MXPA06014388A - Diagnostico y tratamiento de enfermedades asociadas con la proteina siglec-6. - Google Patents

Diagnostico y tratamiento de enfermedades asociadas con la proteina siglec-6.

Info

Publication number
MXPA06014388A
MXPA06014388A MXPA06014388A MXPA06014388A MXPA06014388A MX PA06014388 A MXPA06014388 A MX PA06014388A MX PA06014388 A MXPA06014388 A MX PA06014388A MX PA06014388 A MXPA06014388 A MX PA06014388A MX PA06014388 A MXPA06014388 A MX PA06014388A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
antibody
siglec
protein
cells
seq
Prior art date
Application number
MXPA06014388A
Other languages
English (en)
Inventor
Zhengbin Yao
Guanghui Hu
Shen-Wu Wang
Original Assignee
Tanox Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tanox Inc filed Critical Tanox Inc
Publication of MXPA06014388A publication Critical patent/MXPA06014388A/es

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/24—Immunology or allergic disorders

Abstract

La presente invencion se refiere a agonistas, antagonistas y a otras moleculas que se unen de manera especifica a la proteina SIGLEC-6 en mastocitos, a su uso en el tratamiento del asma y otras enfermedades o trastornos mediados por la proteina SIGLEC-6, a metodos para diagnosticar estas enfermedades o trastornos, y a metodos para cribar compuestos candidatos capaces de modular la actividad de la proteina SIGLEC-6 en los mastocitos. La presente invencion se refiere tambien al diagnostico y tratamiento de trastornos relacionados con las celulas B empleando compuestos que se unen y/o modulan la proteina SIGLEC-6.

