RU2582395C1 - Способ оценки реакции бласттрансформации лимфоцитов методом проточной цитофлуориметрии при специфической активации антигеном - Google Patents
Способ оценки реакции бласттрансформации лимфоцитов методом проточной цитофлуориметрии при специфической активации антигеном Download PDFInfo
- Publication number
- RU2582395C1 RU2582395C1 RU2015113852/15A RU2015113852A RU2582395C1 RU 2582395 C1 RU2582395 C1 RU 2582395C1 RU 2015113852/15 A RU2015113852/15 A RU 2015113852/15A RU 2015113852 A RU2015113852 A RU 2015113852A RU 2582395 C1 RU2582395 C1 RU 2582395C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- lymphocytes
- blast
- antigen
- evaluating
- flow cytometry
- Prior art date
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и может быть использовано для оценки реакции бласттрансформации лимфоцитов. Для этого используют бруцеллин для специфической активации лимфоцитов. Детекцию бластных форм лимфоцитов проводят с помощью моноклональных антител к CD34 с последующим подсчетом клеток методом проточной цитофлуориметрии. Использование данного способа позволяет проводить учет активированных бруцеллином лимфоцитов в РБТЛ с использованием моноклональных антител CD34 у больных бруцеллезом и здоровых доноров. 1 табл.
Description
Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и может быть использовано для оценки интенсивности специфической активации антигеном лимфоцитов крови человека. Для этого проводят оценку реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) при стимуляции их в течение 72 часов антигеном, иммунофлуоресцентным методом на проточном цитофлуориметре. В качестве маркера бластных форм лимфоцитов используют моноклональные антитела к CD34.
Пролиферативный ответ лимфоцитов на определенный антиген дает представление о наличии и выраженности специфической сенсибилизации организма. Специфическими митогенами являются растворимые и корпускулярные антигены, которые вовлекают в процесс бласттрансформации иммунные к ним Т- и В-лимфоциты. В отличие от неспецифических стимуляторов, антигены активируют только те лимфоциты, которые несут специфические к нему рецепторы.
РБТЛ изучают в культуре лимфоцитов in vitro. При постановке РБТЛ у человека берут кровь, выделяют из нее лейкоциты и вносят их в среду 199, затем добавляют специфический антиген или митоген. Учет реакции после стимуляции антигенами производят через 3-5 суток. Под влиянием специфических антигенов в бласты трансформируются не более 7-12% малых лимфоцитов.
Количество образовавшихся бластных клеток в мазках крови определяют с использованием обзорной окраски по Романовскому-Гимзе [B.C. Камышников, 2011]. Однако из-за низкой объективности и трудоемкости (подсчет не менее 1000 лимфоцитов) учета результатов реакции микроскопическим методом был заменен на метод с использованием радиоактивной метки 3Н-тимидина, которая при инкубации встраивается в бласттрансформированные лимфоциты, с последующим подсчетом радиоактивности на автоматическом сцинтилляционном β-счетчике [Дж. М. Клаус, 1990]. Использование радиоактивной метки в РБТЛ считается объективным методом учета при исследовании функционального состояния лимфоцитов в качестве показателя активности клеточного иммунитета, который описан как в отечественной, так и в зарубежной литературе [К.А. Лебедев, И.Д. Понякин, 2003; Л. Йегер, 2007; Т.В. Ferreira et all, 2014; J. Kolata et all, 2015]. Однако необходимость использования радиоактивного 3Н-тимидина в качестве метки для оценки функционального состояния лимфоцитов при антигенной стимуляции в РБТЛ резко ограничивает широкое внедрение метода в лабораторную практику, так как требует специальных условий для его проведения. Прототипом предлагаемого способа, можно считать метод использования моноклональных антител к рецептору Ki-67 для оценки пролиферативной активности лимфоцитов при стимуляции фитогемагглютинином [Е.Г. Артеменко, 2004; Т.И. Булычева, Н.Л. Дейнеко, А.А. Григорьев, 2014]. Однако в данном случае учет реакции проводят методом непрямой иммунофлюоресценции с помощью люминесцентного микроскопа, что также усложняет учет реакции (подсчет не менее 1000 клеток) и не исключает долю субъективности, за счет разного восприятия у исследователей интенсивности свечения флюорохрома.
