KR20210021943A - 미립자 제형용 동결 방지제 - Google Patents

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KR20210021943A
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KR
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mrna
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therapeutically active
liquid phase
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KR1020207030471A
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크리스티안 도멘
필립 벡
Original Assignee
에트리스 게엠베하
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Abstract

(i) 액체 상에 현탁된 치료적 활성제의 나노입자 또는 미세입자 제형, 및 (ii) 입자 제형을 안정화시키는 1개 또는 2개의 하이드록시 그룹으로 치환된 C3-C5 알칸으로부터 선택된 적어도 하나의 동결 방지 첨가제를 포함하는 조성물이 제공된다. 추가의 측면은 안정화된 조성물을 동결시킴으로써 수득될 수 있는 고체 조성물 및 본 발명에 따르는 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

미립자 제형용 동결 방지제
본 발명은 치료적 활성제의 입자 제형, 특히 나노 입자 또는 미세입자를 포함하는 제형을 포함하는 조성물의 안정화에 관한 것이다.
나노 입자 및 미세입자 제형은 치료적 활성제가 기도에 또는 기도를 통해 적용함으로써 체내로 들어갈 수 있도록 하는 능력으로 공지되어 있다. 그러나, 나노 입자 또는 미세입자로서 제형화된 많은 활성제는 실온에서, 심지어 냉장 상태(예: 2 내지 8℃)에서 제한된 안정성 문제를 겪는다. 동결된 제형은 장기간 안정성을 상당히 개선시키고, 따라서 나노 입자 또는 미세입자로서 제형화된 치료적 활성제의 이용가능성을 개선시킨다. 그러나, 동결은 일반적으로 기능의 손실이 동반되는 응집 프로세스를 유도한다. 종래의 동결 방지 첨가제의 첨가가 동결 동안 입자 응집을 방지하지만(예를 들어, W. Abdelwahed et al., Adv. Drug Del. Rev. 58 (2006), 1688-1713; J.C. Kasper et al., J. Contr. Rel. 151 (2011), 246-255), 생성되는 제형이 폐 적용 후 기능적이지 않다는 문제가 남는다. 따라서, 기도에 또는 기도를 통한 적용을 위한 기능성을 유지하면서 동결 동안 나노 입자 또는 미세입자의 안정화는 당과 같은 표준 동결방지제로 확실하게 달성될 수 없었다.
본 발명의 맥락에서, 기도에 또는 기도를 통해 적용 동안 기능성을 유지하면서 나노 입자 또는 미세입자 제형의 동결을 예기치 않게 가능하게 하는 첨가제 부류가 동정되었다. 입자 제형과 이러한 동결 방지 첨가제를 조합하는 조성물은 제형이 그들의 적용 전에 고체 동결 상태로 편리하게 저장되고/되거나 고체 동결 상태로 이송되도록 한다.
따라서, 본 발명은, 제1 측면에 따라서,
(i) 액체 상에 현탁된 치료적 활성제의 나노입자 또는 미세입자 제형, 및
(ii) 1개 또는 2개의 하이드록시 그룹으로 치환된 C3-C5 알칸으로부터 선택된 적어도 하나의 동결 방지 첨가제(cryoprotective additive)를 포함하는 조성물을 제공한다.
제2 측면에 따라서, 본 발명은
(i) 치료적 활성제의 나노입자 또는 미세입자 제형, 및
(ii) 1개 또는 2개의 하이드록시 그룹으로 치환된 C3-C5 알칸으로부터 선택된 적어도 하나의 동결 방지 첨가제를 포함하고,
상기 제1 측면에 따르는 조성물을 동결시킴으로써 수득될 수 있는 조성물을 제공한다.
하기에서, 제1 측면에 따르는 조성물은 또한 본원에서 "현탁액 조성물"로서 지칭될 수 있고, 제2 측면에 따르는 조성물은 "고체 조성물"로서 지칭될 수 있다.
본 발명의 추가의 측면은 상기 제1 측면에 따라는 조성물의 제조 방법으로서, 상기 방법이
a) 액체 상에 현탁된 치료적 활성제의 나노 입자 또는 미세입자 제형을 제공 하는 단계, 및
b) 1개 또는 2개의 하이드록시 그룹으로 치환된 C3-C5 알칸으로부터 선택된 적어도 하나의 동결 방지 첨가제를 상기 액체 상에 첨가하는 단계로서, 상기 동결 방지 첨가제의 상기 액체 상에의 첨가가 액체 상에 현탁된 나노 입자 또는 미세입자 제형을 제공하기 전, 제공하는 동안 또는 제공한 후에 달성될 수 있는, 단계를 포함하는, 제조 방법에 관한 것이다.
유사하게, 본 발명은 추가의 측면에 따라서 상기 제2 측면에 따르는 고체 조성물의 제조 방법으로서, 상기 방법이
a) 액체 상에 현탁된 치료적 활성제의 나노 입자 또는 미세입자 제형을 제공하는 단계, 및
b) 1개 또는 2개의 하이드록시 그룹으로 치환된 C3-C5 알칸으로부터 선택된 적어도 하나의 동결 방지 첨가제를 액체 상에 첨가하는 단계로서, 상기 동결 방지 첨가제의 상기 액체 상에의 첨가가 액체 상에 현탁된 나노 입자 또는 미세입자 제형을 제공하기 전, 제공하는 동안 또는 제공한 후에 달성될 수 있는, 단계를 포함하는 공정에 의해 상기 제1 측면에 따르는 조성물을 제공하는 제1 단계 및
상기 제1 단계에서 수득된 조성물을 동결시키는 제2 단계를 포함하는, 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 측면은 치료적 활성제의 나노 입자 또는 미세입자 제형의 보존 방법으로서, 상기 방법이 상기 제1 측면에 따르는 현탁액 조성물을 제공하는 단계, 및 상기 조성물을 동결시키는 단계를 포함하는, 보존 방법에 관한 것이다. 또한, 추가의 측면은 치료적 활성제의 나노 입자 또는 미세입자 제형을 포함하는 조성물을 위한 동결 방지 첨가제로서의 1개 또는 2개의 하이드록시 그룹으로 치환된 C3-C5 알칸으로부터 선택된 화합물의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 추가의 측면은 액체에 현탁된 미립자 조성물(particulate composition)로부터 에어로졸을 형성하거나 이러한 조성물을 분무(nebulising)하기 위한 장치를 제공하며, 이 장치는 본 발명의 제1 측면에 따르는 조성물을 포함한다. 관련 측면은 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 제1 측면에 따르는 조성물을 제공하며, 여기서 상기 조성물은 기도에 또는 기도를 통해 투여된다.
하기에서, 본 발명 및 상기 논의된 이의 측면에 대한 상세한 설명이 제공될 것이다. 이러한 맥락에서, 이러한 측면은 밀접하게 관련되어 있음이 인식될 것이다. 따라서, 한 측면의 특징과 관련하여 제공되는 상세한 정보는 달리 지시되지 않는 한 이 특징에 의존하는 다른 측면에도 적용될 것임이 이해될 것이다.
치료적 활성제
본 발명에 따르는 조성물은 치료적 활성제의 나노 입자 또는 미세입자 제형을 포함한다. 다양한 치료적 활성제가 이러한 입자 제형에 적합한 것으로 공지되어 있다. 이러한 맥락에서, 치료 활성에 대한 참조는 질환 또는 장애가 환자에게 영향을 미치는 것을 예방하기 위해 투여되는 제제 뿐만 아니라 질환 또는 장애를 치료하기 위해 환자에게 투여되는 제제를 포함한다.
본 발명의 맥락에서 사용하기에 바람직한 치료적 활성제는 핵산이다. 나노 입자 또는 미세입자 제형에 포함된 치료적 활성제로서의 핵산 중에서, RNA가 더 바람직하고, 보다 바람직하게는 단일 가닥 RNA이고, 가장 바람직하게는 변형된 mRNA를 포함하는 mRNA이다.
용어 "핵산"은 모든 형태의 천연 유형의 핵산뿐만 아니라 화학적으로 및/또는 효소적으로 합성된 핵산을 포함하고, 또한 핵산 유사체 및 핵산 유도체, 예를 들어, 고정된 핵산(LNA), 펩티드 핵산(PNA), 올리고뉴클레오사이드 티오포스페이트 및 포스포트리에스테르, 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드, 양이온성 올리고뉴클레오타이드(US6017700 A, WO/2007/069092), 치환된 리보-올리고뉴클레오타이드 또는 포스포로티오에이트를 포함한다. 또한, 용어 "핵산"은 또한 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체를 포함하는 임의의 분자를 지칭한다. 본 발명의 조성물에 포함되는 핵산의 서열 또는 크기에 대한 제한은 없다. 핵산은 주로 본 발명의 조성물이 전달되는 생물학적 표적에서 달성되는 생물학적 효과에 의해 정의된다. 예를 들어, 유전자 또는 핵산 요법에 적용하는 경우, 핵산 또는 핵산 서열은 발현될 유전자 또는 유전자 단편에 의해 또는 결함있는 유전자 또는 임의의 유전자 표적 서열의 의도된 치환 또는 복구에 의해 또는 억제, 녹다운 또는 하향 조절되는 유전자의 표적 서열에 의해 정의될 수 있다.
용어 "핵산"은 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. RNA와 관련하여, 원칙적으로, 임의의 유형의 RNA가 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, RNA는 단일 가닥 RNA이다. 용어 "단일 가닥 RNA"는 2개 이상의 개별 쇄가 개별 쇄의 하이브리드화로 인해 이중 가닥 분자를 형성하는 RNA 분자와 대조적으로 리보뉴클레오타이드의 단일 연속 쇄를 의미한다. 용어 "단일 가닥 RNA"는 단일 가닥 분자가 루프, 2차 또는 3차 구조와 같은 이중 가닥 구조를 그 자체로 형성한다는 것을 배제하지 않는다.
용어 "RNA"는 아미노산 서열을 코딩하는 RNA뿐만 아니라 아미노산 서열을 코딩하지 않는 RNA를 포함한다. 게놈의 80% 이상이 단백질을 코딩하지 않는 기능적 DNA 요소를 함유한다고 제안되었다. 이러한 비코딩 서열은 조절 DNA 요소(전사 인자, 조절자 및 공동 조절자 등의 결합 부위) 및 단백질로 번역되지 않는 전사체를 코딩하는 서열을 포함한다. 게놈에 의해 인코딩되고 RNA로 전사되지만 단백질로 번역되지 않는 이러한 전사체는 비코딩 RNA(ncRNA)라고 지칭된다. 따라서, 하나의 구현예에서, RNA는 비코딩 RNA이다. 바람직하게는, 비코딩 RNA는 단일 가닥 분자이다. 연구에 따르면, ncRNA가 유전자 조절, 게놈 완전성의 유지, 세포 분화 및 발달에 중요한 역할자이며, 그들이 다양한 인간 질환에서 잘못 조절된다는 것이 입증된다. 상이한 유형의 ncRNA: 짧은(20-50 nt), 중간(50-200 nt), 긴(> 200 nt) ncRNA가 존재한다. 짧은 ncRNA에는 microRNA(miRNA), 짧은 간섭성 RNA(siRNA), 피위-기능성 RNA(piRNA) 및 전사 개시 RNA(tiRNA)가 포함된다. 중간 ncRNA의 예에는 소형 핵 RNA(snRNA), 소형 핵인 RNA(snoRNA), 전달 RNA(tRNA), 전사 개시-부위-관련 RNA(TSSaRNA), 프로모터-관련 소형 RNA(PASR) 및 프로모터 업스트림 전사체(PROMPT)가 포함된다. 긴 비코딩 RNA(lncRNA)에는 긴 유전자간 비코딩 RNA(lincRNA), 안티센스-lncRNA, 인트론 lncRNA, 전사된 초보존 RNA(T-UCR) 및 기타가 포함된다(참조: Bhan A, Mandal SS, ChemMedChem. 2014 Mar 26. doi: 10.1002/cmdc.201300534). 상기 언급된 비코딩 RNA 중 siRNA만이 이중 가닥이다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 비코딩 RNA가 단일 가닥이기 때문에, 비코딩 RNA는 siRNA가 아닌 것이 바람직하다. 또 다른 구현예에서, RNA는 코딩 RNA, 즉 아미노산 서열을 코딩하는 RNA이다. 이러한 RNA 분자는 또한 mRNA(메신저 RNA)라고 지칭되며, 단일 가닥 RNA 분자이다. 핵산은 당업자에게 공지된 합성 화학 및 효소 방법론으로, 또는 재조합 기술의 사용으로 제조될 수 있거나, 천연 공급원으로부터 또는 이들의 조합에 의해 단리될 수 있다. 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드는 임의로 비천연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있고, 단일 또는 이중 또는 삼중 가닥일 수 있다. "핵산"은 또한 센스 및 안티센스 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드, 즉 DNA 및/또는 RNA에서 특정 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다.
바람직하게는, 본 발명의 맥락에서 용어 핵산은 RNA, 보다 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 가장 바람직하게는 mRNA를 지칭한다. 특정 맥락에서 달리 지시되지 않는 한, 본원에 사용된 용어 mRNA는 변형된 mRNA를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 즉, 본 발명의 맥락에서 사용되는 나노 입자 또는 미세입자는 바람직하게는 치료적 활성제로서 핵산을 포함하고, 핵산은 바람직하게는 RNA, 보다 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 가장 바람직하게는 mRNA이며, 이 mRNA는 변형된 mRNA일 수 있다.
메신저 RNA(mRNA)는 주로 아데노신, 시티딘, 우리딘 및 구아노신을 뉴클레오사이드로서 사용하여 뉴클레오사이드 포스페이트 빌딩 블록으로 구성된 공중합체로서, 이는 중간체 담체로서 세포핵의 DNA로부터 유전 정보를 세포질로 가져오고, 여기서 단백질로 번역된다. 따라서, 그들은 유전자 발현의 대안으로 적합하다.
본 발명의 맥락에서, mRNA는 세포 내로 들어 오는 경우, 단백질 또는 이의 단편의 발현에 적합하거나 단백질 또는 이의 단편으로 번역 가능한 임의의 폴리리보뉴클레오타이드 분자를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 여기서 용어 "단백질"은 임의의 종류의 아미노산 서열, 즉 각각 펩티드 결합을 통해 연결되고 펩티드 및 융합 단백질을 또한 포함하는 2개 이상의 아미노산의 쇄를 포함한다.
mRNA는 세포 또는 세포 주변에서 기능이 필요하거나 유익한 단백질 또는 이의 단편, 예를 들어, 결핍 또는 결함 있는 형태가 질환 또는 질병의 유발자이고, 이의 제공이 질환 또는 질병을 완화하거나 예방할 수 있는 단백질, 또는 세포 또는 그 주변에서 신체에 유익한 과정을 촉진할 수 있는 단백질을 인코딩하는 리보뉴클레오타이드 서열을 함유한다. mRNA는 완전한 단백질 또는 이의 기능적 변이체에 대한 서열을 함유할 수 있다. 또한, 리보뉴클레오타이드 서열은 인자, 유도제, 조절제, 자극제 또는 효소로 작용하는 단백질 또는 이의 기능적 단편을 인코딩할 수 있으며, 여기서 이 단백질은 기능이 장애, 특히 대사 장애를 치료하기 위해 또는 새로운 혈관, 조직 등의 형성과 같은 생체내 과정을 개시하기 위해 필요한 것이다. 여기서, 기능적 변이체는 세포에서 기능이 필요하거나 이의 결핍 또는 결함 있는 형태가 병원성인 단백질의 기능을 수행할 수 있는 단편을 의미하는 것으로 이해된다. 또한, mRNA는 또한 추가의 기능적 영역 및/또는 3' 또는 5' 비코딩 영역을 가질 수 있다. 3' 및/또는 5' 비코딩 영역은 RNA의 안정화에 기여하는 단백질 인코딩 서열 또는 인공 서열에 자연적으로 인접하는 영역일 수 있다. 당업자는 일상적인 실험에 의해 각각의 경우에 이에 적합한 서열을 결정할 수 있다.
바람직한 구현예에서, mRNA는 특히 번역을 개선하기 위해 3' 말단에 m7GpppG 캡, 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 및/또는 polyA 테일을 함유한다. mRNA는 번역을 촉진하는 추가 영역을 가질 수 있다.
바람직한 구현예에서, mRNA는 변형된 뉴클레오타이드와 변형되지 않은 뉴클레오타이드의 조합을 함유하는 mRNA이다. 바람직하게는, 그것은 WO2011/012316에 기재된 바와 같이 변형된 뉴클레오타이드와 변형되지 않은 뉴클레오타이드의 조합을 함유하는 mRNA이다. 본원에 기재된 mRNA는 증가된 안정성과 감소된 면역원성을 나타내는 것으로 보고되어 있다. 바람직한 구현예에서, 이러한 변형된 mRNA에서 시티딘 뉴클레오타이드의 5 내지 50% 및 우리딘 뉴클레오타이드의 5 내지 50%가 변형된다. 아데노신- 및 구아노신 함유 뉴클레오타이드는 변형되지 않을 수 있다. 아데노신 및 구아노신 뉴클레오타이드는 변형되지 않거나 부분적으로 변형될 수 있으며, 그들은 바람직하게는 변형되지 않은 형태로 존재한다. 바람직하게는, 10 내지 35%의 시티딘 및 우리딘 뉴클레오타이드가 변형되고, 특히 바람직하게는 변형된 시티딘 뉴클레오타이드의 함량은 7.5 내지 25% 범위이고, 변형된 우리딘 뉴클레오타이드의 함량은 7.5 내지 25% 범위이다. 사실상 비교적 낮은 함량, 예를 들어, 각각 10%의 변형된 시티딘 및 우리딘 뉴클레오타이드만이 목적하는 특성을 달성할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 변형된 시티딘 뉴클레오타이드가 5-메틸시티딘 잔기이고 변형된 우리딘 뉴클레오타이드가 2-티오우리딘 잔기인 것이 특히 바람직하다. 가장 바람직하게는, 변형된 시티딘 뉴클레오타이드의 함량 및 변형된 우리딘 뉴클레오타이드의 함량은 각각 25%이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, mRNA는 관련 세포에서만 목적하는 mRNA의 활성을 허용하기 위해 표적 결합 부위, 표적화 서열 및/또는 마이크로-RNA 결합 부위와 조합될 수 있다. 추가의 바람직한 구현예에서, RNA는 3' polyA 테일의 마이크로-RNA 또는 shRNA 다운스트림과 조합될 수 있다.
또한, 용어 "핵산(들)"은 당업계에 공지된 DNA 또는 RNA 또는 이의 하이브리드 또는 이의 임의의 변형을 지칭할 수 있다(변형의 예로서, 예를 들어, US 8278036, WO 2013/052523, WO 2011/012316, US 5525711, US 4711955, US 5792608 또는 EP 302175(Lorenz et al. 2004, Bioorg Med Chem Lett, 14, 4975-4977; Soutschek et al. 2004, Nature, 432, 173-178) 참조). 이러한 핵산 분자(들)는 단일 가닥 또는 이중 가닥, 선형 또는 원형, 천연 또는 합성이며, 임의의 크기 제한은 없다. 예를 들어, 핵산 분자(들)는 게놈 DNA, cDNA, mRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 또는 작은 간섭성 RNA(siRNA), 마이크로 RNA, 안타고미르, 또는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), tRNA 또는 이러한 RNA 또는 키메라플라스트를 인코딩하는 긴 이중 가닥 RNA 또는 DNA 작제물(Colestrauss et al. 1996, Science, 273, 1386-1389), 또는 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복체로 클러스터된 압타머(RNA 유도 부위 특이적 DNA 절단을 위한 "CRISPR")(Cong et al. 2013, Science, 339, 819-823), 또는 RNA 및 DNA일 수 있다. 상기 핵산 분자(들)는 플라스미드, 코스미드, 인공 염색체, 바이러스 DNA 또는 RNA, 박테리오파지 DNA, 코딩 및 비코딩 단일 가닥 (mRNA) 또는 이중 가닥 RNA 및 올리고 뉴클레오타이드(들)의 형태일 수 있으며, 여기서 상기 기재된 바와 같은 당 백본 및/또는 염기의 임의의 최신 변형 및 3'- 또는 5'-변형이 포함된다. 특히 바람직한 구현예에서, 핵산은 RNA, 보다 바람직하게는 mRNA 또는 siRNA, 가장 바람직하게는 mRNA이다.
핵산(들)은 표적 세포에서 발현될 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 함유할 수 있다. 당업자에게 익히 공지된 방법을 사용하여 재조합 핵산 분자를 작제할 수 있고; 예를 들어, 문헌[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (2001) NY 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, NY (1989)]에 기재된 기술을 참조한다.
