JP2023541458A - Ｃｄ５修飾のための化合物および方法 - Google Patents

Abstract

本明細書では、例えば、細胞に修飾を行うために使用され得る、ＣＤ５を標的とする標的化ドメインを含むｇＲＮＡが提供される。また、本明細書では、ＣＤ５遺伝子に修飾（例えば、挿入または欠失）を有する遺伝子操作された細胞の方法、およびかかる遺伝子操作された細胞を、造血器悪性腫瘍を有する対象などの対象に投与することを伴う方法も提供される。

Description

関連出願
本出願は、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、２０２０年９月１４日に出願された米国仮出願第６３／０７８，１３７号の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張する。

対象が、疾患または状態に関連する抗原を標的とする免疫療法、例えば、抗がんＣＡＲ－Ｔ療法を施されるとき、当該療法は、標的化されることを意図している病的細胞だけでなく、標的抗原を発現し得る非病的細胞も枯渇させ得る。この「標的上・疾患外（on-target, off-disease）」効果が、いくつかのＣＡＲ－Ｔ治療剤、例えば、ＣＤ１９またはＣＤ３３を標的とするものについて報告されている。標的抗原が、生存もしくは対象に必要とされる細胞の表面上に、または枯渇が対象の健康に著しい損害を与える細胞の表面上に発現される場合、対象は、免疫療法を受けることが可能ではない場合があるか、またはかかる療法を施されると、重度の副作用に直面しなければならない場合がある。他の事例では、免疫療法を構成する免疫エフェクター細胞上に、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞の表面上に発現される抗原を標的とする免疫療法を施すことが望ましい場合があり、これは、フラトリサイドをもたらし、それぞれの治療剤を無効にするか、または生産することを事実上不可能にし得る。

本開示のいくつかの態様は、特定の免疫療法アプローチ、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞またはＣＡＲ－ＮＫ細胞などの治療を必要とする対象における具体的な抗原を標的とするリンパ球エフェクター細胞を含む免疫治療剤の有害な標的上・疾患外効果に対処する組成物、方法、方略、および治療法を記載する。

本開示の態様は、表１～３のいずれかに記載される配列を含む標的化ドメインを含む、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を提供する。いくつかの態様では、ｇＲＮＡは、標的化ドメインを含み、標的化ドメインは、配列番号４３～６３のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、第１の相補性ドメインと、結合ドメインと、第１の相補性ドメインに相補的である第２の相補性ドメインと、近位ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、化学的に修飾されている１つ以上のヌクレオチド残基を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’Ｏ－メチル部分を含む１つ以上のヌクレオチド残基を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ホスホロチオアートを含む１つ以上のヌクレオチド残基を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、チオＰＡＣＥ部分を含む１つ以上のヌクレオチド残基を含む。

本開示の態様は、細胞を提供することと、細胞を、（ｉ）本明細書に記載されるｇＲＮＡのうちのいずれか、または本明細書に記載されるｇＲＮＡのうちのいずれかによって標的化される標的化ドメインを標的とするｇＲＮＡ、および（ｉｉ）ｇＲＮＡに結合するＲＮＡ誘導ヌクレアーゼと接触させ、したがって、（ｉ）のｇＲＮＡが（ｉｉ）のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼとリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成し、および／またはそれを維持するため、かつＲＮＰ複合体が細胞のゲノム内の標的ドメインに結合するために好適な条件下で、ＲＮＰ複合体を形成することを含む、遺伝子操作された細胞を産生する方法を提供する。いくつかの実施形態では、接触させることは、予備形成されたリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の形態で、（ｉ）および（ｉｉ）を細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、接触させることは、（ｉ）のｇＲＮＡおよび／または（ｉｉ）のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする核酸の形態で、（ｉ）および／または（ｉｉ）を細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、（ｉ）のｇＲＮＡおよび／または（ｉｉ）のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする核酸は、ＲＮＡ、好ましくは、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ類似体である。いくつかの実施形態では、リボ核タンパク質複合体は、エレクトロポレーションを介して細胞に導入される。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、ｓｐＣａｓヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ｓａＣａｓヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼである。

いくつかの実施形態では、細胞は、造血細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、造血幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、造血前駆細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、免疫エフェクター細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、リンパ球である。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｔリンパ球である。

本開示の態様は、本明細書に記載される方法のうちのいずれかによって取得される遺伝子操作された細胞を提供する。本開示の態様は、本明細書に記載される遺伝子操作された細胞を含む細胞集団を提供する。

本開示の態様は、遺伝子操作された細胞を含む細胞集団を提供し、遺伝子操作された細胞は、表１～３のいずれかに記載される標的化ドメインを含むｇＲＮＡに結合されたときに、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼによって切断された部位のすぐ近位の挿入または欠失からなるゲノム修飾を含む。いくつかの実施形態では、ゲノム修飾は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）事象によって生成された挿入または欠失である。いくつかの実施形態では、ゲノム修飾は、相同誘導型修復（ＨＤＲ）事象によって生成された挿入または欠失である。いくつかの実施形態では、ゲノム修飾は、かかるゲノム修飾を持つ遺伝子操作された細胞におけるＣＤ５の機能喪失をもたらす。いくつかの実施形態では、ゲノム修飾は、ＣＤ５のゲノム修飾を持たない同じ細胞型の野生型細胞におけるＣＤ５の発現レベルと比較して、２５％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、２％未満、１％未満、０．１％未満、０．０１％未満、または０．００１％未満までのＣＤ５の発現の低減をもたらす。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細胞は、造血幹または前駆細胞である。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細胞は、免疫エフェクター細胞である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細胞は、Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ５を標的とする。

いくつかの実施形態では、細胞集団は、レシピエントの骨髄にＣＤ５編集造血幹細胞を生着し、かつレシピエントにおける全ての血液系細胞型の分化した子孫を生成する能力によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、細胞集団は、少なくとも５０％の効率でレシピエントの骨髄にＣＤ５編集造血幹細胞を生着する能力によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、細胞集団は、少なくとも６０％の効率でレシピエントの骨髄にＣＤ５編集造血幹細胞を生着する能力によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、細胞集団は、少なくとも７０％の効率でレシピエントの骨髄にＣＤ５編集造血幹細胞を生着する能力によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、細胞集団は、少なくとも８０％の効率でレシピエントの骨髄にＣＤ５編集造血幹細胞を生着する能力によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、細胞集団は、少なくとも９０％の効率でレシピエントの骨髄にＣＤ５編集造血幹細胞を生着する能力によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、細胞集団は、未編集造血幹細胞の分化能力と同等である分化能によって特徴付けられるＣＤ５編集造血幹細胞を含む。

本開示の態様は、本明細書に記載される遺伝子操作された細胞のうちのいずれかまたは本明細書に記載される細胞集団のうちのいずれかを、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象は、造血器悪性腫瘍を有するか、または造血器悪性腫瘍と診断されている。いくつかの実施形態では、本方法は、有効量のＣＤ５を標的とする薬剤を対象に投与することを更に含み、薬剤は、ＣＤ５に結合する抗原結合断片を含む。

上記の要約は、非限定的な様式で、本明細書に開示される技術の実施形態、利点、特徴、および使用のうちのいくつかを例証するように意図されている。本明細書に開示される技術のその他の実施形態、利点、特徴、および使用が、発明を実施するための形態、図面、実施例、および特許請求の範囲から明らかであろう。

図１は、３つの細胞外ドメインを含むＣＤ５の予測される構造の概略図である（出典：Ｊａｍｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．（１９９９）３（３）：２３９－４５）。 図２は、９１．８％の編集効率をもたらした、例示的なｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ ＣＤ５－４）で編集されたヒト動員末梢血ＣＤ３４＋細胞のＩＮＤＥＬ（挿入／欠失）分布を示すグラフである。Ｘ軸は、ＩＮＤＥＬのサイズを示し、Ｙ軸は、混合物中の具体的なＩＮＤＥＬの割合を示す。 図３Ａ～３Ｄは、ドナーからの遺伝子編集されたＣＤ３４＋細胞のインビトロコロニー形成を示す。対照またはＣＤ５修飾ＣＤ３４＋細胞を、エレクトロポレーションの２日後、モックエレクトロポレーション（モックＥＰ）または指示されたＣＤ５ ｇＲＮＡのいずれかとともにＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（商標）培地に播種し、１４日後にコロニー形成についてスコア付けした。図３Ａおよび３Ｃは、赤血球（ＢＦＵ－Ｅ：バースト形成単位）および顆粒球／マクロファージ（ＣＦＵ－ＧＭ：コロニー形成単位－顆粒球／マクロファージ）コロニー形成を示す。図３Ｂおよび３Ｄは、多能性骨髄前駆細胞コロニー形成（顆粒球、赤血球、単球、および巨核球を生成する）（ＣＦＵ－ＧＥＭＭ：多能性骨髄前駆細胞のコロニー形成単位）を示す。図３Ａおよび３Ｂについては、ＣＤ５ ｇＲＮＡは、Ｓｙｎｔｈｅｇｏによって提供された。図３Ｃおよび３Ｄについては、ＣＤ５ ｇＲＮＡは、ＡｘｏＬａｂｓによって提供された。 図３Ａ～３Ｄは、ドナーからの遺伝子編集されたＣＤ３４＋細胞のインビトロコロニー形成を示す。対照またはＣＤ５修飾ＣＤ３４＋細胞を、エレクトロポレーションの２日後、モックエレクトロポレーション（モックＥＰ）または指示されたＣＤ５ ｇＲＮＡのいずれかとともにＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（商標）培地に播種し、１４日後にコロニー形成についてスコア付けした。図３Ａおよび３Ｃは、赤血球（ＢＦＵ－Ｅ：バースト形成単位）および顆粒球／マクロファージ（ＣＦＵ－ＧＭ：コロニー形成単位－顆粒球／マクロファージ）コロニー形成を示す。図３Ｂおよび３Ｄは、多能性骨髄前駆細胞コロニー形成（顆粒球、赤血球、単球、および巨核球を生成する）（ＣＦＵ－ＧＥＭＭ：多能性骨髄前駆細胞のコロニー形成単位）を示す。図３Ａおよび３Ｂについては、ＣＤ５ ｇＲＮＡは、Ｓｙｎｔｈｅｇｏによって提供された。図３Ｃおよび３Ｄについては、ＣＤ５ ｇＲＮＡは、ＡｘｏＬａｂｓによって提供された。 図４は、修飾Ｍｏｌｔ－４細胞上のＣＤ５表面発現のグラフを示す。ＣＤ５発現を欠くアイソタイプ対照細胞（「アイソ対照」）、モックエレクトロポレーション細胞（「モックＥＰ」）、および指示されたＣＤ５ ｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ ＣＤ５－１、ｇＲＮＡ ＣＤ５－４、およびｇＲＮＡ ＣＤ５－１８）を使用して編集された細胞におけるＣＤ５の発現。Ｘ軸は、抗体染色の強度を示し、Ｙ軸は、細胞数に対応する。 図５は、指示されたＣＤ５ ｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ ＣＤ５－１、ｇＲＮＡ ＣＤ５－４、またはｇＲＮＡ ＣＤ５－１８）、ＣＤ３３を標的とする対照ｇＲＮＡ（ＣＤ３３ ｇＲＮＡ）、またはモックエレクトロポレーション（「モック」）を使用して編集された活性化初代Ｔ細胞において評価されたＣＤ５表面発現のグラフを示す。また、対照として、ナイーブ初代Ｔ細胞、ナイーブ不活化初代Ｔ細胞、ＣＤ５発現を欠くアイソタイプ対照細胞、および未染色の活性化初代Ｔ細胞も含まれる。Ｘ軸は、抗体染色の強度を示し、Ｙ軸は、細胞数に対応する。各状態に対するＣＤ５＋細胞の割合も提示される。 図６Ａ～６Ｃは、指示されたＣＤ ｇＲＮＡまたはモックエレクトロポレーション（「モック」）を用いたエレクトロポレーション後２日目または５日目の初代Ｔ細胞におけるＣＤ５の編集のグラフを示す。図６Ａは、（ＩＣＥによる）編集効率を示す。図６Ｂは、正規化されたＣＤ５ ＲＮＡ発現を示す。 図６Ｃは、細胞表面ＣＤ５発現（ＣＤ５陽性細胞の割合）を示す。編集および発現を、エレクトロポレーションの２日後（太い灰色）またはエレクトロポレーションの５日後（斜線）に評価した。 図７は、ＣＤ５編集ヒト動員末梢血（ｍＰＢ）細胞を照射されたマウスに生着させ、１６週間後の選択組織（例えば、胸腺、血液、骨髄（ＢＭ））中のキメラ現象、系統再構成、およびＣＤ５発現を評価する実験の概略図を示す。 図８Ａおよび８Ｂは、ＣＤ５編集動員末梢血細胞（ｍＰＢ）（「ＣＤ５ＫＯ」）、または対照ｇＲＮＡでエレクトロポレーションされた（「ｇＣｔｒｌ ＥＰ」）か、もしくはエレクトロポレーションされなかった（「ＥＰなし」）による生着から１６週間後のマウスから取得された組織中のヒトキメラ現象のグラフを示す。図８Ａは、骨髄（ＢＭ）中のヒトキメラ現象の割合を示す。図８Ｂは、末梢血（ＰＢ）中のヒトキメラ現象の割合を示す。 図９Ａ～９Ｄは、ＣＤ５編集ｍＰＢ（「ＣＤ５ＫＯ」）、または対照ｇＲＮＡでエレクトロポレーションされた（「ｇＣｔｒｌ ＥＰ」）か、もしくはエレクトロポレーションされなかった（「ＥＰなし」）による生着から１６週間後のマウスから取得された骨髄中の系統再構成のグラフを示す。図９Ａは、ＣＤ３４＋細胞の割合（ｈＣＤ４５＋に対する％）を示す。図９Ｂは、ＣＤ１９＋細胞の割合（ｈＣＤ４５＋に対する％）を示す。 図９Ｃは、ＣＤ３＋細胞の割合（ｈＣＤ４５＋に対する％）を示す。図９Ｄは、ＣＤ３３＋細胞の割合（ｈＣＤ４５＋に対する％）を示す。 図１０Ａ～１０Ｄは、ＣＤ５編集ｍＰＢ（「ＣＤ５ＫＯ」）、または対照ｇＲＮＡでエレクトロポレーションされた（「ｇＣｔｒｌ ＥＰ」）か、もしくはエレクトロポレーションされなかった（「ＥＰなし」）による生着から１６週間後のマウスから取得された血液中の系統再構成のグラフを示す。図１０Ａは、ＣＤ３４＋細胞の割合（ｈＣＤ４５＋に対する％）を示す。図１０Ｂは、ＣＤ１９＋細胞の割合（ｈＣＤ４５＋に対する％）を示す。 図１０Ｃは、ＣＤ３＋細胞の割合（ｈＣＤ４５＋に対する％）を示す。図１０Ｄは、ＣＤ３３＋細胞の割合（（ｈＣＤ４５＋に対する％）を示す。「ＮＳ」が、レベル間に統計的有意差がないことを示す一方で、「＊」は、統計的有意差を示す。 図１１Ａ～１１Ｃは、ＣＤ５編集ｍＰＢ（「ＣＤ５ＫＯ」）、または対照ｇＲＮＡでエレクトロポレーションされた（「ｇＣｔｒｌ ＥＰ」）か、もしくはエレクトロポレーションされなかった（「ＥＰなし」）による生着から１６週間後のマウスから取得された胸腺中の成熟Ｔ細胞集団のグラフを示す。図１１Ａは、ＣＤ３＋細胞の割合（ｈＣＤ４５＋に対する％）を示す。図１１Ｂは、ＣＤ４＋細胞の割合（ｈＣＤ４５＋に対する％）を示す。図１１Ｃは、ＣＤ８＋細胞の割合（ｈＣＤ４５＋に対する％）を示す。「ＮＳ」は、レベル間に統計的有意差がないことを示す。 図１２Ａ～１２Ｄは、ＣＤ５編集ｍＰＢ（「ＣＤ５ＫＯ」）、または対照ｇＲＮＡでエレクトロポレーションされた（「ｇＣｔｒｌ ＥＰ」）か、もしくはエレクトロポレーションされなかった（「ＥＰなし」）による生着から１６週間後のマウスから取得された胸腺から単離された細胞の集団におけるＣＤ５＋発現のグラフを示す。図１２Ａは、ｈＣＤ４５＋細胞に対するＣＤ５＋細胞の割合を示す。図１２Ｂは、ＣＤ３＋細胞に対するＣＤ５＋細胞の割合を示す。 図１２Ｃは、ＣＤ４＋細胞に対するＣＤ５＋細胞の割合を示す。図１２Ｄは、ＣＤ８＋細胞に対するＣＤ５＋細胞の割合を示す。各列について、上部分（薄い灰色）は、ＣＤ５陰性細胞に対応し、下部分（濃い色のグラフ）は、ＣＤ５陽性細胞に対応する。

本開示のいくつかの態様は、治療剤、例えば、免疫療法剤によって標的化される抗原の発現が欠損している、遺伝子組換え細胞、例えば、造血細胞に関連する組成物、方法、方略、および治療法を提供する。本明細書で提供される遺伝子組換え細胞は、例えば、特定の免疫療法剤に関連する特定の望ましくない効果、例えば、任意の標的上・疾患外細胞傷害性を軽減または完全に回避するために有用である。

特定の免疫療法剤に関連するかかる望ましくない効果は、例えば、免疫療法の介入を必要とする対象内の健康な細胞が免疫療法剤によって標的化される抗原を発現するときに生じ得る。例えば、対象は、典型的には健康な細胞では発現されないが、対象内の非悪性細胞のサブセットでは比較的低いレベルで発現され得る、具体的な抗原の発現の上昇したレベルに関連する悪性腫瘍と診断され得る。免疫療法剤、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞治療剤、または抗原を標的とする治療用抗体もしくは抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の対象への投与は、悪性細胞の効率的な殺傷をもたらし得るが、対象において抗原を発現する非悪性細胞の除去ももたらし得る。この標的上・疾患外細胞傷害性は、重大な副作用をもたらし、場合によっては、免疫療法剤の使用を完全に無効にし得る。

本明細書で提供される組成物、方法、方略、および治療法は、特定の免疫療法剤の標的上・疾患外細胞傷害性の問題に対処する。例えば、本開示のいくつかの態様は、免疫療法剤によって標的化される抗原、またはその抗原の具体的な形態の発現の欠如をもたらす、そのゲノムに修飾を有する遺伝子操作された細胞を提供する。かかる遺伝子操作された細胞およびその子孫は、免疫療法剤によって標的化されず、したがって、免疫療法剤によってもたらされるいかなる細胞傷害性も受けない。例えば、細胞療法剤によって標的化かつ殺傷された可能性のある健康な細胞に取って代わるために、および／または細胞療法剤による標的化に耐性がある細胞の集団を提供するために、かかる細胞を、抗原を標的とする免疫療法剤を受けている対象に投与することができる。例えば、対象における健康な造血細胞が抗原を発現する場合、抗原を発現せず、したがって、細胞治療剤によって標的化されない、本明細書で提供される遺伝子操作された造血細胞、例えば、遺伝子操作された造血幹または前駆細胞が、対象に投与され得る。かかる造血幹または前駆細胞は、対象における造血ニッチに再集合することができ、その子孫は、細胞療法剤によって除去された可能性のあるいずれかを含む、様々な造血系統を再構成することができる。

Ｌｙｔ－１とも称されるＣＤ５は、高度に保存されたスカベンジャー受容体システイン豊富（ＳＲＣＲ）スーパーファミリーに属する６７ｋＤａのＩ型膜貫通糖タンパク質である。ＣＤ５は、細胞表面に現局され、３つの予測される細胞外ドメインを含む（図１）。ＣＤ５の細胞内部分は、いずれの内因性触媒活性も欠いているが、潜在的なリン酸化調節のための残基を含む、細胞質尾部である（図１）。ＣＤ５をコードする遺伝子は、ゲノム凝集データベース（ｇｎｏｍＡＤ）を使用した分析に基づいて、タンパク質が単一のアイソフォームに存在すると報告されている、１１個のエクソンからなる。