Спектр применения РБТЛ в практике достаточно широк: оценка иммунного статуса, изучение механизмов активации клеток при пролиферации, оценка действия иммунотропных и иммуномодулирующих средств [Н.Н. Дергунова, 2003; B.C. Камышников, 2011; P.C. Janson, 2011; Р. Marits, 2014]. В последнее время в связи с резким увеличением количества работ по трансплантации органов и костного мозга, при онкологических и онкогематологических заболеваниях этот тест становится особенно востребованным. В связи с вышеизложенным, в настоящее время повышается актуальность внедрения новых, объективных способов учета результатов РБТЛ с использованием высокоточного аналитического оборудования.
В практике здравоохранения при иммунофенотипировании бластных форм лимфоцитов используют моноклональные антитела к CD34 [С.А. Луговская, М.Е. Почтарь, 2005; Г.Э. Плужникова, 2008; В. А. Зурочка, А.В. Зурочка, Е.Г. Костоломова, 2012; W.R. Widowati et all, 2014; F. Liu et all, 2015].
Реакция основана на экспрессии гемопоэтическими бластными лимфоидными клетками антигена CD34 и заключается в том, что клетки инкубируют с моноклональными антителами к CD34. Подсчет количества бластных форм лимфоцитов (CD34+) осуществляют автоматически с помощью проточной цитофлуориметрии.
В доступной литературе не обнаружены данные об использовании проточной цитофлуориметрии для подсчета бласттрансформированных клеток в РБТЛ с применением моноклональных антител к CD34.
Задачей изобретения является повышение качества учета активированных антигеном лимфоцитов в РБТЛ с использованием моноклональных антител CD34 при помощи проточного цитофлуориметра.
Заявляемый способ осуществляется следующим образом. В стерильную пробирку, содержащую 1 мл среды 199, добавить 100 Ед пенициллина и 10 Ед стрептомицина, внести антиген и 100 мкл плазмы с лейкоцитами крови пациентов. Для оптимального протекания РБТЛ необходимо присутствие макрофагов, поэтому использовать высокоочищенные лимфоциты не рекомендуется [В.А. Зурочка, А.В. Зурочка, Е.Г. Костоломова, 2012], для моделирования клеткам специфического микроокружения в смесь добавляли 100 мкл аутологичной сыворотки. Реакционную смесь культивировали в CO2-инкубаторе при 37°С в течение 72 часов с последующим центрифугированием при оборотах 2000g 10 мин, надосадочную жидкость сливали. К 50 мкл осажденных клеток приливали 10 мкл моноклональных антител к антигену CD34, конъюгированных с флуорохромом, инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 15 минут. Далее добавляли 500 мкл лизирующего раствора в разведении 1:10, не содержащего фиксирующих компонентов, и инкубировали в течение 10-12 минут в темноте при комнатной температуре. Клетки осаждали центрифугированием при 2000g в течение 5 минут, освобождали от надосадочной жидкости. К получившемуся осадку приливали 450 мкл отмывочного буфера (Cell Wash) и ресуспендировали. Подсчитывали количество бластных клеток (CD34) на проточном цитофлуориметре, при этом в каждой пробе анализировали 30000 клеток.
Подсчет количества бластных клеток (CD34) осуществляли непосредственно после окончания реакции.
На примере больных бруцеллезом была изучена специфичность и чувствительность предлагаемого способа. В качестве антигена использовали бруцеллин - производство «НПО «Микроген» Минздравсоцразвития России (Россия). Для определения специфичности заявляемого способа, при постановке РБТЛ, в плазму вносили антигены: тулярин - производство «НПО «Микроген» Минздравсоцразвития России» (Россия) и туберкулин - производство ФГУП СПбНИИВС ФМБА (Россия). Пред постановкой РБТЛ определяли фоновое количество CD34+ лимфоцитов у больных бруцеллезом и относительно здоровых доноров. Для контроля спонтанной неспецифической пролиферации лимфоцитов у обследуемых, в пробы вносили равный с антигеном объем (50 мкл) стерильного физиологического раствора.