상기 주시된 바와 같이, 핵산은 나노 입자 또는 미세입자 제형에 바람직한 치료적 활성제로서 포함될 것이다. 일반적으로, 치료 효과는 핵산과 세포 분자 및 세포 기관의 상호 작용에 의해 달성될 수 있다. 이러한 상호 작용만으로, 예를 들어, 특정 CpG 올리고뉴클레오타이드 및 톨형 및 다른 세포외 또는 세포내 수용체와 특이적으로 상호 작용하도록 설계된 서열의 경우와 같이 선천적 면역계를 활성화할 수 있다. 또한, 세포에서 핵산의 흡수 또는 도입은 핵산에 포함된 유전자와 같은 뉴클레오타이드 서열의 발현을 유도하도록 의도될 수 있으며, 도입된 외인성 핵산의 세포내 존재의 결과로 내인성 유전자 발현의 하향 조절, 사일런싱 또는 녹다운을 의도할 수 있거나, 선택된 염기 또는 내인성 핵산 서열의 전체 스트레치의 복구, 절제, 삽입 또는 교환과 같은 내인성 핵산 서열의 변형을 의도할 수 있거나, 도입된 외인성 핵산의 세포내 존재 및 상호 작용의 결과로 사실상 임의의 세포 과정에 의한 간섭을 의도할 수 있다. 도입된 외인성 핵산의 과발현은, 특히 낭포성 섬유증, 혈우병 또는 근이영양증과 같은 많은 대사 및 유전성 질환이 있는 경우와 같이 내인성 유전자가 결함이 있거나 침묵하여 유전자 발현이 없거나, 불충분하거나, 결함이 있거나, 기능 장애가 있는 생성물을 유도하는 경우에 내인성 유전자 발현을 보상하거나 보완하도록 의도될 수 있다. 도입된 외인성 핵산의 과발현은 또한 발현 생성물이 유전자 발현의 조절, 신호 전달 및 기타 세포 과정과 같은 임의의 내인성 세포 과정과 상호 작용하거나 간섭하도록 의도될 수 있다. 도입된 외인성 핵산의 과발현은 또한 형질 감염되거나 형질 도입된 세포가 거주하거나 거주하도록 만들어진 유기체의 맥락에서 면역 반응을 일으키도록 의도될 수 있다. 예는 백신 접종 목적을 위한 항원을 제시하기 위해 수지상 세포와 같은 항원 제시 세포의 유전자 변형이다. 다른 예는 종양 특이적 면역 반응을 유도하기 위해 종양에서 사이토카인의 과발현이다. 또한, 도입된 외인성 핵산의 과발현은 또한 변형된 T-세포 또는 전구체 또는 줄기 또는 재생 의학을 위한 다른 세포와 같은 세포 요법을 위한 일시적으로 유전자 변형된 세포를 생체내 또는 생체외에서 생성하도록 의도될 수 있다.
치료 목적을 위한 내인성 유전자 발현의 하향 조절, 사일런싱 또는 녹다운은, 예를 들어, RNA 간섭(RNAi), 리보자임, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, tRNA, 이러한 하향 조절이 서열 특이적이거나 비특이적일 수 있고, 또한 긴 이중 가닥 RNA가 세포에 도입될 경우처럼 세포사를 유도할 수 있는 긴 이중 가닥 RNA에 의해 달성될 수 있다. 내인성 또는 기존의 유전자 발현의 하향 조절, 사일런싱 또는 녹다운은 바이러스 감염 및 암을 포함한 후천성, 유전성 또는 자발적으로 발생하는 질환의 치료에 유용할 수 있다. 핵산의 세포로의 도입이, 예를 들어, 바이러스 감염 또는 신생물을 예방하기 위한 예방 조치로서 실행될 수 있다는 것도 예상될 수 있다. 내인성 유전자 발현의 하향 조절, 사일런싱 또는 녹다운은 전사 수준 및 번역 수준에서 발휘될 수 있다. 다수의 메커니즘이 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어, 후성 유전적 변형, 염색질 구조의 변화, 도입된 핵산에 의한 전사 인자의 선택적 결합, 삼중 나선 형성과 같은 비통상적인 염기 쌍 메커니즘을 포함하는 염기 쌍에 의한 게놈 DNA, mRNA 또는 기타 RNA 종의 상보적 서열에 대한 도입된 핵산의 하이브리드화를 포함한다. 유사하게, 유전자 복구, 염기 또는 서열 변화는 엑손 스키핑을 포함하는 게놈 수준 및 mRNA 수준에서 달성될 수 있다. 염기 또는 서열 변화는, 예를 들어, RNA 유도된 부위 특이적 DNA 절단, 트랜스-스플라이싱, 트랜스-스플라이싱 리보자임, 키메라플라스트, 스플라이코좀 매개된 RNA 트랜스-스플라이싱을 활용하는 절단 및 플라스트 메커니즘에 의해, 또는 그룹 II 또는 재표적화 인트론을 활용하거나, 바이러스에 의해 매개되는 삽입 돌연변이 유발을 활용하거나 원핵, 진핵 또는 바이러스 인테그라제 시스템을 사용하여 표적화 게놈 삽입을 활용함으로써 달성될 수 있다. 핵산은 살아 있는 시스템의 구축 계획의 담체이며 그들이 많은 세포 과정에 직접적 및 간접적인 방식으로 참여하기 때문에 이론적으로 임의의 세포 과정은 핵산을 외부에서 세포로 도입함으로써 영향을 받을 수 있다. 특히, 이러한 도입은 세포 또는 기관 배양에서 생체내 및 생체외에서 직접 수행될 수 있으며, 이어서 이렇게 변형된 기관 또는 세포를 수용자에게 이식할 수 있다. 치료적 활성제로서 핵산과 함께 본 발명의 맥락에서 사용하기 위한 나노 입자 또는 미세입자 제형은 상기한 모든 목적에 유용할 수 있다.
본 발명의 맥락에서 사용하기 위한 나노 입자 또는 미세입자 제형은 단일 치료적 활성제를 포함할 수 있지만, 대안적으로 2개 이상의 치료적 활성제의 조합을, 예를 들어, 단일 입자에 조합된 2종 이상의 치료적 활성제를 포함하는 입자 형태로, 또는 내부에 함유된 치료적 활성제의 유형이 다른 입자의 블렌드 형태로 포함할 수 있음이 이해될 것이다.
입자 제형
본 발명에 따르는 조성물 (즉, 현탁액 조성물 및 고체 조성물)은 치료적 활성제의 나노 입자 또는 미세입자 제형을 포함한다. 숙련된 독자에 의해 이해되는 바와 같이, "또는"은 특별히 달리 지시되지 않는 한 비배타적인 방식으로 이 맥락에서 사용된다. 따라서, 나노 입자 또는 미세입자 제형에 대한 참조는 치료적 활성제를 포함하는 나노 입자를 함유하는 제형, 치료적 활성제를 포함하는 미세입자를 함유하는 제형, 및 치료적 활성제를 포함하는 나노 입자 및 미세입자를 모두 함유하는 제형을 포함한다. 편의상, "나노 입자 또는 미세입자 제형"은 본 발명의 논의에서 "입자 제형" 또는 "미립자 제형"으로서 본원에서 약칭될 수 있다. 유사하게, 나노 입자 또는 미세입자는 "입자"로서 지칭될 수 있다.
나노 입자 또는 미세입자 제형의 입자는 유일한 성분으로서 치료적 활성제를 함유할 수 있다. 그러나, 입자는 하나 이상의 추가 성분과 조합하여 치료적 활성제를 함유하는 것이 바람직하다. 이들 추가 성분은 전형적으로 약제학적으로 허용되는 성분, 예를 들어, 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 첨가제이다.
본 발명에 따르는 조성물에서 나노 입자 또는 미세입자 제형은 치료적 활성제를 함유하는 나노 입자 또는 미세입자를 포함한다. 입자 제형은 이러한 나노 입자 또는 미세입자로 구성될 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 나노 입자는 일반적으로 나노미터 크기 범위의 직경, 즉 직경이 1nm 이상, 1000nm 미만인 입자를 지칭한다. 용어 미세입자는 일반적으로 마이크로미터 크기 범위의 직경, 즉 직경이 1000nm 이상, 100㎛ 이하인 입자를 지칭한다.
나노 입자 또는 미세입자 제형은 전형적으로 1 내지 4000nm, 더욱 바람직하게는 2 내지 2500nm, 가장 바람직하게는 5 내지 1000nm 범위의 평균 입자 직경을 나타낸다.
나노 입자 또는 미세입자 제형에서 단일 입자의 직경에 대한 상한치는 바람직하게는 20㎛, 보다 바람직하게는 10㎛, 가장 바람직하게는 5㎛이다. 따라서, 상기로부터 이해될 것과 같이, 매우 바람직한 입자 제형은 평균 입자 직경이 5 내지 1000nm 범위인 입자, 및 최대 입자 직경이 5㎛인 입자일 것이다.
본원에서 지칭된 나노 입자 또는 미세입자 제형의 입자 직경 및 평균 입자 직경은 동적 광 산란(DLS)을 통해 편리하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 본원에서 지칭되는 직경 및 평균 직경은 동적 광 산란을 통해 결정된 현탁된 상태의 입자의 유체역학적 직경으로 지시된다. 결과를 보고할 때 온도의 영향이 측정 장비(예: Malvern ZetaSizer)에 의해 고려되기 때문에, 측정된 직경은 일반적으로 온도 의존적이지 않다. 그러나, 측정은 전형적으로 실온(25℃)에서 수행된다. DLS 측정을 위한 현탁 매질로서, 예를 들어, 물 또는 동결 방지 첨가제를 함유하는 물이 적절하게 사용될 수 있다. 동결된 고체 조성물의 경우에, 입자 직경은 전형적으로 조성물을 해동한 후에 결정된다. 평균 입자 크기 또는 평균 입자 직경이 지시된 경우, 평균은 달리 지시되지 않는 한 전형적으로 z-평균이다.
바람직하게는, 나노 입자 또는 미세입자 제형은 입자 제형 내 입자의 총 중량에 대한 치료적 활성제의 중량으로 표현된 0.1 내지 95%(w/w), 보다 바람직하게는 0.5 내지 90%(w/w), 가장 바람직하게는 1 내지 80%(w/w) 범위의 활성 부하를 갖는다.
치료적 활성제 이외에, 본 발명의 맥락에서 사용하기 위한 나노 입자 또는 미세입자 제형의 입자는 하나 이상의 추가 성분, 예를 들어, 전형적으로 약제학적으로 허용되는 성분인 부형제 또는 첨가제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 추가 성분은 특정 부위로의 수송을 촉진하거나 입자가 환자에게 투여된 후 특정 부위로의 입자의 추가 흡수를 촉진하거나 그들은 입자 또는 그 안에 함유된 치료적 활성제를 안정화시키는 데 도움을 줄 수 있다.
치료적 활성제가 핵산인 경우, 핵산을 포함하는 입자에 유용한 성분은 바이러스 벡터이다. 이러한 바이러스 벡터는, 예를 들어, 문헌(참조: A.C. Silva et al., Current Drug Metabolism, 16, 2015, 3-16)의 검토 논문 및 여기서 논의된 문헌에서 논의된 바와 같이 당업계에 공지되어 있다.
또한, 다양한 중합체가 나노 입자 또는 미세입자를 포함하는 입자 제형에서 치료적 활성제의 제형을 위한 부형제로서 확립된다. 이러한 중합체는 또한 본 발명의 맥락에서 사용되는 미립자 제형을 위한 추가 성분을 제공할 수 있다. 예를 들어, 적합한 중합체 부형제는 입자를 환자에게 투여 후 체내에서 재흡수될 수 있는 중합체, 예를 들어, 아미노산, 탄수화물, 또는 락트산 및/또는 글리콜산으로부터 형성된 천연 중합체를 포함하는 중합체를 포함한다.
치료적 활성제로서, 핵산, 바람직하게는 RNA, 더욱 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 가장 바람직하게는 mRNA를 포함하는 입자 제형의 경우, 바람직한 추가 성분은 양이온성 부형제이다. 이러한 양이온성 부형제와 음전하를 제공하는 핵산은 함께 복합체를 형성할 수 있다. 양이온성 부형제에 대한 참조는, 양이온성 그룹이 부형제의 전체 양전하를 제공하기에 충분히 높은 수로 존재하는 한, 각각의 부형제에서 음이온성 그룹 또는 중성 영역의 존재를 배제하지 않는다는 것이 이해될 것이다.
따라서, 하나의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 맥락에서 지칭되는 나노 입자 또는 미세입자 제형은 핵산 및 양이온성 부형제로서 양이온성 올리고머 또는 중합체, 바람직하게는 중합체에 의해 형성된 복합체의 형태로 치료적 활성제로서 핵산, 바람직하게는 RNA, 보다 바람직하게는 단일 RNA, 가장 바람직하게는 mRNA를 포함하는 입자 제형이다. 이러한 복합체는 당업계에서 폴리플렉스로서도 지칭된다.
이러한 폴리플렉스, 및 그들을 형성할 수 있는 적합한 올리고머 또는 중합체는 당업계에 공지되어 있다. 본 발명의 맥락에서 지칭되는 입자 제형에 또한 사용될 수 있는 폴리플렉스의 형성을 위한 예시적인 적합한 양이온성 올리고머 또는 중합체는 문헌[참조: A.C. Silva et al., Current Drug Metabolism, 16, 2015, 3-16] 및 그 안에 언급된 문헌, 문헌[참조: J.C. Kasper et al., J. Contr. Rel. 151(2011), 246-255], 문헌[참조: WO 2014/207231] 및 그 안에 언급된 문헌, 및 문헌[참조: WO 2016/097377] 및 그 안에 언급된 문헌에 논의되어 있다.
적합한 양이온성 올리고머 또는 중합체는 특히 아미노 그룹이 함유된 복수의 단위를 포함하는 양이온성 올리고머 또는 중합체를 포함한다. 아미노 그룹은 양성자화되어 중합체의 양전하를 제공할 수 있다.
핵산 및 아미노 그룹이 함유된 복수의 단위를 포함하는 양이온성 올리고머 또는 중합체로부터 형성된 폴리플렉스에서, 양이온성 올리고머 또는 중합체 중 아민 질소 원자의 수 대 핵산 중의 포스페이트 그룹의 수의 N/P 비율은 바람직하게는 1 내지 100, 보다 바람직하게는 2 내지 80, 가장 바람직하게는 3 내지 60의 범위이다.
복수의 아미노 그룹을 포함하는 양이온성 올리고머 또는 중합체 중에서, 하기 (1), (2), (3) 및 (4)로부터 독립적으로 선택된 복수의 단위를 포함하는 올리고머 또는 중합체가 바람직하다:
Figure pct00001
여기서. 반복 단위 (1), (2), (3) 및/또는 (4)의 질소 원자 중 하나 이상은 양성자화되어 중합체의 양전하를 제공할 수 있다.
입자 제형을 제공하기 위한 양이온성 올리고머 또는 중합체로서 특히 바람직한 것은 아미노 그룹이 함유된 복수의 단위를 포함하는 다음 4가지 부류의 올리고머 또는 중합체이다.
첫번째 바람직한 부류로서, 분지형 폴리(에틸렌 이민)("brPEI")을 포함하는 폴리(에틸렌 이민)("PEI")이 언급된다.
두번째 바람직한 부류의 양이온성 올리고머 또는 중합체는 그들이 WO 2014/207231(출원인: 에트리스 게엠베하(ethris GmbH))에 개시되어 있는 바와 같이, 측쇄 및/또는 말단 그룹으로서 다음 화학식 II의 복수의 그룹을 포함하는 올리고머 또는 중합체이다:
[화학식 II]
Figure pct00002
상기 화학식 II에서,
변수 a, b, p, m, n 및 R2 내지 R6은 복수의 이러한 그룹에서 화학식 II의 각 그룹에 대해 독립적으로 다음과 같이 정의된다:
a는 1이고 b는 2 내지 4의 정수이거나; a는 2 내지 4의 정수이고 b는 1이고,
p는 1 또는 2이고,
m은 1 또는 2이고; n은 0 또는 1이고 m + n은 ≥ 2이고;
R2 내지 R5는 서로 독립적으로 수소; 그룹 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7(여기서, R7은 C3-C18 알킬 또는 하나의 C-C 이중 결합을 갖는 C3-C18 알케닐로부터 선택된다); 아미노 그룹을 위한 보호 그룹; 및 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄로부터 선택되고;
R6은 수소; 그룹 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7(여기서, R7은 C3-C18 알킬 또는 하나의 C-C 이중 결합을 갖는 C3-C18 알케닐로부터 선택된다); 아미노 그룹을 위한 보호 그룹; -C(NH)-NH2; 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄; 및 수용체 리간드로부터 선택되고,
여기서, 화학식 II에서 지시된 질소 원자 중 하나 이상은 양성자화되어 화학식 II의 양이온성 그룹을 제공할 수 있다.
이들 올리고머 또는 중합체, 및 상기 화학식 II에 함유된 변수의 추가의 바람직한 정의와 관련하여, 구체적으로 달리 지시되지 않는 한, WO 2014/207231의 각각의 개시내용은 또한 본원에 기재된 발명에도 적용된다. 또한, 핵산 및 폴리플렉스 형태의 이들 올리고머 및 중합체를 함유하는 조성물의 관점에서, WO 2014/207231에 제공된 정보는 본원에서 지칭된 입자 제형에 적용 가능하다.
세번째 바람직한 부류의 양이온성 올리고머 또는 중합체는, 그들이 WO 2014/207231(출원인: 에트리스 게엠베하)에 개시되어 있는 바와 같이, 반복 단위로서 다음 화학식 III의 복수의 그룹을 포함하는 올리고머 또는 중합체이다:
[화학식 III]
Figure pct00003
상기 화학식 III에서,
변수 a, b, p, m, n 및 R2 내지 R5는 복수의 이러한 그룹에서 화학식 III의 각 그룹에 대해 독립적으로 다음과 같이 정의된다:
a는 1이고 b는 2 내지 4의 정수이거나; a는 2 내지 4의 정수이고 b는 1이고,
p는 1 또는 2이고,
m은 1 또는 2이고; n은 0 또는 1이고 m + n은 ≥ 2이고;
R2 내지 R5는 서로 독립적으로 수소; 그룹 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7(여기서, R7은 C3-C18 알킬 또는 하나의 C-C 이중 결합을 갖는 C3-C18 알케닐로부터 선택된다); 아미노 그룹을 위한 보호 그룹; -C(NH)-NH2; 및 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄로부터 선택되고;
여기서, 화학식 III에서 지시된 질소 원자 중 하나 이상은 양성자화되어 화학식 III의 양이온성 그룹을 제공할 수 있다.
이들 올리고머 또는 중합체, 및 상기 화학식 III에 함유된 변수의 추가의 바람직한 정의와 관련하여, 구체적으로 달리 지시되지 않는 한, WO 2014/207231의 각각의 개시내용은 또한 본원에 기재된 발명에도 적용된다. 또한, 핵산 및 폴리플렉스 형태의 이들 올리고머 및 중합체를 함유하는 조성물의 관점에서, WO 2014/207231에 제공된 정보는 본원에서 지칭된 입자 제형에 적용 가능하다.
네 번째 바람직한 부류의 양이온성 올리고머 또는 중합체는 WO 2016/097377(출원인: 에트리스 게엠베하)에 개시된 바와 같이 통계적 공중합체에 의해 제공된다. 그것은 다음 화학식 (a1) 및 (a2)의 반복 단위로부터 독립적으로 선택된 복수의 반복 단위 (a):
Figure pct00004
및 하기 화학식 (b1) 내지 (b4)의 반복 단위로부터 독립적으로 선택된 복수의 반복 단위 (b)를 포함하고:
Figure pct00005
반복 단위 (a)의 합 대 반복 단위 (b)의 합의 몰 비는 0.7/1.0 내지 1.0/0.7의 범위 내에 있고, 공중합체에 함유된 반복 단위 (a) 및/또는 (b)의 질소 원자 중 하나 이상은 양성자화되어 양이온성 공중합체를 제공할 수 있다.