ＣＤ５は、Ｔ細胞、胸腺細胞、およびＢ－１ａ細胞と称されるＢ細胞のサブセット上の様々な発生および活性化段階で発現される汎Ｔ細胞マーカーとみなされる。ＣＤ５は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達の強度の調節に関与し、免疫寛容およびＢ細胞受容体（ＢＣＲ）シグナル伝達の負の調節において役割を果たすと考えられている。動物実験では、ＣＤ５は、野生型マウスにおける全ての成熟Ｔ細胞ならびにＢ－１細胞上で高度に発現されるが、ＣＤ５が欠損しているマウスが健康であり、効果的な免疫応答を開始することが可能であるため、必須とはみなされないことが報告されている。Ｔａｒａｋｈｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９４）２４（７）：１６７８－１６８４を参照されたい。

健康な細胞上のその正常な発現に加えて、ＣＤ５は、様々なＴリンパ球系白血病およびリンパ腫において高度に発現される。例えば、ＣＤ５は、Ｔ細胞リンパ腫および白血病の約８５％で高度に発現されることが報告されており、慢性リンパ性白血病およびマントル細胞リンパ腫のほぼ全ての症例で検出されている。ＣＤ５発現はまた、急性骨髄性白血病の症例の約２０％で報告されている。例えば、Ｃｈａｌｌａｇｕｎｄｌａ ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．（２０１４）１４２（６）：８３７－８４４、Ｓｃｈｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ．Ｏｎｃｏｌ．（２０１９）９：１２６を参照されたい。かかる悪性細胞上の高レベルの発現に起因して、ＣＤ５は、多数の治療剤が開発されている、かかる適応症に対する免疫療法のための魅力的な標的である。例えば、現在、ＣＤ５特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ Ｔ細胞）を発現するエフェクターＴ細胞、ならびに抗体薬物コンジュゲートの使用を伴う、いくつかの継続中の臨床試験がある。

正常で健康な細胞上のＣＤ５の共有発現、ならびに悪性Ｔ細胞などの悪性細胞上の広く発現される抗原であることに起因して、ＣＤ５の治療標的化は、健康な細胞に向けた実質的な「標的上・疾患外」活性をもたらし得る。具体的な免疫療法を使用したＣＤ５の標的化は、健康なＴ細胞などの正常で健康な（非がん）細胞の殺傷に関連し、Ｔ細胞無形成と称される、一時的免疫抑制につながると報告されている。加えて、ＣＤ５特異的ＣＡＲ Ｔ細胞療法は、療法の有効性を低減する、ＣＡＲ Ｔ細胞のフラトリサイドに関連する。例えば、Ｓｃｈｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ．Ｏｎｃｏｌ．（２０１９）９：１２６を参照されたい。

本明細書では、ＣＤ５をコードする遺伝子の遺伝子修飾を特異的に誘導するために開発されたｇＲＮＡが記載される。また、本明細書では、修飾された細胞がＣＤ５特異的免疫療法によって認識されないように、ＣＤ５が欠損しているか、またはＣＤ５の発現が低減した、造血細胞、免疫細胞、リンパ球、およびかかる細胞の集団などの遺伝子組換え細胞を産生するためのかかるｇＲＮＡの使用も提供される。また、本明細書では、特定の免疫療法剤の標的上・疾患外細胞傷害性の問題に対処するために、かかる細胞またはその組成物を対象に投与することを伴う、方法も提供される。いくつかの実施例では、本明細書に記載されるように、遺伝子組換え細胞は、例えば、ＣＤ５が欠損しているか、またはＣＤ５の発現が低減し、したがって、ＣＤ５特異的免疫療法による殺傷に耐性があるＴ細胞などの系統に専念した細胞に進化することが可能である、ＣＤ５が欠損しているか、またはＣＤ５の発現が低減した造血細胞である。代替的に、または加えて、いくつかの実施例では、本明細書に記載されるように、遺伝子組換え細胞は、ＣＤ５が欠損しているか、またはＣＤ５の発現が低減し、したがって、他のＣＤ５特異的ＣＡＲ Ｔ細胞によるフラトリサイド殺傷に耐性がある、ＣＤ５特異的ＣＡＲ Ｔ細胞などの免疫細胞である。

遺伝子操作された細胞ならびに関連する組成物および方法
本開示のいくつかの態様は、ＣＤ５の発現の喪失、またはＣＤ５を標的とする免疫療法剤によって認識されないＣＤ５のバリアント型の発現をもたらす、そのゲノムにおける修飾を含む、遺伝子操作された細胞を提供する。いくつかの実施形態では、細胞のゲノムにおける修飾は、ＣＤ５をコードするゲノム配列における変異である。

本明細書で使用される場合の「変異」という用語は、参照配列、例えば、かかる変異を有していない細胞の対応する配列、または対応する野生型核酸配列と比較して、核酸配列の変化（例えば、挿入、欠失、逆位、または置換）を指す。本明細書で提供されるいくつかの実施形態では、ＣＤ５をコードする遺伝子における変異は、変異を持つ細胞におけるＣＤ５の発現の喪失をもたらす。いくつかの実施形態では、ＣＤ５をコードする遺伝子における変異は、ＣＤ５を標的とする免疫療法剤によって結合されていないか、または遺伝子によってコードされる非変異ＣＤ５形態よりも著しく低いレベルで結合されている、ＣＤ５のバリアント型の発現をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＣＤ５遺伝子におけるゲノム変異を持つ細胞は、ＣＤ５を標的とする免疫療法剤、例えば、抗ＣＤ５抗体またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）によって結合されないか、または著しく低いレベルで結合される。

本開示のいくつかの態様は、本明細書に記載される遺伝子操作された細胞、例えば、ＣＤ５の発現の喪失、またはＣＤ５を標的とする免疫療法剤によって認識されないＣＤ５のバリアント型の発現をもたらす、そのゲノムにおける修飾を含む、遺伝子操作された細胞を生成するための組成物および方法を提供する。本明細書で提供されるかかる組成物および方法は、限定されるものではないが、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼなどのＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを使用することによる、遺伝子操作された細胞のための好適な方略およびアプローチ、ならびにかかるＲＮＡ誘導ヌクレアーゼに結合し、それらを細胞のゲノム内の好適な標的部位に標的化して、ＣＤ５の発現の喪失、またはＣＤ５を標的とする免疫療法剤によって認識されないＣＤ５のバリアント型の発現をもたらす、ゲノム修飾を生じさせることが可能である好適なＲＮＡを含む。

いくつかの実施形態では、例えば、本明細書に記載される遺伝子操作された細胞（例えば、遺伝子操作された造血幹もしくは前駆細胞または遺伝子操作された免疫エフェクター細胞などの遺伝子操作された造血細胞）が、「編集」とも称される標的化された変化を細胞のゲノムに導入することが可能な任意の技術を含む、ゲノム編集技術を介して生成される。

１つの例示的な好適なゲノム編集技術は、細胞のゲノムに標的一本鎖または二本鎖ＤＮＡ切断を導入するためのＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの使用を含む、「細胞編集」であり、これは、例えば、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、マイクロホモロジー媒介末端結合（「代替ＮＨＥＪ」もしくは「ａｌｔ－ＮＨＥＪ」と称されることもあるＭＭＥＪ）、または典型的には（例えば、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド配列挿入、欠失、逆位、または置換を介して）ヌクレアーゼ切断の部位に、またはそのすぐ近位に改変された核酸配列をもたらす相同誘導型修復（ＨＤＲ）などの細胞修復機構を誘起する。Ｙｅｈ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（２０１９）２１：１４６８－１４７８、例えば、Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ（２０１４）１５７：１２６２－１２７８、Ｊａｓｉｎ ｅｔ ａｌ．ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ（２０１６）４４：６－１６、Ｓｆｅｉｒ ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．（２０１５）４０：７０１－７１４を参照されたい。

別の例示的な好適なゲノム編集技術は、「塩基編集」であり、これは、塩基エディタ、例えば、具体的な核酸塩基、例えば、細胞ミスマッチ修復機構を介して、ＣヌクレオチドからＴヌクレオチドへの変化、またはＡヌクレオチドからＧヌクレオチドへの変化をもたらす、ＣまたはＡヌクレオチドのシトシンまたはアデノシン核酸塩基を標的とし、脱アミン化する、デアミナーゼに融合されたヌクレアーゼ損傷または部分的ヌクレアーゼ損傷ＲＮＡ誘導ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質の使用を含む。例えば、Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２０１６）５３３：４２０－４２４、Ｒｅｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．（２０１８）１９（１２）：７７０－７８８、Ａｎｚａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０２０）３８：８２４－８４４を参照されたい。

更に別の例示的な好適なゲノム編集技術には、触媒的に損なわれたまたは部分的に触媒的に損なわれたＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ、例えば、操作された逆転写酵素（ＲＴ）ドメインに融合されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼを使用した、新しい遺伝情報、例えば、改変されたヌクレオチド配列の特異的に標的化されたゲノム部位への導入改を含む、「プライム編集」が含まれる。Ｃａｓ／ＲＴ融合は、所望の編集をコードする核酸配列も含み、ＲＴのためのプライマーとして機能することができる、ガイドＲＮＡによってゲノム内の標的部位に標的化される。例えば、Ａｎｚａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２０１９）５７６（７７８５）：１４９－１５７を参照されたい。

ゲノム編集技術の使用は、典型的には、いくつかの実施形態では、例えば、塩基編集またはプライム編集のために、触媒的に損なわれるか、または部分的に触媒的に損なわれ得る、好適なＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの使用を特徴とする。好適なＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの例としては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼが挙げられる。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で提供される細胞を遺伝子操作する方法で使用するための好適なＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、例えば、ｓｐＣａｓ９またはｓａＣａｓ９ヌクレアーゼである。別の例について、いくつかの実施形態では、本明細書で提供される遺伝子操作細胞の方法で使用するための好適なＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、Ｃａｓ１２ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼ（Ｃｐｆ１とも称される）である。例示的な好適なＣａｓ１２ヌクレアーゼには、限定されるものではないが、ＡｓＣａｓ１２ａ、ＦｎＣａｓ１２ａ、他のＣａｓ１２ａオルソログ、およびＭＡＤ７システム（ＭＡＤ７（商標）、Ｉｎｓｃｒｉｐｔａ，Ｉｎｃ．）、またはＡｌｔ－Ｒ Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）Ｕｌｔｒａヌクレアーゼ（Ａｌｔ－Ｒ（登録商標）Ｃａｓ１２ａ Ｕｌｔｒａ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）などのＣａｓ１２ａ誘導体が含まれる。例えば、Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．ＬＩＰＳＣＯＭＢ２０１７．Ｉｎ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ：Ｉｎｓｃｒｉｐｔａ Ｉｎｃ．、Ｐｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．（２０２０）１１７（６０）：１８０５－１８１６を参照されたい。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子操作された細胞（例えば、遺伝子操作された造血細胞、例えば、遺伝子操作された造血幹もしくは前駆細胞、または遺伝子操作された免疫エフェクター細胞など）は、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼが標的部位に結合し、細胞のゲノムＤＮＡを切断するために好適な条件下で、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはＣａｓ１２ａヌクレアーゼなどを、細胞のゲノム内の好適な標的部位に標的化することによって生成される。好適なＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、好適なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）によってゲノム内の具体的な標的部位に標的化され得る。本開示の態様によるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼを標的化するための好適なｇＲＮＡが、本明細書で提供され、例示的な好適なｇＲＮＡが、本明細書の他の場所でより詳細に記載される。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＣＤ５ ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと複合体化される。様々なＣａｓ９ヌクレアーゼが、例えば、ＣＤ５遺伝子にゲノム修飾を生成するために、本開示の態様によるゲノム編集を生じさせるために本明細書で提供されるｇＲＮＡとともに使用するために好適である。典型的には、ＣａｓヌクレアーゼおよびｇＲＮＡは、細胞のゲノム上の標的部位、例えば、ＣＤ５遺伝子内の標的部位を標的とする、Ｃａｓ／ｇＲＮＡ複合体の形成に好適な形態および条件下で提供される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ／ｇＲＮＡ複合体をＣＤ５遺伝子内の所望の標的ドメインに標的化するための所望のＰＡＭ特異性を示す、Ｃａｓヌクレアーゼが使用される。好適な標的ドメインおよび対応するｇＲＮＡ標的化ドメイン配列が、本明細書で提供される。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ／ｇＲＮＡ複合体が、例えば、インビトロで形成され、標的細胞が、例えば、細胞内へのＣａｓ／ｇＲＮＡ複合体のエレクトロポレーションを介して、Ｃａｓ／ｇＲＮＡ複合体と接触される。いくつかの実施形態では、細胞は、別々にＣａｓタンパク質およびｇＲＮＡと接触され、Ｃａｓ／ｇＲＮＡ複合体は、細胞内に形成される。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、および／またはｇＲＮＡをコードする核酸、または両方と接触される。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される遺伝子操作された細胞は、好適なゲノム編集技術を使用して生成され、ゲノム編集技術は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼの使用によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＳｐＣａｓ９）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳａＣａｓ９）、もしくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ｓｔＣａｓ９）のものであるか、またはそれらに由来する。追加の好適なＣａｓ９分子としては、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＮｍＣａｓ９）、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ属、Ｃｙｃｌｉｐｈｉｌｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ（ＣｊＣａｓ９）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｃｏｌｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ、Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｈｉｂａｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｌｉｃｈｕｍ、ｇａｍｍａ ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｕｔｏｒｕｍ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｎａｅｄｉ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ、Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ ｍｕｌｉｅｒｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉｉ、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ属、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｙｚｙｇｉｉ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ属、Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ ｍｕｅｌｌｅｒｉ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属、Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｉｎｅａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ属、Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ属、もしくはＶｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅのもの、またはそれらに由来するものが含まれる。いくつかの実施形態では、かかるＣａｓ９ヌクレアーゼの触媒的に損なわれたまたは部分的に損なわれたバリアントが、使用され得る。追加の好適なＣａｓ９ヌクレアーゼ、およびヌクレアーゼバリアントが、本開示に基づいて当業者に明らかであろう。本開示は、この点に関して限定されない。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、天然に存在するＣａｓ分子である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、例えば、少なくとも１つのアミノ酸残基だけ、参照配列、例えば、最も類似する天然に存在するＣａｓ９分子、または参照によりその全体で本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開ＷＯ２０１５／１５７０７０号の表５０の配列と異なる、操作、改変、または修飾されたＣａｓ分子である。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼのクラス２のＶ型に属するＣａｓヌクレアーゼが使用される。クラス２のＶ型Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｖ－Ａ型、Ｖ－Ｂ型、Ｖ－Ｃ型、およびＶ－Ｕ型として更に分類することができる。例えば、Ｓｔｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （２０１７）を参照されたい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃ２ｃ１などのＶ－Ｂ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。例えば、Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ（２０１５）６０：３８５－３９７を参照されたい。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるゲノム編集の方法で使用されるＣａｓヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）ヌクレアーゼなどのＶ－Ａ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。例えば、Ｓｔｒｏｈｋｅｎｄｌ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ（２０１８）７１：１－９を参照されたい。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるゲノム編集の方法で使用されるＣａｓヌクレアーゼは、Ｐｒｏｖｅｔｅｌｌａ属、もしくはＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ属、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属（ＡｓＣｐｆ１）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ細菌（ＬｐＣｐｆ１）、またはＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅに由来するＣｐｆ１ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＭＡＤ７（商標）（Ｉｎｓｃｒｉｐｔａ）である。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの天然に存在するバリアントおよび修飾されたバリアントの両方が、本開示の態様による使用に好適である。例えば、ｄＣａｓまたはニッカーゼバリアント、改変されたＰＡＭ特異性を有するＣａｓバリアント、および改善されたヌクレアーゼ活性を有するＣａｓバリアントが、本開示のいくつかの実施形態によって包含される。

いくつかの例示的で非限定的な好適なＣａｓヌクレアーゼのいくつかの特徴が、いかなる特定の理論にも拘束されることを所望することなく、本明細書により詳細に記載される。

天然に存在するＣａｓ９ヌクレアーゼは、典型的には、２つのローブ：認識（ＲＥＣ）ローブおよびヌクレアーゼ（ＮＵＣ）ローブを含み、その各々は、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／１５７０７０号、例えば、その中の図９Ａ～９Ｂ（その出願が参照によりその全体で本明細書に組み込まれる）に記載されるドメインを更に含む。

ＲＥＣローブは、アルギニン豊富ブリッジヘリックス（ＢＨ）、ＲＥＣ１ドメイン、およびＲＥＣ２ドメインを含む。ＲＥＣローブは、Ｃａｓ９特異的機能ドメインであると考えられる。ＢＨドメインは、長いアルファヘリックスおよびアルギニン豊富領域であり、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９の配列のアミノ酸６０～９３を含む。ＲＥＣ１ドメインは、例えば、ｇＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡの反復：抗反復二本鎖の認識に関与する。ＲＥＣ１ドメインは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９の配列のアミノ酸９４～１７９および３０８～７１７に２つのＲＥＣ１モチーフを含む。これら２つのＲＥＣ１ドメインは、線形一次構造ではＲＥＣ２ドメインによって分離されているが、三次構造に集合し、ＲＥＣ１ドメインを形成する。ＲＥＣ２ドメインまたはその一部はまた、反復：抗反復二本鎖の認識において役割を果たし得る。ＲＥＣ２ドメインは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９の配列のアミノ酸１８０～３０７を含む。

ＮＵＣローブは、ＲｕｖＣドメイン（本明細書ではＲｕｖＣ様ドメインとも称される）、ＨＮＨドメイン（本明細書ではＨＮＨ様ドメインとも称される）、およびＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインを含む。ＲｕｖＣドメインは、レトロウイルスインテグラーゼスーパーファミリーメンバーと構造的類似性を共有し、一本鎖、例えば、標的核酸分子の非相補鎖を切断する。ＲｕｖＣドメインは、それぞれ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９の配列のアミノ酸１～５９、７１８～７６９、および９０９～１０９８において、３つの分割ＲｕｖＣモチーフ（当技術分野ではしばしば、ＲｕｖＣＩドメイン、またはＮ末端ＲｕｖＣドメイン、ＲｕｖＣＩＩドメイン、およびＲｕｖＣＩＩＩドメインと一般的に称される、ＲｕｖＣ Ｉ、ＲｕｖＣＩＩ、およびＲｕｖＣＩＩＩ）から組み立てられる。ＲＥＣ１ドメインと同様に、３つのＲｕｖＣモチーフは、一次構造内の他のドメインによって直線的に分離されるが、三次構造では、３つのＲｕｖＣモチーフは、集合してＲｕｖＣドメインを形成する。ＨＮＨドメインは、ＨＮＨエンドヌクレアーゼと構造的類似性を共有し、一本鎖、例えば、標的核酸分子の相補鎖を切断する。ＨＮＨドメインは、ＲｕｖＣ ＩＩ－ＩＩＩモチーフの間に存在し、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９の配列のアミノ酸７７５～９０８を含む。ＰＩドメインは、標的核酸分子のＰＡＭと相互作用し、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９の配列のアミノ酸１０９９～１３６８を含む。

結晶構造が、天然に存在する細菌Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３４３（６１７６）：１２４７９９７，２０１４を参照）、およびガイドＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの合成融合）を有するＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２０１４）１５６：９３５－９４９、およびＡｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２０１４）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅｌ３５７９を参照）について決定されている。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＣａｓ９分子は、標的部位に、またはその直接近位に二本鎖ＤＮＡ切断の導入をもたらす、ヌクレアーゼ活性を示す。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、エンドヌクレアーゼの触媒残基のうちの１つを不活化するように修飾されている。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、ニッカーゼであり、一本鎖切断を生じる。例えば、Ｄａｂｒｏｗｓｋａ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（２０１８）１２（７５）を参照されたい。酵素のＲｕｖＣおよびＨＮＨ触媒ドメイン内の１つ以上の変異が、Ｃａｓ９効率を改善し得ることが示されている。例えば、Ｓａｒａｉ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔｌｙ Ｐｈａｒｍａ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１７）１８（１３）を参照されたい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、第２のドメイン、例えば、ＤＮＡまたはクロマチンを修飾するドメイン、例えば、デアミナーゼまたはデメチラーゼドメインに融合される。いくつかのかかる実施形態では、Ｃａｓ９分子は、そのエンドヌクレアーゼ活性を排除するように修飾される。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＣａｓヌクレアーゼまたはＣａｓ／ｇＲＮＡ複合体は、相同誘導型修復（ＨＤＲ）のためのテンプレートとともに投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＣａｓヌクレアーゼまたはＣａｓ／ｇＲＮＡ複合体は、ＨＤＲテンプレートを伴わずに投与される。

