CN114878814A - 循环滤泡调节性t细胞作为过敏性哮喘诊断标记物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明中循环滤泡调节性T细胞作为过敏性哮喘诊断标记物的应用方法，通过血液样本中循环滤泡调节性T细胞在CD4+T细胞中所占比例来表征过敏性哮喘；应用过程中，通过检测试剂中的荧光标记准确定位循环滤泡调节性T细胞，快速检测出血液中循环滤泡调节性T细胞的数量水平，检测技术简便可行，时间短，精确度高，易于推广与临床应用。
Description
技术领域
本发明涉及医学诊断技术领域，具体为循环滤泡调节性T细胞作为过敏性哮喘诊断标记物的应用。
背景技术
过敏性哮喘是由尘螨、花粉、化学物质和真菌等过敏原引起的一种慢性过敏性疾病，其特点是血清免疫球蛋白E(Immunoglobulin E，IgE)滴度增高。过敏性哮喘的临床表现、气道炎症的类型和强度具有异质性，症状包括喘息、呼吸困难、胸闷和咳嗽等。
目前用于诊断过敏性哮喘的方法，大致可以分为两类：
(1)体内实验：如皮肤点刺试验、特异性激发实验等。
但是此类实验适应人群有局限性。如果患者对某种物质高度过敏，则试验可能导致过敏的发作甚至过敏性休克，另外身体虚弱、哮喘急性发作期、以及不合作的儿童也不宜做点刺试验。实验结果也易受到药物影响。
(2)体外实验：如放射性变应原吸附试验、酶联免疫法测IgE、免疫印迹法等。
放射性变应原吸附试验灵敏度高、特异性高，被称为过敏原体外检测的“金标准”，但是需要专用仪器及试剂、价格昂贵。酶联免疫法测IgE只能定性/半定量结果，方法繁琐，灵敏度低。而目前临床使用的免疫印迹法操作繁复，要获得非常精确的结果十分困难，常出现一个操作者检测出“+”，而另一个操作者检测出“++”的现象，也间接导致了不同医院的检验结果无法互认。
发明内容
为了解决现有的过敏性哮喘的诊断方法中，体内实验的方法适用人群有限，体外实验存在成本过高或者灵敏度较低的问题，本发明提供循环滤泡调节性T细胞作为过敏性哮喘诊断标记物的应用，基于循环滤泡调节性T细胞作为过敏性哮喘诊断标记物，其能以极高的灵敏度，简单快速的实现对过敏性哮喘的检测，同时成本较低，非常适于在临床的推广应用。
本发明的技术方案是这样的：
循环滤泡调节性T细胞作为过敏性哮喘诊断标记物的应用。
其进一步特征在于：
其通过血液样本中循环滤泡调节性T细胞数量水平作为过敏性哮喘的表征。
所述血液样本为离体样本。
所述血液样本为外周血。
其通过循环滤泡调节性T细胞的检测试剂实现循环滤泡调节性T细胞作为过敏性哮喘诊断标记物的应用。
其通过所述检测试剂检测血液样本中循环滤泡调节性T细胞的数量水平。
所述检测试剂为流式荧光抗体，所述流式荧光抗体具备可供检测的标记。
所述检测试剂通过免疫学抗原抗体特异性结合的方式检测循环滤泡调节性T细胞。
所述检测试剂中的流式荧光染料选自Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 488、Brilliant Violet 480、Brilliant Violet 750、Brilliant Violet 570、Super Bright436、PE、APC、APC-R700。
本发明中循环滤泡调节性T细胞作为过敏性哮喘诊断标记物的应用方法，通过血液样本中循环滤泡调节性T细胞在CD4+T细胞中所占比例来表征过敏性哮喘；应用过程中，通过检测试剂中的荧光标记准确定位循环滤泡调节性T细胞，快速检测出血液中循环滤泡调节性T细胞的数量水平，检测技术简便可行，时间短，精确度高，易于推广与临床应用。
附图说明
图1为通过全光谱流式细胞仪检测外周血cTFR细胞的设门方法；
图2为过敏性哮喘患者外周血cTFR细胞占CD4+T细胞的比例的实施例；
图3为cTFR细胞比例与过敏性哮喘临床指标相关性的实施例。