이 공중합체의 추가의 바람직한 정의와 관련하여, 구체적으로 달리 지시되지 않는 한, WO 2016/097377의 각각의 개시내용이 또한 본원에 기재된 발명에 적용된다. 본원에서 주시된 바와 같이, 특히 바람직한 공중합체는 반복 단위 (a1) 및 (b1)을 포함하거나, 반복 단위 (a1) 및 (b1)로 구성되는 선형 공중합체이다. 또한, 핵산 및 이들 올리고머 및 중합체를 폴리플렉스 형태로 함유하는 조성물의 관점에서, WO 2016/097377에 제공된 정보는 본원에서 지칭된 입자 제형에 적용 가능하다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 맥락에서 지칭되는 바와 같은 나노 입자 또는 미세입자 제형은 핵산 및 양이온성 부형제로서 양이온성 지질 또는 양이온성 리피도이드(lipidoid)에 의해 형성된 복합체 형태로 치료적 활성제로서 핵산, 바람직하게는 RNA, 더욱 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 가장 바람직하게는 mRNA를 포함하는 입자 제형이다. 달리 정의되지 않는 한, 이러한 복합체는 특히 핵산과 양이온성 지질 또는 양이온성 리피도이드의 복합체를 포함하는 리포플렉스, 리포좀 및 지질 나노 입자("LNP")를 포함한다.
본 발명의 맥락에서 핵산과의 복합체 형성용으로 또한 사용될 수 있는 적합한 양이온성 지질 또는 양이온성 지질 및 리피도이드는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[참조: A.C. Silva et al., Current Drug Metabolism, 16, 2015, 3-16 및 그 안에 언급된 문헌, US 2017/0267631, WO 2016/081029, WO 2011/071860, WO 2016/118697, US 8450298 B2, WO 2014/207231 및 E.R. Lee et al., Human Gene Therapy 7:1701-1717, September 10, 1996]에 논의되어 있다. 용어 "리피도이드"는 지질 구조는 갖지 않지만 지질의 특성을 나타내는 물질을 확립한다.
양이온성 리피도이드와의 복합체 형태로, 예를 들어, 리포플렉스, 리포좀 또는 LNP로서 치료적 활성제로서 핵산, 바람직하게는 RNA, 더욱 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 가장 바람직하게는 mRNA를 함유하는 입자 제형에 사용하기 위한 바람직한 부류의 리피도이드는 WO 2014/207231(출원인: 에트리스 게엠베하)에 개시된 바와 같이 다음 화학식 IV의 구조를 갖는 리피도이드이다:
[화학식 IV]
Figure pct00006
상기 화학식 IV에서,
변수 a, b, p, m, n 및 R1 내지 R6은 다음과 같이 정의된다:
a는 1이고 b는 2 내지 4의 정수이거나; a는 2 내지 4의 정수이고 b는 1이고,
p는 1 또는 2이고,
m은 1 또는 2이고; n은 0 또는 1이고 m + n은 ≥ 2이고;
R1 내지 R6은 서로 독립적으로 수소; 그룹 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7(여기서, R7은 C3-C18 알킬 또는 하나의 C-C 이중 결합을 갖는 C3-C18 알케닐로부터 선택된다); 아미노 그룹을 위한 보호 그룹; -C(NH)-NH2; 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄; 및 수용체 리간드로부터 선택되고; 단 R1 내지 R6 중 적어도 두 개의 잔기는 그룹 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7(여기서, R7은 C3-C18 알킬 또는 하나의 C-C 이중 결합을 갖는 C3-C18 알케닐로부터 선택된다)이고;
여기서, 화학식 IV에서 지시된 질소 원자 중 하나 이상은 양성자화되어 화학식 IV의 양이온성 리피도이드를 제공할 수 있다.
이들 리피도이드, 및 상기 화학식 IV에 함유된 변수의 추가의 바람직한 정의와 관련하여, 구체적으로 달리 지시되지 않는 한, WO 2014/207231의 각각의 개시내용이 또한 본원에 기재된 발명에 적용된다. 또한, 핵산 및 이들 리피도이드를 복합체 형태, 예를 들어, 리포플렉스, 리포좀 또는 LNP 형태로 함유하는 조성물의 관점에서, WO 2014/207231에 제공된 정보는 본원에서 지칭된 입자 제형에 적용 가능하다.
본원에서 지칭되는 바와 같은 입자 제형에 함유될 수 있는 양이온성 지질과 핵산의 복합체를 제공하기 위한 또 다른 바람직한 유형의 지질은 양이온성 지질 젠 자임 지질 67(GL67)이다. 이 양이온 유도체화된 지질은 핵산, 바람직하게는 RNA,보다 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 가장 바람직하게는 mRNA의 복합체화에 매우 유용하다.
아미노 그룹을 함유하는 양이온성 지질 또는 양이온성 리피도이드, 예를 들어, 화학식 IV의 리피도이드로 형성된 핵산의 복합체를 포함하는 입자 제형의 경우, 리포플렉스의 N/P 비율은 바람직하게는 1 내지 100, 더욱 바람직하게는 2 내지 80이고, 가장 바람직한 것은 3 내지 60의 N/P 비율이다.
리포플렉스, LNP 또는 리포좀과 같은 양이온성 지질 또는 양이온성 리피도이드와 핵산의 복합체 형태로 치료적 활성제를 포함하는 입자 제형에 함유될 수 있는 임의의 성분으로서, 헬퍼 지질이 언급될 수 있다. 그들은 하나 이상의 스테로이드(예: 콜레스테롤 또는 덱사메타손), 중성 지질(예: DMPE, DOPE, DSPE, DPPE, DMPC, DOPC, DSPC, 또는 DPPC), 스핑고지질 및 페길화 지질(예: DMG-PEG, DMPE-PEG 또는 세라미아드-PEG)로부터 선택될 수 있다. 이러한 헬퍼 지질은 단독으로 또는 이의 둘 이상의 유형의 조합으로 사용될 수 있다. 양이온성 지질 또는 리피도이드를 포함하는 치료적 활성제의 미립자 제형용 부형제로서 또한 유용한 것은 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 알킬렌 단위의 공중합체이다.
이러한 복합체의 형성에 적합한 추가의 성분은 문헌[참조: A.C. Silva et al., Current Drug Metabolism, 16, 2015, 3-16 및 그 안에서 논의된 문헌]에 언급되어 있다.
바람직하게는, 양이온성 지질 또는 양이온성 리피도이드와 핵산의 복합체를 포함하는 입자 제형은 지질 및 리피도이드(존재하는 임의의 헬퍼 지질 포함)의 총 중량 대 핵산의 중량의 비뷸이 0.1 내지 200, 더욱 바람직하게는 0.2 내지 150, 가장 바람직하게는 0.5 내지 100의 범위이도록 하는 양으로 핵산을 함유한다.
상기 논의를 고려하여, 본 발명의 맥락에서 사용하기 위한 나노 입자 또는 미세입자 제형이 또한 바람직하며, 여기서 치료적 활성제는 mRNA이며, mRNA는 양이온성 중합체 또는 올리고머와의 복합체 형태로 또는 양이온성 지질 또는 양이온성 리피도이드와의 복합체 형태로 포함된다는 것이 자명할 것이다. 양이온성 부형제의 적합하고 바람직한 유형과 관련하여, 상기 고려 사항이 계속 적용된다. 또한, 이들 바람직한 입자 제형의 경우, 입자 제형 중의 입자는 전형적으로 1 내지 4000nm, 더욱 바람직하게는 2 내지 2500nm, 가장 바람직하게는 5 내지 1000nm 범위의 평균 입자 직경을 나타낸다. 나노 입자 또는 미세입자 제형 중 입자 직경의 상한치는 바람직하게는 20㎛, 더욱 바람직하게는 10㎛, 가장 바람직하게는 5㎛이다.
치료적 활성제 이외에, 입자 제형은 임의의 첨가제로서 또는 임의의 첨가제들로서 치료제의 전달 동안, 바람직하게는 치료제로서의 핵산의 세포로의 전달 동안 이펙터 기능을 발휘하는 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 폴리음이온, 상술한 바와 같은 지질, 양이온성 펩티드와 같은 폴리플렉스의 형성을 위한 상기 논의된 것들 이외의 추가의 폴리양이온, 차폐성 올리고머 또는 중합체, 폴록사머(플루로닉으로서 공지되기도 함), 폴록사민, 표적화 리간드, 엔도좀 용해제, 세포 침투 및 신호 펩티드, 자기 및 비자성 나노 입자, RNAse 억제제, 형광 염료, 방사성 동위 원소 또는 의료 영상용 조영제일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 용어 "이펙터 기능"은 생물학적 표적에서 또는 중에서 또는 생물학적 표적 주위에서 조성물의 치료적 활성제의 의도된 생물학적 효과를 달성하는 것을 지지하는 임의의 기능을 포함한다. 예를 들어, 핵산 전달용 조성물은 스터퍼 물질로서 비코딩 핵산 또는 비-핵산 폴리음이온을 포함하도록 제형화되었다(참조: Kichler et al. 2005, J Gene Med, 7, 1459-1467). 이러한 스터퍼 물질은 의도된 생물학적 효과를 갖는 핵산의 용량을 감소시키면서 이러한 스터퍼 물질의 부재하에 더 높은 핵산 용량에서 수득되는 효과의 정도 또는 정도를 유지하는데 적합하다. 비핵산 폴리음이온은 또한 감소된 독성에서 연장된 생체내 유전자 발현을 수득하는데 사용되었다(참조: Uchida et al. 2011, J Control Release, 155, 296-302). 핵산과 양이온성 중합체 또는 올리고머의 복합체를 포함하는 본 발명의 입자 제형은 또한 리포폴리플렉스의 경우와 같이 양이온성, 음이온성 또는 중성 지질을 포함할 수 있다(참조: Li and Huang in "Nonviral Vectors for Gene Therapy", Academic Press 1999, Chapter 13, 295-303). 리포폴리플렉스는 상기 제시된 바와 같은 화학식 IV에 상응하는 리피도이드를 사용하여 상기 제시된 바와 같은 화학식 II 또는 III에 상응하는 중합체로부터 유리하게 제조될 수 있다. 또한, 본 발명에 사용된 입자 제형은 폴리플렉스의 형성을 위해 상기 논의된 것들 이외의 올리고- 또는 폴리양이온을 포함할 수 있다. 이러한 추가의 폴리양이온은 핵산의 목적하는 압축 정도를 달성하는데 유용할 수 있거나, 폴리양이온성 펩티드의 경우, 이전에 기재된 바와 같은 핵 국소화 신호 기능을 가질 수 있다(참조: Ritter et al. 2003, J Mol Med, 81, 708-717). 차폐성 중합체, 예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)이 또한 본 발명의 맥락에서 사용된 입자 제형에 포함될 수 있고, 빈번하게 사용되어, 예를 들어, 핵산과 양이온성 부형제의 착물을 응집 및/또는 생물학적 환경에서 목적하지 않은 상호작용(옵소닌화), 예를 들어, 혈청 성분, 혈액 세포 또는 세포외 매트릭스와의 상호작용으로부터 안정화시킨다. 차폐는 또한 핵산-포함 조성물의 독성을 감소시키는 데 적합할 수 있다(참조: Finsinger et al. 2000, Gene Ther, 7, 1183-1192). 예를 들어, PEG와 같은 차폐 중합체는 다른 올리고머 또는 중합체, 또는 입자 제형에 존재할 수 있는 지질 또는 리피도이드에 직접 공유 결합될 수 있다. 커플링은 중합체 백본에서, 바람직하게는 가능하다면 중합체 백본 또는 덴드리머의 말단에서 달성될 수 있다. 그러나, 커플링은 또한 화학식 (1) 내지 (4), II, III, IV 또는 상기한 (a1), (a2) 또는 (b1) 내지 (b4) 중 어느 하나에 함유된 아미노 그룹에서 달성될 수 있다.
핵산과 양이온성 부형제의 복합체를 포함하는 입자 제형에 유용한 성분일 수 있는 문헌에 기재된 다른 예시적인 차폐 중합체는 하이드록시 에틸 전분(HES; Noga et al. Journal of Controlled Release, 2012. 159(1): 92-103), PAS-폴리펩티드(Pro, Ala, Ser 폴리펩티드: Schlapschy et a. Protein Eng Des Sel. 2013 Aug;26(8): 489-501) 또는 폴리사르코신(Psar,: Heller et al. Macromol Biosci 2014); 14: 1380-1395)을 포함한다.
표적화 리간드가, 예를 들어, 표적 세포의 우선적이고 개선된 형질 감염을 위한 핵산 전달용 입자 제형에 유용할 수 있다(참조: Philipp and Wagner in "Gene and Cell Therapy - Therapeutic Mechanisms and Strategy", 3rd Edition, Chapter 15. CRC Press, Taylor & Francis Group LLC, Boca Raton 2009). 표적화 리간드는 본 발명의 조성물에 직접적 또는 간접적인 방식으로 표적 인식 및/또는 표적 결합 기능을 부여하는 임의의 화합물일 수 있다. 예시적인 표적화 리간드는 WO 2011/076391에 개시된 프로스타사이클린 유사체, 예를 들어, 일로프로스트 또는 트레프로스티닐이다. 항체는 또한 표적화 리간드로서 작용할 수 있다. 나노 입자 또는 미세입자용 리간드로서, 엽산 및 N-아세틸 갈락토사민이 언급될 수 있다. 가장 일반적인 용어로, 표적은 표적화 리간드가 분자 상호작용을 통해 특이적으로 결합할 수 있고, 이러한 결합이 표적 조직 중에서 및/또는 표적 세포에서 또는 표적 세포 중에서 조성물에 포함된 치료제, 예를 들어, 핵산의 우선적 축적을 궁극적으로 유도하는 뚜렷한 생물학적 구조이다. PEG (또는 HES 및 PSar) 쇄와 유사하게, 표적화 리간드는, 예를 들어, 중합체 백본 또는 덴드리머의 말단에 커플링될 수 있다. 그러나, 커플링은 또한 화학식 (1) 내지 (4), II, III, IV 또는 상기한 (a1), (a2) 또는 (b1) 내지 (b4) 중 어느 하나의 그룹에서 달성될 수 있다.
또한, 엔도좀 분해제, 예를 들어, 엔도좀 분해 펩티드(참조: Plank et al. 1998, Adv Drug Deliv Rev, 34, 21-35) 또는 세포내 이입 핵산의 엔도좀 방출을 향상시키는 데 적합한 임의의 다른 화합물은 본 발명의 조성물의 유용한 성분이다. 유사하게, 세포 침투 펩티드(다른 맥락에서, 단백질 형질 도입 도메인으로서 공지되기도 함)(참조: Lindgren et al. 2000, Trends Pharmacol Sci, 21, 99-103)는 핵산의 세포내 전달을 매개하기 위해 본 발명의 조성물의 유용한 성분일 수 있다. 소위 TAT 펩티드는 이 부류에 속하며, 핵 국소화 기능을 또한 갖는다(참조: Rudolph et al. 2003, J Biol Chem, 278, 11411-11418).
동결 방지 첨가제
나노 입자 또는 미세입자 제형 이외의 추가 성분으로서, 본 발명에 따르는 조성물은 1개 또는 2개의 하이드록시 그룹으로 치환된 C3-C5 알칸으로부터 선택된 동결 방지 첨가제를 포함한다. 숙련된 독자에 의해 이해되는 바와 같이, 이러한 치환된 알칸은 선형 또는 분지형 알칸일 수 있다. 그들은 3 내지 5개의 탄소 원자를 갖는다. 하이드록시 치환체의 수에 따라, 그들은 모노- 또는 디알콜로서, 또는 알칸올 또는 알칸디올로서 지칭될 수 있다.
바람직하게는, 동결 방지 첨가제는 적어도 하나의 2차 하이드록시 그룹(예: 추가의 하이드록시 그룹 없는 하나의 2차 하이드록시 그룹, 또는 하나의 2차 하이드록시 그룹 및 하나의 1차 하이드록시 그룹, 또는 2개의 2차 하이드록시 그룹)을 포함한다.
보다 바람직하게는, 동결 방지 첨가제는 1,2-프로판디올, 2-프로판올, 1,2-부탄디올 및 1,3-부탄디올로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 동결 방지 첨가제는 1,2-프로판디올이다.
조성물
상기 주시된 바와 같이, 본 발명은 제1 측면으로서 현탁액 조성물 및 제2 측면으로서 고체 조성물을 제공하며, 이들 각각은 치료적 활성제의 나노 입자 또는 미세입자 제형 및 상기 추가로 상세히 논의된 동결 방지 첨가제를 포함한다.
본 발명에 따르는 조성물이 치료적 활성제를 함유하고 환자에게 치료적 활성제를 투여하기에 적합하기 때문에, 그들은 치료적 조성물 또는 약제학적 조성물로 지칭될 수 있다.
특히, 본 발명의 제1 측면에 따르는 현탁액 조성물은 다음을 포함한다:
(i) 액체 상에 현탁된 치료적 활성제의 나노 입자 또는 미세입자 제형, 및
(ii) 1개 또는 2개의 하이드록시 그룹으로 치환된 C3-C5 알칸으로부터 선택된 적어도 하나의 동결 방지 첨가제.
이해되는 바와 같이, 치료제, 이의 입자 제형 및 동결 방지 첨가제의 적합하고 바람직한 구현예에 관한 정보는 이 맥락에서 계속 적용된다.
현탁액 조성물은 바람직하게는 조성물의 총 용적을 기준으로 하여 입자 제형에 0.01 내지 50㎎/ml, 보다 바람직하게는 0.02 내지 30mg/ml의 농도로 함유되는 치료적 활성제를 제공하는 양으로 입자 제형의 입자를 포함한다.
동결 방지 첨가제는 바람직하게는 0.5 내지 50% w/v, 보다 바람직하게는 1 내지 40% w/v, 가장 바람직하게는 1 내지 30% w/v의 농도로 현탁액 조성물에 함유되며, 여기서 백분율 값은 동결 방지 첨가제의 중량을 조성물의 총 용적의 100ml당 g 단위로 나타낸다. 전형적으로, 동결 방지 첨가제는 액체 상에 함유되고, 바람직하게는 용해되며, 여기서 입자 제형은 현탁된다. 그러나, 그것은 또한 액체 상에 현탁된 입자와 부분적으로 연관될 수 있다.
본 발명의 제1 측면에 따르는 현탁액 조성물의 액체 상은 전형적으로 용매 로서 물을 함유한다. 바람직하게는, 50용적% 이상, 보다 바람직하게는 70용적% 이상(20℃에서 액체 상의 총 용적을 기준으로 하여)이 물에 의해 제공된다. 보다 바람직하게는, 물 및 동결 방지 첨가제가 액체 상에 함유된 유일한 용매이다.
액체 상의 예시적인 추가의 임의의 첨가제로서, 염, 당, 유기 용매 및 완충제로부터 선택된 하나 이상이 언급될 수 있다.
용어 "현탁된"에 의해 암시된 바와 같이, 치료적 활성제의 나노 입자 또는 미세입자 제형은 연속 액체 상에서 불연속 고체 상을 형성한다.
일반적으로, 현탁액 조성물은 동결 방지 첨가제를 임의로 그 안에 용해된 추가의 첨가제와 함께 포함하는 하나의 연속 액체 상, 및 그 안에 불연속 고체 상으로서 현탁된 치료적 활성제의 나노 입자 또는 미세입자 제형을 갖는 2상 현탁액 조성물로서 제공되는 것이 바람직하다.
제2 측면의 고체 조성물은
(i) 치료적 활성제의 나노 입자 또는 미세입자 제형, 및
(ii) 1개 또는 2개의 하이드록시 그룹으로 치환된 C3-C5 알칸으로부터 선택된 적어도 하나의 동결 방지 첨가제를 포함하고,
제1 측면에 따르는 조성물을 동결시킴으로써 수득될 수 있다.
고체 조성물은 고체 조성물을 수득하기 위해 동결될 수 있는 현탁액 조성물과 동일한 성분을 함유한다. 따라서, 치료제, 이의 입자 제형, 동결 방지 첨가제, 및 현탁액 조성물을 위해 제공된 액체 상 및 이의 성분의 적합하고 바람직한 구현예에 관한 정보는 고체 조성물에 계속 적용된다. 그러나, 숙련된 독자에 의해 이해되는 바와 같이, 고체 조성물 및 현탁액 조성물은 현탁액 조성물의 액체 상이 고체 조성물에서 고형화되었다는 점에서 상이하다. 그 정도까지, 고체 조성물은 동결된 액체의 고체 연속 상에서 치료제의 나노 입자 또는 미세입자 제형의 분산액을 함유한다. 상기에 따라, 동결 방지 첨가제는 전형적으로 입자 제형이 분산되는 연속 상에 함유된다.
