物化合物或组合物导入中枢神经系统中；心室内注射例如可借助于附着于囊(reservoir)，例如Ommaya囊的心室内注射导管进行。也可以应用肺部给予，例如通过使用雾化吸入器或者喷雾器及含有雾化剂的配制品进行。

在一个特定的实施方案中，可能希望将本发明的化合物或组合物局部给予需要治疗的部位；这可以通过例如但非限于局部注入或者利用植入体而实现，所述植入体是有孔的、无孔的或者凝胶状材料，包括膜如sialastic膜或者纤维。优选地，当给予本发明的蛋白质包括抗体时，必须注意使用所述蛋白质不吸附的材料。

在另一个实施方案中，所述化合物或组合物可以在运载体中输送，特别是在脂质体中输送(见Langer，Science 249：1527-1533(1990)；Treat etal.，in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer，Lopez-Berestein and Fidler(eds.)，Liss，New York，pp.353-365(1989)；Lopez-Berestein，ibid.，pp.317-327；see generally ibid.)。

在另一个实施方案中，所述化合物或组合物可以在控制释放系统中输送。在一个实施方案中，可以使用泵(见Langer，见上；Sefton，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201(1987)；Buchwald et al.，Surgery 88：507(1980)；Saudek et al.，N.Engl.J.Med.321：574(1989))。在另一个实施方案中，可以使用聚合物材料(见Medical Applications of Controlled Release，Langerand Wise(eds.)，CRC Pres.，Boca Raton，Fla.(1974)；Controlled DrugBioavailability，Drug Product Design and Performance，Smolen and Ball(eds.)，Wiley，New York(1984)；Ranger and Peppas，J.，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61(1983)；也见Levy et al.，Science 228：190(1985)；During et al.，Ann.Neurol.25：351(1989)；Howard et al.，J.Neurosurg.71：105(1989)所述)。在另一个实施方案中，可以将控制释放系统置于治疗靶位即脑的附近，因此仅需要全身给予剂量的一部分即可(见例如Goodson，in Medical Applications of Controlled Release，见上，vol.2，pp.115-138(1984))。其它控制释放系统由Langer(Science 249：1527-1533(1990))综述。

在其中本发明的化合物是编码蛋白质的核酸的特定实施方案中，所述核酸可以在体内给予以促进其编码的蛋白质的表达，这可通过将其构建为合适的核酸表达载体的一部分并例如通过反转录病毒载体给予以使其成为细胞内的核酸实现(见美国专利No.4,980,286)，或者通过直接注射实现，或者通过使用微粒轰击(例如基因枪；Biolistic，Dupont)实现，或者用脂质或者细胞表面受体或者转染剂包被实现，或者通过将其与已知进入细胞核中的同源同源异形盒(homeobox)样肽以连接的形式给予(见例如Joliot et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：1864-1868(1991))等等实现，或者核酸可以通过同源重组导入细胞内并掺入宿主细胞DNA中以进行表达。

本发明还提供了组合物。这些组合物包含治疗有效量的化合物及可接受的载体。术语“载体”是指与治疗剂一起给予的稀释剂、佐剂、赋形剂或者运载体。这些载体可以是无菌液体，如水和油，包括源于石油、动物、植物或者合成的油，如花生油、豆油、矿物油、芝麻油等等。当所述组合物经静脉内给予时，水是优选的载体。盐水溶液和葡萄糖水溶液及甘油溶液也可以用作液体载体，特别用作可注射的溶液。合适的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、凝胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、干燥的脱脂乳、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等等。如果需要，所述组合物也可以含有小量的增湿剂或乳化剂，或者pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳状液、片剂、药丸、胶囊、粉末、持续释放的配制品等形式。所述组合物可以用传统的结合剂和载体如甘油三酯配制为栓剂。口服配制品可包括标准载体如药物级的甘露醇、乳糖、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的载体例如由E.W.Martin在Remington′sPharmaceutical Sciences中描述。这些组合物含有治疗有效量的化合物，优选纯化形式，及合适量的载体以提供正确给予患者的形式。所述配制品应适于给予模式。

在优选的实施方案中，所述组合物是根据用于静脉内给予人体的常规程序配制的。典型地，静脉内给予的组合物是于无菌等渗水相缓冲液中的溶液。如果需要，则所述组合物还可包括一种增溶剂和一种局部麻醉剂如利多卡因以减轻注射部位的疼痛。通常地，所述成分是单独或者混和在单位剂量形式中提供的，例如为在密封的容器中的干燥冻干粉末或者无水浓缩物，所述容器如标明活性剂的量的安瓿或者小袋。在所述组合物是通过注入给予的情况中，所述组合物可以分散在含有无菌药物级水或盐水的输液瓶中。在所述组合物是通过注射给予的情况中，可以提供一安瓿的无菌注射用水或盐水，以便所述成分可以在给予之前混和。水相载体如没有非挥发性热源的水、无菌水和抑菌水也适于形成可注射溶液。除了这些形式的水之外，可以使用一些其它的水相载体。这些载体包括可以灭菌的等渗注射组合物，如氯化钠溶液、林格液、葡萄糖溶液、葡萄糖和氯化钠溶液、及乳酸林格液。非水相载体如棉籽油、芝麻油或者花生油及酯类如豆蔻酸异丙酯也可以用作组合物的溶剂系统。再者，可以加入增强组合物稳定性、无菌性和等渗性的各种添加剂，包括抗菌防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。

本发明的化合物有效治疗、抑制和预防与表达SIGLEC-6相关的B细胞介导的疾病或失调或者与异常表达和/或活性相关的SIGLEC-6介导的疾病或失调的量，可以通过标准临床技术确定。另外，体外分析可任选地用于帮助鉴别最佳的剂量范围。配制品中应用的精确剂量也可以根据给予途径及疾病或失调的严重程度而定，并且应根据专业人员的判断及每个患者的情况而决定。可以从衍生自体外或者动物模型测试系统的剂量应答曲线外推得到有效剂量。

对于抗体而言，给予患者的剂量典型为0.1mg/kg至100mg/kg患者体重。优选地，给予患者的剂量在0.1mg/kg至20mg/kg患者体重范围之间，更优选为1mg/kg至10mg/kg患者体重。通常地，由于对外源多肽的免疫应答，人抗体在人体内较来自其它物种的抗体具有较长的半衰期。因此，通常可以以较低剂量及较低频率给予人抗体。

SIGLEC-6受体蛋白纯化

本发明的抗体也可以用于从重组细胞培养物、污染物和天然环境中分离和纯化SIGLEC-6受体蛋白的方法。所述方法包括将含有SIGLEC-6受体蛋白的组合物和污染物暴露于能结合该受体的抗-SIGLEC-6抗体，使得SIGLEC-6受体蛋白与所述抗体结合，从污染物中分离抗体-受体复合物，以及从所述复合物中回收SIGLEC-6受体蛋白。