いくつかの実施形態では、酵素の特異性を強化する（例えば、標的外効果を低減し、堅調な標的上切断を維持する）ように修飾される、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが使用される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、強化特異性Ｃａｓ９バリアント（例えば、ｅＳＰＣａｓ９）である。例えば、Ｓｌａｙｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１６）３５１（６２６８）：８４－８８を参照されたい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、高忠実度Ｃａｓ９バリアント（例えば、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１）である。例えば、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２０１６）５２９：４９０－４９５を参照されたい。

様々なＣａｓヌクレアーゼが、当技術分野で公知であり、様々な供給源から入手され、酵素の１つ以上の活性または特異性を調節するように操作／修飾され得る。好適なＣａｓヌクレアーゼ、例えば、好適なＣａｓ９ヌクレアーゼ、例えば、ｓｐＣａｓ９およびｓａＣａｓ９などのＰＡＭ配列の選好および特異性が、当技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、１つ以上のＰＡＭ配列を認識するように操作／修飾されている。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼが操作／修飾を伴わずに認識するＰＡＭ配列とは異なる１つ以上のＰＡＭ配列を認識するように操作／修飾されている。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、酵素の標的外活性を低減するように操作／修飾されている。

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼ活性の特異性を改変する（例えば、標的外切断を低減し、細胞内のエンドヌクレアーゼ活性または存続期間を減少させ、相同誘導型組換えを増加させ、非相同末端結合を低減する）ように更に修飾される、Ｃａｓヌクレアーゼが使用される。例えば、Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ（２０１７）１６８：２０－３６を参照されたい。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼのＰＡＭ認識または選好を改変するように修飾される、Ｃａｓヌクレアーゼが使用される。例えば、ＳｐＣａｓ９が、ＰＡＭ配列ＮＧＧを認識する一方で、１つ以上の修飾を含むＳｐＣａｓ９のいくつかのバリアント（例えば、ＶＱＲ ＳｐＣａｓ９、ＥＱＲ ＳｐＣａｓ９、ＶＲＥＲ ＳｐＣａｓ９）は、バリアントＰＡＭ配列、例えば、ＮＧＡ、ＮＧＡＧ、および／またはＮＧＣＧを認識し得る。別の例について、ＳａＣａｓ９が、ＰＡＭ配列ＮＮＧＲＲＴを認識する一方で、１つ以上の修飾を含むＳａＣａｓ９のいくつかのバリアント（例えば、ＫＫＨ ＳａＣａｓ９）は、ＰＡＭ配列ＮＮＮＲＲＴを認識し得る。別の実施例では、ＦｎＣａｓ９が、ＰＡＭ配列ＮＮＧを認識する一方で、ＦｎＣａｓ９のバリアントは、１つ以上の修飾（例えば、ＲＨＡ ＦｎＣａｓ９）を含み、ＰＡＭ配列ＹＧを認識し得る。別の実施例では、置換変異Ｓ５４２ＲおよびＫ６０７Ｒを含むＣａｓ１２ａヌクレアーゼは、ＰＡＭ配列ＴＹＣＶを認識する。別の実施例では、置換変異Ｓ５４２Ｒ、Ｋ６０７Ｒ、およびＮ５５２Ｒを含むＣｐｆ１エンドヌクレアーゼは、ＰＡＭ配列ＴＡＴＶを認識する。例えば、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１７）３５（８）：７８９－７９２を参照されたい。

いくつかの実施形態では、１つより多く（例えば、２つ、３つ、またはそれ以上）のＣａｓ９分子が使用される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子のうちの少なくとも１つは、Ｃａｓ９酵素である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ分子のうちの少なくとも１つは、Ｃｐｆ１酵素である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子のうちの少なくとも１つは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子のうちの少なくとも１つは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来し、少なくとも１つのＣａｓ９分子は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓではない生物に由来する。

いくつかの実施形態では、塩基エディタが、ＣＤ５の発現の喪失、または免疫療法によって標的化されないＣＤ５バリアントの発現をもたらす、ゲノム修飾を生成するために使用される。塩基エディタは、典型的には、機能ドメイン、例えば、デアミナーゼドメインに融合された触媒的に不活性または部分的に不活性なＣａｓヌクレアーゼを含む。例えば、Ｅｉｄ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（２０１８）４７５（１１）：１９５５－１９６４、Ｒｅｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１８）１９：７７０－７８８を参照されたい。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓヌクレアーゼは、「死Ｃａｓ」または「ｄＣａｓ」と称される。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、アデニン塩基エディタ（ＡＢＥ）、例えば、ＲＮＡアデニンデアミナーゼＴａｄＡから進化したＡＢＥに融合されたｄＣａｓを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、シチジンデアミナーゼ酵素（例えば、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ、ｐｍＣＤＡ１、活性化誘発性シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ））に融合されたｄＣａｓを含む。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ分子は、低減した活性を有し、例えば、ニッカーゼ（ｎＣａｓと称される）である。

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、１つ以上のウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）ドメインに融合されたｄＣａｓ９を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、アデニン塩基エディタ（ＡＢＥ）、例えば、ＲＮＡアデニンデアミナーゼＴａｄＡから進化したＡＢＥに融合されたｄＣａｓ９を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、シチジンデアミナーゼ酵素（例えば、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ、ｐｍＣＤＡ１、活性化誘発性シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ））に融合されたｄＣａｓ９を含む。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ９分子は、低減した活性を有し、ｎＣａｓ９である。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ９分子（ｄＣａｓ９）は、１つ以上のウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）ドメインに融合される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、アデニン塩基エディタ（ＡＢＥ）、例えば、ＲＮＡアデニンデアミナーゼＴａｄＡから進化したＡＢＥに融合された不活性Ｃａｓ９分子（ｄＣａｓ９）を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、アデニン塩基エディタ（ＡＢＥ）、例えば、ＲＮＡアデニンデアミナーゼＴａｄＡから進化したＡＢＥに融合されたｎＣａｓ９を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、シチジンデアミナーゼ酵素（例えば、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ、ｐｍＣＤＡ１、活性化誘発性シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ））に融合されたｄＣａｓ９を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、シチジンデアミナーゼ酵素（例えば、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ、ｐｍＣＤＡ１、活性化誘発性シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ））に融合されたｎＣａｓ９を含む。

好適な塩基エディタの例としては、限定されるものではないが、ＢＥ１、ＢＥ２、ＢＥ３、ＨＦ－ＢＥ３、ＢＥ４、ＢＥ４ｍａｘ、ＢＥ４－Ｇａｍ、ＹＥ１－ＢＥ３、ＥＥ－ＢＥ３、ＹＥ２－ＢＥ３、ＹＥＥ－ＣＥ３、ＶＱＲ－ＢＥ３、ＶＲＥＲ－ＢＥ３、ＳａＢＥ３、ＳａＢＥ４、ＳａＢＥ４－Ｇａｍ、Ｓａ（ＫＫＨ）－ＢＥ３、Ｔａｒｇｅｔ－ＡＩＤ、Ｔａｒｇｅｔ－ＡＩＤ－ＮＧ、ｘＢＥ３、ｅＡ３Ａ－ＢＥ３、ＢＥ－ＰＬＵＳ、ＴＡＭ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｘ、ＡＢＥ７．９、ＡＢＥ７．１０、ＡＢＥ７．１０＊、ｘＡＢＥ、ＡＢＥＳａ、ＶＱＲ－ＡＢＥ、ＶＲＥＲ－ＡＢＥ、Ｓａ（ＫＫＨ）－ＡＢＥ、およびＣＲＩＳＰＲ－ＳＫＩＰが挙げられる。塩基エディタの追加の例は、例えば、参照によりそれらの全体で本明細書に組み込まれる、米国公開第２０１８／０３１２８２５Ａ１号、米国公開第２０１８／０３１２８２８Ａ１号、およびＰＣＴ公開第２０１８／１６５６２９Ａ１号で見出すことができる。

本開示のいくつかの態様は、ＣＤ５の発現の喪失、またはＣＤ５を標的とする免疫療法剤によって認識されないＣＤ５のバリアント型の発現をもたらす細胞のゲノムにおける修飾を生じさせるために、例えば、本明細書で提供されるＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを細胞のゲノム内の好適な標的部位に標的化するために好適であるガイドＲＮＡを提供する。

「ガイドＲＮＡ」および「ｇＲＮＡ」という用語は、本明細書では同義的に使用され、核酸、典型的には、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼによって結合され、標的核酸、例えば、細胞のゲノム内の標的部位へのＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの特異的標的化またはホーミングを促進するＲＮＡを指す。ｇＲＮＡは、典型的には、少なくとも２つのドメイン：ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼへの結合を媒介する「ｇＲＮＡ足場」または「ｇＲＮＡ骨格」と称されることもある（「結合ドメイン」とも称される）「結合ドメイン」、および標的部位へのｇＲＮＡ結合ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの標的化を媒介する「標的化ドメイン」を含む。いくつかのｇＲＮＡは、追加のドメイン、例えば、相補性ドメイン、またはステムループドメインを含む。天然に存在するｇＲＮＡ結合ドメインおよびその操作されたバリアントの構造および配列は、当業者に周知されている。いくつかの好適なｇＲＮＡが、単一の核酸配列を含む単分子である一方で、他の好適なｇＲＮＡは、２つの配列（例えば、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ配列）を含む。

いくつかの例示的な好適なＣａｓ９ ｇＲＮＡ足場配列が本明細書で提供され、追加の好適なｇＲＮＡ足場配列が、本開示に基づいて当業者に明らかであろう。かかる追加の好適な足場配列には、限定されるものではないが、Ｊｉｎｅｋ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１２）３３７（６０９６）：８１６－８２１、Ｒａｎ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（２０１３）８：２２８１－２３０８、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／０９３６９４号、およびＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／１７６７７２号に記載されているものが含まれる。

例えば、天然に存在するｓｐＣａｓ９ ｇＲＮＡの結合ドメインは、典型的には、ｃｒＲＮＡ（部分的に）およびｔｒａｃｒＲＮＡという２つのＲＮＡ分子を含む。例えば、テトラループを介して、またはクリックケミストリー型共有結合を介して、互いに共有結合されたｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ配列の両方を含む、単一のＲＮＡ分子のみを含むｓｐＣａｓ９ ｇＲＮＡのバリアントが、操作されており、一般的に「単一ガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」と称される。天然に存在するＣａｓ１２ａガイドＲＮＡが単一のＲＮＡ分子を含むため、他のＣａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼとともに使用するための好適なｇＲＮＡは、典型的には、単一のＲＮＡ分子のみを含む。したがって、好適なｇＲＮＡは、本明細書ではｓｇＲＮＡと称されることもある、単分子（単一のＲＮＡ分子を有する）、またはモジュール式（１つより多く、典型的には、２つの別個のＲＮＡ分子を含む）であり得る。

ＣＤ５遺伝子内の標的部位を標的とするために好適なｇＲＮＡは、いくつかのドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが使用されるいくつかの実施形態では、単分子ｓｇＲＮＡは、５’から３’まで、
ＣＤ５遺伝子内の標的部位配列に対応する標的化ドメインと、
第１の相補性ドメインと、
結合ドメインと、
第２の相補性ドメイン（第１の相補性ドメインに相補的である）と、
近位ドメインと、
任意選択的に、テールドメインと、を含む、第２の鎖とを含む。

これらのドメインの各々が、ここでより詳細に記載される。

本明細書で提供されるｇＲＮＡは、典型的には、細胞のゲノム内の標的部位に結合する標的化ドメインを含む。標的部位は、典型的には、ＰＡＭ配列と、ＰＡＭ配列と同一の鎖上に、かつそれに直接隣接して、標的ドメインとを含む、二本鎖ＤＮＡ配列である。ｇＲＮＡの標的化ドメインは、典型的には、時として１つ以上のミスマッチを伴う標的ドメインの配列に類似するが、典型的には、ＤＮＡ配列の代わりにＲＮＡを含むという点で標的ドメイン配列に対応する、ＲＮＡ配列を含む。

したがって、ｇＲＮＡの標的化ドメインは、（完全または部分的相補性で）標的ドメインの配列に相補的である二本鎖標的部位の配列と、したがって、ＰＡＭ配列を含む鎖に相補的である鎖と塩基対合する。ｇＲＮＡの標的化ドメインは、典型的には、ＰＡＭ配列を含まないことが理解されるであろう。ＰＡＭの場所は、採用されるヌクレアーゼに応じて、標的ドメイン配列の５’または３’であり得ることが更に理解されるであろう。例えば、ＰＡＭは、典型的には、Ｃａｓ９ヌクレアーゼについては標的ドメイン配列の３’、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼについては標的ドメイン配列の５’である。ＰＡＭの場所および標的部位に結合するｇＲＮＡの機構の例証については、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｖａｎｅｇａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｎｇａｌ Ｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１９；６：６の図１を参照されたい。ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを標的部位に標的化するｇＲＮＡの機構の追加の例証および説明については、両方とも参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｕ Ｙ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２０１４（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２８０８）およびＳｔｅｒｎｂｅｒｇ ＳＨ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２０１４（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅｌ３０１１）を参照されたい。

標的化ドメインは、標的ドメインの配列に対応するヌクレオチド配列、すなわち、ＰＡＭ配列に直接隣接するＤＮＡ配列（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼについてはＰＡＭ配列の５’、またはＣａｓ１２ａヌクレアーゼについてはＰＡＭ配列の３’）を含み得る。標的化ドメイン配列は、典型的には、１７～３０個のヌクレオチドを含み、標的ドメイン配列に完全に対応する（すなわち、いかなるミスマッチヌクレオチドも伴わない）か、または１つ以上であるが典型的には４つ以下のミスマッチを含み得る。標的化ドメインが、ＲＮＡ分子の一部であるため、ｇＲＮＡが、典型的には、リボヌクレオチドを含む一方で、ＤＮＡ標的化ドメインは、デオキシリボヌクレオチドを含むであろう。

２２ヌクレオチド標的ドメインおよびＮＧＧ ＰＡＭ配列を含むＣａｓ９標的部位、ならびに標的ドメインに完全に対応する（したがって、標的ドメインおよびＰＡＭを含む鎖に相補的なＤＮＡ鎖と完全な相補性で塩基対合する）標的化ドメインを含むｇＲＮＡの例示的な例証が、以下に提供される。

２２ヌクレオチド標的ドメインおよびＴＴＮ ＰＡＭ配列を含むＣａｓ１２ａ標的部位、ならびに標的ドメインに完全に対応する（したがって、標的ドメインおよびＰＡＭを含む鎖に相補的なＤＮＡ鎖と完全な相補性で塩基対合する）標的化ドメインを含むｇＲＮＡの例示的な例証が、以下に提供される。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａ ＰＡＭ配列は、５’－Ｔ－Ｔ－Ｔ－Ｖ－３’である。

理論によって拘束されることを所望しないが、少なくともいくつかの実施形態では、標的化ドメインの長さおよび標的配列との相補性は、標的核酸とのｇＲＮＡ／Ｃａｓ９分子複合体の相互作用の特異性に寄与すると考えられる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｇＲＮＡの標的化ドメインは、長さが５～５０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、長さが１５～２５個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、長さが１８～２２個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、長さが１９～２１個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、長さが１５個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、長さが１６個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、長さが１７個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、長さが１８個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、長さが１９個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、長さが２０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、長さが２１個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、長さが２２個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、長さが２３個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、長さが２４個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、長さが２５個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、ミスマッチを伴わずに、本明細書で提供される標的ドメイン配列またはその一部に完全に対応する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｇＲＮＡの標的化ドメインは、本明細書で提供される標的ドメイン配列に対して１つのミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメイン配列に対して２つのミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、標的ドメインは、標的ドメイン配列に対して３つのミスマッチを含む。

いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、例えば、参照によりその全体で組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／１５７０７０号に記載されるように、コアドメインと、二次標的化ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、コアドメインは、標的化ドメインの３’末端から約８～約１３個のヌクレオチド（例えば、標的化ドメインの最も３’位の８～１３個のヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態では、二次ドメインは、コアドメインに対して５’に位置付けられる。いくつかの実施形態では、コアドメインは、標的ドメイン配列またはその一部に完全に対応する。他の実施形態では、コアドメインは、標的ドメイン配列の対応するヌクレオチドとミスマッチである、１つ以上のヌクレオチドを含み得る。

いくつかの実施形態では、例えば、Ｃａｓ９ ｇＲＮＡが提供されるいくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、第１の相補性ドメインと、第２の相補性ドメインを含み、第１の相補性ドメインは、第２の相補性ドメインと相補的であり、少なくともいくつかの実施形態では、少なくともいくつかの生理学的条件下で二本鎖領域を形成するために、第２の相補性ドメインに対して十分な相補性を有する。いくつかの実施形態では、第１の相補性ドメインは、長さが５～３０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、第１の相補性ドメインは、５’から３’の方向に、５’サブドメイン、中央サブドメイン、および３’サブドメインである、３つのサブドメインを含む。いくつかの実施形態では、５’サブドメインは、長さが４～９個、例えば、４、５、６、７、８または９個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、中央サブドメインは、長さが１つ、２つ、または３つ、例えば、１つのヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、３’サブドメインは、長さが３～２５個、例えば、４～２２個、４～１８個、または４～１０個、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個のヌクレオチドである。第１の相補性ドメインは、天然に存在する第１の相補性ドメインと相同性を共有するか、またはそれに由来し得る。一実施形態では、これは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの第１の相補性ドメインと少なくとも５０％の相同性を有する。

上述のドメインの配列および配置は、その中のページ８８～１１２を含む、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／１５７０７０号により詳細に記載されている。

結合ドメインは、単分子ｇＲＮＡの第１の相補性ドメインを第２の相補性ドメインと結合する役割を果たし得る。結合ドメインは、第１および第２の相補性ドメインを共有結合的または非共有結合的に結合することができる。いくつかの実施形態では、結合は、共有結合である。いくつかの実施形態では、結合ドメインは、第１の相補性ドメインと第２の相補性ドメインとの間に介在する共有結合であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、結合ドメインは、１つ以上、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、結合ドメインは、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１８／１２６１７６号に開示される、少なくとも１つの非ヌクレオチド結合を含む。

いくつかの実施形態では、第２の相補性ドメインは、少なくとも部分的に、第１の相補性ドメインと相補的であり、一実施形態では、少なくともいくつかの生理学的条件下で二本鎖領域を形成するために第２の相補性ドメインに対して十分な相補性を有する。いくつかの実施形態では、第２の相補性ドメインは、第１の相補性ドメインとの相補性を欠く配列、例えば、二本鎖領域からループを作る配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、第２の相補性ドメインは、長さが５～２７個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、第２の相補性ドメインは、第１の相補性領域よりも長い。一実施形態では、相補ドメインは、長さが５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、第２の相補性ドメインは、５’から３’の方向に、５’サブドメイン、中央サブドメイン、および３’サブドメインである、３つのサブドメインを含む。いくつかの実施形態では、５’サブドメインは、長さが３～２５個、例えば、４～２２個、４～１８個、または４～１０個、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、中央サブドメインは、長さが１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ、例えば、３つのヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、３’サブドメインは、長さが４～９個、例えば、４、５、６、７、８または９個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、第１の相補性ドメインの５’サブドメインおよび３’サブドメインは、それぞれ、第２の相補性ドメインの３’サブドメインおよび５’サブドメインと相補的、例えば、完全に相補的である。

いくつかの実施形態では、近位ドメインは、長さが５～２０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、近位ドメインは、天然に存在する近位ドメインと相同性を共有するか、またはそれに由来し得る。一実施形態では、これは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓと少なくとも５０％の相同性を有する。

