WO2017204446A2 - 수용체 시너지 활성을 이용한 nk 세포의 활성도 검사 방법 및 이를 이용한 nk 세포의 활성도가 관련된 질환의 진단 방법 - Google Patents

수용체 시너지 활성을 이용한 nk 세포의 활성도 검사 방법 및 이를 이용한 nk 세포의 활성도가 관련된 질환의 진단 방법 Download PDF

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김헌식
명승재
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울산대학교 산학협력단
재단법인 아산사회복지재단
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for examining the activity of NK cells using receptor synergistic activity of NK cells and a method for diagnosing a disease related to the activity of NK cells using the same.
  • NK cells Natural killer cells
  • MHC major histocompatibility complex
  • NK cells The activity of NK cells involves various activating and inhibitory receptors.
  • receptors considered dominant are immunoreceptor tyrosine-based activation motifs (ITAMs) -associated signaling molecules (eg, FcR ⁇ chains or TCR ⁇ chains) associated with NKp46 and the signaling molecule DAP10.
  • ITAMs immunoreceptor tyrosine-based activation motifs
  • NKp46 a signaling ⁇ chains or TCR ⁇ chains
  • DAP10 signaling molecule DAP10
  • Receptors considered costimulatory include DNAM-1 (CD226), CD2, and NKp80 ( KLRF1 gene products, as well as members of the signaling lymphocytic activation molecule (SLAM) family, such as 2B4 (CD244).
  • SLAM signaling lymphocytic activation molecule
  • ITAM-related molecules contribute to the signaling by several different activating receptors of NK cells, NKp46 and NKp30, which are related to FcR ⁇ and / or TCR ⁇ , while natural cytotoxicity receptors (NCRs), while NKp44 Is associated with the signal adapter DAP12 (EMBO J. 2004; 23: 255-9).
  • Hemophagocytic lymphohistiocytosis is a disease that shows the proliferation of monocytes or macrophage and shows uncontrolled hypersecretion of hemophagocytosis and inflammatory cytokines.
  • immunodeficiency X-linked lymphoproliferative disease 1 is a disease with symptoms such as HLH, which is caused by Epstein-Barr virus (EBV),
  • EBV Epstein-Barr virus
  • SH2D1A which makes SAP proteins, forms the genetic basis of XLP1 (Annu. Rev. Immunol. 2007; 25: 337-79, Annu. Rev. Immunol. 2011; 29: 665-705) .
  • 2B4 contains an ITSM motif at the cellular tail and carries activation signals through recruitment of small adapters SAP and SAP-associated tyrosine kinase Fyn ( J. Exp . Med . 202, 181-192 (2005), Immunity 36, 974-985 (2012)). Signaling of 2B4 leads to a Vav1, p38 MAPK, Erk, and the PLC-enabled g2 (Nat. Immunol. 9, 495-502 (2008). Note that in NK cells obtained from congenital XLP1 patients lacking functional SAP expression, 2B4 is inactive and can instead transmit an inhibitory signal ( Annu . Rev. Immunol . 25, 337-379 (2007)).
  • NK cell defects are thought to contribute to signs of clinical XLP1, such as killing defects of Epstein Barr virus (EBV) -infected B cells, defects in IFN-g production, fulminant mononucleosis, and B-cell lymphoma do.
  • EBV Epstein Barr virus
  • NKG2D J. Immunol. 175, 5541-5550 (2005), Cancer Res. 69, 7775-7783 (2009), J. Immunol. 189, 1360-1371 (2012), which is an anticancer receptor in NK cells of cancer patients
  • Defects have been observed in NK cell activation via DNAM-1 (Immunol. Cell Biol. 90, 109-115 (2012)).
  • the expression and function of NKG2D and 2B4 are also reduced in NK cells of hepatitis B virus infected patients (PloS Pathog. 8, e1002594 (2012)).
  • One aspect includes specifically stimulating two or more factors that are distinct on NK cells in a sample; Measuring the degree of synergistic activation of the NK cells induced by stimulation with the two or more factors; And it provides a method for testing the activity of NK cells comprising the step of comparing the degree of synergistic activation of the NK cells compared to normal NK cells.
  • Another aspect is a stimulatory substance that produces synergistic activity of NK cells, the antibody or fragment thereof specific for two or more factors that are distinguished on the NK cell, or a target cell or polypeptide that causes specific activity, specifically
  • a composition for inducing activity and a composition for testing the activity of NK cells comprising one or more selected from a reversible or irreversible effector.
  • Another aspect is a stimulus substance that stimulates two or more factors distinguished on NK cells in a sample to cause synergistic activity of the NK cells, wherein the antibody or fragment thereof, specific for each or more than two factors, or a specific activity thereof One or more selected from target cells or polypeptides that cause proliferation, compositions that specifically induce activity, and reversible or irreversible agents; And it provides a kit for diagnosing a disease associated with the synergistic activity of NK cells comprising a substance for detecting the presence or absence of activation of the NK cells compared to normal NK cells.
  • One aspect includes specifically stimulating two or more factors that are distinct on NK cells in a sample; Measuring the degree of synergistic activation of the NK cells induced by stimulation with the two or more factors; And it provides a method for testing the activity of NK cells comprising the step of comparing the degree of synergistic activation of the NK cells compared to normal NK cells.
  • the sample may be a biological sample derived from an individual, eg, a mammal, including a human.
  • the biological sample may be isolated from an individual, and may be blood, whole blood, serum, plasma, lymph, urine, feces, tissue, cells, organs, bone marrow, saliva, sputum, cerebrospinal fluid, or a combination thereof.
  • the biological sample may also comprise PBMCs, purified NK cells or primary resting cells (ie, isolated directly from blood).
  • the sample is blood.
  • differentiation includes all cases that are not equivalent in position, structure, function, etc. in a cell. Specifically, different signaling processes are induced within the cell after stimulation, or positions or factors on the cells themselves are structurally different so that the means or methods of stimulation are different, or in a single stimulus different roles in the cell. Or insufficiently effective in effectively activating.
  • factor refers to all molecular elements that cause synergistic activation of NK cells. Specifically, the factor may include intracellular and external adapters, proteins, glycoproteins, peptides, and motifs that can bind to receptors, channels, and specific ligands in and out of cells.
  • the factor may be a receptor.
  • receptor refers to any molecule that binds to a specific substance and changes the activity of NK cells.
  • specific substances include chemical compositions, specific proteins derived from the body or artificial, peptides, cholesterol, glycoproteins, cytokines or chemokines by other immune cells or NK cells themselves, or specific receptors on target cells or NK cells themselves. Or membrane protein.
  • the factor may be present on the cell surface or within the cell.
  • the factor when it is a receptor, it is located on the cell surface of the NK cells and binds to a specific substance and transmits the signal into the cell to induce the activity of the NK cells, as well as through the cell membrane to the cell membrane inner surface or cytoplasm.
  • Representative receptors include all receptors that can bind to a specific external stimulus and cause a signaling action.
  • the term "stimulus” means acting on a factor to cause specific signaling in and out of NK cells.
  • the method of causing stimulation may employ antibodies, fragments or peptides specific for one or more of the factors, compositions that specifically induce or inhibit, and reversible or irreversible agonists or antagonists.
  • culture with a culture comprising various target cells capable of stimulating NK cells eg, K562, 721.221, or P815 coated with specific receptor stimulating antibodies).
  • NK cell activity is not sufficient to effectively activate NK cell activity, but the effect of each of the single factors is significantly changed compared to that of each of the single factors when each distinct factor is co-stimulated simultaneously or sequentially. It means that it can be induced or effectively activate the NK cell activity effectively.
  • “synergistic activity” or “synergy activation” of NK cells specifically stimulates two or more factors distinguished on NK cells, respectively, and combinations thereof, to stimulate stimulation for each of these factors and combinations thereof.
  • the degree of NK cell activity is at least 1.5 times, at least 2 times, or at least 3 times, it may be determined that synergistic activity is induced, and if it is more than 2 times, it may be determined that synergistic activity is induced.
  • the degree of synergistic activation is secreted by the degree of phosphorylation or expression of subfactors, degranulation activity, cytotoxic activity and NK cell stimulation using flow cytometry, immunoblotting, etc., as described herein.
  • the cytokines can be quantified based on the measurement, but are not limited thereto.
  • the step of comparing the synergistic activation of the NK cells compared to the normal NK cells specifically, two or more factors distinguished under the same conditions as the experimental group with normal NK cells as a control group, respectively Or when synergistic activation occurs in normal NK cells when stimulated with a specific combination, it is determined to be abnormal when the test group is markedly high, not present, or significantly less.
  • it is easy to artificially generate synergistic activation includes determining by comparing the data.
  • abnormal NK cell refers to NK cells that have or are derived from an individual with no disease, and the individual without the disease is at least physical, genetic, or exotic known to affect NK cell activity. There is no condition.
  • the method may further comprise the step of separating the NK cells required in the sample. If necessary, the step may be performed after stimulation while being present with other blood cells or lymphocytes, and the stimulating step may be performed after the step is performed to prepare a sample containing only NK cells as lymphocytes.
  • the degree of purification of the isolated NK cells and the composition of the sample may vary to the extent necessary for the experiment. NK cells can be used as it is purified from the sample as needed, and can be used after proliferation in order to secure conditions or cell mass suitable for the experiment.
  • the step of separating the NK cells may not be necessary. .
  • the stimulus may be made simultaneously or sequentially to the factor. Specifically, it may be stimulated by structurally binding to the factor or by modifying the factor. Such modifications may include post-translation modifications or cleavage such as, for example, phosphorylation, ubiquitination, sulfonylation, methylation, parylation or glycosylation.
  • the factor is selected from ITAM-containing signaling molecules (eg, CD16, NKp46, NKp30 or NKp44, etc.), NKG2D, 2B4 (CD244), DNAM-1 (CD226), CD2 and NKp80 It may be.
  • ITAM-containing signaling molecules eg, CD16, NKp46, NKp30 or NKp44, etc.
  • NKG2D, 2B4 CD244
  • DNAM-1 CD226)
  • CD2 and NKp80 It may be. According to Bryceson Y et al. (Blood 2006; 107: 159-166) and Kim HS et al.
  • NK cell synergy activation may be possible by various combinations of the factors listed above, combinations of these factors Examples may include, but are not limited to, 2B4 and DNAM-1, DNAM-1 and NKG2D, 2B4 and NKG2D, or 2B4, DNAM-1 and NKG2D.
  • said stimulating in said stimulating step is an antibody or fragment thereof specific for said two or more factors, or a fragment thereof, a target cell or polypeptide that elicits specific activity, a compound that specifically induces or inhibits, and It may be caused by one or more selected from reversible or irreversible agonists or antagonists.
  • Antibodies or fragments thereof specific for such factors include isotypes and may bind simultaneously to two or more distinct factors. Specifically, an example of simultaneous binding to two or more distinct factors may be P815 coated with CD244 / 2B4 or CD226 / DNAM-1.
  • the agent or antagonist may be a compound having structurally specific properties for a factor of interest, and may be a polypeptide having tertiary structural specificity.
  • the target cell that induces activity specific to said factor may be coated with one or more selected from antibodies, fragments and combinations thereof against two or more factors distinguished on NK cells. Two or more factors distinguished on said NK cells are as described above.
  • the antibody may be an antibody against the isotype of the factors, and the fragment may comprise only a specific portion of the antibody sufficient to effect activity as a fragment of the antibody. Coating can be carried out by preincubation with target cells, as described in the Examples below, or can be coated with the antibody, fragment or combination thereof using cross-linking techniques.
  • the step of measuring the degree of activation comprises the degree of phosphorylation or expression of subfactors of two or more factors distinguished on the NK cells, degranulation activity, cytotoxicity activity and NK cell stimulation. It may include one or more selected from the measurements of cytokines secreted by.
  • the term “subfactor” refers to an intracellular protein or polypeptide that is affected by increased expression or phosphorylation when a factor on the NK cell is stimulated, and particularly for phosphorylation, the subfactor is a substrate. Can be used as the same meaning (substrate).
  • the expression level of the subfactor may be determined by, for example, a well-known immunoblot using an antibody specific for Erk or pY174-Vav1, which is one of intracellular proteins involved in NK cell activation after lysis of stimulated NK cells. It can be measured using an immunoblot method.
  • the degranulation activity may mean, for example, inducing lysis of target cells with perforin or granzyme secretion, which can be analyzed using FACS. Specifically, after stimulating PBMC or purely isolated NK cells isolated from a sample, a method of measuring CD107a expression in proportion to degranulation can be measured using a fluorochrome-conjugated antibody.