也可以应用本领域已知的各种纯化方法，例如从重组细胞培养物或者天然来源中回收SIGLEC-6受体蛋白的亲和纯化方法。在这种方法中，使用本领域熟知的方法将针对SIGLEC-6的抗体固定在合适的支持物如Sephadex树脂或者滤纸上。然后将固定的抗体与含有要纯化的SIGLEC-6受体蛋白的样品组合物或者溶液接触。将该支持物用能基本除去样品中除了与固定的抗体结合的SIGLEC-6受体蛋白之外的所有物质的合适溶剂洗涤。最后，将该支持物用另一种合适的溶剂洗涤，所述溶剂从所述抗体中除去SIGLEC-6受体蛋白。

敲除动物

另一方面，本发明提供了一种敲除动物，其基因组中在其内源SIGLEC-6受体基因中具有杂合的或者纯合的破坏(disruption)，所述破坏抑制或者阻止生物学功能性SIGLEC-6受体蛋白的表达。优选地，本发明的敲除动物在其内源SIGLEC-6受体基因中具有纯合破坏。优选地，本发明的敲除动物是小鼠。所述敲除动物可以使用本领域技术人员已知的技术容易地产生。基因破坏可以一些方式实现，包括将终止密码子导入多肽编码序列的任何部分中以产生生物学失活的多肽，在启动子或其它调节序列中导入突变以抑制或阻止多肽表达，将外源序列插入基因中以使基因失活，及在基因中缺失序列。

可利用一些技术将特异性DNA序列导入哺乳动物种系中，以实现这些序列(转基因)稳定传递至每个随后的世代中。最常用的技术使将DNA直接显微注射进受精的卵母细胞的前核中。衍生自这些卵母细胞的小鼠或其它动物以大约10-20％的频率成为转基因动物始祖，其通过繁殖将产生不同转基因小鼠品系。通过胚胎处理和显微注射产生转基因动物特别是如小鼠动物这样的动物的方法已经是本领域常规方法，例如美国专利No.4,736,866、4,870,009和4,873,191及Hogan，B.，Manipulating the MouseEmbryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)所述。相似方法用于产生其它转基因动物。

胚胎干细胞(ES细胞)技术可用于产生具有特异性缺失的基因的敲除小鼠(及其它动物)。将可以在体外培养并遗传修饰的全能胚胎干细胞聚集在或者显微注射进小鼠胚胎中，以产生可以将这些遗传修饰传递至其子代的嵌合小鼠。通过直接繁殖，可以获得缺乏这种基因的小鼠。其它一些方法可用于产生遗传修饰的动物，例如细胞质内精子注射技术(ICSI)可用于产生转基因小鼠。这种方法需要将精母细胞的头部注射进未受精的卵母细胞的细胞质中，使得该卵母细胞受精，随后激活植入前胚胎的适当细胞分裂。将由此获得的小鼠胚胎转移至代孕雌性受体中。该雌性动物产生一窝小鼠。在用于生产转基因小鼠的ICSI中，将精子或者精母细胞头部悬浮液与含有希望的DNA分子(转基因)的溶液一起温育。这些将与一旦显微注射即成为外源DNA的载体的精子相互作用。一旦位于卵母细胞内部，则该DNA被整合进基因组中，产生转基因小鼠。这种方法与迄今为止使用传统的前核显微注射方案获得的那些结果相比更高产量(高于80％)地产生转基因小鼠。

本发明可通过如下实施例得以进一步例证，这些实施例只是例证本发明，而无限制本发明范围之意。

实施例

实施例1：肥大细胞差异表达的SIGLEC-6的鉴别

对非冗余的人蛋白质数据库IPI(Internation Protein Index)检索含有如下成分的新分子：1)至少一个免疫球蛋白(Ig)结构域，2)至少一个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)，和3)一个跨膜区。这些特征由介导免疫系统功能的许多信号激活受体所共有。使用基于Hidden MarkovModel(HMM)的方法进行Ig-结构域检索。由113个确信的Ig结构域的排列所构建并用HMMER程序校准的所述HMM得自Pfam(version 6.6)数据库。

为了检索含有ITIM基序的蛋白质，首先基于ITIM基序的共有特征构建PROSITE-格式化的基序谱，并使用软件“seedtop”(NCBI)进行检索。

使用软件TMHMM版本2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)对所有IPI蛋白均进行大规模跨膜区预测。

发现Siglec-6cDNA序列符合所有三个标准。

实施例2：微阵列分析

将RNA样品送往Expression Analysis进行微阵列实验以逆转Northern(B.Phimister，Nature Genetics supplement，21：1，1999)。将cDNA样品进行标记并与Human Genome U133 Plus 2.0 Array GeneChip杂交。每个杂交获得的原始数据是黑白混杂的图像，然后将其转移并通过Affymetrix 5.0 ArraySuite软件分析。这个软件应用统计学算法计算阵列上每个转录体的定量值(信号强度)和定性值(存在或不存在)。

实施例3：SIGLEC-6mRNA表达的实时定量PCR分析

在选择后基于SIGLEC-6核苷酸序列使用Primer Express 2.0(AppliedBiosystems，Inc.)合成两个寡核苷酸引物：

5′TGGAGCTGCC TCAAGTAGGG 3′(SEQ ID NO 3)和

5′CGCGGCAGGT GAAATCTCCT 3′(SEQ ID NO 4)，

然后用于监测SIGLEC-6的表达。

使用SYBR Green试剂，利用ABI Prism 7900(Applied Biosystems，Inc.)序列检测系统，根据厂商指导进行实时定量PCR。分离总RNA以测定如下细胞中的SIGLEC-6mRNA水平：Daudi(衍生自Burkitt′s淋巴瘤的B淋巴母细胞系，ATCC No.CCL-213)，THP-1(单核细胞白血病细胞系，ATCC No.TIB202)，HMC-1，(母细胞瘤(mastoma)细胞系)；周围血单核细胞(PBMC)；原代单核细胞；原代B细胞；原代中性粒细胞；体外培养8-9周的肥大细胞。来自脑、心脏、肾、肝、肺、脾、胸腺和气管的第一cDNA链得自BD Bioscience Clontech(Palo Alto，CA)。

将等量的来自上述细胞的每一种RNA用于逆转录反应中以产生第一链cDNA，其在定量PCR反应中用作模板以获得扩增循环阈值(C_t)。使用来自18S RNA的对照C_t将所述C_t标准化以获得ΔC_t。为了对比不同细胞和组织中的SIGLEC-6基因表达的相对水平，使用最低表达水平作为基数计算ΔΔC_t值，然后转变为相关表达差异值。