Description

DIAGNOSTICO Y TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES ASOCIADAS CON LA PROTEÍNA SIGLEC-6 REFERENCIA CRUZADA CON SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica la prioridad a la solicitud provisional de los Estados Unidos No. 60/578,194, la cual se presentó el 9 de junio de 2004 y de la solicitud provisional de los Estados Unidos 60/580,422, la cual se presentó el 17 de junio de 2004, las cuales se incorporan a esta divulgación como referencia en sus totalidades.
CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la proteina Siglec-6, la cual se expresa en grandes cantidades en la superficie de mastocitos y monocitos sanguíneos circulantes (CBMC, circulating blood monocytes) , y la proteina se emplea en el tratamiento de enfermedades o trastornos relacionados con mastocitos . La presente invención también se refiere al uso de la proteina Siglec-6 en el diagnostico y el tratamiento de enfermedades y trastornos relacionados con las células B, por ejemplo, la leucemia y el linfoma inducidos por las células B.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Se ha descrito un grupo de moléculas de adhesión dependientes del ácido siálico dentro de la superfamilia de moléculas como la inmunoglobulina (Klem, S. et al., 1998 Eur. J. Biochem 255:663-672). El termino "siglec" ha sido adoptado para describir esta familia (lecticinas relacionadas con Ig de unión al acido siálico) . Hasta hoy dia, los miembros del grupo incluyen Siglec-1 (sialoadhesina) , Siglec-2 (CD22) , Siglec-3 (CD33) , Siglec-4 (MAG o glucoproteina mediada por la mielina) , Siglec-4b (SMP o proteina de la mielina de las células Schwann) , Siglec-5 (0B- BP2), Siglec-6 (OB-BP1, CD33L) , Siglec-7, Siglec-8, Siglec-9, Siglec-10, Siglec-11 y Siglec 12. Se piensa que la actividad biológica de los miembros de proteínas del grupo Siglec que está implicada en diversos procesos biológicos, por ejemplo, la hemopoyesis, desarrollo neuronal e inmunidad (Vinson, M. et al., 1996 supra). Los estudios también sugieren que estas proteínas median la adhesión celular/señalización celular a través del reconocimiento de glucanos de superficie celular sialisados (Kelm, S. et al., 1996 Glycoconj . J. 13:913-926; Kelm, S. et al., 1998 Eur. J. Biochem. 255:663-672; Vinson, M. et al., 1996 J. Biol. Chem. 271:9267-9272). Las proteínas Siglec conocidas se expresan en diversos tipos de células hematopoyéticas, a pesar de eso todas ellas comparten una estructura similar incluida el dominio fijo V N-terminal simple (membrana distal) seguido por números variables de dominios fijos C2 extracelulares, un dominio de transmembrana y una cola citoplásmica corta. Además, el dominio fijo V Terminal tiene un puente de bisulfuro intralaminillas inusual que es único entre los miembros de la superfamilia Ig (Williams, A. F. y Barclay, A. N. 1988 Annu. Rev. Im unol . 6:381-405; Williams, A. F., et al., 19813 Cold Spring Harbor Sym . Quant . Biol 54:637-647; Pedraza, L., et al., 1990 J. Cell. Biol. 111:2651-2661) . Los resultados de varias metodologías de investigación, incluidos los mutantes truncantes (Nath, D., et al., J. Biol. Chem. 270:26184-26191), mutagénesis dirigida a sitio (Vinson, M., et al., 1996 J. Biol. Chem. 271:9267-9272; Van der Mer e, P. a., et al., 1996 J. Biol Chem. 271:9273- 9280), cristalografía por rayóos X y NMR (Nuclear Magnetic Resonance, resonancia magnética nuclear) (discutido en: Crocker, P.R., et al., 1997 Glycoconjugate J. 14: 601-609) han demostrado que el rostro GFCO'C" del dominio fijo V N-terminal de las proteínas Siglec conocidas interactúa con el acido siálico. Por lo tanto, el dominio fijo V media la adhesión célula a célula al interactuar con el acido siálico. Los ligandos propuestos para las proteínas Siglec conocidas son glucoproteinas o glucolipidos en otras células, o en algunos casos en la misma célula, modificados para incluir azucares o acido siálico. Existen aproximadamente 40 ácidos siálicos de origen natural (Sia) que se agregan a la diversidad estructural de las glucoproteinas de superficie celular. Los más comunes son NeuSAc, Neu9Ac2 y Neu5Gc, que se presentan en las posiciones terminales ligadas a otros azucares como Gal, GalNAc, GlcNAc y Sia por si mismas en las glucoproteinas y en los glucolipidos . Se ha postulado que el patrón de expresión de los ácidos siálicos en ciertos tipos celulares es controlado por la expresión especifica de sialiltransferasas (Paulson, J. C. et al., 1989 J. Biol. Chem. 264:10931-10934). Las proteínas Siglec pueden reconocer no sólo los ácidos siálicos terminales, sino también el contexto de estas entidades con base en los azucares pre-terrminales a los cuales se adhieren éstas proteínas (Kelm, S., et al., 1996 Glycoconj . J. 13:913-926) . Las proteínas Siglec pueden mediar la adhesión célula a célula al funcionar como lectinas dependientes del acido siálico con especificidades distintas para el tipo de acido siálico y para su unión con los azucares subterminales (Kelm, S., 1994 supra; Powell, L. D., et al . , 1994 J. Biol. Chem. 269:10628-10636; Sjoberg, E., et al., 1994 J. Cell Biol. 126:549-562; Collins, B., E., et al., 1997 J. Biol. Chem. 272:1248-1255). Se han analizado las interacciones estructurales entre la sialoadhesina y los carbohidratos (por ejemplo, véase Collins, et al., J. Biol. Chem 272:16889-95, 1997; véase también May et al., Mol. Cell 1:719-28, 1998). Las proteínas Siglec exhiben reconocimiento funcional proteina-carbohidrato a través de glucoconjugados sialilados específicos en sus moléculas cognadas, y algunas de ellas se unen con los glucanos que terminan en los ácidos siálicos a-2,3 ligados (Kelm et al., Curr. Biol. 4:965-72, 1994). La actividad de unión del ácido siálico por lo usual reside en el dominio similar a Ig fija de forma V N-Terminal, y también puede involucrar el penúltimo dominio similar a Ig. Se ha informado que algunos miembros de este grupo exhiben distintas especificidades para tanto el tipo de ácido de siálico como para su unión con azucares subterminales . Las secuencias de aminoácidos de las colas citoplásmicas de diversas proteínas Siglec sugieren fuertemente que participan en la señalización intracelular. Por ejemplo, la proteina Siglec-2 tiene 6 tirosinas en el dominio citoplásmico, dos de las cuales residen dentro de las secuencias moleculares recurrentes ITAM ( Immunotyrosine-based activation motifs, secuencias moleculares recurrentes de activación basadas en inmunotirosina) las cuales median la activación, y cuatro adentro de las secuencias moleculares recurrentes ITIM ( immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif, secuencias moleculares recurrentes de inhibición con base de tirosina inmunorreceptora) las cuales median la inhibición (Taylor, V. et al., 1999 J. Biol. Chem. 274:11505-11512). La fosforilación de las tirosinas de secuencia molecular recurrente ITAM permitirá el reclutamiento de Src, mientras que la fosforilación de las tirosinas de la secuencia molecular recurrente ITIM permitía el reclutamiento de SHP-1 y SHP-2. La proteina Siglec-3 contiene dos ITIM que reclutan SHP-1 y SHP-2 con la fosforilación (Taylor, V., et al., 1999 supra). La proteina Siglec-6 tiene también secuencias moleculares recurrentes de señalización similares a SLAM putativas en la cola citoplásmica; la secuencia SLAM es un acrónimo de Signaling Lymphocyte Activation Molecule (molécula de activación de linfocitos de señalización). (Patel, N. et al., 1999 J. Biol. Chem. 274:22729-22738) . Esto forma evidencia de que infiltrados de célula inflamatoria tienen una función significativa en la conducción de la patogénesis del asma y de otras enfermedades alérgicas al dañar el tejido y al liberar agentes proinflamatorios . Los eosinófilos, neutrófilos, macrófagos, mastocitos y linfocitos activados incrementan los sitios de inflamación y cada uno es capaz de modificar la respuesta global inflamatoria (Busse, W. W. 1998 J.
Allergi Clin. Immunol . 102:Sl7-22). Los eosinófilos son de particular interés en el asma y alergia debido a su apariencia conspicua en los sitios de inflamación causada por alérgenos (Kroegel, C. et al., 1994 Eur. Respir. J. 7:519-543; Haczku, A. 1998 Acta. Microbiol. Immunol . Hung. 45:19-29; Boyce, J. A. 1997 Allergy Asthma Proc. 18:293-300) . A través de la liberación de proteínas de granulos tóxicos, mediadores lipidos proinflamatorios y citocinas, asi como los eosinófilos han sido implicados como los principales responsables de la reestructuración e hipersensibilidad de las vias respiratorias en el asma (Durha , S. R. 1998 Clin. Exp. Allergy 28 Suppl. 2:11-6). ' Se han reportado que muchas proteínas contiene una secuencia molecular recurrente de señalización inhibidora citoplásmica que está asociada con la traducción de las funciones efectoras inhibidoras, por ejemplo, la "secuencia molecular recurrente de inhibición con base de tirosina inmunorreceptora", "ITIM" (Renard et al., Immun Rev 155:205-221, 1997). Las ITIM tiene la secuencia de consenso I/VxYxxL/V y se han descubierto en las porciones citoplásmicas de diversas proteínas de traducción de señales del sistema inmunitario, muchas de las cuales, como las proteínas Siglec, mas allá de la súper familia Ig o de la familia de lecitina C dimérica de tipo II (véase Renard et al., 1997, supra). Las proteínas que contiene ITIM incluyen los "receptores similares a linfocitos citoliticos Ig" o "KIR, killer cell Ig-like receptors" , y algunos miembros del receptor similar a Ig de leucocitos o de la familia "LIR" de proteínas (Renard et al., 1997, supra; Cosman et al., Im unity 7:273-82, 1997; Borges et al., J Immunol 159:5192-96, 1997). Se considera que la traducción de señales mediante una ITIM regula de manera descendente las actividades celulares dirigidas, por ejemplo, la expresión de proteina de superficie celular. Renard propuso que la regulación de las funciones celulares 'complejas es afinada por la interacción entre la traducción de señales inhibidoras mediadas por ITIM y la activación de las mismas funciones mediante una secuencia molecular activadora de 16-18 aminoácidos, la secuencia "ITAM" que está presente en otras proteínas. Se ha propuesto que algunas de las proteínas Siglec contiene una o más ITIM en sus regiones citoplásmicas . CD22 tiene mas de una ITIM y se ha caracterizado como un regulador negativo de la activación de las células B. CD33 y Siglec 8 también han sido reportadas que contiene secuencias moleculares recurrentes ITIM en sus dominios citoplásmicos (Ulyanova et al., Eur J Immunol 29:3440-49; Floyd et al., 2000, supra). Una ITIM también está presente en la cola citoplásmica de p75/AIRMl/Siglec 7, una proteína expresada en niveles significativos en el subconjunto de linfocitos citoliticos naturales (NK) CD8+ (Nicoll et al., 1999, supra). La expresión de la proteína Siglec está restringida enormemente a las células mieloides del sistema in unitario, y se cree que está implicada en el control de las interacciones mieloides, como por ejemplo, las adhesiones entre células presentadoras de antigeno (APC, antigen presenting cells) , por ejemplo, los macrófagos (incluida la microglia) , o células dendriticas y otras células implicadas en la inmunidad mediada por células, por ejemplo, las células T o los linfocitos citoliticos naturales. Estos polipéptidos pueden funcionar en la captura y captación de antigenos cuando se expresan en las APC, y por lo tanto pueden proporcionar objetivos para intensificar las vacunas contra tumores a base de células. Se ha observado que muchas proteínas Siglec se expresan principalmente en subconjunto de tipos específicos de células hemotopoyéticas . La expresión de CD33 está considerablemente restringida al linaje mielomonocitico, y está presente en los monocitos maduros y en los macrófagos tisulares (Freeman et al., 1995, supra) . CD22 se expresa principalmente en las células B, - mientras que la proteina Siglec-8 se expresa específicamente en granulocitos eosinofílicos (Floyd et al., 1994; J. Biol. Chem. 275:861-866,2000). La sialoadhesina se expresa en altos niveles en los macrófagos en condiciones inflamatorias crónicas y en tumores, lo que sugiere una función en la defensa del hospedero, y puede mediar interacciones especificas célula a célula y célula - sustrato in vitro (Crocker et al., 1994; Crocker et al., 1997, supra). Umansky et al. ha reportado que los macrófagos positivos a la sialoadhesina contribuyen con la resistencia del hospedero contra la metástasis de tumores, en los que estos macrófagos pueden funcionar como células presentadoras de antigeno, y también que la expresión de sialoadhesión es sensible a los corticosteroides, linfocinas y citocinas (Umansky et al., 1996 y 1996) . Comparaciones con otros miembros conocidos de la familia Siglec (CD22, CD33, glucoproteína asociada con mielina y la sialoadhesina) muestran que OB-BPl/Siglec-6, OB-BP2/Siglec-5 y CD33/Siglec-3 constituyen un subgrupo único relacionado con un alto nivel de identidad de aminoácidos global: Siglec-6 versus Siglec-5 (59%), Siglec-6 versus CD33 (63%) y Siglec-6/Siglec-5 versus CD33 (56%) . Los dominios citoplásmicos no tienen un alto nivel de conservación, pero exhiben novedosas secuencias moleculares recurrentes que son sitios putativos de la fosforilación de tirosina, entre los que se incluyen, una secuencia molecular inhibidora de tirosina cinasa inmunorreceptora y una secuencia molecular recurrente encontrada en las SLAM y en proteínas similares a SLAM. Se aisló la proteina Siglec-6 (0B-BP1) de la linea celular eritroleucémica TF-1 de origen humano (Patel, N., et al., 1999 J. Biol. Chem 274:22729-22738). La proteina Siglec-6 es esencialmente igual a la péptido CD33-Ll, excepto por unas pocas diferencias de aminoácidos. Los tejidos humanos mostraron altos niveles de ARNm de Siglec-6 en la placenta y una expresión moderada en el bazo, leucocitos de sangre periférica y en el intestino delgado. Un anticuerpo monoclonal especifico para la proteina Siglec-6 confirmó una alta expresión en los cito- y sincitiotrofoblastos de la placenta. El uso de este anticuerpo en los leucocitos de la sangre periférica mostró un patrón de expresión casi exclusivo en las células B. Las formas recombinantes de los dominios extracelulares de Siglec-6, Siglec-5 y CD33/Siglec-3 fueron analizados para detectar la unión especifica de leptina. Si bien la proteína Siglec-6 exhibió una unión estrecha (K(d) 91 nM) , las otras dos mostraron una unión débil con valores K(d) en el intervalo de 1-2 icroM. Estudios con ligandos sialilados indicaron que la proteina Siglec-6 se une de manera selectiva a Neu5Acalpha2-6GalNAcalpha (sialyl-Tn) , lo que permite su designación formal como Siglec-6. Debido al patrón de expresión restringido de la proteina Siglec-6, ha sido sugerido que puede mediar eventos de reconocimiento de célula a célula al interactuar con ligandos de glucoproteínas sialilados expresados en poblaciones de células especificas . Hemos descubierto que la proteina Siglec-6 se expresa altamente en los mastocitos y en una pequeña subpoblación de células B, pero no en monocitos primarios, neutrófilos o linfocitos T. Por lo tanto, la proteína SIGLEC-6 pude resultar benéfica como un objetivo específico y dirigido para el tratamiento de enfermedades asociadas con la proliferación de mastocitos y para inhibir mediadores de mastocitos que llevan a enfermedades inflamatorias o alérgicas, incluido el asma. Además, la proteina SIGLEC-6 puede resultar benéfica como un objetivo especifico y dirigido para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades mediadas por las células B, por ejemplo, la leucemia y el linfoma inducido por células B.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método para modular una respuesta inmunitaria inducida por mastocitos que expresan la proteína SIGLEC-6. La presente invención incluye el tratamiento de enfermedades inmunitarias, entre las que se incluyen, enfermedades alérgicas, por ejemplo, el asma, así como enfermedades inflamatorias, mediante el uso de agonistas de SIGLEC-6. Debido a que la proteína SIGLEC-6 contiene una secuencia molecular recurrente de inhibición con base de tirosina inmunorreceptora, o "ITIM, Immunoreceptor Tyrosine-Based Inhibi tion Motif" una molécula agonista que se une a la proteína SIGLEC-6, por ejemplo, un anticuerpo, debería estimular la ITIM para inhibir ciertas funciones de mastocitos . Esta molécula también puede ser una molécula biespecífica que reticule la ITIM de SIGLEC-6 con una ITAM, por ejemplo, FceRI, inhibiendo con ello la acción del receptor que contiene ITAM. La presente invención también se refiere a un método para diagnosticar y tratar trastornos relacionados con las células B, en donde las células B expresan la proteína SIGLEC-6 en su superficie celular. La presente invención incluye el tratamiento de enfermedades relacionadas con las células B, por ejemplo, la leucemia y linfoma inducido por células B. Debido a que la proteína SIGLEC-6 contiene una secuencia molecular recurrente de inhibición con base de tirosina inmunorreceptora, "ITIM", una molécula agonista que se une a la proteína SIGLEC-6, por ejemplo, un anticuerpo, debería estimular la ITIM para inhibir la función de las células B. Esta molécula también puede ser una molécula biespecifica que reticule la ITIM de la proteína SIGLEC-6 con una ITAM, por ejemplo FceRI, inhibiendo con ello la acción el receptor que contiene ITAM. La presente invención incluye anticuerpos que de manera especifica se unen a la proteina SIGLEC-6, incluyendo anticuerpos agonistas, anticuerpos antagonistas, anticuerpos que contienen una citotoxicidad celular mediada por. Fe, por ejemplo, citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpo (ADCC, antibody-dependent cell-media ted cytotoxici ty) , conjugados de anticuerpo, anticuerpos que bloquean la unión a la proteina SIGLEC-6, y anticuerpos que de manera específica se unen a la proteína SIGLEC-6 para la detección e identificación de diagnóstico de células B que expresan la proteína SIGLEC-6. Estos anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales y fragmentos de unión funcionales de los mismos. Los anticuerpos también pueden ser anticuerpos de un solo dominio que tengan sólo una cadena pesada o una cadena ligera. Los anticuerpos monoclonales pueden ser humanizados, humanos, quiméricos, biespecíficos o conjugados. La presente invención también incluye anticuerpos de una sola cadena. Se pueden usar conjugados de anticuerpos para la eliminación de mastocitos o para la inducción de apoptosis de mastocitos. También se pueden usar conjugados de anticuerpo para la eliminación de células B patológicas o para la inducción de apoptosis en las células B que expresan la proteína SIGLEC-6. La entidad conjugada puede incluir toxinas, isótopos radioactivos, etiquetas, por ejemplo, entidades fotoreactivas o una entidad inductora de la apoptosis, por ejemplo, un miembro pro-apoptótico de la familia Bcl-2 seleccionado de Bax- , Bak, Bcl-Xs, Bad, Bid, Bik, Erk y Bok. La presente invención incluye composiciones de estos anticuerpos anti-SIGLEC-6 para su uso en el diagnóstico y/o el tratamiento. Las composiciones incluyen los anticuerpos en combinación con portadores, adyuvantes, diluyentes, excipientes y/o aditivos adecuados. Otro aspecto de la presente invención se refiere a métodos de cribado para identificar agentes de interés que se unan con (por ejemplo, ligandos) y/o modulen la actividad biológica de proteínas SIGLEC-6. Debido a que las proteínas SIGLEC-6 se expresan en los mastocitos, estos agentes pueden estar involucrados en la modulación de mastocitos o en otra maduración, migración, activación o comunicación de células inmunitarias con otras células. Además, la proteína SIGLEC-6 se expresa en la superficie de ciertas células B, y se pueden usar estos agentes para eliminar o destruir esta población de células B. Por lo tanto, los agentes que se unen con las proteínas SIGLEC-6 y modulan su actividad biológica pueden resultar eficaces en regular ciertos síntomas de asma y otras enfermedades alérgicas, la leucemia o reducir la inflamación. La presente invención también incluye métodos de diagnóstico para enfermedades y trastornos mediados por mastocitos mediante el uso de anticuerpos anti-SIGLEC-6. La proteína SIGLEC-6 es muy específica para los mastocitos, por lo tanto, alguien puede detectar la presencia y frecuencia de mastocitos en una muestra determinada, por ejemplo, una biopsia tisular, con anticuerpos dirigidos a la proteína SIGLEC-6. El incremento relativo de proteínas SIGLEC-6 en una muestra puede ser indicativo de, por ejemplo, asma, en pacientes con niveles incrementados de mastocitos en el tejido de músculo liso del pulmón. También se pueden emplear anticuerpos anti-SIGLEC-6 para detectar la presencia o incremento/disminución de células que expresan la proteína SIGLEC-6. La presente invención también incluye métodos de diagnóstico para enfermedades y trastornos relacionados con las células B, en donde las células B expresan la proteína SIGLEC-6, mediante el uso de anticuerpos anti-SIGLEC-6. Se puede usar la proteina SIGLEC-6 para detectar la presencia y frecuencia de células B que expresan SIGLEC-6 en una muestra determinada, por ejemplo, una muestra sanguínea proveniente de un paciente afectado, con anticuerpos dirigidos a la proteína SIGLEC-6. La presencia de células B que expresan la proteína SIGLEC-6 en una muestra puede ser indicativo de un trastorno relacionado con las células B, por ejemplo, linfoma inducido por células B. También se pueden usar anticuerpos anti-SIGLEC-6 para detectar la presencia o incremento/disminución de células que expresan la proteina SIGLEC-6. Se pueden emplear los anticuerpos de la presente invención en un método de diagnóstico para detectar células B que expresan SIGLEC-6 en tejidos o fluidos corporales. El método comprende exponer la muestra del paciente a un anticuerpo de la presente invención y determinar si el anticuerpo se une a células en la muestra. Se pueden emplear varios métodos de diagnósticos conocidos en la técnica, por ejemplo, análisis de unión competitiva, análisis de intercalado directo o indirecto, y análisis de inmunoprecipitación conducidos en etapas heterogéneas u homogéneas . Se puede detectar la expresión de la proteína SIGLEC-6 en fluidos corporales o tejidos mediante la inmunofluorescencia, tinción FACS o inmunohistoquimica empleando un mAb anti-SIGLEC-6.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS O FIGURAS La Figura 1 describe la secuencia de ácidos nucleicos de Siglec-6 (SEQ ID NO:l) . La Figura 2 describe la secuencia de aminoácidos de la proteina SIGLEC-6 (SEQ ID NO: 2) que incluye la secuencia de señal (subrayada) y las regiones ITIM y SLAM putativas de la región 3' . La Figura 3 describe el nivel de expresión relativo de ARNm de la proteína Siglec-6 en varios tejidos o líneas celulares. La Figura 4 describe la tinción FACS de CBMC, LAD2 y HMC-1, que ilustra la expresión de la proteina SIGLEC-6 en la superficie celular de estas células. La Figura 5 describe el efecto de anti-SIGLEC-6 sobre la activación de CBMC vía Fc?RI . La Figura 6A y 6B muestran las secuencias de ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 7 y 9) y aminoácidos (SEQ ID NO: 8 y 10) de regiones variables de cadena ligera y cadena pesada de Mab 239-90 con regiones determinantes de complementariedad (CDR, complementar ity determining regions) subrayadas.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN DEFINICIONES Los términos empleados en toda esta solicitud se tienen que interpretar con el significado ordinario y típico como aquellos experimentados en la técnica lo harían. Sin embargo, los solicitantes desean que los siguientes términos tengan la definición particular que a continuación se define. El término "agente" se emplea en esta solicitud para denotar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica (por ejemplo, ácido nucleico, un anticuerpo, una proteína o una porción del mismo, por ejemplo, un péptido) o un extracto elaborado a partir de materiales biológicos, como por ejemplo, bacterias, plantas, hongos o células o tejidos de origen animal (particularmente mamíferos) . Se puede hacer adecuada la actividad de estos agentes como un "agente terapéutico", el cual es una sustancia (o sustancias) biológica, fisiológica o farmacológicamente activa que actúa local o sistemáticamente en un individuo. El término "identidad de secuencia" u "homología de secuencia" se deberá interpretar que significa que el porcentaje de residuos de aminoácidos en la secuencia candidata es idéntico con el porcentaje de residuos de una secuencia correspondiente con la cual se compara, después de alinear las secuencias y de introducir huecos, si es necesario, para lograr la máxima identidad porcentual para la secuencia completa, y sin considerar sustitución conservativa alguna como parte de la identidad de secuencia. Ni las extensiones ni inserciones N- o C-terminal deberán interpretarse como identidad reductora o como homología. En la técnica se conocen bien métodos y programas de cómputo para el alineamiento. Se puede medir la identidad de secuencia empleando un software de análisis de secuencia. La frase "prácticamente idéntico" con respecto a una secuencia polipéptida de cadena de anticuerpo puede ser interpretada como una cadena de anticuerpos que exhibe por lo menos una identidad de secuencia del 70%, u 80%, o 90% o 95% con respecto a la secuencia polipéptida de referencia. El término "variante" cuando se emplea para describir una secuencia polipéptida, como por ejemplo, una secuencia de anticuerpos, significa una secuencia de aminoácidos que difiere de su contraparte nativa por uno o más aminoácidos, incluidas las modificaciones, sustituciones, inserciones y eliminaciones, pero que retiene la misma función biológica o tiene una función biológica similar que su contraparte nativa. Las variantes incluyen polipéptidos que tienen una identidad de secuencia de por lo menos el 70% cuando se comparan con su contraparte nativa, una identidad de secuencia de por lo menos 85% y/o una identidad de secuencia de por lo menos el 95%. Las variantes incluyen, por ejemplo, polipéptidos con sustituciones de aminoácidos conservadores. El término "sustitución de aminoácidos conservadores" significa que un aminoácido en un polipéptido ha sido sustituido por un aminoácido que tiene una cadena secundaria similar. Por ejemplo, la glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina tienen cadenas secundarias alifáticas; la serina y treonina tienen cadenas secundarias hidroxi-alifáticas; la asparagina y glutamina tienen cadenas secundarias que contienen amida; la fenilalanina, tirosina y triptófano tienen cadenas secundarias aromáticas; la lisina, arginina e histidina tienen cadenas secundarias básicas; y la cisteina y metionina tienen cadenas secundarias que contienen azufre. Las sustituciones de aminoácidos conservadores preferentes son valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina y asparagina-gluta ina. El término "fragmento", cuando se emplea para describir un polipéptido, significa un subconjunto de secuencia de aminoácidos de su contraparte nativa que retiene alguna actividad biológica de su contraparte nativa. Los fragmentos incluyen secuencias de aminoácidos de por lo menos 10 a 20 aminoácidos consecutivos de la secuencia nativa o de por lo menos 20 a 30 aminoácidos consecutivos de la secuencia nativa. El término "agonista" significa cualquier molécula que directa o indirectamente promueve, intensifica o estimula la función normal de la proteina SIGLEC-6. Un tipo de agonista es una molécula que interactúa con la proteína SIGLEC-6 de una manera que imita su ligando, entre los que se incluyen, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo . El término "antagonista" significa cualquier molécula que bloquea, previene, inhibe o neutraliza la función normal de la proteína SIGLEC-6. Un tipo de antagonista es una molécula que interfiere con la interacción entre la proteina SIGLEC-6 y su ligando, entre los que se incluyen, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. Otro tipo de antagonista es un nucleótido antisentido que inhiba la trascripción correcta de SIGLEC-6 nativa o ARNis que se une al trascripto nativo. El término "anticuerpo", como se emplea en la presente descripción, se refiere a moléculas de inmunoglobulina y a porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antigeno que específicamente se unen con un antígeno. Las moléculas de inmunoglobulina de la presente invención pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY) , clase (por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2) o de una subclase de molécula de inmunoglobulina. Aún más, el término "anticuerpo" (Ab) o "anticuerpo monoclonal" (Mab) se entiende que incluye moléculas intactas, asi como fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, fragmentos Fab y F(ab')2) los cuales son capaces de unirse de manera específica a proteínas. Los fragmentos Fab y F(ab')2 carecen del fragmento Fe del anticuerpo intacto, aunque más rápidamente de la circulación del animal o planta, y pueden tener una menor unión tisular no específica que un anticuerpo intacto (Wahl et al., J. Nucí. Med. 24:316-325 (1983) ) . Por lo tanto, estos fragmentos se consideran preferidos, asi como los productos de un FAB o de otra genoteca expresión de inmunoglobulina. Aún más, los anticuerpos de la presente invención incluyen anticuerpos quiméricos, de una sola cadena y humanizados. Los anticuerpos nativos y las inmunoglobulinas son glucoproteínas usualmente heterotetraméricas de aproximadamente 150,000 daltones, compuesto por dos cadenas ligeras idénticas (L) y por dos cadenas idénticas pesadas (H) . Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo. Un anticuerpo se puede unir a una proteína SIGLEC-6 con una afinidad de unión (Kd) de por lo menos aproximadamente 10~8, 10"9, 10"10, 10"11, 10"12 M. Los anticuerpos de la presente invención también incluyen anticuerpos de un solo dominio en los cuales el anticuerpo funcional está únicamente compuesto por una cadena pesada o por una cadena ligera, por ejemplo aquellos descritos en los documentos WO04081026 El término "variable" en el contexto del dominio variable de anticuerpos, se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren ampliamente en secuencia entre anticuerpos, y se emplean en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su objetivo particular. Sin embargo, la variabilidad no está uniformemente distribuida a través de los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos llamados regiones determinantes de complementariedad (CDR, complementar ity determining regions) también conocidas como regiones hipervariables tanto en los dominios variables de cadena ligera y en los dominios variables de cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables son llamadas la estructura (FR) . Cada uno de los dominios variables de cadenas pesada y ligera nativas comprenden cuatro regiones FR, adoptando ampliamente una configuración de hoja ß, conectada por tres CDR, las cuales forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lienzo ß. Las CDR en cada cadena están sujetas juntas en proximidad cercana mediante las regiones FR, y con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión objetivo de anticuerpos (véase Kabat et al . ) . De la manera como se usa en esta descripción, se lleva a cabo la numeración de los residuos de aminoácidos de inmunoglobulina de acuerdo con el sistema de numeración de residuos de aminoácidos de inmunoglobulina de Kabat et al., (Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico, Instituto Nacional de Salud, Bethesda, Md. 1987), a menos que se indique algo distinto. El término "fragmento de anticuerpo" se refiere a una porción de un anticuerpo de longitud completa, en términos generales la unión objetivo o la región variable. Los ejemplos de fragmento de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv. La frase "fragmento funcional" de un anticuerpo es un compuesto que tiene actividad biológica cualitativa en común con un anticuerpo de longitud completa. Por ejemplo, un análogo o fragmento funcional de un anticuerpo anti-SIGLEC-6 es uno el cual se puede unir a la proteina SIGLEC-6 de tal manera que actúe como el ligando natural y active la 1TIM, con lo que se inhibe las funciones de los mastocitos. Como se emplea en esta descripción, el término "fragmento funcional" con respecto a anticuerpos, incluye fragmentos Fv, F(ab) y F(ab')2. Un fragmento "Fv" es el fragmento de anticuerpo minimo el cual contiene un reconocimiento de objetivo completo y un sitio de unión. Esta región consiste de un dimero de un dominio variable de cadena pesada y de un dominio variable de cadena ligera en una asociación firme y no covalente (dímero VH- VL) . Es en esta configuración que las tres CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión objetivo en la superficie del dímero VH - VL. Conjuntamente, las seis CDR confieren especificidad de unión objetivo al anticuerpo. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende únicamente tres CDR especificas para un objetivo) tiene la capacidad de reconocer y unirse al objetivo, aunque con una afinidad menor que la del sitio de unión completo. Los fragmentos de anticuerpo "Fv de una sola cadena" o "sFv" comprenden los dominios VH y VL de un anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una sola cadena polipéptida. En términos generales, el polipéptido Fv además comprende un ligador polipéptido entre los dominios VH y VL el cual permite que el fragmento sFv forme la estructura deseada para la unión objetivo. El fragmento Fab contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en la terminal carboxilo del dominio CH1 de cadena pesada incluyendo una o más cisteínas de la región de bisagra de anticuerpo. Los dominios F(ab') son producidos mediante la escisión del enlace de disulfuro en las cisteínas de bisagra del producto de digestión de pepsina F(ab')2.
Aquellos expertos en la técnica conocen acoplamientos químicos adicionales de estos fragmentos de anticuerpo. El término "anticuerpo monoclonal", tal como se emplea en esta descripción, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos prácticamente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, excepto por las posibles mutaciones que de manera natural suceden que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, se dirigen hacia un solo sitio objetivo. Aún más, en contraste con las preparaciones de anticuerpo convencionales (policlonales) que por lo habitual incluyen distintos anticuerpos dirigidos hacia distintas determinantes (epitopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige hacia una sola determinante en el objetivo. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos en que se pueden sintetizar mediante el cultivo de hibridoma, y descontaminar mediante otras inmunoglobulinas. El "monoclonal" modificador indica el carácter del anticuerpo que es obtenido de una población prácticamente homogénea de anticuerpos, y no se considera que requiere de la producción de anticuerpo mediante algún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales para emplearse con la presente invención pueden ser aislados de genotecas de anticuerpos fágicos empleando las técnicas bien conocidas. Los anticuerpos monoclonales progenitores para emplearse de acuerdo con la presente invención pueden ser elaborados mediante el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler y Milstein, Nature 256,495 (1975), o se pueden elaborar mediante métodos recombinantes. Tal como se emplea en esta descripción, el término "trastorno mediado por SIGLEC-6" significa una condición o enfermedad la cual se caracteriza por la perdida de inhibición de SIGLEC-6 y por la activación y proliferación de mastocitos o por la liberación de histamina. Específicamente se debería interpretar que incluye condiciones asociadas con hipersensibilidad anafiláctica y alergias atópicas, entre las que se incluyen: el asma, rinitis alérgica y conjuntivitis (alergia al polen) , eczema, urticaria, dermatitis atópica y alergias alimentarias. La condición fisiológica seria del choque anafiláctico causado por, por ejemplo, picaduras de abejas, mordeduras de serpientes, alimentos o medicación, también se abarca por el alcance de este término. Como se emplea en esta descripción, el término "trastorno relacionado con células B" significa una condición o enfermedad que se caracteriza por las células B que expresan SIGLEC-6 y que tienen una expresión, activación o liberación de citocinas anormales. De manera específica se deberá interpretar que incluye condiciones asociadas con perfiles patológicos de las células B, por ejemplo, linfomas inducidos por células B. El término "fragmento biológicamente activo de SIGLEC-6" se refiere a un fragmento de SIGLEC-6 que es suficiente para mediar por lo menos sus actividades biológicas, por ejemplo, la desgranulación. Un fragmento biológicamente activo de preferencia comprende el dominio ITIM, opcionalmente el dominio SLAM, una porción que comprende estos dos dominios conservados, por ejemplo, el dominio intracelular. Un fragmento biológicamente activo de la proteína SIGLEC-6 también puede comprender todo o un fragmento del dominio extracelular y también puede comprender el dominio de transmembrana. Esta invención no está limitada a la metodología, protocolos, líneas celulares, vectores y reactivos particulares descritos en esta divulgación, ya que estos pueden variar. Además, la terminología empleada en este documento es únicamente para el propósito de describir modalidades particulares y no se pretende que limite el alcance de la presente invención. Como se emplea en esta descripción y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", y "el, la" incluyen las referencias en plural, a menos que el contexto claramente indique algo distinto, por ejemplo, haciendo referencia a "una célula hospedera" incluye una pluralidad de este tipo de células hospederas . A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos y cualquier acrónimo empleado en esta descripción tienen el mismo significado que comúnmente entendería alguien experto en la técnica en el campo de la invención. Aunque se pueden emplear cualquier método y material similar o equivalente a aquellos descritos en este documento en la práctica de la presente invención, en esta divulgación se describen métodos, dispositivos y materiales. Todas las patentes y publicaciones mencionadas en este documento se incorporan a la misma como referencia conforme lo permite la Ley con el propósito de describir y divulgar las proteínas, enzimas, vectores, células hospederas y metodologías reportadas en la misma que se deben emplear con la presente invención. Sin embargo, nada de este documento constituye una admisión de que la presente invención no tiene derecho de anteceder esta divulgación en virtud de la presente invención. Se puede comprender con mayor claridad la presente invención haciendo referencia a la siguiente descripción detallada de la misma y a los ejemplos incluidos en este documento. Se descubrió que la proteína SIGLEC-6 se expresa diferencialmente en mastocitos primarios de origen humano en comparación con otros tipos celulares, también la proteína SIGLEC-6 se expresó en monocitos sanguíneos circulantes (CBMC, circulating blood monocytes) . La proteina SIGLEC-6, puede, por consiguiente, tener una función importante en la estimulación de las actividades de mastocitos en tejidos de las vías respiratorias y/o periféricos o conectivos para respuestas inflamatorias y alérgicas. Por lo tanto se puede usar la proteína SIGLEC-6 como un objetivo terapéutico para tratar enfermedades mediadas por mastocitos, por ejemplo, el asma alérgica o no alérgica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD, chronic obstructive pulmonary disease) , rinitis alérgica, anafilaxis, enfermedad gastrointestinal alérgica, dermatitis atópica, artritis reumatoide, esclerosis del sistema y otras enfermedades alérgicas, autoinmunitarias e inflamatorias. Los activadores/inhibidores de la proteina SIGLEC-6 para este tratamiento pueden ser anticuerpos, miméticos de péptidos para el ligando, moléculas pequeñas, antisentido o AR i .
IDENTIFICACIÓN DE SIGLEC-6 Se identificaron genes diferencialmente expresados en mastocitos de origen humano inicialmente al comparar los niveles de expresión de ARNm entre mastocitos (cultivados a partir de células CD34+ sanguíneas del cordón umbilical) , PBMC (peripheral blood mononuclear cells, células mononucleares de sangre periférica) , y THP-1 (leucemia onocitica aguda; linfocitos) empleando la tecnología de microanálisis genético. (Véase los siguientes ejemplos) . Se confirmo aún más la expresión diferencial de la proteína SIGLEC-6 de mastocitos mediante RT-PCR cuantitativa empleando varios distintos tipos celulares y tejidos humanos.
AGONISTAS Y ANTAGONISTAS La presente invención proporciona agonistas y antagonistas que directa o indirectamente activan o inhiben la expresión o acción de la proteina SIGLEC-6, o se unen a la misma con fines de detección. Los tipos de agonistas y antagonistas incluyen, entre otros, polipéptidos, proteínas, péptidos, glucoproteínas, glucopéptidos, glucolipidos, polisacáridos, oligosacáridos, nucleótidos, moléculas orgánicas, moléculas bioorgánicas, peptidomiméticos, agentes farmacológicos y sus metabolitos, y secuencias de control de trascripción y traducción. En una modalidad, el agonista puede ser un anticuerpo que se une de manera eficaz con el dominio extracelular de SEQ ID NO: 2. Estos anticuerpos se unen a la proteina SIGLEC-6 activando la ITIM, y por lo tanto inhiben la activación de los mastocitos y/o inhiben las células B aliviando los trastornos relacionados con las células B. El agonista también puede incluir anticuerpos que de manera especifica se unan a la proteína SIGLEC-6 e influyan en las acciones y funciones biológicas, por ejemplo, para activar o inhibir la producción de citocinas. Los anticuerpos agonistas pueden ser policlonales o monoclonales, y pueden ser quiméricos, humanos, humanizados, o desinmunizados. Se pueden usar anticuerpos agonistas para prevenir o tratar enfermedades caracterizadas por la proliferación y/o desgranulación de mastocitos . Se pueden emplear los agonistas para el tratamiento de varias enfermedades inmunitarias, entre las que se incluyen, enfermedades alérgicas, por ejemplo, el asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, hipersensibilidad a alimentos y urticaria; enfermedades asociadas con trasplantes incluido el rechazo a injerto o la enfermedad de injerto contra hospedero; dermopatías autoinmunitarias o inmuno-mediadas incluidas las dermopatías con ampollas, eritema multiforma y dermatitis por contacto, soriasis; artritis reumatoide, artritis crónica juvenil; enfermedad de hígado inflamatorio (es decir, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn) ; eritematosis lupus sistémico; lupus eritematoso sistémico; espondiloartropatias; esclerosis sistémica (escleroderma) ; miopatias inflamatorias idiopáticas (dermatomiositis, polimiositis) ; síndrome de Sjogren; vasculitis sistémica; sarcoidosis; anemia hemolítica autoinmunitaria (pancitopenia inmunitaria, hemoglobinuria paroxistica nocturna) , trombocitopenia autoinmunitaria (púrpura trombocitopénica idiopática, trombocitopenia inmuno-mediada) ; tiroiditis (enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, Tiroiditis linfocítica juvenil, tiroiditis atrófica) ; diabetes mellitus; nefropatia immuno-mediada (glomerulonefritis, nefritis tubulointersticial) ; enfermedades desmielinizantes de los sistemas central nervioso y sistema nervioso periférico, por ejemplo, esclerosis múltiple, polineuropatia desmielinizante idiopática o síndrome de Guillain-Barre, y polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica; enfermedades hepatobiliares, por ejemplo, hepatitis infecciosa (hepatitis A, B, C, D, E y otros virus no hepatotrópicos) , Hepatitis crónica activa autoinmune, cirrosis biliar primaria, hepatitis granulomatosa, y cholangitis esclerosante; neumopatías inflamatorias y fibróticas, por ejemplo, fibrosis cistica, enteropatia por sensibilidad al gluten y la enfermedad de Whipple; enfermedades inmunológicas del pulmón, por ejemplo, neumonia eosinofilica, fibrosis pulmonar idiopática y neumonitis por hipersensibilidad. También se pueden emplear los anticuerpos de la presente invención para propósitos de diagnóstico con el fin de detectar la presencia y/o niveles de mastocitos al medir la unión de la proteína SIGLEC-6 en una muestra de un paciente, por ejemplo, una biopsia histica o una muestra mucolítica .