  • the cytotoxic activity is determined by, for example, incubation with a culture comprising target cells capable of activating NK cells labeled with europium fluorescent dyes, and then the amount of fluorescent dyes released through target cell lysis. Measurements can be made using a microplate reader.
  • the cytokine may be selected from IFN- ⁇ , TNF- ⁇ , TNF- ⁇ , MIP-1 ⁇ , MIP-1 ⁇ , PANTES, IL-8 and IL-10.
  • the NK cell immunoactivator expression analysis may be performed using FACS, intracellular cytokine staining, or ELISA. Specifically, after staining the surface of NK cells with a specific fluorochrome-conjugated antibody, the cells are permeabilized and treated with another specific immunoactivator (eg, IFN- ⁇ ) with fluorochrome-conjugated antibodies. By staining the cytokines and the like can be used a method for measuring the expression of immune activator in NK cells.
  • the normal person showed a more than two-fold difference in synergistic activation based on the higher of the two factors in terms of cytokine secretion or cytotoxic degranulation.
  • synergistic activation there was a more than two-fold difference in the amount of synergistic activated cytokine secretion or the degree of cytotoxic degranulation.
  • comparing the level of synergistic activation of the NK cells with the normal NK cells is cytokine secreted by the degree of phosphorylation or expression of the subfactor, degranulation activity, cytotoxic activity and NK cell stimulation
  • the difference in the amount of secretion is more than two times, specifically two or more times based on the higher of the two factors can be determined that the activity of NK cells in the sample is normal.
  • the difference in the amount of synergistic activated cytokine secretion or cytotoxic degranulation of the NK cells is 2 times or less, specifically 2 based on the amount of synergistic activated cytokine secretion or cytotoxic degranulation of normal NK cells. If it is less than 2 times, it can be determined that the activity of NK cells in the sample is abnormal.
  • the method for testing the activity of NK cells of the present invention can be used to provide information on the diagnosis of a disease associated with the synergistic activity of NK cells.
  • the present inventors found that although NKH activation is induced in HLH patients and pancreatic cancer patients, the normal persons have a high degree of synergistic activation, whereas the patients fail or do not have a small degree of synergistic activity.
  • synergistic activation compared with simply inducing NK cell activation makes the comparison more meaningful and easier and more accurate in diagnosing HLH or pancreatic cancer. Therefore, the method for testing the activity of NK cells of the present invention may be useful for distinguishing samples showing abnormal NK cell synergistic activity, and providing information on diagnosis of a disease associated with synergistic activity of NK cells, including HLH and pancreatic cancer.
  • the disease associated with the synergistic activity of the NK cell is an abnormal synergistic activity of the NK cell, for example, irritable immune disease, autoimmune disease, immune rejection, immunodeficiency disease, histiocytosis, cancer, Type 2 diabetes, parasitic infectious diseases and viral diseases.
  • the irritable immune disease is at least one selected from asthma and sinusitis
  • the autoimmune disease is at least one selected from lupus, multiple sclerosis, type 1 diabetes and rheumatoid arthritis
  • the histiocytosis is HLH, XLP1 And may be one or more selected from XLP2.
  • Hematopoietic lymphocytocytosis is associated with group 2 Langerhans' cell histiocytosis, erythroid phagocytosis (family, sporadic), infectious hematopoietic syndrome, virus-associated hematopoietic syndrome, massive lymphadenopathy May include the meaning of histiocytosis, or reticulosis.
  • the term "cancer” includes a tumor, hematologic cancer, or solid cancer, and includes not impairing synergistic activity of an individual's NK cells or causing synergistic activity of NK cells as a target cell under certain conditions.
  • the cancer is lung cancer, liver cancer, esophageal cancer, gastric cancer, colon cancer, small intestine cancer, pancreatic cancer, melanoma, breast cancer, oral cancer, brain tumor, thyroid cancer, parathyroid cancer, kidney cancer, cervical cancer, sarcoma, prostate cancer, urethra It may be selected from the group consisting of cancer, bladder cancer, testicular cancer, hematologic cancer, lymphoma, skin cancer, psoriasis and fibroadenoma.
  • the cancer may be pancreatic cancer or B cell lymphoma.
  • the viral disease may be hepatitis B.
  • the immunodeficiency disease may be DiGeorge synderome or Chedial-Higashi syndrome.
  • the information on the disease associated with the activity of the NK cells can be determined to be abnormal NK cells when no synergistic activation of the experimental group NK cells compared to normal NK cells, or NK cells that lost synergistic activity to a specific receptor target It can be determined that the target cell is associated with a particular disease if it causes or does not cause abnormal synergistic activity against the cell.
  • the target cell may further comprise coating with one or more selected from antibodies, fragments and combinations thereof against two or more factors distinguished on the NK cells.
  • Another aspect is a stimulatory substance that produces synergistic activity of NK cells, the antibody or fragment thereof specific for two or more factors that are distinguished on the NK cell, or a target cell or polypeptide that causes specific activity, specifically It provides a composition for testing the activity of NK cells comprising a compound inducing activity, and at least one selected from a reversible or irreversible effector.
  • the factor on the NK cells can be selected from NKG2D, 2B4 (CD244), DNAM-1 (CD226), CD2, CD16, NKp30, NKp44, NKp46, and NKp80.
  • said composition is secreted by the degree of phosphorylation or expression of subfactors of said factor, degranulation activity, cytotoxic activity and NK cell stimulation. It may further comprise an antibody or fragment thereof for detecting one or more selected of the measured cytokines.
  • the agent for detecting the presence of synergistic activation of the NK cells is Perforin, Granzim, CD107a, CD107b, IFN- ⁇ , MIP-1 ⁇ , MIP-1 ⁇ , TNF- ⁇ , TNF- ⁇ , PANTES, One or more selected from antibodies, fragments or combinations thereof against one or more selected from IL-8 and IL-10.
  • the composition for testing the activity of the NK cells is a substance for visually displaying the detection result of the presence of synergistic activation of the NK cells, dye (dye), fluorescent dyes, secondary antibodies, or biological or molecular It may further include an enemy probe.
  • Another aspect is a stimulus substance that stimulates two or more factors distinguished on NK cells in a sample to cause synergistic activity of the NK cells, wherein the antibody or fragment thereof, specific for each or more than two factors, or a specific activity thereof One or more selected from target cells or polypeptides that cause proliferation, compounds that specifically induce activity, and reversible or irreversible agents; And it provides a kit for diagnosing a disease associated with the synergistic activity of NK cells comprising a substance for detecting the presence or absence of activation of the NK cells compared to normal NK cells.
  • the agent for detecting the presence of synergistic activation of the NK cells is Perforin, Granzim, CD107a, CD107b, IFN- ⁇ , MIP-1 ⁇ , MIP-1 ⁇ , TNF- ⁇ , TNF- ⁇ , PANTES, At least one selected from antibodies, fragments or combinations thereof against at least one selected from IL-8 and IL-10, or a fluorescent dye.
  • the antibody, fragment or combination thereof may be labeled or unlabeled with a fluorescent probe.
  • the fluorescent dye or fluorescent probe may vary depending on conditions such as an object to be detected, a combination or number of the objects, a desired wavelength, a detector, and the like, for example, peridinin chlorophyll (PerCP), phycoerythrin (phycoerythrin; PE), fluorescent isothiocyanate (FITC), or europium (europium), but is not limited thereto.
  • PerCP peridinin chlorophyll
  • PE phycoerythrin
  • FITC fluorescent isothiocyanate
  • europium europium
  • IFN- [gamma] and TNF- [alpha] are labeled with a fluorescent probe, FITC, so that the IFN- [gamma] and TNF- [alpha] can be directly detected by flow cytometry without secondary processing.
  • a fluorescent dye for example, P815
  • P815 fluorescent dye
  • the degree of synergy activation can be measured. Therefore, using a fluorescent dye as a substance for detecting the presence of synergistic activation of the NK cells may be particularly advantageous for measuring cytotoxicity.
  • the target cell that induces activity specific for a factor on the NK cell may be coated with one or more selected from antibodies, fragments, and combinations thereof against two or more factors distinguished on the NK cell.
  • the NK cell activity test kit is a material for visually displaying the detection result of the presence of synergistic activation of the NK cells, a dye, fluorescent dyes, secondary antibodies, or biological or molecular probes It may further include.
  • the disease associated with the synergistic activity of the NK cells may be selected from irritable immune diseases, autoimmune diseases, immune rejection, histiocytosis, cancer, type 2 diabetes, parasitic infection diseases and viral infection diseases.
  • kits such as those mentioned in the method for assaying the activity of the claimed NK cells or for the composition for testing the activity of NK cells, are understood as mentioned in the method or composition claimed above.
  • NK cells activity test method comprising the step of comparing the degree of synergistic activation of the NK cells compared to normal NK cells, it is possible to test the activity of NK cells in a simpler, faster and more significant than the known technology
  • diseases associated with the activity of NK cells can be readily diagnosed early and prognostic.
  • a stimulant that produces synergistic activity of NK cells according to another aspect, wherein the antibody or fragment thereof specific for two or more factors distinguished on the NK cells, or a target cell or polypeptide that induces specific activity, specific
  • a method for early diagnosis, prognostic determination, and the like of diseases related to the activity of NK cells using a composition for inducing activity, and a composition for testing the activity of NK cells comprising one or more selected from reversible or irreversible agonists.
  • Stimulus substance that stimulates two or more factors distinguished on NK cells in a sample according to another aspect, thereby causing synergistic activity of the NK cells, wherein the antibody or fragment thereof, specific for two or more factors, respectively One or more selected from target cells or polypeptides that induce activity, compositions that specifically induce activity, and reversible or irreversible agents;
  • a kit for diagnosing a disease related to synergistic activity of NK cells including a substance that detects the presence or absence of activation of the NK cells compared to normal NK cells, by activating NK cells in a simpler, faster, and more meaningful manner than the known technology. Early diagnosis or prognosis can be determined.
  • Figure 1 shows the results of flow cytometry analysis of the degree of phosphorylation of NF- ⁇ B p65 subunit when specifically stimulating the distinct factors NKG2D and / or 2B4.
  • Figure 2 shows the results of flow cytometry analysis of the frequency of cells expressing IFN- ⁇ or TNF- ⁇ when specifically stimulating the distinct factors NKG2D and / or 2B4.
  • Figure 3 confirms the synergistic activity of NK cells as cytotoxic when single or co-stimulated specific receptors.
  • NK cells 4 shows the expression level of factors related to NK cell activation when NK cells obtained from normal or XLP1 patient donors are stimulated with distinct factors NKG2D and / or 2B4.
  • FIG. 5 (A) When NK cells obtained from normal or XLP1 patient donors were stimulated with distinct factors NKG2D and / or 2B4, IFN- ⁇ expression was analyzed by flow cytometry. (B) The percentage of NK cells expressing IFN- [gamma] expressing IFN- [gamma] is shown when stimulation (IFN- [gamma] + NK cells) is applied to NK cells without stimulation ([Delta] IFN- [gamma] + cells).
  • FIG. 6 shows defective cytotoxic degranulation of XLP1 NK cells for coactivation
  • A expression of CD107a when NK cells obtained from normal or XLP1 donors are stimulated with distinct factors NKG2D and / or 2B4 The degree was analyzed by flow cytometry.
  • B The percentage of increase of CD107a + NK cells is shown when no stimulation is applied to NK cells ( ⁇ CD107a + cells) compared to stimulation (CD107a + NK cells).
  • Figure 7 shows the results of flow cytometry analysis of the degree of activity by the stimulation of the NKG2D / 2B4 combination in various blood cells.
  • Figure 8 shows the results of flow cytometry analysis of the degree of activity by stimulation of the NKG2D / 2B4 combination in NK cells.
  • Example 1 The distinct factor NKG2D And 2B4's Normal by joint activation NK Check for synergistic activity in cells
  • PBMCs Peripheral blood mononuclear cells
  • LSM lymphocyte separation medium
  • NK cell separation kit StemCell Technologies
  • Human NK cell host NKL (donated by M. Robertson) was cultured in RPMI1640 supplemented with 10% FBS, 1 mM sodium pyruvate, and 200 U / ml recombinant IL-2 (rIL-2).
  • NKL cells were resting in RPMI1640 supplemented with 5% FBS and 0.5 mM sodium pyruvate for 24 hours without rIL-2.
  • NK- ⁇ B is an important transcription factor as a regulator in the innate and acquired immune responses, resulting in increased NK cell activity upon phosphorylation of the NK- ⁇ B subunit p65 Ser536 residue (Front Immunol. 2014; 5: 662.) . Therefore, phosphorylation of NF- ⁇ B p65 subunits in primary resting NK cells was measured as NK cell activity factor.