広範囲のテールドメインが、ｇＲＮＡで使用するために好適である。いくつかの実施形態では、テールドメインは、長さが０（不在）、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、テールドメインヌクレオチドは、天然に存在するテールドメインの５’末端からの配列に由来するか、またはそれと相同性を共有する。いくつかの実施形態では、テールドメインは、互いに相補的であり、少なくともいくつかの生理学的条件下で二本鎖領域を形成する配列を含む。いくつかの実施形態では、テールドメインは、存在しないか、または長さが１～５０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、テールドメインは、天然に存在する近位テールドメインと相同性を共有するか、またはそれに由来し得る。いくつかの実施形態では、テールドメインは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のテールドメインと少なくとも５０％の相同性／同一性を有する。いくつかの実施形態では、テールドメインは、３’末端に、インビトロまたはインビボ転写の方法に関連するヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｇＲＮＡは、
例えば、５’から３’の方向に、
標的化ドメイン（ＣＤ５遺伝子内の標的ドメインに対応する）と、
第１の相補性ドメインと、を含む、第１の鎖と、
例えば、５’から３’の方向に、
任意選択的に、５’拡張ドメインと、
第２の相補性ドメインと、
近位ドメインと、
任意選択的に、テールドメインと、を含む、第２の鎖とを含む。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｇＲＮＡのうちのいずれかは、化学的に修飾されている１つ以上のヌクレオチドを含む。ｇＲＮＡの化学修飾は、以前に記載されており、好適な化学修飾には、ｇＲＮＡ機能のために有益であり、所与のｇＲＮＡの任意の望ましくない特性、例えば、標的外効果を計測可能に増加させない、任意の修飾が含まれる。好適な化学修飾としては、例えば、ｇＲＮＡがエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ触媒活性の影響をあまり受けなくするものが挙げられ、限定されるものではないが、ホスホロチオアート骨格修飾、２’－Ｏ－Ｍｅ修飾（例えば、３’および５’末端の一方または両方における）、２’Ｆ修飾、二環式ヌクレオチド－ｃＥｔによるリボース糖の置き換え、３’チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）修飾、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。追加の好適なｇＲＮＡ修飾が、本開示に基づいて当業者に明らかとなり、かかる好適なｇＲＮＡ修飾には、限定されるものではないが、例えば、各々が参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、Ｒａｈｄａｒ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ（２０１５）１１２（５１）Ｅ７１１０－Ｅ７１１７、およびＨｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１５）；３３（９）：９８５－９８９に記載されているものが含まれる。

例えば、本明細書で提供されるｇＲＮＡは、１つ以上の２’－Ｏ修飾ヌクレオチド、例えば、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５’末端に、２’－Ｏ修飾ヌクレオチド、例えば、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの３’末端に、２’－Ｏ修飾ヌクレオチド、例えば、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５’および３’末端の両方に、２’－Ｏ修飾ヌクレオチド、例えば、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第２のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの５’末端からの第３のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾され、例えば、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第２のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端からの第３のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第３のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第２のヌクレオチド、および３’末端からの第３のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾され、例えば、ｇＲＮＡの３’末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第３のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端からの第４のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチドは、化学的に修飾されていない。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチドは、化学的に修飾された糖を有していない。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第３のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第３のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端からの第４のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル修飾される。いくつかの実施形態では、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドへのリン酸塩結合を含む。いくつかの実施形態では、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドへのホスホロチオアート結合を含む。いくつかの実施形態では、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドへのチオＰＡＣＥ結合を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｇＲＮＡは、１つ以上の２’－Ｏ修飾および３’リン修飾ヌクレオチド、例えば、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオアートヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５’末端に、２’－Ｏ修飾および３’リン修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオアートヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの３’末端に、２’－Ｏ修飾および３’リン修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオアートヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５’および３’末端に、２’－Ｏ修飾および３’リン修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオアートヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、１つ以上の非架橋酸素原子が硫黄原子に置き換えられている、骨格を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾および３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第２のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの５’末端からの第３のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオアート修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾および３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第２のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端からの第３のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオアート修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾および３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第３のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第２のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端からの第３のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオアート修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾および３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの３’末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第３のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端からの第４のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオアート修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチドは、化学的に修飾されていない。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチドは、化学的に修飾された糖を有していない。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾および３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第３のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第３のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端からの第４のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオアート修飾される。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｇＲＮＡは、１つ以上の２’－Ｏ修飾および３’－リン修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５’末端に、２’－Ｏ修飾および３’リン修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの３’末端に、２’－Ｏ修飾および３’リン修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５’および３’末端に、２’－Ｏ修飾および３’リン修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、１つ以上の非架橋酸素原子が硫黄原子に置き換えられ、１つ以上の非架橋酸素原子が酢酸基に置き換えられている、骨格を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾および３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第２のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの５’末端からの第３のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾および３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第２のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端からの第３のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾および３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第３のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第２のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端からの第３のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾および３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの３’末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第３のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端からの第４のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチドは、化学的に修飾されていない。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチドは、化学的に修飾された糖を有していない。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾および３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第３のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第３のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端からの第４のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ修飾される。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｇＲＮＡは、化学的に修飾された骨格を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ホスホロチオアート結合を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の非架橋酸素原子は、硫黄原子に置き換えられている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第２のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの５’末端からの第３のヌクレオチドは各々、ホスホロチオアート結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第２のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端からの第３のヌクレオチドは各々、ホスホロチオアート結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第３のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第２のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端からの第３のヌクレオチドは各々、ホスホロチオアート結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第３のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端からの第４のヌクレオチドは各々、ホスホロチオアート結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第２のヌクレオチド、５’末端からの第３のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第３のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端からの第４のヌクレオチドは各々、ホスホロチオアート結合を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｇＲＮＡは、チオＰＡＣＥ結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、１つ以上の非架橋酸素原子が硫黄原子に置き換えられ、１つ以上の非架橋酸素原子が酢酸基に置き換えられている、骨格を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第２のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの５’末端からの第３のヌクレオチドは各々、チオＰＡＣＥ結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第２のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端からの第３のヌクレオチドは各々、チオＰＡＣＥ結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第３のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第２のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端からの第３のヌクレオチドは各々、チオＰＡＣＥ結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第３のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端からの第４のヌクレオチドは各々、チオＰＡＣＥ結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第２のヌクレオチド、５’末端からの第３のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第３のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端からの第４のヌクレオチドは各々、チオＰＡＣＥ結合を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｇＲＮＡは、１つ以上の２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオアートヌクレオチド、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、または６個の２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオアートヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｇＲＮＡは、３つの末端位置および５’末端のうちの１つ以上に、ならびに／または３つの末端位置および３’末端のうちの１つ以上に、修飾ヌクレオチド（例えば、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオアートヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、例えば、参照によりそれらの全体で組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／２１４４６０号、同ＷＯ２０１６／０８９４３３号、および同ＷＯ２０１６／１６４３５６号に記載されるように、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。

本明細書で提供されるＣＤ５標的化ｇＲＮＡは、好適な任意の様式で細胞に送達され得る。例えば、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼに結合されたｇＲＮＡを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの送達のための様々な好適な方法が記載されており、例示的な好適な方法は、限定されるものではないが、細胞へのＲＮＰのエレクトロポレーション、細胞へのＣａｓヌクレアーゼおよびｇＲＮＡをコードするｍＲＮＡのエレクトロポレーション、様々なタンパク質または核酸トランスフェクション方法、および例えば、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）スベクターなどのウイルスベクターを介したコードするＲＮＡまたはＤＮＡの送達を含む。任意の好適な送達方法が、本開示によって包含され、本開示は、この点に関して限定されない。

本開示は、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをヒトＣＤ５に標的化するために有用である、いくつかのＣＤ５標的部位および対応するｇＲＮＡを提供する。以下の表１は、本明細書に記載されるｇＲＮＡによって結合され得るヒト内因性ＣＤ５遺伝子内の好ましい標的ドメインを例証する。

表１．ヒトＣＤ５の例示的なＣａｓ９標的部位配列が提供され、かかる部位を標的化するために有用である例示的なｇＲＮＡ標的化ドメイン配列も同様である。各標的部位について、第１の配列は、ＤＮＡ標的ドメイン配列を表し、第２の配列は、その補体を表し、第３の配列は、その逆補体を表し、第４の配列は、それぞれの標的部位を標的とするために使用され得るｇＲＮＡの例示的な標的化ドメイン配列を表す。

表２．ヒトＣＤ５の例示的なＣａｓ９標的部位配列が提供され、かかる部位を標的化するために有用である例示的なｇＲＮＡ標的化ドメイン配列も同様である。各標的部位について、第１の配列は、ＤＮＡ標的ドメイン配列を表し、第２の配列は、その補体を表し、第３の配列は、その逆補体を表し、第４の配列は、それぞれの標的部位を標的とするために使用され得るｇＲＮＡの例示的な標的化ドメイン配列を表す。

本開示は、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをヒトＣＤ５に標的化するために有用である、例示的なＣＤ５標的化ｇＲＮＡを提供する。以下の表３は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをヒト内因性ＣＤ５遺伝子に標的化するｇＲＮＡで使用するための好ましい標的化ドメインを例証する。
表３．ヒトＣＤ５を標的とするｇＲＮＡの例示的な標的化ドメイン配列が提供される。

ＣＤ５の代表的なアミノ酸配列が、以下に示されるＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０６１２７．２によって提供される。
ＭＰＭＧＳＬＱＰＬＡＴＬＹＬＬＧＭＬＶＡＳＣＬＧＲＬＳＷＹＤＰＤＦＱＡＲＬＴＲＳＮＳＫＣＱＧＱＬＥＶＹＬＫＤＧＷＨＭＶＣ
ＳＱＳＷＧＲＳＳＫＱＷＥＤＰＳＱＡＳＫＶＣＱＲＬＮＣＧＶＰＬＳＬＧＰＦＬＶＴＹＴＰＱＳＳＩＩＣＹＧＱＬＧＳＦＳＮＣＳＨＳ
ＲＮＤＭＣＨＳＬＧＬＴＣＬＥＰＱＫＴＴＰＰＴＴＲＰＰＰＴＴＴＰＥＰＴＡＰＰＲＬＱＬＶＡＱＳＧＧＱＨＣＡＧＶＶＥＦＹＳＧＳ
ＬＧＧＴＩＳＹＥＡＱＤＫＴＱＤＬＥＮＦＬＣＮＮＬＱＣＧＳＦＬＫＨＬＰＥＴＥＡＧＲＡＱＤＰＧＥＰＲＥＨＱＰＬＰＩＱＷＫＩＱ
ＮＳＳＣＴＳＬＥＨＣＦＲＫＩＫＰＱＫＳＧＲＶＬＡＬＬＣＳＧＦＱＰＫＶＱＳＲＬＶＧＧＳＳＩＣＥＧＴＶＥＶＲＱＧＡＱＷＡＡＬ
ＣＤＳＳＳＡＲＳＳＬＲＷＥＥＶＣＲＥＱＱＣＧＳＶＮＳＹＲＶＬＤＡＧＤＰＴＳＲＧＬＦＣＰＨＱＫＬＳＱＣＨＥＬＷＥＲＮＳＹＣ
ＫＫＶＦＶＴＣＱＤＰＮＰＡＧＬＡＡＧＴＶＡＳＩＩＬＡＬＶＬＬＶＶＬＬＶＶＣＧＰＬＡＹＫＫＬＶＫＫＦＲＱＫＫＱＲＱＷＩＧＰ
ＴＧＭＮＱＮＭＳＦＨＲＮＨＴＡＴＶＲＳＨＡＥＮＰＴＡＳＨＶＤＮＥＹＳＱＰＰＲＮＳＨＬＳＡＹＰＡＬＥＧＡＬＨＲＳＳＭＱＰＤ
ＮＳＳＤＳＤＹＤＬＨＧＡＱＲＬ（配列番号６４）

ＣＤ５の代表的なｃＤＮＡ配列が、以下に示されるＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿０１４２０７．４によって提供される。

本開示のいくつかの態様は、ＣＤ５の発現の喪失、またはＣＤ５を標的とする免疫療法剤によって認識されないＣＤ５のバリアント型の発現をもたらす、そのゲノムにおける修飾を含む、遺伝子操作された細胞を提供する。いくつかの実施形態では、細胞のゲノムにおける修飾は、ＣＤ５をコードするゲノム配列における変異である。いくつかの実施形態では、修飾は、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼおよび本明細書で提供されるＣＤ５標的部位を標的とするｇＲＮＡを使用する、または本明細書で提供される標的化ドメイン配列を含む、ゲノム編集を介して、影響を受ける。

本明細書で提供される組成物、方法、方略、および治療法は、任意の細胞または細胞型に適用され得るが、本発明の態様によるＣＤ５遺伝子におけるゲノム修飾に特に好適であるいくつかの例示的な細胞および細胞型が、本明細書により詳細に記載される。しかしながら、当業者は、かかる実施例の提供が、いくつかの具体的な実施形態を例証する目的のためのものであることを理解し、追加の好適な細胞および細胞型が、この点に関して限定されない、本開示に基づいて当業者に明らかであろう。

本開示のいくつかの態様は、ＣＤ５の発現の喪失、またはＣＤ５を標的とする免疫療法剤によって認識されないＣＤ５のバリアント型の発現をもたらす、そのゲノムにおける修飾を含む、遺伝子操作された造血細胞を提供する。いくつかの実施形態では、そのゲノムにおける修飾を含む遺伝子操作された細胞は、例えば、同じ細胞型であるがゲノム修飾を含まない造血細胞と比較して、ＣＤ５の細胞表面発現の低減、および／またはＣＤ５を標的とする免疫療法剤による結合の低減をもたらす。いくつかの実施形態では、造血細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）である。いくつかの実施形態では、造血細胞は、造血前駆細胞（ＨＰＣ）である。いくつかの実施形態では、造血細胞は、造血幹細胞または前駆細胞である。

いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ３４＋である。いくつかの実施形態では、細胞は、造血細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、造血幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、造血前駆細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、免疫エフェクター細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、リンパ球である。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、幹細胞である。いくつかの実施形態では、幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、間葉系幹細胞、または組織特異的幹細胞からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、細胞は、レシピエントの骨髄にＣＤ５編集造血幹細胞を生着し、かつレシピエントにおける全ての血液系細胞型の分化した子孫を生成する能力によって特徴付けられる細胞の集団に含まれる。いくつかの実施形態では、細胞集団は、少なくとも５０％の効率でレシピエントの骨髄にＣＤ５編集造血幹細胞を生着する能力によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、細胞集団は、少なくとも６０％の効率でレシピエントの骨髄にＣＤ５編集造血幹細胞を生着する能力によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、細胞集団は、少なくとも７０％の効率でレシピエントの骨髄にＣＤ５編集造血幹細胞を生着する能力によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、細胞集団は、少なくとも８０％の効率でレシピエントの骨髄にＣＤ５編集造血幹細胞を生着する能力によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、細胞集団は、少なくとも９０％の効率でレシピエントの骨髄にＣＤ５編集造血幹細胞を生着する能力によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、細胞集団は、未編集造血幹細胞の分化能力と同等である分化能によって特徴付けられるＣＤ５編集造血幹細胞を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＤ５の発現の喪失、またはＣＤ５を標的とする免疫療法剤によって認識されないＣＤ５のバリアント型の発現をもたらす、そのゲノムにおける修飾を含む造血細胞（例えば、ＨＳＣまたはＨＰＣ）が、ヌクレアーゼおよび／または本明細書に記載されるヒトＣＤ５を標的とするｇＲＮＡを使用して作成される。かかる細胞は、細胞をヌクレアーゼおよび／もしくはｇＲＮＡと接触させることによって作成され得るか、または細胞は、ヌクレアーゼおよび／もしくはｇＲＮＡと接触された細胞の娘細胞であり得ることが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細胞（例えば、遺伝子操作されたＨＳＣまたはＨＰＣ）は、ＨＳＣもしくはＨＰＣニッチに集合すること、および／または対象の造血系を再構成することが可能である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細胞（例えば、ＨＳＣまたはＨＰＣ）は、ヒト対象に生着すること、骨髄系細胞を産生すること、およびリンパ系細胞を産生することのうちの１つ以上（例えば、全て）が可能である。いくつかの好ましい実施形態では、本明細書で提供される遺伝子操作された造血細胞またはその子孫は、同じ細胞型であるが、ＣＤ５の発現の喪失、またはＣＤ５を標的とする免疫療法剤によって認識されないＣＤ５のバリアント型の発現をもたらすゲノム修飾を含まない造血細胞と比較して、好ましくは、いかなる分化バイアスも伴わずに、全ての血液細胞系統に分化することができる。

ドナー細胞をレシピエント宿主生物内に生着させると、例えば、所与のニッチ（例えば、骨髄）内の生着したドナー細胞（およびその子孫）ならびに宿主細胞の相対レベルは、宿主生物の生理学的および／または治療的転帰にとって重要であることが理解されるであろう。所与の組織またはニッチ内の宿主細胞に対する生着したドナー細胞またはその子孫のレベルは、本明細書ではキメラ現象と称される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細胞（例えば、ＨＳＣまたはＨＰＣ）は、ヒト対象に生着することが可能であり、同じ細胞型であるが、ＣＤ５の発現の喪失、またはＣＤ５を標的とする免疫療法剤によって認識されないＣＤ５のバリアント型の発現をもたらすゲノム修飾を含まない造血細胞と比較して、キメラ現象にいかなる差異も示さない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細胞（例えば、ＨＳＣまたはＨＰＣ）は、同じ細胞型であるが、ＣＤ５の発現の喪失、またはＣＤ５を標的とする免疫療法剤によって認識されないＣＤ５のバリアント型の発現をもたらすゲノム修飾を含まない造血細胞と比較して、キメラ現象に１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０％以下の差異を示す。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される遺伝子操作された細胞は、１つだけのゲノム修飾、例えば、ＣＤ５の発現の喪失、またはＣＤ５を標的とする免疫療法剤によって認識されないＣＤ５のバリアント型の発現をもたらすゲノム修飾を含む。本明細書で提供される遺伝子編集方法は、標的遺伝子の一方または両方の対立遺伝子におけるゲノム修飾をもたらし得ることが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、所与の遺伝子座の両方の対立遺伝子におけるゲノム修飾を含む、遺伝子操作された細胞が好ましい。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される遺伝子操作された細胞は、ＣＤ５の発現の喪失、またはＣＤ５を標的とする免疫療法剤によって認識されないＣＤ５のバリアント型の発現をもたらすゲノム修飾に加えて、２つ以上のゲノム修飾、例えば、１つ以上のゲノム修飾を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される遺伝子操作された細胞は、ＣＤ５の発現の喪失、またはＣＤ５を標的とする免疫療法剤によって認識されないＣＤ５のバリアント型の発現をもたらすゲノム修飾を含み、更に、例えば、細胞のゲノムに統合されたＣＡＲをコードする発現構築物の形態で、キメラ抗原受容体をコードする発現構築物を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ５に結合する、結合ドメイン、例えば、抗体断片を含む。