POLIPÉPTIDOS En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para el tratamiento empleando un polipéptido aislado de la proteina SIGLEC-6 que tenga la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; una variante de SEQ ID NO: 2; o el fragmento del dominio extracelular de SEQ ID NO: 2. En una modalidad, el péptido aislado puede ser útil para bloquear la unión del ligando natural con la proteina SIGLEC-6 en la superficie de mastocitos. Con el fin de romper la tolerancia, se puede conjugar el péptido con cualquier epítopo de células T, por ejemplo, la toxina tetánica, toxina difteria o tos ferina.
POLINUCLEÓTIDOS QUE CODIFICAN ANTICUERPOS La presente invención además proporciona polinucleótidos que comprenden una secuencia nucleótida que codifica un anticuerpo de la presente invención y fragmentos del mismo. La presente invención también abarca polinucleótidos que hibridizan en condiciones severas o de baja exigencia de hibridación, por ejemplo, tal como se define supra, con polinucleótidos que codifican un anticuerpo que de manera especifica se une a la proteina SIGLEC-6, de preferencia, un anticuerpo que se une a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, particularmente el dominio extracelular de SEQ ID NO 2. Se pueden obtener los polinucleótidos y la secuencia nucleótida de los polinucleótidos determinados, empleando los métodos de secuenciación de ácido nucleico comunes conocidos en la técnica. Si se conoce la secuencia nucleótida del anticuerpo, se puede ensamblar un polinucleótido que codifique el anticuerpo a partir de oligonucleótidos químicamente sintetizados (por ejemplo, tal como se describe en Kutmeier et al., Bio Techniques 17:242(1994)), la cual, en breve, involucra la síntesis de oligonucleótidos superpuestos que contienen porciones de la secuencia que codifica el anticuerpo, anulación y ligación de esos oligonucleótidos, y después la amplificación de los oligonucleótidos ligados mediante PCR. Alternativamente, se puede generar un polinucleótido que codifique un anticuerpo a partir de ácido nucleico proveniente de una fuente adecuada. Si no se cuenta con un clon que contenga un ácido nucleótido que codifique un anticuerpo particular, pero se conoce la secuencia de la molécula anticuerpo, se puede sintetizar químicamente un ácido nucleico que codifique la inmunoglobulina o se puede obtener a partir de una fuente adecuada (por ejemplo, una genoteca de ADNc de anticuerpo, o una genoteca de ADNc generada a partir de, o un ácido nucleico, de preferencia poli A + ARN, aislado de, cualquier tejido o célula que exprese el anticuerpo, por ejemplo, células de hibridoma seleccionadas para expresar un anticuerpo de la presente invención) mediante amplificación PCR empleando cebadores sintéticos hibridizables en los extremos 3' y 5' de la secuencia o al clonar empleando una sonda de oligonucleótido especifica para la secuencia genética particular con el fin de identificar, por ejemplo, un clon de ADNc a partir de una genoteca de ADNc que codifique el anticuerpo. Después se pueden clonar ácidos nucleicos amplificados generados por PCR en los vectores clonantes replicables empleando cualquier método bien conocido en la técnica. Una vez que se determina la secuencia nucleótida y la secuencia de aminoácidos correspondiente del anticuerpo, se puede manipular la secuencia nucleótida del anticuerpo empleando los métodos bien conocidos en la técnica para la manipulación de secuencias nucleótidas, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante, mutagénesis dirigida al sitio, PCR, etc. (véase, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. y Ausubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, las cuales se incorporan como referencia en nuestra descripción en sus totalidades) , para generar anticuerpos que tengan una distinta secuencia de aminoácidos, por ejemplo, para crear sustituciones, eliminaciones y/o inserciones de aminoácidos. En una modalidad específica, la secuencia de aminoácidos de los dominios variables de cadena pesada y/o cadena ligera pueden ser inspeccionados para identificar las secuencias de regiones determinantes de complementariedad (CDR) mediante métodos que son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante la comparación con secuencias de aminoácidos conocidas de otras regiones variables de cadena pesada y cadena ligera para determinar las regiones de hipervariabilidad de secuencia. Empleando técnicas de ADN recombinante de rutina, se puede insertar una o más de las CDR dentro de las regiones estructurales, por ejemplo, en las regiones estructurales de origen humano para humanizar un anticuerpo no humano, tal como se describe en lo anterior. Las regiones estructurales pueden ser de origen natural o regiones estructurales de consenso, y de preferencia pueden ser regiones estructurales de origen humano (véase, por ejemplo, Chothia et al., J. Mol. Biol. 278: 457-479 (1998) para una lista de regiones estructurales de origen humano) . De preferencia, el polinucleótido generado mediante la combinación de las regiones estructurales y de las CDR codifica un anticuerpo que de manera específica se une a un polipéptido de la presente invención. De preferencia, como se discutió en lo anterior, se puede elaborar una o más sustituciones de aminoácidos dentro de las regiones estructurales, y de preferencia, las sustituciones de aminoácido mejoran la unión del anticuerpo con su antigeno. Adicionalmente, se pueden emplear este tipo de métodos, para elaborar sustituciones o eliminaciones de aminoácidos de uno o más residuos de cisteína de región variable que participen en un enlace de disulfuro intracadena con el fin de generar moléculas de anticuerpo que carezcan de uno o más enlaces de disulfuro intracadena. La presente invención abarca otras alteraciones al polinucleótido y estas alteraciones están dentro de la experiencia de la técnica. Además, se pueden emplear técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison et al, Proc. Nati. Acad. Sci. 81:851-855 (1984); Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984); Takeda et al., Nature 314:452-454 (1985)) al cortar y empalmar genes de una molécula de anticuerpo de origen murino de especificidad antigena apropiada juntos con genes de una molécula de anticuerpo de origen humano de actividad biológica apropiada. Tal como se describió en lo anterior, un anticuerpo quimérico es una molécula en la cual se derivan porciones distintas de especies animales distintas, por ejemplo, aquellas que tienen una región variable derivada de mAb de origen murino y de una región constante de inmunoglobulina de origen humano, por ejemplo, anticuerpos humanizados . Alternativamente, se pueden adaptar las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de una sola cadena (patente de los Estados Unidos No. 4,946,778; Bird, Science 242:423-42 (1988); Huston et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); y la obra de Ward et al., Nature 334:544-54 (1989)) para producir anticuerpos de una sola cadena. Los anticuerpos de una sola cadena son formados al enlazar los fragmentos de cadena pesada y cadena ligera de la región Fv via un puente de aminoácidos, lo que produce un polipéptido de una sola cadena. También se pueden emplear técnicas para el montaje de fragmentos Fv funcionales en E. coli (Skerra et al., Science242: 1038-1041 (1988) ) .
VECTORES En otro aspecto, la presente invención proporciona a un vector que comprende una secuencia nucleótida que codifica anticuerpos anti-SIGLEC-6 de la presente invención, y una célula hospedera que comprende este vector. En sistemas bacterianos, se pueden seleccionar de manera ventajosa varios vectores de expresión dependiendo del uso pretendido para la molécula de anticuerpo que se está expresando. Por ejemplo, cuando se va a producir una cantidad grande de esta proteina, para la generación de composiciones farmacéuticas de una molécula de anticuerpo, pueden resultar deseables vectores que se dirijan a la expresión de altos niveles de productos de proteina de fusión que con facilidad se purifiquen. Ese tipo de vectores incluyen, entre otros, el vector pUR278 de expresión de E.coli (Ruther et al., EMBO J. 2:1791 (1983)), en el cual se puede ligar la secuencia codificadora de anticuerpo individualmente al vector en una estructura con la región codificadora de lac Z, de modo que se produzca una proteina de fusión; los vectores pIN (Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13:3101- 3109 (1985); y lo similar. También, se pueden emplear vectores pGEX para expresar polipéptidos extraños como proteínas de fusión de la glutationa-S-transferasa (GST, glutathione S-transferase) . En general, estas proteínas de fusión son solubles y se pueden purificar con facilidad a partir de células lisadas mediante la absorción y unión a perlas de glutationa-agarosa de matriz seguido por la elución de glutationina libre. Los vectores pGEX están diseñados para incluir trombina o sitios de escisión del factor Xa proteasa, de modo que el producto genético objetivo clonado pueda ser liberado de la entidad GST. En un sistema de insectos, se emplea el virus de polihedrosis nuclear (AcNPV, Virus Autographa californica de la polihedrosis nuclear) como un vector para expresar genes extraños . El virus crece en células Spodoptera frugiperda. Se puede clonar la secuencia codificadora de anticuerpo individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen de la polihedrina) del virus y se puede colocar bajo control de un promotor AcNPV (por ejemplo, el promotor de polihedrina) . En células hospederas de mamífero, se puede utilizar varios sistemas de expresión de base viral. En casos donde se emplea un adenovirus como un vector de expresión, se puede ligar la secuencia codificadora de anticuerpo de interés a un complejo de control de trascripción/translación de adenovirus, por ejemplo, el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Después se puede insertar este gen quimérico en el genoma del adenovirus mediante una recombinación in vitro o in vivo .
La inserción en una región no esencial del genoma viral (por ejemplo, región El o E3) producirá, un virus recombinante que es viable y capaz de expresar la molécula de anticuerpo en hospederos infectados. (Véase, por ejemplo, Logan .& Shenk, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:355-359 (1984)). Quizá también sean necesarias señales de iniciación específicas para la traslación eficiente de secuencias codificadoras de anticuerpo insertadas. Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG y las secuencias adyacentes. Aún más, el codón de iniciación puede estar en fase con el cuadro de lectura de la secuencia codificadora deseada para asegurar la traslación del inserto completo. Estas señales de control de translación exógenas y los codónes de iniciación pueden ser de una variedad de orígenes, tanto natural como sintético. Se puede intensificar la eficiencia de expresión mediante la inclusión de elementos intensificadores de trascripción apropiados, ter inadores de trascripción, etc. (Véase Bittner et al., Methods in Enzymol. 153:51-544 (1987)). Para la producción de alto rendimiento y a largo plazo de proteínas recombinantes, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, se pueden diseñar lineas celulares en las cuales se exprese establemente la molécula de anticuerpo. En lugar de utilizar vectores de expresión que contengan orígenes virales de replicación, se pueden transformar células hospederas con ADN controlado mediante elementos de control de expresión apropiados (por ejemplo, promotores, intensificadores, secuencias, terminadores de trascripción, sitios de poliadenilación, etc.), y mediante un marcador seleccionable. Después de la introducción del ADN extraño, se puede permitir que las células diseñadas crezcan durante 1-2 dias en medios enriquecidos, y después se pueden cambiar a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células se integren de manera estable al plásmido en sus cromosomas y crezcan formando foci, el cual a su vez se puede clonar y diseminar en las lineas celulares . Se puede usar de manera ventajosa este método para diseñar lineas celulares las cuales expresen la molécula de anticuerpo. Se pueden emplear varios sistemas de selección, entre los que se incluyen la timidina quinasa del virus del herpes simple (Wigler et al., Cell 11:223 (1977)), hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (Szybalska & Szybalski, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 48:202 (1992)), y se pueden emplear genes de la adenina fosforibosiltransferasa (Lowy et al., Cell 22:817 (1980)) en las células in tk-, hgprt- o aprt, respectivamente. También, se pueden emplear la resistencia a antimetabolitos como la base de selecciópn para los siguientes genes: dhfr, el cual confiere resistencia al metotrexato (Wigler et al., Nati. Acad. Sci. USA 77:357 (1980); O'Hare et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)); gpt, el cual confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan & Berg, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)); neo, el cual confiere resistencia al aminoglucósido G-418 Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu y Wu Biotherapy 3 : 87-95 (1991) ; Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol . 32:573- 596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); y Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); Mayo, 1993, TIB TECH 11 (5) : 155-215) ; e hygro, el cual confiere resistencia a la higromicina (Santerre et al., Gene 30:147 (1984)). Se pueden aplicar de manera rutinaria los métodos comúnmente conocidos en la técnica de tecnología de ADN recombinante con el fin de seleccionar el clon recombinante deseado, y este tiempo de métodos se describen, por ejemplo, en Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993) ; Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); y en los Capítulos 12 y 13, Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1 (1981), los cuales se incorporan como referencia a esta divulgación en sus totalidades. Se pueden incrementar los niveles de expresión de una molécula de anticuerpo mediante la amplificación de vectores (para una revisión, véase Bebbington y Hentschel, El uso de vectores con base en la aplicación genética para la expresión de genes clonados en células de mamíferos en la clonación de ADN, Vol .3. (Academic Press, New York, 1987)). Cuando un marcador en el sistema de vector que expresa el anticuerpo se puede amplificar, el incremento en el nivel del inhibidor presente en el cultivo de célula hospedera incrementará el número de copias del gen marcador. Dado que la región amplificada está asociada con el gen de anticuerpo, también se incrementará la producción del anticuerpo (Crouse et al., Mol. Cell. Biol. 3:257 (1983) ) . Se puede co-transfectar la célula hospedera con dos vectores de expresión de la presente invención, el primer vector que codifica un polipéptido derivado de cadena pesada y el segundo vector que codifica un polipéptido derivado de cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que puedan tener una expresión igual de los péptidos de cadena pesada y cadena ligera. Alternativamente, se puede usar un solo vector el cual codifique, y sea capaz de expresar tanto polipéptidos de cadena pesada como polipéptidos de cadena ligera. En estas situaciones, se deberá colocar la cadena ligera antes de la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada libre tóxica ( Proudfoot, Na ture 322:52 (1986); Kohler, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:2197 (1980),). Las secuencias codificadoras para las cadenas pesadas y cadenas ligeras pueden comprender ADNc y ADN genómico . Además, las secuencias que codifican péptidos de señal apropiados que no están actualmente asociados con SIGLEC-6 pueden ser incorporados en los vectores de expresión. Por ejemplo, se puede fusionar una secuencia nucleótida para un péptido señal (líder secretorio) en cuadro con la secuencia de polipéptidos, de modo que inicialmente se traduzca el anticuerpo anti-SIGLEC-6 como una proteina de fusión que comprende el péptido señal. Un péptido señal que es funcional en las células hospederas pretendidas intensifica la secreción extracelular del polipéptido apropiado. Se puede escisionar el péptido señal a partir del polipéptido con la secreción de la célula.
CÉLULAS HOSPEDERAS Las células hospederas adecuadas para la expresión de SIGLEC-6 y de polipéptidos anti-SIGLEC-6 incluyen células procarióticas, levadura y otras células eucarióticas. Las células procarióticas útiles como células hospederas en la presente invención incluyen organismos gram negativo o gram positivo, por ejemplo, E. coli o Bacilli. En una célula hospedera procariótica, un polipéptido puede incluir un residuo de metionina N-terminal para facilitar la expresión del polipéptido recombinante en la célula hospedera procariótica. Se puede escisionar el residió Met N-terminal a partir del polipéptido recombinante expresado receptor para SIGLEC-6. Las células promotoras que por lo común se emplean para los vectores de expresión de célula hospedera procariótica recombinante incluyen ß-lactamasa y el sistema promotor de lactosa. Las levaduras útiles como células hospederas en la presente invención incluyen aquellas provenientes de los genes Saccharomyces, Pichia, K. Actinomycetes y Kluyveromyces . A menudo los vectores de levadura contendrán un origen de secuencia de replicación proveniente de un plásmido de levadura de 2µ , una secuencia autónomamente replicadora (ARS, autonomously replicating sequence) , una región promotora, secuencias para la poliadenilación, secuencias para la terminación de trascripción y un gen marcador seleccionable. Las secuencias promotoras adecuadas para vectores de levadura incluyen, entre otros, promotores para metalotioneina, 3-fosfoglicerato cinasa (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, (1980)) u otras enzimas glucolíticas . En la técnica se conocen bien otros promotores adecuados y vectores adecuados para la levadura y para los protocolos de transformación de levadura. En la técnica es bien sabido que también se pueden emplear sistemas de cultivo de células hospederas de origen mamífero o de origen de insectos con el fin de expresar la proteina SIGLEC-6 recombinante, por ejemplo, sistemas de Baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células de insectos (Luckow y Summers, Bio/Technology 6:47 (1988)), o se pueden emplear células NSO o células de ovario de hámster chino (CHO, Chínese hámster ovary) para la expresión en mamíferos. A partir de genomas virales se pueden extirpar secuencias de control de trascripción o traducción para vectores de expresión de células hospederas de mamíferos. Las secuencias promotoras y las secuencias intensificadoras comúnmente empleadas se derivan de virus de polioma, Adenovirus 2, Virus 40 de Simio (SV40) y del citomegalovirus humano. Además, se puede elegir una cepa de célula hospedera la cual module la expresión de las secuencias insertadas, o modifique y procese el producto genético en la manera especifica deseada. Estas modificaciones (por ejemplo, la glucosilación) y procesamientos (por ejemplo, la escisión) de los productos de proteina pueden ser importantes para la función de la proteina. Distintas células hospederas tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento posterior a la traslación y para la modificación de proteínas y productos genéticos. Se pueden elegir líneas celulares o sistemas hospederos apropiados para asegurar la modificación correcta y procesamiento de la proteina extraña expresada. Para este fin, se pueden emplear células hospederas eucarióticas que posean el mecanismo celular para el procesamiento correcto del trascripto primario, glucosilación y fosforilación del producto genético. Este tipo de células hospederas de mamífero incluyen, entre otros, CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38, y en particular, líneas celulares de cáncer pulmonar, por ejemplo, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 y T47D, y una línea celular de glándula mamaria normal, por ejemplo, CRL7030 y Hs578Bst.
ANTICUERPOS La presente invención proporciona un anticuerpo que se une a la proteina SIGLEC-6 y métodos para la producción de este anticuerpo, incluidos anticuerpos que funcionan como agonistas nativos, antagonistas o ligadores de superficie, todos de o contra SIGLEC-6. Los anticuerpos de la presente invención incluyen, entre otros, anticuerpos policlonales, monoclonales, monovalentes, biespecíficos, heteroconjugados, multiespecíficos, humanos, humanizados o quiméricos, anticuerpos de una sola cadena, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), fragmentos producidos mediante la genoteca de expresión Fab, anticuerpos anti-idiotipicos (anti-Id) (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos anti-Id contra anticuerpos de la presente invención) , y fragmentos de unión epitopos de cualquiera de los anteriores. En una modalidad, el método comprende emplear polipéptidos que portan epitopos aislados de SIGLEC-6 o fragmentos antigénicos de los mismos como un inmunógeno para la producción de anticuerpos que se unen a SIGLEC-6 en un protocolo conocido para la producción de anticuerpos . Los métodos bien conocidos en la técnica incluyen, entre otros, inmunización in vivo, inmunización in vitro, y métodos de exhibición de fagos. Véase por ejemplo, Sutcliffe et al., supra; Wilson et al., supra, and Bittle et al., J. Gen. Virol., 66:2347-2354 (1985). Además, se pueden emplear polipéptidos de SIGLEC-6 para generar anticuerpos que de manera inmunoespecifica se unan a un polipéptido, fragmento de polipéptido o a una variante de SEQ ID NO: 2, y/o a un epitopo, tal como se determinó por los inmunoanálisis bien conocidos en la técnica para la evaluación de la unión especifica anticuerpo-antígeno. También se pueden seleccionar anticuerpos al cribar una genoteca de scFv de origen humano de aquellos que se unen a SIGLEC-6 (Griffiths et . Al., EMBO J. 12:725-734 (1993)). Se puede evaluar la especificidad y actividad de clones específicos empleando análisis conocidos (Griffiths et. Al.; Clarkson et . Al., Nature, 352:642-648 (1991) ) . Después del primer paso de cribado, se obtiene una genoteca de fagos que contiene una pluralidad de distintos anticuerpos de una sola cadena exhibidos en fagos que tienen una unión mejorada con la proteina SIGLEC-6. Los pasos posteriores de cribado proporcionan genotecas adicionales con mayores afinidades de unión. Se pueden llevar a cabo una exhibición monovalente con el uso de fagómido y fago auxiliar. El fago adecuado incluye los fagos filamentosos M13, fl y fd. En esta invención también se conoce y se puede usar la exhibición de proteínas de fusión con proteínas de revestimiento de virus . Para cribar anticuerpos que se unan a un epitopo particular en el antigeno de interés (por ejemplo, aquellos que bloquean la unión de cualquiera de los anticuerpos descritos en esta divulgación con la proteina SIGLEC-6) , se puede llevar a cabo un análisis de reticulación-bloqueo de rutina, como por ejemplo, el que se describe en A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lañe (1988). Alternativamente, se puede llevar a cabo un mapeo de epitopos, por ejemplo, el descrito en Champe et al., J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995), para determinar si el anticuerpo se une a un epítopo de interés . Los anticuerpos pueden ser fragmentos de unión a antígenos de origen humano de la presente invención e incluyen, entre otros, Fab, Fab1 y F(ab')2, Fd, Fvs de una sola cadena (scFv) , anticuerpo de una sola cadena, Fvs ligados a disulfuro (sdFv) y fragmentos que comprenden ya sea un dominio VL o VH. Los fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno, incluidos los anticuerpos de una sola cadena, pueden comprender la o las regiones variable solas en combinación con la totalidad o una porción de lo siguiente: región de bisagra, los dominios CH1, CH2 y CH3. También se incluyen en la presente invención los fragmentos de unión a antígeno que también comprenden cualquier combinación de región variable con una región de bisagra, dominios CH1, CH2 y CH3. Los anticuerpos de la presente invención también pueden provenir de cualquier origen animal incluidas las aves y los mamíferos. De preferencia, los anticuerpos son de origen humano, murino (por ejemplo, ratón y rata), ovejas, conejos, cabras, conejillos de indias, camellos, caballos o pollos. Tal como se usa en esta divulgación, el término anticuerpos "de origen humano" incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina de origen humano e incluyen anticuerpos aislados de genotecas de inmunoglobulina de origen humano o provienen de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas de origen humano y que no expresan inmunoglobulinas endógenas, tal como se describe infra, como por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos No. 5,939,598 de Kucherlapati et al. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser monoespecificos, biespecíficos, triespecificos o de una multiespecificidad mayor. Los anticuerpos multiespecificos pueden ser específicos para distintos epítopos de un polipéptido de la presente invención o pueden ser específicos para tanto un polipéptido de la presente invención asi como para un epitopo heterólogo, por ejemplo, un polipéptido heterólogo o un material de soporte sólido. Véase por ejemplo, las publicaciones de PCT WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, et al., J. Immunol . 147 : 60- 69 (1991 ) ; las patentes de los Estados Unidos Nos. 4,474,893; 4,714,681; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,819; Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992) . Se pueden describir o especificar los anticuerpos de la presente invención en términos de uno o varios epítopos o una o varias porciones de un polipéptido de la presente invención al cual reconocen o de manera especifica se unen. Se puede especificar el o los epitopos o una o varias porciones de polipéptido tal como se describe en esta divulgación, por ejemplo, mediante las posiciones N-terminal y C-terminal o mediante el tamaño en los residuos de aminoácidos contiguos.
También se pueden describir o especificar los anticuerpos de la presente invención en términos de su reactividad cruzada. Se incluyen los anticuerpos que no se unen a ningún otro análogo, ortólogo u homólogo de un polipéptido de la presente invención. Los anticuerpos que se unen a polipéptidos con por lo menos 95%, por lo menos 90%, por lo menos 85%, por lo menos 80%, por lo menos 75%, por lo menos 70%, por lo menos 65%, por lo menos 60%, por lo menos 55% y por lo menos 50% de identidad (según lo calculado empleando métodos conocidos en la técnica y como se describe en esta divulgación) con respecto a un polipéptido de la presente invención también están incluidos en la presente invención. Los anticuerpos que no se unen a polipéptidos en por lo menos 95%, por lo menos 90%, por lo menos 85%, por lo menos 80%, por lo menos 75%, por lo menos 70%, por lo menos 65%, por lo menos 60%, por lo menos 55%, y por lo menos 50% de identidad (según lo calculado empleando métodos conocidos en la técnica y como se describe en esta divulgación) con respecto a un polipéptido de la presente invención también están incluidos en la presente invención. En una modalidad especifica, la reactividad cruzada anteriormente descrita es con respecto a cualquier polipéptido antígeno o inmunogénico específico solo, o con respecto a una combinación o combinaciones de 2, 3, 4, 5 o más de los polipéptidos antígenos y/o inmunogénicos descritos en esta divulgación. Además en la presente invención se incluyen los anticuerpos que se unen a polipéptidos codificados por polinucleótidos que hibrizan con un polinucleótido de la presente invención bajo condiciones severas de hibridación (tal como se describe en esta divulgación) . También se pueden describir o especificar los anticuerpos de la presente invención en términos de su afinidad de unión hacia un polipéptido de la presente invención. Las afinidades de unión preferidas pueden fluctuar en la constante de disociación o kd de 10~2 M a 10"15 M. Los anticuerpos de la presente invención pueden actuar como agonistas, antagonistas o ligadores específicos de la proteína SIGLEC-6. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos que interrumpen las interacciones receptor/ligando entre la proteína SIGLEC y su ligando ya sea parcial o totalmente. Se puede determinar la activación del receptor (es decir, la señalización) mediante técnicas descritas en esta divulgación o mediante otra técnica conocida en la técnica. Por ejemplo, se puede determinar la activación del receptor al detectar la fosforilación (por ejemplo, la tirosina o serina/treonina) del receptor o de su sustrato mediante inmunoprecipitación seguido por el análisis de transferencia Western (por ejemplo, tal como se describe en lo anterior) . Además en la presente invención se incluyen anticuerpos que activan al receptor. Estos anticuerpos pueden actuar como agonistas del receptor, es decir, potencializar o activar ya sea todas o un subconjunto de las actividades biológicas de la activación del receptor mediada por ligando. Se pueden especificar los anticuerpos como agonistas, antagonistas o como agonistas inversos por las actividades biológicas que comprenden las actividades biológicas específicas. Se pueden elaborar los anteriores agonistas de anticuerpo empleando métodos conocidos en la técnica. Véase por ejemplo, la publicación PCT WO 96/40281; la patente de los Estados Unidos No. 5,811,097; Deng et al., Blood 92 (6) : 1981-1988 (1998); Chen et al., Cáncer Res. 58 (16) : 3668-3678 (1998); Harrop et al., J. Immunol. 161 (4): 1786-1794 (1998); Zhu et al., Cáncer Res. 58 (15) :3209-3214 (1998); Yoon et al., J. Immunol . 160(7) .-3170-3179 (1998); Prat et al., J. Cell. Sci. 11 (Pt2) :237-247 (1998); Pitard et al., J. Immunol . Methods 205(2) :177-190 (1997); Liautard et al., Cytokine 9(4):233-241 (1997); Carlson et al., J. Biol. Chem. 272 (17 ): 11295-11301 (1997); Taryman et al., Neuron 14 (4 ): 755-762 (1995); Muller et al., Structure 6 (9) : 1153-1167 (1998); Bartunek et a Cytokine 8(l):14-20 (1996) (las cuales todas se incorporan como referencia a esta divulgación en sus totalidades) .
Tal como se discute más adelante con mayor detalle, se pueden emplear los anticuerpos de la presente invención ya sea solos o en combinación con otros compuestos o composiciones. Los anticuerpos además se pueden fusionar de manera recombinante con un polipéptido heterólogo en la N- o C-terminal o se pueden químicamente conjugar (incluyendo las conjugaciones covalente y no covalentes) con polipéptidos o con otras composiciones. Por ejemplo, se pueden fusionar o conjugar de manera recombinante los anticuerpos de la presente invención con moléculas útiles como etiquetas en el análisis de diagnóstico o detección y con moléculas efectoras, por ejemplo, polipéptidos heterólogos, fármacos, radionucleótidos o toxinas. Véase, por ejemplo, las publicaciones de PCT WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; la patente de los Estados Unidos No. 5,314,995; y en el documento EP 396,387. Los anticuerpos de la presente invención incluyen derivados que son modificados, por ejemplo, mediante la adhesión covalente de cualquier tipo de molécula al anticuerpo de modo que la adhesión covalente no evite que el anticuerpo genere una respuesta anti-iodotipica. Por ejemplo, pero no de una manera limitante, los derivados de anticuerpo incluyen anticuerpos que han sido modificados, por ejemplo, mediante la glucosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivación mediante grupos protectores-bloqueadores conocidos, escisión proteolítica, unión a un ligando celular u a otra proteina, por ejemplo la albúmina, etc. Se pueden llevar a cabo cualquiera de numerosas modificaciones químicas mediante técnicas conocidas entre las que se incluyen, la escisión química especifica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Además, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.
MÉTODO PARA ELABORAR ANTICUERPOS CONTRA SIGLEC-6 Se pueden elaborar los anticuerpos de la presente invención mediante cualquier método conocido. Por lo habitual, se puede administrar un fragmento o proteina de polipéptido de la proteina SIGLEC-6 a varios animales hospederos, entre los que se incluyen, conejos, ratones, ratas, etc., para inducir la producción de sueros que contengan anticuerpos policlonales específicos para la proteina SIGLEC-6. La administración de un polipéptido de la proteína SIGLEC-6 puede implicar una o más inyecciones de un agente inmunizante y, si se desea, un adyuvante. Se pueden emplear varios adyuvantes para incrementar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie hospedera, e incluyen entre otros, el agente de Freund (completo e incompleto) , geles minerales, como por ejemplo, hidróxido de aluminio, sustancias activas superficiales, por ejemplo, la lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, hemocianina de lapa californiana, dinitrofenol, y adyuvantes de origen humano potencialmente útiles, como por ejemplo, BCG (bacille Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Este tipo de adyuvantes también son bien conocidos en la técnica. Para los propósitos de la presente invención, el término "agente inmunizante" se puede definir como un polipéptido de la presente invención, incluidos los fragmentos, variantes y/o derivados del mismo, además de fusiones con polipéptidos heterólogos y otras formas de polipéptidos descritos en esta divulgación. Por lo habitual, el agente inmunizante y/o adyuvante se inyectará al mamífero mediante múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales, aunque también se puede administrar por vía intramuscular y/o por vía IV. El agente inmunizante puede incluir polipéptidos de la proteina SIGLEC-6 o una proteína de fusión o variantes de los mismos. Dependiendo de la naturaleza de los polipéptidos (es decir, el porcentaje de hidrofobicidad, el porcentaje de hidrofilicidad, la estabilidad, la carga neta, el punto isoeléctrico, etc.), pueden resultar útiles para conjugar el agente inmunizante con una proteína conocida que se sabe es inmunogénica en el mamífero que se va a inmunizar. Este tipo de conjugación incluye la conjugación química mediante la derivación de grupos funcionales químicos activos con el péptido de la presente invención y con la proteina inmunogénica de modo que se forme un enlace covalente, o bien mediante la metodología basada en la proteina de fusión, o mediante otros métodos conocidos por los expertos en la técnica. Los ejemplos de este tipo de proteínas inmunogénicas incluyen, entre otros, hemocianina de lapa californiana, albúmina sérica, tiroglobulina de bovino y el inhibidor de tripsina de soya. Se pueden emplear varios adyuvantes para incrementar la respuesta inmunológica, dependiendo de las especies hospederas, entre las que se incluyen, el agente de Freund (completo e incompleto), sales minerales, como por ejemplo, el hidróxido de aluminio, sustancias activas superficiales, por ejemplo, la lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, hemocianina de lapa californiana, dinitrofenol, y adyuvantes de origen humano potencialmente útiles, como por ejemplo, BCG (bacille Calmette-Guerin) y Corynebacgterium parvum. Se pueden emplear ejemplos adicionales de adyuvantes que incluyan el adyuvante MPL-TDM (monofosforil lipido A, trehalosa dicorinomicolato sintético) . Se puede inmunizar el animal empleando células completas. Por lo general, se emplean linfocitos de sangre periférica ("PBL, peripheral blood lymphocytes ) si se desean células de origen humano, o se emplean células esplénicas o células del ganglio linfático si se desean fuentes de mamíferos de origen no humano. También se puede inmunizar el animal hospedero empleando un vector de expresión que contenga un ADNc que codifique la proteína inmunogénica deseada. Alguien experto en la técnica puede seleccionar el protocolo de inmunización sin necesidad de experimentación innecesaria. Los anticuerpos de la presente invención pueden comprender anticuerpos monoclonales . Se pueden preparar anticuerpos monoclonales empleando los métodos de hibridoma, por ejemplo, aquellos descritos por Kohler y Milstein, Nature, 256:495 (1975) y en la patente de los Estados Unidos No. 4,376,110, de Harlow, et al., Antibodies : A Laboratory Manual, (Cold spring Harbor Laboratory Press, 2.su?.nd ed. (1988), de Hammerling, et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas (Elsevier, N.Y., (1981)), u otros métodos conocidos por el técnico. Otros ejemplos de métodos que se pueden emplear para producir anticuerpos monoclonales incluyen, entre otros, la técnica de hibridomas de células B de origen humano (Kosbor et al., 1983, I munology Today 4:72; Colé et al., 1983, Proc . Nati . Acad. Sci . USA 80:2026- 2030), y la técnica de hibridoma EB (Colé et al., 1985, Monoclonal Antibodies And Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., págs. 77-96). Este tipo de anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina entre las que se incluyen IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquier subclase de las mismas. El hibridoma producido mediante el mAb de esta invención puede ser cultivado in vitro o in vivo . La producción de altos títulos de mAbs in vivo hace de esto el método actualmente preferido de producción. En un método de hibridoma, un ratón, un ratón humanizado, un ratón con un sistema inmunitario humano, un hámster u otro animal hospedero apropiado, por lo habitual es inmunizado con un agente inmunizante para obtener linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que de manera especifica se unirán al agente inmunizante. Alternativamente, se pueden inmunizar los linfocitos in vitro . Posteriormente se fusionan los linfocitos con una línea celular inmortalizada empleando un agente de fusión adecuado, por ejemplo, polietilen glicol, con el fin de formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies : Principies and Practice, Academic Press, (1986), págs. 59-103). Las líneas celulares inmortalizadas por lo usual son células transformadas de mamífero, particularmente células de mieloma de origen murino, bovino y humano. Por lo habitual, se emplean líneas celulares de mieloma de ratón o rata. Se pueden cultivar las células de hibridoma en un medio de cultivo adecuado que de preferencia contenga una o más sustancias que inhiban el crecimiento o supervivencia de las células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células parentales carecen de enzima hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferasa (HGPRT, enzyme hypoxanthine guanine phosphoribosyl transf erase, o HPRT, Hypoxanthine- guanine phosphoribosyl transf erase) , el medio de cultivo para las hibridomas por lo habitual incluirá hipoxantina, aminofterina y timidina ("medio HAT"), cuyas sustancias evitan el crecimiento de las células deficientes de HGPRT. Las líneas celulares inmortalizadas preferidas son aquellas que se fusionan de manera eficaz, soportan establemente un alto nivel de expresión estable del anticuerpo mediante las células productoras de anticuerpo seleccionadas, y son sensibles a un medio, por ejemplo, el medio HAT. Las líneas celulares inmortalizadas más preferidas son líneas de mieloma de origen murino, las cuales se pueden obtener, por ejemplo, a partir de Institute Cell Distribution Center, San Diego, 'Calif, y de American Type Culture Collection, Manassas, Va. Tal como se ha inferido en toda la especificación ratón-humano también han sido descritas para la producción de anticuerpos monoclonales de origen humano (Kozbor, J. Immunol . , 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp . 51-63). El medio de cultivo, en el cual se cultivan las células de hibridoma, posteriormente puede ser analizado para detectar la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra los anticuerpos de la presente invención. De preferencia, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos mediante las células de hibridoma es determinada mediante la inmunoprecipitación o mediante un análisis de unión in vitro, por ejemplo, el radioinmunoanálisis (RÍA) o mediante el enzimoinmunoanálisis de absorción (ELISA, enzyme-linked immunoadsorbant assay) . Este tipo de técnicas son bien conocidas en la técnica y están dentro de la experiencia del técnico. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede, como por ejemplo, ser determinada mediante el análisis de Scatchard de Munson y Pollart, Anal. Biochem., 107:220(1980) . Después de que se han identificado las células de hibrodoma deseadas, se pueden subclonar los clones al limitar los procedimientos de dilución y se pueden hacer crecer mediante métodos estándares (Goding, supra) . Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, el medio de Eagle modificado de Dulbecco y el medio RPMI-1640. Alternativamente, se puede hacer crecer las células de hibridoma in vivo como ascitis en un mamífero . Los anticuerpos monoclonales segregados mediante los subclones pueden ser aislados o purificados a partir de medios de cultivo o del fluido de ascitis mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulina, por ejemplo, proteína A-sefarosa, cromatografía mediante hidroxiapatita, cromatografía mediante exclusión por gel, electroforesis por gel, diálisis o cromatografía por afinidad. El técnico experto sabrá que existe una variedad de métodos en la técnica para la producción de anticuerpos monoclonales y, por lo tanto, la presente invención no está limitada a una sola producción en hibridomas. Por ejemplo, se pueden elaborar los anticuerpos monoclonales mediante métodos de ADN recombinante, por ejemplo, los descritos en la Patente de los Estados Unidos No. 4,816,567. En este contexto, el término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo derivado de un solo clon eucariótico, fago o clon procariótico. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la presente invención puede ser aislado y secuenciados con facilidad empleando procedimientos convencionales (por ejemplo, empleando sondas de oligonucleótidos que sean capaces de unirse de manera especifica a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos de origen murino, o empleando estas cadenas provenientes de un origen humano, humanizado o de otras fuentes) . Las células de hibridoma de la presente invención sirven como una fuente preferida de este tipo de ADN . Una vez aislado, se puede colocar el ADN en vectores de expresión, los cuales posteriormente se transforman en células hospederas, por ejemplo, células COS de simio, las células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de ningún otro modo produzcan proteína de inmunoglobulina, con el fin de obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospederas recombinantes. También se puede modificar el ADN, por ejemplo, al sustituir la secuencia codificadora para los dominios constante de cadena ligera y cadena pesada en lugar de las secuencias homologas de origen murino (patente de los Estados Unidos No. 4,816,567; Morrison et al, supra) o mediante la unión covalente con toda la secuencia codificadora de inmunoglobulina o con parte de la secuencia codificadora para un polipéptido de no inmunoglobulina. Este tipo de polipéptido de no inmunoglobulina puede ser sustituido por los dominios constantes de un anticuerpo de la presente invención, o se puede sustituir por los dominios variables de un sitio de combinación de antigeno de un anticuerpo de la presente invención para crear un anticuerpo bivalente quimérico. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monovalentes. En la técnica se conocen bien los métodos para la preparación de anticuerpos monovalentes. Por ejemplo, un método implica la expresión recombinante de cadena pesada modificada y cadena ligera de inmunoglobulina. La cadena pesada por lo general se trunca en cualquier punto en la región Fe de modo que se evite la reticulación de la cadena pesada. Alternativamente, se sustituyen los residuos de cisteina relevante con otro residuo de aminoácido o se elimina con el fin de evitar la reticulación. Los métodos in vitro también son adecuados para la preparación de anticuerpos monovalentes. La digestión de anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, particularmente los fragmentos Fab, puede ser llevada a cabo empleando técnicas de rutina conocidas en la técnica. Se pueden preparar anticuerpos monoclonales empleando una amplia gama de técnicas conocidas en la técnica, incluido el uso de tecnología de hibridoma, recombinantes y tecnologías de exhibición de fagos, o una combinación de las mismas. Por ejemplo, se puede producir anticuerpos monoclonales empleando técnicas de hibridoma incluidas aquellas conocidas en la técnica y encontradas en por ejemplo, en Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988) ; Hammerling, et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N. Y., 1981) (estas referencias se incorporan en sus totalidades como referencias) . El término "anticuerpo monoclonal" como se emplea en esta divulgación no está limitado a anticuerpos producidos a través de tecnología de hibridoma. El término "anticuerpo- monoclonal" se refiere a un anticuerpo que sea derivado de un solo clon, incluido cualquier clon eucariótico, procariótico, o un clon fágico, y no por el método por el cual fue producido. Los métodos para producir y cribar anticuerpos específicos empleando tecnología de hibridoma son de rutina y bien conocidos en la técnica y se discuten con detalle en los ejemplos de esta divulgación. En un ejemplo no restrictivo, se pueden inmunizar ratones con un polipéptido de la invención o con una sola célula que exprese este péptido. Una vez que se detecta una respuesta inmunitaria, por ejemplo, se detectan anticuerpos específicos para el antígeno en el suero de ratón, se cosecha el bazo del ratón y se aislan los esplenocitos . Posteriormente se fusionan los esplenocitos, mediante técnicas bien conocidas, con cualquier célula de mieloma adecuada, por ejemplo, células de la línea celular SP20 que se pueden conseguir en la ATCC. Se seleccionan y clonan las hibridomas mediante dilución limitada. Posteriormente se evalúan los clones de hibridoma mediante métodos conocidos en la técnica para células que segregan anticuerpos capaces de unirse a un polipéptido de la presente invención. Se puede generar el fluido de ascitis, que en términos generales contienen altos niveles de anticuerpos, al inmunizar ratones con clones de hibridoma positivo. En otra modalidad, también se pueden generar los anticuerpos de la presente invención empleando varios métodos de exhibición de fagos conocidos en la técnica. En los métodos de exhibición de fagos, se exhiben dominios de anticuerpos funcionales en la superficie de las partículas fágicas, las cuales portan las secuencias polinucleótidas que las codifican. En una modalidad particular, se puede utilizar estos fagos para exhibir dominios de unión antígeno expresados a partir de una genoteca de anticuerpo combinatoria o repetitiva (por ejemplo, de origen humano o murino) . Un fago que expresa un dominio de unión a fago que se une al antígeno de interés pueden ser seleccionados o identificados con un antigeno, por ejemplo, empleando un antígeno etiquetado o con un antigeno enlazado o capturado en una superficie sólida o perla. Los fagos empleados en estos métodos por lo habitual son fagos filamentosos que incluyen los dominios de unión fd y M13 expresados a partir del fago con Fab, Fv o dominios de anticuerpo Fv estabilizados con disulfuro fusionados de manera recombinante con la proteina del gen III o gen VIII fágico. Los ejemplos de métodos de exhibición de fagos que pueden ser empleados para obtener los anticuerpos de la presente invención incluyen aquellos descritos en Brinkrnan et al., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952- 958 (1994); Persic et al., Gene 187 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57:191-280 (1994); solicitud PCT No. PCT/GB91/01134 ; publicaciones PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,698,426; 5,223,409 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727 5,733,743; y 5,969,108; cada uno de los cuales se incorpora a esta divulgación como referencia en su totalidad. Tal como se describe en las referencias anteriores, después de la selección de fagos, se puede aislar las regiones codificadoras de anticuerpo a partir del fago y se pueden usar para generar anticuerpos completos, incluidos anticuerpos de origen humano o cualquier otro fragmento de unión a antígeno deseado, y se pueden expresar en cualquier hospedero, incluidas células de mamíferos, células de insectos, células vegetales, células de levadura y bacterias, por ejemplo, tal como se describe con detalle lineas arriba. Por ejemplo, también se pueden emplear técnicas para producir fragmentos Fab, Fab' y F(ab')2 empleando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, aquellos descritos en la publicación PCT WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12(6) :864- 869 (1992); y Sawai et al., AJRI 34:26-34 (1995); y Better et al., Science 240:1041- 1043 (1988) (estas referencias se incorporan como referencia en sus totalidades) . Los ejemplos de las técnicas que pueden ser empleadas para Fvs de una sola cadena y anticuerpos incluyen aquellos descritos en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,946,778 y 5,258,498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993); y Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988). Para algunos usos, incluido el uso in vivo de anticuerpos en humanos y análisis de detección in vitro, puede resultar preferente usar anticuerpos quiméricos, humanizados o anticuerpos de origen humano. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la cual distintas porciones del anticuerpo se derivan de distintas especies animales, por ejemplo, anticuerpos que tienen una región variable derivada de un anticuerpo monoclonal de origen murino y de una región constante de inmunoglobulina de origen humano. Los métodos para la producción de anticuerpos quiméricos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., (1989) J. Im unol . Methods 125:191-202; las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,807,715; 4,816,567; y 4,816397, los cuales se incorporan como referencia a esta divulgación en sus totalidades. Los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpo de especies no humanas que se unen al antígeno deseado que tiene una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de especies no humanas y de regiones estructurales provenientes de una molécula inmunoglobulina de origen humano. A menudo, los residuos estructurales en las regiones estructurales de origen humano serán sustituidos con el residuo correspondiente proveniente del anticuerpo donador de CDR con el fin de alterar, de preferencia intensificar, la unión de antigeno. Estas sustituciones estructurales son identificadas mediante métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante la modelación de las interacciones de la CDR y de los residuos estructurales con el fin de identificar los residuos estructurales importantes para la unión del antigeno y para la comparación de secuencia con el fin de identificar residuos estructurales inusuales en posiciones particulares (Véase, por ejemplo, Queen et al., la patente de los Estados Unidos No. 5,585,089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988), las cuales se incorporan a esta regulación como referencia en sus totalidades) . Se pueden humanizar anticuerpos empleando una variedad de técnicas conocidas en la técnica, entre las que se incluyen, injerto de CDR (EP 239,400; publicación PCT WO 91/09967; las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,225,539; 5,530,101; y 5,585,089), chapeado o reformación de superficie (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28 (4/5) : 489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al., PNAS 91:969-973 (1994)) y permuta de cadena (patente de los Estados Unidos No. 5,565,332) . En términos generales, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en sí mismo provenientes de una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácidos de origen no humano a menudo son llamados como residuos de "importación", los cuales por lo habitual provienen de un dominio variable de "importación". Esencialmente, se puede llevar a cabo la humanización siguiendo los métodos de Winter y colaboradores, (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988), al sustituir las secuencias CDR o las CDR de origen murino por las secuencias correspondientes de un anticuerpo de origen humano. Por consiguiente, estos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente de los Estados Unidos No. 4,816,567), en donde prácticamente menos de un dominio variable intacto de origen humano ha sido sustituido por la secuencia correspondiente proveniente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados por lo habitual son anticuerpos de origen humano en los cuales se han sustituido algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos FR a partir de sitios análogos en los anticuerpos de origen murino. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá prácticamente todos los o por lo menos uno, y por lo habitual dos, dominios variables, en los cuales todas o prácticamente todas las regiones CDR corresponden con aquellas de una inmunoglobulina de origen no humano y todas o prácticamente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia de consenso de inmunoglobulina de origen humano. El anticuerpo humanizado de manera óptima también comprenderá por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe) ,por lo habitual una de una inmunoglobulina de origen humano (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988) y Presta, Curr. Op . Struct. Biol., 2:593-596 (1992). En las Figuras 6A y 6B se muestran la secuencia de ácidos nucleicos (SEQ ID NOs: 7 y 9) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NOs: 8 y 10) de las regiones variables de un anticuerpo preferido de la presente invención. SEQ ID NOs: 7 y 8 son el ácido nucleico y el aminoácido, respectivamente, de la región variable de cadena ligera, y SEQ ID NOs: 9 y 10 son el ácido nucleico y el aminoácido respectivamente de la región variable de cadena pesada, con CDR o regiones determinantes de complementariedad (regiones hipervariables) subrayadas en estas secuencias. Los anticuerpos preferidos adicionales de la presente invención tendrán una identidad de secuencia importante con ya sea una o ambas secuencias de cadena pesada y cadena ligera mostradas en las Figuras 6A y 6B . De manera más particular, los anticuerpos preferidos incluyen aquellos que tienen por lo menos aproximadamente 70 por ciento de homología (identidad de secuencia) con respecto a SEQ ID NOs: 8 y/o 10, con mayor preferencia aproximadamente 80 por ciento o más homología con respecto a SEQ ID NOs: 8 y/o 10, aún con mayor preferencia aproximadamente 85 por ciento, 90 ó 95 por ciento o más homología con respecto a SEQ ID NOs: 8 y/o 10. Los anticuerpos preferidos de la presente invención tendrán una alta identidad de secuencia con respecto a las regiones CDR (subrayadas en la Figura 6b) de SEQ ID NOs: 8 y/o 10. Los anticuerpos especialmente preferidos de la presente invención tendrán, una, dos o tres CDR de una región variable de cadena ligera que tenga una alta identidad de secuencia (por lo menos 90% o 95% de identidad de secuencia) con respecto o es la misma que la una, dos o tres CDR correspondientes de la región variable de cadena ligera de Mab 239-90 y son los siguientes: 1) KASQNVDYDGDSYMN (SEQ ID NO: 12); 2) AASNLES (SEQ ID NO: 14); y 3) QQSNEDPWT (SEQ ID NO: 16)). Los anticuerpos especialmente preferidos de la presente invención también contendrán una, dos o tres CDR de una región variable de cadena pesada que tenga una alta identidad de secuencia (por lo menos 90% o 95% de identidad de secuencia) con respecto con respecto o serán la misma que la una, dos o tres de las CDR correspondiente de la región variable de cadena pesada de Mab 239-90 y son los siguientes: 1) AYTFLTYYMN (SEQ ID NO: 18); 2) QIFPASGSTNYNEMFKG (SEQ ID NO: 20); y 3) SFGGGFAY (SEQ ID NO: 22) . Los ácidos nucleicos generalmente preferidos de la presente invención expresarán un anticuerpo de la invención que exhiba las afinidades de unión preferidas y otras propiedades descritas en esta divulgación. Los ácidos nucleicos preferidos de la presente invención también tendrán una identidad de secuencia importante con respecto a una o ambas secuencias de cadena pesada o cadena ligera mostradas en la Figura 6A. De manera más particular, los ácidos nucleicos preferidos contendrán una secuencia que tenga por lo menos aproximadamente 70 por ciento de homología (identidad de secuencia) con respecto a SEQ ID NOs: 7 y/o 9, de manera más preferente aproximadamente 80 por ciento o más homología con respecto a SEQ ID NOs: 7 y/o 9, aún con mayor preferencia aproximadamente 85 por ciento, 90 ó 95 por ciento o mayor homología con respecto a SEQ ID NOs: 7 y/o 9. Las secuencias de ácidos nucleicos particularmente preferidas de la presente invención tendrán una alta identidad de secuencia con respecto a CDR (mostradas subrayadas en la Figura 6A) de SEQ ID NOs: 7 y/o 9. Los ácidos nucleicos especialmente preferidos son aquellos que codifican una región variable de cadena ligera de anticuerpo y tienen una, dos o tres secuencias que codifican las CDR y tienen una alta identidad de secuencia (por lo menos 90% o 95% de identidad de secuencia) con respecto a o son la misma que una, dos o tres de las secuencias que codifican las CDR correspondientes de Mab 239-90 (aquellas regiones hipervariables mostradas subrayadas en la Figura 6 y son lo siguiente: 1) aaggccagccaaaatgttgattatgatggtgacagttatatgaac (SEQ ID NO: 11); 2) gctgcgtccaatctagaatct (SEQ ID NO: 13); y 3) cagcaaagtaatgaggatccgtggacg (SEQ ID NO: 15)). Los ácidos nucleicos especialmente preferidos también codifican una región de cadena pesada de anticuerpo y tienen una, dos o tres secuencias que codifican las CDR y también una alta identidad de secuencia (por lo menos 90% o 95% de identidad de secuencia) con respecto a o son las mismas que la una, dos o tres de las secuencias codificadoras de las CDR correspondientes de Mab 239-90 (aquellas CDR mostradas subrayadas en la Figura 6 y son los siguientes: 1) gcctataccttcctcacctactacatgaac (SEQ ID NO: 17) ; 2) cagatttttcctgcaagtggtagtactaactacaatgagatgttcaagggc (SEQ ID NO: 19); y 3) tctttcgggggggggtttgcttac (SEQ ID NO: 21) ) . Los anticuerpos también pueden comprender una o más de las CDR descritas en esta divulgación en las cuales se sustituye, elimina o agrega uno o más aminoácidos (por ejemplo, con un aminoácido conservado) . Los anticuerpos completamente humanos son particularmente deseables para el tratamiento terapéutico de pacientes humanos. Se pueden elaborar anticuerpos humanos mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica, entre los que se incluyen, métodos de escisión de fagos descritos anteriormente empleando las genotecas de anticuerpo derivadas de secuencias de inmunoglobulina de origen humano. También véase, las Patentes de Estados Unidos Nos. 4,444,887 y 4,716,111 ; y las publicaciones PCT WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, y WO 91/10741; las cuales se incorporan a esta divulgación como referencia en sus totalidades. La técnica de Colé et al., y Boerder et al., también están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (colé et al., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Riss, (1985) ; y Boerner et al., J. Immunol . , 147 (1) : 86-95, (1991)). También se pueden producir anticuerpos humanos empleando ratones transgénicos que sean incapaces de expresar inmunoglobulinas endógenas funcionales, pero que puedan expresar genes de inmunoglobulina de origen humano. Por ejemplo, los complejos de gen de inmunoglobulina de cadena pesada y cadena ligera de origen humano pueden ser introducidos aleatoriamente o mediante recombinación homologa en células madres embrionarias de ratón. Alternativamente, la región variable humana, la región constante, y la región de diversidad pueden ser introducidas en células madre embrionarias de ratón, además de los genes de cadena pesada y cadena ligera de origen humano. Los genes de inmunoglobulina de cadena pesada y cadena ligera de origen murino se pueden convertir en no funcionales por separado o simultáneamente con la introducción de locus de inmunoglobulina humana mediante la recombinación homologa. En particular, la eliminación de homocigotos de la región JH evita la producción de anticuerpos endógenos. Las células madre embrionarias modificadas se diseminan y microinyectan en blastocitos para producir ratones quiméricos . Después se engendran ratones quiméricos para producir la descendencia de homocigotos que expresen anticuerpos humanos. Se inmunizan los ratones transgénicos de manera normal con un antigeno seleccionado, por ejemplo, con todo o con una porción de un polipéptido de la presente invención. Los anticuerpos monoclonales dirigidos hacia el antigeno pueden ser obtenidos a partir de ratones inmunizados o transgénicos empleando tecnología de hibridoma convencional. Los transgenes de inmunoglobulina de origen humano obtenidos de ratones transgénicos se reacomodan durante la diferenciación de las células B, y posteriormente experimentan un intercambio de clase y una mutación somática. Por lo tanto, al utilizar esta técnica, es posible producir anticuerpo IgG, IgA, IgM e IgE terapéuticamente útiles. Para una revisión de esta tecnología para producir anticuerpos humanos, véase Lonberg y Huszar, Int. Rev. Inmunol . 13:65-93(1995). Para una discusión detallada de esta tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y de protocolos para producir este tipo de anticuerpos véase, por ejemplo, las publicaciones de PCT WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; patente europea No. 0 598 877; las patentes de los Estados Unidos Nos. ,413,923; 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806; 5,814,318; 5,885,793; 5,916,771; y 5,939,598, las cuales se incorporan como referencia en esta divulgación en sus totalidades. Además, a empresas como Abgenix, Inc. (Freemont, Calif.), Genpharm (San José, Calif.) y Medarex, Inc. (Princeton, N.J.) se les puede solicitar proveer anticuerpos humanos dirigidos contra un antigeno seleccionado empleando una tecnología similar a la descrita anteriormente. De modo semejante, se pueden elaborar anticuerpos humanos al introducir locus de inmunoglobulina de origen humano en animales transgénicos, por ejemplo, ratones en los cuales se haya parcial o completamente inactivado los genes de inmunoglobulina endógena. Con el desafío, se observa que la producción de anticuerpos de origen humano, la cual tiene una gran similitud que la observada en el ser humano en todos los sentidos, incluye el rearreglo de genes, ensamble y creación de un repertorio de anticuerpos. Se describe esta metodología, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; ,625,126; 5,633,425; 5,661,106, y en las siguientes publicaciones científicas: Marks et al., Biotechnol., :779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994); Fishwild et al., Nature Bíotechnol . , 14:845-51 (1996); ?euberger, Nature Biotechnol . , 14:826 (1996); Lonberg y Huszer, Intern. Rev. Immunol . , 13:65-93 (1995). Se pueden generar anticuerpos completamente humanos que reconozcan un epitopo seleccionado empleando una técnica llamada "selección guiada". En esta metodología se emplea un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, por ejemplo, un anticuerpo de origen murino, para guiar la selección de un anticuerpo completamente humano que reconozca el mismo epítopo. (Jespers et al., Bio/technology 12:899-903 (1988) ) . Además, los anticuerpos contra la proteina SIGLEC-6, pueden ser usados, a su vez, para generar anticuerpos anti-iodotipos que "imiten" el receptor empleando técnicas bien conocidas por aquellos experimentados en la técnica. (Véase, por ejemplo, Greenspan & Bona, FASEB J. 7 (5) : 437-444; (1989) y Nissinoff, J. Immunol. 147 (8 ): 2429-2438 (1991)). Por ejemplo, anticuerpos que se unan e inhiban competitivamente la multimerización y/o la unión de SIGLEC-6 con un ligando pueden ser empleados con el fin de generar anti-iodotipos que "imiten" la multimerización de polipéptidos y/o el dominio de unión y, como consecuencia, se unan a y neutralicen la proteina SIGLEC-6 y/o a su ligando. Se puede usar esta neutralización de anti-iodotipos o fragmentos Fab de estos anti-iodotipos en regímenes terapéuticos para neutralizar ligandos de polipéptidos. Por ejemplo, se puede usar estos anticuerpos anti-iodotipicos para unir un polipéptido de la presente invención y/o unir sus lígandos/receptores y con ello bloquear su actividad biológica. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos biespecificos . Los anticuerpos biespecífieos son monoclonales, de preferencia humanos o humanizados, anticuerpos que tienen especificidades de unión para por lo menos dos antigenos distintos. En la presente invención, se puede dirigir una de las especificidades de unión hacia un polipéptido de la presente invención, el otro puede ser para cualquier otro antigeno, de preferencia para una proteína de superficie celular, receptor, sub-unidad receptora, antigeno específico a tejidos, proteína viralmente derivada, proteína de envoltura viralmente codificada, proteina bacterianamente derivada, o proteina de superficie bacteriana, etc. En la técnica se conocen los métodos para elaborar anticuerpos biespecificos . Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos está basada en la co-expresión de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas pesadas tienen distintas especificidades (Milstein y Cuello, Nature, 305:537-539(1983). Debido a la distribución aleatoria de cadenas pesada y cadena ligera de inmunoglobulina, estas hibridomas (quadromas) producen una mezcla potencial de diez distintas moléculas de anticuerpo, de las cuales una tiene la estructura biespecifica correcta. Por lo habitual se realiza purificación la molécula correcta mediante pasos de cromatografía por afinidad. Procedimientos similares se describen en el documento WO 93/08829, publicado el 13 de Mayo de 1993, y en la obra de Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991) . Dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) pueden ser fusionados a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. De preferencia la fusión es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende por lo menos parte de la bisagra, las regiones CH2 y CH3. Se prefiere tener la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contenga el sitio necesario para la unión de cadena ligera presente en por lo menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, son insertados en vectores de expresión separados, y son co-transformados en un organismo hospedero adecuado. Para detalles adicionales sobre la generación de anticuerpos biespecíficos véase, por ejemplo, Suresh et al., Meth, . In Enzym., 121:210 (1986) . La presente invención también contempla anticuerpos heteroconjugados. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos por dos anticuerpos covalentemente unidos. Estos anticuerpos han sido propuestos, por ejemplo, para dirigir las células de sistema inmunitario hacia células no deseadas (Patente de los Estados Unidos Número 4,676,980), y para el tratamiento de la infección de HIV (Documentos WO 91/00360; WO 92/20373 y EPO3089) . Se contempla que los anticuerpos pueden ser preparados in vitro empleando métodos conocidos en la química de síntesis de proteínas, incluidos aquellos métodos que implican agentes reticulantes. Por ejemplo, se pueden elaborar inmunotoxinas empleando una reacción de intercambio de disulfuro o al formar un enlace de tioéster. Los ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen el iminotiolato y metil-4-mercaptobutimiridato y aquellos descritos, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos Número 4,676,980.
MÉTODOS PARA PRODUCIR ANTICUERPOS Se pueden producir los anticuerpos de la presente invención mediante cualquier método conocido en la técnica para la generación o síntesis de anticuerpos, en particular, mediante síntesis química o mediante técnicas de expresión recombinante. La expresión recombinante de un anticuerpo de la presente invención, o fragmento, derivado o análogo del mismo (por ejemplo, una cadena pesada o una cadena ligera de un anticuerpo de la presente invención o un anticuerpo de cadena sola de la presente invención) , implica la construcción de un vector de expresión que contenga un polinucleótido que codifique el anticuerpo. Una vez que se haya obtenido un polinucleótido que codifique una molécula de anticuerpo, o una cadena pesada o una cadena ligera de un anticuerpo, o una porción del mismo (de preferencia que contenga el dominio variable de cadena pesada o cadena ligera) , de la presente invención, se puede producir el vector para la producción de la molécula de anticuerpo mediante tecnología de ADN recombinante empleando técnicas bien conocidas en la técnica. Por consiguiente, en esta divulgación se describen métodos para la preparación de una proteína al expresar un polinucleótido que contenga una secuencia nucleótida que codifique el anticuerpo. Se pueden emplear métodos que son bien conocidos por aquellos experimentados en la técnica para construir vectores de expresión que contenga secuencias modificantes del anticuerpo y señales de control de trascripción y traducción apropiadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas, y recombinación genética in vivo . Por lo tanto, la presente invención proporciona vectores replicables que comprenden una secuencia nucleótida que codifica una molécula de anticuerpo de la presente invención, o una cadena ligera o una cadena pesada de la misma, o un dominio variable de cadena pesada o de cadena ligera, unida de manera operativa a un promotor. Estos vectores pueden incluir la secuencia que codifica la región constante de la molécula de anticuerpo (véase, por ejemplo, la Publicación de PCT WO 86/05907, Publicación de PCT WO 89/01036; y la Patente de los Estados Unidos Número 5,122,464) y se puede clonar el dominio variable del anticuerpo en este vector para la expresión de toda la cadena pesada o cadena ligera. Se transfecta el vector de expresión con una célula hospedera mediante técnicas convencionales y posteriormente se cultiva las células transfectadas mediante técnicas convencionales para producir un anticuerpo de la presente invención. Por lo tanto, la presente invención incluye células hospederas que contienen un polinucleótido que codifica un anticuerpo de la presente invención, o una cadena pesada o una cadena ligera del mismo, o un anticuerpo de una sola cadena de la presente invención, unida de manera operativa a un promotor heterólogo. En modalidades preferidas para la expresión de anticuerpos de dos cadenas, se pueden co-expresar vectores que codifiquen tanto la cadena pesada como la cadena ligera en la célula hospedera para la expresión de toda la molécula de inmunoglobulina, tal como se detalla más adelante. Se puede utilizar una variedad de sistemas de vectores de expresión de hospedero para expresar las moléculas de anticuerpo de la presente invención. Estos sistemas de expresión de hospedero representan vehículos mediante los cuales las secuencias codificadoras de interés pueden ser producidas y posteriormente purificadas, pero también representan células las cuales pueden, cuando son transformadas o transfectadas con las secuencias codificadoras de nucleótidos apropiadas, expresar una molécula de anticuerpo de la presente invención in situ . Estas células incluyen, entre otras, microorganismos, por ejemplo, bacterias (por ejemplo, E. Coli, B. Subtilis) transformadas con vectores de expresión de ADN bacteriófago, ADN plásmido, o ADN cósmido que contengan secuencias codificadoras de anticuerpo; levaduras (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia) transformada con vectores de expresión de levadura recombinante que contengan secuencias codificadoras de anticuerpo, sistemas de células de insectos infectados con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo, baculovirus) que contengan secuencias codificadoras de anticuerpo; sistemas de células vegetales infectados con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transfectados con vectores de expresión de plásmido recombinante (por ejemplo, el plásmido Ti) que contengan secuencias codificadoras de anticuerpo; o sistemas de células de mamíferos (por ejemplo, células COS, CHO, BHK, 293, 3T3) , que cosechan construcciones de expresión recombinante que contengan promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, promotor de metalotioneina) o provenientes de virus de mamíferos (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor 7.5K del virus de vacuna) . De preferencia, las células de bacterias, como por ejemplo, la Escherichia coli, y con mayor preferencia las células eucarióticas, especialmente para la expresión de molécula de anticuerpo recombinante completa, son usadas para la expresión de una molécula de anticuerpo recombinante. Por ejemplo, células de mamíferos, células de ovarios de hámster chino (CHO) , junto con un vector como por ejemplo el elemento promotor genético temprano inmediato principal derivado del citomegalovirus humano es un sistema de expresión eficaz para anticuerpos (Foecking et al., Gene 45:101 (1986); Cockett et al., Bio/Technology 8:2 (1990)).
Una vez que se ha producido una molécula de anticuerpo de la presente invención mediante un animal, químicamente sintetizado o recombinantemente expresado, puede ser purificada mediante cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, mediante cromatografía (por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía por afinidad, particularmente mediante afinidad para el antígeno específico después de la proteina con A, y mediante cromatografía de columna de exclusión molecular) , centrifugación, solubilidad diferencial o mediante cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. Además, se pueden fusionar los anticuerpos de la presente invención o fragmentos de los mismos con secuencias de polipéptidos heterólogos descritos en esta divulgación o mediante cualquier otro método conocido en la técnica, para facilitar la purificación. La presente invención abarca anticuerpos recombinantemente fusionados o químicamente conjugados (incluyendo las conjugaciones covalentes y no covalentes) a un polipéptido (o una porción del mismo, de preferencia de por lo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ó 100 aminoácidos del polipéptido) de la presente invención para generar proteínas de fusión. La fusión no necesariamente necesita ser dirigida, pero puede suceder a través de secuencias ligadoras . Los anticuerpos pueden ser específicos para antígenos que no sean polipéptidos (o para una porción de los mismos, de preferencia de por lo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ó 100 aminoácidos del polipéptido) de la presente invención. Por ejemplo, se pueden usar anticuerpos para dirigir los polipéptidos de la presente invención hacia tipos de células particulares, ya sea in vitro o in vivo, al fusionar o conjugar los polipéptidos de la presente invención con anticuerpos específicos para particulares receptores de superficie celular. También se pueden usar los anticuerpos fusionados o conjugados con los polipéptidos de la presente invención en inmunoanálisis in vitro o en métodos de purificación empleando métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Harbor et ah, supra, y la publicación PCT WO 93/21232; EP 439,095; Naramura et al., Immunol . Lett. 39:91-99 (1994); la patente de los Estados Unidos No. 5,474,981; Gillies et al . , PNAS 89:1428-1432 (1992); Fell et al., J. Immunol. 146:2446-2452(1991), los cuales se incorporan como referencia en sus totalidades. La presente invención además incluye composiciones que comprenden los polipéptidos de la presente invención fusionados o conjugados con dominios de anticuerpo aparte de las regiones variables. Por ejemplo, se pueden fusionar o conjugar los polipéptidos de la presente invención con una región Fe de anticuerpo, o con una porción de la misma. La porción de anticuerpo fusionada con un polipéptido de la presente invención puede comprender la región constante, región de bisagra, dominio CH1, dominio CH2 y dominio CH3 o cualquier combinación de todos los dominios o porciones de los mismos. También se puede fusionar o conjugar los polipéptidos con las porciones de anticuerpo anteriores con el fin de formar multímeros. Por ejemplo, las porciones Fe fusionadas con los polipéptidos de la presente invención pueden formar dimeros a través de la unión de disulfuro entre las porciones Fe. Se pueden elaborar formas multiméricas mayores al fusionar los polipéptidos con porciones de IgA e IgM. En la técnica se conocen bien métodos para fusionar y conjugar los polipéptidos de la presente invención con porciones de anticuerpo. Véase, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,336,603; 5,622,929; 5,359,046; 5,349,053; 5,447,851; 5,112,946; EP 307,434; EP 367,166; publicaciones PCT WO 96/04388; WO 91/06570; Ashkenazi et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:10535-10539 (1991); Zheng et al., J. Immunol . 154:5590-5600 (1995); y Vil et al., Proc. Nati. Acad. Sd. USA 89:11337-11341(1992) (estas referencias se incorporan como referencias en sus totalidades) . Tal como se ha discutido en lo anterior, los polipéptidos correspondientes a un polipéptido, fragmento de polipéptido, o a una variante de SEQ ID NO: 2 pueden ser fusionados o conjugados con las porciones de anticuerpo anteriores para incrementar la vida media in vivo de los polipéptidos o para emplearse en inmunoanálisis empleando métodos conocidos en la técnica. Además, los polipéptidos correspondientes a SEQ ID NO: 2 pueden ser fusionados o conjugados con las anteriores porciones de anticuerpo para facilitar la purificación. Un ejemplo reportado describe proteínas quiméricas compuestas por los primeros dos dóminos del polipéptido CD4 de origen humano y por varios dominios de regiones constantes de cadenas pesada y ligera de inmunoglobulinas de mamíferos (documento EP 394,827; Traunecker et al., Nature 331:84-86 (1988)). Los polipéptidos de la presente invención fusionados o conjugados con un anticuerpo que tenga estructuras diméricas enlazadas con disulfuro (debido al IgG) también pueden resultar más eficientes en la unión y neutralización de otras moléculas, en comparación con la proteina segregada monomérica o con un fragmento de proteina solo.
(Fountoulakis et al., J. Biochem. 270:3958-3964(1995)). En muchos casos, la parte Fe en una proteína de fusión es benéfica en la terapia y diagnóstico, y por lo tanto puede producir, por ejemplo, propiedades farmacocinéticas mejoradas. (Documento EP A 232,262). Alternativamente, resultarla deseable la eliminación de la parte Fe después de que se ha expresado, detectado y purificado la proteina de fusión. Por ejemplo, la porción Fe puede imposibilitar la terapia y diagnóstico si se emplea la proteina de fusión como un antigeno para las inmunizaciones . En el descubrimiento de fármacos, se han fusionado proteínas humanas, por ejemplo la hIL-5, con porciones Fe para el propósito de análisis de cribado de alta resolución para identificar antagonistas de hIL-5 (véase, Bennett et al., J. Molecular Recognition 8:52-58 (1995); Johanson et al., J. Biol. Chem. 270:9459-9471 (1995). Aún más, se pueden fusionar los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la presente invención con secuencias marcadoras, por ejemplo, un péptido para facilitar la purificación. En modalidades preferidas, la secuencia de aminoácidos marcadora es un polipéptido de hexa-histidina, por ejemplo, la etiqueta provista en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311), entre otros, muchos de los cuales se encuentran disponibles en el mercado. Tal como se describe en Gentz et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:821-824(1989), la hexa-histidina proporciona una purificación conveniente de la proteína de fusión. Otras etiquetas de péptido útiles para la purificación incluyen, entre otras, la etiqueta "HA", la cual corresponde a un epitopo derivado de la proteina hemaglutinina de influenza (Wilson et al., Cell 37:767(1984)) y la etiqueta "bandera". La presente invención además abarca anticuerpos o fragmentos de los mismos conjugados a un agente de diagnóstico terapéutico. Se pueden emplear los anticuerpos a manera de diagnóstico para, por ejemplo, monitorear el desarrollo o progresión de un tumor como parte de un procedimiento de evaluación clínica para, por ejemplo, determinar la eficacia de un régimen determinado de tratamiento. Se puede facilitar la detección al acoplar el anticuerpo a una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, materiales radioactivos, metales emisores de positrones empleando varias tomografias de emisión de positrones, y iones metálicos para magnéticos no radioactivos . Se puede acoplar o conjugar la sustancia detectable ya sea directamente al anticuerpo (o a un fragmento de los mismos) o indirectamente, a través de un intermediario (por ejemplo, un ligador conocido en la técnica) empleando técnicas conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Número 4,741,900 para iones metálicos que se pueden conjugar con anticuerpos para emplearlos como en el proceso de diagnóstico de acuerdo con la presente invención. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen la peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupo prostético adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbelliferona, fluorosceina, fluorosceina isotiocinato, rodamina, diclorotriazinilamina, fluorosceína, cloruro de dansilo o ficoritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye el luminol; los ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen la luciferasa, luciferina, y aequorina; y los ejemplos de materiales radioactivos adecuados incluyen 1251, 1311, lllln o 99Tc. Además, se puede conjugar un anticuerpo o fragmento del mismo con una entidad terapéutica, por ejemplo, la citotoxina, por ejemplo, un agente citostático o citocidal, un agente terapéutico o un ion metálico radioactivo, por ejemplo, alfa-emisores, por ejemplo, 213BÍ. Una citotoxina o un agente citotóxico incluye cualquier agente que sea experimental a las células. Los ejemplos incluyen: paclitaxol, citochalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenoposide, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxi antracin diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glucocorticoides, procaina, tetracaína, lidocaina, propranolol y puromicina y análogos y homólogos de los mismos. Los agentes terapéuticos incluyen, entre otros,- antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazin) , agentes alquilantes (por ejemplo, meclorotamina, tioepa clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU) , ciclofosfamida, busulfano, dibromomannitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatina) , antraciclinas (por ejemplo, daunorubicina (anteriormente daunomicina) y doxorubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina) , bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC) ) , y agentes anti-mitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina). Se pueden emplear los conjugados de la presente invención para modificar una respuesta biológica determinada, el agente terapéutico o la entidad farmacéutica no está destinada a limitarse a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, la entidad farmacéutica puede ser una proteina o un polipéptido que posea una actividad biológica deseada. Estas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina por ejemplo la abrina, la ricina A, exotoxina pseudomonas o toxina de difteria; una proteina, por ejemplo, el factor de necrosis tumoral, a-interferón, beta-interferón, factor de crecimiento del tejido nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador de plasminógeno tisular, un agente apoptótico, por ejemplo, TNF-alfa, TNF-beta, AIM I (Véase, la Publicación Internacional Número WO 97/33899) , AIM II (Véase, la Publicación Internacional Número WO 97/34911), Ligando Fas (Takahashi et al., Int. Inmunol . , 6:1567-1574(1994)), VEGI (Véase, la Publicación Internacional Número WO 99/23105) , un agente trombótico o un agente anti-angiogénico, por ejemplo, angioestatina o endostatina; o, modificadores de respuesta biológica, como por ejemplo, linfoquinas, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6") y factor estimulador de colonias de macrófagos y granulocitos ("GM-CSF", granulocyte macrophage colony stimulating factor) , factor de estimulación de colonias de granulocitos ("G-CSF", granulocyte colony stimula ting factor) u otros factores de crecimiento. También se pueden adjuntar los anticuerpos a soportes sólidos, lo cual es particularmente útil para inmunoanálisis o para la purificación de antígeno de objetivo. Estos soportes sólidos incluyen, entre otros, vidrio, celulosa, poliacrilamida, nailon, poliestireno, cloruro de polivinilo o polipropileno. Son bien conocidas las técnicas para la conjugación de este tipo de entidades terapéuticas con anticuerpos, véase por ejemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cáncer Therapy" , en Monoclonal Antibodies And Cáncer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), págs. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery" , en Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), págs.. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)/ Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review" , en Monoclonal Antibodies ' 84 : Biological And Clinical Applica tions, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis , Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cáncer Therapy" , en Monoclonal Antibodies For Cáncer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), págs. 303-16 (Academic Press 1985) , y Thorpe et al., "The Prepara tion And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conj ugates " , Immunol. Rev. 62:119-58 (1982). Alternativamente, se puede conjugar un anticuerpo con un segundo anticuerpo para formar un heteroconjugado de anticuerpo, tal como se describe por Segal en la Patente de los Estados Unidos Número 4,676,980, la cual se incorpora a esta divulgación como referencia en su totalidad. Se puede usar como una sustancia terapéutica un anticuerpo, con o sin una entidad terapéutica conjugada al mismo, administrado solo o en combinación con uno o varios factores citotóxicos y/o con una o varias citocinas. La presente invención también abarca la creación de anticuerpos sintéticos dirigidos hacia los polipéptidos de la presente invención. Un ejemplo de anticuerpo sintético se describe en Radrizzani, M., et al., Medicina, (Aires), 59(6):753-8, (1999)). Recientemente, se ha descrito una nueva clase de anticuerpos sintéticos y se han nombrado como polímeros molecularmente impresos (MIP, molecularly imprinted polymers) (Semorex, Inc) . Los polímeros, péptidos y enzimas a menudo se emplean como elementos de reconocimiento molecular en sensores químicos y biológicos. Sin embargo, su carencia de estabilidad y de mecanismos de traducción de señal limitan su uso como dispositivos de sensado. Los polímeros molecularmente impresos (MIP) son capaces de imitar la función de receptores biológicos, pero con menos restricciones de estabilidad. Estos polímeros proporcionan una alta sensibilidad y selectividad al mismo tiempo que mantienen una excelente estabilidad térmica y mecánica. Los MIP tienen la habilidad de unirse a pequeñas moléculas y de dirigir las moléculas, por ejemplo orgánicos y proteínas, con una potencia igual o superior en comparación con los anticuerpos naturales. Estos "súper" MIP tienen mayores afinidades por sus objetivos y, por lo tanto, requieren menos concentraciones de unión eficaz. Durante la síntesis, los MIP son impresos para que tengan un tamaño complementario, forma y carga y grupos funcionales del objetivo seleccionado al usar la propia molécula de objetivo (como por ejemplo, un polipéptido, un anticuerpo, etc.), o una sustancia que tenga una estructura muy similar, como su "impresión" o "molde". Se pueden derivar los MIP con los mismos reactivos provistos para los anticuerpos. Por ejemplo, se puede recubrir los "súper" MIP fluorescentes sobre perlas o pozos para usarlos en separaciones o análisis muy sensibles, o para emplearlos en un cribado de alta resolución de proteínas. Aún más, los MIP basados en la estructura de uno o varios polipéptidos de la presente invención pueden resultar útiles en el cribado de compuestos que se unan a uno o varios polipéptidos de la presente invención. Este tipo de MIP haría la función de un "receptor" sintético al imitar la arquitectura natural del polipéptido. De hecho, la capacidad de un MIP para realizar la función de un receptor sintético ya se ha demostrado para el receptor de estrógeno (Ye, L., Yu, Y., Mosbach, K, Analyst . , 126(6) :760-5, (2001); Dickert, F, L., Hayden, O., Halikias, K, P, Analyst., 126 (6) : 766-71, (2001)). Se puede imitar un receptor sintético ya sea en su totalidad (por ejemplo, como la proteína completa) , o se puede imitar como una serie de péptidos cortos que correspondan a la proteína (Rachkov, A., Minoura, N, Biochim, Biophys, Acta., 1544(1- 2) :255-66, (2001)). Este tipo de MIP de receptor sintético pueden ser empleados en algunos o en más de los métodos de cribado descritos anteriormente en esta divulgación. Los MIP también han mostrado ser útiles en el "sensado" de la presencia de su molécula imitada (Cheng, Z., Wang, E., Yang, X, Biosens, Bioelectron. , 16 (3) : 179-85, (2001); Jenkins, A, L., Yin, R., Jensen, J. L, Analyst., 126(6) :798-802, (2001); Jenkins, A, L., Yin, R., Jensen, J. L, Analyst, 126 ( 6) : 798-802, (2001)). Por ejemplo, se puede emplear un MIP diseñado empleando un polipéptido de la presente invención en análisis diseñados para identificar, y potencialmente cuantificar, el nivel de este polipéptido en una muestra. Se puede emplear este MIP como un sustituto de cualquier componente descrito en los análisis, o dispositivos, provistos en esta divulgación (por ejemplo, el análisis ELISA, etc.). Se pueden emplear varios métodos para crear MIP contra un receptor específico, ligando, polipéptido, péptido, molécula orgánica. Varios métodos preferidos se describen por Esteban et al en J. Anal, Chem., 370(7) :795-802, (2001), la cual se incorpora a esta divulgación como referencia en su totalidad además de cualquier referencia citada en la misma. En la técnica se conocen métodos adicionales y la presente invención los abarca, por ejemplo, Hart, B, R., Shea, K, J. J. Am. Chem, Soc, 123 (9) :2072-3, (2001); y Quaglia, M., Chenon, K., Hall, A, J., De, Lorenzi, E., Sellergren, B, J. Am. Chem, Soc, 123 (10) :2146-54, (2001); los cuales se incorporan a esta divulgación como referencia en sus totalidades.