  • NK cells Purified human primary NK or NKL cells were preincubated with mAbs specific for NKG2D and / or 2B4 or isotype control mAb (cIgG1) at NK receptor (all at 10 ⁇ g / ml) on ice for 30 minutes. After washing with medium, NK cells were stimulated by receptor crosslinking with goat anti-mouse F (ab ') 2 secondary Ab at 37 ° C for 5 minutes. Cells were washed with DPBS and fixed at 4% paraformaldehyde at 37 ° C. for 10 minutes. The immobilized cells were then permeabilized on ice for 30 minutes with 90% methanol and blocked for 10 minutes at room temperature with 0.5% BSA.
  • Cells were stained with Alexa Fluor 488-conjugated anti-pS536 p65 Ab (93H1) or isotype control rabbit IgG (DA1E) (Cell Signaling) and analyzed for flow analysis using a flow cytometry analyzer for p65 phosphorylation.
  • the percentage of cells that respond increases synergistically with NKG2D and 2B4 coupled stimulation of primary NK cells, while the response to receptor alone is significantly less than that of coactivation. Appeared.
  • NK Immune activator measurement as an indicator of synergistic activity of cells
  • NK cells When NK cells are activated, they secrete IFN- ⁇ or TNF- ⁇ , which are immune activators (or cytokines). Therefore, we tested whether the secretion of cytokines increased synergistically by the coactivation of specific factors.
  • NK cells were harvested as described above and PBMCs were stimulated with P815 cells (American Type Culture Collection) preincubated with mAbs specific for NKG2D and / or 2B4 or isotype control mAbs. It was then incubated for 6 hours and the cell surface markers stained with CD3 and CD56. Cytokine production by NK cells was measured as intracellular expression of IFN- ⁇ or TNF- ⁇ in CD3-CD56 + NK cells. Specifically, PBMCs or primary resting NK cells were stimulated at 37 ° C. for 1 hour with the same number of designated labeled cells. Brefeldin A (GolgiPlug; BD Bioscience) was then added and incubated for an additional 5 hours for a total of 6 hours.
  • P815 cells American Type Culture Collection
  • mAbs specific for NKG2D and / or 2B4 or isotype control mAbs It was then incubated for 6 hours and the cell surface markers stained with CD3 and CD56. Cytokin
  • the cells were then stained with surface markers with anti-CD56-PE and / or anti-CD3-PerCP mAbs for 30 minutes in the 4 ° C. dark. After washing cells twice with FACS buffer, they were incubated in BD Cytofix / Cytoperm solution (BD Bioscience) for 20 minutes at 4 ° C. in the dark. After intracellular staining with anti-IFN- ⁇ -FITC or anti-TNF- ⁇ -FITC mAb for 30 minutes in the dark at 4 ° C, cells were washed twice with BD Perm / Wash buffer (BD Bioscience). Cells were then gated against NK cells and analyzed by flow cytometry.
  • BD Cytofix / Cytoperm solution BD Bioscience
  • Example 2 By coactivation of distinct factors NK Cytotoxicity measurement as an indicator of synergistic activity of cells
  • P815 cells were preincubated with mAbs or isotype control mAbs specific for CD56, CD16 and NKG2D and / or 2B4, DNAM-1 and / or 2B4, and P815 coated with the NK cell specific receptor stimulating antibody was europium ) Labeled with fluorescent dye (dye). Then, as described above, the primary resting NK cells were stimulated by culturing with the P815 cells. Afterwards, the culture medium was recovered by centrifugation, and the amount of fluorescent dyes released through target cell lysis, which is an indicator of cytotoxicity, was measured. The degree of fluorescence in the culture was analyzed through a microplate reader.
  • CD16 induced exceptionally strong cytotoxicity, but when stimulated with NKG2D + 2B4 and DNAM-1 + 2B4, they induce synergistic cytotoxicity compared to the stimulated cases, respectively.
  • specific receptor stimulation for example, by the use of specific receptor stimulating antibodies as described above, thereby enabling synergistic measurements by specifically stimulating two distinct factors.
  • synergistic activity induced by simultaneous stimulation compared to the case of single stimulation may be easy to distinguish due to a significant difference in comparing NK activity.
  • Example 3 Normal and XLP1 Patient's NKG2D And 2B4's Comparison of NK Cell Activity Using Synergistic Differences in Specific Factor Expression by Coactivation
  • NK cells were donated from a patient of XLP1.
  • Hereditary SH2D1A as a Target for Congenital XLP1 Gene mutation patients were included.
  • NK cells of XLP1 patients were expanded as described above to study molecular signaling on NF- ⁇ B activation and effector function.
  • NK cells from normal donors were also proliferated and, after resting periods, stimulated with NKG2D and 2B4 to reproduce synergistic increases in effector function and signaling.
  • NK cells and NK cells in XLP1 patients were compared using Western blot. Specifically, primary resting NK cells after proliferation from normal or XLP1 patient donors were preincubated with mAbs or isotype control mAb (cIgG1) specific for the designated receptor. After crosslinking the receptors for 2 minutes (p-Akt and p-Erk1 / 2) and 5 minutes (pS536-p65 and pS276-p65), the lysates were immunoblotted with the specified phosphorylation. As a result, as shown in FIG.
  • diagnosing XLP1 synergistic activity caused by coactivating distinct factors of NK cells is observed because the difference is significantly observed when co-activating each distinct factor rather than measuring the activity of NK cells. It is shown that diagnosing XLP1 may be advantageous.
  • Example 4 Normal and XLP1 Patient's NKG2D And 2B4's By joint activation IFN using synergistic differences in the amount of - ⁇ expression NK Cell activity comparison
  • a test was performed to compare the expression level of IFN- ⁇ , one of the immune activators. Specifically, primary resting NK cells after propagation from normal or XLP1 patient donors were mixed with P815 cells preincubated with mAbs specific for the designated receptor. After incubation for 6 hours, staining with fluorochrome-conjugated mAb for CD56 and intracellular staining with IFN- ⁇ were analyzed by flow cytometry as described above.
  • Example 5 Normal and XLP1 Patient's NKG2D And 2B4's By joint activation In degranulation Using synergistic differences NK Cell activity comparison
  • XLP1 By measuring the expression level of CD107a on the surface of NK cells in proportion to degranulation, one of the indicators of NK cell activity, we examined whether XLP1 could be diagnosed by the synergistic effect caused by the stimulation of two distinct factors.
  • NK cells Degranulation of NK cells was assessed by CD107a expression and Granzyme B release (BioLegend) on the cell surface.
  • primary resting NK cells of normal and XLP1 patients were propagated as described above and then mixed with P815 preincubated with mAb specific for the designated receptor in the presence of fluorochrome-conjugated anti-CD107a mAb. . It was then incubated for 2 hours and cells analyzed using flow cytometer. Specifically, it was spun down at 30 ⁇ g for 3 minutes, incubated at 37 ° C. for 2 hours, and spun down again. Cell pellets were resuspended in FACS buffer (PBS with 2% FBS) and stained in the dark for 30 minutes at 4 ° C. with anti-CD56-PE. Lymphocytes were gated with forward scatter / side scatter and CD107a expression in NK cells was analyzed by flow cytometry and FlowJo software.
  • monocytes of normal persons were mixed with P815 cells expressing ligands specific for receptors designated (ULBP1 for NKG2D, and CD48 for 2B4) in the presence of fluorochrome-conjugated anti-CD107a mAb. Then, as in Example 5, each cell pellet was obtained and resuspended and stained in the dark for 30 minutes at 4 ° C. with anti-CD3-PerCP, anti-CD56-PE.
  • Lymphocytes were gated with forward scattering / lateral scattering and flow cytometry was performed for CD107a expression of NK cells (CD3-CD56 +), NKT cells (CD3 + CD56 +), T cells (CD3 + CD56-), and remaining cells (CD3-CD56-). And by FlowJo software.
  • pancreatic cancer samples were used to measure the expression level of CD107a on the surface of NK cells in proportion to degranulation, one of NK cell activity indicators. .
  • monocytes of normal and pancreatic cancer patients were treated with P815 cells expressing ligands specific for receptors designated (ULBP1 for NKG2D, and CD48 for 2B4) in the presence of fluorochrome-conjugated anti-CD107a mAb.
  • PBMCs monocytes
  • P815 cells expressing ligands specific for receptors designated (ULBP1 for NKG2D, and CD48 for 2B4)
  • fluorochrome-conjugated anti-CD107a mAb As a comparison group, K562, a blood cancer cell line utilized for measuring NK cell activity, was used.
  • each cell pellet was obtained and resuspended and stained in the dark for 30 minutes at 4 ° C. with anti-CD3-PerCP, anti-CD56-PE.
  • Lymphocytes were gated with forward scattering / lateral scattering and CD107a expression in NK cells (CD3-CD56 +) was analyzed by flow cytometry and FlowJo software.
  • NK cells were stimulated with the comparative group K562, there was no significant difference in induction of degranulation of NK cells in normal subjects and pancreatic cancer patients, unlike when specifically stimulated with NKG2D and 2B4. Therefore, it can be seen that synergistic activation by stimulation of specific factors on NK cells, such as the combined stimulation of NKG2D and 2B4, is more meaningful as a diagnostic method for NK cell activity than using K562.

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Abstract

본 발명은 시료 내의 NK 세포 상에 구별되는 두 개 이상의 인자를 특이적으로 자극하는 단계; 상기 NK 세포의 시너지 활성화 정도를 측정하는 단계; 및 정상 NK 세포 대비 상기 NK 세포의 시너지 활성화 정도를 비교하는 단계를 포함하는 NK 세포의 활성도 검사 방법 및 NK 세포의 활성도 검사용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 NK 세포의 시너지 활성과 관련된 질환의 진단용 키트에 관한 것이다.

Description

수용체 시너지 활성을 이용한 NK 세포의 활성도 검사 방법 및 이를 이용한 NK 세포의 활성도가 관련된 질환의 진단 방법
본 발명은 NK 세포의 수용체 시너지 활성을 이용한 NK 세포의 활성도를 검사하는 방법 및 이를 이용한 NK 세포의 활성과 관련된 질환을 진단하는 방법에 관한 것이다.
NK 세포(natural killer cell)는 선천적 면역 및 후천적(adaptive) 면역계에 중요한 세포독성 림프구의 한 종류이다. NK 세포는 바이러스 감염된 세포나 암세포에 반응하는데, 전형적으로 세포 표면에 MHC(major histocompatibility complex)의 이상 현상을 감지한다. 이러한 NK 세포는 퍼포린(perforin)을 분비해 감염 세포나 암세포의 세포막에 구멍을 내고, 여기에 그랜짐(granzyme)을 내어 이 세포들을 사멸시키는 세포독성을 갖는다. B 세포 림프종 및 많은 암환자의 경우 NK 세포의 수나 항암활성에 결함이 발견되고 있으며 NK 세포의 기능 이상은 이러한 암의 발생과 밀접한 관련을 가지고 있음이 알려져있다 (Annu. Rev. Immunol. 2013; 31:227-258).
NK 세포의 활성에는 다양한 활성화 및 저해성 수용체가 관여(engage)한다. 지배적이라 간주되는 수용체 중에는 면역 수용체 티로신-기반 활성 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif: ITAM)-관련 신호전달 분자 (예를 들어, FcR γ 사슬 또는 TCRζ 사슬)와 관련된 NKp46 및 신호전달 분자 DAP10와 관련된 수용체 NKG2D (EMBO J. 2004; 23:255.-9, Annu. Rev. Immunol. 2005; 23:225-74)에 관련한 것들이 있다. 공동자극성이라 간주되는 수용체로는, 2B4 (CD244)와 같은 신호전달 림프구 활성 분자 (signaling lymphocytic activation molecule: SLAM) 패밀리의 구성원들 뿐만아니라, DNAM-1 (CD226), CD2, 및 NKp80 (KLRF1 유전자 산물)과 같이 다양한 수용체를 포함한다.
ITAM-관련 분자는 NK 세포의 여러 다른 활성화 수용체에 의한 신호전달에 기여하는데, 자연 세포독성 수용체 (natural cytotoxicity receptor: NCR)가운데 NKp46 및 NKp30은 FcR γ 및/또는 TCR ζ과 관련되고, 반면에 NKp44는 신호 어댑터(adaptor) DAP12와 관련된다 (EMBO J. 2004; 23:255-9).