상기에 비추어 볼 때, 조성물이 (i) 치료적 활성제가 mRNA이고 mRNA가 양이온성 중합체 또는 올리고머와의 복합체 형태로 또는 양이온성 지질 또는 양이온성 리피도이드와의 복합체 형태로 입자 제형에 포함되는 나노 입자 또는 미세입자 제형 및 (ii) 동결 방지 첨가제로서 1,2 프로판디올을 포함하는 본 발명에 따르는 현탁액 조성물 또는 고체 조성물로서 또한 바람직하다는 것이 또한 명백할 것이다. 양이온성 중합체 또는 올리고머의 적합하고 바람직한 유형, 및 양이온성 지질 및 양이온성 리피도이드의 바람직한 유형과 관련하여, 상기 고려 사항이 계속 적용된다. 또한 이러한 바람직한 조성물에 대해, 입자 제형 중 입자는 전형적으로 1 내지 4000nm, 보다 바람직하게는 2 내지 2500nm, 가장 바람직하게는 5 내지 1000nm 범위의 평균 입자 직경을 나타낸다. 나노 입자 또는 미세입자 제형 중 입자 직경의 상한치는 바람직하게는 20㎛, 보다 바람직하게는 10㎛, 가장 바람직하게는 5㎛이다.
약제학적 측면
본 발명의 제1 측면에 따르는 현탁액 조성물은 그 안에 함유된 치료적 활성제를 대상체에게 투여하기에 적합하다. 상기 설명된 바와 같이, 상기 조성물은 다른 동결 방지제를 함유하는 입자 조성물과 비교하여 동결 중 또는 동결 후 입자의 응집을 방지하고, 기도로 또는 기도를 통한 투여, 특히 폐 투여 또는 비강 투여를 위한 기능성이 유지되면서 동결된 상태로 유지될 수 있다는 예상치 못한 이점을 갖는다. 따라서, 현탁액 조성물의 바람직한 투여 경로는 기도로 또는 기도를 통한 투여, 특히 폐 투여 또는 비강 투여이다.
그러나, 본 발명에 따르는 조성물은 또한, 예를 들어, 동결 동안 또는 후에 입자 응집이 동결 방지제에 의해 방지되는 효과를 활용하기 위해, 현탁액의 형태로 정맥내 투여와 같은 치료적 활성제의 나노 입자 또는 미세입자 제형에 대해 당업계에 공지되어 있는 다른 투여 경로를 통해 투여될 수 있다는 것이 숙련된 독자에 의해 이해될 것이다. 이러한 맥락에서, 1개 또는 2개의 하이드록시 그룹으로 치환된 C3-C5 알칸의 존재가, 특히 치료제가 핵산, 바람직하게는 RNA, 더욱 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 가장 바람직하게는 mRNA인 경우, 현탁액 조성물이 정맥내 투여와 같은 대안적인 경로를 통해 투여되는 경우, 치료제의 효능에 대해 유익한 영향을 미칠 수 있다는 것이 밝혀졌다.
치료적 활성제가 핵산, 바람직하게는 RNA, 더욱 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 가장 바람직하게는 mRNA인 경우, 핵산은 기도 내에서 또는 기도를 통해 표적 세포로 전달될 수 있다. 용어 "표적 세포로 전달된"은 바람직하게는 RNA, 바람직하게는 mRNA과 같은 단일 가닥 RNA의 세포로의 이동을 의미한다.
조성물은 적절한 용량으로 대상체에 투여될 수 있다. 투여량 섭생은 주치의 및 임상 요인에 의해 결정될 것이다. 의학 분야에서 익히 공지되어 있는 바와 같이, 임의의 한 대상체에 대한 투여량은 대상체의 크기, 체표면적, 연령, 투여될 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반적인 건강 및 동시에 투여되는 다른 약물을 포함하는 많은 요인에 따라 달라진다. 치료적 활성 물질의 전형적인 용량은, 예를 들어, 1ng 내지 수 g의 범위일 수 있다. (m)RNA 요법의 바람직한 경우에 적용하면, 발현 또는 발현 억제를 위한 (m)RNA의 투여량은 이 범위에 상응해야 하지만, 특히 전술한 요인을 고려할 때 이 예시적인 범위 이하 또는 이상의 용량이 예상된다. 일반적으로, 약제학적 조성물의 규칙적인 투여로서의 섭생은 0.01㎍ 내지 10mg 단위/체중 kg/일의 범위여야 한다. 섭생이 연속 주입인 경우, 그것은 또한 각각 1㎍ 내지 10mg 단위/체중 kg의 범위여야 한다. 진행은 주기적인 평가로 모니터링될 수 있다. 투여량은 다양하지만, 본 발명의 조성물의 성분으로서 (m)RNA의 투여에 바람직한 투여량은 (m)RNA의 분자의 약 106 내지 1019 카피이다.
액체에 현탁된 미립자 조성물로부터 에어로졸을 형성하거나 이러한 조성물을 분무하기 위한 장치는 당업계에 공지되어 있고, 시판된다. 그들은 기도로 또는 기도를 통한 본 발명의 제1 측면에 따르는 현탁액 조성물의 투여, 특히 폐 투여를 달성하기 위해 사용될 수 있다. 코를 통한 투여의 경우, 예를 들어, 비강 분무 장치 또는 비강 주입이 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 한 측면은 액체에 현탁된 미립자 조성물로부터 에어로졸을 형성하거나 이러한 조성물을 분무하기 위한 장치에 관한 것으로, 이 장치는 본 발명에 따르는 현탁액 조성물을 포함한다. 상기 장치는 바람직하게 계량된 용량 흡입기, 분무기 및 비강 분무 장치로부터 선택된 흡입기이다.
또한, 상기 장치에 사용된 본 발명에 따르는 조성물의 경우, 바람직한 구현예와 함께 상기 제공된 정보가 계속 적용된다. 따라서, 예를 들어, 이러한 장치에 사용되는 바람직한 현탁액 조성물은 (i) 치료적 활성제가 mRNA이고 mRNA가 양이온성 중합체 또는 올리고머와의 복합체 형태로 또는 양이온성 지질 또는 양이온성 리피도이드와의 복합체 형태로 입자 제형에 포함되는 나노 입자 또는 미세입자 제형 및 (ii) 동결 방지 첨가제로서 1,2 프로판디올을 포함한다. 적합하고 바람직한 유형의 양이온성 중합체 또는 올리고머, 및 바람직한 유형의 양이온성 지질 및 양이온성 리피도이드와 관련하여, 상기 고려 사항이 계속 적용된다. 또한, 이러한 바람직한 조성물의 경우, 입자 제형 중 입자는 전형적으로 1 내지 4000nm, 보다 바람직하게는 2 내지 2500nm, 가장 바람직하게는 5 내지 1000nm 범위의 평균 입자 직경을 나타낸다. 나노 입자 또는 미세입자 제형 중 입자 직경의 상한치는 바람직하게는 20㎛, 보다 바람직하게는 10㎛, 가장 바람직하게는 5㎛이다.
상기 설명된 바와 같이, 본 발명에 따르는 현탁액 조성물은 제조, 동결된 상태로 저장 및 해동에 의한 회수 후 편리하게 투여될 수 있다. 그러나, 본 발명에 따르는 현탁액 조성물은 또한 제조 직후에 투여될 수 있음이 이해될 것이며, 1개 또는 2개의 하이드록실 그룹으로 치환된 C3-C5 알칸의 존재가, 특히 치료제가 핵산, 바람직하게는 RNA, 보다 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 가장 바람직하게는 mRNA 인 경우, 심지어 새로 제조된 조성물에서도 치료제의 효능에 유익한 영향을 미칠 수 있다는 것이 밝혀졌다.
따라서, 본 발명은 또한 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명에 따르는 현탁액 조성물을 제공하고, 바람직하게는 상기 조성물은 기도로 또는 기도를 통해 투여되어야 한다. 보다 바람직하게는, 상기 조성물은 폐 투여 또는 비강 투여를 통해 투여되어야 한다. 상기 조성물이 투여될 수 있는 환자는 동물 및 인간을 포함한다.
또한, 본 발명에 의해 이용 가능한 것은 본 발명의 현탁액 조성물을, 상기 조성물에 함유된 치료적 활성제가 예방 또는 치료 효과를 유발하도록 하기 위해 바람직하게는 기도로 또는 기도를 통한 투여를 통해, 더욱 바람직하게는 폐 투여 또는 비강 투여를 통해 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법이다. 또한, 이러한 맥락에서 용어 "환자"는 동물 및 인간을 포함한다.
또한 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명에 따르는 조성물의 경우, 바람직한 구현예에 대해 상기 제공된 정보가 계속 적용된다. 따라서, 예를 들어, 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 바람직한 현탁액 조성물은 (i) 치료적 활성제가 mRNA이고 mRNA가 양이온성 중합체 또는 올리고머와의 복합체 형태로 또는 양이온성 지질 또는 양이온성 리피도이드와의 복합체 형태로 입자 제형에 포함되는 나노 입자 또는 미세입자 제형 및 (ii) 동결 방지 첨가제로서 1,2 프로판디올을 포함한다. 적합하고 바람직한 유형의 양이온성 중합체 또는 올리고머, 및 바람직한 유형의 양이온성 지질 및 양이온성 리피도이드와 관련하여, 상기 고려 사항이 계속 적용된다. 또한 이러한 바람직한 조성물의 경우, 입자 제형의 입자는 전형적으로 1 내지 4000nm, 보다 바람직하게는 2 내지 2500nm, 가장 바람직하게는 5 내지 1000nm 범위의 평균 입자 직경을 나타낸다. 나노 입자 또는 미세입자 제형의 입자 직경에 대한 상한치는 바람직하게는 20㎛, 보다 바람직하게는 10㎛, 가장 바람직하게는 5㎛이다.
상기 주시된 바와 같이, 투여는 조성물의 제조 직후에 달성될 수 있지만, 투여가 현탁액 조성물이 적어도 1회 동결되고 해동된 후에 달성되면 동결 방지 첨가제의 효과가 현저하다.
본 발명의 현탁액 조성물을 투여함으로써 질환이 치료되거나 예방될 수 있다. 용어 "질환"은 본 발명의 조성물을 사용함으로써 치료되고, 예방되거나 또는 백신화될 수 있는 임의의 인식가능한 병리학적 상태를 지칭한다. 상기 질환은, 예를 들어, 선척적, 후천적, 감염성 또는 비감염성, 연령 관련, 심혈관, 대사, 장, 종양성(특히 암) 또는 유전적일 수 있다. 질환은, 예를 들어, 생리학적 과정, 분자 과정, 차례로, 예를 들어, 유기체의 유전 장비, 거동적, 사회적 또는 환경적 요인, 예를 들어, 화학 물질 또는 방사선에의 노출에 기반할 수 있는 유기체 내의 생화학적 반응의 불규칙성에 기반할 수 있다. 본 발명에 따르는 현탁액 조성물은 폐 질환의 치료 또는 예방에 사용하기에 특히 적합하다.
상기 기재된 바람직한 구현예와 일치하여, 치료적 활성제가 RNA, 더욱 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 가장 바람직하게는 mRNA인 경우, 본 발명의 현탁액 조성물은 RNA 기반 요법에 사용될 수 있다. RNA 분자, 바람직하게는 mRNA의 분자는 단백질을 인코딩하는 서열을 포함하고, 따라서 RNA 기반 요법에 사용될 수 있고, 여기서 RNA, 바람직하게는 mRNA는 치료 또는 예방 효과를 갖는 치료적 또는 약제학적 활성 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩한다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 본 발명의 현탁액 조성물은 하기 표에 인용된 질환의 치료 또는 예방에서 RNA 기반 요법에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르는 RNA 기반 요법은 하기 표에 인용된 질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다 .
따라서, 본 발명의 현탁액 조성물은 하기 표에 기재된 유전자 결함이 이어서 본 발명의 RNA 분자, 바람직하게는 mRNA 분자를 사용하여 전사체 대체 요법/효소 대체 요법에 의해 치료 또는 예방될 수 있는 질환을 유도하는 경우에 RNA 기반 요법에 사용될 수 있고, 여기서 RNA 분자는 개시된 결함 있는 유전자를 보상하는 온전한 버전의 단백질 또는 이의 기능적 단편을 인코딩한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 현탁액 조성물은 본 발명에 따르는 RNA-기반 요법에 사용될 수 있으며, 여기서 RNA, 바람직하게는 mRNA는 치료 또는 예방 효과를 갖는 치료적 또는 약제학적 활성 폴리펩티드, 단백질 또는 펩티드를 인코딩하고, 상기 폴리펩티드, 단백질 또는 펩티드는 하기 표에 요약된 유전자에 의해 인코딩된 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 현탁액 조성물은 폐 질환의 치료 또는 예방에서 RNA 기반 요법에 사용하기에 특히 적합하다. 예시적인 질환으로서, 다음 표에 인용된 알파-1-항트립신, 천식(asthma), 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 계면활성제 대사 기능 장애(Surfactant metabolism dysfunction) 또는 원발성 섬모 운동 이상증(Primary ciliary dyskinesia)이 언급될 수 있다.
다른 예시적인 구현예에서, 본 발명의 현탁액 조성물은 고셔병(Gaucher disease), 파브리병(Fabry disease), MPS I, MPS II(헌터 증후군), MPS VI 및 글리코겐 저장 질환, 예를 들어, 글리코겐 저장 질환 I형(폰 기에르케병(von Gierecke's disease)), II형(폼페병(Pompe's disease)), III형(코리병(Cori's disease)), IV형(안데르센병(Andersen's disease)), V형(맥아들병(McArdle's disease)), VI형(허스병(Hers disease)), VII형(타우리병(Tauri's disease)), VII형, IX형, X형, XI형(판코니-비켈 증후군(Fanconi-Bickel syndrome)), XI형, 또는 0형과 같은 리소좀 질환의 치료 또는 예방에서 RNA-기반 요법에 사용될 수 있다. 전사체 대체 요법/효소 대체 요법은 근본적인 유전적 결함에 유익하게 영향을 미치지 않지만, 환자가 결핍된 효소의 농도를 증가시킨다. 예로서, 폼페병에서 전사체 대체 요법/효소 대체 요법은 결핍된 리소좀 효소 산 알파-글루코시다제(GAA)를 대체한다.
추가의 예에 따르면, 본 발명에 따르는 RNA-기반 요법은 암(cancer), 심혈관 질환(cardiovascular disease), 바이러스 감염(viral infection), 면역 장애(immune dysfunction), 자가면역 질환(autoimmune disease), 신경학적 장애(neurologic disorder), 유전적 대사 장애(inherited metabolic disorders) 또는 유전적 장애(genetic disorder) 또는 세포에서 생성된 단백질 또는 단백질 단편이 환자에 유익한 영향을 미칠 수 있는 임의의 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 암의 예는 두경부암(head and neck cancer), 유방암(breast cancer), 신장암(renal cancer), 방광암(bladder cancer), 폐암(lung cancer), 전립선암(prostate cancer), 골암(bone cancer), 뇌암(brain cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 항문암(anal cancer), 결장암(colon cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 충수암(appendix cancer), 안암(eye cancer), 위암(gastric cancer), 백혈병(leukemia), 림프종(lymphoma), 간암(liver cancer), 피부암(skin cancer), 난소암(ovarian cancer), 음경암(penile cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 고환암(testicular cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 질암(vaginal cancer), 외음부암(vulvar cancer), 자궁 내막암(endometrial cancer), 심장암(cardiac cancer) 및 육종(sarcoma)을 포함한다. 심혈관 질환의 예는 아테롬성 동맥경화증(atherosclerosis), 관상 동맥 심장 질환(coronary heart disease), 폐 심장 질환(pulmonary heart disease) 및 심근병증(cardiomyopathy)을 포함한다. 면역 장애 및 자가면역 질환의 예는 류마티스성 질환(rheumatic diseases), 다발성 경화증(multiple sclerosis) 및 천식(asthma)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 바이러스 감염의 예는 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus), 단순 포진 바이러스(herpes simplex virus), 인간 유두종 바이러스(human papillomavirus) 뿐만 아니라 B형 및 C형 간염 바이러스(hepatitis B and C virus)에 의한 감염을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 신경학적 장애의 예는 파킨슨병(Parkinson's disease), 다발성 경화증, 및 치매(dementia)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 유전적 대사 장애의 예는 고셔병(Gaucher's disease) 및 페닐케톤뇨증(Phenylketonuria)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
인간 유전자 및 유전적 장애의 비제한적인 예
질환 병리학 유전자, 유전
혈액 질환
판코니 빈혈(Fanconi Anemia) 빈혈 및 호중구 감소증, DNA 복구 메커니즘이 영향을 받는다는 증거 FANCA, 상 염색체 열성
혈우병(Hemophilia)-A 비정상적인 출혈 응고 인자 VIII, X-염색체 열성
혈우병-B 비정상적인 출혈 응고 인자 IX, X-염색체 열성
유전성 구상 적혈구증(Hereditary Spherocytosis)(다양한 유형) 구형 적혈구(구형 적혈구) 안키린(ANK1)
발작성 야행성 혈색소뇨증(Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria) 빈혈 및 소변내 혈액 존재 PIG-A, X-염색체
만발성 피부 포르피린증(Porphyria cutanea tarda) 헴의 과잉 생산, 철분 과부하 유로포르피리노겐 탈카복실라제(UROD), 상 염색체 열성
중증 복합 면역 결핍(SCID) 손상된 DNA 합성으로 인해 체액 및 세포 면역에 심각한 면역 결핍 아데노신 데아미나제, 상 염색체 열성, IL-2R-γ, JAK3, (IL-7R-α, RAG1/2, 아르테미스, CD3δ, CD3ε
겸상 적혈구 빈혈(Sickle-cell anemia) 비정상적인 헤모글로빈(HbS) β-헤모글로빈(HB), 상 염색체 열성
지중해 빈혈(Thalassemia)(α- 및 β 형태) α- 또는 β 헤모글로빈의 부족으로 빈혈 초래 HBA1 및/또는 HBA2의 결실
폰 빌레브란트병(Von Willebrand disease)(공지된 세 가지 유형, III형이 가장 심각함) 비정상적인 출혈, 혈우병 A 및 B와 유사한 출혈 상 염색체 우성 및 열성 형태
암
악성 흑색종(Malignant melanoma) P16 돌연변이는 섬유아세포의 조절되지 않은 증식을 유도한다 사이클 의존성 키나제 억제제 2(CDKN2)
신경섬유종증(Neurofibromatosis) (2개 유형) 청각 신경의 양성 종양은 난청을 유도한다 NF1, NF2, 상 염색체 우성
난청(Deafness)(귀))
난청 청력 손실 난청-1A(DFNB1), 상 염색체 열성
펜드레드 증후군(Pendred syndrome) 청력 손실 펜드린(PDS), 상 염색체 열성
심장
모세혈관 확장성 운동실조(Ataxia telangiectasia) DNA 손상 복구 방해, ATM,
아테롬성 동맥경화증(Atherosclerosis) 혈중 콜레스테롤의 증가 apoE,
LQT 증후군(긴 QT) 칼륨 채널 결함 LQT1 및 다른 유전자
폰-히펠 린다우 증후군(Von-Hippel Lindau Syndrome) 혈관의 비정상적인 성장은 암을 초래할 수 있다 VHL, 상 염색체 우성
윌리엄스 뷰렌 증후군(William's Beuren Syndrome) 엘라스틴의 결실은 혈관 결함, 대동맥판 상부 협착증을 초래한다 엘라스틴 및 LIM 키나제 유전자의 결실
대사 장애 및 글리코겐 저장 질환
부신백질 이영양증(Adrenoleukodystrophy) 교란된 지방산 수송 및 대사 ABCD1, X-염색체
알캅톤뇨증(Alkaptonuria) 질소 대사 결함, 산소에 노출되면 소변이 짙어짐 호모겐티스산 옥시다제, 상 염색체 열성
당뇨병 I형 교란된 인슐린 생산 IDDM1, IDDM2, GCK, ...