CRIBADO DE AGONISTAS En otro aspecto, la presente invención proporciona un método de cribado para identificar agonistas de la proteína SIGLEC-6. El método de cribado comprende la acción de exponer la proteina SIGLEC-6 a un potencial agonista de la proteina SIGLEC-6 y determinar si el potencial agonista activa el ITIM, por medio de lo cual se inhibe la liberación de citocina o histamina del mastocito.
(Véase el Ejemplo 11) . Si el potencial agonista se une a la proteina SIGLEC-6, existe una fuerte presunción de que el potencial agonista funcionará realmente como un agonista cuando se administre in vivo a un paciente. Los agonistas de la proteína SIGLEC-6 identificados empleando este método pueden ser caracterizados como un agonista al exponer los mastocitos al agonista y al medir la liberación de citocina o histamina en comparación con las células activadas en ausencia del agonista. Los agonistas evitarán la desgranulación y/o la liberación de histamina al activar el ITIM. Otro método para el cribado comprende transfectar las células con una construcción de gen indicador que contenga la proteína SIGLEC-6. El potencial agonista puede ser un compuesto orgánico o un polipéptido, incluyendo los anticuerpos. Las metodologías de cribado de alta resolución son particularmente contempladas para la detección de moduladores de la proteína SIGLEC-6 descritas en esta divulgación. Estos métodos de cribado de alta resolución por lo habitual implican proporcionar una genoteca química o péptida combinatoria que contenga un gran número de compuestos potenciales terapéuticos (por ejemplo, ligandos o moduladores) . Este tipo de genotecas químicas combinatorias o genotecas de ligandos posteriormente son cribadas en uno o más análisis con el fin de identificar aquellos miembros de la genoteca (por ejemplo, especies químicas particulares o subclases particulares) que exhiban una actividad característica deseada. Los compuestos así identificados pueden servir como compuestos candidatos convencionales, o pueden por si mismos usarse como potenciales terapéuticos o como verdaderos terapéuticos. Una genoteca química combinatoria es una colección de diversos compuestos químicos generados ya sea mediante síntesis química o mediante síntesis biológica, al combinar una diversidad de bloques de formación química (es decir, reactivos, por ejemplo aminoácidos) . A manera de ejemplo, una genoteca combinatoria lineal, por ejemplo un polipéptido o genoteca de péptidos, es formada al combinar un conjunto de bloques de construcción química en cada posible manera para una longitud de compuesto determinada (es decir, el número de aminoácidos en un compuesto polipéptido o péptido) . Se pueden sintetizar millones de compuestos químicos a través de este mezclado combinatorio de bloques de formación química. Aquellos expertos en la técnica pertinente conocen bien la preparación y cribado de genotecas químicas combinatorias. Las genotecas combinatorias incluyen, entre otras, genotecas de péptidos (por ejemplo la Patente de los Estados Unidos No. 5,010,175; Furka, 1991, Int. J. Pept. Prot. Res., 37:487-493; y Houghton et al, 1991, Nature, 354:84-88). También se pueden emplear otras químicas para la generación de genotecas de diversidad química. Los ejemplos no restrictivos de químicas de genoteca de diversidad química incluyen, péptidos (Publicación PCT Número WO 91/019735), péptidos codificados (Publicación PCT Número WO 93/2024), oligómeros aleatorios (Publicación PCT Número WO 92/00091) , benzodiacepinas (Patente de los Estados Unidos Número 5,288,514), diversómeros por ejemplo hidantoinas, benzodiacepinas y dipéptidos (Hobbs et al., 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6909-6913), polipéptidos vinilogos (Hagihara et al., 1992, J. Amer. Chem. Soc, 114:6568), péptido miméticos no pentidales con estructura de glucosa (Hirschmann et al., 1992, J. Amer. Chem. Soc, 114:9217-9218), síntesis orgánica análoga de pequeñas genotecas de compuesto (Chen et al., 1994, J. Amer. Chem. Soc., 116:2661), oligocarbamatos (Cho et al., 1993, Science, 261:1303), y/o peptidil fosfonatos (Campbell et al., 1994, J. Org. Chem., 59:658), genotecas de ácidos nucleicos peptidicos (patente de los Estados Unidos No. 5,539,083), genotecas de anticuerpos (véase, Vaughn et al., 1996, Nature Biotechnology, 14 (3) .-309-314) y PCT/US96/10287) , genotecas de carbohidratos (por ejemplo, Liang et al., 1996, Science, 274- 1520-1522 y la patente de los Estados Unidos No. 5,593,853), genotecas de pequeñas moléculas orgánicas, (benzodiazepinas, Baum C&EN, 18 de junio de 1993, página 33; y la patente de los Estados Unidos No. 5,288,514; isoprenoides, la patente de los Estados Unidos No. 5,569,588; tiazolidinonas y metatiazanonas, la patente de los Estados Unidos No. 5,549,974; pirrolidinas, las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,525,735 y 5,519,134; compuestos de morfolino, la patente de los Estados Unidos No. 5,506,337; y lo similar). En el mercado se encuentran disponibles dispositivos para la preparación de genotecas combinatorias (por ejemplo, 357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville Ky.; Symphony, Rainin, Woburn, Mass.; 433A Applied Biosystems, Foster City, Calif; 9050 Plus, Millipore, Bedford, Mass.) . Además, en el mercado se encuentra disponible un gran número de genotecas combinatorias (por ejemplo, ComGenex, Princeton, NJ.; Asinex, Moscú, Rusia; Tripos, Inc., St. Louis, Mo . ; ChemStar, Ltd., Moscú, Rusia; 3D Pharmaceuticals, Exton, Pa.; Martek Biosciences, Columbia, Md., y lo similar). En una modalidad, la invención proporciona una fase sólida basada en análisis in vitro en un formato de alta resolución, donde la célula -o tejido se adhiere a un sustrato de fase sólida. En estos análisis de alta resolución, es posible cribar hasta varios cientos de distintos moduladores o ligandos en un solo día. En particular, se puede emplear cada pozo de una placa de microvaloración para llevar a cabo un análisis separado en un modulador potencial seleccionado, o, si el fin es observar los efectos cronológicos de la concentración o de la incubación, cada 5-10 pozos pueden evaluar un solo modulador. Por consiguiente, una sola placa de microvaloración estándar puede evaluar aproximadamente 96 moduladores. Si se usan placas con 1536 pozos, entonces una sola placa fácilmente analizar aproximadamente 100 a 1,500 distintos compuestos. Es posible analizar diversas placas distintas por dia; por lo tanto, y a manera de ejemplo, son posibles cribados de análisis de hasta aproximadamente 6,000 a 20,000 distintos compuestos empleando los sistemas integrados descritos. En otro de sus aspectos, la presente invención abarca análisis de cribado y análisis de detección de pequeñas moléculas (por ejemplo, fármaco) que implican la detección o identificación de pequeñas moléculas que pueden unirse con un polipéptido o péptido de la proteína SIGLEC-6. Se consideran particularmente preferentes los ensayos que son adecuados para metodologías de cribado de alta resolución. En este tipo de análisis de detección, identificación o cribado a base de unión, por lo habitual no se requiere de análisis funcional. Todo lo que se necesita es una proteina de objetivo, de preferencia prácticamente purificada, y una genoteca o panel de compuestos (por ejemplo, ligandos, fármacos, pequeñas moléculas) y entidades biológicas a cribarse o analizarse con el objetivo proteinico. De preferencia, las proteínas más pequeñas que se unen a la proteina de objetivo modularán la actividad de alguna manera, debido a la unión preferencial de alta afinidad con las áreas funcionales o sitios en la proteina. Un ejemplo de este análisis de intercambio térmico a base de fluorescencia (3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc., 3DP, Exton, Pa . ) se describe en las patentes de los Estados Unidos Nos. 6,020,141 y 6,036,920 de Pantoliano et al.; véase también, J. Zimmerman, 2000, Gen. Eng. News, 20(8)). El análisis permite la detección de pequeñas moléculas (por ejemplo, fármacos, ligandos st) que se unen para expresar, y de preferencia purificar el polipéptido con base en la afinidad de determinaciones de unión al analizar las curvas desenvolventes térmicas de los complejos proteina-fármaco o ligando. Los fármacos o moléculas de unión determinados mediante esta técnica se pueden analizar aún más, si se desea, mediante métodos, como por ejemplo los descritos en esta divulgación, con el fin de determinar si las moléculas afectan o modulan la función o actividad de la proteina de objetivo. Para purificar un polipéptido o péptido de la proteina SIGLEC-6 para cuantificar una unión biológica o una actividad de unión de ligando, la fuente puede ser un lisado de célula completo que se pueda preparar mediante ciclos sucesivos de congelación-descongelación (por ejemplo, de uno a tres) en presencia de inhibidores de proteasa estándares. Se puede parcial o completamente purificar el péptido de la proteína SIGLEC-6 mediante métodos de purificación de proteina estándares, por ejemplo, cromatografía por afinidad empleando el anticuerpo específico descrito más adelante, o mediante ligandos específicos para una etiqueta de epitopo diseñada en la molécula de monopéptido de la proteina SIGLEC-6 recombinante, también tal como se describe en esta divulgación. Después se puede cuantificar la actividad de unión tal como se describe. Los compuestos que se identifican de acuerdo con los métodos provistos en esta divulgación, y que modulan o regulan la actividad biológica o la fisiología de los péptidos de SIGLEC-6 de acuerdo con la presente invención son una modalidad preferida de esta invención. Se contempla que este tipo de compuestos moduladores se pueden emplear en el tratamiento y métodos terapéuticos para tratar una condición que sea mediada por péptidos de SIGLEC-6 al administrar a un individuo que necesite de dicho tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto identificado por los métodos descritos en esta divulgación. Además, la presente invención proporciona métodos para tratar un individuo que necesite de dicho tratamiento por una enfermedad, trastorno o condición que sea mediada por los péptidos de la proteína SIGLEC-6 de la presente invención, los métodos comprenden administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto modulador de la proteina SIGLEC-6 identificado mediante un método provisto en esta divulgación.
USOS TERAPÉUTICOS DE LOS ANTICUERPOS La presente invención además se dirige a terapias con base en anticuerpos que implican administrar anticuerpos de la presente invención a un animal, de preferencia a un mamífero, y con mayor preferencia al ser humano, para tratar una o más de las enfermedades, trastornos o condiciones descritas. Los compuestos terapéuticos de la presente invención incluyen, entre otros, anticuerpos de la presente invención (incluidos los fragmentos, análogos y derivados de los mismos tal como se describe en esta divulgación) y ácidos nucleicos en los anticuerpos de la presente invención (incluidos los fragmentos, análogos y derivados de los mismos y anticuerpos anti-iodotipicos tal como se describe en esta divulgación) . Se pueden usar los anticuerpos de la presente invención para tratar, inhibir o prevenir enfermedades, trastornos o condiciones asociadas con una expresión aberrante y/o actividad de la proteina Siglec-6 o con un polipéptido de la presente invención, entre los que se incluyen, cualquiera o más de las enfermedades, trastornos o condiciones descritas en esta divulgación. El tratamiento y/o prevención de enfermedades, trastornos o condiciones asociadas con la proteina Siglec-6 o con una expresión aberrante y/o actividad de un polipéptido de la presente invención incluye, entre otras, aliviar los síntomas asociados con estas enfermedades, trastornos o condiciones, eliminando la población de células B que expresan la proteina Siglec-6, o eliminando las células B que expresan la proteína Siglec-ß. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser provistos en composiciones farmacéuticamente aceptables tal como se conoce en la técnica o como se describe en esta divulgación. Un resumen de las maneras en las cuales se pueden usar los anticuerpos de la presente invención terapéuticamente incluye la unión de la proteina Siglec-6 o polinucleótidos o de los polipéptidos de la presente invención local o sistémicamente en el cuerpo o mediante citotoxicidad directa del anticuerpo, por ejemplo, según lo medido por células de complemento (CDC) o por células efectoras (ADCC) . Más adelante se describe con mayor detalle alguna de estas metodologías. De acuerdo con las enseñanzas provistas en esta divulgación, alguien con experiencia ordinaria en la técnica sabrá como emplear los anticuerpos de la presente invención para propósitos de diagnóstico, monitoreo o terapéuticos sin una experimentación adicional. Los anticuerpos de esta invención pueden ser utilizados ventajosamente en combinación con otros anticuerpos monoclonales o quiméricos, o con linfocinas o factores de crecimiento hematopoyéticos (por ejemplo, IL-2, IL-3 e IL-7) , por ejemplo, los cuales sirven para incrementar el número o actividad de células efectoras que interactúan con los anticuerpos. Se pueden administrar los anticuerpos de la presente invención solos o en combinación con otros tipos de tratamientos (por ejemplo, terapia por radiación, quimioterapia, terapia hormonal, inmunoterapia y agentes anticáncer) . En términos generales, se prefiere la administración de productos de un origen de especies o reactividad de especies (en el caso de los anticuerpos) que sea de la misma especie a la del paciente. Por lo tanto, en una modalidad preferida, anticuerpos, fragmentos, derivados, análogos o ácidos nucleicos de origen humano o humanizados, son administrados a un paciente humano para terapia o profilaxis. Se prefiere usar anticuerpos inhibidores y/o neutralizantes in vivo potentes y/o de alta afinidad contra la proteina Siglec-6 o polipéptidos o polinucleótidos de la presente invención, fragmentos o regiones de los mismos, tanto para inmunoanálisis dirigidos contra como para terapia de trastornos relacionados con la proteína Siglec-6 o polinucleótidos o polipéptidos, incluidos los fragmentos de los mismos, de la presente invención. Este tipo de anticuerpos, fragmentos o regiones de preferencia tendrán una afinidad por la proteina Siglec-6 o polinucleótidos o polipéptidos de la presente invención, incluidos los fragmentos de los mismos . Los anticuerpos dirigidos contra polipéptidos de la presente invención son útiles para inhibir las reacciones alérgicas en animales. Por ejemplo, al administrar una dosis terapéuticamente aceptable de un anticuerpo o anticuerpos de la presente invención, o una mezcla de los anticuerpos presentes, o en combinación con otros anticuerpos de fuentes diversas, el animal no podrá experimentar una respuesta alérgica a los antígenos. De modo semejante, alguien podría visualizar clonar el gen que codifica un anticuerpo dirigido contra un polipéptido de la presente invención, este polipéptido que tiene el potencial de producir una respuesta alérgica y/o inmunitaria en un organismo, y transformar el organismo con este gen de anticuerpo de modo que se exprese (por ejemplo, constitutivamente, induciblemente, etc.) en el organismo. Por lo tanto, el organismo podria efectivamente volverse resistente a una respuesta alérgica derivada de la ingestión o presencia de este polipéptido in unitario/reactivo alérgico. Aún más, el uso de los anticuerpos de la presente invención puede tener utilidad particular en la prevención y/o alivio de enfermedades y/o trastornos autoinmunitarios, por ejemplo las condiciones que por lo habitual se originan por anticuerpos que están dirigidos contra proteínas endógenas. Por ejemplo, en el caso donde el polipéptido de la presente invención es responsable de modular la respuesta inmunitaria contra auto-antigenos, de transformar el organismo y/o individuo con una construcción que comprende cualquiera de los promotores descritos en esta divulgación o de alguna otra manera conocida en la técnica, además, con un polinucleótido que codifica el anticuerpo dirigido contra el polipéptido de la presente invención podria inhibir de manera eficaz el sistema inmunitario de organismos a partir de producir una respuesta inmunitaria contra el o los auto-antigenos. En el resto de la presente divulgación se proporcionan descripciones detalladas de las aplicaciones terapéuticas y/o de terapia génica de la presente invención. Alternativamente, se podrían presentar los anticuerpos de la presente invención en una planta (por ejemplo, al clonar el gen del anticuerpo dirigido contra un polipéptido de la presente invención y al transformar una planta con un vector adecuado que comprenda este gen para la expresión constitutiva del anticuerpo de la planta) , y posteriormente con la ingesta de la planta por parte de un animal, con lo que se confiere inmunidad temporal al animal contra el antigeno especifico contra el cual está dirigido el anticuerpo (Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Números 5,914,123 y 6,034,298).
TERAPIA GÉNICA A BASE DE ANTICUERPOS En una modalidad especifica, los ácidos nucleicos que comprenden secuencias que codifican anticuerpos o derivados funcionales de los mismos, son administrados para la profilaxis, tratamiento o inhibición de una enfermedad o trastorno mediado por mastocitos, por medio de la terapia génica. El término terapia génica se refiere a una terapia que se lleva a cabo con la administración a un individuo de un ácido nucleico expresado o expresable. En esta modalidad de la invención los ácidos nucleicos producen sus anticuerpos codificados que median un efecto terapéutico. En otra modalidad, los ácidos nucleicos que comprenden secuencias que codifican anticuerpos o derivados funcionales de los mismos, son administrados para la profilaxis, tratamiento o inhibición de enfermedades o trastornos mediados por células B, en donde las células B se expresan por medio de la terapia génica. Se puede usar cualquiera de los métodos de terapia génica disponibles en la técnica de acuerdo con la presente invención. Más adelante se describen métodos ilustrativos . Para revisiones generales de los métodos de terapia génica, véase Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993); Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); y Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); May, TIBTECH 11(5): 155-215 (1993). Los métodos que por lo común se conocen en la técnica de tecnología de ADN recombinante que se pueden usar son descritos en Ausubel et al . (eds . ) , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993) ; y Kriegler, Gene Transfer and Expression , A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990) . De acuerdo con la presente invención, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo son parte de un vector de expresión que expresa el anticuerpo o fragmentos o proteínas quiméricas o cadenas pesadas o cadenas ligeras del mismo en un hospedero adecuado. En particular, estas secuencias de ácidos nucleicos tienen promotores operativamente unidos a la región que codifica el anticuerpo, este promotor es inducible o constitutivo, y opcionalmente, es específico a un tejido. En otra modalidad particular, se emplean las moléculas de ácidos nucleicos en las cuales se flanquean las secuencias codificadoras de anticuerpo y cualquier otra secuencia deseada mediante regiones que promueven la recombinación homologa en un sitio deseado en el genoma, lo que proporciona la expresión intracromosomal de los ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo (Koller and Smithies, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989). En modalidades específicas, la molécula de anticuerpo expresada es un anticuerpo de una sola cadena; alternativamente, las secuencias de ácido nucleico incluyen secuencias que codifican cadenas pesadas así como cadenas ligeras o fragmentos de los mismos del anticuerpo. El suministro de ácidos nucleicos a un paciente puede ser de manera directa en cuyo caso el paciente directamente es expuesto al ácido nucleico o a los vectores que portan el ácido nucleico, o de manera indirecta, en cuyo caso, las células primero son transformadas con los ácidos nucleicos in vitro, posteriormente son trasplantadas en el paciente. Estas dos metodologías son de uso común, respectivamente, como terapia génica in vivo o ex vivo . En una modalidad especifica, las secuencias de ácidos nucleicos son administradas directamente in vivo, donde esto es expresado para producir el producto codificado. Esto se puede llevar a cabo mediante cualquiera de los numerosos métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, al construirlos como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado y al administrarlos de modo que se vuelvan intracelulares, por ejemplo, mediante la infección empleando retrovirales defectuosos o atenuados o mediante otros vectores virales (véase por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Número 4,980,286), o mediante la inyección directa de ADN desnudo, o mediante el uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, una pistola de genes; Biolistic, Dupont), o al recurrir con lípidos o receptores de superficie celular o agentes transfectantes, mediante la encapsulación en liposomas, microparticulas o microcápsulas, o al administrarlos en combinación con un péptido que se sabe ingresa al núcleo, al administrarlo junto con un ligando sujeto a endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu y Wu, J. Biol. Chem...262 : 429-4432 (1987 ) ) (la cual se pueden usar para dirigir tipos celulares que de manera especifica expresan los receptores), etc. En otra modalidad, se pueden formar complejos de ácido nucleico-ligando en los cuales el ligando comprende un péptido viral fusogénico para interrumpir los endosomas, lo que permite que el ácido nucleico evite la degradación lisosomal. En todavía otra modalidad, se puede dirigir el ácido nucleico in vivo para la ingestión y expresión especifica de células, al dirigir un receptor específico (véase por ejemplo, las Publicaciones PCT WO 92/06180; WO 92/22635; WO92/20316; W093/14188, WO93/20221) . Alternativamente, se puede introducir el ácido nucleico intracelularmente y se puede incorporar dentro del ADN de la célula hospedera para su expresión, mediante recombinación homologa (Koller and Smithies, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:8932-8935(1989); Zijlstra et al., Nature 342:435-438(1989)). En una modalidad específica, se emplean vectores virales que contienen secuencias de ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo de la presente invención. Por ejemplo, se puede emplear un vector retroviral (véase Miller et al., Meth . Enzymol. 217:581-599(1993)). Estos vectores retrovirales contienen los componentes necesarios para el empaque correcto del genoma viral y la integración en el ADN de la célula hospedera. Las secuencias del ácido nucleico que codifican el anticuerpo para emplearse en la terapia génica son clonados en uno o más vectores, lo que facilita el suministro del gen a un paciente. En Boesen et al., Biotherapy 6:291-302(1994) se pueden encontrar mayores detalles acerca de los vectores retrovirales, esta obra describe el uso de un vector retroviral para suministrar el gen drl a las células madre he atopoyéticas con el fin de hacer las células madre más resistentes a la quimioterapia. Otras referencias que ilustran el . uso de vectores retrovirales en la terapia génica son: Clowes et al., J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994); Kiem et al., Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons and Gunzberg, Human Gene Therapy 4:129-141 (1993); y Grossman and Wilson, Curr. Opin. en Genetics and Devel. 3:110-114 (1993).
Los adenovirus son otros vectores virales que se pueden emplear en la terapia génica. Los adenovirus son vehículos especialmente atractivos para el suministro de genes al epitelio respiratorio. Los adenovirus de manera natural infectan el epitelio respiratorio donde pueden causar una enfermedad moderada. Otros objetivos de los sistemas de suministro a base de adenovirus son el higado, el sistema central nervioso, las células endoteliales y los músculos. Los adenovirus tienen la ventaja de ser capaces de infectar células no divisorias. Kozarsky and Wilson, Current Opinión en Genetics and Development 3 : 499-503 (1993) presentan una revisión de la terapia génica a base de adenovirus. Bout et al., Human Gene Therapy 5:3-10(1994) demostró el uso de vectores de adenovirus para transferir genes al epitelio respiratorio de monos de la India (Macaca mulatta ) . Otros ejemplos del uso de adenovirus en terapia génica pueden ser encontrados en Rosenfeld et al., Science 252:431-434 (1991); Rosenfeld et al., Cell 68:143-155 (1992); Mastrangeli et al., J. Clin. Invest. 91:225-234 (1993); la publicación PCT W094/12649; y Wang, et al., Gene Therapy 2:775-783 (1995). En una modalidad preferida, se emplean vectores de adenovirus . También se han propuesto virus adeno-asociados (AAV, Adeno-associa ted virus) para su uso en terapia génica (Walsh et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 (1993); U.S. Pat. No. 5,436,146). Otra metodología para la terapia génica implica transferir un gen a células en cultivo celular mediante este tipo de métodos como la electroporación, lipofección, transfección mediada por fosfato de calcio o infección viral. Por lo usual, el método de transferencia incluye la transferencia de un marcador seleccionable hacia las células. Después se colocan las células bajo selección para aislar aquellas células que tienen captación y que se expresan en el gen transferido. Posteriormente estas células son administradas a un paciente. En esta modalidad, se introduce el ácido nucleico a una célula antes de la administración in vivo de la célula recombinante resultante. Se puede llevar a cabo esta introducción mediante cualquier método conocido en la técnica, entre los que se incluyen, la transfección, electroporación, microinyección, infección con un vector viral o bacteriófago que contenga las secuencias de ácidos nucleicos, fusión celular, transferencia genética mediada por cromosoma, - transferencia genética mediada por microcélulas, fusión de esferoplastos, etc. En la técnica se conocen numerosas técnicas para la introducción de genes extraños en las células (véase, por ejemplo, Loeffler and Behr, Meth. Enzymol. 217:599-618 (1993); Cohén et al., Meth. Enzymol. 217:618-644 (1993); Cline, Pharmac. Ther. 29:69-92m (1985) y se pueden usar de acuerdo con la presente invención, siempre y cuando no se interrumpan las funciones embrionarias y fisiológicas necesarias de las células receptoras. La técnica proporcionarla la transferencia estable del ácido nucleico a la célula, de modo que el ácido nucleico se pueda expresar mediante la célula y de preferencia sea hereditario y se pueda expresar en su descendencia celular. Se pueden suministrar las células recombinantes resultantes a un paciente mediante varios métodos conocidos en la técnica. Las células sanguíneas recombinante (por ejemplo, las células madre hematopoyéticas o las células progenitoras) son administradas de preferencia por via intravenosa. La cantidad de células visualizadas para emplearse depende del efecto deseado, el estado del paciente, etc., y alguien experimentado en la técnica puede determinar tal cantidad. Las células en las cuales se puede introducir un ácido nucleico para los propósitos de terapia génica abarcan cualquier tipo celular deseable y disponible, e incluye entre otras, las células epiteliales, células endoteliales, queratinocitos, fibroblastos, células musculares, hepatocitos; células sanguíneas, como por ejemplo, tlimfocitos, blimocitos, monocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megacariocitos, granulocitos; varias células madre o progenitoras, en particular células madre hematopoyéticas o células progenitoras, por ejemplo, las obtenidas a partir de la médula ósea, sangre del cordón umbilical, sangre periférica, hígado fetal, etc. En una modalidad preferida, la célula empleada para la terapia génica es autóloga al paciente. En una modalidad en la cual se emplean células recombinantes en la terapia génica, se introducen secuencias de ácido nucleico que codifican un anticuerpo en las células de modo que se puedan expresar mediante las células o por su progenie, y posteriormente se administran las células recombinantes in vivo para el efecto terapéutico. En una modalidad especifica, se usan células madre o células progenitoras. Cualquier célula madre y/o progenitora que se pueda aislar y mantener in vitro puede potencialmente ser usada de acuerdo con esta modalidad de la presente invención (véase por ejemplo, la Publicación de PCT WO 94/08598; Stemple and Anderson, Cell 71:973-985 (1992); Rheinwald, Meth. Cell Bio. 21 A:229 (1980); y Pittelkow and Scott, Mayo Clinic Proc. 61:771 (1986) ) . En una modalidad especifica, el ácido nucleico a introducirse para los propósitos de terapia génica comprende un promotor inducible ligado de manera operativa a la región codificadora, de modo que la expresión del ácido nucleico sea controlable al controlar la presencia o la ausencia del inductor apropiado de trascripción. En una modalidad, la terapia podria dirigirse al pulmón de un paciente asmático para reducir o eliminar los mastocitos que son la causa de los síntomas asmáticos y de la remodelación de las vías respiratorias a través de la inducción y eliminación de citocina. Podria aplicarse a la presente invención las técnicas actuales de terapia génica en pacientes con fibrosis cística.
DIAGNÓSTICO E IMAGINOLOGÍA CON ANTICUERPOS Se pueden emplear anticuerpos etiquetados, y derivados y análogos de los mismos, que de manera específica se unan a la proteina SIGLEC-6 para propósitos de diagnóstico con el fin de detectar, diagnosticar o monitorear enfermedades, trastornos y/o condiciones asociadas con células B que expresan la proteina Siglec-6 y/o asociadas con la expresión aberrante y/o actividad de la proteina SIGLEC-6. El método comprende: (a) evaluar la expresión de la proteína SIGLEC-6 en células o fluido corporal de un individuo empleando uno o más anticuerpos de la presente invención: y (b) comparar el nivel de expresión con un nivel de expresión estándar, con lo cual un incremento o disminución en el nivel de expresión analizado en comparación con el nivel de expresión estándar es indicativo de una enfermedad o condición mediada por células B y/o de una expresión aberrante. La invención proporciona un análisis de diagnóstico para diagnosticar una enfermedad; el análisis comprende: (a) evaluar la expresión de la proteina SIGLEC-6 en células o fluido corporal de un individuo empleando uno o más anticuerpos de la presente invención; y (b) comparar el nivel de expresión con un nivel de expresión estándar, con lo cual un incremento -o disminución en el nivel de expresión analizado en comparación con el nivel de expresión estándar es indicativo de un trastorno en particular. Se pueden usar los anticuerpos de la invención para evaluar los niveles de proteínas en una muestra biológica empleando métodos inmunohistológicos clásicos conocidos por aquellos experimentados en la técnica (por ejemplo, véase, Jalkanen, et al.. J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)). Otros métodos basados en anticuerpos útiles para detectar expresión incluyen los inmunoanálisis, por ejemplo, el enzimoinmunoanálisis de absorción (ELISA) y el radioinmunoanálisis (RÍA) . En la técnica se conocen las etiquetas de análisis de anticuerpo adecuadas e incluyen etiquetas de enzimas, por ejemplo, glucosa oxidasa, radioisótopos, por ejemplo, yodo (1251, 1211), carbono (14C) , azufre (35S) , tritio (3H) , indio (112ln) y tecnecio (99Tc) ; etiquetas luminiscentes, por ejemplo, luminol; y etiquetas fluorescentes, por ejemplo, fluoresceina, rodamina y biotina. Un aspecto de la presente invención incluye la detección y diagnóstico in vivo de enfermedades o trastornos mediados por mastocitos en un animal, por ejemplo el ser humano. En una modalidad, el diagnóstico comprende: a) administrar (por ejemplo, por vía parenteral, subcutánea o intraperitoneal) a un individuo una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-SIGLEC-6 etiquetado el cual de manera especifica se une a la superficie de mastocitos; b) esperar un intervalo de tiempo después de la administración para permitir que el anticuerpo etiquetado de manera preferencial se concentre en sitios en el individuo donde se expresa el polipéptido (y para una molécula etiquetada no unida a depurarse al nivel de antecedencia) ; c) determinar el nivel de antecedencia; y d) detectar la molécula etiquetada en el individuo, de modo que la detección de la molécula etiquetada arriba del nivel de antecedencia indique que el individuo tiene una enfermedad o trastorno particular asociado con la expresión aberrante del polipéptido de interés . Se puede determinar el nivel de antecedencia mediante varios métodos, entre los que se incluyen, comparar la cantidad de molécula etiquetada detectada con un valor estándar previamente determinado para un sistema particular. Otro aspecto de la presente invención incluye la detección y diagnóstico in vivo de enfermedades o trastornos mediados por células B en un animal, por ejemplo el ser humano. En una modalidad, el diagnóstico comprende: a) administrar (por ejemplo, por via parenteral, subcutánea o intraperitoneal) a un individuo una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-SIGLEC-6 etiquetado el cual de manera especifica se une a la superficie de mastocitos; b) esperar un intervalo de tiempo después de la administración para permitir que el anticuerpo etiquetado de manera preferencial se concentre en sitios en el individuo donde se expresa el polipéptido (y para una molécula etiquetada no unida a depurarse al nivel de antecedencia) ; c) determinar el nivel de antecedencia; y d) detectar la molécula etiquetada en el individuo, de modo que la detección de la molécula etiquetada arriba del nivel de antecedencia indique que el individuo tiene una enfermedad o trastorno particular asociado con las células B que expresan la proteina SIGLEC-6. Se puede determinar el nivel de antecedencia mediante varios métodos, entre los que se incluyen, comparar la cantidad de molécula etiquetada detectada con un valor estándar previamente determinado para un sistema particular. En la técnica se comprenderá que el tamaño del individuo y el sistema de imaginologia empleado determinarán la cantidad de la entidad de imaginologia necesaria para producir imágenes de diagnóstico. En el caso de una entidad de radioisótopo, para un individuo humano, la cantidad de radioactividad inyectada por lo habitual fluctuará entre aproximadamente 5 y 20 milésimas de Curie de 99 mTc. El anticuerpo etiquetado o el fragmento de anticuerpo entonces de preferencia se acumulará en la ubicación de los mastocitos que contienen la proteína específica. La imaginologia in vivo se describe en S. W. Burchiel et al., "Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments . " (Capítulo 13 en Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cáncer, S. W. Burchiel and B. A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982) . Dependiendo de diversas variables entre las que se incluyen el tipo de etiqueta empleada y el modo de administración, el intervalo de tiempo posterior a la administración para permitir que la molécula etiquetada de preferencia se concentre en sitios en el individuo y para una molécula etiquetada no unida que se va a depurar al nivel de antecedencia es de 6 a 48 horas o de 6 a 24 horas o de 6 a 12 horas. En otra modalidad, el intervalo de tiempo posterior a la administración es de 5 a 20 dias o de 5 a 10 días.
En una modalidad, se lleva a cabo un monitoreo de la enfermedad o trastorno al repetir el método de diagnóstico de la enfermedad o trastorno, por ejemplo, un mes después del diagnóstico inicial, seis meses después del diagnóstico inicial, un año después del diagnóstico inicial, etc. Se puede detectar la presencia del anticuerpo etiquetado en el paciente empleando métodos conocidos en la técnica para el cribado in vivo . Estos métodos dependen del tipo de etiqueta empleada. Los técnicos experimentados serán capaces de determinar el método apropiado para detectar una etiqueta en particular. Los métodos y dispositivos que se pueden emplear en los métodos de diagnóstico de la presente invención incluyen, entre otros, tomografía por computadora (CT, computed tomography) , escaneo completo del cuerpo, por ejemplo, tomografía de emisiones por posición (PET, position emission tomography) , imaginología por resonancia magnética (MRI, magnetic resonance imaging) y sonografia. En una modalidad especifica, se etiqueta la molécula con un radioisótopo y se detecta en un paciente empleando un instrumento quirúrgico de respuesta a radiación (Thurston et al., Patente de los Estados Unidos Número 5,441,050). En otra modalidad, se etiqueta el ' anticuerpo con un compuesto fluorescente y se detecta en un paciente empleando un instrumento de escaneo sensible a la fluorescencia. En otra modalidad, se etiqueta el anticuerpo con un metal emisor de positrones y se detecta en el paciente empleando tomografía de emisión de positrones. En todavía otra modalidad, se etiqueta el anticuerpo con una etiqueta paramagnética y se detecta en un paciente empleando imaginologia de resonancia magnética (MRI) .
DIAGNÓSTICO DE PREDISPOSICIÓN A ENFERMEDADES En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para diagnosticar la predisposición de un paciente a desarrollar una enfermedad mediada por células B y/o enfermedades causadas por la expresión no regulada de citocinas. La presente invención está basada en el descubrimiento de que la presencia del o el incremento de la cantidad del receptor de la proteina SIGLEC-6 en ciertas células, tejidos o fluidos corporales del paciente puede ser indicativo de una disposición a ciertas enfermedades inmunitarias o enfermedades mediadas por células B. En otra modalidad, el método comprende recolectar del paciente una muestra celular, tisular o de fluido corporal de la cual se tiene la sospecha que contiene mastocitos; analizar el tejido o fluido corporal para detectar la expresión modulada de la proteina SIGLEC-6; y predecir la predisposición del paciente a ciertas enfermedades inmunitarias con base en el nivel de expresión del receptor de la proteína SIGLEC-6 en el tejido o fluido corporal . En otra modalidad, el método comprende recolectar de un paciente una muestra celular, tisular o de fluido corporal de la cual se tiene la sospecha que contiene células B que expresan la proteina SIGLEC-6; analizar el tejido o fluido corporal para cuantificar la expresión modulada de la proteina SIGLEC-6; y predecir la predisposición del paciente a ciertas enfermedades inmunitarias con base en el nivel de expresión del receptor de la proteina SIGLEC-6 en el tejido o fluido corporal. En otra modalidad, el método comprende recolectar de un paciente una muestra celular, tisular o de fluido corporal de la cual se sabe contiene un nivel definido del receptor de la proteína SIGLEC-6; analizar el tejido o fluido corporal para detectar la cantidad del receptor de la proteina SIGLEC-6 en el tejido; y predecir la predisposición del paciente a ciertas enfermedades inmunitarias con base en el cambio en la cantidad del receptor de la proteína SIGLEC-6 en el tejido o fluido corporal en comparación con un nivel definido o evaluado establecido para la célula, tejido o fluido corporal normal. El nivel definido del receptor de la proteina SIGLEC-6 puede ser una cantidad conocida basada en los valores de literatura o se puede determinar con antelación al medir la cantidad en la célula, tejido o fluidos corporales normales. De manera específica, la determinación de los niveles de receptor de la proteina SIGLEC-6 en ciertos tejidos o fluidos corporales permite la detección especifica y temprana, de preferencia antes de que se presente la enfermedad, de enfermedades inmunitarias en el paciente. Las enfermedades inmunitarias que se pueden diagnosticar empleando el presente método incluyen, entre otras, las enfermedades inmunitarias descritas en esta divulgación. En la modalidad preferida, tejido o fluido corporal es sangre periférica, leucocitos de sangre periférica, tejido de biopsia, por ejemplo, biopsias de pulmón o biopsias de la piel, y fluido o tejido sinovial.