具体实施方式
滤泡调节性T(follicular regulatory T cell，TFR)细胞是2011年新发现的定位于生发中心且负向调控生发中心体液免疫反应的最主要细胞群体。TFR细胞同时具有TFH细胞及TREG细胞的双重特性：不仅表达TFH细胞特征分子CXCR5、功能性分子PD-1、ICOS和Bcl-6，同时还表达TREG细胞发挥抑制功能相关分子如CTLA-4和Foxp3等。循环TFR(circulatingTFR，cTFR)是存在于外周血中的TFR细胞。与组织TFR细胞表型不同，cTFR细胞低表达CD127和CD45RA，高表达CXCR5和CD25。
现有研究中，cTFR细胞的变化和功能在类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和重症肌无力等自身免疫性疾病中研究较多。类风湿性关节炎患者外周血cTFR细胞显著减少，且cTFR比例与血清IgG滴度呈负相关，经治疗后，cTFR细胞比例恢复稳定。系统性红斑狼疮患者外周血cTFR细胞显著升高，cTFR频率与患者IgG和IgA水平，以及疾病严重度评分呈正相关。相对于自身免疫病，cTFR细胞在过敏性疾病中研究较少。
本发明人经研究发现，过敏性哮喘患者在疾病发作期cTFR细胞比例下降，并且血液中的cTFR细胞比例与过敏性哮喘有极强的相关性，可用于过敏性哮喘的诊断。
具体地，本发明技术方案中，通过流式荧光抗体染色外周血单个核细胞，使用全光谱流式细胞仪检测cTFR细胞的数量，当循环滤泡调节性T细胞在CD4+T细胞中所占比例低于健康人平均比例时，则表示存在过敏性哮喘的特征。本方法中，使用循环滤泡调节性T细胞在CD4+T细胞中的比例，作为对过敏性哮喘判断的参数，在通常情况下，健康人外周血循环滤泡调节性T细胞在CD4+T细胞中的比例是已知的，在一个较高的范围内波动，比例为0.8～2.0％，本方法中以循环滤泡调节性T细胞在CD4+T细胞中的比例来做计算的基准，确保本方法客观且更具实用性，不会出现不同检测机构检测结果不一致的问题。
检测过程中，使用的检测试剂通过免疫学抗原抗体特异性结合的方式检测cTFR细胞。检测试剂中的荧光染料选自Alexa Fluor 532(AF532)、Alexa Fluor 488(AF488)、Brilliant Violet 480(BV480)、Brilliant Violet 750(BV750)、Brilliant Violet 570(BV570)、Super Bright 436(SB436)、PE、APC、APC-R700。
其中，使用全光谱流式细胞仪检测对细胞进行定位的方法，以及健康人群的循环滤泡调节性T细胞在CD4+T细胞中所占比例，属于本领域技术人员公知的技术和内容。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例1中，通过全光谱流式细胞仪检测外周血中cTFR细胞。其通过EDTA抗凝管收集外周血，使用Ficoll密度梯度离心法分离PBMCs。
其具体步骤包括：
S1：取11个EP管并标记序号1～11，每个EP管中含有0.5×106～1.5×106个PBMCs(外周血单个核细胞)；重悬于50～100μL含2％FBS(胎牛血清)的PBS(phosphate bufferedsaline,磷酸缓冲盐溶液)中。按照表1中的方式加入荧光抗体，并4℃避光孵育。
S2:孵育完成后加入1mL PBS，混匀，1500r/min，4，℃离心5min，弃上清。每管细胞分别重悬于100μL含2％FBS的PBS中，于38通道光谱流式细胞仪Cytek NL-CLC-3000上检测。每种荧光抗体收集50000～100000个PBMCs，记录每种荧光的荧光光谱数据，用于后续定位cTFR细胞。