갈락토스혈증(Galactosemia) 갈락토스 대사 장애 갈락토스-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제 유전자(GALT), 상 염색체 열성
고슈병(Gauche disease) 지방 대사 장애 글루코세레브로시다제
글루코스 갈락토시다제 흡수 장애 장 내강의 교란된 글루코스 및 갈락토스 수송은 설사를 일으킨다 SGLT1, 상 염색체 열성
글리코겐 저장 질환 I형, 폰 기에르케병(Von-Gierke's disease) 간 및 신장에 글루코스의 축적 글루코스-6-포스파타제, 상 염색체 열성
글리코겐 저장 질환 II형, 폼페병(Pompe's disease) 간, 심장, 골격근, 심비대에 글리코겐의 축적 α-1-글루코시다제, 상 염색체 열성
글리코겐 저장 질환 III형, 코리병(Cori's disease) 간, 심장, 골격근, 간 비대에 글리코겐의 축적 탈분지화 효소, 상 염색체 열성
글리코겐 저장 질환 V형, 맥아들병(McArdle's disease) 근육 세포에서 글리코겐을 사용할 수 없음 근육 포스포릴라제, 상 염색체 열성
글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제 글루타티온을 유지하지 못하면 용혈성 빈혈을 초래한다 G6PD, X-염색체 열성
유전성 혈색소 침착증(Hereditary Hemochromatosis)(4개 유형) 장에서 과도한 철분 흡수로 인한 신체(특히, 간)에서 과도한 철분 혈색소 침착증(HFE)
호모시스틴뇨증(Homocystinuria) 질소 대사 결함 시스타티온 신세타제 결함, 상 염색체 열성
레쉬 니한 증후군(Lesh Nyhan Syndrome) 통풍, 요산 결석 및 근육 손실로 이어지는 요산의 축적 HPRT1, X-염색체
단풍당밀뇨증(Maple Syrup Urine Disease) 아미노산 대사 결함은 α-케토산의 축적 및 치료하지 않으면 첫 달에 사망을 초래한다 분지된-쇄-알파-데하이드로게나제 (BCKDH)
멘케스 증후군(Menkes' Syndrome) 구리 흡수 능력 감소는 치료하지 않으면 유아기 사망을 초래한다 ATP7A, X-염색체 열성
비만(Obesity) 체중 증가 다유전자성, 상승된 렙틴 수준이 역할을 할 수 있다
페닐케톤뇨증(Phenylketonuria) 페닐알라닌을 티로신으로 분해하지 못하면 정신 지체를 초래한다 페닐알라닌 하이드록실라제 (PAH), 상 염색체 열성
탄지에르병(Tangier disease) 혈장 고밀도 지단백질 수준의 감소 ATP-결합 카세트-1 유전자 (ABCA1)
젤위거 증후군(Zellweger Syndrome)(유아기 사망 초래) 혈액 내 높은 수준의 철 및 구리 PXR1 (퍼옥시좀의 표면 상 수용체)
윌슨병(Wilsons Disease) 뇌 및 간에 구리 축적 ATP7B (P형 ATPase), 상 염색체 열성
근골격계
연골무형성증(Achondroplasis) 연골 세포의 느린 증식으로 인해 큰 머리를 갖는 작은 키 섬유아세포 성장 인자 수용체 3 (FGF3R),
사르코-마리-투스 증후군(Charcot-Marie-Tooth Syndrome) 및 이의 더 심각한 형태인 데제린-소타스 증후군(Dejerine-Sottas Syndrome) 사지 근육의 퇴행 상이한 유전자 돌연변이로 인한 다양한 형태, 상 염색체 열성 및 X-염색체
코케인 증후군(Cockayne syndrome) (2개 유형) 조기 성숙 및 작은 키, "즉석(on the fly)" DNA 복구의 손실 그룹 8 절제 복구 교차-보완 단백질(ERCC8)
연골외배엽 이형성증(Chondroectodermal dysplasia) 뼈의 기형 및 다지증 EVC, 상 염색체 열성
이영양성 형성 이상(Diastrophic dysplasia; DTD) 기형 손, 황산염 트랜스포터 결함 DTDST 유전자
뒤쉔 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy) 후속적 기능 상실로 인한 근육 조직의 비대 DMD, X-염색체 열성
진행성 골화성 섬유이형성증(Fibrodysplasia Ossificans Progressiva) 이소성 골 혈성 NOG, BMP, 상 염색체 우성
프리드리히 운동 실조(Friedreich's ataxia) 심장 비대 및 근육 조정의 점진적 상실 프라탁신, 상 염색체 열성
저인산증(Hypophosphatasia) 광물화 과정에 영향을 미치는 알칼리성 포스파타제의 비정상적 버전의 생성 ALPL, 상 염색체 열성
마르판 증후군(Marfan Syndrome) 피브릴린 결핍으로 인한 결합 조직 장애 피브릴린 1 (FBN), 상 염색체 우성
근긴장성 이영양증(Myotonic dystrophy)(청년기 동안 발병) 골격근 세포에서 단백질 키나제 결함 근긴장성 이영양증 단백질 키나제(DMPK), 상 염색체 우성
불완전 골혈성증(Osteogenesis imperfect)(다양한 유형) I형 콜라겐 형성의 결함은 출생 후 다발성 골절을 초래한다 COL1A1, COL1A2
프라더-윌리 증후군(Prader-Willi Syndrome) 감소된 근긴장도 및 정신 지체 염색체 15의 결실로 인해 결실된 SNRPN(소형 리비핵단백질 N)
뉴런 및 뇌
알츠하이머병(Alzheimer disease) 아밀로이드 생성 증가, 사실을 기억하는 점진적 무능력 다유전자성, PS1, PS2, ...
근위축성 측삭 경화증(Amyotrophic lateral sclerosis; ALS)(다양한 형태) 운동 뉴런 세포의 점진적 퇴행(슈퍼옥사이드 라디칼 제거의 결함) 슈퍼옥사이드 디스무타제 1(SOD1), 관련된 다양한 유전자
안젤만 증후군(Angelman syndrome) 부적절한 웃음을 갖는 정신 지체 염색체 15의 게놈 각인
피루바트 데하이드로게나제 치료하지 않을 경우 신경학적 결함 피루바트 데하이드로게나제, 상 염색체 열성
레프섬병(Refsum disease) 피탄산의 축적은 말초 신경 병증을 초래한다 피타노일-CoA 하이드록실라제 (PHYH), 상 염색체 열성
레트 증후군(Rett's syndrome) 생후 6-18개월 사이에 발달 정지된 정신 지체 메틸-CpG-결합 단백질-2 (MECP2), X-염색체 우성
테이-삭스병(Tay-Sachs disease) (다양한 형태의 중증도) GM2 강글리오사이드의 교란 된 분해는 신경학적 손상을 초래한다 HEXA(β-헥소사미니다스 A), 상 염색체 열성
라포라병(LaFora Disease) 공격적인 형태의 간질 EPM2A, 상 염색체 열성
본태성 떨림(Essential tremor)(다양한 형태) 제어할 수 없는 흔들림 ETM1, ETM2, 상 염색체 우성
취약 X 증후군 FMR1 RNA 결합 단백질의 부족, 정신 지체 FMR1 유전자는 5'UTR 영역에서 CGG 증폭으로 인해 발현되지 않는다
헌팅턴병(Huntington's disease) 성인기에 발병한 진행성 치매 HTT(헌팅틴), 상 염색체 우성
장
바터 증후군(Bartter's syndrome) (3개 유형) 신장 질환 신장 클로라이드 채널 B 유전자(CLCNKB), 상 염색체 열성
다낭성 신장 질환(Polycystic kidney disease)(2개 유형) 신장 질환 PDK1, PDK2, 상 염색체 우성, 공지된 상 염색체 열성 형태(ARPKD)도 있다
폐
알파-1-항트립신 엘라스타제의 제어되지 않은 방출로 인한 폐포 결함 SERPINA1, 상 염색체 공동 우성
천식(Asthma) 기도의 만성 염증성 장애 다유전자성
낭포성 섬유증(Cystic fibrosis) 결함있는 Cl- 이온 수송으로 인해 과도하게 점성인 점액질 CFTR (낭포성 섬유증 전도도 막 관통 조절제), 상 염색체 열성
계면활성제 대사 기능 장애(Surfactant metabolism dysfunction)(다양한 유형) 신생아는 정상 체중이지만, 모두 팽창하지 않는다 ATP-결합 카세트 트랜스포터(ABCA3)
원발성 섬모 운동 이상증(Primary cliliary dyskinesia) 섬모 기능의 결함/결손으로 인해 과도하게 점성인 점액질 DNAI1, CCNO, CCDC40 등
리소좀 저장 질환
파브리병(Fabry's disease) 그 밖에, 세라마이드 트리헥소사이드의 축적으로 인한 피부 병변 α-갈락토시다제 A, X-염색체 열성
고셔병
I형: 성인 형태(치료하에 정상 수명)
II형: 유아기 형태(1세 이전 사망)
III형: 유년기 형태(유아기 발병, II형보다 덜 심함)		 글루코세레브로사이드(강글리오사이드, 스핑고지질)의 축적 글루코세레브로시다제, 상 염색체 열성,
헌터 증후군(Hunter's Syndrome) 점질다당류의 축적 L-이두로노설파트 설파타제, X-염색체 열성
헐러 증후군(Hurler's Syndrome) (10세까지 사망) 점질다당류의 축적 α-L-이두로니다제, 상 염색체 열성
니만-피크병(Niemann-Pick Disease)(3개의 다른 형태 A, B, C) 리소좀으로부터 콜레스테롤 방출의 결함, 스핑고미엘린의 축적 스핑고미엘리나제, 상 염색체 열성
테이-삭스병(4세까지 사망) 신경 세포에서 GM2 강글리오사이드의 축적 헥소사미니다제 A, 상 염색체 열성
피부
백색질(Albinism) 질소 대사 결함 티로시나제 결핍, 상 염색체 열성
백색질, 눈피부, II형 멜라닌 색소의 생합성 감소 OCA2, 상 염색체 열성
앨러스-단로스 증후군(Ehlers-Danlos Syndrome)(다양한 유형) 일반적인 횡격막 탈장, 망막 박리 콜라겐 합성의 다양한 결함
수포성 표피박리증(Epidermolysis bullosa)(단순성 EB, 연접부 EB, 이영양형 EB 및 킨들러 증후군을 포함하는 다양한 유형) 각질 세포 구조적 안정성의 유지 또는 각질 세포의 기저 진피에의 부착의 결함 수포성 표피박리증 황반 유형 (EBM), 진행성 수포성 표피박리증 3(EBR3), 가성 접합부 수포성 표피박리증 4(EBR4), 데스모플라킨 (DSP), 플라코필린-1(PKP1), 크레아틴(KRT5, KRT14), 플렉틴 (PLEC),ITGA6, 인테그린 서브유닛 (ITGB4), 라미닌 서브유닛 (LAMA3, LAMP3, LAMB3, LAMC2), 콜라겐 (COL17A1, COL7A1 (상 염색체 우성), FERMT1, 상 염색체 열성
하아트누프병(Hartnup's disease) 위장관, 광 민감성 피부에서 트립토판 흡수 결함 SLC6A19, 상 염색체 열성
유전성 출혈성 모세혈관 확장증(Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia), 오슬러-베버-렌두 증후군(Osler-Weber-Rendu Syndrome) 피부와 점막의 모세혈관 확장증 엔도글린(ENG), 상 염색체 우성
가족성 고콜레스테롤혈증
(Hypercholesterolemia, familial)		 저밀도 지단백질에 결합된 혈청 콜레스테롤의 상승, 피부 축적 및 아테롬성 동맥경화증 저밀도 지단백질 수용체(LDLR), 아포지단백질 B(APOB), 상 염색체 우성
색소성 피부건조증(Xeroderma pigmentosa) 자외선 노출로 인한 피부 결함 및 흑색종 DNA 복구 결함, 상 염색체 열성
남성형 대머리(Male pattern baldness) 피부에서 테스토스테론의 디하이드로테스토스테론으로의 교란된 전환 5-α-리덕타제
유전적 간 질환
아미노산 대사 장애 아미노산 티로신과 페닐알라닌을 분해하는 다단계 공정의 중단 FAH, TAT, HPD, 상 염색체 열성
베타-지중해 빈혈 인터미디어 성숙한 적혈구 부족 HBB, 상 염색체 열성
크리글러-나자르 증후군(Crigler-Najjar syndrome) 빌리루빈이 물에 용해가능해지는 글루쿠론화의 결핍 UGT1A1, 상 염색체 열성
지방산 산화 장애 장쇄 지방산 및 매우 장쇄 지방산의 처리 부족으로 기면 및 저혈당증을 초래한다 HADHA, ACADVL 상 염색체 열성
프럭토스 대사 장애 저혈당증을 유발하는 글루코스생성 장애 FBP1, ALDOB, 상 염색체 열성
갈락토스혈증(Galactosemia) 갈락토스 처리 부족 GALT, GALK1, GALE, 상 염색체 열성
글리코겐 저장 질환 글루코스 6-포스페이트 및 글리코겐의 교란된 쇠약은 세포 손상을 일으키는 비정상적인 글리코겐 분자뿐만 아니라 글리코겐의 축적을 초래한다 G6PC, SLC37A4, AGL, GBE1, 상 염색체 열성
헴 생합성 장애(Heme biosynthesis disorder) 유로포르피리노겐 탈카복실라제의 감소로 인해 포르피린이라는 화합물이 축적되어 간에 독성 수준을 유발한다 UROD 상 염색체 우성, ALAS2 X-연관 우성, ALAD 상 염색체 열성
지질 대사 (수송) 장애 콜레스테롤 및 기타 지질의 이동을 억제하여 세포에 축적되는 기능성 단백질의 부족 NPC1, NPC2 상 염색체 열성, LDLR, 상 염색체 우성
금속 대사 장애 철과 구리의 저장 및 수송 장애로 인해 조직과 기관에 축적을 초래한다 ATP7B, HAMP, HFE, HFE2, 상 염색체 열성
유기산 장애
(산뇨증(Acidurias)/산혈증(Acidemias))		 여러 단백질 구성 요소(아미노산), 특정 지질 및 콜레스테롤의 분해 중단 BCKDHA, BCKDHB, 및 DBT, PCCA 및 PCCB, MUT, MMAA, MMAB, MMADHC, MCEE, IVD, MCCC1 또는 MCCC2, 상 염색체 열성
1형 원발성 고옥살산뇨증(Primary hyperoxaluria type 1) 신장 손상으로 이어지는 글리옥실레이트의 분해 중단 AGXT, GRHPR, 상 염색체 열성
진행성 가족성 간내 담즙 정체증
(Progressive familial intrahepatic cholestasis)		 간 손상을 유발하는 간 세포에 담즙산의 축적 ATP8B1, 상 염색체 열성
혈소판 활동 장애(Thrombocyte activity disorder) 효소 활동 부족은 출혈과 응고 사이의 일반적인 균형을 방해한다 ADAMTS13, 상 염색체 열성
요소 순환 장애(Urea cycle disorders) 고암모니아혈증(hyperammonemia)의 형태를 유발하는 요소 순환 장애 OTC (X-연관 장애), CPS1, ASS1 and SLC25A13, ASL, 상 염색체 열성
제조 방법
본 발명의 추가의 측면은 상기 제1 측면에 따르는 조성물의 제조 방법으로사, 상기 방법이
a) 액체 상에 현탁된 것을 포함하는 치료적 활성제의 나노 입자 또는 미세입자 제형을 제공하는 단계, 및
b) 1개 또는 2개의 하이드록시 그룹으로 치환된 C3-C5 알칸으로부터 선택된 적어도 하나의 동결 방지 첨가제를 액체 상에 첨가하는 단계로서, 상기 동결 방지 첨가제의 상기 액체 상에의 첨가가 액체 상에 현탁된 입자 제형을 제공하기 전, 제공하는 동안 또는 제공한 후에 달성될 수 있는, 단계를 포함하는, 제조 방법에 관한 것이다.
나노 입자 또는 미세입자를 포함하는 치료적 활성제의 입자 제형의 제공과 관련하여, 기술이 당업계에 확립된다.
치료제로서 핵산, 바람직하게는 RNA, 보다 바람직하게는 단일 가닥 RNA, 가장 바람직하게는 mRNA의 입자 제형을 제공하는 방법에 관해서는, 상기 논의된 문헌, 예를 들어, 문헌[참조: A.C. Silva et al., Current Drug Metabolism, 16, 2015, 3-16 및 그 안에 언급된 문헌, J.C. Kasper et al., J. Contr. Rel. 151 (2011), 246-255, WO 2014/207231 및 그 안에 언급된 문헌, WO 2016/097377 및 그 안에 언급된 문헌, US 2017/0267631, WO 2016/081029, WO 2011/071860, WO 2016/118697, US 8450298 B2 및 E.R. Lee et al., Human Gene Therapy 7:1701-1717, September 10, 1996]을 다시 참조할 수 있다.
양이온성 중합체, 올리고머, 지질 또는 리피도이드와의 복합체 형태, 예를 들어, 폴리플렉스, 리포플렉스, 리포좀 또는 LNP로 활성제로서의 핵산, 바람직하게는 RNA, 더욱 바람직하게는 단일 RNA 가닥, 가장 바람직하게는 mRNA를 함유하는 바람직한 입자 제형은 양으로 하전된 올리고머, 중합체, 지질 또는 리피도이드와 음으로 하전된 핵산의 자기 조립체를 사용하여 편리하게 형성될 수 있다.
자기 조립체는 성분의 용액을 혼합시 발생할 수 있다. 자기 조립체는, 예를 들어, 피펫팅 및 진탕/와동을 사용하거나, 예를 들어, 문헌[참조: Hirota et al. (Hirota et al. 1999, Biotechniques, 27, 286-290) 또는 Kasper et al. (Kasper et al. 2011, Eur J Pharm Biopharm, 77, 182-185)]에 의해 기재된 바와 같은 마이크로-혼합을 위한 자동화 장치를 사용하여 수동 혼합함으로써 또는 문헌[참조: Xuan et al. (Xuan et al. 2010, Microfluidics and Nanofluidics, 9, 1-16)]에 의해 검토된 바와 같은 미소유체 포커싱에 의해 달성될 수 있다. 입자 제형의 입자에 도입될 핵산 및 올리고머, 중합체, 지질 또는 리피도이드 이외에 추가의 성분을 도입하기 위해, 순차적인 혼합이 사용될 수 있다. 이 경우에, 임의의 추가 성분은 올리고머, 중합체, 지질 또는 리피도이드와 핵산의 자기 조립 후 첨가될 수 있거나, 혼합 전 이들 중 어느 하나에 첨가될 수 있다.
예를 들어, 폴리플렉스의 형성은 물에 핵산을 함유하는 용액과 물에 양이온성 중합체 또는 올리고머를 함유하는 용액을 혼합함으로써 편리하게 달성될 수 있다.
또한, 리포솜의 형성을 위해, 확립된 기술이 이용가능하다. 그들은, 예를 들어, 지질 또는 리피도이드 성분, 예를 들어, 지질 또는 리피도이드 필름의 재수화에 이어, 예를 들어, 필요할 경우, 초음파처리 또는 압출과 같은 균질화 기술을 포함한다. 대안적인 접근법은 유기 용매에 용해된 지질 또는 리피도이드 성분의 물 또는 수용액으로의 주입이다.
지질 나노 입자 또는 리포플렉스의 형성을 위해 의존할 수 있는 예시적인 방법으로서 용매 치환 방법이 언급될 수 있다.
바이러스 벡터에 의존하는 입자는 공지된 생물학적 방법에 의해 제공될 수 있다.
입자 제형의 제조를 위한 추가의 예로서, 치료적 활성제를 포함하는 입자는 임의로 매트릭스 형성제와 조합하여 활성제를 함유하는 용액의 유화 후, 입자를 고화시킴으로써 형성될 수 있다. 고화는, 예를 들어, 매트릭스 형성 물질이 함유된 유화된 오일 상으로부터 용매를 제거하거나 매트릭스 형성을 위한 성분을 가교결합시키거나 중합시킴으로써 달성될 수 있다. 또한, 리포솜 제형의 형성을 위한 물질 및 방법은 숙련된 의사에게 공지되어 있다.
동결 방지 첨가제는 액체 상에 편리하게 첨가될 수 있고, 여기서 나노 입자 또는 미세입자 제형은 현탁되어 있거나, 현탁액이 제공되어야 한다. 다시 말하면, 동결 방지 첨가제의 액체 상에의 첨가는 액체 상에 현탁된 입자 제형을 제공하기 전, 제공하는 동안 또는 제공한 후에 달성될 수 있다.
본 발명의 제2 측면에 따르는 고체 조성물은
a) 액체 상에 현탁된 치료적 활성제의 나노 입자 또는 미세입자 제형을 제공하는 단계, 및
b) 1개 또는 2개의 하이드록시 그룹으로 치환된 C3-C5 알칸으로부터 선택된 적어도 하나의 동결 방지 첨가제를 액체 상에 첨가하는 단계로서, 상기 동결 방지 첨가제의 액체 상에의 첨가는 액체 상에 현탁된 입자 제형을 제공하기 전, 제공하는 동안 또는 제공한 후에 달성될 수 있는, 단계를 포함하는 공정에 의해 상기 제1 측면에 따르는 조성물을 제조하는 제1 단계 및
상기 제1 단계에서 수득된 조성물을 동결시키는 제2 단계를 포함하는 공정으로 제조될 수 있다.
제1 단계와 관련하여, 현탁액 조성물의 제조와 관련하여 상기 제공된 정보가 고체 조성물의 제조에 동일하게 적용된다는 것이 이해될 것이다.