本開示のいくつかの態様は、ＣＤ５の発現の喪失、またはＣＤ５を標的とする免疫療法剤によって認識されないＣＤ５のバリアント型の発現をもたらす、そのゲノムにおける修飾を含む、遺伝子操作された免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、リンパ球である。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態では、Ｔリンパ球は、アルファ／ベータＴリンパ球である。いくつかの実施形態では、Ｔリンパ球は、ガンマ／デルタＴリンパ球である。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ細胞）である。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、内因性導入遺伝子、例えば、トランスジェニックタンパク質を発現しない。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ＣＤ５を標的とするＣＡＲを発現する。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ＣＤ５を標的とするＣＡＲを発現しない。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される遺伝子操作された細胞は、ＣＤ５の発現の喪失、またはＣＤ５を標的とする免疫療法剤によって認識されないＣＤ５のバリアント型の発現をもたらすゲノム修飾を含み、外因性タンパク質をコードする発現構築物を含まず、例えば、ＣＡＲをコードする発現構築物を含まない。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される遺伝子操作された細胞は、実質的にＣＤ５タンパク質を発現せず、例えば、免疫染色法などの好適な方法によって測定され得るＣＤ５タンパク質を発現しない。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される遺伝子操作された細胞は、実質的に野生型ＣＤ５タンパク質を発現しないが、変異ＣＤ５タンパク質バリアント、例えば、ＣＤ５を標的とする免疫療法剤、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞治療剤、または抗ＣＤ５抗体、抗体断片、もしくは抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）によって認識されないバリアントを発現する。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される遺伝子操作された細胞は、造血細胞、例えば、造血幹細胞、造血前駆細胞（ＨＰＣ）、造血幹または前駆細胞である。造血幹細胞（ＨＳＣ）は、多能性、自己再生性、ならびに／またはそれぞれ、骨髄細胞（例えば、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、樹状細胞、赤血球、血小板など）およびリンパ系細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）を更に生じさせる骨髄およびリンパ系前駆細胞の両方を含む、造血系の全ての系統を生成および／もしくは再構成する能力によって特徴付けられる細胞である。ＨＳＣは、ＨＳＣの同定および／または単離に使用され得る、１つ以上の細胞表面マーカー、例えば、ＣＤ３４（例えば、ＣＤ３４＋）の発現、ならびに細胞系統への関与に関連する細胞表面マーカーの不在によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子操作された細胞（例えば、遺伝子操作されたＨＳＣ）は、典型的にはＨＳＣ同定もしくは単離に関連する１つ以上の細胞表面マーカーを発現しないか、低減した量の細胞表面マーカーを発現するか、または細胞表面マーカーを標的とする免疫療法剤によって認識されないバリアント細胞表面マーカーを発現するが、それでもなお、自己再生が可能であり、造血系の全ての系統を生成および／または再構成することができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子操作された細胞の集団は、複数の遺伝子操作された造血幹細胞を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子操作された細胞の集団は、複数の遺伝子操作された造血前駆細胞を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子操作された細胞の集団は、複数の遺伝子操作された造血幹細胞および複数の遺伝子操作された造血前駆細胞を含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたＨＳＣは、ヒト対象などの対象から取得される。ＨＳＣを取得する方法は、例えば、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ出願第ＵＳ２０１６／０５７３３９号に記載されている。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、末梢血ＨＳＣである。いくつかの実施形態では、哺乳類対象は、非ヒト霊長類、齧歯類（例えば、マウスもしくはラット）、ウシ、ブタ、ウマ、または家畜である。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、造血器悪性腫瘍を有するヒト対象などのヒト対象から取得される。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、健康なドナーから取得される。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、キメラ受容体を発現する免疫細胞が後に投与されるであろう対象から取得される。細胞が取得された同じ対象に投与されるＨＳＣは、自己細胞と称される一方で、細胞が投与される対象ではない対象から取得されるＨＳＣは、同種異系細胞と称される。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細胞の集団は、細胞の異種集団、例えば、異なるＣＤ５変異を含む遺伝子操作された細胞の異種集団である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細胞の集団内のＣＤ５をコードする遺伝子のコピーの少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％は、本明細書に記載されるゲノム編集アプローチによって、例えば、本明細書で提供されるｇＲＮＡを使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによって生じさせられる変異を含む。一例として、遺伝子操作された細胞の集団は、複数の異なるＣＤ５変異を含むことができ、複数の各変異は、変異を有する細胞の集団内のＣＤ５のコピーの割合に寄与し得る。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された造血細胞上のＣＤ５の発現は、天然に存在する造血細胞（例えば、野生型対応物）上のＣＤ５の発現と比較される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作は、天然に存在する造血細胞（例えば、野生型対応物）上のＣＤ５の発現と比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のＣＤ５の発現レベルの低減をもたらす。例えば、いくつかの実施形態では、遺伝子操作された造血細胞は、天然に存在する造血細胞（例えば、野生型対応物）と比較して、ＣＤ５の２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満を発現する。

いくつかの実施形態では、例えば、本明細書に記載されるＣＤ５を標的とするｇＲＮＡを使用する、本明細書に記載される遺伝子操作は、天然に存在する造血細胞（例えば、野生型対応物）上の野生型ＣＤ５の発現のレベルと比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の野生型ＣＤ５の発現レベルの低減をもたらす。例えば、いくつかの実施形態では、遺伝子操作された造血細胞は、天然に存在する造血細胞（例えば、野生型対応物）と比較して、ＣＤ５の２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満を発現する。

いくつかの実施形態では、例えば、本明細書に記載されるＣＤ５を標的とするｇＲＮＡを使用する、本明細書に記載される遺伝子操作は、好適な対照（例えば、１つの細胞または複数の細胞）と比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の野生型系統特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ５）の発現レベルの低減をもたらす。いくつかの実施形態では、好適な対照は、同じ対象からの複数の操作されていない細胞において測定または予期される野生型系統特異的細胞表面抗原のレベルを含む。いくつかの実施形態では、好適な対照は、健康な対象からの複数の細胞において測定または予期される野生型系統特異的細胞表面抗原のレベルを含む。いくつかの実施形態では、好適な対照は、健康な個人（例えば、１０、２０、５０、または１００人の個人）のプールからの細胞の集団において測定または予期される野生型系統特異的細胞表面抗原のレベルを含む。いくつかの実施形態では、好適な対照は、本明細書に記載される治療、例えば、抗ＣＤ５療法を必要とする対象、例えば、対象ががんを有し、がんの細胞がＣＤ５を発現する、対象において測定または予期される野生型系統特異的細胞表面抗原のレベルを含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細胞を遺伝子操作する方法は、野生型細胞、例えば、野生型造血幹または前駆細胞を提供するステップを含む。いくつかの実施形態では、野生型細胞は、ＣＤ５をコードする遺伝子の２つの機能的コピーを含む（例えば、発現する）未編集の細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、配列番号６５によるＣＤ５遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、配列番号６４でコードされるＣＤ５タンパク質をコードするＣＤ５遺伝子配列を含み、例えば、ＣＤ５遺伝子配列は、配列番号６５に対して１つ以上のサイレント変異を含み得る。いくつかの実施形態では、本方法で使用される細胞は、天然に存在する細胞または操作されていない細胞である。いくつかの実施形態では、野生型細胞は、ＣＤ５を発現するか、またはＣＣＲＦ－ＣＥＭ、ＤＮＤ－４１、ＨＰＢ－ＡＬＬ、ＪＵＲＫＡＴ、ＭＯＬＴ－４、ＲＰＭＩ－８４０１、もしくはＨＬ－６０細胞などのＣＤ５を発現する細胞株と同等の（またはその９０％～１１０％、８０％～１２０％、７０％～１３０％、６０～１４０％、もしくは５０％～１５０％以内の）レベルでＣＤ５を発現する更に分化した細胞を生じさせる。いくつかの実施形態では、野生型細胞は、ＣＤ５に結合する抗体（例えば、抗ＣＤ５抗体、例えば、Ｈ６５、Ｔ１０１、抗Ｌｅｕ－１、ＴＡＢ－８８５）に結合するか、またはＣＣＲＦ－ＣＥＭ、ＤＮＤ－４１、ＨＰＢ－ＡＬＬ、ＪＵＲＫＡＴ、ＭＯＬＴ－４、ＲＰＭＩ－８４０１、もしくはＨＬ－６０細胞などのＣＤ５を発現する細胞株への抗体の結合と同等の（またはその９０％～１１０％、８０％～１２０％、７０％～１３０％、６０～１４０％、もしくは５０％～１５０％以内の）レベルでかかる抗体に結合する更に分化した細胞を生じさせる。抗体結合は、例えば、フローサイトメトリーまたは免疫組織化学によって測定され得る。

二重ｇＲＮＡ組成物およびその使用
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｇＲＮＡ（例えば、表１～３のいずれかで提供されるｇＲＮＡ）は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼをゲノム内の２つの部位に標的化するために、第２のｇＲＮＡと組み合わせて使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、細胞が、２つの薬剤：抗ＣＤ５薬剤および第２の系統特異的細胞表面抗原を標的とする薬剤に耐性を示し得るように、ＣＤ５および第２の系統特異的細胞表面抗原、例えば、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＬＬ－１、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ６、ＣＤ７、またはＢＣＭＡが欠損している造血細胞を産生することが所望され得る。いくつかの実施形態では、例えば、２回の切断を行い、２つの切断部位の間に欠失または挿入を作成するために、細胞を、ＣＤ５の異なる部位を標的とする２つの異なるｇＲＮＡと接触させることが望ましい。したがって、本開示は、ｇＲＮＡおよび関連するＣＲＩＳＰＲシステムの様々な組み合わせ、ならびにｇＲＮＡおよび関連するＣＲＩＳＰＲシステムのかかる組み合わせを使用したゲノム編集方法によって作成された細胞を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＤ５ ｇＲＮＡは、第２のｇＲＮＡとは異なるヌクレアーゼに結合する。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＤ５ ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９に結合し得、第２のｇＲＮＡは、Ｃａｓ１２ａに結合し得るか、またはその逆も同様である。

いくつかの実施形態では、第１のｇＲＮＡは、本明細書で提供されるＣＤ５ ｇＲＮＡ（例えば、表１～３のいずれかで提供されるｇＲＮＡまたはそのバリアント）であり、第２のｇＲＮＡは、以下から選択される系統特異的細胞表面抗原を標的とする：ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、Ｂ７Ｈ６、Ｂ７Ｈ３、ＣＤ２３、ＣＤ３３、ＣＤ３８、Ｃ型レクチン様分子－１、ＣＳ１、ＩＬ－５、Ｌ１－ＣＡＭ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＣＤ１３８、ＣＤ１３３、ＣＤ７０、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ１３、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＤ１１、ＣＤ１２３、ＣＤ３８６、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ４１、ＣＤ６１、ＣＤ６２、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ１４６、ＣＤ３２６、ＬＭＰ２、ＣＤ２２、ＣＤ３８２、ＣＤ１０、ＣＤ３／ＴＣＲ、ＣＤ７９／ＢＣＲ、およびＣＤ２６。

いくつかの実施形態では、第１のｇＲＮＡは、本明細書で提供されるＣＤ５ ｇＲＮＡ（例えば、表１～３のいずれか１つで提供されるｇＲＮＡまたはそのバリアント）であり、第２のｇＲＮＡは、腫瘍性もしくは悪性疾患または障害、例えば、具体的なタイプのがんに関連する系統特異的細胞表面抗原、例えば、限定されるものではないが、ＣＤ２０、ＣＤ２２（非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ））、ＣＤ３８２（Ｂ細胞性ＣＬＬ）、ＣＤ３３（急性骨髄性白血病（ＡＭＬ））、ＣＤ１０（ｇｐ１００）（一般的な（Ｂ前）急性リンパ性白血病および悪性黒色腫）、ＣＤ３／Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）（Ｔ細胞リンパ腫および白血病）、ＣＤ７９／Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）（Ｂ細胞リンパ腫および白血病）、ＣＤ２６（上皮およびリンパ性悪性腫瘍）、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ（リンパ性悪性腫瘍）、ＲＣＡＳ１（婦人科がん、胆管がん、および膵管腺がん）、ならびに前立腺特異的膜抗原を標的とする。

いくつかの実施形態では、第１のｇＲＮＡは、本明細書で提供されるＣＤ５ ｇＲＮＡ（例えば、表１～３のいずれか１つで提供されるｇＲＮＡまたはそのバリアント）であり、第２のｇＲＮＡは、以下から選択される系統特異的細胞表面抗原を標的とする：ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ１ｅ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ３ｄ、ＣＤ３ｅ、ＣＤ３ｇ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤｗ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ１７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３２ｃ、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４２ｄ、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４５ＲＣ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ３８０、ＣＤ３８１、ＣＤ３８２、ＣＤ３８３、ＣＤ３８４、ＣＤ３８５、ＣＤ３８６、ＣＤ３８７、ＣＤ３８８、ＣＤ３８９、ＣＤ６０ａ、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４ａ、ＣＤ６５、ＣＤ６５ｓ、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６Ｆ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７５Ｓ、ＣＤ７７、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５Ａ、ＣＤ８５Ｃ、ＣＤ８５Ｄ、ＣＤ８５Ｅ、ＣＤ８５Ｆ、ＣＤ８５Ｇ、ＣＤ８５Ｈ、ＣＤ８５Ｉ、ＣＤ８５Ｊ、ＣＤ８５Ｋ、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９２、ＣＤ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ９９Ｒ、ＣＤ１００、ＣＤ１０１、ＣＤ１０２、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ１０８、ＣＤ１０９、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、ＣＤ１１４、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１１８、ＣＤ１１９、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１２１ｂ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤ１２５、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤ１２９、ＣＤ１３０、ＣＤ１３１、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤ１３６、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１３９、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４、ＣＤｗ１４５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１５０、ＣＤ１５２、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１５６ａ、ＣＤ１５６ｂ、ＣＤ１５６ｃ、ＣＤ１５７、ＣＤ１５８ｂ１、ＣＤ１５８ｂ２、ＣＤ１５８ｄ、ＣＤ１５８ｅ１／ｅ２、ＣＤ１５８ｆ、ＣＤ１５８ｇ、ＣＤ１５８ｈ、ＣＤ１５８ｉ、ＣＤ１５８ｊ、ＣＤ１５８ｋ、ＣＤ１５９ａ、ＣＤ１５９ｃ、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１６３、ＣＤ１６４、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６、ＣＤ１６７ａ、ＣＤ１６８、ＣＤ１６９、ＣＤ１７０、ＣＤ１７１、ＣＤ１７２ａ、ＣＤ１７２ｂ、ＣＤ１７２ｇ、ＣＤ１７３、ＣＤ１７４、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７６、ＣＤ１７７、ＣＤ１７８、ＣＤ１７９ａ、ＣＤ１７９ｂ、ＣＤ１８０、ＣＤ１８１、ＣＤ１８２、ＣＤ１８３、ＣＤ１８４、ＣＤ１８５、ＣＤ１８６、ＣＤ１９１、ＣＤ１９２、ＣＤ１９３、ＣＤ１９４、ＣＤ１９５、ＣＤ１９６、ＣＤ１９７、ＣＤｗ１９８、ＣＤｗ１９９、ＣＤ２００、ＣＤ２０１、ＣＤ２０２ｂ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ２０４、ＣＤ２０５、ＣＤ２０６、ＣＤ２０７、ＣＤ２０８、ＣＤ２０９、ＣＤ２１０ａ、ＣＤｗ２１０ｂ、ＣＤ２１２、ＣＤ２１３ａ１、ＣＤ２１３ａ２、ＣＤ２１５、ＣＤ２１７、ＣＤ２１８ａ、ＣＤ２１８ｂ、ＣＤ２２０、ＣＤ２２１、ＣＤ２２２、ＣＤ２２３、ＣＤ２２４、ＣＤ２２５、ＣＤ２２６、ＣＤ２２７、ＣＤ２２８、ＣＤ２２９、ＣＤ２３０、ＣＤ２３１、ＣＤ２３２、ＣＤ２３３、ＣＤ２３４、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２３５ｂ、ＣＤ２３６、ＣＤ２３６Ｒ、ＣＤ２３８、ＣＤ２３９、ＣＤ２４０、ＣＤ２４１、ＣＤ２４２、ＣＤ２４３、ＣＤ２４４、ＣＤ２４５、ＣＤ２４６、ＣＤ２４７、ＣＤ２４８、ＣＤ２４９、ＣＤ２５２、ＣＤ２５３、ＣＤ２５４、ＣＤ２５６、ＣＤ２５７、ＣＤ２５８、ＣＤ２６１、ＣＤ２６２、ＣＤ２６３、ＣＤ２６４、ＣＤ２６５、ＣＤ２６６、ＣＤ２６７、ＣＤ２６８、ＣＤ２６９、ＣＤ２７０、ＣＤ２７２、ＣＤ２７２、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ２７５、ＣＤ２７６、ＣＤ２７７、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＣＤ２８０、ＣＤ２８１、ＣＤ２８２、ＣＤ２８３、ＣＤ２８４、ＣＤ２８６、ＣＤ２８８、ＣＤ２８９、ＣＤ２９０、ＣＤ２９２、ＣＤｗ２９３、ＣＤ２９４、ＣＤ２９５、ＣＤ２９６、ＣＤ２９７、ＣＤ２９８、ＣＤ２９９、ＣＤ３００ａ、ＣＤ３００ｃ、ＣＤ３００ｅ、ＣＤ３０１、ＣＤ３０２、ＣＤ３０３、ＣＤ３０４、ＣＤ３０５、ＣＤ３０６、ＣＤ３０７ａ、ＣＤ３０７ｂ、ＣＤ３０７ｃ、ＣＤ３０７ｄ、ＣＤ３０７ｅ、ＣＤ３０９、ＣＤ３１２、ＣＤ３１４、ＣＤ３１５、ＣＤ３１６、ＣＤ３１７、ＣＤ３１８、ＣＤ３１９、ＣＤ３２０、ＣＤ３２１、ＣＤ３２２、ＣＤ３２４、ＣＤ３２５、ＣＤ３２６、ＣＤ３２７、ＣＤ３２８、ＣＤ３２９、ＣＤ３３１、ＣＤ３３２、ＣＤ３３３、ＣＤ３３４、ＣＤ３３５、ＣＤ３３６、ＣＤ３３７、ＣＤ３３８、ＣＤ３３９、ＣＤ３４０、ＣＤ３４４、ＣＤ３４９、ＣＤ３５０、ＣＤ３５１、ＣＤ３５２、ＣＤ３５３、ＣＤ３５４、ＣＤ３５５、ＣＤ３５７、ＣＤ３５８、ＣＤ３５９、ＣＤ３６０、ＣＤ３６１、ＣＤ３６２、またはＣＤ３６３。

いくつかの実施形態では、第２のｇＲＮＡは、各々が参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／０６６７６０号、同ＷＯ２０１９／０４６２８５号、同ＷＯ／２０１８／１６０７６８号、またはＢｏｒｏｔ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ（２０１９）１１６（２４）１１９７８－１１９８７のいずれかに開示されるｇＲＮＡである。

投与を必要とする対象への投与の方法
本開示のいくつかの態様は、ＣＤ５の発現の喪失、またはＣＤ５を標的とする免疫療法剤によって認識されないＣＤ５のバリアント型の発現をもたらす、そのゲノムにおける修飾を含む、有効数の本明細書に記載される遺伝子操作された細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。

投与を必要とする対象は、いくつかの実施形態では、ＣＤ５を標的とする免疫療法を受けているか、または受けようとしている対象である。投与を必要とする対象は、いくつかの実施形態では、悪性細胞上のＣＤ５の発現によって特徴付けられる悪性腫瘍を有するか、または悪性腫瘍と診断された対象である。いくつかの実施形態では、かかる悪性腫瘍を有する対象は、ＣＤ５を標的とする免疫療法の候補であり得るが、有害な標的上・疾患外効果のリスクが、対象にとって予期または観察される利益を上回り得る。いくつかのかかる実施形態では、本明細書で提供される遺伝子操作された細胞が、ＣＤ５を標的とする免疫療法剤によって効率的に標的化されないため、本明細書に記載される遺伝子操作された細胞の投与は、有害な標的上・疾患外効果の改善をもたらす。

いくつかの実施形態では、悪性腫瘍は、血液悪性腫瘍、または血液のがんである。いくつかの実施形態では、悪性腫瘍は、リンパ性悪性腫瘍である。一般に、リンパ性悪性腫瘍は、Ｔ系統またはＢ系統のリンパ球などのリンパ系細胞の不適切な産生、発生、および／または機能に関連する。いくつかの実施形態では、悪性腫瘍は、細胞表面上でＣＤ５を発現する細胞に特徴付けられるか、または関連する。

いくつかの実施形態では、悪性腫瘍は、Ｔ系統がん、例えば、Ｔ細胞白血病またはＴ細胞リンパ腫などの異常Ｔリンパ球に関連する。

Ｔ細胞白血病およびＴ細胞リンパ腫の例としては、限定されるものではないが、Ｔ系統急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、ホジキンリンパ腫、もしくは非ホジキンリンパ腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、大顆粒球性白血病、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、Ｔ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ－ＰＬＬ）、Ｔ細胞性慢性リンパ性白血病、Ｔリンパ球性白血病、Ｔ細胞リンパ性白血病、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病、マントル細胞リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、未分化大細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ腫、皮膚未分化大細胞リンパ腫、腸症型Ｔ細胞リンパ腫、肝脾ガンマ・デルタＴ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、または有毛細胞白血病が挙げられる。いくつかの実施例では、悪性腫瘍は、急性Ｔ系統急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）である。