以上步骤为记录各种荧光的光谱数据，每台仪器只需做一次。
表1：抗体列表
S3:取0.5×106～1.5×106个PBMCs，重悬于50～100μL含2％FBS的PBS中，加入荧光抗体。
本实施例中，每份50μL外周血单个核细胞悬液体系中加入0.5μL CD3-AF532，0.5μL TCRγδ-BV480，0.25μL CD4-BV750，0.25μL CD8a-BV570，1μL CD19-SB436，1μL CD25-PE，1μL CD127-APC-R700，1μL CXCR5-APC，1μL CD45RA-AF488。
S4：孵育完成后加入1mL PBS，混匀；离心速度设置为：1500r/min，4℃，离心处理5min后，弃上清，保留沉淀。
S5：将细胞重悬于100μL含2％FBS的PBS中，加入1μL 7-AAD，避光孵育5min。
S6：混匀细胞后，于38通道光谱流式细胞仪Cytek NL-CLC-3000上检测，收集150000～300000个PBMCs，检测目标细胞数量。
cTFR细胞定义为CD3+CD4+CD25highCD127lowCXCR5+CD45RAlow。
如图1所示，为通过全光谱流式细胞仪检测外周血cTFR细胞的设门方法。首先根据FSC和SSC圈出淋巴细胞亚群，再根据FSC-A和FSC-H去除粘连信号获得单个细胞，然后根据活细胞染料7-AAD圈出活细胞。以CD3和CD19设门，排除了B细胞，获得T细胞。以CD3和TCRγδ设门，排除γδT细胞，获得αβT细胞。以CD4和CD8设门，排除CD8+T细胞，获得CD4+T细胞。以CD45RA和CXCR5设门，获得滤泡T细胞。以CD25和CD127设门，获得cTFR细胞。
基于本方法可以精准地获得cTFR细胞的定义，进而确保对过敏性哮喘的诊断的准确性。
实施例2中，通过分别检测25例过敏性哮喘患者和15例健康患者的外周血中cTFR细胞所占比例，判断cTFR细胞比例与过敏性哮喘临床指标相关性。
收集25例过敏性哮喘患者和15例健康对照的基本信息和临床资料，包括性别，年龄，血清总IgE水平，第1秒用力呼气容积占预计值的百分比(FEV1％)，嗜酸性粒细胞百分比(EOS％)和C-反应蛋白(CRP)。哮喘患者和健康志愿者基本信息和临床检查指标见表2。
表2：健康对照组和过敏性哮喘组临床资料比较
| 健康对照组(n＝15) | 过敏性哮喘组(n＝25) | |
| 性别(男/女) | 6/9 | 10/15 |
| 年龄(岁) | 29.3±6.1 | 32.5±8.9 |
| FEV1％ | 89.57±4.93 | 80.49±5.42*** |
| TIgE(IU/mL) | 49.7±36.5 | 440.9±171.7** |
| EOS％ | 0.73±0.64 | 6.04±4.63** |
| CRP(mg/L) | 3.77±0.8 | 10.41±2.79** |
表2中，**表示：P＜0.01vs健康对照组；***表示：P＜0.001vs健康对照组，其中P为统计学差异，P＜0.05表示具有显著的统计学差异。
健康对照组和过敏性哮喘组的性别和年龄均无统计学差异(P＞0.05)。哮喘患者FEV1％显著低于健康对照(P＜0.001)，提示哮喘患者呼气性的呼吸困难，肺功能损伤，可表征疾病的严重程度，FEV1％数值越低，疾病越严重。哮喘患者血清总IgE、EOS％和CRP水平均显著高于健康对照(P＜0.01)
对25例过敏性哮喘患者外周血cTFR细胞与临床指标的相关性进行Spearman秩统计学分析。结果发现：cTFR与血清总IgE呈负相关(r＝-0.4626，P＝0.0199)，与FEV1％呈正相关(r＝0.5900，P＝0.0019)。
其中，使用全光谱流式细胞仪检测25例过敏性哮喘患者和15例健康对照外周血中cTFR细胞占CD4+T细胞的比例，参照说明书附图2。图2中，Health＝健康人，Asthma＝过敏性哮喘，****表示P＜0.0001。