제2 단계로서의 동결 단계는 전형적으로 적합한 용기에서 현탁액 조성물을 충분히 저온(예: -10℃ 이하, 바람직하게는 -20℃ 이하)에 적용함으로써 달성된다. 냉각 매질로서, 예를 들어, 차가운 공기 또는 차가운 액체가 사용될 수 있다.
부수적으로, 상기 설명된 바와 같이, 본 발명의 제2 측면에 따르는 고체 조성물은 나노 입자 또는 미세입자를 함유하는 치료적 활성제의 입자 제형이 저장되도록 하는 조성물이다. 그 정도로, 본 발명의 제1 측면에 따르는 현탁액 조성물이 또한 고체 조성물을 해동시킴으로써 본 발명의 제2 측면에 따르는 고체 조성물로부터 회수될 수 있음이 이해될 것이다.
따라서, 추가의 측면으로서, 본 발명은 또한 상기 제1 측면에 따르는 조성물을 제조 방법으로서, 상기 방법이
a) 액체 상에 현탁된 치료적 활성제의 나노 입자 또는 미세입자 제형을 제공하는 단계, 및
b) 1개 또는 2개의 하이드록시 그룹으로 치환된 C3-C5 알칸으로부터 선택된 적어도 하나의 동결 방지 첨가제를 액체 상에 첨가하는 단계로서, 상기 동결 방지 첨가제의 액체 상에의 첨가가 액체 상에 현탁된 입자 제형을 제공하기 전, 제공하는 동안 또는 제공한 후에 달성될 수 있는, 단계를 포함하는 공정에 의해 상기 제1 측면에 따르는 조성물을 제조하는 제1 단계,
상기 제1 단계에서 수득된 조성물을 동결시키는 제2 단계 및
상기 제2 단계에서 수득된 동결된 조성물을 해동시키는 제3 단계를 포함하는, 제조 방법을 제공한다.
방법 및 용도
또한, 본 발명은 치료적 활성제의 나노 입자 또는 미세입자 제형을 보존하는 방법을 제공하며, 이 방법은 본 발명의 상기 제1 측면에 따르는 조성물, 즉
(i) 액체 상에 현탁된 치료적 활성제의 나노 입자 또는 미세입자 제형, 및
(ii) 1개 또는 2개의 하이드록시 그룹으로 치환된 C3-C5 알칸으로부터 선택된 적어도 하나의 동결 방지 첨가제를 포함하는 조성물을 제공하는 단계 및
상기 조성물을 동결시키는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명의 이러한 측면과 관련하여, 치료제, 이의 입자 제형, 동결 방지 첨가제, 액체 상, 조성물을 제공하는 데 이용 가능한 공정 및 동결 단계의 적합하고 바람직한 구현예에 관한 상기 제공된 정보가 계속 적용된다.
숙련된 독자에 의해 이해되는 바와 같이, 용어 "보존"은 이러한 맥락에서 치료적 활성제의 입자 제형의 관련 치료 특성이 저장 동안 상당한 정도로 유지되고, 바람직하게는 완전히 유지된다는 것을 나타낸다. 입자 제형을 보존하는 방법은 전형적으로 목적하는 시간 동안, 예를 들어, 몇 시간, 몇 일, 몇 주, 몇 개월 또는 심지어 몇 년 동안 동결된 상태로 유지하면서 동결된 조성물의 저장을 추가로 포함한다.
또 다른 측면으로서, 본 발명은 치료적 활성제의 나노 입자 또는 미세입자 제형을 포함하는 조성물을 위한 동결 방지 첨가제로서 1개 또는 2개의 하이드록시 그룹으로 치환된 C3-C5 알칸으로부터 선택된 화합물의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명의 이러한 측면과 관련하여, 치료제, 이의 입자 제형 및 동결 방지 첨가제의 적합하고 바람직한 구현예에 관한 상기 제공된 정보가 계속 적용된다.
이해되는 바와 같이, 동결 보호 첨가제로서의 사용은 조성물에서 1개 또는 2개의 하이드록시 그룹으로 치환된 C3-C5 알칸으로부터 선택된 화합물과 치료적 활성제의 입자 제형의 조합을 포함한다. 두 성분이 조합된 조성물은 본 발명의 제1 측면에 따르는 조성물이다. 사용은 추가로 조성물을 동결시켜 1개 또는 2개의 하이드록시 그룹으로 치환된 C3-C5 알칸으로부터 선택된 화합물이 동결 방지제로서 작용할 수 있도록, 즉 그것이 입자 조성물의 입자를 보호할 수 있고, 특히 기도에 또는 기도를 통해 적용하기 위한 이들의 기능성이 상당한 정도로 유지되고, 바람직하게는 완전히 유지된다는 것을 보장할 수 있도록 함을 포함한다.
본 발명의 중요한 측면의 요약이 다음 항목에 제공된다. 이들 항목은 본 발명의 일반적인 개시 내용의 일부를 형성하여, 예를 들어, 추가의 바람직한 구현예 또는 선택적 특징과 관련하여 명세서의 앞부분에 제공된 정보가 다음 항목에도 적용되도록 한다는 것이 이해될 것이다.
1. (i) 액체 상에 현탁된 치료적 활성제의 나노 입자 또는 미세입자 제형, 및
(ii) 1개 또는 2개의 하이드록시 그룹으로 치환된 C3-C5 알칸으로부터 선택된 하나 이상의 동결 방지 첨가제를 포함하는 조성물.
2. 항목 1에 있어서, 치료적 활성제가 핵산인, 조성물.
3. 항목 2에 있어서, 핵산이 RNA인, 조성물.
4. 항목 3에 있어서, RNA가 mRNA인, 조성물.
5. 항목 1 내지 4 중 어느 한 항목에 있어서, 나노 입자 또는 미세입자 제형이 1 내지 4000nm, 더욱 바람직하게는 2 내지 2500nm, 가장 바람직하게는 5 내지 1000nm 범위의 평균 입자 직경을 나타내는, 조성물.
6. 항목 1 내지 5 중 어느 한 항목에 있어서, 나노 입자 또는 미세입자 제형의 입자가 20㎛, 더욱 바람직하게는 10㎛, 가장 바람직하게는 5㎛의 최대 입자 직경을 갖는, 조성물.
7. 항목 1 내지 6 중 어느 한 항목에 있어서, 나노 입자 또는 미세입자 제형이 입자 제형 내의 입자의 총 중량에 대한 치료적 활성제의 중량으로 표현되는, 0.1 내지 95%, 보다 바람직하게는 0.5 내지 90%, 가장 바람직하게는 1 내지 80% 범위의 활성 부하를 갖는, 조성물.
8. 항목 2 내지 7 중 어느 한 항목에 있어서, 치료적 활성제가 핵산이고, 나노 입자 또는 미세입자 제형의 입자가 핵산과 양이온성 부형제를 포함하는, 조성물.
9. 항목 8에 있어서, 입자 제형의 입자가 핵산을, 핵산과 양이온성 부형제로서의 양이온성 올리고머 또는 양이온성 중합체에 의해 형성된 복합체 형태로 포함하는, 조성물.
10. 항목 9에 있어서, 복합체가 핵산과 아미노 그룹이 함유된 복수의 단위를 포함하는 양이온성 올리고머 또는 중합체에 의해 형성되는, 조성물.
11. 항목 10에 있어서, 양이온성 올리고머 또는 중합체 중 아민 질소 원자 N의 수 대 상기 핵산 중 포스페이트 그룹 P의 수의 N/P 비율이 1 내지 100, 더욱 바람직하게는 2 내지 80, 가장 바람직하게는 3 내지 60의 범위인, 조성물.
12. 항목 10 또는 11에 있어서, 양이온성 중합체가 하기 (1), (2), (3) 및 (4)로부터 독립적으로 선택된 복수의 단위를 포함하고,
Figure pct00007
반복 단위 (1), (2), (3) 및/또는 (4)의 질소 원자 중 하나 이상이 양성자화되어 중합체의 양전하를 제공할 수 있는, 조성물.
13. 항목 8에 있어서, 입자 제형의 입자가 핵산을, 핵산과 양이온성 부형제로서의 양이온성 지질 또는 양이온성 리피도이드에 의해 형성된 복합체 형태로 포함하는, 조성물.
14. 항목 13에 있어서, 입자 제형의 입자가 리포플렉스, 리포솜 또는 지질 나노 입자를 포함하는, 조성물.
15. 항목 13 또는 14에 있어서, 입자 제형의 입자가 스테롤, 중성 지질, 스핑고지질 및 페길화 지질로부터 선택된 이상의 헬퍼 지질을 추가로 포함하는, 조성물.
16. 항목 13 내지 15 중 어느 한 항목에 있어서, 지질 및 리피도이드의 총 중량 대 상기 핵산의 중량의 비율이 0.1 내지 200, 더욱 바람직하게는 0.2 내지 150, 가장 바람직하게는 0.5 내지 100의 범위인, 조성물.
17. 항목 1 내지 16 중 어느 한 항목에 있어서, 동결 방지 첨가제가 적어도 하나의 2차 하이드록시 그룹을 포함하는, 조성물.
18. 항목 17에 있어서, 동결 방지 첨가제가 1,2-프로판디올, 2-프로판올, 1,2-부탄디올 및 1,3-부탄디올로부터 선택되는, 조성물.
19. 항목 17에 있어서, 동결 방지 첨가제가 1,2-프로판디올인, 조성물.
20. 항목 1 내지 19 중 어느 한 항목에 있어서, 동결 방지 첨가제가, 액체 상의 용적을 기준으로 하여, 0.5 내지 50% w/v, 보다 바람직하게는 1 내지 40% w/v, 가장 바람직하게는 1 내지 30% w/v의 농도로 함유되는, 조성물.
21. 항목 1 내지 20 중 어느 한 항목에 있어서, 나노 입자 또는 미세입자 제형의 입자를, 입자 제형에 함유된 치료적 활성제를 조성물의 총 용적을 기준으로 하여 0.01 내지 50mg/ml, 보다 바람직하게는 0.02 내지 30mg/ml의 농도로 제공하기 위한 양으로 포함하는, 조성물.
22. 항목 1 내지 21 중 어느 한 항목에 있어서, 물 및 상기 동결 방지 첨가제가 액체 상에 함유된 유일한 용매인, 조성물.
23. (i) 치료적 활성제의 나노 입자 또는 미세입자 제형, 및
(ii) 1개 또는 2개의 하이드록시 그룹으로 치환된 C3-C5 알칸으로부터 선택된 적어도 하나의 동결 방지 첨가제를 포함하고,
항목 1 내지 22 중 어느 한 항목에 따르는 조성물을 동결시킴으로써 수득될 수 있는 고체 조성물.
24. 항목 1 내지 22 중 어느 한 항목에 따르는 조성물의 제조 방법으로서, 상기 방법이
a) 액체 상에 현탁된 치료적 활성제의 나노 입자 또는 미세입자 제형을 제공하는 단계, 및
b) 1개 또는 2개의 하이드록시 그룹으로 치환된 C3-C5 알칸으로부터 선택된 적어도 하나의 동결 방지 첨가제를 액체 상에 첨가하는 단계로서, 동결 방지 첨가제의 액체 상에의 첨가가 액체 상에 현탁된 입자 제형을 제공하기 전, 제공하는 동안 또는 제공한 후에 달성될 수 있는, 단계를 포함하는, 제조 방법.
25. 항목 23에 따르는 고체 조성물의 제조 방법으로서, 방법이
a) 액체 상에 현탁된 치료적 활성제의 나노 입자 또는 미세입자 제형을 제공하는 단계, 및
b) 1개 또는 2개의 하이드록시 그룹으로 치환된 C3-C5 알칸으로부터 선택된 적어도 하나의 동결 방지 첨가제를 액체 상에 첨가하는 단계로서, 동결 방지 첨가제의 액체 상에의 첨가가 액체 상에 현탁된 입자 제형을 제공하기 전, 제공하는 동안 또는 제공한 후에 달성될 수 있는, 단계를 포함하는 공정에 의해 상기 제1 측면에 따르는 조성물을 제조하는 제1 단계 및
제1 단계에서 수득된 조성물을 동결시키는 제2 단계를 포함하는, 제조 방법.
26. 치료적 활성제의 나노 입자 또는 미세입자 제형의 보존 방법으로서, 상기 방법이 항목 1 내지 22 중 어느 한 항목에 따르는 현탁액 조성물을 제공하는 단계 및 상기 조성물을 동결시키는 단계를 포함하는, 보존 방법.
27. 치료적 활성제의 나노 입자 또는 미세입자 제형을 포함하는 조성물을 위한 동결 방지 첨가제로서 1개 또는 2개의 하이드록시 그룹으로 치환된 C3-C5 알칸으로부터 선택된 화합물의 용도.
28. 액체에 현탁된 미립자 조성물로부터 에어로졸을 형성하거나, 이러한 조성물을 분무하기 위한 장치로서, 이러한 장치가 항목 1 내지 22 중 어느 한 항목에 따르는 조성물을 포함하는, 장치.
29. 항목 28에 있어서, 장치가 계량된 용량 흡입기, 분무기 및 비강 분무 장치로부터 선택된 흡입기인, 장치.
30. 항목 1 내지 22 중 어느 한 항목에 따르는 조성물을 바람직하게는 기도로 또는 기도를 통한 투여를 통해, 더욱 바람직하게는 폐 투여 또는 비강 투여를 통해 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법.
31. 항목 1 내지 22 중 어느 한 항목에 있어서, 조성물이 기도에 또는 기도를 통해 투여되는, 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 조성물.
32. 항목 31에 있어서, 조성물이 폐 투여를 통해 또는 비강 투여를 통해 투여되는, 조성물.
33. 항목 31 또는 32에 있어서, 치료적 활성제가 RNA 기반 요법을 통한 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 RNA, 보다 바람직하게는 mRNA인, 조성물.
34. 항목 31 내지 33 중 어느 한 항목에 있어서, 치료되거나 예방될 상기 질환이 폐 질환인, 조성물.
도 1: A549 세포에서 첨가제를 함유하는 brPEI/FLuc mRNA N/P 10 제형의 형질 감염 효율
도 2: 1회 동결-해동 주기 후 brPEI/mRNA 제형의 생체내 형질 감염 효율
도 3: 1회 동결-해동 주기 후 brPEI/mRNA 제형의 생체내 형질 감염 효율. 점선: 신선한 입자의 활성의 50%.
도 4: 농축된 중합체/mRNA 제형의 생체내 형질 감염 효율
도 5: 1,2-프로판디올에서 동결 후 지질 기반 나노 입자 또는 미세입자의 생체내 형질 감염 효율
실시예
약어
약어 설명
RT 실온
mRNA 메신저 리보핵산
brPEI 분지형 폴리에틸렌이민
FLuc 반딧불이 루시퍼라제
w/o 없이
cmRNA 화학적으로 변형된 리보핵산
FLuc 반딧불이 루시퍼라제
PG 1,2-프로판디올, 프로필렌 글리콜
N/P 담체 아민 질소 대 mRNA 포스페이트 비율
실시예 I: 나노 입자 또는 미세입자 제형을 위한 동결 방지 첨가제로서 상이한 부류의 분자의 스크리닝.
복합체 형성
분지형 폴리(에틸렌이민)(brPEI) 및 루시퍼라제를 인코딩하는 mRNA의 복합체는 0.25mg/mL의 최종 농도로 형성되었다. 표준 혼합 공정에서, mRNA는 물을 사용하여 0.5mg/mL의 농도로 희석시켰다. 동일한 용적의 brPEI 용액을 물에서 0.65mg/mL의 농도로 제조했다. mRNA 용액을 brPEI 용액에 주입한 다음, 전자 피펫(Mettler-Toledo, E4 LTS 1000 μL)을 사용하여 혼합하여 나노 입자 또는 미세입자를 형성했다. 혼합 후, 복합체를 사용 전에 얼음 위에서 20분 동안 배양했다.
크기 측정
입자 직경의 결정을 위해, 100μL의 입자의 현탁액을 큐벳(브랜드, UV-큐벳 마이크로)에 충전시키고, Malvern ZetaSizer Nano ZS(Malvern Instruments)를 사용하여 측정하여 유체역학적 직경 및 평균 유체역학적 직경(z-평균)을 nm 단위로 제공한다. 현탁 매질로서, 물 또는 지시된 바와 같이 동결 방지 첨가제를 함유하는 물이 사용되었다.
동결-해동 도전
제형을 2X (20/10/2%) 첨가제 용액(표 1)으로 1:2로 희석하고, 이중으로 분할했다. 각각 생성되는 제형 중 하나의 샘플을 첨가제의 존재하에 크기 결정(Malvern Zetasizer NanoZS)에 사용했다. 나머지 샘플은 -20℃에서 16시간 동안 동결시키고, 실온에서 해동시키고, 용액이 실온에 도달하기 전에 얼음 위에 즉시 저장했다. 이어서, 각각 해동된 제형을 크기 결정(Malvern Zetasizer NanoZS)에 사용하였고, 다음 방정식에 따라 동결 전과 해동 후 제형의 크기 편차 %와 관련하여 비교하였으며, 여기서 dh는 z-평균 입자 직경을 나타낸다:
Figure pct00008
형질 감염 및 루시퍼라제 활성 검정
A549 세포를 37℃, 5% CO2에서 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S)이 보충된 MEM 배지에서 배양하였다. 세포를 형질 감염 24시간 전에 96-웰 플레이트에서 100μL 배지에서 20000개 세포/웰로 접종하였다. 형질 감염 당일에 배지를 FBS 및 페니실린/스트렙토마이신이 없는 MEM으로 교체한 후, 60μL/웰로 복합체화된 mRNA를 이중으로 첨가했다. 형질 감염 4시간 후, 배지는 10% FBS 및 1% P/S를 갖는 MEM으로 교체했다. 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양 후, 배지를 제거하고, 세포를 100μL 용해 완충액(25mM Tris HCl, 0.1% TritonX-100, pH 7.8)에 용해시키고, 플레이트 진탕기에서 600rpm에서 30분 동안 배양했다. 다음으로, 각 웰로부터 50μL 세포 용해물을 96-웰 플레이트로 옮기고, 리포터 반딧불이 루시퍼라제의 활성은 루시페린 완충액(0.47mM D-루시페린, 0.27mM 코엔자임 A, 3.33mM의 DTT, 0.53mM의 ATP, 1.1mM의 MgCO3, 2.7mM MgSO4, 20mM의 트리신, 0.1mM의 EDTA)을 첨가한 후 Tecan Infinite 200 PRO에서 생물발광 강도로 측정했다.
생체내 실험을 위한 샘플 제조
복합체를 다음 변형과 함께 "복합체 형성" 및 "동결-해동 도전"하에 기재된 바와 같이 제조했다. 4mL의 복합체 용액을 0.5mg/mL의 mRNA 농도로 제조하고, 이중 농축된 첨가제 용액으로 1:2로 희석하여 0.25mg/mL(8mL)의 최종 mRNA 농도를 수득했다. 동물에게 분무될 때까지 샘플을 동결 유지시켰다.
분무
동물을 Buxco 소형 대량 투여 챔버(Small Size Mass Dosing Chamber)(Data Sciences International, Germany)에 위치시켰다. 제형을 실온에서 해동시키고, 실온에 도달하기 전에 분쇄된 얼음 위에 놓은 다음, Aeroneb Solo 분무기(nAeroneb, Germany)를 사용하여 공기 순환 속도 3L/분 및 듀티 사이클 100%로 분무했다.
외식된 폐의 생물 발광 측정
적용 24시간 후, 동물을 펜타닐/미다졸람/메데토미딘(0.05/5.0/0.5 mg/kg BW)의 복강내 주사를 통해 완전 마취하에 놓았다. 50μL의 D-루시페린(포스페이트 완충 식염수에 용해된 30mg/mL, pH 7)을 스니핑 경로(비공에 직접 적용한 후 용액 흡입)를 통해 적용하고, 100μL의 D-루시페린을 복강내 주사로 전신 적용했다. 루시페린 투여 10분 후, 마우스를 자궁 경부 탈구를 통해 안락사시켰다. 오른쪽 심장을 통해 PBS로 관류 후, 폐를 외식시켰다. 비닝 세트 8 및 노출 시간 5분으로 Xenogen IVIS Luminar XR(Caliper LifeSciences)을 사용하여 생물 발광을 측정했다. 생물 발광을 정량화하고, Living Image Software 4.4(Xenogen)를 사용하여 분석했다. 과포화된 사진의 경우(선형 범위를 벗어난 발현 검출), 노출 시간은 1분으로 단축되었다. 생물 발광은 총 플럭스/기관(광자/초)으로 측정되었다. 과포화가 없는 사진만 분석에 사용되었다. 폐를 급속 동결시키고, -80℃에 저장했다.