定量RT-PCR分析示出SIGLEC-6mRNA在人肥大细胞中无论是在原代细胞培养物还是在母细胞瘤细胞系中均以极高水平表达(表1)。

表1：通过定量RT-PCR评估的SIGLEC-6mRNA的表达概况

组织/细胞	Ct	相对表达
			脑	33.0	7.9
心	32.1	13.7
			肾	33.1	6.6

肝	35.9	1.0
			肺	31.4	22.5
脾	29.1	105.7
			胸腺	30.2	50.1
气管	29.8	68.5
			PBMC培养物(1)	28.4	117.4
PBMC培养物(2)	28.7	96.6
			中性粒细胞培养物(1)	33.6	3.3
中性粒细胞培养物(2)	33.0	6.1
			肥大细胞培养物(1)	20.5	26354.1
肥大细胞培养物(2)	19.9	38402.0
			THP细胞系	28.5	100.0
Daudi细胞系	34.6	1.6
			单核细胞培养物	33.3	4.9
HPB-All T细胞系	33.7	3.2
			HMC-1肥大细胞系	20.3	31908.0

实施例4：SIGLEC-6的表达构建体

将SIGLEC-6的编码序列(SEQ ID NO：1)使用Siglec-6序列的两个寡核苷酸引物进行PCR扩增：

5′CACCATGCTA CCGCTGCTGC TGA(SEQ ID NO：5)

3′：TCACTTGTGT ATCTTGATTT CTG(SEQ ID NO：6)

并克隆进在C末端融合了V5标记的pcDNA3.1D/V5-His载体(Invitrogen)中。将所得克隆pSiglec-6-V5瞬时转染进293T细胞中。在转染48小时后，收获转染的细胞并通匀浆或者冷冻-解冻方法分成膜和胞质级分。使用抗-V5Mab和抗小鼠IgG缀合物进行Western印迹分析。SIGLEC-6主要表达为55kDa蛋白质，大于计算的50kDa分子量，提示SIGLEC-6也许被翻译后修饰，例如通过糖基化修饰。Patel et al.(J.Biol.Chem.，见上)报道了胞外结构域内的7个可能的糖基化位点(见图2，黑体字序列)。

经核实SIGLEC-6表达构建体的序列与NM_001245(GenBank登记号)相同。

实施例5：针对SIGLEC-6的诊断分析

为了确定SIGLEC-6蛋白是否在细胞中表达，可以使用全血、分离的周围血单核细胞或者在组织如淋巴结中进行免疫荧光实验。将大约25,000个细胞通过细胞离心涂片法(cytospin)涂片于载玻片上并风干。将细胞在室温用Carnoy′s Fix(60％乙醇，30％氯仿和10％乙酸)固定10分钟，用PBS洗涤3次。将细胞在冰上用封闭溶液(于PBS中的1％马血清，2％兔血清，1％BSA和1％山羊血清)预封闭30分钟，并与抗-SIGLEC-6mAb(于PBS中于1％BSA中1μg/ml)在室温温育30分钟。然后将细胞洗涤3次并与1∶100稀释的山羊抗小鼠IgG(H+L)-FITC(Jackson Immuno Lab)在室温温育30分钟。洗涤细胞、风干并用盖玻片覆盖。使用荧光显微镜检测荧光染色，并用Snap-Shot软件记录结果。

为了进行FACS染色，洗涤分离的细胞并与封闭缓冲液(于PBS中的1％马血清，2％兔血清，1％BSA和1％山羊血清)在4℃预温育30分钟。然后将细胞与FITC缀合的抗-SIGLEC-6mAb(10μg/ml)或者在相同缓冲液中温育30分钟。或者，可以首先将细胞用未缀合的抗-SIGLEC-6mAb染色，随后用FITC或PE缀合的抗小鼠IgG染色。在洗涤3次后，将细胞固定在具有1％多聚甲醛的1×PBS中。样品通过FACScan(BectonDickinson，Franklin Lakes，NJ)进行分析。

为了进行免疫组织化学分析，使用人体组织的10％福尔马林固定的及石蜡包埋的或者低温丙酮固定的系列切片。将石蜡包埋的组织样品脱蜡、再水合、在室温在含有2％正常山羊血清的PBS中温育30分钟、然后在4℃在含有10μg/ml纯化的抗-SIGLEC-6抗体或者0.5μg/ml的细胞标记物的mAb(Chemicon International，Temecula，CA clone#G3，MAB 1222)的缓冲液中温育过夜。洗涤样品，在室温在含有AP标记的山羊抗小鼠IgG的缓冲液中温育1小时，在PBS中洗涤两次，并在室温在碱性磷酸酶底物溶液(Pierce，Rockford，IL；Cat#34034)中温育15分钟。将抗体染色的组织切片用Gill′s苏木精复染，并用Immu-Mount(Shandon，Pittsburgh，PA)覆盖。

实施例6：免疫组织化学

对细胞进行分级分离导致SIGLEC-6存在于膜级分中，而在胞质级分中极少。为了进一步确认SIGLEC-6在细胞表面上表达，将三个细胞系(CBMC、LAD2和HMC-1)用PE缀合的小鼠抗人SIGLEC-6抗体进行免疫染色。FACS分析结果示于图4，证实SIGLEC-6在这些细胞的表面上表达。

另外，对得自位于Cooperative Human Tissue Network(CHTN)，Soutem division，University of Alabama，Birmingham的人肺和气管组织样品中的肥大细胞分析SIGLEC-6的存在情况。使用10％福尔马林固定的和石蜡包埋的或者低温丙酮固定的人气管和肺组织系列切片。将每个石蜡包埋的组织样品脱蜡、再水合、在室温在含有2％正常山羊血清的PBS中温育30分钟，然后在4℃在含有10μg/ml纯化的抗人SIGLEC-6抗体(BD Phanningen^TM clone# E20-1232)或者0.5μg/ml抗人类胰蛋白酶抗体(Chemicon International，Temecula，CA clone #G3，MAB 1222)的缓冲液中温育过夜。洗涤样品，在室温在含有AP标记的山羊抗小鼠IgG的缓冲液中温育1小时，在PBS中洗涤两次，并在室温在碱性磷酸酶底物溶液(Pierce，Rockford，IL；Cat#34034)中温育15分钟。将抗体染色的组织切片用Gill′s苏木精复染及用Immu-Mount(Shandon，Pittsburgh，PA)覆盖。

用抗SIGLEC-6抗体染色的细胞也示出用抗类胰蛋白酶(一种确定的肥大细胞的细胞标记物)染色，表明SIGLEC-6在这些组织样品中的肥大细胞上表达。组织肥大细胞上SIGLEC-6的检测与先前FACS结果一致，表明这种蛋白质在培养的人肥大细胞以及LAD2细胞上表达。

实施例7：抗-SIGLEC-6抗体产生及筛选

本发明的抗-SIGLEC-6抗体可以通过本领域熟知的传统杂交瘤技术产生。简而言之，将小鼠用体外合成自实施例4中产生的表达构建体的SIGLEC-6进行免疫。将免疫原在完全弗氏佐剂中乳化，并经皮下或者腹膜内注射10-100μg。10-15天后，将免疫的动物用在不完全弗氏佐剂中乳化的另外的SIGLEC-6加强。之后每一周至两周将小鼠定期加强免疫。