PROFILAXIS Y TRATAMIENTO DE ENFERMEDAD MEDIADA POR CÉLULAS B Y/O MEDIADA POR LA PROTEÍNA SIGLEC-6 En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para el tratamiento de enfermedades mediadas por la proteína SIGLEC-6 en un mamífero. El método comprende administrar a un mamífero una cantidad de un compuesto modulador de la proteina SIGLEC-6 con el fin de tratar una enfermedad, un ejemplo de este compuesto es un anticuerpo agonista anti-SIGLEC-6. El anticuerpo agonista se une al receptor de la proteína SIGLEC-6 y regula la expresión del receptor celular y/o citocina para producir niveles de citocinas característicos de estados de no enfermedad. Las enfermedades mediadas por la proteina SIGLEC-6 incluyen la alergia, el asma, enfermedad autoinmunitaria u otras enfermedades inflamatorias, así como, la mastocitosis . En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar enfermedades mediadas por células B en un mamífero. El método comprende administrar a un mamífero una cantidad de un compuesto modulador de la proteína SIGLEC-6 con el fin de tratar una enfermedad, un ejemplo de este compuesto es un anticuerpo agonista anti-SIGLEC-6 o una pequeña molécula que imite el ligando natural para la proteína SIGLEC-6. El anticuerpo agonista se une al receptor de la proteína SIGLEC-6 y regula la expresión del receptor celular y/o citocina para producir niveles de citocina característicos de estados de no enfermedad. Las enfermedades mediadas por las células B incluyen, entre otras, la leucemia y linfomas de células B. El anticuerpo empleado en la profilaxis y tratamiento de estas enfermedades también puede ser diseñado para efectuar una función efectora para eliminar mastocitos y/o células B que expresen la proteina SIGLEC-6 o para conjugarse con la entidad, por ejemplo, una citotoxina o una molécula que induzca la apoptosis. Las dosificaciones del compuesto modulador de la proteina SIGLEC-6 fluctúan de acuerdo con la edad, tamaño y carácter del mamífero y de la enfermedad en particulares . Los técnicos experimentados pueden determinar las dosificaciones con base en estos factores. Se puede administrar el compuesto modulador de la proteína SIGLEC-6 en los regímenes de tratamiento congruente con la enfermedad, por ejemplo, una sola o unas pocas dosis de uno a varios dias para aliviar un estado de enfermedad o dosis periódicas en un intervalo de tiempo prolongado para la profilaxis de alergia o asma. Se puede administrar a un mamífero el compuesto modulador de la proteína SIGLEC-6 de cualquier manera aceptable, entre las que se incluyen, la administración oral, la inyección, empleando un implante, aerosol en los pulmones y lo similar. Las inyecciones y los implantes permiten un control preciso del tiempo y de los niveles de dosificación empleados en la administración. Se puede administrar el compuesto modulador de la proteína SIGLEC-6 por vía parenteral. Como se usa en esta divulgación, el término administración parenteral significa una inyección intravenosa, intramuscular, o intraperitoneal, o un implante subcutáneo . Cuando se administra mediante inyección, se puede administrar a un mamífero el compuesto modulador de la proteína SIGLEC-6 en una formulación inyectable que contenga cualquier agente biocompatible y un portador compatible, por ejemplo, varios vehículos, adyuvantes, aditivos y diluyentes.
ADMINISTRACIÓN Y COMPOSICIONES TERAPÉUTICAS/PROFILÁCTICAS La invención proporciona métodos para el tratamiento, inhibición y profilaxis mediante la administración a un individuo de una cantidad eficaz de un compuesto o composición de la invención, de preferencia un anticuerpo. El individuo de preferencia es un animal, entre los que se incluyen, animales como por ejemplo, vacas, cerdos, caballos, pollos, gatos, perros, etc., y de preferencia es un mamífero, y con mayor preferencia es el ser humano. Más adelante se describen formulaciones y métodos de administración que se pueden emplear cuando el compuesto comprende un ácido nucleico o una inmunoglobulina. Se conocen varios sistemas de suministro y se pueden emplear para administrar un compuesto de la invención, por ejemplo, encapsulamiento en liposomas, microparticulas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el compuesto, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu and Wu, J. Biol. Chem., 262:4429-4432(1987)), construcción de un ácido nucleico como parte de un retroviral o de otro vector, etc. Los métodos de introducción incluyen, entre otros, las rutas intratérmicas, intramusculares, intraperitoneales, intravenosas, subcutáneas, intranasales, epidurales y orales. Se pueden administrar los compuestos o composiciones mediante cualquier ruta conveniente, por ejemplo, mediante infusión o inyección rápida intravenosa, mediante absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, la mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y se pueden administrar juntos con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. Además, puede resultar deseable introducir los compuestos farmacéuticos o composiciones farmacéuticas de la presente invención en el sistema central nervioso mediante cualquier ruta adecuada, entre las que se incluyen, la inyección intraventricular e intratecal; se puede facilitar la inyección intraventricular mediante un catéter intraventricular, por ejemplo, adherido a un receptáculo, por ejemplo, un receptáculo de Omma a . También se puede emplear la administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y mediante la formulación con un agente aerolizante. En una modalidad específica, puede resultar deseable administrar los compuestos o composiciones de la presente invención localmente en el área que necesite del tratamiento; se pueden lograr esto mediante, por ejemplo, y no de manera limitante, infusión local o por medio de un implante, este implante es de un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluidas las membranas, por ejemplo, las membranas sialásticas o las fibras. De preferencia, cuando se administra una proteina, incluido un anticuerpo, de la presente invención, se debe tener cuidado de usar materiales que no absorban la proteina. En otra modalidad, se puede suministrar el compuesto o composición en una ampolla, en particular una liposoma (véase, Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat et al., en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cáncer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, págs. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., págs. 317-327; véase en términos generales en ibídem) . En todavía otra modalidad, se puede suministrar el compuesto o composición en un sistema de liberación controlado. En una modalidad, se puede emplear una bomba (véase, por ejemplo, Langer, supra; Sefton, CRC Crit . Ref.
Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwaid et al., Surgery 88:507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)). En otra modalidad, se pueden usar materiales poliméricos (véase, Medical Applications of Controlled Reléase, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Ratón, Fia. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983); véase también Levy et al., Science 228:190 (1985); During et al., Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard et al., J. Neurosurg. 71:105 (1989)). En todavía otra modalidad, se puede colocar un sistema de liberación controlada en proximidad del objetivo terapéutico, es decir, el cerebro, con lo que se requiere sólo de una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Reléase, supra, vol. 2, págs. 115-138 (1984)). Otro sistema de liberación controlada es discutido en la revisión de Langer (Science 249:1527-1533(1990)). En una modalidad específica donde el compuesto de la invención es un ácido nucleico que codifica a una proteína, se puede administrar el ácido nucleico in vivo para promover la expresión de su proteina codificada, al construirlo como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado y al administrarlo de modo que sea intracelular, por ejemplo, mediante el uso de un vector retroviral (véase la patente de los Estados Unidos Número 4,980,286), o mediante inyección directa, o mediante el uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, una pistola de genes; Biolistic, Dupont) , o cubriendo con lípidos o con receptores de superficie celular o con agentes transfectantes, o al administrarlo junto con un péptido similar a una homeosecuencia el cual se sabe ingresa al núcleo (véase, por ejemplo, Joliot et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:1864-1868(1991)), etc. Alternativamente, se puede introducir un ácido nucleico intracelularmente y se puede incorporar dentro del ADN de la célula hospedera para su expresión, mediante recombinación homologa. La presente invención también proporciona composiciones. Estas composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto, y un portador aceptable. El término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehiculo con el cual se administra el agente terapéutico. Estos tipos de portadores pueden ser líquidos estériles, por ejemplo, agua o aceites, incluidos aquellos de origen de petróleo, animal, vegetal o sintéticos, como por ejemplo, aceite de cacahuate, aceite de soya, aceite vegetal, aceite de ajonjolí y lo similar. El agua es un portador preferido cuando se administra la composición por via intravenosa. Las soluciones salinas y las soluciones de dextrosa y glicerol acuosas también pueden ser empleadas como portadores líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los excipientes adecuados incluyen el almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y lo similar. La composición, si desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsificantes, o agentes amortiguadores del pH. Estas composiciones pueden tener la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, pildoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación prolongada y lo similar. Se puede formular la composición como supositorios, con los aglutinantes y portadores tradicionales, por ejemplo, los triglicéridos. La formal oral puede incluir portadores estándares, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Ejemplos de portadores adecuados se describen en "Remington ' s Pharmaceutical Sciences " por E. W. Martin. Estas composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto, de preferencia de forma pura, junto con una cantidad adecuada del portador de modo que se proporcione la forma para la administración correcta al paciente. La formulación será adecuada para el modo de administración. En una modalidad preferida, se formula la composición, de acuerdo con los procedimientos de rutina, como una composición adaptada para su administración intravenosa para el ser humano. Por lo habitual, las composiciones para la administración intravenosa son soluciones en un amortiguador acuoso, isotónico y estéril. Cuando es necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local, por ejemplo, la lignocaína para aliviar el dolor en el sitio de la inyección. En general, se suministran los ingredientes ya sea por separado o mezclados juntos en una forma de dosis unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado o como un concentrado sin agua en un recipiente herméticamente sellado, por ejemplo, una ampolleta o una bolsita indicando la cantidad del agente activo. Cuando se tiene que administrar la composición mediante infusión, se puede despachar con una botella de infusión que contenga agua de grado farmacéutico estéril o salina. Cuando se administre la composición mediante inyección, se puede proporcionar una ampolleta con agua estéril para inyección o salina de modo que se puedan mezclar los ingredientes antes de su administración. Vehículos acuosos, como por ejemplo, el agua que no tenga pirógenos no volátiles, agua estéril y agua bacteriostática también son adecuados para formar soluciones inyectables. Además de estas formas de agua, se pueden emplear otros diversos vehículos acuosos. Estos incluyen composiciones de inyección isotónica que se pueden esterilizar, como por ejemplo, el cloruro de sodio, el agente de Ringer, la dextrosa, dextrosa y cloruro de sodio, el agente de Ringer lactado. Vehículos no acuosos, por ejemplo, aceite de algodón, aceite de ajonjolí, o aceite de cacahuate, y esteres, como por ejemplo, isopropil miristato también pueden ser usados como sistemas solventes para las composiciones. Además, se pueden agregar varios aditivos que intensifiquen la estabilidad, esterilidad e isotonicidad de la composición, entre los que se incluyen, conservadores antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y agentes amortiguadores. La cantidad del compuesto de la invención que será eficaz en el tratamiento, inhibición o profilaxis de una enfermedad mediada por células B o de un trastorno asociado con la expresión de la proteina SIGLEC-6 o con una enfermedad mediada con la proteina SIGLE-6 o trastorno asociado con la expresión aberrante y/o actividad, puede ser determinada mediante técnicas clínicas estándares. Además, opcionalmente se pueden emplear análisis in vitro para ayudar en la identificación de los intervalos de dosis óptimos. La dosis precisa a emplearse en la formulación también dependerá de la ruta de administración, y de la severidad de la enfermedad o trastorno, y deberá decidirse de acuerdo con el criterio del médico de cabecera y de cada una de las circunstancias del paciente. Se pueden extrapolar las dosis eficaces a partir de las curvas dosis-respuesta derivadas de sistemas de evaluación del modelo in vitro o animal. Para los anticuerpos, las dosis administradas a un paciente por lo habitual es 0.1 mg/kg a 100 mg/kg del peso corporal del paciente. De preferencia, la dosis administrada a un paciente está entre 0.1 mg/kg y 20 mg/kg del peso corporal del paciente, con mayor preferencia 1 mg/kg a 10 mg/kg del peso corporal del paciente. Por lo general, los anticuerpos humanos tienen una vida media prolongada dentro del cuerpo humano en comparación con los anticuerpos de otras especies, debido a la respuesta inmunitaria a los péptidos extraños. Por ello, a menudo son posibles dosificaciones interiores de anticuerpos humanos y una administración menos frecuente.
PURIFICACIÓN DE PROTEÍNA RECEPTORA DE SIGLEC-6 Se pueden usar los anticuerpos de la presente invención también en un método para aislar y purificar la proteína receptora de SIGLEC-6 a partir de cultivos celulares recombinantes, contaminantes y ambientes nativos. El método comprende exponer una composición que contenga una proteina receptora de SIGLEC-6 y contaminantes a un anticuerpo anti-SIGLEC-6 capaz de unirse a los receptores, lo que permite que la proteina receptora de SIGLEC-6 se adhiera al anticuerpo, separando los complejos anticuerpo-receptor de los contaminantes, y recuperando la proteína receptora de SIGLEC-6 de los complejos. En la técnica también se pueden emplear varios métodos de purificación, por ejemplo, métodos de purificación por afinidad que recuperan la proteína receptora de SIGLEC-6 del cultivo celular recombinante o de fuentes nativas. En este método, los anticuerpos contra SIGLEC-6 se inmovilizan en un soporte adecuado, como por ejemplo, la resina Sephadex o papel filtro empleando métodos bien conocidos en la técnica. Después el anticuerpo inmovilizado se pone en contacto con una composición o una solución muestra que contenga la proteina receptora de SIGLEC-6 a ser purificada. Posteriormente, se lava el soporte por un solvente adecuado capaz de retirar prácticamente todo el material de la muestra, salvo la proteina receptora de SIGLEC-6 unida al anticuerpo inmovilizado. Por último, se lava el soporte con otro solvente adecuado que retire la proteina receptora de SIGLEC-6 del anticuerpo.
ANIMALES INACTIVADOS En otro aspecto, la presente invención proporciona un animal inactivado que comprende un genoma que tiene una interrupción heterocigótica u homocigota en su gen endógeno receptor de SIGLEC-6 que suprime o evita la expresión de las proteínas receptoras de SIGLEC-6 biológicamente funcionales. De preferencia, el animal inactivado de la presente invención tiene una interrupción homocigota en su gen endógeno receptor de SIGLEC-6. De preferencia, el animal inactivado de la presente invención es un ratón. Se puede obtener el animal inactivado con facilidad empleando técnicas conocidas por aquellos técnicos experimentados. Se puede llevar a cabo la interrupción genética de varias maneras, entre las que se incluyen, la introducción de un codón finalizador en una parte de la secuencia codificadora del polipéptido, lo que produce un polipéptido biológicamente inactivo, la introducción de una mutación en un promotor o en otra secuencia reguladora que suprime o evita la expresión de polipéptido y la inserción de una secuencia exógena en el gel que inactive al gen, y la eliminación de secuencias del gen. Varias técnicas están disponibles para introducir secuencias de ADN específico en la linea germinal de mamífero y para lograr la condición estable de estas secuencias (transgenes) a cada una generación posterior. La técnica comúnmente más usada es dirigir la microinyección de ADN en los pronúcleos de oocitos fertilizados. Los ratones u otros animales derivados de estos oocitos serán, en una frecuencia de aproximadamente 10 a 20%, los fundadores transgénicos a través de los cuales se reproducirán las líneas de ratones transgénicos distintas. Los métodos para generar animales transgénicos vía la manipulación y microinyección embrionaria, particularmente animales, por ejemplo los ratones, se han vuelto convencionales en la técnica, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos 4,736,866, 4,870,009 y 4,873,191; y en Hogan, B., Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1986). Se emplean métodos similares para la producción de otros animales transgénicos . Se puede usar la tecnología de célula madre embrionaria ("célula ES") para crear ratones inactivados (y otros animales) con genes específicamente eliminados. Las células madre embrionarias totipotentes, las cuales pueden ser cultivadas in vitro y genéticamente modificadas, se agregan a o se microinyectan a embriones de ratón para producir un ratón quimérico que pueda transmitir esta modificación genética a su descendencia. A través de la reproducción dirigida, se puede, por consiguiente, obtener un ratón que carezca de este gen. Otros diversos métodos están disponibles para la producción de animales genéticamente modificados, por ejemplo, la técnica de inyección de esperma intracitoplásmico (ICSI, intracytoplasmic sperm inj ection) puede ser usada para la producción de ratones transgénicos. Este método requiere la microinyección en el núcleo de un espermatocito en el citoplasma de un oocito no fertilizado, provocando la fertilización del oocito, y la posterior activación de las divisiones celulares apropiadas de un embrión de pre-implantación. Los embriones de ratón obtenidos de esta manera se transfieren a una hembra receptora pseudopreñada. La hembra dará a luz a una carnada de ratones. En el ICSI aplicado a la producción de ratones transgénicos, se incuba una suspensión de esperma o de núcleos de espermatocitos con una solución que contenga las moléculas de ADN deseadas (transgen) . Estas moléculas interactúan con el esperma que, una vez microinyectado, actúa como un vehículo portador para el ADN extraño. Una vez dentro del oocito, el ADN se integra en el genoma, lo que produce un ratón transgénico. Este método produce altos rendimientos (arriba del 80%) de ratones transgénicos en comparación con aquellos obtenidos hoy dia empleando protocolos de microinyección o nucleares tradicionales . Se puede ilustrar aún más esta invención con los siguientes ejemplos, aunque se comprenderá que estos ejemplos están incluidos meramente con fines de ilustración y no pretenden limitar el alcance de la invención, a menos que de manera específica se indique algo distinto.
EJEMPLOS EJEMPLO 1: IDENTIFICACIÓN DE SIGLEC-6 DIFERENCIALMENTE EXPRESADA EN MASTOCITOS Se consultó esta base de datos de proteina humana no redundante IPI (índice de Proteína Internacional) para buscar moléculas novedosas que contengan: 1) por lo menos un dominio de inmunoglobulina (Ig) ; 2) por lo menos una secuencia molecular recurrente de inhibición con base de tirosina inmunorreceptora (ITIM) ; y 3) una región de transmembrana. Estas características son compartidas por muchos receptores activadores de señales que median las funciones de sistemas inmunitarios . Se empleó un método basado en el modelo de Hidden Markov (HMM, Hidden Markov Model ) para la búsqueda de dominio Ig. El método HMM, el cual se constituyó a partir de un alineamiento de 113 presuntos dominios Ig y se calibro empleando el programa HMMER, el cual fue obtenido de la base de datos Pfam (versión 6.6). Para buscar proteínas que contengan la secuencia molecular ITIM, en primer lugar se construyó un perfil de secuencia molecular recurrente formateada PROSITE con base en las características comunes de la secuencia molecular recurrente ITIM, y se empleó el software "seedtop" (NCBI) para realizar la búsqueda. Se llevó a cabo una predicción de la región de transmembrana a gran escala para todas las proteínas IPI empleando el software TMHMM, versión 2.0 (http: //www. cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) . Se descubrió que la secuencia de ADNc de la proteina Siglec-6 cumple con todos los criterios.
EJEMPLO 2: ANÁLISIS DE MICROARREGLO Se enviaron muestras de ARN a Expression Analysis donde se llevaron a cabo experimentos de microarreglo para con respecto a Northerns inverso (B. Phimister, Nature Genetics supplement, 21:1, 1999). Se etiquetó la muestra de ADNc y se hibridizó con Human Genome U133 Plus 2.0 Array GeneChip. Se recibieron los datos iniciales como imágenes pixeladas en blanco y negro para cada hibridación, las cuales posiblemente se transfirieron a y analizaron mediante el software Affymetrix 5.0 ArraySuite. Este software emplea algoritmos estadísticos para calcular un valor cuantitativo (Intensidad de Señalamiento) y un valor cualitativo (presencia o ausencia) para cada trascripto en el arreglo.
EJEMPLO 3: ANÁLISIS PCR CUANTITATIVO EN TIEMPO REAL DE LA EXPRESIÓN DE ARNm DE SIGLEC-6 Se sintetizaron dos cebadores de oligonucleótidos: 5' TGGAGCTGCCTCAAGTAGGG 3' (SEQ ID NO 3) y 5' CGCGGCAGGTGAAATCTCCT 3' (SEQ ID NO 4), con base en las secuencias nucleótidas de SIGLEC-6 después de una selección empleando Primer Express 2.0 (Applied Biosystems, Inc.), y posteriormente se empleó para monitorear la expresión de SIGLEC-6. Se llevó a cabo un PCR cuantitativo en tiempo real con el sistema de detección de secuencia ABI Prism 7900 (Applied Biosystems, Inc.), empleando reactivos SYBR Green, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se aislaron los ARN totales para medir e nivel de ARNm de SIGLEC-6 en las células siguientes: Daudi (una línea celular de limfoblastos B derivados del linfoma de Burkitt, ATCC No. CCL-213) , THP-1 (una linea celular de leucemia monocitica, ATCC No. TIB202), HMC-1, (una linea celular de mastoma) ; células mononucleares de sangre periférica (PBMC, peripheral blood mononuclear cells) ; monocitos primarios; células B primarias; neutrófilos primarios; mastocitos cultivados in vitro a las 8-9 semanas. El ADNc de primera hebra obtenido del cerebro, corazón, riñon, higado, pulmón, bazo, timo y traquea provinieron de BD Bioscience Clontech (Palo Alto, CA) .
Cantidades iguales de cada uno de los ARN de las células indicadas anteriormente fueron empleadas en una reacción de trascripción inversa para generar los ADNc de primera hebra, los cuales se usaron como moldes en las reacciones PCR cuantitativas para obtener el ciclo de amplificación umbral (Ct) . Se normalizó el valor Ct empleando el control Ct de 18S ARN para obtener el valor ?Ct. Para comparar los niveles relativos de la expresión genética de SIGLEC-6 en distintas células y tejidos, se calcularon los valores ??Ct empleando como base el nivel de expresión más bajo, los cuales posteriormente se convirtieron en valores de diferencia de expresión relativa. El análisis RT-PCR cuantitativo mostró que el ARNm de SIGLEC-6 fue expresado en niveles muy altos en mastocitos humanos, tanto en cultivo celular primario como en una línea celular de mastoma (Tabla 1) .
TABLA 1 Perfil de expresión del ARNm de SIGLEC-6 valorado mediante RT-PCR cuantitativo EJEMPLO 4: CONSTRUCCIONES DE EXPRESIÓN DE SIGLEC-6 Se amplificó mediante PCR la secuencia codificadora de SIGLEC-6 (SEQ ID NO: 1) empleando dos cebadores de oligonucleótidos a partir de la secuencia de Siglec-6 : 5' CACCATGCTACCGCTGCTGCTGA (SEQ ID NO: 5) 3': TCACTTGTGTATCTTGATTTCTG (SEQ ID NO: 6) y se clonó en el vector pcDNA3.1D/V5-His (Invitrogen) con una etiqueta V5 fusionada a la C-terminal.
Se transfectó el clon resultante, pSiglec-6-V5, de manera transitoria en las células 293T. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se cosecharon células transfectadas y se separaron en fracciones de membrana y fracciones citosólicas ya sea mediante homogenización o mediante el método de congelación-descongelación. Se llevó a cabo el análisis de transferencia Western empleando los conjugados IgG anti-ratón y MAb anti-V5. Se expresó la proteina SIGLEC-6 predominantemente como una proteina de 55 kDa, la cual es más grande que el peso molecular de 50 kDa calculado, lo que implica que se puede modificar la proteína SIGLEC-6 posterior a la traducción, por ejemplo, mediante glucosilación. Patel et al.(J. Biol. Chem., supra) informó siete posibles sitios de glucosilación dentro del dominio extracelular (véase la . Figura 2, Secuencias en Negrillas) . Se verificó que la secuencia de la construcción de expresión de SIGLEC-6 fuera idéntica a NM_001245 (Número de Acceso de GenBank) .
EJEMPLO 5: ANÁLISIS DE DIAGNÓSTICO PARA SIGLEC-6 Para determinar si la proteína SIGLEC-6 se expresa en células, se pueden llevar a cabo experimentos de inmunofluorescencia con sangre completa, células mononucleares de sangre periférica aislada o en tejidos, por ejemplo, los nodos linfáticos. Se colocaron aproximadamente 25,000 células sobre portaobjetos y se secaron al aire. Se fijaron las células con Carnoy's Fix (60% de etanol, 30% de cloroformo y 10% de ácido acético) durante 10 minutos a la temperatura ambiente, y se lavaron con PBS tres veces. Las células se pre-bloquearon con una solución de bloque (suero de caballo al 1%, suero de conejo al 2%, BSA al 1%, y, suero de cabra al 1% en PBS) en hielo durante 30 minutos e incubaron con mAb anti-SIGLEC-6 (1 ug/ml en BSA al en PBS) durante 30 minutos a la temperatura ambiente. Posteriormente se lavaron las células tres veces e incubaron con IgG (H+L) -FITC anti-ratón de cabra (Jackson Inmuno Lab), en una dilución de 1:100 durante 30 minutos a la temperatura ambiente. Se lavaron las células, se secaron al aire y cubrieron con portaobjetos. Se examinó la tinción de fluorescencia empleando un microscopio de fluorescencia y se registraron los resultados empleando el software Snap-Shot. Para realizar la tinción FACS, se lavaron células aisladas y se pre-incubaron a 4°C durante 30 minutos con un amortiguador de bloqueo (suero de caballo al 1%, suero de conejo al 2%, BSA al 1%, y, suero de cabra al 1% en PBS) . Después se incubaron las células con mAb anti-SIGLEC-6 conjugado con FITC (10 µg/ml) o en el mismo amortiguador durante 30 minutos. Alternativamente, en primer lugar se pueden teñir las células con mAb anti-SGLEC-6 no conjugado seguido por IgG anti-ratón conjugada con FICT o PE. Después de tres lavados, se fijaron las células en 1 x PBS con paraformaldehído al 1%. Se analizaron las muestras mediante FACScan (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) . Para realizar la inmunohistoquimica, se emplearon secciones seriales, de tejidos humanos, fijadas con criostato-acetona o impregnadas con parafinas, y fijas con formalina al 10%, Las muestras de tejido impregnadas en parafina fueron desparafinadas, rehidratadas, incubadas durante 30 minutos a la temperatura en PBS que contenia suero de cabra normal al 2%, y posteriormente fueron incubadas durante la noche a 4°C en un amortiguador que contenia 10 µg/ml de anticuerpo anti-SIGLEC-6 purificado o de 0.5 ug/ml de mAb con respecto a un marcado celular (Chemicon International, Temecula, CA clone #G3, MAB1222) . Se lavaron las muestras, incubaron durante una hora a la temperatura en un amortiguador que contenía IgG anti-ratón de cabra etiquetado con AP, se lavaron dos veces en PBS, e incubaron durante 15 minutos a la temperatura ambiente en una solución de sustrato de fosfatasa alcalina (Pierce, Rockford, IL; Cat#34034) . Se sometieron a tinción de contraste las secciones de tejido teñidas con anticuerpo con hematoxilina de Gilí y se cubrieron con Immu-Mount (Shandon, Pittsburgh, PA) .
EJEMPLO 6: INMUNOHISTOQUÍMICA El fraccionado de las células produjo la presencia de la proteina SIGLEC-6 en la fracción de membrana, pero se presentó muy poca en el citosol . Para confirmar aún más la expresión de la proteina SIGLEC-6 en la superficie celular, se inmunotiñeron tres lineas celulares (CBMC, LAD2 y HMC-1) con un anticuerpo contra SIGLEC-6 antihumano de ratón conjugado con PE. En la Figura 4 se presentan los resultados del análisis FACS, lo que verifica que la proteína SIGLEC-6 se expresa en la superficie celular de estas células. Además, se analizó la presencia de la proteína SIGLEC-6 en los mastocitos de muestra de tejido de pulmón y traquea humano obtenidos de Cooperative Human Tissue Network (CHTN) , división Soutern, Universidad de Alabama en Birmingham. Se emplearon secciones seriales, de tejidos de traquea y pulmón humano, fijadas en criostato-acetona o impregnadas con parafina y fijas con formalina al 10%. Se desparafinaron cada una de las especies de tejido impregnado en parafina, se rehidrataron, incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente en PBS que contenía suero de cabra normal al 2%, y posteriormente se incubaron durante la noche a 4°C en amortiguador que contenia ya sea 10 ug/ml de anticuerpo contra SIGLEC-6 anti humano purificado (BD Pharmingen™, clon # E20-1232) o 0.5ug/ml de anticuerpo contra triptasa anti humano (Chemicon International, Temecula, CA, clon #G3, MAB1222) . Se lavaron las muestras, incubaron durante 1 hora a la temperatura ambiente en el amortiguador que contenia IgG anti-ratón de cabra etiquetado con AP, se lavaron dos veces en PBS, e incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente en la solución de sustrato de fosfatasa alcalina (Pierce, Rockford, IL; Cat#34034) . Se sometieron a tinción por contraste las secciones de tejido teñidas con el anticuerpo con hematoxilina de Gilí y se cubrieron con Immu-Mount (Shandon, Pittsburgh, PA) . Las células teñidas con anti-SIGLEC-6 también mostraron tinción con anti-triptasa, un marcador celular establecido para mastocitos, lo que reveló que se expresó la proteina SIGLEC-6 en los mastocitos en estas muestras de tejido. La detección de la proteína SIGLEC-6 en los mastocitos tisulares fue congruente con los resultados previos de la tinción FACS que indicaron la expresión de esta proteina en mastocitos humanos cultivados asi como en las células LAD2.
EJEMPLO 7: GENERACIÓN Y CRIBADO DE ANTICUERPO ANTI-SIGLEC-6 Se pueden generar los anticuerpos anti-SIGLEC-6 de la presente invención mediante las técnicas de hibridoma tradicionales bien conocidas en la técnica. Brevemente, se inmunizaron ratones con la proteína SIGLEC-6 sintetizada in vitro a partir de la construcción de la expresión generada en el ejemplo 4 anterior. Se emulsifico el inmunógeno en adyuvante completo de Freund, e inyectó por vía subcutánea o intraperitoneal en cantidades que fluctuaron entre 10 y 100 µg. De diez a quince días más tarde, a los animales inmunizados se les aplicó una dosis de recuerdo de la proteína SIGLEC-6 adicional emulsificada en adyuvante incompleto de Freund. A los ratones periódicamente se les aplicó una dosis de recuerdo posteriormente en un esquema de inmunización de una vez a la semana a dos veces por semana . Además, también se generaron anticuerpos al administrar la construcción de ADNc del ejemplo 4, y la •expresión de la proteína SIGLEC-6 in vivo indujo una respuesta inmunitaria a la proteina en el ratón inmunizado. Posteriormente se emplearon ambos tipos de ratones para generar hibridomas. Para cada fusión, se prepararon suspensiones celulares solas a partir del bazo de un ratón inmunizado y se emplearon para la fusión con las células de mieloma SP2/0. Se fusionaron células SP2/0 (1 x 108) y células e'splénicas (1 x 108) en un medio que contenía polietilenglicol al 50% (P.M. 1450) (Kodak, Rochester, NY) y dimetil sulfóxido al 5% (Sigma Chemical Co . , St . Louis MO) . Posteriormente, se ajustaron las células a una concentración de 1.7 x 105 células esplénicas/ml de la suspensión en el medio DMEM (Dulbecco ' s Modif ied Eagle Médium, medio de Eagle Modificado de Dulbecco) (Gibco, Grand Island, NY) , se complementaron con suero de bovino fetal al 5% y HAT (hipoxantina sódica lOmM, aminopterina 40 µM y timidina 1.6 mM) . Se agregaron doscientos cincuenta microlitros de la suspensión celular a cada pozo de aproximadamente cincuenta placas de microvaloración de 96 pozos. Después de aproximadamente diez días, se tiraron los sobrenadantes del cultivo para su cribado mediante reactividad con la proteina SIGLEC-6 purificada de origen humano mediante análisis ELISA. Los pozos de las placas de microvaloración Immulon II (Dynatech Laboratories, Chantilly, VA) fueron cubiertos durante la noche con la proteína SIGLEC-6 de origen humano en una concentración de 0.1 µg/ml (50 µl/pozo) . Posteriormente, se saturaron los sitios de unión no específicos en los pozos mediante la incubación de 200 µl de BLOTTO al 5% (leche en polvo sin grasa) en salina amortiguada con fosfato (PBS) durante una hora. Posteriormente, se lavaron los pozos con amortiguador PBST (PBS que contenia TWEEN®20 al 0.05%). Se agregaron cincuenta microlitros del sobrenadante de cultivo de cada pozo de fusión al pozo recubierto junto con 50 µl de BLOTTO durante 1 hora a la temperatura ambiente. Se lavaron los pozos con PBST. Posteriormente, se detectaron los anticuerpos unidos mediante la reacción con peroxidasa de rábano diluido (HRP) conjugada con IgG anti-ratón de cabra (Fe especifica) (Jackson InmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) durante una hora a la temperatura ambiente. Posteriormente, se lavaron los pozos con PBST. Una solución de sustrato de peroxidasa que contenía 3, 3, 5, 5-tetrametil benzidina al 0.1% (Sigma, St. Louis, MO) y peróxido de hidrógeno al 0.003% (Sigma, St . Louis, MO) en acetato de sodio 0.1M, pH 6.0, fue agregada a los pozos para el desarrollo de color durante 30 minutos. Se finalizó la reacción con la adición de 50 µl de H2S0 2M por pozo. Se tomó lectura de la densidad óptica (OD) a 450nm con un lector ELISA (Dynatech Laboratories, Chantilly, VA) . Los hibridomas en pozos positivos para la reactividad de la proteína SIGLEC-6 fueron clonados de una sola célula al limitar el método de dilución. Después se diseminaron los hibridomas monoclonales y se recolectaron los sobrenadantes de cultivo para su purificación mediante cromatografía de proteina A. Después se caracterizaron los anticuerpos purificados para la determinación de constantes de unión cinética y afinidad mediante BIAcore y para los efectos sobre la liberación de histamina a partir de mastocitos . Se secuenciaron los anticuerpos anti-Siglec-6 monoclonales aislados siguiendo protocolos estándares usados en la técnica. A continuación se muestran secuencias nucleótidas y de aminoácidos de regiones variables de cadena ligera (Kappa) y cadena pesada (H) del Mab 239-90 de anticuerpo monoclonal con regiones determinantes de complementariedad (CDR) subrayadas: Región variable de cadena ligera (Kappa) : gacattg gctgacccaatctccagcttctttggctgtgtctctagggcagagggccaccatctcctgcaaggccagccaaaatgtt gattatgatggtgacagttatatgaactggtaccaacagaaaccagggcagccacccaaactcctcatctatgctgcgtccaatcta gaatctgggatcccagccaggtttagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatg ctgcaacctattactgtcagcaaagtaatgaggatccgtggacg tcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa (SEQ ID NO: 7) DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQNVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNLES GIPARFSGSGSGTPFTLNIHPVEEEDAM?YCQQSNEDPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 8 ) Región variable de cadena pesada : cagcígcagcagtctggacctgagctggtgaggcctgggacttcagtgaagatttcctgcaaggcttctgcctataccttcctcacc tactacatgaactgggtgaagcagaggcctggacagggccttgagtggattggacagatttttcctgcaagtggtagtactaacta caatgagatgttcaagggcaaggccacattgactgtagacacatcctccagcacagcctacatactgctaaacagcctgacatctg aggactctgcggtctatttctgtacaagatct tcgggggggggt tgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgca (SEQ ID NO: 9) QVQLQQSGPELVRPGTSVKISCKASAYTFLTYYMNWVKQRPGQGLEWIGQIFPASGSTNY NEMFKGKATLTVDTSSSTAYILLNSLTSEDSAVYFCTRSFGGGFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 10) Las regiones subrayadas corresponden a las CDR Kabat, tal como se indica a continuación para la cadena ligera (Kappa) : Vk-CDRl : aaggccagccaaaatgttgattatgatggtgacagttatatgaac (SEQ ID NO: 11) ; KASQNVDYDGDSYMN (SEQ ID NO: 12) Vk-CDR2: gctgcgtccaatctagaatct (SEQ E) NO: 13) AASNLES (SEQ ID NO: 14) Vk-CDR3: cagcaaagtaatgaggatccgtggacg (SEQ ID NO: 15) QQSNEDPWT (SEQ ID NO: 16) y para la cadena pesada: Vh-CDRl: gccíataccttcctcacctactacatgaac (SEQ ID NO: 17) AYTFLTYYMN (SEQ ID NO: 18); V-2-CDR2: cagatttttcctgcaagtggtagtactaactacaatgagatgttcaagggc (SEQ ID NO: 19) QIFPASGSTNYNEMFKG (SEQ ID NO: 20); Vh-CDR3: tctttcgggggggggtttgcttac (SEQ ID NO: 21) SFGGGFAY (SEQ ID NO: 22).
EJEMPLO 8: EFECTO DE LA PROTEINA SIGLEC-6 SOBRE LA DESGRANULACION DE MASTOCITOS Se cultivaron células CD34+ de sangre de cordón humano (Bio-Whittaker, Walkersville, MD) durante siete semanas en medios de cultivo compuestos por RPMI1640 (Invitrogen) suplementados con FBS al 10% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) , L-glutamina 2 mM, 2-ME 50µM, 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina, 1 µg/ml de gentamicina, 100 ng/ml de SCF, 50 ng/ml de IL-6 y 10 ng/ml de IL-10. Se tiñeron las células con mAb anti-triptasa para determinar el porcentaje de mastocitos. Inicialmente, se sembraron suspensiones celulares a una densidad de 5 X 105 células/ml y se reemplazó una vez por semana el medio suplementado con citocina. Se empleó el siguiente protocolo para activar los CBMC de origen humano con la proteína SIGLEC-6 vía la reticulación Fc?RI . Los CBMC, cultivados tal como se describió anteriormente, fueron sembrados en placas de microvaloración a una densidad de 10,000 células/lOOul/pozo. Se trataron las células con 15 ng/ml de rIFN-? de origen humano durante 48 horas. Posteriormente, se incubaron las células durante 1 hora a 37 °C con Fc?RI F(ab')2 anti-humano de ratón en presencia de anticuerpo anti-SIGLEC-6 (2 a 10 µg/ml) , o una proteina especifica de mastocitos irrelevante como un control negativo. Se centrifugaron las placas a 1000 rpm durante 2 minutos y se retiró el sobrenadante. Se agregaron 100 ul de medios frescos seguido por 10 µg/ml de IgG F(ab')2 anti-ratón de cabra y se incubaron las placas durante 2 horas. Se recolectaron los sobrenadantes y se cuantificó la cantidad de histamina liberada debido a la reticulación. Se llevo a cabo el análisis de liberación de histamina empleando reactivos y protocolos estándares obtenidos de Beckman Coulter (Fullerton, CA) . En breve, se cosecharon sobrenadantes CBMC activados y se midieron sus contenidos de histamina empleando un estuche de inmunoanálisis de histamina (Beckman-Coulter, Palatine, IL) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El inmunoanálisis estuvo basado en una competencia entre la histamina a ser analizada y un conjugado de fosfatasa alcalina-histamina . Se sometió a acilación la histamina presente en el sobrenadante celular con un reactivo acilante en un pH ligeramente alcalino, y se agregó en pozos de microvaloración revestidos con anticuerpos anti-histamina. Se recubrieron los pozos de microvaloración con un número limitado de anticuerpos, lo que permitió que se efectuara una competencia entre el conjugando y la histamina asilada en la muestra. Después de 2 horas de incubación a 4°C, se enjuagaron los pozos para retirar los componentes no enlazados. Se cuantificó la actividad enzimática unida al agregar un sustrato cromogénico (pNPP) . La intensidad del color fue inversamente proporcional a la concentración de histamina en la muestra. Se calculó la histamina liberada con base en una curva estándar obtenida con los estándares provistos en el estuche. En la Figura 5 se presentan los resultados de este experimento de reticulación. Si se presenta la reticulación, entonces se liberará la histamina del CBMC. Tal como se puede apreciar, el equipo C-Kit (expresado en los CBMC) y de un anticuerpo irrelevante no afectaron la cantidad de histamina liberada de las células ya sea en presencia o ausencia de Fc?RI . En contraste, el componente anti-SIGLEC-6 fue capaz de inhibir la cantidad de histamina liberada de una manera dependiente a la dosis.
EJEMPLO 9: ANÁLISIS ADCC Se estableció un análisis funcional ADCC para cribar candidatos de anticuerpo monoclonal anti-SIGLEC-6. Se etiquetaron las células objetivos (por ejemplo, CBMC o LAD2) con 100 µCi de 51Cr durante 60 minutos y se emplearon PBMC de origen humano como las células efectoras . Se coincubaron las células objetivo (5 x 103/pozo) y las células efectoras en varias proporciones E:T en 200 µl de RPMI1640 en una placa de fondo en forma de U de 96 pozos en triplicado durante 6 horas a 37 °C con la proteina SIGLEC-6 (2 µg/pozo; Roche) o con un anticuerpo de control. Posteriormente, se cuantificó la radioactividad del sobrenadante (100 µl) con un contador gamma. Se calculó el porcentaje de lisis especifico de acuerdo con la formula: % lisis específica = 100 x (cpm experimental - cpm espontáneo) / (cpm máximo - cpm espontáneo). Los controles incluyen la incubación de células objetivos sin el anticuerpo o con un anticuerpo irrelevante.
EJEMPLO 10: ANÁLISIS DE PROLIFERACIÓN/INHIBICIÓN Se evaluaron los anticuerpos monoclonales anti-SIGLEC-6 en la linea celular LAD2 de mastocitos para medir los efectos sobre la proliferación e inhibición celular. Se agregó H3-dCTP al medio de cultivo celular LAD2 en presencia de varias concentraciones del anticuerpo anti-SIGLEC-6 durante un periodo de 7 días. Se lavaron las células para retirar el elemento H3-dCTP no incorporado y se fijaron las células con TCA al 10% antes de medir el nivel de incorporación mediante conteo de centelleos . Incrementos en la incorporación de H3-dCTP indican un efecto de proliferación mediante el anticuerpo anti-SIGLEC-6 sobre los mastocitos humanos, mientras que las disminuciones en la incorporación de H3-dCTP indican un efecto inhibidor del anticuerpo anti-SIGLEC-6 sobre los mastocitos humanos.
EJEMPLO 11: APOPTOSIS DE MASTOCITOS Se puede crear la Anexina V, un marcador celular de apoptosis celular, con el fin de detectar si anticuerpos monoclonales anti-SIGLEC-6 tienen un efecto biológico sobre el proceso de apoptosis de mastocitos. Se usará anti-Anexina V conjugada con FICTS para hacer la tinción FACS en CBMC de origen humano después de 24 horas de incubación con candidatos de anticuerpo anti-SIGLEC-6. Cualquier nivel de expresión de Anexina V en la superficie celular indicara un efecto de anticuerpo anti-SIGLEC-6 sobre la apoptosis de mastocitos .
EJEMPLO 12: CRIBADO DE AGONISTAS Dado que las moléculas de SIGLEC-6 tienen dos dominios ITIM en la c-terminal que porta el sitio de tirosina, cualquier fosforilación de tirosina mediante un anticuerpo y seria un indicativo de un agonista. Se llevará a cabo este experimento al tratar mastocitos o una linea celular de mastocitos, por ejemplo LAD2 , con un candidato de anticuerpo monoclonal anti-SIGLEC-6 durante cinco minutos en la condición del cultivo celular normal, posteriormente, se someterán a lisis las células, se efectuará el lisado celular en un formato de transferencia Western, y se monitoreará la transferencia con anti-fosfotirosina monoclonal. Los candidatos de anticuerpos que causen la fosforilación de tirosina de proteina del dominio citoplasto SIGLEC-6 con la unión serán considerados agonísticos en comparación con un crecimiento de cultivo celular similar en ausencia del anticuerpo.