균질화된 폐에서 루시퍼라제 활성
해동된 기관을 칭량하고, 외식된 폐의 절반을 FastPrep°-24 균질화기(MP Biomedicals)를 사용하여 용해 완충액에서 균질화했다. 100μL 루시페린 완충액을 Lumat LB 9507 광도계(Berthold Technologies)에 의해 75μL의 원심분리된 용해물에 자동으로 첨가했다. 루시퍼라제 활성은 RLU/s로 측정하였고, RLU/기관으로 전환시켰다.
결과
1회 동결-해동 주기 후 중합체/mRNA 제형의 입자 응집을 방지하는 능력이 당업계에서 동결 방지 첨가제로서 확립된 화합물을 포함하여 상이한 유형의 첨가제에 대해 제시되었다. 1,2-프로판디올을 사용하는 조성물은 본 발명에 따르는 조성물이고, 다른 조성물은 참조 조성물이다. 유체역학적 입자 직경은 동결 전에 평가했다. -20℃에서 16시간 후, 제형을 해동하고, 유체역학적 입자 직경을 다시 측정했다. 동결 전과 해동 후 입자 사이의 크기 차이는 표 1b에 나타낸다. 큰 숫자는 거대한 크기 증가 및 따라서 응집을 나타낸다.
[표 1a]
ZetaSizer Nano ZS(Malvern)로 측정된 물에서 새로 제조된 복합체의 표준 크기
Figure pct00009
[표 1b]
상이한 유형 및 농도의 첨가제에서 신선한 복합체와 비교된 1회 동결-해동 주기 후 입자 크기 편차.
지시된 %(w/v)의 첨가제를 함유하는 0.25mg/mL mRNA 농도에서 brPEI 25kDa/mRNA N/P 10 제형의 동결-해동 도전(-20℃). α-락토스 일수화물 및 D-만니톨을 물에 대한 제한된 용해도로 인해 감소된 농도에서 시험했다. 염화나트륨은 등장성 농도 범위 내에서 유지되도록 감소된 농도에서 시험했다. n = 1.
Figure pct00010
Figure pct00011
*참조 조성물
상기 실험의 mRNA/중합체/1,2-프로판디올 중량비.
1,2-프로판디올
% w/v		 mRNA [mg] 중합체 [mg] 1,2-프로판디올 [mg]
1 1 1.3 41.6
5 1 1.3 208.0
10 1 1.3 416.0
100% 이상의 크기 증가(100%
Figure pct00012
이중 직경)는 응집 과정으로 정의되었다. 이 임계값 미만의 크기 차이를 초래하는 첨가제는 1회 동결-해동 주기 후 A549 세포에 대한 형질 감염 효율에 대해 시험관내에서 시험되도록 선택되었다(도 1 및 표 3). 당은 시험관내에서 시험되지 않았다.
도 1은 A549 세포에서 첨가제를 함유하는 brPEI/FLuc mRNA N/P 10 제형의 형질 감염 효율을 도시한다.
도 1의 표 데이터.
용량 [μg mRNA/well]
첨가제 0.125 0.25 0.5
유형 농도
[% w/v] 		RLU [cps]
brPEI 25kDa/Fluc, N/P10 신선한 복합체* 0 11 ± 0.5 76 ± 29.5 698 ± 364.5
폴리소르바트-80* 5 10 ± 2.5 85 ± 16.5 875 ± 405.5
폴리비닐피롤리돈* 5 14 ± 1.5 60 ± 24.0 336 ± 121.0
PEG 공칭Mp 4k* 10 17 ± 1.0 58 ± 5.5 365 ± 69.5
(2-하이드록시프로필)-β-사이클로-덱스트린* 5 11 ± 3.5 44 ± 9.5 332 ± 12.5
글리세롤* 5 17 ± 2.0 31 ± 6.0 204 ± 64.0
PEG 공칭 Mp 10k* 10 9 ± 3.0 19 ± 8.0 205 ± 33.0
D-만니톨* 5 20 ± 7.5 22 ± 9.0 179 ± 5.5
1,2-프로판디올 5 8 ± 6.5 15 ± 3.5 176 ± 3.5
*참조 조성물
표 데이터로부터, 모든 첨가제가 형질 감염 효율을 유지시키고, 따라서 마우스에 분무하여 시험되도록 선택되었다는 것을 알 수 있다. 반딧불이 루시퍼라제를 인코딩하는 2mg mRNA를 함유하는 8mL 복합체 용액을 BALB/c 마우스 그룹(n=3)에 분무했다. 처리 24시간 후, 마우스를 안락사시켰다. mRNA 전달 효율은 절제된 기관(Ivis에 의해) 및 기관 균질화물(도 2 및 표 4 참조)에서 루시퍼라제 활성의 정량화를 통해 분석되었다. 사용된 mRNA/중합체/1,2-프로판디올 중량비는 표 5에 보고되어 있다.
도 2는 1회 동결-해동 주기 후 분무를 통해 적용된 brPEI/mRNA 제형의 생체내 형질 감염 효율을 도시한다.
N/P 10 및 0.25mg/mL에서 brPEI 25kDa와 복합체화된 2mg FLuc mRNA를 지시된 첨가제의 존재하에 1회 동결-해동 주기 후에 마우스에게 분무하였다. 참고로, 한 그룹은 첨가제를 첨가하지 않고 새로 제조된 입자로 처리했다. 10% PEG4k 또는 PEG10k를 함유하는 고점도의 제형은 Aeroneb 분무기에 의한 분무를 억제했다. n = 3.
생물 발광 데이터를 포함하는 도 2의 표 데이터.
첨가제 생물 발광
(외식된 폐) 		루시퍼라제 활성
(균질물)
유형 농도
[% w/v]		 총 플럭스 [photos/초] STDEV [RLU/기관] STDEV
w/o (신선한 복합체)* 0 113600 90026 11745 5284
1,2-프로판디올 5 134100 65699 11168 5372
(2-하이드록시프로필)-β-사이클로-덱스트린* 5 20110 9911 2347 1292
D-만니톨* 5 11760 4135 977 453
폴리소르바트-80* 5 16117 11444 1075 919
글리세롤* 5 7610 624 719 80
폴리비닐피롤리돈* 5 7463 2292 369 180
PEG 공칭Mp 4k* 10 분무 가능하지 않음
PEG 공칭Mp 10k* 10 분무 가능하지 않음
트레할로스* 5 10140 3675 978 172
수크로스* 5 8922 838 716 78
락토스* 5 5792 1770 338 46
*참조 조성물
상기 실험의 mRNA/중합체/1,2-프로판디올 중량비.
1,2-프로판디올
% w/v		 mRNA
[mg]		 중합체
[mg]		 1,2-프로판디올 [mg]
5 1 1.3 208.0
토론 및 결론
1,2-프로판디올(프로필렌 글리콜, PG)은 새로 제형화된 brPEI/mRNA 나노 입자 또는 미세입자와 비교하여 1회 동결-해동 주기 후 생체내 분무 후 입자 응집을 방지하고 제형의 형질 감염 효율을 유지하는 첨가제로서 동정되었다.
실시예 II: 나노 입자 또는 미세입자에 대한 동결 방지제로서 1,2-프로판디올과 구조적으로 관련된 상이한 첨가제의 비교.
복합체 형성
분지형 폴리(에틸렌이민)(brPEI) 및 루시퍼라제를 인코딩하는 mRNA의 복합체는 0.25mg/mL의 최종 농도로 형성되었다. 표준 혼합 공정에서, mRNA는 물을 사용하여 0.5mg/mL의 농도로 희석시켰다. 동일한 용적의 brPEI 용액을 물에서 0.65mg/mL의 농도로 제조했다. mRNA 용액을 brPEI 용액에 주입한 다음 전자 피펫(Mettler-Toledo, E4 LTS 1000 μL)을 사용하여 혼합하여 나노 입자를 형성했다. 혼합 후, 복합체를 사용 전에 얼음 위에서 20분 동안 배양했다.
크기 측정
입자 직경의 결정을 위해, 100μL의 입자의 현탁액을 큐벳(브랜드, UV-큐벳 마이크로)에 충전시키고, Malvern ZetaSizer Nano ZS(Malvern Instruments)를 사용하여 측정하여 유체역학적 직경 및 평균 유체역학적 직경(z-평균)을 nm 단위로 제공한다. 현탁 매질로서, 물 또는 지시된 바와 같이 동결 방지 첨가제를 함유하는 물이 사용되었다.
동결-해동 도전
제형을 2X (20/10/2%) 첨가제 용액(표 6)으로 1:2로 희석하고, 이중으로 분할했다. 일부 첨가제의 용해도가 제한되었기 때문에, 다음 물질이 감소된 농도(표 6 참조)로 시험되었다: 2-메틸-1,4-부탄디올, 펜타에리트리톨. 각각 생성되는 제형 중 하나의 샘플을 첨가제의 존재하에 크기 결정(Malvern Zetasizer NanoZS)에 사용했다. 나머지 샘플은 -20℃에서 16시간 동안 동결시키고, 실온에서 해동시키고, 용액이 실온에 도달하기 전에 얼음 위에 즉시 저장했다. 이어서, 각각 해동된 제형 중 하나의 샘플을 크기 결정(Malvern Zetasizer NanoZS)에 사용하였고, 다음 방정식에 따라 동결 전과 해동 후 제형의 크기 편차 %와 관련하여 비교하였으며, 여기서 dh는 z-평균 입자 직경을 나타낸다:
Figure pct00013
생체내 실험을 위한 샘플 제조
복합체를 다음 변형과 함께 "복합체 형성" 및 "동결-해동 도전"하에 기재된 바와 같이 제조했다. 4mL의 복합체 용액을 0.5mg/mL의 농도로 제조하고, 이중 농축된 첨가제 용액으로 1:2로 희석하여 0.25mg/mL(8mL)의 최종 mRNA 농도를 초래했다. 동물에게 분무될 때까지 샘플을 동결 유지시켰다.
분무
동물을 Buxco 소형 대량 투여 챔버(Data Sciences International, Germany)에 위치시켰다. 제형을 실온에서 해동시키고, 실온에 도달하기 전에 분쇄된 얼음 위에 놓은 다음, Aeroneb Solo 분무기(nAeroneb, Germany)를 사용하여 공기 순환 속도 3L/분 및 듀티 사이클 100%로 분무했다.
외식된 폐의 생물 발광 측정
적용 24시간 후, 동물을 펜타닐/미다졸람/메데토미딘(0.05/5.0/0.5 mg/kg BW)의 복강내 주사를 통해 완전 마취하에 놓았다. 50μL의 D-루시페린(포스페이트 완충 식염수에 용해된 30mg/mL, pH 7)을 스니핑 경로(비공에 직접 적용한 후 용액 흡입)를 통해 적용하고, 100μL의 D-루시페린을 복강내 주사로 전신 적용했다. 루시페린 투여 10분 후, 마우스를 자궁 경부 탈구를 통해 안락사시켰다. 오른쪽 심장을 통해 PBS로 관류 후, 폐를 외식시켰다. 비닝 세트 8 및 노출 시간 5분으로 Xenogen IVIS Luminar XR(Caliper LifeSciences)을 사용하여 생물 발광을 측정했다. 생물 발광을 정량화하고, Living Image Software 4.4(Xenogen)를 사용하여 분석했다. 과포화된 사진의 경우(선형 범위를 벗어난 발현 검출), 노출 시간은 1분으로 단축되었다. 생물 발광은 총 플럭스/기관(광자/초)으로 측정되었다. 과포화가 없는 사진만 분석에 사용되었다. 폐를 급속 동결시키고, -80℃에 저장했다.
균질화된 폐에서 루시퍼라제 활성
기관을 칭량하고, 외식된 폐의 절반을 FastPrep°-24 균질화기(MP Biomedicals)를 사용하여 용해 완충액에서 균질화했다. 100μL 루시페린 완충액을 Lumat LB 9507 광도계(Berthold Technologies)에 의해 75μL의 원심분리된 용해물에 자동으로 첨가했다. 루시퍼라제 활성은 RLU/s로 측정하였고, RLU/기관으로 전환시켰다.
결과
실시예 I은 1,2-프로판디올이 생체내 활성을 유지하면서 동결 동안 나노 입자 또는 미세입자 응집을 방지하는 반면, 글리세롤(화학적 유사성을 갖는 분자)이 생체내 활성을 유지하지 않고 동결 동안 응집을 방지한다는 것을 보여준다. 이 사험의 결과는 1,2-프로판디올과 구조적으로 관련된 C3-C5 알칸올 및 알칸디올이 1회 동결-해동 도전 동안 응집을 방지할 수 있고, 후속적 분무 후 형질 감염 효율을 유지시킬 수 있음을 보여준다. 복합체가 형성되고, 첨가제 용액(물 중)과 혼합하여 표 6에 나열된 최종 첨가제 농도를 초래했다.
유체역학적 입자 직경을 -20℃에서 동결 전에 측정했다. 16시간 후, 모든 제형을 해동하고, 입자 크기를 다시 측정했다. 동결 전 대 해동 후 크기 편차 %는 표 6b에 제시된다. 높은 숫자는 크기의 큰 증가 및 따라서 응집을 나타낸다.
[표 6a]
물에서 새로 제조된 복합체의 표준 크기. ZetaSizer Nano ZS(Malvern)로 삼중 측정
Figure pct00014
[표 6b]
시험된 첨가제 농도의 동결 전 대 해동 후 크기 편차 %.
2-메틸-1,4-부탄디올 및 펜타에리트리톨은 물에 대한 제한된 용해도로 인해 감소된 농도로 시험되었다. n = 1.
Figure pct00015
*참조 예
100% 이상의 입자 크기의 변화(100%
Figure pct00016
이중 직경)는 응집 과정으로 정의되었다. 이 임계값 미만의 크기 편차 %를 초래하는 첨가제는 마우스에게 분무로 시험되도록 선택되었다(도 3 및 표 7).
도 3은 1회 동결-해동 주기 후 brPEI/mRNA 제형의 생체내 형질 감염 효율을 도시한다.
N/P 10 및 0.25mg/mL에서 brPEI 25kDa와 복합체화된 2mg/8mL FLuc mRNA를 지시된 첨가제의 존재하에 1회 동결-해동 주기 후에 마우스에게 분무하였다. 처리 24시간 후 마우스를 마취시키고, 폐를 외식하고, 균질화하고 루시퍼라제 활성을 측정하였다. n = 3.
생물 발광 데이터를 포함하는 도 3의 표 데이터.
첨가제 생물 발광
(외식된 폐) 		루시퍼라제 활성
(균질물)
유형 농도
[% w/v] 		총 플럭스 [photos/초] STDEV [RLU/기관] STDEV
w/o (신선한 복합체)* 0 113600 90026 11745 5284
1,2-프로판디올 5 168833 87083 22457 9895
2-프로판올 10 208173 93362 17680 3807
1,2-부탄디올 5 77080 27417 9475 5724
1,3-부탄디올 5 65000 39251 7508 2858
2-메틸-1,4-부탄디올 0.625 58187 21887 5465 2697
글리세롤 포멀* 5 19097 14362 1137 1040
테트라글리콜* 5 10407 880 267 112
1,1,1-트리스(하이드록시메틸)프로판* 5 38467 30234 266 163
트리에틸렌 글리콜* 5 17833 3734 245 102
* 참고 예
토론 및 결론
이 연구에서, 1,2-프로판디올과 구조적으로 관련된 알칸올/알칸디올이 1회 동결-해동 주기 후 뮤린 폐에 분무한 후 복합체 형질 감염 효율을 유지하는 능력을 갖는다는 것을 입증할 수 있다. 생물물리학적 특성을 동결 전 및 1회 동결-해동 주기 후에 먼저 입자의 응집 또는 붕괴로서 분석하여 비기능성 제형을 유도했다. 실시예 I의 발견은 1,2-프로판디올과 글리세롤이 입자 크기를 보존할 때 복제될 수 있었다. 이전 연구에서 이미 입증된 바와 같이, 입자 크기의 보존은 마우스에 분무 후 자동적으로 기능성 입자를 초래하지 않았다.
실시예 III: 다양한 mRNA 농도 및/또는 다양한 N/P 비율에서 동결 제형.
복합체 형성
분지형 (폴리에틸렌이민)(brPEI), P7(선형 (폴리에틸렌이민-코-프로필렌이민), MW: 20kDa) 또는 P12 선형 (폴리에틸렌이민-코-프로필렌이민), MW: 24kDa)와 루시퍼라제를 인코딩하는 mRNA의 복합체가 0.25mg/mL의 농도로 형성되었다. 표준 혼합 공정에서, mRNA를 물에서 0.5mg/mL의 농도로 희석시켰다. 동일한 용적의 중합체 용액을 물에서 0.65mg/mL의 농도로 제조했다. 나노 입자를 제형화하기 위해, mRNA 용액을 brPEI 용액에 주입한 다음 전자 피펫(Mettler-Toledo, E4 LTS 1000 μL)을 사용하여 혼합했다. 혼합 후, 복합체를 사용 전에 얼음 위에서 20분 동안 배양하였다.
제형의 농도
사용 전에, Amicon® Ultra-15 원심분리 필터 장치(Merck Millipore, PLHK Ultracel-PL 막, 100 kDa 분자량 컷-오프)의 막을 15mL의 물(500 x g)로 세척했다. 이어서, 폴리플렉스 제형을 필터 장치로 옮기고, 500 x g 및 4℃에서 원심분리했다. 5분 간격으로, 유체 수준을 체크하여 과농도를 회피하였고, 용액을 1mL 피펫으로 완전히 혼합했다. 각 간격에서, 샘플 농도는 핵산 농도(A260)의 분광 광도계 평가에 의해 모니터링했다. 이 과정은 목적하는 농도에 도달할 때까지 반복되었다.
크기 측정
입자 직경의 결정을 위해, 200μL의 입자의 현탁액을 큐벳(브랜드, UV-큐벳 마이크로)에 충전시키고, Malvern ZetaSizer Nano ZS(Malvern Instruments)를 사용하여 측정하여 유체역학적 직경 및 평균 유체역학적 직경(z-평균)을 nm 단위로 제공했다. 현탁 매질로서, 물 또는 지시된 바와 같이 동결 방지 첨가제를 함유하는 물이 사용되었다.
동결-해동 도전
폴리플렉스 크기(Malvern Zetasizer NanoZS)의 초기 결정 후, 제형을 96-웰 저프로파일 PCR 플레이트(투명함, RNAse 및 DNase 비함유)에 분배하고, 2X(20/10/2%) 첨가제 용액(표 1)으로 1:2로 희석시켰다. 각각 생성되는 제형 중 하나의 샘플을 크기 결정(Malvern Zetasizer NanoZS)에 사용했다. 나머지 샘플을 -20℃에서 약 16시간 동안 동결시키고, 실온에서 해동하고, 용액이 실온에 도달하기 전에 얼음에 즉시 저장했다. 이어서, 각각 해동된 제형 중 하나의 샘플을 크기 결정(Malvern Zetasizer NanoZS)에 사용하고, 다음 방정식에 따라 동결 전과 해동 후 제형의 크기 편차 %와 관련하여 비교하였고, 여기서 dh는 z-평균 입자 직경을 나타낸다:
Figure pct00017
결과
증가된 mRNA 농도 및/또는 감소된 N/P 비율에서 또한 나노 입자 또는 미세입자에 대한 동결 방지제로서 작용하는 동정된 분자의 특허청구된 부류의 능력이 이 실험에서 나타날 수 있다. 이러한 목적으로, 1,2-프로판디올이 대표적인 첨가제로서 선택되었다. 표 8은 상이한 mRNA 농도(0.25, 1.1 또는 2.3 mg/mL) 및 상이한 N/P 비율(N/P 4 또는 10)에서 동결된 복합체의 동결 전 대 해동 후의 입자 크기 편차 %를 보여준다. 사용된 mRNA/중합체/1,2-프로판디올 중량비는 표 9에 보고되어 있다.
동결 전 대 해동 후 크기 편차 %. n = 3.
N/P
비율		 mRNA 농도
[mg/mL]		 1,2-프로판디올[% w/v]
10 5
4 0..25 -2 -1 4 12 15 17
4 1.1 5 15 6 25 29 20
10 2.3 20 20 21 17 22 22
데이터는 모든 시험된 조건이 첨가제를 사용하여 응집의 회피를 유도했음을 보여준다.
상기 실험의 mRNA/중합체/1,2-프로판디올 중량비.