另外，抗体也可以通过给予实施例4的cDNA构建体而产生，并且SIGLEC-6的体内表达在免疫的小鼠中诱导对所述蛋白质的免疫应答。

然后将这两种类型的小鼠均用于产生杂交瘤。为了进行每种融合，从免疫的小鼠的脾中制备单细胞悬浮液并用于与SP2/0骨髓瘤细胞融合。SP2/0细胞(1×10⁸)和脾细胞(1×10⁸)在含有50％聚乙二醇(M.W.1450)(Kodak，Rochester，NY)和5％二甲亚砜(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)的培养基中融合。然后将细胞调节为于DMEM培养基(Gibco，GrandIsland，NY)中的1.7×10⁵个脾细胞/ml的悬浮液，培养基中补加5％胎牛血清和HAT(10mM次黄嘌呤钠，40μM氨基蝶呤及1.6mM胸苷)。将250μl细胞悬浮液加入到大约50个96孔微量测试平板的每个孔中。10天后，提取培养物上清，通过ELISA对与纯化的人SIGLEC-6的反应性进行筛选。

将Immulon II(Dynatech Laboratories，Chantilly，VA)微量测试平板的孔用0.1μg/ml(50μl/孔)的人SIGLEC-6包被过夜。然后将孔中非特异性结合部位通过与于PBS中的200μl的5％BLOTTO(脱脂奶粉)温育1小时而饱和。然后将孔用PBST缓冲液(含有0.05％TWEEN20的PBS)洗涤。将每个融合孔的50μl培养上清与50μl BLOTTO一起在室温加入包被的孔中1小时。将所述孔用PBST洗涤。然后通过与稀释的辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗小鼠IgG(Fc特异性)(Jackson InmunoResearchLaboratories，West Grove，PA)在室温反应1小时而检测结合的抗体。然后将孔用PBST洗涤。向孔中加入含有于0.1M乙酸钠pH 6.0中0.1％的3，3，5，5-四甲基联苯胺(Sigma，St.Louis，MO)和0.003％过氧化氢(Sigma，St.Louis，MO)的过氧化物酶底物溶液30分钟以生色。反应通过加入50μl的2M H₂SO₄/孔而终止。使用ELISA读数器(Dynatech Laboratories，Chantilly，VA)在450nm读出光密度(OD)。

SIGLEC-6反应性阳性的孔中的杂交瘤是通过限制稀释方法克隆的单一细胞。然后将单克隆杂交瘤扩增，收集培养物上清以通过蛋白A层析进行纯化。然后鉴定纯化的抗体以通过BIAcore确定亲和性及动力学结合常数及鉴定对肥大细胞释放组胺的作用。

根据本领域使用的标准方案对分离的单克隆抗-Siglec-6抗体测序。如下示出了单克隆抗体Mab 239-90的轻链(kappa)和重链(H)可变区的核苷酸和氨基酸序列，下划线处为互补决定区(CDR)：

轻链可变区(Kappa)：

gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc

atctcctgca aggccagcca aaatgttgat tatgatggtg acagttatat gaactggtac

caacagaaac cagggcagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcgtccaa tctagaatct

gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat

cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtgg

acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa(SEQ ID NO：7)

DIVLTQSPASLAVSLGQRATISC KASQNVDYDGDSYMNWYQQKPGQP

PKLLIY AASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC QQSN

EDPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO：8)

重链可变区：

cagctgcagc agtctggacc tgagctggtg aggcctggga cttcagtgaa gatttcctgc

aaggcttctg cctatacctt cctcacctac tacatgaact gggtgaagca gaggcctgga

cagggccttg agtggattgg acagattttt cctgcaagtg gtagtactaa ctacaatgag

atgttcaagg gcaaggccac attgactgta gacacatcct ccagcacagc ctacatactg

ctaaacagcc tgacatctga ggactctgcg gtctatttct gtacaagatc tttcgggggg

gggtttgctt actggggcca agggactctg gtcactgtct ctgca(SEQ ID NO：9)

QVQLQQSGPELVRPGTSVKISCKAS AYTFLTYYMNWVKQRPGQGLE

WIG QIFPASGSTNYNEMFKGKATLTVDTSSSTAYILLNSLTSEDSAVYFC

TR SFGGGFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO：10)

下划线区域相应于Kabat CDR，如下所示：

对于轻链(kappa)：

Vk-CDR1：

aaggccagce aaaatgttga ttatgatggt gacagttata tgaac(SEQ ID NO：11)；

KASQNVDYDGDSYMN(SEQ ID NO：12)；

Vk-CDR2：

gctgcgtcca atctagaatc t(SEQ ID NO：13)；

AASNLES(SEQ ID NO：14)；

Vk-CDR3：

cagcaaagta atgaggatcc gtggacg(SEQ ID NO：15)；

QQSNEDPWT(SEQ ID NO：16)；

对于重链：

Vh-CDR1：

gcctatacct tcctcaccta ctacatgaac(SEQ ID NO：17)

AYTFLTYYMN(SEQ ID NO：18)；

Vh-CDR2：

cagatttttc ctgcaagtgg tagtactaac tacaatgaga tgttcaaggg c(SEQ ID NO：19)

QIFPASGSTNYNEMFKG(SEQ ID NO：20)；

Vh-CDR3：

tctttcgggg gggggtttgc ttac(SEQ ID NO：21)

SFGGGFAY(SEQ ID NO：22)

实施例8：对SIGLEC-6肥大细胞脱粒的作用

将人脐带血CD34⁺细胞(Bio-Whittaker，Walkersville，MD)在由RPMI1640(Invitrogen)补加10％FBS(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、2mM L-谷氨酰胺、50μM 2-ME、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、1μg/ml庆大霉素、100ng/ml SCF、50ng/ml IL-6和10ng/ml IL-10组成的的培养基中培养7周。将细胞用抗类胰蛋白酶mAb染色，以确定肥大细胞的百分比。将细胞悬浮液最初以5×10⁵个细胞/ml密度接种，一周一次替换补加细胞因子的培养基。

使用如下方案通过FcγRI交联激活具有SIGLEC-6的人CBMC。将如上述培养的CBMC以10,000个细胞/100μl/孔的密度接种在微量滴定平板中。将细胞用15ng/ml的人rIFN-γ处理48小时。然后将细胞在37℃与小鼠抗人FcγRI F(ab′)₂在存在抗-SIGLEC-6抗体(2或10μg/ml)或者存在不相关的肥大细胞特异性蛋白质作为阴性对照的条件下温育1小时。将平板在1000rpm离心2分钟，除去上清。加入100μl的新鲜培养基，随后加入10μg/ml的山羊抗小鼠IgG F(ab′)₂，将平板温育2小时。收集上清，测定由于交联引起的组胺释放量。