혈구탐식성 림프조직구증(Hemophagocytic lymphohistiocytosis: HLH)은 단구(monocyte) 또는 대식세포(macrophage)의 증식을 보이는 질환으로 조절되지 않는 혈구탐식과 염증성 시토킨(cytokine)의 과분비 현상을 보인다. 여기서 특히 면역결핍성 X-연관 림프증식증후군 1 (immunodeficiency X-linked lymphoproliferative disease 1: XLP1)은 HLH과 같은 증상을 보이는 질환으로, 엡스타인 바 바이러스(EBV: Epstein-Barr virus)에 감염되어 발병하거나, 선천적 XLP1의 경우 SAP 단백질을 만드는 SH2D1A의 돌연변이가 XLP1의 유전적 기반을 형성한다.(Annu. Rev. Immunol. 2007; 25:337-79, Annu. Rev. Immunol. 2011; 29:665-705).
2B4는 세포질적 말단(tail)에 ITSM 모티프를 함유하고 있고 소형 어답터 SAP 및 SAP-관련 티로신 키나제 Fyn의 모집을 통한 활성화 신호를 전달한다 (J. Exp . Med. 202, 181-192 (2005), Immunity 36, 974-985 (2012)). 2B4의 신호전달은 Vav1, p38 MAPK, Erk, 및 PLC-g2 활성화를 이끌어 낸다 (Nat. Immunol. 9, 495-502 (2008)). 주목할 점은, 기능적인 SAP 발현이 부족한 선천적 XLP1 환자로부터 얻은 NK 세포에서, 2B4가 활성하지 못하고, 대신 억제적 신호를 전달할 수 있다는 것이다 (Annu . Rev. Immunol. 25, 337-379 (2007)). 이러한 NK 세포 결함은 엡스타인 바 바이러스 (EBV)-감염된 B 세포의 살해 결함, IFN-g 생산 결함, 전격성 단핵증(fulminant mononucleosis) 및 B-세포 림프종과 같은 임상적인 XLP1의 징후에 기여하는 것으로 생각된다.
한편, 암환자의 NK 세포에서 항암수용체인 NKG2D (J. Immunol. 175, 5541-5550 (2005), Cancer Res. 69, 7775-7783 (2009), J. Immunol. 189, 1360-1371 (2012)), DNAM-1 (Immunol. Cell Biol. 90, 109-115 (2012))을 통한 NK 세포활성화에 결함이 관찰된 바 있다. 또한, B 형간염 바이러스 감염환자의 NK 세포에서도 NKG2D, 2B4의 발현과 기능이 감소되어있는 것으로 알려져 있다 (PloS Pathog. 8, e1002594 (2012)).
따라서, HLH 뿐 아니라, 암과 바이러스 감염질환에서도 NK 세포활성도 검사를 통해 상기 질환을 진단하고자 하나, NK 세포 활성도를 측정하는 기존의 기술은 방사성 동위원소, 또는 형광표지 탐침(probe)을 이용한 것으로서, 비용이나 시간면에서 임상적으로 적용하기에 부적합하므로, NK 세포의 활성도를 간편하고 신속하면서도 유의적으로 측정할 수 있는 방법이 다양한 면역 관련 질환의 조기 진단 및 예후 판단에 중요하게 인식되고 있다.
일 양상은 시료 내의 NK 세포 상에 구별되는 두 개 이상의 인자를 특이적으로 자극하는 단계; 상기 두 개 이상의 인자에 대한 자극으로 유발된, 상기 NK 세포의 시너지 활성화 정도를 측정하는 단계; 및 정상 NK 세포 대비 상기 NK 세포의 시너지 활성화 정도를 비교하는 단계를 포함하는 NK 세포의 활성도 검사 방법을 제공한다.
다른 양상은 NK 세포의 시너지한 활성을 일으키는 자극 물질로서, 상기 NK 세포 상에 구별되는 두 개 이상의 인자에 각각 또는 동시에 특이적인 항체 또는 그 단편, 특이적인 활성을 유발하는 표적 세포 또는 폴리펩티드, 특이적으로 활성을 유도하는 조성물, 및 가역적 또는 비가역적인 작용자 중 선택된 하나 이상을 포함하는 NK 세포의 활성도 검사용 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 시료 내의 NK 세포 상에 구별되는 두 개 이상의 인자를 자극하여 상기 NK 세포의 시너지한 활성을 일으키는 자극 물질로서, 두 개 이상의 인자에 각각 또는 동시에 특이적인 항체 또는 그 단편, 특이적인 활성을 유발하는 표적 세포 또는 폴리펩티드, 특이적으로 활성을 유도하는 조성물, 및 가역적 또는 비가역적인 작용자 중 선택된 하나 이상; 및 정상 NK 세포 대비 상기 NK 세포의 활성화 존재 여부를 검출하는 물질을 포함하는 NK 세포의 시너지 활성과 관련된 질환의 진단용 키트를 제공한다.
일 양상은 시료 내의 NK 세포 상에 구별되는 두 개 이상의 인자를 특이적으로 자극하는 단계; 상기 두 개 이상의 인자에 대한 자극으로 유발된, 상기 NK 세포의 시너지 활성화 정도를 측정하는 단계; 및 정상 NK 세포 대비 상기 NK 세포의 시너지 활성화 정도를 비교하는 단계를 포함하는 NK 세포의 활성도 검사 방법을 제공한다.
상기 시료는 개체, 예를 들면, 인간을 포함한 포유류 등으로부터 유래된 생물학적 시료일 수 있다. 또한, 상기 생물학적 시료는 개체로부터 분리된 것일 수 있으며, 혈액, 전혈, 혈청, 혈장, 림프액, 소변, 분변, 조직, 세포, 기관, 골수, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 그들의 조합일 수 있다. 또한 상기 생물학적 시료는 PBMC, 정제된 NK 세포 또는 일차성 휴지기의 세포(primary resting cell) (즉, 혈액에서 바로 분리한)를 포함하는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 시료는 혈액이다.
상기 용어 "구별"은 세포에서의 위치, 구조, 및 기능 등에서 동등하지 않은 모든 경우를 포함한다. 구체적으로, 자극 후 세포 내에서 유발하는 신호전달 과정을 상이하게 하거나, 세포 상의 위치 또는 인자 그 자체가 구조적으로 상이하여 자극 수단 또는 방법을 다르게 해야 하거나, 단일 자극된 경우 세포 내에서의 역할이 상이하거나 효과적으로 유효하게 활성을 일으키기에 부족한 것을 의미할 수 있다.
상기 용어 "인자"는 NK 세포의 시너지 활성화를 일으키는 모든 분자적 요소를 의미한다. 구체적으로, 상기 인자는 세포 내외의 수용체, 채널(channel), 및 특이적인 리간드와 결합할 수 있는 세포 내외의 어답터(adaptor), 단백질, 당단백질, 펩티드, 및 모티프를 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 인자는 수용체일 수 있다. 상기 용어 "수용체"는 특정 물질과 결합하여 NK 세포의 활성을 변화시키는 모든 분자를 말한다. 상기 특정 물질은 화학적 조성물, 체내 유래 또는 인공적인 특정 단백질, 펩티드, 콜레스테롤, 당단백질을 포함하며, 다른 면역 세포 또는 NK 세포 스스로에 의한 시토킨 또는 케모킨, 또는 표적 세포 또는 NK 세포 자체의 특정 수용체 또는 막단백질을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 인자는 세포 표면 또는 세포 내에 존재하는 것일 수 있다. 따라서, 예를 들어, 상기 인자가 수용체일 경우, NK 세포의 세포 표면에 위치하여 특정 물질과 결합하여 세포 내로 신호 전달하여 NK 세포의 활성을 일으키는 경우 뿐만아니라, 세포막을 통과하여 세포막 내면 또는 세포질에 존재하는 수용체로서 외부 특정 자극 물질과 결합하여 신호전달 작용을 일으킬 수 있는 모든 수용체를 포함한다.
상기 용어 "자극"은 인자에 작용하여 NK 세포 내외의 특정 신호전달을 일으키는 것을 의미한다. 상기 자극을 일으키는 방법은 상기 인자의 하나 이상에 대해 특이적인 항체, 그 단편, 또는 펩티드, 특이적으로 유도 또는 억제하는 조성물, 및 가역적 또는 비가역적인 작용자(agonist) 또는 길항제(antagonist)를 이용할 수도 있고, NK 세포를 자극 할 수 있는 다양한 표적세포 (예를 들어, K562, 721.221, 또는 특정 수용체자극 항체로 코팅된 P815)를 포함하는 배양물과 배양하는 것을 포함할 수 있다.
상기 용어 "시너지"는 단일 인자 각각의 효과는 NK 세포활성을 효과적으로 유효하게 활성화 시키기에 부족하나 구별되는 각 인자가 동시적 또는 순차적으로 공동자극된 경우, 단일 인자 각각 자극된 것 대비 현저하게 변화를 유발하거나, NK 세포 활성을 효과적으로 유효하게 활성화 시킬 수 있는 것을 의미한다. 따라서, NK 세포의 "시너지 활성" 또는 "시너지 활성화"는 NK 세포 상에 구별되는 두 개 이상의 인자를 각각 및 이들의 조합에 대해 특이적으로 자극하여, 상기 각 인자 및 이들의 조합에 대한 자극에 의한 상기 NK 세포의 활성을 측정하여, 상기 각 인자의 자극에 의한 NK 세포 활성 정도 대비 (바람직하게는, 상기 각 인자 중 더 많이 활성화된 NK 세포 활성 정도 대비)상기 각 인자의 조합의 자극에 의한 NK 세포 활성 정도가 1.5배 이상, 2배 이상, 또는 3 배 이상인 경우, 시너지 활성이 유발된 것으로 결정할 수 있고, 바람직하게는 2배 이상인 경우 시너지 활성이 유발된 것으로 결정할 수 있다. 상기 시너지 활성화 정도는 본 명세서에 기재된 바와 같이, 유동세포계측분석, 면역블롯(immunoblotting) 등을 이용하여, 하위인자의 인산화 또는 발현 정도, 탈과립화 활성, 세포독성 활성 및 NK 세포 자극에 의해 분비된 시토킨을 측정한 것을 기준으로 수치화할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 NK 세포의 활성도를 검사하는 방법에서, 정상 NK 세포 대비 상기 NK 세포의 시너지 활성화를 비교하는 단계는, 구체적으로 정상적인 NK 세포를 대조군으로 실험군과 동등한 조건에서 구별되는 두 개 이상의 인자를 각각 또는 특정 조합으로 자극하였을 때, 정상적인 NK 세포에서 나타나는 시너지한 활성화 현상이 실험군에서 현저하게 높거나, 나타나지 않거나 그 정도가 현저하게 적은 경우 비정상으로 판단하는 것을 포함한다. 또한 단일 인자를 자극한 경우에 비해 공동 자극한 경우 비교가 용이하여 인위적으로 시너지 활성화를 유발하여 그 데이터를 비교함으로써 판단하는 것을 포함한다. 상기 단계에 의하여 비정상적인 NK 세포와 관련한 질환의 병리학적 징후, 바이러스 감염, 암 세포의 존재, 및 특정 암을 판단하고 상기 질병들에 대해 예후 예측 할 수 있다. 상기 "정상 NK 세포"는 질병을 갖지 않는 개체가 갖는 또는 그러한 개체로부터 유래된 NK 세포를 말하며, 상기 질병을 갖지 않는 개체는 적어도 NK 세포 활성에 영향을 미치는 것이라 알려진 신체적, 유전적, 또는 외래적 조건을 갖지 않는다.
일 구체예에서, 상기 방법은 상기 시료 중 필요로 하는 NK 세포를 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 필요에 따라 다른 혈구 또는 림프구와 함께 존재하는 중에 자극 후 상기 단계가 이루어질 수 있고, 림프구로서 NK 세포만을 포함하는 시료로 하기 위해 상기 단계가 이루어진 후 상기 자극하는 단계가 이루어질 수 있다. 분리된 NK 세포의 정제도 및 그 시료의 구성은 실험에 필요한 정도로 다양할 수 있다. NK 세포는 필요에 따라 시료에서 정제된 그대로를 사용할 수 있고, 실험에 적합한 조건 또는 세포량을 확보하기 위하여 증식시킨 후 사용할 수 있다.