Проведена сравнительная оценка способов подсчета бластных клеток в анализируемом материале по заявляемому способу и применяемого в лабораторной практике обзорного окрашивания мазков по Романовскому-Гимзе. Объектом исследования служили 55 образцов крови больных бруцеллезом (40) и относительно здоровых доноров (15).
Постановку РБТЛ с плазмой крови каждого образца осуществляли одновременно. Осажденные клетки после инкубации использовали для приготовления мазков на предметном стекле с последующей их окраской по Романовскому-Гимзе и подсчетом количества бластных клеток в световом микроскопе. Часть клеток инкубировали с моноклональными антителами к антигену CD34, и по окончании инкубации определяли количество бластных лимфоцитов в проточно-цитометрическом анализе.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программы Microsoft Excel 2010. Для выявления статистической значимости различий результатов использовали t-критерий Стьюдента, при уровне достоверности Р≤0,05.
Полученные результаты представлены в таблице. Как видно из таблицы, уровень пролиферативного ответа лимфоцитов на бруцеллин, у неинфицированных возбудителем бруцеллеза и больных бруцеллезом, достоверно различался (Р≤0,001).
Активация лимфоцитов крови туберкулином и тулярином не стимулировала статистически достоверного увеличения количества CD34+ клеток, выявляемых после постановки РБТЛ, что свидетельствует о специфичности предлагаемого способа.
Таким образом, предлагаемый способ оценки реакции бласттрансформации лимфоцитов при стимуляции антигеном, с применением проточной цитофлуориметрии не требует специальных условий проведения, как при использовании радиоактивной метки, отличается простотой учета и высокой объективностью за счет большего количества автоматически учтенных клеток (30000 клеток), высокой чувствительностью (100%) и специфичностью (>99%).
Claims (1)
- Способ оценки реакции бласттрансформации лимфоцитов, включающий использование бруцеллина для специфической активации лимфоцитов и моноклональных антител к CD34 для детекции бластных форм лимфоцитов, с последующим подсчетом количества клеток методом проточной цитофлуориметрии.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2015113852/15A RU2582395C1 (ru) | 2015-04-14 | 2015-04-14 | Способ оценки реакции бласттрансформации лимфоцитов методом проточной цитофлуориметрии при специфической активации антигеном |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2015113852/15A RU2582395C1 (ru) | 2015-04-14 | 2015-04-14 | Способ оценки реакции бласттрансформации лимфоцитов методом проточной цитофлуориметрии при специфической активации антигеном |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2582395C1 true RU2582395C1 (ru) | 2016-04-27 |
Family
ID=55794448
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2015113852/15A RU2582395C1 (ru) | 2015-04-14 | 2015-04-14 | Способ оценки реакции бласттрансформации лимфоцитов методом проточной цитофлуориметрии при специфической активации антигеном |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2582395C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2725872C1 (ru) * | 2019-07-30 | 2020-07-07 | Федеральное казённое учреждение здравоохранения Ставропольский научно-исследовательский институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ применения комплекса водорастворимых антигенов чумного микроба для оценки уровня противочумного иммунитета |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1992008803A1 (en) * | 1990-11-20 | 1992-05-29 | Vera Stejskal | A method for in vitro analysis of metal-induced allergies |
RU2438135C1 (ru) * | 2010-05-06 | 2011-12-27 | Учреждение Российской академии медицинских наук Гематологический научный центр РАМН | Способ иммуноцитохимической оценки пролиферативного состояния лимфоцитов по характеру экспрессии c-концевого фрагмента белка b23/нуклеофозмина в реакции непрямой иммунофлюоресценции |