使用得自Beckman Coulter(Fullerton，CA)的标准试剂和方案进行组胺释放分析。简而言之，收获激活的CBMC上清，使用组胺免疫分析试剂盒(Beckman-Coulter，Palatine，IL)根据厂商指导测定其组胺含量。所述免疫分析基于待分析的组胺与组胺-碱性磷酸酶缀合物之间的竞争。细胞上清中存在的组胺用酰化试剂在略碱性pH下酰化，加入到用抗组胺抗体包被的微量滴定平板孔上。将微量滴定孔用限制数目的抗体包被，以使得在缀合物与样品中乙酰化的组胺之间发生竞争。在4℃温育2小时后，对孔进行漂洗以除去未结合的成分。结合的酶活性通过加入生色底物(pNPP)测定。颜色强度与样品中组胺的浓度成反比。释放的组胺基于用试剂盒中提供的标准物获得的标准曲线计算。

这个交联实验结果示于图5。如果发生交联，则组胺将从CBMC中释放。如所观查到的，C-Kit(在CBMC上表达)和不相关抗体在有或无FcγRI存在的条件下对细胞的组胺释放量均无影响。相反，抗-SIGLEC-6能以剂量依赖性方式抑制释放的组胺量。

实施例9：ADCC分析

进行ADCC功能分析以筛选抗-SIGLEC-6单克隆抗体候选物。将靶细胞(如CBMC或LAD2)用100μCi⁵¹Cr标记60分钟，人PBMC用作效应细胞。将靶细胞(5×10³/孔)与效应细胞以各种E”T比率在96孔U形底平板中一式三份与SIGLEC-6(2μg/孔；Roche)或者对照抗体在200μl的RPMI 1640中在37℃共温育6小时。然后用γ计数仪测定上清(100μl)的放射性。根据如下算式计算特异性裂解的百分比：％特异性裂解＝100×(实验cpm-自发cpm)/(最大cpm-自发cpm)。对照组包括将靶细胞不与抗体或者与不相关的抗体一起温育。

实施例10：增殖/抑制分析

在肥大细胞系LAD2细胞上测试抗-SIGLEC-6单克隆抗体，以测定其对细胞增殖和抑制的作用。将H3-dCTP加入存在各种浓度抗-SIGLEC-6抗体的LAD2细胞培养基中培养7天。洗涤细胞以除去未掺入的H3-dCTP，将细胞用10％TCA固定，之后通过闪烁计数仪测定掺入水平。H3-dCTP掺入的增加提示抗SIGLEC-6抗体对人肥大细胞的增殖作用，H3-dCTP掺入的降低表示抗SIGLEC-6抗体对人肥大细胞的抑制作用。

实施例11：肥大细胞的细胞凋亡

膜联蛋白V(Annexin V)(一种细胞凋亡的细胞标记物)可用于检测抗-SIGLEC-6单克隆抗体对于肥大细胞凋亡过程是否具有生物学作用。FITC-缀合的抗-膜联蛋白V用于对与抗-SIGLEC-6抗体候选物温育24小时后的人CBMC进行FACS染色。任何细胞表面膜联蛋白V表达水平均提示对于肥大细胞凋亡的抗-SIGLEC-6抗体作用。

实施例12：激动剂筛选

由于SIGLEC-6分子在C末端酪氨酸位点具有两个ITIM结构域，因此一种抗体导致的任何酪氨酸磷酸化均是激动剂的指征。

这个实验如下述程序进行：用抗-SIGLEC-6单克隆抗体候选物对肥大细胞或者肥大细胞系如LAD2在正常细胞培养条件下处理5分钟，然后使细胞裂解，将细胞裂解物进行Western印迹，用单克隆抗磷酸酪氨酸探查印迹。与在没有抗体存在的条件下生长的相似细胞培养物相比，基于结合而导致SIGLEC-6胞质结构域蛋白质酪氨酸磷酸化的抗体候选物将被认为具有激动剂作用。

                            序列表

<110>泰勒公司

<120>SIGLEC-6相关疾病的诊断和治疗

<130>CASE1065

<140>PCT/US2005/020271

<141>2005-06-09

<150>US 60/578,194

<151>2004-06-09

<150>US 60/580,422

<151>2004-06-17

<160>22

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1711

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<221>misc_feature

<222>(1645)..(1645)