그러나, 특정 인자의 조합의 경우 NK 세포에 특이적이므로 (실시예 6), 본 발명의 방법에서 상기 NK 세포에 특이적인 인자의 조합을 이용하는 경우, 상기 NK 세포를 분리하는 단계는 필수적이지 않을 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 자극은 상기 인자에 동시에 또는 순차적으로 이루어지는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 인자에 구조적으로 결합하거나, 상기 인자를 개조(modify)하여 자극할 수 있다. 상기 개조는 예를 들어 인산화, 유비퀴틴화, 설포닐화, 메틸레이션(methylation), 파릴레이션(parylation) 또는 당화(glycosylation)와 같은 번역후 개조(post-translation modification) 또는 절단을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 인자는 ITAM-함유하는 신호전달 분자(예를 들어, CD16, NKp46, NKp30 또는 NKp44 등), NKG2D, 2B4 (CD244), DNAM-1 (CD226), CD2 및 NKp80 중 선택된 것일 수 있다. Bryceson Y 등(Blood 2006;107:159-166) 및 Kim HS 등(Immunity 2010;32:175-186)에 의하면 NK 세포 시너지 활성화는 상기 나열된 인자들의 다양한 조합에 의해 가능할 수 있으며, 상기 인자의 조합의 예로는 2B4 및 DNAM-1, DNAM-1 및 NKG2D, 2B4 및 NKG2D, 또는 2B4, DNAM-1 및 NKG2D가 있을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구체예에서, 상기 자극하는 단계에서 상기 자극은 상기 두 개 이상의 인자에 각각 또는 동시에 특이적인 항체 또는 그 단편, 특이적인 활성을 유발하는 표적 세포 또는 폴리펩티드, 특이적으로 유도 또는 억제하는 화합물, 및 가역적 또는 비가역적인 작용자(agonist) 또는 길항제(antagonist) 중 선택된 하나 이상에 의해서 유발될 수 있다. 상기 인자에 특이적인 항체 또는 그 단편은 이소형을 포함하며, 구별되는 두 개 이상의 인자에 동시에 결합할 수도 있다. 구체적으로, 상기 구별되는 두 개 이상의 인자에 동시 결합하는 예로 CD244/2B4 또는 CD226/DNAM-1으로 코팅된 P815이 있을 수 있다. 상기 작용자 또는 길항제는 대상 인자에 대해 구조적으로 특이적인 성질을 갖는 화합물일 수 있고, 3차 구조적으로 특이성을 가지는 폴리펩티드일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 인자에 특이적인 활성을 유발하는 표적 세포는 NK 세포 상에 구별되는 두 개 이상의 인자에 대한 항체, 단편 및 이들의 조합 중 선택된 하나 이상의 것으로 코팅된 것일 수 있다. 상기 NK 세포 상에 구별되는 두 개 이상의 인자는 상기 서술한 바와 같다. 항체는 상기 인자들의 이소형에 대한 항체일 수 있으며, 단편은 항체의 단편으로서 활성을 일으키기에 충분한 상기 항체의 특정 부분만을 포함할 수 있다. 코팅은 하기 실시예에서 서술하는 바와 같이, 표적 세포와의 프리인큐베이션으로 수행할 수 있고, 또는 가교(cross-linking) 기법을 이용해서 상기 항체, 단편 또는 그 조합으로 코팅할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 활성화 정도를 측정하는 단계는 상기 NK 세포 상에 구별되는 두 개 이상의 인자의 하위인자의 인산화 또는 발현 정도, 탈과립화(degranulation) 활성, 세포독성(cytotoxicity) 활성 및 NK 세포 자극에 의해 분비된 시토킨의 측정 중 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. 용어 "하위인자"는 상기 NK 세포 상의 인자가 자극되는 경우 영향을 받아 발현이 증가되거나, 인산화되는 세포 내 단백질 또는 변화되는 폴리펩티드 등을 의미하는 것으로서, 특히 인산화 반응에 대한 경우, 상기 하위인자는 기질(substrate)과 동일한 의미로 사용될 수 있다.
상기 하위인자의 발현 정도는 예를 들어, 자극된 NK 세포를 용해시킨 후, NK 세포 활성화에 관여하는 세포 내 단백질 중 하나인 Erk 또는 pY174-Vav1에 특이적인 항체를 이용하는 종래의 잘 알려진 면역블롯(immunoblot) 방식을 이용하여 측정할 수 있다.
상기 탈과립화 활성은 예를 들어, 퍼포린(perforin) 또는 그란짐(granzyme) 분비로 표적 세포의 용해를 유도하는 것을 의미할 수 있고, 이를 FACS를 이용해 분석할 수 있다. 구체적으로, 시료에서 분리한 PBMC 혹은 순수 분리된 NK 세포를 자극한 후, 탈과립화와 비례하는 CD107a 발현을 플루오로크롬-접합된 항체를 이용하여 측정하는 방법을 이용할 수 있다.
상기 세포독성 활성은 예를 들어, 유로피움(europium) 형광 염료로 표지된 NK 세포를 활성화시킬 수 있는 표적 세포를 포함하는 배양물과 배양한 후, 표적 세포 용해를 통해 배출된 형광 염료의 양을 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 측정할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 시토킨은 IFN-γ, TNF-α, TNF- β, MIP-1α, MIP-1β, PANTES, IL-8 및 IL-10 중 선택되는 것일 수 있다. 상기와 같은 NK 세포의 면역활성인자 발현 분석은 FACS, 세포 내 시토킨 염색 또는 ELISA 등을 이용하여 이루어질 수 있다. 구체적으로 플루오로크롬-접합된 특정 항체를 이용하여 NK 세포 표면을 염색한 후 세포를 투과성화(permeabilization)하고 플로오로크롬-접합된 다른 특정 면역활성인자(예를 들어, IFN-γ) 항체로 상기 시토킨 등을 염색하여 NK 세포 내의 면역활성인자의 발현을 측정하는 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 시토킨 분비량 또는 세포독성 탈과립화 정도에서 환자에 비해 정상인은 두 개의 인자 중 더 높게 나온 것을 기준으로 시너지 활성화를 유발한 경우 2배 이상의 차이를 보였으며, NK 세포의 시너지 활성화를 유발한 후 비교하였을 때도, 시너지 활성화된 시토킨 분비량 또는 세포독성 탈과립화 정도의 차이에서 2배 이상의 차이를 보였다.
따라서, 일 구체예에서, 상기 정상 NK 세포 대비 상기 NK 세포의 시너지 활성화 정도를 비교하는 단계는 상기 하위인자의 인산화 또는 발현 정도, 탈과립화 활성, 세포독성 활성 및 NK 세포 자극에 의해 분비된 시토킨 분비량 정도의 차이가 2배 이상, 구체적으로는 두 개의 인자 중 더 높게 나온 것을 기준으로 2 배 이상인 경우 상기 시료 중에 NK 세포의 활성이 정상인 것으로 판단할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 NK 세포의 시너지 활성화된 시토킨 분비량 또는 세포독성 탈과립화 정도의 차이가 2배 이하, 구체적으로 정상 NK 세포의 시너지 활성화된 시토킨 분비량 또는 세포독성 탈과립화 정도를 기준으로 2배 이하인 경우, 상기 시료 중에 NK 세포의 활성이 비정상인 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 NK 세포의 활성도 검사 방법은 NK 세포의 시너지 활성과 관련된 질환의 진단에 대한 정보를 제공하는데 이용될 수 있다.
본 발명자들은 HLH 환자 및 췌장암 환자에서 NK 세포의 활성화는 유발되기는 하나, 정상인은 시너지 활성화 정도가 큰 반면, 상기 환자들은 시너지 활성에서 실패하거나 그 정도가 현저히 적음을 발견하였다. 특히 시너지 활성화를 유발시켜 비교하는 경우, 단순히 NK 세포 활성화를 유발하여 비교하는 것보다 시너지 활성화를 유발시켜 비교하는 것이 HLH 또는 췌장암을 진단하기에 유의성을 높이고, 더 쉽고 정확함을 발견하였다. 따라서, 본 발명의 NK 세포의 활성도 검사 방법은 비정상적인 NK 세포 시너지 활성을 보이는 시료를 구별하여, HLH 및 췌장암을 포함한 NK 세포의 시너지 활성과 관련된 질환의 진단에 대한 정보를 제공하는데 유용할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 NK 세포의 시너지 활성과 관련된 질환은 비정상적인 NK 세포의 시너지 활성도를 보이는 것으로서, 예를 들어, 과민성 면역질환, 자가면역질환, 면역거부반응, 면역결핍질환, 조직구증, 암, 2형 당뇨병, 기생충 감염 질환 및 바이러스 질환일 수 있다. 상기 과민성 면역질환은 천식 및 축농증 중 선택된 하나 이상의 것이거나, 상기 자가면역질환은 루푸스, 다발성 경화증(multiple sclerosis), 1형 당뇨병 및 류마티스 관절염 중 선택된 하나 이상의 것이거나, 또는 상기 조직구증은 HLH, XLP1, 및 XLP2에서 선택된 어느 하나 이상의 것일 수 있다. 혈구탐식성 림프조직구증(HLH)은 제 2군 랑게르한스 세포 조직구증, 적혈구탐식성 림프조직구증식증 (가족성, 산발성), 감염연관성 혈구탐식증후군, 바이러스 연관성 혈구탐식증후군, 거대한 림프절병증을 동반한 조직구증, 또는 망상조직구증의 의미를 포함할 수 있다. 상기 "암"은 종양, 혈액암 또는 고형암을 포함하는 의미으로서, 개체의 NK 세포의 시너지 활성을 손상시키거나 또는 특정 조건에서 표적 세포로서 NK 세포의 시너지 활성을 일으키지 않는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 암은 폐암, 간암, 식도암, 위암, 대장암, 소장암, 췌장암, 흑색종, 유방암, 구강암, 뇌종양, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 자궁경부암, 육종, 전립선암, 요도암, 방광암, 고환암, 혈액암, 림프종, 피부암, 건선 및 섬유선종으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 암은 췌장암 또는 B 세포 림프종(B cell lymphoma)일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 바이러스 질환은 B형 간염일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 면역결핍질환은 디조지증후군(DiGeorge synderome) 또는 체디악히가시증후군(Chedial-Higashi syndrome)일 수 있다.
상기 NK 세포의 활성과 관련된 질환에 대한 정보는, 정상 NK 세포 대비 실험군 NK 세포의 시너지 활성화가 검출되지 않는 경우 비정상적인 NK 세포로 판단할 수 있고, 또는 특정 수용체에 대해 시너지 활성을 상실한 NK 세포가 표적 세포에 대해 비정상적으로 시너지 활성을 일으키거나 일으키지 않는 경우 상기 표적 세포가 특정한 질병과 관련이 있음을 판단할 수 있다. 상기 특정한 질병의 판단을 보다 용이하게 하기 위해서 상기 표적 세포는 NK 세포 상에 구별되는 두 개 이상의 인자에 대한 항체, 단편 및 이들의 조합 중 선택된 하나 이상의 것으로 코팅하는 단계를 더 포함할 수 있다.
다른 양상은 NK 세포의 시너지한 활성을 일으키는 자극 물질로서, 상기 NK 세포 상에 구별되는 두 개 이상의 인자에 각각 또는 동시에 특이적인 항체 또는 그 단편, 특이적인 활성을 유발하는 표적 세포 또는 폴리펩티드, 특이적으로 활성을 유도하는 화합물, 및 가역적 또는 비가역적인 작용자 중 선택된 하나 이상을 포함하는 NK 세포의 활성도 검사용 조성물을 제공한다.
일 구체예에서, 상기 NK 세포 상에 인자는 NKG2D, 2B4 (CD244), DNAM-1 (CD226), CD2, CD16, NKp30, NKp44, NKp46, 및 NKp80 중 선택된 것일 수 있다.
일 구체예에서, 정상 NK 세포 대비 상기 NK 세포의 시너지 활성화 존재 여부를 검출하기 위하여, 상기 조성물은 상기 인자의 하위인자의 인산화 또는 발현 정도, 탈과립화 활성, 세포독성 활성 및 NK 세포 자극에 의해 분비된 시토킨의 측정 중 선택된 하나 이상을 검출하기 위한 항체 또는 그 단편을 더 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 NK 세포의 시너지 활성화 존재 여부를 검출하는 물질은 퍼포린, 그란짐, CD107a, CD107b, IFN-γ, MIP-1α, MIP-1β, TNF-α, TNF-β, PANTES, IL-8 및 IL-10 중 선택된 하나 이상에 대한 항체, 단편 또는 이들의 조합 중 선택된 하나 이상의 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 NK 세포의 활성도 검사용 조성물은 상기 NK 세포의 시너지 활성화 존재 여부의 검출 결과를 시각적으로 표시하기 위한 물질로서, 염료(dye), 형광 염료, 2차 항체, 또는 생물학적 또는 분자적 탐침(probe)을 더 포함할 수 있다.