いくつかの実施形態では、悪性腫瘍は、Ｔ系統がん、例えば、Ｂ細胞白血病またはＢ細胞リンパ腫などの異常Ｂリンパ球に関連する。いくつかの実施形態では、Ｂ系統急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）または慢性リンパ性白血病（Ｂ－ＣＬＬ）である。

また、本開示の範囲内には、再発性もしくは難治Ｔ細胞悪性腫瘍またはＢ細胞悪性腫瘍などの再発性および／または難治性とみなされる悪性腫瘍がある。

投与を必要とする対象は、いくつかの実施形態では、ＣＤ５を標的とする免疫エフェクター細胞療法、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法を受けているか、または受けるであろう対象であり、免疫エフェクター細胞は、ＣＤ５を標的とするＣＡＲを発現し、免疫エフェクター細胞の少なくともサブセットもまた、その細胞表面上にＣＤ５を発現する。かかる実施形態では、免疫エフェクター細胞集団内のフラトリサイドは、免疫エフェクター細胞療法の有効性に著しく影響を及ぼし得る。本明細書で使用される場合、「フラトリサイド」という用語は、自己殺傷を指す。例えば、細胞の集団のうちの細胞が、同じ集団の細胞を殺傷するか、または殺傷を誘発する。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞療法の細胞が、免疫エフェクター細胞療法の他の細胞を殺傷するか、または殺傷を誘発する。いくつかの実施形態では、フラトリサイドは、所望の臨床転帰、例えば、対象内でＣＤ５を発現する悪性細胞の除去が達成され得る前に、免疫エフェクター細胞の一部または集団全体を除去する。いくつかのかかる実施形態では、本明細書で提供される遺伝子操作された免疫エフェクター細胞、例えば、ＣＤ５を発現しないか、またはＣＡＲによって認識されるＣＤ５バリアントを発現しない免疫エフェクター細胞を、免疫エフェクター細胞療法の基礎を形成する免疫エフェクター細胞として使用することが、かかるフラトリサイドおよび治療転帰に対する関連する悪影響を回避するであろう。かかる実施形態では、本明細書で提供される遺伝子操作された免疫エフェクター細胞、例えば、ＣＤ５を発現しないか、またはＣＡＲによって認識されるＣＤ５バリアントを発現しない免疫エフェクター細胞は、ＣＤ５標的化ＣＡＲも発現するように更に修飾され得る。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、リンパ球、例えば、Ｔリンパ球、例えば、アルファ／ベータＴリンパ球、ガンマ／デルタＴリンパ球、またはナチュラルキラーＴ細胞などであり得る。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞であり得る。

いくつかの実施形態では、ＣＤ５の発現の喪失、またはＣＤ５を標的とする免疫療法剤によって認識されないＣＤ５のバリアント型の発現をもたらす、そのゲノムにおける修飾を含む、本明細書に記載される有効数の遺伝子操作された細胞が、それを必要とする対象、例えば、ＣＤ５を標的とする免疫療法を受けているか、または受けるであろう対象に投与され、免疫療法は、例えば、ＣＤ５を発現する対象における健康な細胞に向けた細胞傷害性の形態で、有害な標的上・疾患外効果に関連するか、または関連する危険性がある。いくつかの実施形態では、有効数のかかる遺伝子操作された細胞は、抗ＣＤ５免疫療法剤と組み合わせて対象に投与され得る。

薬剤（例えば、ＣＤ５修飾細胞および抗ＣＤ５免疫療法剤）が組み合わせて投与されると、細胞および薬剤が、同時に、または異なる時間に、例えば、時間的に近接して、投与され得ることが理解される。更に、細胞および薬剤は、混合され得るか、または別個の体積もしくは剤形であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、組み合わせでの投与は、同じ治療過程における、例えば、抗ＣＤ５免疫療法を用いて対象を治療する過程における投与を含み、対象は、有効数の遺伝子操作されたＣＤ５修飾細胞を、抗ＣＤ５免疫療法と同時に、または連続的に、例えば、治療の前、間、もしくは後に投与され得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＣＤ５を標的とする免疫療法剤は、ＣＤ５に結合することが可能な抗原結合断片（例えば、一本鎖抗体）を含むキメラ抗原受容体を発現する免疫細胞である。免疫細胞は、例えば、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞）またはＮＫ細胞であり得る。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン、例えば、刺激分子に由来するものを含む、組換えポリペプチドを含むことができる。１つのいくつかの実施形態では、細胞質シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢ（すなわち、ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、および／またはＣＤ２８などの少なくとも１つの共刺激分子、またはそれらの分子の断片に由来する、１つ以上の機能的シグナル伝達ドメインを更に含む。ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、ＣＤ５結合抗体断片を含み得る。抗体断片は、１つ以上のＣＤＲ、可変領域（もしくはその部分）、定常領域（もしくはその部分）、または前述のうちのいずれかの組み合わせを含むことができる。

抗ヒトＣＤ５抗体の例示的な重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列および核酸配列が、例えば、Ｍａｍｏｎｋｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ（２０１５）１２６（８）：９８３－９９２で提供されている。下記

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、典型的には、（例えば、ＣＤ８またはＣＤ２８からの）ヒンジ領域、（例えば、ＣＤ８またはＣＤ２８からの）膜貫通ドメイン、１つ以上の共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８または４－１ＢＢ）、およびシグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ｚｅｔａ）を含み得る、例えば、ＣＡＲフレームワークに融合された抗体断片を含む、抗原結合ドメインを含む。ＣＡＲドメインおよび成分の例示的な配列が、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１９／１７８３８２号、および以下の表４で提供される。
表４：キメラ受容体の例示的な成分

いくつかの実施形態では、投与を必要とする対象に投与される本明細書で提供される遺伝子操作された細胞、例えば、ＨＳＣ、ＨＰＣ、または免疫エフェクター細胞の数は、１０^６～１０^１１の範囲内である。しかしながら、この例示的な範囲を下回るか、または上回る量もまた、本開示の範囲内である。例えば、いくつかの実施形態では、投与を必要とする対象に投与される本明細書で提供される遺伝子操作された細胞、例えば、ＨＳＣ、ＨＰＣ、または免疫エフェクター細胞の数は、約１０^６、約１０^７、約１０^８、約１０^９、約１０^１０、または約１０^１１である。いくつかの実施形態では、投与を必要とする対象に投与される本明細書で提供される遺伝子操作された細胞、例えば、ＨＳＣ、ＨＰＣ、または免疫エフェクター細胞の数は、１０^６～１０^９の範囲内、１０^６～１０^８の範囲内、１０^７～１０^９の範囲内、１０^７～１０^１０の範囲内、１０^８～１０^１０の範囲内、または１０^９～１０^１１の範囲内である。

いくつかの実施形態では、ＣＤ５を標的とする免疫療法剤は、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。ＡＤＣは、毒素または薬物分子にコンジュゲートされた抗体またはその抗原結合断片を含む分子であり得る。対応する抗原への抗体またはその断片の結合は、その細胞表面上に抗原を提示する細胞（例えば、標的細胞）への毒素または薬物分子の送達を可能にし、それによって、標的細胞の死をもたらす。

ＣＤ５に結合する好適な抗体および抗体断片が、当業者に明らかとなり、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００８／１２１１１６０号、同第ＷＯ２０１０／０２２７３７号、同第２０２０／０２３５６１号、および同第ＷＯ２００８／０２５４０２７号、ならびに例えば、Ｓｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ（１９９３）３６（５）：６２０－６３０に記載されているものを含む。

抗体薬物コンジュゲートでの使用に適合する毒素または薬物は、当技術分野で公知であり、当技術分野の当業者には明らかであろう。例えば、Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｒｅｐ．（２０１５）３５（４）：ｅ００２２５、Ｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（２０１７）１６：３１５－３３７、Ｍａｒｉｎ－Ａｃｅｖｅｄｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．（２０１８）１１：８、Ｅｌｇｕｎｄｉ ｅｔ ａｌ．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ（２０１７）１２２：２－１９を参照されたい。

いくつかの実施形態では、抗体薬物コンジュゲートは、抗体および薬物分子を付着させるリンカー（例えば、切断可能なリンカーなどのペプチドリンカー）を更に含み得る。

抗体薬物コンジュゲートのための好適な毒素または薬物の例としては、限定されるものではないが、ブレンツキシマブベドチン、グレンバツムマブべドチン／ＣＤＸ－０１１、デパツキシズマブマホドチン／ＡＢＴ－４１４、ＰＳＭＡ ＡＤＣ、ポラツズマブベドチン／ＲＧ７５９６／ＤＣＤＳ４５０１Ａ、デニンツズマブマホドチン／ＳＧＮ－ＣＤ１９Ａ、ＡＧＳ－１６Ｃ３Ｆ、ＣＤＸ－０１４、ＲＧ７８４１／ＤＬＹＥ５９５３Ａ、ＲＧ７８８２／ＤＭＵＣ４０６Ａ、ＲＧ７９８６／ＤＣＤＳ０７８０Ａ、ＳＧＮ－ＬＩＶ１Ａ、エンフォルトマブベドチン／ＡＳＧ－２２ＭＥ、ＡＧ－１５ＭＥ、ＡＧＳ６７Ｅ、テリソツズマブベドチン／ＡＢＢＶ－３９９、ＡＢＢＶ－２２１、ＡＢＢＶ－０８５、ＧＳＫ－２８５７９１６、チソツマブベドチン／ＨｕＭａｘ－ＴＦ－ＡＤＣ、ＨｕＭａｘ－Ａｘｌ－ＡＤＣ、ピナツズマブベドチン／ＲＧ７５９３／ＤＣＤＴ２９８０Ｓ、リファスツズマブベドチン／ＲＧ７５９９／ＤＮＩＢ０６００Ａ、インデュサツマブベドチン／ＭＬＮ－０２６４／ＴＡＫ－２６４、バンドルツズマブベドチン／ＲＧ７４５０／ＤＳＴＰ３０８６Ｓ、ソフィツズマブベドチン／ＲＧ７４５８／ＤＭＵＣ５７５４Ａ、ＲＧ７６００／ＤＭＯＴ４０３９Ａ、ＲＧ７３３６／ＤＥＤＮ６５２６Ａ、ＭＥ１５４７、ＰＦ－０６２６３５０７／ＡＤＣ ５Ｔ４、トラスツズマブエムタンシン／Ｔ－ＤＭ１、ミルベツキシマブソラブタンシン／ＩＭＧＮ８５３、コルツキシマブラブタンシン／ＳＡＲ３４１９、ナラツキシマブエムタンシン／ＩＭＧＮ５２９、インダツキシマブラブタンシン／ＢＴ－０６２、アネツマブラブタンシン／ＢＡＹ９４－９３４３、ＳＡＲ４０８７０１、ＳＡＲ４２８９２６、ＡＭＧ２２４、ＰＣＡ０６２、ＨＫＴ２８８、ＬＹ３０７６２２６、ＳＡＲ５６６６５８、ロルボツズマブメルタンシン／ＩＭＧＮ９０１、カンツズマブメルタンシン／ＳＢ－４０８０７５、カンツズマブラブタンシン／ＩＭＧＮ２４２、ラプリツキシマブエムタンシン／ＩＭＧＮ２８９、ＩＭＧＮ３８８、ビバツズマブメルタンシン、ＡＶＥ９６３３、ＢＩＩＢ０１５、ＭＬＮ２７０４、ＡＭＧ１７２、ＡＭＧ５９５、ＬＯＰ６２８、バダスツキシマブタリリン／ＳＧＮ－ＣＤ３３Ａ、ＳＧＮ－ＣＤ７０Ａ、ＳＧＮ－ＣＤ１９Ｂ、ＳＧＮ－ＣＤ１２３Ａ、ＳＧＮ－ＣＤ３５２Ａ、ロバルピツズマブテシリン／ＳＣ１６ＬＤ６．５、ＳＣ－００２、ＳＣ－００３、ＡＤＣＴ－３０１／ＨｕＭａｘ－ＴＡＣ－ＰＢＤ、ＡＤＣＴ－４０２、ＭＥＤＩ３７２６／ＡＤＣ－４０１、ＩＭＧＮ７７９、ＩＭＧＮ６３２、ゲムツズマブオゾガマイシン、イノツズマブオゾガマイシン／ＣＭＣ－５４４、ＰＦ－０６６４７２６３、ＣＭＤ－１９３、ＣＭＢ－４０１、トラスツズマブデュオカルマジン／ＳＹＤ９８５、ＢＭＳ－９３６５６１／ＭＤＸ－１２０３、サシツズマブゴビテカン／ＩＭＭＵ－１３２、ラベツズマブゴビテカン／ＩＭＭＵ－１３０、ＤＳ－８２０１ａ、Ｕ３－１４０２、ミラツズマブドキソルビシン／ＩＭＭＵ－１１０／ｈＬＬ１－ＤＯＸ、ＢＭＳ－９８６１４８、ＲＣ４８－ＡＤＣ／ヘルツズマブ－ｖｃ－ＭＭＡＥ、ＰＦ－０６６４７０２０、ＰＦ－０６６５０８０８、ＰＦ－０６６６４１７８／ＲＮ９２７Ｃ、ルパルツマブアマドチン／ＢＡＹ１１２９９８０、アプルツマブイキサドチン／ＢＡＹ１１８７９８２、ＡＲＸ７８８、ＡＧＳ６２Ｐ１、ＸＭＴ－１５２２、ＡｂＧｎ－１０７、ＭＥＤＩ４２７６、ＤＳＴＡ４６３７Ｓ／ＲＧ７８６１に含まれる毒素および薬物が挙げられる。

いくつかの実施形態では、細胞表面系統特異的タンパク質のエピトープへの抗体薬物コンジュゲートの結合は、抗体薬物コンジュゲートの内部化を誘発し、薬物（または毒素）は、細胞内に放出され得る。いくつかの実施形態では、細胞表面系統特異的タンパク質のエピトープへの抗体薬物コンジュゲートの結合は、毒素または薬物の内部化を誘発し、これは、毒素または薬物が系統特異的タンパク質を発現する細胞（標的細胞）を殺傷することを可能にする。いくつかの実施形態では、細胞表面系統特異的タンパク質のエピトープへの抗体薬物コンジュゲートの結合は、毒素または薬物の内部化を誘発し、これは、系統特異的タンパク質を発現する細胞（標的細胞）の活性を調節し得る。本明細書に記載される抗体薬物コンジュゲートで使用される毒素または薬物のタイプは、いかなる具体的なタイプにも限定されない。

本明細書に開示される技術の実施形態、利点、特徴、および使用のうちのいくつかが、以下の実施例からより完全に理解されるであろう。実施例は、本開示の利益のうちのいくつかを例証し、かつ特定の実施形態を説明することを意図しているが、本開示の全範囲を例示することを意図しておらず、したがって、本開示の範囲を限定しない。

実施例１：ヒト細胞におけるＣＤ５の遺伝子編集
ｓｇＲＮＡ構築物の設計
非常に低い予測標的外活性に基づいて、ＣＤ５をコードする遺伝子を標的とする約３５０個のｇＲＮＡが同定された（例えば、Ｂｅｎｃｈｌｉｎｇアルゴリズム、Ｄｏｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ ２０１６、Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ ２０１３）。全ての設計された合成ｓｇＲＮＡが、５’および３’末端の両方における３つの末端位置で、化学的に修飾されたヌクレオチドを用いて産生された。修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオアート（「ｍｓ」と省略される）を含み、ｍｓ－ｓｇＲＮＡは、ＨＰＬＣ精製された。ｓｇＲＮＡは、ＳｙｎｔｈｅｇｏまたはＡｘｏＬａｂｓから入手された。Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｙｎｔｈｅｇｏから購入された。

初代ヒトＣＤ３４＋ＨＳＣにおける編集
表１および２に示される２１個のｇＲＮＡを使用して、ＣＤ５ ｇＲＮＡのスクリーニングを実施した。動員末梢血（ｍＰＢ）に由来するＣＤ３４＋ＨＳＣを、ドナーから取得した。ＨＳＣを編集するために、約２×１０^５個の細胞をペレット化し、再懸濁させ、３ｕｇのＣａｓ９および３ｕｇのｇＲＮＡを含有するＲＮＰ複合体と混合した。Ｌｏｎｚａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ２を使用して、ＣＤ３４＋ＨＳＣをエレクトロポレーションした。

ゲノムＤＮＡ分析
全てのゲノム分析について、ＤＮＡが細胞から採取され、標的領域に隣接するプライマーで増幅され、精製されて、対立遺伝子修飾頻度が、ＴＩＤＥ（Ｔｒａｃｋｉｎｇ ｏｆ Ｉｎｄｅｌｓ ｂｙ Ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）を使用して分析された。モックトランスフェクトサンプルからの参照配列を使用して、分析が実施された。パラメータが、１０個のヌクレオチドのデフォルト最大Ｉｎｄｅｌサイズに設定され、分解ウィンドウが、高品質のトレースを伴って可能な限り最大のウィンドウを網羅するように設定された。３．５％の検出感度を下回る全てのＴＩＤＥ分析が、０％に設定された。

ヒトＣＤ３４＋細胞が、Ｃａｓ９タンパク質でエレクトロポレーションされ、上記に記載されるように、ＣＤ５標的化ｇＲＮＡを示した。

編集の割合が、ＴＩＤＥによって評価される％ＩＮＤＥＬによって決定された（図２、表５）。編集効率が、フローサイトメトリー分析から決定された。

図２に示されるように、ｇＲＮＡ ＣＤ５－４は、高い割合のＩｎｄｅｌを生じ、９１．８％の編集効率であった。
表５．ＣＤ５ ｇＲＮＡの遺伝子編集効率。

いくつかのＣＤ５ ｇＲＮＡに対する編集効率評価も、表６に示される追加のドナーから取得されたＣＤ３４＋細胞で実施された。
表６．ＣＤ５ ｇＲＮＡの遺伝子編集効率。

フローサイトメトリー分析
ＣＤ５ ｇＲＮＡ編集細胞はまた、例えば、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）によって、ＣＤ５タンパク質の表面発現について評価される。生ＣＤ３４＋ＨＳＣが、抗ＣＤ５抗体を使用してＣＤ５について染色され、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上でフローサイトメトリーによって分析される。ＣＤ５遺伝子が遺伝子組換えされている細胞は、ＦＡＣＳによって検出されるＣＤ５発現の低減を示す。

Ｔ－ＡＬＬ細胞株における編集
細胞型に基づいてＣＤ５ ｇＲＮＡの編集効率が異なっていたかどうかを評価するために、本明細書に記載されるＣＤ５ ｇＲＮＡを使用して、Ｔ－ＡＬＬ細胞株の細胞を編集した。Ｃａｓ９タンパク質およびｍｓ－ｓｇＲＮＡを（１：１の重量比で）混合し、エレクトロポレーションの前に室温で１０分間インキュベートした。ＭａｘＣｙｔｅ ＡＴｘ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、Ｍｏｌｔ－４細胞をＣａｓ９リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）でエレクトロポレーションした。細胞を、フローサイトメトリー選別まで３７℃で５～７日間インキュベートした。

Ｍｏｌｔ－４におけるいくつかのＣＤ５ ｇＲＮＡの編集効率評価が、表７に示される。これらの結果は、編集効率が異なるタイプの細胞間で一貫していたことを示す。
表７．ＣＤ５ ｇＲＮＡの遺伝子編集効率。

ＣＤ５の細胞表面レベルを、本明細書に記載されるように、フローサイトメトリーによって未編集Ｍｏｌｔ－４細胞で測定した。簡潔に述べると、ヒトＣＤ５に対する蛍光色素コンジュゲート抗体を購入した。細胞をヒトＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸの存在下で抗ＣＤ５抗体とともに氷上で３０分間インキュベートすることによって、細胞表面染色を実施した。死細胞を、ＤＡＰＩ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）染色による分析から除外した。サンプルを入手し、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を用いて分析した。