<223>n is a，c，g，or t

<400>1

cattgtgttg gggcccagga agcctccgcc tcagagatgc taccgctgct gctgcccctg    60

ctgtgggcag gggccctggc tcaggagcgg agattccagc tggaggggcc agagtcactg    120

acggtgcagg agggtctgtg cgtcctcgta ccctgcagat tgcccactac ccttccagcc    180

tcgtactatg gttatggcta ctggttcctg gaaggggctg atgttccagt ggccacaaac    240

gacccagacg aagaagtgca ggaggagacc cggggccgat tccacctcct ctgggatccc    300

agaaggaaga actgctccct gagcatcaga gatgcccgga ggagggacaa tgctgcatac    360

ttctttcggt tgaagtccaa atggatgaaa tacggttata catcttccaa gatatatgtg    420

cgtgtgatgg ccctgaccca caggcccaac atctccatcc caggacctgg agtctggcca    480

tccagcaatc tgacctgctc tgtgccctgg gtctgtgagc aggggacgcc ccccatcttc    540

tcctggatgt cagctgcccc ccacctcctg ggccccagga ccacccagtc ctcggtgctc    600

acaatcaccc cggcccagga ccacagcacc aacctcacct gtcaggtgac gttccctgga    660

gccggtgtga ccatggagag aaccatccag ctcaatgtct cctatgctcc acagaaagtg    720

gccatcagca tcttccaagg aaacagcgca gccttcaaaa tcctgcaaaa cacctcgtcc    780

ctccctgtcc tggagggcca ggctctgcgg ctgctctgtg atgctgacgg caacccccct    840

gcacacctga gctggttcca gggcttcccc gccctgaacg ccacccccat ctccaatacc    900

ggggtcctgg agctgcctca agtagggtct gcagaagaag gagatttcac ctgccgtgct    960

cagcatcctc tgggctccct gcaaatctct ctgagtctct ttgtgcattg gaaaccagaa    1020

ggcagggctg gtggtgtcct gggagcagtc tggggagcta gcatcacaac cctggttttc    1080

ctctgtgttt gcttcatctt cagagtgaag actagaagga agaaagcagc ccagccagtg    1140

caaaacacgg atgatgtgaa ccccgtcatg gtctcaggct ccaggggtca tcagcaccag    1200

ttccagacag gcatagtttc agaccaccct gctgaggctg gccccatctc agaagatgag    1260

caggagctcc actacgctgt cctacacttc cacaaggtgc aacctcagga accaaaggtc    1320

accgacactg agtactcaga aatcaagata cacaagtgag gaattgtcca aagcataacc    1380

ttgattggag agacatgggt acctctcagt gtattggtta ctagggctgc cacagcaatg    1440

taccacaaac cgagtgacat aaacacagaa ctttattttc gatagtttca gatgttagag    1500

gtctgagaac aaggtgttat cagggttggt cccttctaag gcctctcttg ttggctttga    1560

gatggctgtc tcctccttgt gtcttcacat ggtctttcct ctgagtgtgt ttgtgtccta    1620

atcttctctt cttataaaga cactnagtca tattggatta gggcctcccc atgacctaat    1680

ttaaataaat taactattta aagaccctcc a                                   1711

<210>2

<211>440

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>2

Met Leu Pro Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala Gln

1               5                   10                  15

Glu Arg Arg Phe Gln Leu Glu Gly Pro Glu Ser Leu Thr Val Gln Glu

            20                  25                  30

Gly Leu Cys Val Leu Val Pro Cys Arg Leu Pro Thr Thr Leu Pro Ala

        35                  40                  45

Ser Tyr Tyr Gly Tyr Gly Tyr Trp Phe Leu Glu Gly Ala Asp Val Pro

    50                  55                  60

Val Ala Thr Asn Asp Pro Asp Glu Glu Val Gln Glu Glu Thr Arg Gly

65                  70                  75                  80

Arg Phe His Leu Leu Trp Asp Pro Arg Arg Lys Asn Cys Ser Leu Ser

                85                  90                  95

Ile Arg Asp Ala Arg Arg Arg Asp Asn Ala Ala Tyr Phe Phe Arg Leu

            100                 105                 110

Lys Ser Lys Trp Met Lys Tyr Gly Tyr Thr Ser Ser Lys Ile Tyr Val

        115                 120                 125

Arg Val Met Ala Leu Thr His Arg Pro Asn Ile Ser Ile Pro Gly Pro

    130                 135                 140

Gly Val Trp Pro Ser Ser Asn Leu Thr Cys Ser Val Pro Trp Val Cys

145                 150                 155                 160

Glu Gln Gly Thr Pro Pro Ile Phe Ser Trp Met Ser Ala Ala Pro His

                165                 170                 175

Leu Leu Gly Pro Arg Thr Thr Gln Ser Ser Val Leu Thr Ile Thr pro

            180                 185                 190

Ala Gln Asp His Ser Thr Asn Leu Thr Cys Gln Val Thr Phe Pro Gly

        195                 200                 205

Ala Gly Val Thr Met Glu Arg Thr Ile Gln Leu Asn Val Ser Tyr Ala

    210                 215                 220

Pro Gln Lys Val Ala Ile Ser Ile Phe Gln Gly Asn Ser Ala Ala Phe

225                 230                 235                 240

Lys Ile Leu Gln Asn Thr Ser Ser Leu Pro Val Leu Glu Gly Gln Ala

                245                 250                 255

Leu Arg Leu Leu Cys Asp Ala Asp Gly Asn Pro Pro Ala His Leu Ser

            260                 265                 270

Trp Phe Gln Gly Phe Pro Ala Leu Asn Ala Thr Pro Ile Ser Asn Thr

        275                 280                 285

Gly Val Leu Glu Leu Pro Gln Val Gly Ser Ala Glu Glu Gly Asp Phe

    290                 295                 300

Thr Cys Arg Ala Gln His Pro Leu Gly Ser Leu Gln Ile Ser Leu Ser

305                 310                 315                 320

Leu Phe Val His Trp Lys Pro Glu Gly Arg Ala Gly Gly Val Leu Gly

                325                 330                 335

Ala Val Trp Gly Ala Ser Ile Thr Thr Leu Val Phe Leu Cys Val Cys

            340                 345                 350

Phe Ile Phe Arg Val Lys Thr Arg Arg Lys Lys Ala Ala Gln Pro Val

        355                 360                 365

Gln Asn Thr Asp Asp Val Asn Pro Val Met Val Ser Gly Ser Arg Gly

    370                 375                 380

His Gln His Gln Phe Gln Thr Gly Ile Val Ser Asp His Pro Ala Glu

385                 390                 395                 400

Ala Gly Pro Ile Ser Glu Asp Glu Gln Glu Leu His Tyr Ala Val Leu

                405                 410                 415

His Phe His Lys Val Gln Pro Gln Glu Pro Lys Val Thr Asp Thr Glu

            420                 425                 430

Tyr Ser Glu Ile Lys Ile His Lys

        435                 440

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>ARTIFICIAL

<220>

<223>OLIGONUCLEOTIDE PRIMER FOR SIGLEC-6

<400>3

tggagctgcc tcaagtaggg                                            20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>ARTIFICIAL

<220>

<223>OLIGONUCLEOTIDE PRIMER FOR SIGLEC-6

<400>4

cgcggcaggt gaaatctcct                                            20

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>ARTIFICIAL

<220>

<223>OLIGONUCLEOTIDE PRIMER FOR SIGLEC-6

<400>5

caccatgcta ccgctgctgc tga                                        23

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>ARTIFICIAL

<220>

<223>OLIGONUCLEOTIDE PRIMER FOR SIGLEC-6

<400>6

tcacttgtgt atcttgattt ctg                                        23

<210>7

<211>333

<212>DNA

<213>Mus musculus

<400>7

gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc    60

atctcctgca aggccagcca aaatgttgat tatgatggtg acagttatat gaactggtac    120

caacagaaac cagggcagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcgtccaa tctagaatct    180

gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat    240

cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtgg    300

acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa                                 333

<210>8

<211>111

<212>PRT

<213>Mus musculus

<400>8

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1               5                   10                  15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Tyr Asp

            20                  25                  30

Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

        35                  40                  45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

    50                  55                  60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65                  70                  75                  80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

                85                  90                  95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

            100                 105                 110

<210>9

<211>345

<212>DNA

<213>Mus musculus

<400>9

cagctgcagc agtctggacc tgagctggtg aggcctggga cttcagtgaa gatttcctgc    60

aaggcttctg cctatacctt cctcacctac tacatgaact gggtgaagca gaggcctgga    120

cagggccttg agtggattgg acagattttt cctgcaagtg gtagtactaa ctacaatgag    180

atgttcaagg gcaaggccac attgactgta gacacatcct ccagcacagc ctacatactg    240

ctaaacagcc tgacatctga ggactctgcg gtctatttct gtacaagatc tttcgggggg    300

gggtttgctt actggggcca agggactctg gtcactgtct ctgca                    345

<210>10

<211>117

<212>PRT

<213>Mus musculus

<400>10

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr

1               5                   10                  15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Ala Tyr Thr Phe Leu Thr Tyr

            20                  25                  30

Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

        35                  40                  45

Gly Gln Ile Phe Pro Ala Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Met Phe

    50                  55                  60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Ile Leu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

                85                  90                  95

Thr Arg Ser Phe Gly Gly Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

            100                 105                 110

Val Thr Val Ser Ala

        115

<210>11

<211>45

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Nucleic Acid Sequence of Light Chain CDRl of MAb 239-90

<400>11

aaggccagcc aaaatgttga ttatgatggt gacagttata tgaac                45

<210>12

<211>15

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<223>Amino Acid Sequence of Light Chain CDRl of MAb 239-90