상기 조성물에서 언급된 용어 또는 요소 중 청구된 NK 세포의 활성도 검사 방법에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 청구된 NK 세포의 활성도 검사 방법에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.
또 다른 양상은 시료 내의 NK 세포 상에 구별되는 두 개 이상의 인자를 자극하여 상기 NK 세포의 시너지한 활성을 일으키는 자극 물질로서, 두 개 이상의 인자에 각각 또는 동시에 특이적인 항체 또는 그 단편, 특이적인 활성을 유발하는 표적 세포 또는 폴리펩티드, 특이적으로 활성을 유도하는 화합물, 및 가역적 또는 비가역적인 작용자 중 선택된 하나 이상; 및 정상 NK 세포 대비 상기 NK 세포의 활성화 존재 여부를 검출하는 물질을 포함하는 NK 세포의 시너지 활성과 관련된 질환의 진단용 키트를 제공한다.
일 구체예에서, 상기 NK 세포의 시너지 활성화 존재 여부를 검출하는 물질은 퍼포린, 그란짐, CD107a, CD107b, IFN-γ, MIP-1α, MIP-1β, TNF-α, TNF-β, PANTES, IL-8 및 IL-10 중 선택된 하나 이상에 대한 항체, 단편 또는 이들의 조합 중 선택된 하나 이상이거나 또는 형광 염료(dye)일 수 있다. 상기 항체, 단편 또는 이들의 조합은 형광 프로브(probe)로 표지되거나 표지되지 않은 것일 수 있다. 상기 형광 염료 또는 형광 프로브는 검출하고자 하는 대상, 상기 대상의 조합 또는 개수, 원하는 파장, 검출기 등의 조건에 따라 다양할 수 있고, 예를 들어, 페리디닌 클로로필(peridinin chlorophyll; PerCP), 피코에리트린(phycoerythrin; PE), 형광 이소티오시아네이트 (fluorescein isothiocyanate; FITC), 또는 유로피움(europium)일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 실시예에 따르면, IFN-γ 및 TNF-α에 형광 프로브인 FITC로 표지함으로써 2차적 처리 없이, 유동세포계측기로 상기 IFN-γ 및 TNF-α를 직접 검출할 수 있다. 또한, 본 발명의 실시예에 따르면, 형광 염료로 염색한 표적 세포(예를 들어, P815)에 대한 NK 세포의 활성화에 의해, 상기 표적 세포가 용해되어 배출되는 형광 염료를 측정함으로써, NK 세포의 시너지 활성화 정도를 측정할 수 있다. 따라서, 상기 NK 세포의 시너지 활성화 존재 여부를 검출하는 물질로 형광 염료를 사용하는 것은, 세포 독성을 측정하는데 특히 유리할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 NK 세포 상의 인자에 특이적인 활성을 유발하는 표적 세포는 NK 세포 상에 구별되는 두 개 이상의 인자에 대한 항체, 단편 및 이들의 조합 중 선택된 하나 이상의 것으로 코팅된 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 NK 세포의 활성도 검사용 키트는 상기 NK 세포의 시너지 활성화 존재 여부의 검출 결과를 시각적으로 표시하기 위한 물질로서, 염료, 형광 염료, 2차 항체, 또는 생물학적 또는 분자적 탐침을 더 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 NK 세포의 시너지 활성과 관련된 질환은 과민성 면역질환, 자가면역질환, 면역거부반응, 조직구증, 암, 2형 당뇨병, 기생충 감염 질환 및 바이러스 감염 질환 중 선택된 것일 수 있다.
상기 키트에서 언급된 용어 또는 요소 중 청구된 NK 세포의 활성도 검사 방법 또는 NK 세포의 활성도 검사용 조성물에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 상기 청구된 방법 또는 조성물에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.
일 양상에 따른 시료 내의 NK 세포 상에 구별되는 두 개 이상의 인자를 특이적으로 자극하는 단계; 상기 NK 세포의 시너지 활성화 정도를 측정하는 단계; 및 정상 NK 세포 대비 상기 NK 세포의 시너지 활성화 정도를 비교하는 단계를 포함하는 NK 세포의 활성도 검사 방법을 이용하여, 기존에 알려진 기술보다 간편하고 신속하면서도, 유의성 있게 NK 세포의 활성도를 검사할 수 있어, NK 세포의 활성과 관련된 질환을 용이하게 조기 진단 및 예후 판단할 수 있다.
다른 양상에 따른 NK 세포의 시너지한 활성을 일으키는 자극 물질로서, 상기 NK 세포 상에 구별되는 두 개 이상의 인자에 각각 또는 동시에 특이적인 항체 또는 그 단편, 특이적인 활성을 유발하는 표적 세포 또는 폴리펩티드, 특이적으로 활성을 유도하는 조성물, 및 가역적 또는 비가역적인 작용자 중 선택된 하나 이상을 포함하는 NK 세포의 활성도 검사용 조성물을 이용하여, NK 세포의 활성과 관련된 질환의 조기 진단, 예후 판단 등을 위한 방법을 용이하게 수행할 수 있고, 키트를 용이하게 제조 또는 이용할 수 있다.
또 다른 양상에 따른 시료 내의 NK 세포 상에 구별되는 두 개 이상의 인자를 자극하여 상기 NK 세포의 시너지한 활성을 일으키는 자극 물질로서, 두 개 이상의 인자에 각각 또는 동시에 특이적인 항체 또는 그 단편, 특이적인 활성을 유발하는 표적 세포 또는 폴리펩티드, 특이적으로 활성을 유도하는 조성물, 및 가역적 또는 비가역적인 작용자 중 선택된 하나 이상; 및 정상 NK 세포 대비 상기 NK 세포의 활성화 존재 여부를 검출하는 물질을 포함하는 NK 세포의 시너지 활성과 관련된 질환의 진단용 키트를 이용하여, 기존에 알려진 기술보다 간편하고 신속하면서도, 유의성 있게 NK 세포의 활성과 관련된 질환을 조기 진단 또는 예후 판단할 수 있다.
도 1은 구별되는 인자 NKG2D 및/또는 2B4를 특이적으로 자극한 경우 NF-κB p65 서브유닛의 인산화 정도에 대한 유동세포계측 분석 결과를 나타낸다.
도 2는 구별되는 인자 NKG2D 및/또는 2B4를 특이적으로 자극한 경우 IFN-γ 또는 TNF-α를 발현시키는 세포의 빈도에 대한 유동세포계측 분석 결과를 나타낸다.
도 3은 특정 수용체를 단일 또는 공동자극한 경우 NK 세포의 시너지한 활성을 세포독성으로서 확인한 것이다.
도 4는 정상 또는 XLP1 환자 공여자로부터 획득한 NK 세포를 구별되는 인자 NKG2D 및/또는 2B4로 자극한 경우, NK 세포 활성화와 관련된 인자의 발현 정도를 보여준다.
도 5은 (A) 정상 또는 XLP1 환자 공여자로부터 획득한 NK 세포를 구별되는 인자 NKG2D 및/또는 2B4로 자극한 경우, IFN-γ 발현 정도를 유동세포계측기에 의해 분석한 것이다. (B) NK 세포에 자극을 가하지 않은 경우 (ΔIFN-γ+ 세포) 대비 자극을 가한 경우(IFN-γ+ NK 세포) IFN-γ를 발현하는 NK 세포 증가 백분율을 나타낸다.
도 6은 공동활성화에 대한 XLP1 NK 세포의 결함적 세포독성 탈과립화를 나타내는 것으로, (A) 정상 또는 XLP1 공여자로부터 획득한 NK 세포를 구별되는 인자 NKG2D 및/또는 2B4로 자극한 경우, CD107a의 발현 정도를 유동세포계측기에 의해서 분석한 것이다. (B) NK 세포에 자극을 가하지 않은 경우(ΔCD107a+ 세포) 대비자극을 가한 경우 (CD107a+ NK 세포) CD107a+ NK 세포의 증가 백분율을 나타낸다.
도 7은 다양한 혈구 세포에서 NKG2D/2B4 조합의 자극에 의한 활성 정도에 대한 유동세포계측 분석 결과를 나타낸다.
도 8은 NK 세포에서 NKG2D/2B4 조합의 자극에 의한 활성 정도에 대한 유동세포계측 분석 결과를 나타낸다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 구별되는 인자인 NKG2D 및 2B4의 공동활성화에 의한 정상 NK 세포에서의 시너지한 활성도 존재 여부 확인
1-1. NK 세포의 획득
아산 메디컬 센터, UCL Istitute of Child Health, 및 필라델피아 소아 병원의 기관 심의 위원회에 의해 승인받은 프로토콜 하에 고지에 입각하여 건강한 공여자 및 XLP1 공여자로부터 인간 혈액 시료를 연구를 목적으로 혈액을 채취하였다. 밀도 구배 원심분리기 (림프구 분리 배지(lymphocyte separation medium: LSM) (MP Biomedicals)를 이용)에 의해 말초혈액 단핵세포 (Peripheral blood mononuclear cells: PBMCs)를 혈액 시료로부터 분리하고 이 과정을 진행하는 동안 저온 보존(cryopreserved)하였다. 인간 NK 세포를 종래에 알려진 바와 같이(Sci. Signal. 5, ra49 (2012)), NK 세포 분리 키트 (StemCell Technologies)를 이용하여 음성선택(negative selection)에 의해 PBMC로부터 정제하였다. 이들 세포는 유동세포계측법에 의해 평가된 바에 따라, 97 내지 99%의 CD3-CD56+였다. 인간 NK 세포 주인 NKL (M.Robertson의 기증)을 10% FBS, 1 mM 소디움 피루베이트, 및 200 U/ml 재조합 IL-2 (rIL-2)로 보충된 RPMI1640에서 배양하였다. NKL 세포를 rIL-2 없이, 24시간 동안 5% FBS 및 0.5 mM 소디움 피루베이트로 보충된 RPMI1640에서 휴지시켰다.
1-2. NKG2D 및 2B4의 공동활성화에 의한 NK 세포의 시너지한 활성의 지표로서 NF-κB p65 서브유닛의 인산화
NK-κB는 선천적 및 후천적 면역 반응에서 조절자로서 중요한 전사 인자로서, NK-κB 서브유닛 p65 Ser536 잔기의 인산화가 되는 경우 NK 세포의 활성이 증가하게 된다(Front Immunol. 2014; 5: 662.). 따라서, NK 세포의 활성도 인자로 일차 휴지기의 NK 세포 중에 NF-κB p65 서브유닛의 인산화를 측정하였다.
NK 세포의 활성화를 일으키는 특정 인자를 자극하기 위하여 하기의 수용체 가교를 실시하였다.
정제된 인간 일차 NK 또는 NKL 세포를 30분 동안 얼음에서 NK 수용체 (모두 10 ㎍/ml에서)에 NKG2D 및/또는 2B4에 특이적인 mAb 또는 이소형 대조군 mAb (cIgG1)와 프리인큐베이션(preincubation) 하였다. 배지로 세척한 후, NK 세포를 5분간 37℃에서 염소 항-마우스 F(ab')2 이차 Ab로 수용체 가교함으로써 자극하였다. 세포를 DPBS로 세척하고 4% 파라포름알데히드로 37℃에서 10 분간 고정시켰다. 그런 다음 고정된 세포를 90% 메탄올로 30분간 얼음에서 투과성화(permeabilize)하고 0.5% BSA로 실온에서 10분간 블로킹하였다. 세포를 Alexa Fluor 488-접합된 항-pS536 p65 Ab (93H1) 또는 이소형 대조군 토끼 IgG (DA1E) (Cell Signaling)로 염색한 후, p65 인산화에 대해 유동세포계측 분석기를 이용하여 분석하였다.
그 결과, 도 1에서 보여지는 바와 같이 반응하는 세포의 비율이 일차성 NK 세포의 NKG2D 및 2B4로 결합된 자극에 따라 시너지하게 증가하는 반면, 수용체 단독에 대한 반응은 공동활성화 된 경우보다 현저하게 적은 것으로 나타났다.
1-3. NKG2D 및 2B4의 공동활성화에 의한 NK 세포의 시너지한 활성의 지표로서 면역활성인자 측정
NK 세포가 활성화되는 경우 면역활성인자(또는 시토킨)인 IFN-γ 또는 TNF-α 등을 분비한다. 따라서, 구별되는 특정 인자의 공동활성화에 의해서 시토킨의 분비량이 시너지하게 증가하는지 여부를 테스트 하였다.