フローサイトメトリー選別については、細胞を蛍光色素コンジュゲート抗体で染色し、続いて、細胞選別装置で選別を行った。以下の表４および表８に示されるように、例示的なＣＤ５ ｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ ＣＤ５－１、ｇＲＮＡ ＣＤ５－４、およびｇＲＮＡ ＣＤ５－１８）を使用して編集されたＭｏｌｔ－４細胞は、モックエレクトロポレーション細胞（モックＥＰ）と比較して、低減したレベルのＣＤ５を示した。これらの結果は、本明細書に記載されるＣＤ５ ｇＲＮＡを用いた遺伝子編集が、ＣＤ５の表面発現の低減をもたらすことを示す。
表８．細胞選別によるＣＤ５の発現。

次いで、編集された細胞は、本明細書に記載されるインビトロ細胞傷害性アッセイを使用して、ＣＡＲＴエフェクター細胞に対する耐性について更に試験され得る。

実施例２：生存率に対するＣＤ５編集の効果
細胞生存率に対するＣＤ５のゲノム編集の効果を、ＣＤ３４＋ＨＳＣで評価した。簡潔に述べると、ＨＳＰＣを解凍し、計数し、細胞生存率を評価した。ヌクレオフェクションを、本明細書に記載されるＣＤ５ ｇＲＮＡを含む複合体を用いて実施し、実施例１に記載されるように実施した。細胞を計数し、細胞生存率を指示された時点で評価した。いくつかの例示的なＣＤ５ ｇＲＮＡの結果が、表９に示され、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ送達がＨＳＣにおいて生存率を損なわないことを示す。
表９．ＣＤ５編集ＨＳＣの生存率

実施例３：細胞ＣＤ５編集細胞の生成および評価
ＣＤ５遺伝子編集ヒトＣＤ３４＋細胞の分化能を、インビトロコロニー形成アッセイによって測定した。簡潔に述べると、ゲノム編集の数日後、実施例１に記載されるように、ＣＤ３４＋細胞を、６ウェルプレート上のメチルセルロース（ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（商標）Ｈ４０３４ Ｏｐｔｉｍｕｍ、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に２通りに播種し、２週間培養した。次いで、コロニーを計数し、ＳＴＥＭｖｉｓｉｏｎ（商標）（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してスコア付けした。

ＣＤ５について編集された細胞は、ＢＦＵ－Ｅコロニー（バースト形成単位－赤血球）およびＣＦＵ－Ｇ／Ｍ／ＧＭコロニーを産生し、このアッセイにおいて細胞が著しい分化能を保持することを示した（図３Ａおよび３Ｃ）。ＣＤ５ ｇＲＮＡの大部分は、検出可能な数のＣＦＵ－ＧＥＭＭコロニーをもたらした（図３Ｂおよび３Ｄ）。コロニー形成単位（ＣＦＵ）－Ｇ／Ｍ／ＧＭコロニーは、ＣＦＵ－Ｇ（顆粒球）、ＣＦＵ－Ｍ（マクロファージ）、およびＣＦＵ－ＧＭ（顆粒球／マクロファージ）コロニーを指す。ＣＦＵ－ＧＥＭＭ（顆粒球／赤血球／マクロファージ／巨核球）コロニーは、ＣＦＵ－ＧＭコロニーを生じさせる細胞の前駆体である、低分化細胞から生じる。まとめると、分化アッセイは、ＣＤ５編集ヒトＣＤ３４＋細胞が様々な細胞型に分化する能力を保持することを示す。

実施例４：ＣＡＲ－Ｔ細胞傷害性アッセイ
表１および２に示されるｇＲＮＡを使用して産生された遺伝子組換え細胞が、ＣＤ５－ＣＡＲＴ細胞による殺傷について評価され得る。

ＣＡＲ構築物およびレンチウイルス産生
第２世代のＣＡＲが、ＣＤ５を標的とするように構築される。例示的なＣＡＲ構築物は、ＣＤ８αシグナルペプチドを使用する細胞外ｓｃＦｖ抗原結合ドメイン、ＣＤ８αヒンジおよび膜貫通領域、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ξシグナル伝達ドメインからなる。抗ＣＤ５ ｓｃＦｖ配列は、本明細書で参照されるものなどの当技術分野で公知である任意の抗ＣＤ５抗体から取得され得る。標的のＣＡＲ ｃＤＮＡ配列が、ｐＣＤＨ－ＥＦ１α－ＭＣＳ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰ発現ベクターの多重クローニング部位にサブクローニングされ、レンチウイルスが、製造業者のプロトコル（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に従って生成される。リポフェクタミン３０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用した２９３ＴＮ細胞（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の一過性のトランスフェクションによって、レンチウイルスを生成することができる。例示的なＣＡＲ構築物は、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＩＣＯＳ膜貫通ドメイン、ＩＣＯＳシグナル伝達ドメイン、４－１ＢＢシグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ξシグナル伝達ドメインへの抗ＣＤ５ ｓｃＦｖの軽鎖および重鎖を、レンチウイルスプラスミドｐＨＩＶ－Ｚｓｇｒｅｅｎにクローニングすることによって生成される。

ＣＡＲ形質導入および増殖
ヒト初代Ｔ細胞が、製造業者のプロトコル（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って、抗ＣＤ４および抗ＣＤ８マイクロビーズを使用した磁気ビーズ分離によって、Ｌｅｕｋｏ Ｐａｋ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から単離される。精製されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞が、１：１で混合され、抗ＣＤ３／ＣＤ２８結合Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、１：１のビーズ対細胞比で活性化される。使用されるＴ細胞培養培地は、免疫細胞血清代替物、Ｌ－グルタミン、およびＧｌｕｔａＭＡＸ（全てＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入される）、ならびに１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補充したＣＴＳ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ Ｔ細胞増殖培地である。Ｔ細胞形質導入が、ポリブレン（Ｓｉｇｍａ）の存在下でのスピノキュレーションによる活性化の２４時間後に実施される。ＣＡＲ－Ｔ細胞が、凍結保存前に９日間培養される。全ての実験の前に、Ｔ細胞が解凍され、３７℃で４～６時間静置される。

フローサイトメトリーベースのＣＡＲ－Ｔ細胞傷害性アッセイ
標的細胞の細胞傷害性が、陰性対照細胞の生存に対して標的細胞の生存を比較することによって測定される。ＣＤ５細胞傷害性アッセイについては、ＭＯＬＴ－４などのＴ－ＡＬＬ細胞株の野生型およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集細胞が、標的細胞として使用される。野生型Ｒａｊｉ細胞株（ＡＴＣＣ）が、両方の実験のための陰性対照として使用される。代替的に、ＣＤ３４＋細胞が、標的細胞として使用され得、ＣＤ５が欠損しているか、またはＣＤ５の発現が低減したＣＤ３４＋細胞が、実施例１に記載されるように生成され得る。

標的細胞および陰性対照細胞が、製造業者の指示に従って、それぞれ、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）およびＣＦＳＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で染色される。染色後、標的細胞および陰性対照細胞が１：１で混合される。

抗ＣＤ５ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、エフェクターＴ細胞として使用された。非形質導入Ｔ細胞（モックＣＡＲ－Ｔ）が、対照として使用される。エフェクターＴ細胞は、１：１のエフェクター対標的比で２通りに標的細胞／陰性対照細胞混合物と共培養される。エフェクターＴ細胞を含まない標的細胞／陰性対照細胞混合物のみの群が、対照として含まれる。細胞が、フローサイトメトリー分析の前に３７℃で２４時間インキュベートされる。ヨウ化プロピジウム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）が、生存率染料として使用される。特異的細胞溶解の計算については、生標的細胞対生陰性対照細胞の分画（標的分画と称される）が使用される。特異的細胞溶解が、（（エフェクター細胞を含まない標的分画－エフェクター細胞を含む標的分画）／（エフェクターを含まない標的分画））×１００％として計算される。

実施例５：操作されたＨＳＣに対する抗ＣＤ５抗体薬物コンジュゲートの効果
表１および２に示されるｇＲＮＡを使用して産生される遺伝子組換え細胞が、テリモマブアリトックスまたはゾリモマブアリトックスなどの抗体薬物コンジュゲートによる殺傷について評価され得る。

動員された末梢血由来の凍結ＣＤ３４＋ＨＳＰＣが解凍され、Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡを含むリボ核タンパク質を用いたエレクトロポレーションの前に７２時間培養された。サンプルが、以下の条件でエレクトロポレーションされる：
ｉ．）モック（Ｃａｓ９のみ）、
ｉｉ．ＫＯ ｓｇＲＮＡ（表１または２に示されるＣＤ５ ｇＲＮＡのうちのいずれか１つなど）

細胞が、７２時間回復させられ、ゲノムＤＮＡが、収集および分析される。

ＣＤ５陽性細胞の割合が、フローサイトメトリーによって評価され、ＣＤ５ ｇＲＮＡを用いた編集がＣＤ５のノックアウトに効果的であることを確認する。ＨＳＣにおける編集事象は、様々なＩｎｄｅｌ配列をもたらす。

（ｉ）抗体薬物コンジュゲートに対するＣＤ５欠失を有する細胞の感受性
インビトロ毒性を決定するために、細胞が、培養培地中で抗体薬物コンジュゲートとともにインキュベートされ、生細胞の数が、経時的に定量化される。本明細書に記載されるＣＤ５ ｇＲＮＡを用いて生成された、ＣＤ５が欠損しているか、ＣＤ５発現が低減した操作された細胞は、全長ＣＤ５を発現する細胞（モック）よりも抗体薬物コンジュゲート治療に耐性がある。

（ｉｉ）ＣＤ３３修飾細胞の濃縮
ＣＤ５修飾細胞が抗体薬物コンジュゲートを用いた治療後に濃縮されるかどうかをアッセイするために、ＣＤ３４＋ＨＳＰＣが、５０％の標準Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ比で編集される。細胞のバルク集団が、抗体薬物コンジュゲートを用いた治療の前および後に分析される。抗体薬物コンジュゲートを用いた治療後、ＣＤ５欠損細胞の割合が増加するように、ＣＤ５修飾細胞が濃縮される。

（ｉｉｉ）ＣＤ３４＋ＨＳＰＣのインビトロ分化
細胞集団が、分化後の様々な日に、抗体薬物コンジュゲートを用いた治療の前および後のリンパ球分化について評価される。本明細書に記載されるＣＤ５ ｇＲＮＡを用いて生成された、操作されたＣＤ５ノックアウト細胞が、リンパ球分化マーカーの発現の増加を示す一方で、全長ＣＤ５を発現する細胞（モック）は、分化しない。

実施例６：インビボでのＣＤ５ＫＯ ＣＤ３４＋細胞の持続性の評価
動員された末梢血ＣＤ３４＋ＨＳＣ（ｍＰＢ ＣＤ３４＋ＨＳＰＣ）における編集
ｇＲＮＡ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）が、実施例１に記載されるように設計された。ｍＰＢ ＣＤ３４＋ＨＳＰＣが、Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒから購入され、製造業者の指示に従って解凍される。次いで、これらの細胞は、本明細書に記載されるＣＤ５標的化ｇＲＮＡ、ならびにヒトまたはマウスゲノム内の任意の領域を標的としないように設計されている非ＣＤ５標的化対照ｇＲＮＡ（ｇＣｔｒｌ）を使用して、実施例１に記載されるようにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介して編集される。

エクスビボ編集後４、２４、および４８時間に、生存能力のある編集されたＣＤ５ＫＯ細胞および対照細胞の割合が、フローサイトメトリーおよび７ＡＡＤ生存率染料を使用して定量化される。本明細書に記載されるＣＤ５ ｇＲＮＡを使用して編集された高レベルのＣＤ５ＫＯ細胞は、生存能力があり、エレクトロポレーションおよび遺伝子編集後に経時的に生存能力があるままである。これは、非ＣＤ５標的化対照ｇＲＮＡ、ｇＣｔｒｌで編集された対照細胞で観察されるものに類似する。

加えて、エクスビボ編集後４８時間に、ゲノムＤＮＡが、実施例１に記載されるように、ＩＮＤＥＬ（挿入／欠失）によって評価される編集の割合を決定するために、細胞から採取され、標的領域に隣接するプライマーでＰＣＲ増幅され、精製され、ＴＩＤＥによって分析される。

ＴＩＤＥ分析後、本明細書に記載されるＣＤ５ ｇＲＮＡを用いた編集後の長期ＨＳＣ（ＬＴ－ＨＳＣ）の割合が、フローサイトメトリーによって定量化される。指定されたＣＤ５ ｇＲＮＡを用いた編集後のＬＴ－ＨＳＣの割合が、評価される。このアッセイは、例えば、インビボでのＣＤ５ＫＯ細胞の持続性の調査のためにマウスに注射する前に、編集された細胞の凍結保存時に実施され得る。編集された細胞は、１バイアル当たり１ｍＬ体積の培地において、５×１０^６細胞／ｍＬでＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中で凍結保存される。
インビボでのＣＤ５ＫＯ ｍＰＢ ＣＤ３４＋ＨＳＰＣの生着効率および持続性の調査

６～８週齢のメスＮＳＧマウス（ＪＡＸ）が、２～７日間順応させられる。順応後、Ｘ線照射器による１７５ｃＧｙ全身照射を使用して、マウスが照射される。これは、調査の０日目とみなされた。照射後の４～１０時間に、マウスに、本明細書に記載されるＣＤ５ ｇＲＮＡのいずれかの間に生成されたＣＤ５ＫＯ細胞、またはｇＣｔｒｌで編集された対照細胞が生着される。凍結保存細胞が解凍され、ＢｉｏＲａｄ ＴＣ－２０自動細胞カウンターを使用して計数される。生細胞の数が、解凍されたバイアス内で定量化され、これは、マウスにおける生着のための細胞の総数を調製するために使用される。マウスに、１００μＬ体積において１×１０^６個の編集された細胞の単回静脈内注射が与えられる。体重および臨床観察が、４つの群内の各マウスについて週に１回記録される。

生着後の８週目および１２週目に、５０μＬの血液が、フローサイトメトリーによる分析のために、眼窩後方出血によって各マウスから収集される。生着後の１６週目に、マウスが殺処分され、血液、脾臓、および骨髄が、フローサイトメトリーによる分析のために収集される。骨髄が、大腿骨および脛骨から単離される。大腿骨由来の骨髄も、標的上編集分析に使用される。フローサイトメトリーが、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）１０カラーおよびＢＤＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェアを使用して実施される。細胞が、一般的に、最初に７ＡＡＤ生存率染料を使用して生存率別に選別され（生／死分析）、次いで、生細胞が、マウスＣＤ４５（ｍＣＤ４５）ではなくヒトＣＤ４５（ｈＣＤ４５）の発現によってゲーティングされる。次いで、ｈＣＤ４５＋である細胞が、ヒトＣＤ１９（ｈＣＤ１９）（リンパ系細胞、具体的にはＢ細胞）の発現について更にゲーティングされる。ヒトＣＤ４５（ｈＣＤ４５）を発現する細胞もゲーティングされ、骨髄系統の様々な細胞マーカーの存在について分析された。

細胞が生着された、編集された細胞にかかわらず、全てのマウスにわたって同等である分析されたマーカーの各々を発現する細胞の数は、マウスの血液中の本明細書に記載されるｇＲＮＡのうちのいずれかで編集されたＣＤ５ＫＯ細胞の成功した生着を示す。

生着後の８週目、１２週目、および１６週目に、ｈＣＤ４５＋である有核血液細胞の割合が、対照ｇＲＮＡ（ｇＣｔｒｌ）で編集された対照細胞、またはＣＤ５ＫＯ細胞を受容したマウスの群（ｎ＝１５匹のマウス／群）で定量化される。これは、ｈＣＤ４５＋絶対細胞数をマウスＣＤ４５＋（ｍＣＤ４５）絶対細胞数で割ることによって定量化される。

血液中のｈＣＤ５＋細胞の割合も、対照およびＣＤ５ＫＯマウス群において生着後の８週目に定量化された。ＣＤ５ＫＯ細胞（本明細書に記載されるＣＤ５ ｇＲＮＡのうちのいずれかで編集された）を生着されたマウスは、８、１２、および１６週目に対照細胞を生着されたマウスと比較して、著しく低いレベルのｈＣＤ５＋細胞を有すると予期される。

次に、血液中のＣＤ１９＋リンパ系細胞、ｈＣＤ１４＋単球、およびｈＣＤ１１ｂ＋顆粒球／好中球などの分化した細胞の特定の集団の割合が、ＣＤ５ＫＯ細胞または対照細胞を生着されたマウスにおける生着後の８週目、１２週目、および１６週目に定量化される。血液中のｈＣＤ１９＋細胞、ｈＣＤ１４＋細胞、およびｈＣＤ１１ｂ＋細胞のレベルは、対照群とＣＤ５ＫＯ群との間で同等であり、これらの細胞のレベルは、生着後８週目から１６週目まで同等のままであった。血液中の同等レベルのｈＣＤ１９＋、ｈＣＤ１４＋、およびｈＣＤ１１ｂ＋細胞は、類似レベルのヒト骨髄細胞およびリンパ系細胞集団が、ＣＤ５ＫＯ細胞を受容したマウスおよび対照細胞を受容したマウスに存在したことを示す。

最後に、アンプリコンシーケンスが、生着後１６週目に単離された骨髄サンプルに実施されて、編集されたＣＤ５ＫＯ細胞を生着されているマウスにおける標的上ＣＤ５標的化を分析し得る。

生着動物の脾臓から取得された細胞サンプルからの結果
生着後１６週目に、ｈＣＤ４５＋細胞の割合およびｈＣＤ５＋細胞の割合も、対照細胞またはＣＤ５ＫＯ細胞を生着されているマウスの脾臓で定量化される。マウス（対照細胞またはＣＤ５ＫＯ細胞を生着された）の群間の同等レベルのｈＣＤ４５＋細胞および低減したレベルのｈＣＤ５＋細胞は、ＮＳＧマウスの脾臓におけるＣＤ５ＫＯ ＨＳＣの長期持続性を示す。

加えて、生着後１６週目に、脾臓におけるｈＣＤ１４＋単球、ｈＣＤ１１ｂ＋顆粒球／好中球、ＣＤ１９＋リンパ系細胞、およびｈＣＤ３＋Ｔ細胞の割合が定量化される。対照群とＣＤ５ＫＯ群との間の脾臓における同等レベルのｈＣＤ１４＋細胞、ｈＣＤ１１ｂ＋細胞、ｈＣＤ１９＋細胞、およびｈＣＤ３＋は、編集されたＣＤ５ＫＯ細胞が、ＮＳＧマウスの脾臓において多系列ヒト造血細胞再構成が可能であることを示す。

好中球を評価する血液および骨髄における結果
生着後１６週目に、ｈＣＤ１１ｂ＋細胞の割合が、対照細胞またはＣＤ５ＫＯ細胞を生着されたマウスの血液および骨髄で定量化される。ＮＳＧマウスの血液および骨髄の両方における対照細胞およびＣＤ５ＫＯ細胞を生着されたマウスで観察される同等レベルのＣＤ１１ｂ＋好中球集団は、成功した生着および分化を示す。

骨髄およびリンパ系前駆細胞を評価する血液および骨髄における結果
また、１６週目に、血液中のｈＣＤ１２３＋細胞の割合および骨髄中のｈＣＤ１２３＋細胞の割合、ならびに骨髄中のｈＣＤ１０＋細胞の割合が、対照細胞またはＣＤ５ＫＯ細胞を生着されたマウスで定量化される。対照群とＣＤ５ＫＯ群との間の同等レベルの骨髄およびリンパ系前駆細胞は、成功した生着および発生を示した。

実施例７：選択ｇＲＮＡを用いたＣＤ５編集効率の評価
３つの例示的なｇＲＮＡ（それぞれ、指定されたｇＲＮＡ ＣＤ５－１、ｇＲＮＡ ＣＤ５－４、およびｇＲＮＡ ＣＤ５－１８）が、編集後の細胞の高い生存率と相まって、高い編集効率および好ましいＩＮＤＥＬパターンを有するものとして同定され、更なる特徴解析のために選択された。各々、３つの５’および３’末端残基に２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオアートヌクレオチドを含む、３つのｇＲＮＡの２つのバッチを調製した。４つの異なる細胞株（ＣＤ３４＋細胞、Ｍｏｌｔ－４細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、および初代Ｔ細胞）を、Ｃａｓ９および３つのｇＲＮＡのうちの１つを含むリボ核タンパク質複合体でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後の様々な時点で、表１０に示されるように、ＩＮＤＥＬ分析を実施した。
表１０．選択ｇＲＮＡの編集効率およびＩＮＤＥＬ情報