RU2514039C2 (ru) * | 2012-08-10 | 2014-04-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение Гематологический научный центр Минздравсоцразвития РФ | Иммуноцитохимический способ оценки реакции бласттрансформации лимфоцитов (рбтл) при стимуляции их фитогемагглютинином (фга) |
-
2015
- 2015-04-14 RU RU2015113852/15A patent/RU2582395C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1992008803A1 (en) * | 1990-11-20 | 1992-05-29 | Vera Stejskal | A method for in vitro analysis of metal-induced allergies |
RU2438135C1 (ru) * | 2010-05-06 | 2011-12-27 | Учреждение Российской академии медицинских наук Гематологический научный центр РАМН | Способ иммуноцитохимической оценки пролиферативного состояния лимфоцитов по характеру экспрессии c-концевого фрагмента белка b23/нуклеофозмина в реакции непрямой иммунофлюоресценции |
RU2514039C2 (ru) * | 2012-08-10 | 2014-04-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение Гематологический научный центр Минздравсоцразвития РФ | Иммуноцитохимический способ оценки реакции бласттрансформации лимфоцитов (рбтл) при стимуляции их фитогемагглютинином (фга) |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
ЛОГВИНЕНКО О.В. и др. Особенности иммунологических показателей крови у больных различными формами бруцеллеза // Инфекция и иммунитет, 2013, 3, том 3, стр.275-278. FRAHM S.O. et al. Improved ELISA proliferation assay (EPA) for the detection of in vitro сell proliferation by a new Ki-67-antigen directed monoclonal antibody (Ki-S3) // J Immunol Methods. 1998 Feb 1;211(1-2), abstract.. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2725872C1 (ru) * | 2019-07-30 | 2020-07-07 | Федеральное казённое учреждение здравоохранения Ставропольский научно-исследовательский институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ применения комплекса водорастворимых антигенов чумного микроба для оценки уровня противочумного иммунитета |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Franquesa et al. | Update on controls for isolation and quantification methodology of extracellular vesicles derived from adipose tissue mesenchymal stem cells | |
JP5805368B2 (ja) | Ip−10に基づく免疫学的モニタリング | |
JP2008178421A (ja) | リンパ球機能の測定方法 | |
US11079373B2 (en) | Biomarker detection methods and systems and kits for practicing same | |
CN108845129B (zh) | 一种活动性结核类疾病的生物标志物的应用 | |
CN107904278B (zh) | 检测药物对细胞增殖影响的方法 | |
Zolnierowicz et al. | Monitoring cell proliferation in vitro with different cellular fluorescent dyes | |
CN115166252A (zh) | 淋巴细胞亚群分群与定量检测试剂盒及其检测方法与应用 | |
CN109991417B (zh) | 一种结核病的免疫标志物及应用 | |
Xin et al. | Limitations of using IL-17A and IFN-γ-induced protein 10 to detect bovine tuberculosis | |
RU2582395C1 (ru) | Способ оценки реакции бласттрансформации лимфоцитов методом проточной цитофлуориметрии при специфической активации антигеном | |
CN108780086B (zh) | 靶分析物的亚细胞定位 | |
CN102313813B (zh) | 从生物体液样本中富集与检测稀有细胞的整合方法 | |
Salinas-Jazmín et al. | A flow cytometry-based assay for the evaluation of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) in cancer cells | |
DE102015003141B3 (de) | Verfahren zum verbesserten Nachweis Antigen-spezifischer, gewebeinfiltrierender Immunzellen | |
US7169571B2 (en) | Methods for measurement of lymphocyte function | |
Bauman et al. | Canine memory T-cell subsets in health and disease | |
JP7021633B2 (ja) | 細胞観察装置及び免疫細胞の品質管理方法 | |
US20070243576A1 (en) | Method to confirm immunosuppression in human patients by measuring lymphocyte activation | |
RU2589281C1 (ru) | Способ контроля эффективности облучения донорской крови с помощью реакции активации лимфоцитов фитогемагглютинином | |
Xie et al. | In vitro and In vivo CD8+ T Cell Suppression Assays | |
JP7061342B2 (ja) | エフェクター制御性t細胞の検出及び調製 | |
RU2725872C1 (ru) | Способ применения комплекса водорастворимых антигенов чумного микроба для оценки уровня противочумного иммунитета | |
US20160069878A1 (en) | Semi-automated whole blood immuno-potency assay | |
Bauman | Characterization of Memory T-Lymphocyte Subsets in Dogs |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20170415 |