由图2可知，cTFR细胞占CD4+T细胞中的比例在过敏性哮喘患者中显著减少[(0.48±0.13)vs(1.13±0.26)，P＜0.0001]，即：cTFR细胞比例对过敏性哮喘疾病的诊断具有重要意义。
在实施例3中，分析cTFR细胞比例与过敏性哮喘临床指标相关性。分析示意图见说明书附图的图3。根据现有的医学统计，过敏性哮喘会导致总IgE、CRP或EOS％升高，或者会导致FEV1％降低。
图3中的A图为cTFR与IgE的相关性，B图为cTFR与FEV1％的相关性，C图为cTFR与CRP的相关性，D图为cTFR与EOS％的相关性。
由图3可知，cTFR细胞占CD4+T细胞中的比例与血清中的IgE呈负相关，与FEV1％呈正相关，结果具有显著性。cTFR细胞占CD4+T细胞中的比例与CRP和EOS％负相关，结果不具备显著性。即：cTFR细胞在过敏性哮喘患者中的减少与疾病发生有关，cTFR细胞比例对过敏性哮喘疾病的诊断具有重要意义。
本发明技术方案具体应用时，包括基于循环滤泡调节性T细胞的检测试剂实现的检测外周血中cTFR细胞比例的过敏性哮喘诊断用检测试剂、试剂盒和其他任何检测工具和方法，如何使用表1中的抗体、结合固定破膜液及固定破膜缓冲液等成分实现过敏性哮喘诊断用检测试剂、试剂盒，以及如何使用检测试剂和检测试剂盒进行检测为本领域技术人员已知的现有技术。
使用本发明的技术方案后，本发明中，以循环滤泡调节性T细胞作为过敏性哮喘诊断标记物，使用体外的外周血的血液样本，将循环滤泡调节性T细胞在CD4+T细胞中所占比例与健康人群平均水平进行比较，结合其他的临床参数，判断患者是否患有过敏性哮喘，本发明的检测方法适用于各种类型的人群，结果客观，不受任何药物影响，同时，检测过程简单易行，结果准确，非常适用于临床推广。
Claims (9)
1.循环滤泡调节性T细胞作为过敏性哮喘诊断标记物的应用。
2.根据权利要求1所述循环滤泡调节性T细胞作为过敏性哮喘诊断标记物的应用，其特征在于：其通过血液样本中循环滤泡调节性T细胞数量水平作为过敏性哮喘的表征。
3.根据权利要求2所述循环滤泡调节性T细胞作为过敏性哮喘诊断标记物的应用，其特征在于：所述血液样本为离体样本。
4.根据权利要求2所述循环滤泡调节性T细胞作为过敏性哮喘诊断标记物的应用，其特征在于：所述血液样本为外周血。
5.根据权利要求1所述循环滤泡调节性T细胞作为过敏性哮喘诊断标记物的应用，其特征在于：其通过循环滤泡调节性T细胞的检测试剂实现循环滤泡调节性T细胞作为过敏性哮喘诊断标记物的应用。
6.根据权利要求5所述循环滤泡调节性T细胞作为过敏性哮喘诊断标记物的应用，其特征在于：其通过所述检测试剂检测血液样本中循环滤泡调节性T细胞的数量水平。
7.根据权利要求5所述循环滤泡调节性T细胞作为过敏性哮喘诊断标记物的应用，其特征在于：所述检测试剂为流式荧光抗体，所述流式荧光抗体具备可供检测的标记。
8.根据权利要求5所述循环滤泡调节性T细胞作为过敏性哮喘诊断标记物的应用，其特征在于：所述检测试剂通过免疫学抗原抗体特异性结合的方式检测循环滤泡调节性T细胞。
9. 根据权利要求7所述循环滤泡调节性T细胞作为过敏性哮喘诊断标记物的应用，其特征在于：所述检测试剂中的流式荧光染料选自Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 488、Brilliant Violet 480、Brilliant Violet 750、Brilliant Violet 570、Super Bright436、PE、APC、APC-R700。
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