<400>12

Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn

1               5                   10                  15

<210>13

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Nucleic Acid Sequence of Light Chain CDR2 of MAb 239-90

<400>13

gctgcgtcca atctagaatc t                                          21

<210>14

<211>7

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<223>Amino Acid Sequence of Light Chain CDR2 of MAb 239-90

<400>14

Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser

1               5

<210>15

<211>27

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Nucleic Acid Sequence of Light Chain CDR3 of MAb 239-90

<400>15

cagcaaagta atgaggatcc gtggacg                                    27

<210>16

<211>9

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<223>Amino Acid Sequence of Light Chain CDR3 of MAb 239-90

<400>16

Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Trp Thr

1               5

<210>17

<211>30

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Nucleic Acid Sequence of Heavy Chain CDR1 of MAb 239-90

<400>17

gcctatacct tcctcaccta ctacatgaac                                 30

<210>18

<211>10

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<223>Amino Acid Sequence of Heavy Chain CDR1 of MAb 239-90

<400>18

Ala Tyr Thr Phe Leu Thr Tyr Tyr Met Asn

1               5                   10

<210>19

<211>51

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Nucleic Acid Sequence of Heavy Chain CDR2 of MAb 239-90

<400>19

cagatttttc ctgcaagtgg tagtactaac tacaatgaga tgttcaaggg c         51

<210>20

<211>17

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<223>Amino Acid Sequence of Heavy Chain CDR2 of MAb 239-90

<400>20

Gln Ile Phe Pro Ala Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Met Phe Lys

1               5                   10                  15

Gly

<210>21

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Nucleic Acid Sequence of Heavy Chain CDR3 of MAb 239-90

<400>21

tctttcgggg gggggtttgc ttac                                       24

<210>22

<211>8

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<223>Amino Acid Sequence of Heavy Chain CDR3 of MAb 239-90

<400>22

Ser Phe Gly Gly Gly Phe Ala Tyr

1               5

Claims (74)

1.一种结合SIGLEC-6的抗体或其片段，其中所述抗体包含与SEQID NO：12、14、16、18、20或22具有至少大约80％序列相同性的超变区。

2.权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体包含与SEQ ID NO：12、14、16、18、20或22具有至少大约90％序列相同性的超变区。

3.权利要求2的抗体或其片段，其中轻链包含选自Vk-CDR1(SEQ IDNO：12)、Vk-CDR1(SEQ ID NO：14)和Vk-CDR3(SEQ ID NO：16)的超变区。

4.权利要求2的抗体或其片段，其中重链包含选自Vh-CDR1(SEQ IDNO：18)、Vh-CDR1(SEQ ID NO：20)和Vh-CDR3(SEQ ID NO：22)的超变区。

5.权利要求3的抗体或其片段，其中重链包含选自Vh-CDR1(SEQID NO：18)、Vh-CDR1(SEQ ID NO：20)和Vh-CDR3(SEQ ID NO：22)的超变区。

6.权利要求2的抗体或其片段，其中轻链包含Vk-CDR1(SEQ ID NO：12)、Vk-CDR1(SEQ ID NO：14)和Vk-CDR3(SEQ ID NO：16)。

7.权利要求2的抗体或其片段，其中重链包含Vh-CDR1(SEQ IDNO：18)、Vh-CDR1(SEQ ID NO：20)和Vh-CDR3(SEQ ID NO：22)。

8.权利要求6的抗体或其片段，其中重链包含Vh-CDR1(SEQ ID NO：18)、Vh-CDR1(SEQ ID NO：20)和Vh-CDR3(SEQ ID.NO：22)。

9.权利要求1或2的抗体或其片段，其中重链和轻链包含人构架区。

10.权利要求8的抗体或其片段，其中轻链包含SEQ ID NO：8所示的轻链可变区。

11.权利要求8的抗体或其片段，其中重链包含SEQ ID NO：10所示的重链可变区。

12.权利要求10的抗体或其片段，其中重链包含SEQ ID NO：10所示的重链可变区。

13.上述任一项权利要求的抗体或其片段，进一步包含一个恒定区。

14.权利要求13的抗体或其片段，其中轻链和重链可变区与恒定区连接。

15.权利要求1的抗体或其片段的可变轻链或重链。

16.编码权利要求15的可变轻链和/或重链的分离的核酸。

17.包含权利要求16的分离的核酸的组合物。

18.包含权利要求16的分离的核酸的细胞。

19.一种抗体或其片段，其特异性结合SIGLEC-6中的与包含具有SEQ ID NO：12、14、16的CDR的轻链和具有SEQ ID NO：18、20和22的CDR的重链的抗体所结合的表位相同的表位。

20.权利要求1或2的抗体，其中所述抗体是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体或者单结构域抗体。

21.一种组合物，其包含权利要求1或2的抗体及合适的载体、佐剂、稀释剂、赋形剂和/或添加剂。

22.一种产生重链或轻链或其片段的方法，包括将权利要求18的细胞在适合重链或轻链表达的条件下培养，及从细胞培养物中纯化所述重链或轻链。

23.一种产生重链和轻链或其片段的方法，包括将权利要求18的细胞在适合重链和轻链表达的条件下培养，及从细胞培养物中纯化所述重链和轻链。

24.一种产生抗体或其片段的方法，包括将权利要求18的细胞在适合所述抗体表达的条件下培养，及从所述细胞培养物中纯化所述抗体。

25.一种预防和/或治疗对象中肥大细胞介导的疾病或失调的方法，包括给予需要的对象SIGLEC-6受体调节物。

26.权利要求25的方法，其中所述SIGLEC-6受体调节物是SIGLEC-6激动剂。

27.权利要求25的方法，其中所述SIGLEC-6受体调节物是SIGLEC-6拮抗剂。

28.权利要求25的方法，其中SIGLEC-6受体调节物是抗体。

29.一种预防和/或治疗对象中肥大细胞介导的疾病或失调的方法，包括给予需要的对象权利要求1的抗体或其片段。

30.权利要求29的方法，其中所述肥大细胞介导的疾病或失调是哮喘。

31.一种预防和/或治疗对象中肥大细胞介导的疾病或失调的方法，包括给予需要的对象具有杀死肥大细胞的效应物功能的抗SIGLEC-6抗体或其片段。

32.权利要求31的方法，其中所述效应物功能是抗体依赖性细胞介导的胞毒性(ADCC)。

33.一种预防和/或治疗对象中肥大细胞介导的疾病或失调的方法，包括给予需要的对象具有杀死肥大细胞的效应物功能的权利要求1的抗SIGLEC-6抗体或其片段。

34.一种预防和/或治疗对象中肥大细胞介导的疾病的方法，包括给予与诱导肥大细胞凋亡的细胞凋亡诱导成分缀合的抗SIGLEC-6抗体或其片段。

35.权利要求34的方法，其中所述细胞凋亡诱导成分是选自Bax-α、Bak、Bcl-X、Bad、Bid、Bik、Erk和Bok的Bcl-2家族的促细胞凋亡成员。

36.一种预防和/或治疗对象中B细胞介导的疾病或失调的方法，包括给予需要的对象权利要求1的抗体或其片段。

37.一种确定生物学样品中存在SIGLEC-6的方法，包括将生物学样品与权利要求1的抗体或其片段接触，以及确定所述抗体或其片段的存在。

38.一种诊断哺乳动物中肥大细胞介导的失调的方法，包括：

获得怀疑具有肥大细胞介导的失调的哺乳动物样品；

将所述样品与可检测量的抗SIGLEC-6抗体一起温育；

测定结合的抗体的量；

将被怀疑的样品中结合的抗体的量与正常对照组相对比，其中被怀疑具有肥大细胞介导的失调的哺乳动物样品中结合的抗体的量与正常对照组不同则提示该哺乳动物具有或者很可能产生肥大细胞介导的失调。