상기 서술한 바와 같이 NK 세포를 채취하였고, NKG2D 및/또는 2B4에 특이적인 mAb 또는 이소형 대조군 mAb로 프리인큐베이션한 P815 세포(American Type Culture Collection)로 PBMC를 자극하였다. 그 후 6시간 인큐베이션하고, 세포 표면 마커를 CD3 및 CD56로 염색하였다. NK 세포에 의한 시토킨 생산을 CD3-CD56+ NK 세포 중에 IFN-γ 또는 TNF-α의 세포 내 발현을 유동세포계측기로서 측정하였다. 구체적으로는, PBMC 또는 일차 휴지기의 NK 세포를 동일한 수의 지정된 표지 세포로 1시간 동안 37℃에서 자극하였다. 그런 다음, 브레펠딘 A(brefeldin A) (GolgiPlug; BD Bioscience)을 첨가하고, 총 6시간에 대한 추가적인 5시간의 인큐베이션을 하였다. 그런 다음 세포를 4℃ 암실에서 30분간 항-CD56-PE 및/또는 항-CD3-PerCP mAbs로 표면 마커를 염색하였다. FACS 완충액으로 두 번 세포를 세척한 후, 이들을 BD Cytofix/Cytoperm 용액 (BD Bioscience)에 20 분간 암실 4℃에서 인큐베이션하였다. 4℃ 암실에서 30분간 항-IFN-γ-FITC 또는 항-TNF-α-FITC mAb로 세포 내 염색한 전후, 세포를 BD Perm/Wash 완충액 (BD Bioscience)으로 두 번 세척하였다. 그런 다음 세포를 NK 세포에 대해 게이팅하여 유동세포계측기에 의해서 분석하였다.
그 결과, 도 2에서 보여지는 바와 같이 NKG2D 및 2B4의 공동관여(coengagement)는 면역활성인자인 IFN-γ 또는 TNF-α를 발현하는 NK 세포의 비율에서 시너지한 증가를 유발하는 것을 볼 수 있었다.
이를 모두 종합하면, 이러한 결과는 NKG2D 및 2B4 각각의 단일한 자극으로는 NF-κB 활성화를 NK 세포 활성에 유효하게 자극하는데에 있어 충분하지 않으며, NKG2D 및 2B4 공동활성화를 가한 경우 NF-κB 활성화에 대한 임계점(threshold)을 극복하여, NK 세포에 의한 시너지한 시토킨 생성을 유발한다는 것을 보여준다.
각 그래프는 3회 이상의 독립적인 실험에 의해서 제작되었다. 결과는 평균 ± SD로서 나타내었다. 통계적 분석을 GraphPad Prism software을 이용하여 양측 스투덴트 t-검정 (two-tailed student's t-test)에 의해서 수행되었다.
실시예2 . 구별되는 인자들의 공동활성화에 의한 NK 세포의 시너지한 활성의 지표로서 세포독성 측정
상기 NKG2D 및 2B4의 공동활성화에 의해 면역활성인자인 IFN-γ 또는 TNF-α를 발현하는 NK 세포의 비율에서 시너지한 증가가 유발되는 것을 관찰한 것과 같이, 시너지한 활성을 측정하는 한 방법으로서 세포독성에서도 시너지한 증가가 유발되는지 테스트 하였다.
P815 세포를 CD56, CD16 및 NKG2D 및/또는 2B4, DNAM-1 및/또는 2B4에 특이적인 mAb 또는 이소형 대조군 mAb로 프리인큐베이션하고, 상기 NK 세포 특정 수용체자극 항체로 코팅된 P815를 유로피움(europium) 형광 염료(dye)로 표지하였다. 이후 상기 서술한 바와 같이 일차성 휴지기 NK 세포를 상기 P815 세포로 함께 배양함으로써 자극하였다. 이후 원심분리를 통해 배양액을 회수하고 세포 독성의 한 지표인 표적 세포 용해(lysis)를 통해 배출된 형광 염료 양을 측정하였다. 상기 배양액 내의 형광 정도는 마이크로플레이트 리더를 통해 분석하였다.
그 결과, 도 3에서 보여지는 바와 같이 CD16이 예외적으로 단일하게 강한 세포독성을 유발하였으나, NKG2D+2B4 및 DNAM-1+2B4로 자극된 경우는 각각 자극된 경우에 비해 시너지한 세포 독성을 유도하는 것을 볼 수 있었다. 예외적인 경우가 있을 수 있으나, 이는 특정 수용체 자극(예를 들어, 상기와 같이 특정 수용체 자극 항체의 이용)으로써 배제할 수 있으므로, 구별되는 두 인자를 특이적으로 자극하여 시너지 활성 측정을 실현할 수 있을 뿐만 아니라, 단일하게 자극하는 경우에 비해 동시 자극하여 유발된 시너지 활성이 NK 활성도를 비교하기에 현저한 차이를 가져 구별하기 용이할 수 있음을 확인하였다.
실시예3 . 정상 및 XLP1 환자의 NKG2D 및 2B4의 공동활성화에 의한 특정 인자 발현의 시너지한 차이를 이용한 NK 세포 활성도 비교
구별되는 인자 NKG2D 및 2B4를 특이적으로 공동활성화하여 NK 세포의 시너지한 활성을 유발할 수 있음을 확인하였다. 따라서 이러한 시너지한 활성 존재여부를 이용하여 HLH 질환인 XLP1 환자를 진단할 수 있을지 확인하기 위해 특정 인자 발현의 시너지한 차이를 볼 수 있는 웨스턴 블롯(western blot)을 수행하였다.
3-1. XLP1 환자의 NK 세포 획득
상기 서술한 바와 같이 XLP1의 환자로부터 NK 세포를 공여 받았다. 여기에 선천적 XLP1의 대상으로서 유전성 SH2D1A 유전자 돌연변이 환자를 포함하였다. 환자 NK 세포의 공급 한계 때문에, XLP1 환자의 NK 세포를 NF-κB 활성화 및 효과자(effector) 기능에 대한 분자적 신호전달을 연구하기 위해 상기 서술한 바와 같이 증식시켰다. 정상인 공여자의 NK 세포 또한 증식시켰고, 휴지기를 거친 후, NKG2D 및 2B4로 자극하여 효과자 기능 및 신호전달에서의 시너지한 증가를 재생산시켰다.
XLP1 환자의 NK 세포가 질환의 지표가 될 수 있는지 웨스턴 블롯을 수행하였다. 종래에 알려진 바(Nat. Rev. Immunol. 6, 56-66 (2006))에 따르면, SAP는 2B4를 포함하여, 면역 자극에 의한 활성화 신호들을 송신하는데 요구되는 수용체 어답터 단백질인데 XLP1 환자들의 경우 NK 세포 내 SAP 발현량이 고갈되어 있거나 감소되어 있다고 알려져있다. 정상 또는 XLP1 환자 공여자로부터 증식된 일차성 NK 세포의 총 용해물을 SAP 및 액틴에 대해 웨스턴 블롯하여 그 발현량을 알아본 결과, 실험된 네 명의 XLP1 환자 중에, 세 명의 환자가 SAP 발현의 완전한 손실을 유발하는 SH2D1A 유전자에 거시결손(macrodeletion)을 갖고 있었고, 한 명의 환자는 SAP 발현이 감소되어 있지만 완전히 소실되지 않은 미스센스(missense) 돌연변이를 갖고 있음을 확인하였다.
3-2. Erk 및 인산화 된 p65의 시너지한 발현 정도의 비교
정상 NK 세포와 XLP1 환자의 NK 세포에서 활성도 차이를 웨스턴 블롯을 이용하여 비교하였다. 구체적으로, 정상 또는 XLP1 환자 공여자로부터 증식시킨 후의 일차성 휴지기 NK 세포를 지정된 수용체에 대해 특이적인 mAb 또는 이소형 대조군 mAb (cIgG1)와 함께 프리인큐베이션하였다. 2분(p-Akt 및 p-Erk1/2) 및 5분(pS536-p65 및 pS276-p65) 동안 수용체를 가교한 후, 용해물을 지정된 인산화로 면역블롯하였다. 그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, NKG2D 및 2B4가 각각 자극된 경우 NK 세포의 활성지표인 NF-κB 활성화에 의한 p65의 인산화가 관찰되기는 하나, 그 정도가 NKG2D 및 2B4의 공동활성화에 의한 시너지 인산화에 비하여 현저하게 구별되지 않는다. 반면, NKG2D 및 2B4의 공동활성화에 따른 p65의 세린 536 및 276 시너지 인산화는 XLP1 NK 세포에서 현저하게 감소하는 것을 확인할 수 있다. 이는 공동활성화에 의해 유도된 Erk의 시너지한 인산화에서 또한 마찬가지로 나타나서 XLP1 NK 세포에서 정상에 비해 현저하게 감소한 것이 보였다. 따라서 XLP1을 진단하는데 있어, 각각의 구별되는 인자를 자극하여 NK 세포의 활성도를 측정하는 것보다 공동활성화한 경우 그 차이가 현저하게 관찰되므로 NK 세포의 구별되는 인자를 공동활성화 함으로써 유발되는 시너지한 활성도를 기준으로 XLP1을 진단하는 것이 유리할 수 있음을 보여준다.
실시예 4. 정상 및 XLP1 환자의 NKG2D 및 2B4의 공동활성화에 의한 IFN -γ 발현량에서의 시너지한 차이를 이용한 NK 세포 활성 비교
XLP1 진단에 구별되는 두 인자의 자극으로 인한 시너지한 활성을 비교하는 것이 더 유리한지 여부를 알아보기 위하여 면역활성인자 중 하나인 IFN-γ의 발현량을 비교하는 시험을 수행하였다. 구체적으로, 정상 또는 XLP1 환자 공여자로부터 증식시킨 후의 일차성 휴지기 NK 세포를 지정된 수용체에 특이적인 mAb와 프리인큐베이션한 P815 세포와 혼합하였다. 6시간 동안 인큐베이션한 후, CD56에 대한 플루오로크롬-접합된 mAb로 염색하고 IFN-γ으로 세포 내 염색한 후 상기 서술된 바와 같이 유동세포계측기에 의해 분석하였다.
그 결과, 도 5에서 나타난 바와 같이, CD16 자극은 XLP1에서의 NK 세포 활성화에서 의의를 갖지 않을지라도, NKG2D 및 2B4의 결합된 자극에 의하여 IFN-γ을 발현하는 NK 세포의 비율이 XLP1 NK 세포에서 현저하게 감소되는 것으로 보였다. 그 차이는 도 5B 에서와 같이 지정된 수용체로 자극한 후, 자극이 없는 세포(ΔIFN-γ+ 세포) 대비 IFN-γ+ NK 세포 대비 지정된 수용체로 자극한 후 각각의 정상 또는 XLP1 환자 공여자로부터의 IFN-γ+ NK 세포의 증가 백분율로 측정하였다. NKG2D 및 2B4을 각각 단일하게 자극한 것에 비해 NKG2D 및 2B4의 공동결합된 자극에 의한 시너지한 활성도가 더욱 현저하고 분명하게 차이가 나는 것을 볼 수 있다. 이 역시 단일한 자극 후에 비교하는 것에 비해 시너지한 활성화를 일으킨 후 비교하는 것이 더욱 유의하게 판단할 수 있다는 증거를 제시한다.
요약하여, 상기 결과들은 정상 및 XLP1 환자의 NK 세포에서의 유전적 및 분자적 차이가 공동활성화 자극에 대한 결과와 일치함을 증명하면서, XLP1의 진단에 상기 실험에 적용된 인자들의 동태를 판단하는 것이 충분한 근거를 가짐을 보여주며, 진단하는데 있어 단일 인자를 자극하는 것에 비해 시너지한 활성화를 유발할 수 있는 두 개 이상의 인자를 자극함으로써 그에 의한 시너지한 활성도를 비교하는 것이 더욱 유의하게 XLP1을 진단할 수 있는 방법이 될 수 있음을 보여준다. 뿐만 아니라, 여기서 보이는 특정 인자 (Erk)에서만 나타나는 시너지한 인산화, 특정 수용체 조합(NKG2D 및 2B4)에 의한 시너지한 활성화 결과는 특정 수용체의 특이적인 공동활성화를 통해 적어도 XLP1 및 관련 임상예후 예측을 진단하는데 적합함을 증명한다.
각 그래프는 3회 이상의 독립적인 실험에 의해서 제작되었다. 결과는 평균 ± SD로서 나타내었다. 통계적 분석을 GraphPad Prism software을 이용하여 양측 스투덴트 t-검정에 의해서 수행되었다.