Claims (74)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a la proteína SIGLEC-6, en donde el anticuerpo comprende regiones hipervariables que tienen una identidad de secuencia de por lo menos el 80% con respecto a SEQ ID NOs: 12, 14, 16, 18, 20 ó 22.
  2. 2. El anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende regiones hipervariables que tienen una identidad de secuencia de por lo menos el 90% con respecto a SEQ ID NOs: 12, 14, 16, 18, 20 ó 22.
  3. 3. El anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 2, en donde la cadena ligera comprende una región hipervariable seleccionada del grupo formado por Vk-CDRl (SEQ ID NO: 12), Vk-CDRl (SEQ ID NO: 14) y Vk-CDR3 (SEQ ID NO: 16) .
  4. 4. El anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 2, en donde la cadena pesada comprende una región hipervariable seleccionada del grupo formado por Vh-CDRl (SEQ ID NO: 18), Vh-CDRl (SEQ ID NO: 20) y Vh-CDR3 (SEQ ID NO: 22) .
  5. 5. El anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 3, en donde la cadena pesada comprende una región hipervariable seleccionada del grupo formado por Vh-CDRl (SEQ ID NO: 18), Vh-CDRl (SEQ ID NO: 20) y Vh-CDR3 (SEQ ID NO: 22) .
  6. 6. El anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 2, en donde la cadena ligera comprende Vk-CDR1 (SEQ ID NO: 12), Vk-CDRl (SEQ ID NO: 14) y Vk-CDR3 (SEQ ID NO: 16) .
  7. 7. El anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 2, en donde la cadena pesada comprende Vh-CDR1 (SEQ ID NO: 18), Vh-CDRl (SEQ ID NO: 20) y Vh-CDR3 (SEQ ID NO: 22) .
  8. 8. El anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 6, en donde la cadena pesada comprende Vh-CDR1 (SEQ ID NO: 18), Vh-CDRl (SEQ ID NO: 20) y Vh-CDR3 (SEQ ID. NO: 22) .
  9. 9. El anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde las cadenas ligera y pesada comprenden una región estructural de origen humano .
  10. 10. El anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 8, en donde la cadena ligera comprende la región variable de cadena ligera descrita en SEQ ID NO: 8.
  11. 11. El anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 8, en donde la cadena pesada comprende la región variable de cadena pesada descrita en SEQ ID NO: 10.
  12. 12. El anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 10, en donde la cadena pesada comprende la región variable de cadena pesada descrita en SEQ ID NO: 10.
  13. 13. El anticuerpo o fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones precedentes además comprende una región constante.
  14. 14. El anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 13, en donde las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada se ligan a una región constante .
  15. 15. Una cadena ligera o cadena pesada variable del anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 1.
  16. 16. Un ácido nucleico aislado que codifica la cadena ligera y/o cadena pesada variable según la reivindicación 15.
  17. 17. Una composición que comprende el ácido nucleico aislado según la reivindicación 16.
  18. 18. Una célula que comprende el ácido nucleico aislado según la reivindicación 16.
  19. 19. Un anticuerpo o fragmento del mismo que se une de manera específica al mismo epitopo en la proteína SIGLEC-6 como un anticuerpo que comprende una cadena ligera que tiene las CDR de SEQ ID NOs 12, 14, 16, y una cadena pesada que tiene las CDR de SEQ ID NOs 18, 20 y 22.
  20. 20. El anticuerpo según la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde el anticuerpo es anticuerpo de origen humano, humanizado, quimérico, de una sola cadena o de un solo dominio.
  21. 21. Una composición que comprende el anticuerpo según la reivindicación 1 o reivindicación 2 y un portador, adyuvantes, diluyentes, exipientes y/o aditivos adecuados.
  22. 22. Un método para elaborar una cadena pesada o cadena ligera o un fragmento de la misma; el método comprende cultivar una célula según la reivindicación 18 bajo condiciones apropiadas para la expresión de la cadena ligera o cadena pesada; y purificar la cadena pesada o cadena ligera del cultivo celular.
  23. 23. Un método para elaborar una cadena ligera y i una cadena pesada o un fragmento de la misma; el método comprende cultivar una célula según la reivindicación 18 bajo condiciones apropiadas para la expresión de la cadena ligera y cadena pesada; y purificar la cadena pesada y cadena ligera del cultivo celular.
  24. 24. Un método para elaborar un anticuerpo o fragmento del mismo; el método comprende cultivar una célula según la reivindicación 18 bajo condiciones apropiadas para la expresión del anticuerpo; y purificar el anticuerpo del cultivo celular.
  25. 25. Un método para la profilaxis y/o tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por mastocitos en un individuo; el método comprende administrar a un individuo, que necesite del método, un modulador del receptor de la proteína SIGLEC-6.
  26. 26. El método según la reivindicación 25, en donde modulador del receptor de la proteína SIGLEC-6 es un agonista de la proteina SIGLEC-6.
  27. 27. El método según la reivindicación 25, en donde modulador del receptor de la proteína SIGLEC-6 es un antagonista de la proteina SIGLEC-6.
  28. 28. El método según la reivindicación 25, en donde el modulador del receptor de la proteina SIGLEC-6 es un anticuerpo.
  29. 29. Un método para la profilaxis y/o tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por mastocitos en un individuo; el método comprende administrar a un individuo, que necesite del método, un anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 1.
  30. 30. El método según la reivindicación 29, en donde la enfermedad o trastorno mediados por mastocitos es el asma.
  31. 31. Un método para la profilaxis y/o tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por mastocitos en un individuo; el método comprende administrar a un individuo, que necesite del método, un anticuerpo anti-SIGLEC-6 o un fragmento del mismo que tenga una función efectora para eliminar mastocitos.
  32. 32. El método según la reivindicación 31, en donde la función efectora es una citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpo (ADCC, antibody-dependent cell- mediated cytotoxicity) .
  33. 33. Un método para la profilaxis y/o tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por mastocitos en un individuo; el método comprende administrar a un individuo, que necesite del método, un anticuerpo anti-SIGLEC-6 o un fragmento del mismo según la reivindicación 1, que tenga una función efectora para eliminar mastocitos.
  34. 34. Un método para la profilaxis y/o tratamiento de una enfermedad o trastorno mediados por mastocitos; el método comprende administrar un anticuerpo anti-SIGLEC-6 o un fragmento del mismo conjugado con una entidad inductora de apoptosis para inducir la apoptosis en los mastocitos.
  35. 35. El método según la reivindicación 34, en donde la entidad inductora de apoptosis es un miembro pro-apoptótico de la familia Bcl-2 seleccionado de Bax- , Bak, Bcl-Xs, Bad, Bid, Bik, Erk y Bok.
  36. 36. Un método para la profilaxis y/o tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por mastocitos en un individuo; el método comprende administrar a un individuo, que necesite del método, un anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 1.
  37. 37. Un método para determinar la presencia de la proteína SIGLEC-6 en una muestra biológica; el método comprende poner en contacto una muestra biológica con un anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 1, y determinar la presencia del anticuerpo o fragmento del mismo .
  38. 38. Un método para diagnosticar un trastorno mediado por mastocitos en un animal, que comprende: Obtener una muestra de un mamífero sospechoso de padecer un trastorno mediado por mastocitos; Incubar esta muestra con una cantidad detectable del anticuerpo anti-SIGLEC-6; Cuantificar la cantidad de anticuerpo enlazado; Comparar la cantidad de anticuerpo enlazado en la muestra sospechosa con un control normal, en donde una cantidad diferente de anticuerpo enlazado en la muestra del animal sospechoso de padecer un trastorno mediado por mastocitos con respecto al control normal indica que el mamífero tiene o es probable que desarrolle un trastorno mediado por mastocitos .
  39. 39. Un conjunto de accesorios para detectar la presencia de la proteina SIGLEC-6; el conjunto de accesorios comprende un anticuerpo según la reivindicación 1.
  40. 40. Un conjunto de accesorios para diagnosticar una enfermedad o trastorno mediado por mastocitos; el conjunto de accesorios comprende un anticuerpo anti-SIGLEC-6.
  41. 41. Un método para cribrar un compuesto que module la actividad del receptor de la proteina SIGLEC-6, el método comprende : preparar una célula que comprenda una secuencia de ácidos nucleicos que codifique la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO 2 o un fragmento biológicamente activo de la misma; poner en contacto esta o estas células con por lo menos un compuesto del cual se busque determinar su capacidad de modular la actividad del receptor de la proteína SIGLEC-6; monitorear esta célula para observar la modulación de la actividad del receptor de la proteina SIGLEC-6.
  42. 42. El método según la reivindicación 41, en donde la célula es establemente transfectada.
  43. 43. El método según la reivindicación 41, en donde la célula es temporalmente transfectada.
  44. 44. El método según la reivindicación 41, en donde la célula es un mastocito.
  45. 45. El método según la reivindicación 41, en donde el compuesto es un agonista.
  46. 46. El método según la reivindicación 41, en donde el compuesto es un antagonista.
  47. 47. El método según la reivindicación 41, en donde el compuesto es un anticuerpo.
  48. 48. El método según la reivindicación 41, en donde las células empleadas en el paso (a) además comprenden una proteina indicadora, en donde este ADN se une de manera operativa con un elemento de trascripción sensible a la proteína SIGLEC-6.
  49. 49. El método según la reivindicación 41, en donde el paso (b) se lleva a cabo en presencia de concentraciones crecientes de por lo menos un compuesto del cual se busca determinar su capacidad de inhibir la actividad de traducción de señales de esta o estas proteínas receptoras .
  50. 50. El método según la reivindicación 48, en donde el paso (c) comprende monitorear en estas células el nivel de expresión de la proteina indicadora como una función de la concentración del compuesto, indicando con ello la capacidad de este compuesto de inhibir la actividad de traducción de señale.
  51. 51. Un método para cribar agonistas o antagonistas de la actividad de la proteína SIGLEC-6; el método comprende: poner en contacto células que expresan la proteína SIGLEC-6 con un compuesto candidato; analizar una respuesta celular, y comparar la respuesta celular con una respuesta celular estándar elaborada en ausencia del compuesto candidato; por medio de lo cual, un incremento en la respuesta celular con respecto al estándar indica que el compuesto es un agonista y una disminución en la respuesta celular con respecto al estándar indica que el compuesto es un antagonista.
  52. 52. Un método para identificar un compuesto candidato para el tratamiento de trastornos inflamatorios mediados por mastocitos en mamíferos; el método comprende: aplicar este compuesto a mastocitos; cuantificar la expresión/función de la proteína SIGLEC-6; identificar si este compuesto disminuye esta expresión/función de la proteina SIGLEC-6 implicada en los trastornos inflamatorios mediados por mastocitos en comparación con mastocitos en los cuales no se aplicó este compuesto; e identificar un compuesto que disminuya la expresión/función como un compuesto candidato para el tratamiento de trastornos inflamatorios mediados por mastocitos .
  53. 53. El método según la reivindicación 52, en donde el compuesto candidato es un agonista de la proteína SIGLEC-6.
  54. 54. El método según la reivindicación 52, en donde el compuesto candidato es un antagonista de la proteina SIGLEC-6.
  55. 55. El método según la reivindicación 52, en donde el compuesto candidato es un anticuerpo.
  56. 56. Un método para identificar un agente que inhiba una actividad biológica de la proteina SIGLEC-6; el método comprende: poner en contacto un polipéptido que comprenda el dominio ITIM de la proteina SIGLEC-6 con un agente; determinar si el agente se une al dominio ITIM de la proteina SIGLEC-6; y determinar si un agente identificado en b. que se une al dominio ITIM inhibe la liberación de histamina de mastocitos activados.
  57. 57. El método según la reivindicación 56, en donde la acción de determinar la actividad biológica de la proteina SIGLEC-6 comprende la acción de determinar el nivel de liberación de histamina, en donde la liberación de un nivel mayor de liberación de histamina del mastocito en presencia del agente de prueba con respecto a la ausencia del agente de prueba indica que el agente de prueba es un agente que estimula la actividad biológica de la proteina SIGLEC-6, mientras que un nivel inferior de liberación de histamina del mastocito en presencia del agente de prueba con respecto a la ausencia del agente de prueba indica que el agente de prueba es un agente que inhibe la actividad biológica de la proteina SIGLEC-6.
  58. 58. Un método para diagnosticar un trastorno relacionado con las células B, en donde las células B expresan la proteina SIGLEC-6 en un mamífero; el método comprende : Obtener una muestra de un mamífero sospechoso de padecer un trastorno relacionado con las células B; Incubar esta muestra con una cantidad detectable del anticuerpo anti-SIGLEC-6; Cuantificar la cantidad del anticuerpo enlazado; y Comparar la cantidad de anticuerpo enlazado en la muestra sospechada con un control normal.
  59. 59. El método según la reivindicación 58, en donde se etiqueta el anticuerpo.
  60. 60. El método según la reivindicación 59, en donde la etiqueta es una entidad fluorescente, una entidad de radioactividad, una enzima o una entidad luminiscente.
  61. 61. El método según la reivindicación 58, en donde el anticuerpo anti-SIGLEC-6 es detectado por un segundo anticuerpo.
  62. 62. El método según la reivindicación 58, en donde el anticuerpo anti-SIGLEC-6 es detectado por el análisis ELISA.
  63. 63. Un conjunto de accesorios para diagnosticar un trastorno relacionado con las células B; el conjunto de accesorios comprende un anticuerpo anti-SIGLEC-6.
  64. 64. Un conjunto de accesorios para diagnosticar un trastorno relacionado con las células B; el conjunto de accesorios comprende un anticuerpo anti-SIGLEC-6 enlazado con una superficie sólida.
  65. 65. Un método para la profilaxis y/o tratamiento de un trastorno relacionado con las células B, en donde las células B expresan la proteína SIGLEC-6, en un paciente; el método comprende administrar un modulador del receptor de la proteina SIGLEC-6 a un paciente que necesite de este tratamiento.
  66. 66. El método según la reivindicación 65, en donde el modulador del receptor de la proteína SIGLEC-6 es un agonista de la proteina SIGLEC-6.
  67. 67. El método según la reivindicación 66, en donde el modulador del receptor de la proteína SIGLEC-6 es un anticuerpo.
  68. 68. El método según la reivindicación 65, en donde el trastorno relacionado con las células B es un linfoma inducido por células B.
  69. 69. El método según la reivindicación 65, en donde el modulador del receptor de la proteina SIGLEC-6 es un anticuerpo anti-SIGLEC-6 que tiene una función efectora para eliminar células B que expresan la proteína SIGLEC-6.
  70. 70. El método según la reivindicación 69, en donde la función efectora es una citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpo (ADCC) .
  71. 71. El método según la reivindicación 65, en donde el modulador del receptor de la proteina SIGLEC-6 es un anticuerpo anti-SIGLEC-6 conjugado con una entidad inductora de apoptosis para inducir la apoptosis en las células B que expresan la proteina S1GLEC-6.
  72. 72. El método según la reivindicación 71, en donde la entidad inductora de apoptosis es un miembro pro-apoptótico de la familia Bcl-2 seleccionado de Bax-a, Bak, Bcl-Xs, Bad, Bid, Bik, Erk y Bok.
  73. 73. El uso de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1-13 para la preparación de una composición terapéutica o de diagnóstico para el tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por mastocitos.
  74. 74. El uso de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1-13 para la preparación de una composición terapéutica o de diagnóstico para el tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado con las células B, como por ejemplo, el linfoma.
MXPA06014388A 2004-06-09 2005-06-09 Diagnostico y tratamiento de enfermedades asociadas con la proteina siglec-6. MXPA06014388A (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US57819404P 2004-06-09 2004-06-09
US58042204P 2004-06-17 2004-06-17
PCT/US2005/020271 WO2005124358A2 (en) 2004-06-09 2005-06-09 Diagnosis and treatment of siglec-6 associated diseases