39.一种检测SIGLEC-6的存在的试剂盒，其包含权利要求1的抗体。

40.一种诊断SIGLEC-6介导的疾病或者失调的试剂盒，其包括抗SIGLEC-6抗体。

41.一种筛选调节SIGLEC-6受体活性的化合物的方法，包括：

(a)制备包含编码SEQ ID NO：2或其生物学活性片段的氨基酸序列的核酸序列的细胞；

(b)将所述细胞与至少一种要确定其调节SIGLEC-6受体活性的能力的化合物接触；

(c)监测所述细胞的SIGLEC-6受体活性调节情况。

42.权利要求41的方法，其中所述细胞被稳定转染。

43.权利要求41的方法，其中所述细胞被瞬时转染。

44.权利要求41的方法，其中所述细胞是肥大细胞。

45.权利要求41的方法，其中所述化合物是激动剂。

46.权利要求41的方法，其中所述化合物是拮抗剂。

47.权利要求41的方法，其中所述化合物是抗体。

48.权利要求41的方法，其中步骤(a)中应用的细胞进一步包含编码报道蛋白的DNA，其中所述DNA与SIGLEC-6应答性转录元件可操纵地连接。

49.权利要求41的方法，其中步骤(b)在存在增加浓度的至少一种化合物的条件下进行，所述化合物的抑制所述受体蛋白的信号传导活性的能力要被确定。

50.权利要求48的方法，其中步骤(c)包括监测所述细胞中报道蛋白的表达水平作为所述化合物功能的函数，从而提示所述化合物抑制信号传导活性的能力。

51.一种筛选SIGLEC-6活性的激动剂或拮抗剂的方法，包括：

将表达SIGLEC-6的细胞与候选化合物接触；

分析细胞应答；以及

将所述细胞应答与在没有候选化合物的条件下产生的标准细胞应答相对比；从而所述细胞应答高于标准则提示所述化合物是激动剂，所述细胞应答低于标准则提示所述化合物是拮抗剂。

52.一种鉴别治疗肥大细胞介导的哺乳动物炎性病变的候选化合物的方法，包括：

将所述化合物应用于肥大细胞，

测定SIGLEC-6的表达/功能，

与未应用所述化合物的肥大细胞相对比，鉴别所述化合物是否降低参与肥大细胞介导的炎性病变的SIGLEC-6的表达/功能；以及

鉴别一种降低表达/功能的化合物为治疗肥大细胞介导的炎性病变的候选化合物。

53.权利要求52的方法，其中所述候选化合物是SIGLEC-6激动剂。

54.权利要求52的方法，其中所述候选化合物是SIGLEC-6拮抗剂。

55.权利要求52的方法，其中所述候选化合物是抗体。

56.一种鉴别抑制SIGLEC-6生物学活性的活性物质的方法，包括

将包含SIGLEC-6的ITIM结构域的多肽与一种活性物质接触；

确定所述活性物质是否与SIGLEC-6的ITIM结构域结合；以及

确定在步骤b中鉴别的与ITIM结构域结合的活性物质是否抑制激活的肥大细胞的组胺释放。

57.权利要求56的方法，其中确定SIGLEC-6蛋白的生物学活性包括确定组胺释放水平，其中在存在测试剂的条件下从肥大细胞中释放的组胺水平高于没有该测试剂的组则提示所述测试剂是刺激SIGLEC-6生物学活性的活性物质，而在存在测试剂的条件下从肥大细胞中释放的组胺水平低于没有该测试剂的组则提示所述测试剂是抑制SIGLEC-6生物学活性的活性物质。

58.一种诊断哺乳动物中B细胞相关疾病的方法，其中所述B细胞表达SIGLEC-6，所述方法包括：

获得怀疑具有B细胞相关疾病的哺乳动物样品；

将所述样品与可检测量的抗SIGLEC-6抗体一起温育；

测定结合的抗体的量；以及

将怀疑的样品中结合的抗体的量与正常对照组相对比。

59.权利要求58的方法，其中所述抗体是标记的。

60.权利要求59的方法，其中所述标记是荧光成分、放射性成分、酶或者发光成分。

61.权利要求58的方法，其中所述抗SIGLEC-6抗体通过另一种抗体检测。

62.权利要求58的方法，其中所述抗SIGLEC-6抗体通过ELISA检测。

63.一种诊断B细胞相关疾病的试剂盒，其包括抗SIGLEC-6抗体。

64.一种诊断B细胞相关疾病的试剂盒，其包括一种与固体表面结合的抗SIGLEC-6抗体。

65.一种预防和/或治疗患者中B细胞相关疾病的方法，其中所述B细胞表达SIGLEC-6，所述方法包括给予需要这种治疗的患者SIGLEC-6受体调节物。

66.权利要求65的方法，其中所述SIGLEC-6受体调节物是SIGLEC-6激动剂。

67.权利要求66的方法，其中所述SIGLEC-6受体调节物是抗体。

68.权利要求65的方法，其中所述B细胞相关疾病是B细胞淋巴瘤。

69.权利要求65的方法，其中所述SIGLEC-6受体调节物是具有杀死表达SIGLEC-6的B细胞的效应物功能的抗SIGLEC-6抗体。

70.权利要求69的方法，其中所述效应物功能是抗体依赖性细胞介导的胞毒性(ADCC)。

71.权利要求65的方法，其中SIGLEC-6受体调节物是与诱导表达SIGLEC-6的B细胞中细胞凋亡的细胞凋亡诱导成分缀合的抗SIGLEC-6抗体。

72.权利要求71的方法，其中所述细胞凋亡诱导成分是选自Bax-α、Bak、Bcl-X、Bad、Bid、Bik、Erk和Bok的Bcl-2家族的促细胞凋亡成员。

73.权利要求1-13任一项的抗体在制备治疗肥大细胞介导的疾病或失调的治疗或诊断性组合物中的应用。

74.权利要求1-13任一项的抗体在制备治疗B细胞介导的疾病或失调如B细胞淋巴瘤的治疗或诊断性组合物中的应用。

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