실시예 5. 정상 및 XLP1 환자의 NKG2D 및 2B4의 공동활성화에 의한 탈과립화에서의 시너지한 차이를 이용한 NK 세포 활성 비교
NK 세포의 활성지표 중 하나인 탈과립화와 비례하는 NK 세포 표면에서의 CD107a의 발현정도를 측정함으로써 구별되는 두 인자의 자극에 의하여 발생하는 시너지한 효과의 차이로 XLP1을 진단 할 수 있을지 알아보았다.
NK 세포의 탈과립화(degranulation)는 세포 표면의 CD107a 발현 및 그란짐 B 방출 (BioLegend)에 의해서 평가하였다. 요약하면, 상기 서술한 바와 같이 정상 및 XLP1 환자의 일차성 휴지기 NK 세포를 증식시킨 후, 플루오로크롬-접합된 항-CD107a mAb 존재 하에 지정된 수용체에 대해 특이적인 mAb와 프리인큐베이션한 P815와 혼합하였다. 그 후 2시간 동안 인큐베이션하고, 세포를 유동세포계측기를 이용하여 분석하였다. 구체적으로 30 x g에서 3분간 스핀 다운하고, 37℃에서 두 시간 동안 인큐베이션하고, 다시 스핀 다운하였다. 세포 펠렛(pellet)을 FACS 완충액 (2% FBS 포함 PBS)에 재현탁하고 항-CD56-PE로 4℃에서 30분간 암실에 염색하였다. 림프구를 전방 산란(forward scatter)/측방 산란(side scatter)으로 게이팅(gate)하고 NK 세포에서 CD107a 발현을 유동세포계측기 및 FlowJo software로써 분석하였다.
그 결과, 도 6A에서 보여지는 바와 같이, CD16를 자극한 경우에는 시너지한 활성도의 한 측면인 탈과립화에서 정상 NK 세포와 현저한 차이가 관찰되지 않았으나, NKG2D 및 2B4의 결합된 자극에 의하여는 현저한 차이가 보이는 탈과립화가 유도되는 것을 관찰할 수 있다. 여기서 또한 상기 면역활성인자인 IFN-γ을 측정한 경우와 마찬가지로 NKG2D 및 2B4을 각각 단일하게 자극하여 비교하는 것보다 공동활성화에 의한 시너지한 활성도를 유발한 후 그 현저한 차이의 존재여부를 판단하는 것이 진단 방법으로서 더욱 유의하게 의의를 가짐을 알 수 있다. 이는 자극이 없는 세포인 ΔCD107a+ 세포 대비 CD107a+ NK 세포의 백분율을 나타내는 도 6B 그래프에서 더 분명하게 확인할 수 있다.
실시예 6. NKG2D 및 2B4의 공동활성화에 의한 NK 세포 활성의 특이성 평가
NKG2D/2B4 조합을 이용한 시너지 측정이 다른 세포들 중에서도 NK 세포에만 특이적인지 확인하기 위하여 NK 세포의 활성지표 중 하나인 탈과립화와 비례하는 NK 세포 표면에서의 CD107a의 발현정도를 측정하였다.
구체적으로, 정상인의 단핵구(PBMC)를 플루오로크롬-접합된 항-CD107a mAb 존재 하에 지정된 수용체에 대해 특이적인 리간드(NKG2D에 대해 ULBP1, 및 2B4에 대해 CD48)를 발현하는 P815 세포와 혼합하였다. 그 후 실시예 5에서와 같이, 각 세포 펠렛을 수득하여 재현탁하고, 항-CD3-PerCP, 항-CD56-PE로 4℃에서 30분간 암실에 염색하였다. 림프구를 전방 산란/측방 산란으로 게이팅하고 NK 세포(CD3-CD56+), NKT 세포(CD3+CD56+), T 세포(CD3+CD56-), 나머지 세포(CD3-CD56-)의 CD107a 발현을 유동 세포계측기 및 FlowJo software로써 분석하였다.
그 결과, 도 7에서 보여지는 바와 같이, NKG2D 및 2B4을 각각 단일하게 자극한 경우에는 NK 세포를 포함한 다른 세포 모두에서 탈과립화가 관찰되지 않았으나, NKG2D 및 2B4의 결합된 자극에 의하여는 NK 세포 특이적으로 현저한 차이를 보이는 탈과립화가 유도되는 것을 관찰할 수 있었다. 따라서 NKG2D 및 2B4을 각각 단일하게 자극하여 비교하는 것보다 공동활성화에 의한 시너지한 활성도를 유발하면 NK 세포에 특이적으로 활성화를 유도하여 진단 방법으로서 더욱 유의하게 의의를 가짐을 알 수 있다.
실시예 7. 암 환자에서 NKG2D 및 2B4의 공동활성화에 의한 NK 세포 시너지 활성 비교
NKG2D/2B4 조합을 이용한 시너지 측정이 암진단에 적용 가능한지를 알아보기 위해, 췌장암환자 시료를 이용하여 NK 세포의 활성지표 중 하나인 탈과립화와 비례하는 NK 세포 표면에서의 CD107a의 발현정도를 측정하였다.
구체적으로, 정상 및 췌장암 환자의 단핵구(PBMC)를 플루오로크롬-접합된 항-CD107a mAb 존재 하에 지정된 수용체에 대해 특이적인 리간드(NKG2D에 대해 ULBP1, 및 2B4에 대해 CD48)를 발현하는 P815 세포와 혼합하였다. 비교군으로 NK 세포 활성도 측정에 활용되는 혈액암 세포주인 K562를 사용하였다. 그 후 실시예 5에서와 같이, 각 세포 펠렛을 수득하여 재현탁하고, 항-CD3-PerCP, 항-CD56-PE로 4℃에서 30분간 암실에 염색하였다. 림프구를 전방 산란/측방 산란으로 게이팅하고 NK 세포(CD3-CD56+)에서 CD107a 발현을 유동세포계측기 및 FlowJo software로써 분석하였다.
그 결과, 도 8에서 보여지는 바와 같이, NKG2D 및 2B4의 결합된 자극에 의하여는 정상인과 췌장암 환자에서 현저한 차이가 보이는 NK 세포의 탈과립화가 유도되는 것을 관찰할 수 있고, 따라서, NKG2D/2B4 조합을 이용한 시너지 측정이 암진단에도 적용 가능함을 알 수 있다.
특이적인 것은, 비교군인 K562로 NK 세포를 자극한 경우에는 NKG2D 및 2B4을 특이적으로 자극한 경우와 달리, 정상인과 췌장암환자에서 NK 세포의 탈과립화 유도에 별로 차이가 없는 것을 알 수 있었다. 따라서, NKG2D 및 2B4의 결합된 자극과 같이, NK 세포 상에 특이적인 인자의 자극에 의한 시너지 활성화는 K562를 사용하는 것보다 NK 세포 활성도 진단 방법으로서 더욱 유의하게 의의를 가짐을 알 수 있다.

Claims (19)

  1. 시료 내의 NK 세포 상에 구별되는 두 개 이상의 인자를 특이적으로 자극하는 단계;
    상기 두 개 이상의 인자에 대한 자극으로 유발된, 상기 NK 세포의 시너지 활성화 정도를 측정하는 단계; 및
    정상 NK 세포 대비 상기 NK 세포의 시너지 활성화 정도를 비교하는 단계를 포함하는 NK 세포의 활성도 검사 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 방법은 상기 시료 중 필요로 하는 NK 세포를 분리하는 단계를 더 포함하는 NK 세포의 활성도 검사 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 인자는 세포 표면 또는 세포 내에 존재하는 것인 NK 세포의 활성도 검사 방법.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 인자는 NKG2D, 2B4 (CD244), DNAM-1 (CD226), CD2, CD16, NKp30, NKp44, NKp46, 및 NKp80 중 선택된 것인 NK 세포의 활성도 검사 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 자극은 상기 인자에 동시에 또는 순차적으로 이루어지는 것인 NK 세포의 활성도 검사 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 자극은 상기 인자에 각각 또는 동시에 특이적인 항체 또는 그 단편, 특이적인 활성을 유발하는 표적 세포 또는 폴리펩티드, 특이적으로 활성을 유도하는 화합물, 및 가역적 또는 비가역적인 작용자(agonist) 중 선택된 하나 이상에 의한 것인 NK 세포의 활성도 검사 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 인자에 특이적인 활성을 유발하는 표적 세포는 NK 세포 상에 구별되는 두 개 이상의 인자에 대한 항체, 단편 및 이들의 조합 중 선택된 하나 이상의 것으로 코팅된 것인 NK 세포의 활성도 검사 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 활성화 정도를 측정하는 단계는 상기 인자의 하위인자의 인산화 또는 발현 정도, 탈과립화 활성, 세포독성 활성 및 NK 세포 자극에 의해 분비된 시토킨의 측정 중 선택된 하나 이상을 포함하는 것인 NK 세포의 활성도 검사 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 시토킨은 IFN-γ, TNF-α, TNF- β, MIP-1α, MIP-1β, PANTES, IL-8 및 IL-10 중 선택된 것인 NK 세포의 활성도 검사 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 방법은 NK 세포의 시너지 활성과 관련된 질환의 진단에 대한 정보를 제공하기 위한 것인, NK 세포의 활성도 검사 방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 NK 세포의 시너지 활성과 관련된 질환은 과민성 면역질환, 자가면역질환, 면역결핍질환, 면역거부반응, 조직구증, 암, 2형 당뇨병, 기생충 감염 질환 및 바이러스 감염 질환 중 선택된 것인 방법.
  12. NK 세포의 시너지한 활성을 일으키는 자극 물질로서, 상기 NK 세포 상에 구별되는 두 개 이상의 인자에 각각 또는 동시에 특이적인 항체 또는 그 단편, 특이적인 활성을 유발하는 표적 세포 또는 폴리펩티드, 특이적으로 활성을 유도하는 화합물, 및 가역적 또는 비가역적인 작용자 중 선택된 하나 이상을 포함하는 NK 세포의 활성도 검사용 조성물.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 인자는 NKG2D, 2B4 (CD244), DNAM-1 (CD226), CD2, CD16, NKp30, NKp44, NKp46, 및 NKp80 중 선택된 것인 조성물.
  14. 청구항 12에 있어서, 정상 NK 세포 대비 상기 NK 세포의 시너지 활성화 존재 여부를 검출하는 물질로서, 상기 인자의 하위인자의 인산화 또는 발현 정도, 탈과립화 활성, 세포독성 활성 및 NK 세포 자극에 의해 분비된 시토킨의 측정 중 선택된 하나 이상을 검출하기 위한 항체 또는 그 단편을 더 포함하는 것인 조성물.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 NK 세포의 시너지 활성화 존재 여부를 검출하는 물질은 퍼포린, 그란짐, CD107a, CD107b, IFN-γ, MIP-1α, MIP-1β, TNF-α, TNF-β, PANTES, IL-8 및 IL-10 중 선택된 것에 대한 항체, 단편 또는 이들의 조합 중 선택된 하나 이상인 것인 조성물.
  16. 시료 내의 NK 세포 상에 구별되는 두 개 이상의 인자를 자극하여 상기 NK 세포의 시너지한 활성을 일으키는 자극 물질로서, 두 개 이상의 인자에 각각 또는 동시에 특이적인 항체 또는 그 단편, 특이적인 활성을 유발하는 표적 세포 또는 폴리펩티드, 특이적으로 활성을 유도하는 화합물, 및 가역적 또는 비가역적인 작용자 중 선택된 하나 이상; 및
    정상 NK 세포 대비 상기 NK 세포의 활성화 존재 여부를 검출하는 물질을 포함하는 NK 세포의 시너지 활성과 관련된 질환의 진단용 키트.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 NK 세포의 시너지 활성화 존재 여부를 검출하는 물질은 퍼포린, 그란짐, CD107a, CD107b, IFN-γ, MIP-1α, MIP-1β, TNF-α, TNF-β, PANTES, IL-8 및 IL-10 중 선택된 것에 대한 항체, 단편 또는 이들의 조합 중 선택된 하나 이상 또는 형광 염료(dye)인 것인 진단용 키트.
  18. 청구항 16에 있어서, 상기 인자에 특이적인 활성을 유발하는 표적 세포는 NK 세포 상에 구별되는 두 개 이상의 인자에 대한 항체, 단편 및 이들의 조합 중 선택된 하나 이상의 것으로 코팅된 것인 진단용 키트.
  19. 청구항 16에 있어서, NK 세포의 시너지 활성과 관련된 질환은 과민성 면역질환, 자가면역질환, 면역결핍질환, 면역거부반응, 조직구증, 암, 2형 당뇨병, 기생충 감염 질환 및 바이러스 감염 질환 중 선택된 것인 진단용 키트.
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