指示されたＣＤ５ ｇＲＮＡを用いて編集された活性化初代Ｔ細胞におけるＣＤ５細胞表面発現の変化の程度を、エレクトロポレーションの５日後にフローサイトメトリーを使用して測定した（図５）。結果は、ＣＤ５対照細胞と同等である、３つの選択されたｇＲＮＡの各々を用いたエレクトロポレーションの５日後の編集された初代Ｔ細胞上のＣＤ５表面発現のほぼ完全な喪失を示す。これらの結果は、ＣＤ５発現のＣａｓ９媒介性破壊を誘導することにおける選択されたｇＲＮＡの有効性を実証する。

（それぞれ）ＩＣＥおよびフローサイトメトリーを使用して、細胞表面における編集効率、ＣＤ５ ＲＮＡ発現、およびＣＤ５タンパク質発現を、エレクトロポレーション後２日目および５日目に初代Ｔ細胞で更に評価した（図６Ａ～６Ｃ）。結果は、ＣＤ５ ｇＲＮＡの各々が、エレクトロポレーション後２日目にＣＤ５の編集を媒介し、増加するレベルの編集された細胞が、エレクトロポレーション後５日目に見られたことを示す（図６Ａ）。３つの選択されたｇＲＮＡの各々によって誘導された編集は、ＣＤ５ ＲＮＡ発現の約５０％以上の減少を誘発した（図６Ｂ）。ＣＤ５細胞表面タンパク質発現は、エレクトロポレーション後２日目までに約１５～２０％減少し、選択されたｇＲＮＡのうちの２つについては、エレクトロポレーション後５日目にほぼ完全に存在せず、第３のｇＲＮＡが、細胞表面ＣＤ５タンパク質発現のほぼ７０％の減少を誘導した（図６Ｃ）。これらの結果は、インビトロでのＣＲＩＳＰＲ媒介性編集を誘導するためにＣＤ５ ｇＲＮＡを使用して達成された高い編集効率および著しいＣＤ５発現効果を実証する。

実施例８：ＣＤ５ノックアウト細胞をマウスに生着させることのインビボ効果
ドナー細胞をレシピエント宿主生物に移植するとき、レシピエントがドナー細胞を採用する程度、およびレシピエントが宿主細胞を保持する程度は、生理学的および治療結果にとって重要である。この実施例では、免疫不全ＮＳＧマウスを２００ｃＧｙで照射し、次いで、ＣＤ５ｇ ＲＮＡ（「ＣＤ５ ＫＯ」）で編集された１ｅ６ヒト動員末梢血細胞（ｍＰＢ）（１ｅ６細胞／マウス）を生着させた（図７）。対照として、未編集（エレクトロポレーションなし、「ＥＰなしＣｔｒｌ」）ヒトｍＰＢおよび対照ｇＲＮＡ（「ｇＣＴＲＬ」）でエレクトロポレーションされたヒトｍＰＢも、対照ＮＳＧマウスに生着させた。生着後１６週間に、マウスを殺処分し、胸腺、血液、および骨髄の細胞のキメラ現象、系統、およびＣＤ５発現を評価した。

図８Ａ～Ｂは、生着後１６週間のマウスの骨髄（図８Ａ）または末梢血（図８Ｂ）に存在するヒトキメラ現象の程度を示す。結果は、エレクトロポレーションなしｍＰＢ（ＥＰなし）、非ＣＤ５標的ｇＲＮＡ ｍＰＢ（ｇＣｔｒｌ ＥＰ）、または編集されたＣＤ５ ｍＰＢ（ＣＤ５ ＫＯ）で処置されたマウス間で同等のヒトキメラ現象があったことを示す。これは、ＣＤ５修飾が生着後のｍＰＢの採用の程度に著しい影響を及ぼさなかったことを実証する。

分裂して細胞の様々な系統に分化する生着した細胞の能力も、生理学的および治療結果にとって重要である。図９Ａ～９Ｄは、エレクトロポレーションされていないヒトｍＰＢ（ＥＰなし）、対照ｇＲＮＡでエレクトロポレーションされた細胞（ｇＣｔｒｌ ＥＰ）、または例示的なＣＤ５ ｇＲＮＡで編集されたヒトｍＰＢ（ＣＤ５ ＫＯ）を生着させてから１６週間後のマウスから取得された骨髄細胞の系統分析を示す。ヒトＣＤ４５＋細胞集団におけるＣＤ３４＋細胞の頻度（図９Ａ）、ヒトＣＤ４５＋細胞集団におけるＣＤ１９＋細胞の頻度（図９Ｂ）、ヒトＣＤ４５＋細胞集団におけるＣＤ３＋細胞の頻度（図９Ｃ）、およびヒトＣＤ４５＋細胞集団におけるＣＤ３３＋細胞の頻度（図９Ｄ）を、フローサイトメトリーを使用して評価した。結果は、ＣＤ５編集が骨髄中の系統再構成（例えば、ＣＤ３４＋、ＣＤ１９＋、ＣＤ３＋、またはＣＤ３３＋細胞系統）に実質的に影響を及ぼさなかったことを示す。

図１０Ａ～１０Ｄは、エレクトロポレーションされていないヒトｍＰＢ（ＥＰなし）、対照ｇＲＮＡでエレクトロポレーションされた細胞（ｇＣｔｒｌ ＥＰ）、または例示的なＣＤ５標的化ｇＲＮＡで編集されたヒトｍＰＢ（ＣＤ５ ＫＯ）を生着させてから１６週間後のマウスから取得された血液細胞の系統分析を示す。ヒトＣＤ４５＋細胞集団におけるＣＤ３４＋細胞の頻度（図１０Ａ）、ヒトＣＤ４５＋細胞集団におけるＣＤ１９＋細胞の頻度（図１０Ｂ）、ヒトＣＤ４５＋細胞集団におけるＣＤ３＋細胞の頻度（図１０Ｃ）、およびヒトＣＤ４５＋細胞集団におけるＣＤ３３＋細胞の頻度（図１０Ｄ）を、フローサイトメトリーを使用して評価した。結果は、ＣＤ５編集が、血液中の系統再構成（例えば、ＣＤ１９＋、ＣＤ３＋、またはＣＤ３３＋細胞系統）に実質的に影響を及ぼさず、ＣＤ３４＋血液細胞系統再構成にわずかな影響を及ぼしたことを示す。

図１１Ａ～１１Ｃは、エレクトロポレーションされていないヒトｍＰＢ（ＥＰなし）、対照ｇＲＮＡでエレクトロポレーションされた細胞（ｇＣｔｒｌ ＥＰ）、または例示的なＣＤ５標的化ｇＲＮＡで編集されたヒトｍＰＢ（ＣＤ５ ＫＯ）を生着させてから１６週間後のマウスから取得された胸腺中の成熟Ｔ細胞の頻度を示す。ヒトＣＤ４５＋細胞集団におけるＣＤ３＋細胞の頻度（図１１Ａ）、ヒトＣＤ４５＋細胞集団におけるＣＤ４＋細胞の頻度（図１１Ｂ）、およびヒトＣＤ４５＋細胞集団におけるＣＤ８＋細胞の頻度（図１１Ｃｔ）を、免疫染色を使用して評価した。結果は、ＣＤ５編集が成熟Ｔ細胞（例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、またはＣＤ８＋Ｔ細胞）の発生に著しく影響を及ぼさなかったことを示す。

図１２Ａ～１２Ｄは、エレクトロポレーションされていないヒトｍＰＢ（ＥＰなし）、対照ｇＲＮＡでエレクトロポレーションされた細胞（ｇＣｔｒｌ ＥＰ）、または例示的なＣＤ５ ｇＲＮＡで編集されたヒトｍＰＢ（ＣＤ５ ＫＯ）を生着させてから１６週間後のマウスにおける胸腺中のヒトＣＤ４５＋細胞集団、ＣＤ３＋細胞集団、ＣＤ４＋細胞集団、またはＣＤ８＋細胞集団内のＣＤ５＋（濃い灰色）およびＣＤ５－（薄い灰色）細胞の割合を示す。ＣＤ５陽性または陰性の状態を、フローサイトメトリーによって評価した。結果は、ＣＤ５損失が、ｈＣＤ４５＋細胞集団、ＣＤ３＋細胞集団、ＣＤ４＋細胞集団、およびＣＤ８＋細胞集団において少なくとも１６週間維持されることを示し、生着した細胞およびその分化した子孫（例えば、成熟Ｔ細胞）が、生着の少なくとも１６週間後に持続的に減少したＣＤ５レベルを示すことを示す。予期されるように、ＣＤ５＋細胞の減少は、ＥＰなしまたはｇＣｔｒｌ ＥＰ対照マウスでは見られなかった。結果は、ＣＤ５遺伝子へのＣＲＩＳＰＲ誘発性修飾（本開示のＣＤ５特異的ｇＲＮＡによって誘導される）を含む細胞を生着させることが、ＣＤ５編集細胞を生物に安定して導入する効果的な方法であることを示す。

参考文献
例えば、背景技術、発明の概要、発明を実施するための形態、実施例、および／または参考文献の節で、本明細書に述べられる全ての刊行物、特許、特許出願、公開、およびデータベース入力（例えば、配列データベース入力）は、各個々の刊行物、特許、特許出願、公開、およびデータベース入力が、参照により具体的かつ個別に本明細書に組み込まれた場合のように、参照によりそれらの全体で本明細書に組み込まれる。矛盾がある場合、本明細書の任意の定義を含む本出願が優先されるであろう。

均等物および範囲
当業者は、本明細書に記載される実施形態の多くの均等物を認識するか、または日常的な実験のみを使用して確認することができるであろう。本開示の範囲は、上記の説明に限定されることを意図しておらず、むしろ添付の特許請求の範囲に記載されるとおりである。

「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などの冠詞は、反対の指示がない限り、または文脈から明らかでない限り、１つまたは１つより多くを意味し得る。群の２つ以上のメンバーの間に「または」を含む、請求項または明細書は、反対の指示がない限り、または文脈から明らかでない限り、群のメンバーのうちの１つ、１つより多く、または全てが存在する場合に満たされるとみなされる。２つ以上の群のメンバーの間に「または」を含む群の開示は、群の正確に１つのメンバーが存在する実施形態、群の１つより多くのメンバーが存在する実施形態、および群のメンバーの全てが存在する実施形態を提供する。簡潔にするために、これらの実施形態は、本明細書では個別には詳述されていないが、これらの実施形態の各々は、本明細書で提供され、具体的に主張または否定され得ることが理解されるであろう。

本発明は、請求項のうちの１つ以上、または明細書の１つ以上の関連部分からの１つ以上の制限、要素、節、または説明用語が、別の請求項に導入される、全ての変形例、組み合わせ、および順列を包含することを理解されたい。例えば、別の請求項に従属する請求項は、同じ基本請求項に従属する任意の他の請求項で見出される制限のうちの１つ以上を含むように修正され得る。更に、請求項が組成物を列挙する場合、別段の指示がない限り、または矛盾もしくは不一致が生じることが当業者に明白ではない限り、本明細書に開示される作製もしくは使用方法のうちのいずれかによる、または存在する場合、当技術分野で公知の方法による、組成物を作製もしくは使用する方法が含まれることを理解されたい。

要素が、例えば、マーカッシュ群形式でリストとして提示される場合、要素の全ての可能な部分群も開示されており、任意の要素または要素の部分群が群から削除され得ることを理解されたい。また、「含む」という用語は、開放的であることを意図し、追加の要素またはステップの包含を可能にすることにも留意されたい。一般的に、実施形態、製品、または方法が、特定の要素、特徴、またはステップを含むと言及される場合、かかる要素、特徴、もしくはステップからなる、またはそれらから本質的になる実施形態、製品、または方法も同様に提供されることが理解されるべきである。簡潔にするために、これらの実施形態は、本明細書では個別には詳述されていないが、これらの実施形態の各々は、本明細書で提供され、具体的に主張または否定され得ることが理解されるであろう。

範囲が与えられる場合、終点が含まれる。更に、別段の指示がない限り、または文脈および／もしくは当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表される値は、文脈が明確に別段に指示しない限り、いくつかの実施形態では、範囲の下限の単位の１／１０まで、記載された範囲内の任意の特定の値を想定し得ることを理解されたい。簡潔にするために、各範囲内の値は、本明細書には個別に詳述されていないが、これらの値の各々は、本明細書に提供され、具体的に主張または否認され得ることが理解されるであろう。また、別段の指示がない限り、または文脈および／もしくは当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表される値は、所与の範囲内の任意の部分範囲を想定することができ、部分範囲の終点は、範囲の下限の単位の１／１０と同程度の精度で表されることも理解されたい。

加えて、本発明の任意の特定の実施形態は、請求項のうちのいずれか１つ以上から明示的に除外され得ることを理解されたい。範囲が与えられる場合、その範囲内の任意の値は、請求項のうちのいずれか１つ以上から明示的に除外され得る。本明細書に記載される組成物および／または方法の任意の実施形態、要素、特徴、用途、または態様を、いずれか１つ以上の請求項から除外することができる。簡潔にするために、１つ以上の要素、特徴、目的、または態様が除外される実施形態の全ては、本明細書に明示的に記載されていない。

Claims (45)

1. 標的化ドメインを含むｇＲＮＡであって、標的化ドメインが、表１～３のいずれかに記載される配列を含む、前記ｇＲＮＡ。
2. 標的化ドメインを含むｇＲＮＡであって、標的化ドメインが、配列番号４３～６３のうちのいずれか１つの配列を含む、前記ｇＲＮＡ。
3. ｇＲＮＡが、第１の相補性ドメイン、結合ドメイン、第１の相補性ドメインに相補的である第２の相補性ドメイン、および近位ドメインを含む、請求項１または２に記載のｇＲＮＡ。
4. ｇＲＮＡが、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項１～３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
5. ｇＲＮＡが、化学的に修飾されている１つ以上のヌクレオチド残基を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
6. ｇＲＮＡが、２’Ｏ－メチル部分を含む１つ以上のヌクレオチド残基を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
7. ｇＲＮＡが、ホスホロチオアートを含む１つ以上のヌクレオチド残基を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
8. ｇＲＮＡが、チオＰＡＣＥ部分を含む１つ以上のヌクレオチド残基を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
9. 遺伝子操作された細胞を産生する方法であって、
   ａ．細胞を提供することと、
   ｂ．前記細胞を、（ｉ）請求項１～８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡもしくは請求項１～８のいずれか一項によって標的化される標的化ドメインを標的とするｇＲＮＡ、および（ｉｉ）前記ｇＲＮＡに結合するＲＮＡ誘導ヌクレアーゼと接触させ、それにより、（ｉ）のｇＲＮＡが（ｉｉ）のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼとリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成および／または維持するために好適な、かつＲＮＰ複合体が前記細胞のゲノム内の標的ドメインに結合するために好適な条件下で、ＲＮＰ複合体を形成することを含む、前記方法。
10. ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼである、請求項９に記載の方法。
11. ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項１０に記載の方法。
12. ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼが、ｓｐＣａｓヌクレアーゼである、請求項１０に記載の方法。
13. Ｃａｓヌクレアーゼが、ｓａＣａｓヌクレアーゼである、請求項１０に記載の方法。
14. 接触させることが、予備形成されたリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の形態において（ｉ）および（ｉｉ）を細胞に導入することを含む、請求項９～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 接触させることが、（ｉ）のｇＲＮＡおよび／または（ｉｉ）のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする核酸の形態において（ｉ）および／または（ｉｉ）を細胞に導入することを含む、請求項９～１３のいずれか一項に記載の方法。
16. （ｉ）のｇＲＮＡおよび／または（ｉｉ）のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする核酸が、ＲＮＡ、好ましくは、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ類似体である、請求項９～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. リボ核タンパク質複合体が、エレクトロポレーションを介して細胞に導入される、請求項９～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 細胞が、造血細胞である、請求項９～１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 細胞が、造血幹細胞である、請求項９～１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 細胞が、造血前駆細胞である、請求項９～１８のいずれか一項に記載の方法。
21. 細胞が、免疫エフェクター細胞である、請求項９～１７のいずれか一項に記載の方法。
22. 細胞が、リンパ球である、請求項９～１７または２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 細胞が、Ｔリンパ球である、請求項９～１７、２１、または２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 遺伝子操作された細胞であって、細胞が、請求項９～２３のいずれか一項に記載の方法によって取得される、前記遺伝子操作された細胞。
25. 請求項２４に記載の遺伝子操作された細胞を含む、細胞集団。
26. 遺伝子操作された細胞を含む細胞集団であって、遺伝子操作された細胞が、表１～３のいずれかに記載されるとおりの標的化ドメインを含むｇＲＮＡに結合されたときに、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼによって切断された部位のすぐ近位の挿入または欠失からなるゲノム修飾を含む、前記細胞集団。
27. ゲノム修飾が、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）事象によって生成された挿入または欠失である、請求項２６に記載の細胞集団。
28. ゲノム修飾が、相同誘導型修復（ＨＤＲ）事象によって生成された挿入または欠失である、請求項２６に記載の細胞集団。
29. ゲノム修飾が、かかるゲノム修飾を持つ遺伝子操作された細胞におけるＣＤ５の機能喪失をもたらす、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の細胞集団。
30. ゲノム修飾が、ＣＤ５のゲノム修飾を持たない同じ細胞型の野生型細胞におけるＣＤ５の発現レベルと比較して、２５％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、２％未満、１％未満、０．１％未満、０．０１％未満、または０．００１％未満までのＣＤ５の発現の低減をもたらす、請求項２６～２９のいずれか一項に記載の細胞集団。
31. 遺伝子操作された細胞が、造血幹または前駆細胞である、請求項２６～３０のいずれか一項に記載の細胞集団。
32. 遺伝子操作された細胞が、免疫エフェクター細胞である、請求項２６～３０のいずれか一項に記載の細胞集団。
33. 遺伝子操作された細胞が、Ｔリンパ球である、請求項２６～３０または３２に記載の細胞集団。
34. 免疫エフェクター細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する、請求項３２または３３に記載の細胞集団。
35. ＣＡＲが、ＣＤ５を標的とする、請求項３４に記載の細胞集団。
36. レシピエントの骨髄にＣＤ５編集造血幹細胞を生着し、かつレシピエントにおける全ての血液系細胞型の分化した子孫を生成する能力によって特徴付けられる、請求項２６～３１のいずれか一項に記載の細胞集団。
37. 少なくとも５０％の効率でレシピエントの骨髄にＣＤ５編集造血幹細胞を生着する能力によって特徴付けられる、請求項２６～３１または３６のいずれか一項に記載の細胞集団。
38. 少なくとも６０％の効率でレシピエントの骨髄にＣＤ５編集造血幹細胞を生着する能力によって特徴付けられる、請求項２６～３１、３６、または３７のいずれか一項に記載の細胞集団。
39. 少なくとも７０％の効率でレシピエントの骨髄にＣＤ５編集造血幹細胞を生着する能力によって特徴付けられる、請求項２６～３１または３６～３８のいずれか一項に記載の細胞集団。
40. 少なくとも８０％の効率でレシピエントの骨髄にＣＤ５編集造血幹細胞を生着する能力によって特徴付けられる、請求項２６～３１または３６～３９のいずれか一項に記載の細胞集団。
41. 少なくとも９０％の効率でレシピエントの骨髄にＣＤ５編集造血幹細胞を生着する能力によって特徴付けられる、請求項２６～３１または３６～４０のいずれか一項に記載の細胞集団。
42. 前記細胞集団が、未編集造血幹細胞の分化能力と同等である分化能によって特徴付けられるＣＤ５編集造血幹細胞を含む、請求項２６～３１または３６～４１のいずれか一項に記載の細胞集団。
43. 請求項２４に記載の遺伝子操作された細胞または請求項２５～４２のいずれか一項に記載の細胞集団を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
44. 対象が、造血器悪性腫瘍を有するか、または造血器悪性腫瘍と診断されている、請求項４３に記載の方法。
45. 有効量のＣＤ５を標的とする薬剤を対象に投与することを更に含み、薬剤が、ＣＤ５に結合する抗原結合断片を含む、請求項４３または４４に記載の方法。