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MXPA06014388A true MXPA06014388A (es) 2007-03-12

Family

ID=35510373

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MXPA06014388A MXPA06014388A (es) 2004-06-09 2005-06-09 Diagnostico y tratamiento de enfermedades asociadas con la proteina siglec-6.

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20080267973A1 (es)
EP (1) EP1773882A4 (es)
JP (1) JP2008502368A (es)
AU (1) AU2005255423A1 (es)
CA (1) CA2570034A1 (es)
MX (1) MXPA06014388A (es)
WO (1) WO2005124358A2 (es)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11243213B2 (en) * 2015-11-05 2022-02-08 Wayne State University Kits and methods for prediction and treatment of preeclampsia
EP3507601B1 (en) 2016-08-31 2023-08-16 Agency for Science, Technology and Research Methods for the identification, targeting and isolation of human dendritic cell (dc) precursors "pre-dc"
WO2019133818A1 (en) * 2017-12-29 2019-07-04 Cornell University Gene therapy for eosinohilic disorders
CA3190797A1 (en) * 2020-08-10 2022-02-17 Julius-Maximilians-Universitat Wurzburg Siglec-6-binding polypeptides
JPWO2022215566A1 (es) * 2021-04-05 2022-10-13
CA3232225A1 (en) * 2021-09-16 2023-03-23 Allakos Inc. Anti-siglec-6 antibodies and methods of use thereof
WO2023086897A1 (en) * 2021-11-12 2023-05-19 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Siglec-6 antibodies, derivative compounds and related uses

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2431834T3 (es) * 2000-03-07 2013-11-28 The Johns Hopkins University Anticuerpos de sialoadhesina factor-2
AU2002224546A1 (en) * 2000-07-21 2002-02-05 Bristol-Myers Squibb Company Siglec (sialic acid-binding IG-related lectin) polypeptides and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
EP1773882A4 (en) 2008-09-24
AU2005255423A1 (en) 2005-12-29
WO2005124358A2 (en) 2005-12-29
WO2005124358A3 (en) 2007-01-11
CA2570034A1 (en) 2005-12-29
EP1773882A2 (en) 2007-04-18
JP2008502368A (ja) 2008-01-31
US20080267973A1 (en) 2008-10-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11084875B2 (en) Anti-TREM2 antibodies and methods of use thereof
AU2016276981B2 (en) Anti-CD33 antibodies and methods of use thereof
US20100136030A1 (en) Antagonist ox40 antibodies and their use in the treatment of inflammatory and autoimmune diseases
EP2087006B1 (en) Anti-notch3 agonist antibodies and their use in the treatment of notch3-related diseases
EP2500030B2 (en) Use of complement pathway inhibitors to treat ocular diseases
WO2017040301A1 (en) Anti-siglec-7 antibodies and methods of use thereof
US20080267973A1 (en) Diagnosis and Treatment of Siglec-6 Associated Diseases
JP2007526747A (ja) ヒトマスト細胞発現膜タンパク質
IL198079A (en) Anti-3 Notch Agonist Antibodies and Their Use in Preparing Drugs for the Treatment of 3 Notch