N/P 비율 mRNA 농도
[mg/mL]		 1,2-프로판디올
중량%		 mRNA
[mg]		 중합체
[mg]		 1,2-프로판디올
[mg]
4 0.25 10 1 0.52 416.00
4 0.25 5 1 0.52 208.00
4 1.1 10 1 0.52 94.55
4 1.1 5 1 0.52 47.27
10 2.3 10 1 1.30 45.22
10 2.3 5 1 1.30 22.61
토론 및 결론
실시예 III은, 입자 크기가 동결 동안 mRNA 농도뿐만 아니라 중합체 대 mRNA 비율과 무관하게 유지될 수 있음을 입증한다.
실시예 IV: 상이한 폴리양이온에 대해 동정된 첨가제의 동결 방지 특성(혼합 전 첨가)
복합체 형성
양이온성 중합체와 루시퍼라제를 인코딩하는 mRNA의 복합체는 3개의 상이한 중합체 구조를 사용하여 형성되었다: 분지형 폴리(에틸렌이민)(brPEI, 25kDa), 선형 폴리(에틸렌이민-프로필렌이민)(P7, 20kDa) 또는 선형 폴리(에틸렌이민-프로필렌이민)(P12, 24 kDa).
P7 및 P12는 다음 구조의 선형 폴리(에틸렌이민-프로필렌이민) 중합체이다:
Figure pct00018
합성:
무수 2-에틸-2-옥사졸린 및 무수 2-에틸-2-옥사진의 혼합물을 아세토니트릴에서 메틸 트리플레이트와 조합하였다. 중합은 질소 대기하에 130℃에서 30시간 동안 수행하였다. 물을 첨가하고 130℃에서 3시간 동안 배양하여 중합을 중단시켰다. 중합체는 차가운 디에틸 에테르에서 3개의 침전 단계로 수득되었다. 가수분해를 위해 중합체를 진한 염산에 용해시키고, 130℃에서 30시간 동안 배양하였다. 중합체 용액의 pH는 NaOH를 사용하여 pH 10으로 조정하였다. 정제는 탈이온수에 대한 투석 후 동결 건조를 통해 수행되었다. 2-에틸-2-옥사졸린 대 2-에틸-2-옥사진 비율의 변형을 통해, 생성되는 에틸이민(C2) 대 프로필렌이민(C3) 비율이 중합체 내에서 변형될 수 있다. 사용된 메틸 트리플레이트의 양으로 분자량이 조절될 수 있다.
생성되는 중합체는 다음과 같은 특성을 갖는다:
Figure pct00019
복합체는 3개의 다른 N/P 비율 4, 6 및 10에서 0.25mg/mL의 최종 농도로 혼합하였다. 표준 혼합 공정에서, mRNA는 물에서 0.5mg/mL의 농도로 희석시켰다. 동일한 용적의 중합체 용액을 20% 또는 10% (w/v) 1,2-프로판디올을 함유하는 물에서 제조하였다(농도는 표 10 참조). 나노입자는 중합체 용액에 mRNA 용액을 주입 한 후 전자 피펫(Mettler-Toledo, E4 LTS 1000 μL)을 사용하여 혼합함으로써 형성되었다. 혼합 후, 복합체를 사용 전에 얼음 위에서 20분 동안 배양하였다.
다른 N/P 비율에서 복합체를 제조하기 위한 중합체 용액의 농도
의도된 N/P 비율을 위한 중합체 용액의 농도 [mg/mL]
중합체 4 6 10
brPEI 0.26 0.39 0.65
P7 0.29 0.43 0.72
P12 0.29 0.43 0.72
크기 측정
입자 직경의 결정을 위해, 100μL의 입자의 현탁액을 큐벳(브랜드, UV-큐벳 마이크로)에 충전시키고, Malvern ZetaSizer Nano ZS(Malvern Instruments)를 사용하여 측정하여 유체역학적 직경 및 평균 유체역학적 직경(z-평균)을 nm로 제공했다. 현탁 매질로서, 물 또는 지시된 바와 같이 동결 방지 첨가제를 포함하는 물이 사용되었다.
동결-해동 도전
각각 생성되는 제형 중 하나의 샘플을 크기 결정(Malvern Zetasizer NanoZS)에 사용했다. 나머지 샘플을 -20℃에서 약 16시간 동안 동결시키고, 실온에서 해동하고, 용액이 실온에 도달하기 전에 얼음에 즉시 저장했다. 이어서, 각각 해동된 제형 중 하나의 샘플을 크기 결정(Malvern Zetasizer NanoZS)에 사용하고, 다음 방정식에 따라 동결 전과 해동 후 제형의 크기 편차 %와 관련하여 비교하였다:
Figure pct00020
생체내 실험을 위한 샘플 제조
복합체를 8mL의 용적에서 N/P 4에서 "복합체 형성" 및 "동결-해동 도전"하에 기재된 바와 같이 제조했다. 샘플을 동물에게 분무될 때까지 동결 유지시켰다.
분무
동물을 Buxco 소형 대량 투여 챔버(Data Sciences International, Germany)에 위치시켰다. 제형을 실온에서 해동시키고, 실온에 도달하기 전에 분쇄된 얼음 위에 놓은 다음, Aeroneb Solo 분무기(nAeroneb, Germany)를 사용하여 공기 순환 속도 3L/분 및 듀티 사이클 100%로 분무했다.
외식된 폐의 생물 발광 측정
적용 24시간 후, 동물을 펜타닐/미다졸람/메데토미딘(0.05/5.0/0.5 mg/kg BW)의 복강내 주사를 통해 완전 마취하에 놓았다. 50μL의 D-루시페린(포스페이트 완충 식염수에 용해된 30mg/mL, pH 7)을 스니핑 경로(비공에 직접 적용한 후 용액 흡입)를 통해 적용하고, 100μL의 D-루시페린을 복강내 주사로 전신 적용했다. 루시페린 투여 10분 후, 마우스를 자궁 경부 탈구를 통해 안락사시켰다. 오른쪽 심장을 통해 PBS로 관류 후, 폐를 외식시켰다. 비닝 세트 8 및 노출 시간 5분으로 Xenogen IVIS Luminar XR(Caliper LifeSciences)을 사용하여 생물 발광을 측정했다. 생물 발광을 정량화하고, Living Image Software 4.4(Xenogen)를 사용하여 분석했다. 과포화된 사진의 경우(선형 범위를 벗어난 발현 검출), 노출 시간은 1분으로 단축되었다. 생물 발광은 총 플럭스/기관(광자/초)으로 측정되었다. 과포화가 없는 사진만 분석에 사용되었다. 폐를 급속 동결시키고, -80℃에 저장했다.
균질화된 폐에서 루시퍼라제 활성
기관을 칭량하고, 외식된 폐의 절반을 FastPrep°-24 균질화기(MP Biomedicals)를 사용하여 용해 완충액에서 균질화했다. 100μL 루시페린 완충액을 Lumat LB 9507 광도계(Berthold Technologies)에 의해 75μL의 원심분리된 용해물에 자동으로 첨가했다. 루시퍼라제 활성은 RLU/s로 측정하였고, RLU/기관으로 전환시켰다.
결과
실시예 I 내지 III은 분지형 폴리(에틸렌이민)으로 형성된 입자만으로 다른 조건에서 생체내 효율을 유지하면서 응집을 방지하는데 있어서 첨가제의 효율을 입증한다. 이러한 첨가제의 기능성이 중합체 특성과 무관함을 입증하기 위해, 상이한 유형의 중합체가 시험되었다. 1,2-프로판디올이 예시적인 첨가제로서 선택되었다. 중합체는 분지 유형(분지형 및 선형), 분자량(20kDa, 24kDa 및 25kDa), 단량체 조성(폴리(에틸렌이민) 및 폴리(에틸렌이민-프로필렌이민)) 및 N/P 비율(4, 6 및 10)이 다양했다. 선택된 중합체는 이미 분무 후 기능성이 입증되었다. 두 가지 다른 첨가제 농도에 대한 동결 전과 해동 후 입자의 크기 편차 %의 결과는 표 10에 크기 편차로 제시된다. N/P 비율(N/P 4)은 생체내 기능성에 대해 또한 시험되었다. 효율 데이터의 요약은 도 4 및 표 13에 제시된다. 사용된 mRNA/중합체/1,2-프로판디올 중량비는 표 12 및 표 14b에 보고되어 있다.
동결 전 대 해동 후 5% 또는 10% (w/v) 1,2-프로판디올을 함유하는 상이한 중합체를 갖는 복합체 제형의 크기 편차 %.
mRNA 농도
[mg/mL]		 중합체 MWt
[kDa]		 유형 5% 1,2-프로판디올 10% 1,2-프로판디올
N/P 4 N/P 6 N/P 10 N/P 4 N/P 6 N/P 10
0.25 brPEI 25 분지형 27 -22 8 12 7 1
P7 20 선형 31 23 37 9 3 7
P12 24 선형 12 0 48 48 4 2
상기 실험의 mRNA/중합체/1,2-프로판디올 중량비.
중합체 N/P 비율 1,2-프로판디올
% w/v		 mRNA [mg] 중합체 [mg] 1,2-프로판디올 [mg]
brPEI 25kDa 4 5% 1 0.52 208
brPEI 25kDa 6 5% 1 0.78 208
brPEI 25kDa 10 5% 1 1.30 208
brPEI 25kDa 4 10% 1 0.52 416
brPEI 25kDa 6 10% 1 0.78 416
brPEI 25kDa 10 10% 1 1.30 416
P7 4 5% 1 0.58 208
P7 6 5% 1 0.87 208
P7 10 5% 1 1.44 208
P7 4 10% 1 0.58 416
P7 6 10% 1 0.87 416
P7 10 10% 1 1.44 416
P12 4 5% 1 0.58 208
P12 6 5% 1 0.87 208
P12 10 5% 1 1.45 208
P12 4 10% 1 0.58 416
P12 6 10% 1 0.87 416
P12 10 10% 1 1.45 416
도 4는 농축된 중합체/mRNA 제형의 생체내 형질 감염 효율을 도시한다.
N/P 4에서 brPEI 25kDa/P7/P12와 복합체화된 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 2mg의 mRNA를 지시된 첨가제의 존재하에 새로 제조(0.25㎎/mL mRNA; 8mL/그룹) 또는 1회 동결-해동 주기(1mg/mL mRNA; 2mL/그룹) 후에 마우스에게 분무했다. 처리 24시간 후 마우스를 마취시키고, 폐를 외식시켰다. 루시퍼라제 활성은 폐 균질물에서 측정되었다. n = 3
도 4의 표 데이터.
Fluc mRNA 용량/그룹 중합체 mRNA 농도 [mg/mL] 첨가제 생물 발광
(외식된 폐)		 루시퍼라제 활성
(균질물)
유형 농도
[% w/v]		 총 플럭스 [photos/초] STDEV [RLU/기관] STDEV
2 mg brPEI 0.25 신선한 복합체 0 64467 6809 2920 1108
P7 0.25 0 286000 171128 27721 17186
P12 0.25 0 202733 98217 24633 13277
brPEI 1 1,2-프로판디올 5 45500 24307 3152 2717
P7 1 5 589667 274906 31606 10180
P12 1 5 537667 367406 34458 21217
brPEI 1 10 45967 7565 3303 1548
P7 1 10 243000 156506 17646 12823
P12 1 10 289000 205691 31692 30625
[표 14a]
ZetaSizer(Malvern)로 측정된 새로 제조된 복합체의 표준 크기
Figure pct00021
[표 14b]
상기 실험의 mRNA/중합체/1,2-프로판디올 중량비.
Figure pct00022
토론 및 결론
이 실험에서 나타낸 바와 같이, 1,2-프로판디올의 안정화 효과는 중합체 분지 유형, 분자량, 단량체 조성 및 N/P 비율과 무관하다. 이러한 모든 매개 변수의 변화는 1회 동결 해동 도전 후 온전한 복합체를 초래했다. 추가로, 폐 적용 후 이러한 복합체의 기능성은 생체내 실험에서 입증될 수 있었다. 리포터 단백질의 발현 수준과 관련하여 5% 또는 10% 1,2-프로판디올에서 동결된 동일한 복합체와 비교하여 신선한 복합체의 유의한 차이는 검출될 수 없었다. 분지형 폴리(에틸렌이민) 대 폴리(에틸렌이민-프로필렌이민)의 효율의 일반적인 차이는 WO2013182683A1의 진술과 완전히 일치한다. 또한, 이 실험은 첨가제의 첨가 시점이 기능성에 영향을 미치지 않음을 확인했다. 실험 I 및 II에서 복합체화 후 첨가제를 나노 입자에 첨가하는 동안, 이 실험에서는 1,2-프로판디올이 mRNA 용액과 혼합되기 전에 중합체 용액에 첨가되었다.
실시예 V: 동결된 복합체의 안정성
복합체 형성
분지형 (폴리에틸렌이민)(brPEI) 및 루시퍼라제를 인코딩하는 mRNA의 복합체가 0.25mg/mL의 농도로 형성되었다. 표준 혼합 공정에서, mRNA를 물에서 0.5mg/mL의 농도로 희석시켰다. 동일한 용적의 brPEI 용액을 물 또는 10% 1,2-프로판디올에서 0.65mg/mL의 농도로 제조했다. 나노 입자를 제형화하기 위해, mRNA 용액을 brPEI 용액에 주입한 다음 전자 피펫(Mettler-Toledo, E4 LTS 1000 μL)을 사용하여 혼합했다. 혼합 후, 복합체를 사용 전에 얼음 위에서 20분 동안 배양하였다.
동결-해동 도전
폴리플렉스 크기(Malvern Zetasizer NanoZS)의 초기 결정 후, 각 제형의 100μL 삼중물을 지시된 시간 동안 -20℃에서 동결 저장하고, 실온에서 해동시키고, 용액이 실온에 도달하기 전에 얼음에 즉시 저장했다. 이어서, 각각 해동된 제형 중 하나의 샘플을 크기 결정(Malvern Zetasizer NanoZS)에 사용하고, 다음 방정식에 따라 동결 전과 해동 후 제형의 크기 편차 %와 관련하여 비교하였고, 여기서 dh는 z-평균 입자 직경을 나타낸다:
Figure pct00023
mRNA 완전성 측정
나노 입자 제형은 물에서 0.2mg/mL mRNA로 희석시켰다. 이 희석액 5μL를 3μL의 40mg/mL 헤파린, 2μL의 2% v/v 트리톤 X-100 및 10μL 포름아미드로 처리했다. 혼합물을 완전한 입자 파괴를 위해 70℃에서 15분 동안 배양한 다음, 분쇄된 얼음에 유지시켰다. 이어서, 핵산 단편 분석은 모세관 겔 전기영동(Advanced Analytical Fragment Analyzer, PROSize 2.0)에 의해 수행되었다. 처리된 제형(mRNA처리됨)으로부터의 전장 mRNA에 대한 신호를 기준으로 제형화에 사용된 동일한 Lot의 신선한 복합체화되지 않은 mRNA(mRNAref)의 신호와 비교하고, 다음 식에 따라 mRNA 완전성[%]으로 표현하였다:
Figure pct00024
결과
mRNA 기반 나노 입자 또는 미세입자의 중요한 매개 변수는 복합체에서 mRNA 안정성이다. 표 15에 제시된 바와 같이, 25℃에서 복합체를 저장하면 복합체화된 mRNA의 급속한 분해를 초래한다. 이 실험에서, 복합체화된 RNA의 안정성에 대한 복합체를 동결시키는 능력의 영향을 시험했다. 제1 세트에서, 복합체를 RNA로 형성하고, 양호한 실행 첨가제 그룹의 예시적인 후보로서 1,2-프로판디올을 첨가 후 동결시켰다. 복합체에서 mRNA의 완전성(전장 mRNA의 양)은 동결 전 및 -20℃에서 저장 1주일 후에 시험하였다. 신선한 복합체화되지 않은 mRNA를 측정하고, 기준으로 100%로 설정했다. 결과는 표 16에 요약된다.
제2 세트에서, 실험은 -20℃에서 8주 동안 복합체를 저장한 후 반복했다. 결과는 표 17에 묘사된다.
실온에서 복합체에서 mRNA의 완전성.
중합체 mRNA 완전성[%]
0 h 1.5 h 3 h
brPEI 100 77.5 56.4
동결된 복합체(5% 1,2-프로판디올, -20℃, 1주) 대 새로 제조된 폴리플렉스 또는 신선한 mRNA에서 mRNA의 완전성
샘플 mRNA 완전성
[%]
신선한 mRNA 100
신선한 폴리플렉스 98
1-주 FT 폴리플렉스(삼중) 94.7 ± 0.7
동결된 복합체(5% 1,2-프로판디올, -20℃, 8주) 대 신선한 mRNA에서 mRNA의 완전성.
샘플 mRNA 완전성
[%]
신선한 mRNA 100
8-주 FT 폴리플렉스 (삼중) 98.9 ± 7.5
토론 및 결론
기재된 실험은 장기간 저장을 위해 나노 입자 또는 미세입자를 동결시키는 능력의 강력한 이점을 보여준다. 실온에서 저장된 복합체는 몇 시간 내에 mRNA의 분해 과정을 초래하지만, 동결된 상태로 저장된 복합체는 적어도 8주 동안 완전히 보존된 mRNA를 초래한다.
실시예 VI: 지질 기반 제형을 위한 동결 방지제로서 1,2-프로판디올
복합체 형성
지질 성분(양이온성 리피도이드, 헬퍼 지질 콜레스테롤 및 PEG-지질)을 가용화하고, 이소프로판올에서 혼합하고, 시트레이트 완충액(10mM 시트르산, 150mM NaCl, pH 4.5) 중 mRNA 용액에 1:4의 용적비로 주입하여 0.2mg/mL의 mRNA 농도를 초래한다. 복합체는 실온에서 20분 동안 배양했다. 배양 후, 용액을 16시간 동안 물에 대해 투석하였다. 투석 후 mRNA 농도는 0.13mg/mL였다. 0.2 또는 0.5mg/mL의 mRNA 농도에 도달하기 위해, 입자를 45℃에서 SpeedVac(Concentrator Plus, Eppendorf)에서 농축시켰다.
크기 측정
입자 직경의 결정을 위해, 200μL의 입자의 현탁액을 큐벳(브랜드, UV-큐벳 마이크로)에 충전시키고, Malvern ZetaSizer Nano ZS(Malvern Instruments)를 사용하여 측정하여 유체역학적 직경 및 평균 유체역학적 직경(z-평균)을 nm로 제공했다. 현탁 매질로서, 물 또는 지시된 바와 같이 동결 방지 첨가제를 함유하는 물이 사용되었다.
동결-해동 도전
제형은 2X(20 또는 10%) 1,2-프로판디올 용액으로 1:2로 희석시키고, 상이한 샘플로 분할했다. 각각 생성되는 제형 중 하나의 샘플을 첨가제의 존재하에 크기 결정(Malvern Zetasizer NanoZS)에 사용했다. 나머지 샘플을 -20℃에서 약 16시간 동안 동결시키고, 실온에서 해동하고, 용액이 실온에 도달하기 전에 얼음에 즉시 저장했다. 이어서, 각각 해동된 제형 중 하나의 샘플을 크기 결정(Malvern Zetasizer NanoZS)에 사용하고, 다음 방정식에 따라 동결 전과 해동 후 제형의 크기 편차 %와 관련하여 비교하였고, 여기서 dh는 z-평균 입자 직경을 나타낸다:
Figure pct00025
기관내 분무 적용
이소플루란 흡입 마취하에 MicroSprayer 1A 장치(PennCentury, USA)를 사용하여 50μL 복합체 용액을 기관내 적용했다.
외식된 폐의 생물 발광 측정
적용 24시간 후, 동물을 펜타닐/미다졸람/메데토미딘(0.05/5.0/0.5 mg/kg BW)의 복강내 주사를 통해 완전 마취하에 놓았다. 50μL의 D-루시페린(포스페이트 완충 식염수에 용해된 30mg/mL, pH 7)을 스니핑 경로(비공에 직접 적용한 후 용액 흡입)를 통해 적용하고, 100μL의 D-루시페린을 복강내 주사로 전신 적용했다. 루시페린 투여 10분 후, 마우스를 자궁 경부 탈구를 통해 안락사시켰다. 오른쪽 심장을 통해 PBS로 관류 후, 폐를 외식시켰다. 비닝 세트 8 및 노출 시간 5분으로 Xenogen IVIS Luminar XR(Caliper LifeSciences)을 사용하여 생물 발광을 측정했다. 생물 발광을 정량화하고, Living Image Software 4.4(Xenogen)를 사용하여 분석했다. 과포화된 사진의 경우(선형 범위를 벗어난 발현 검출), 노출 시간은 1분으로 단축되었다. 생물 발광은 총 플럭스/기관(광자/초)으로 측정되었다. 과포화가 없는 사진만 분석에 사용되었다. 폐를 급속 동결시키고, -80℃에 저장했다.
균질화된 폐에서 루시퍼라제 활성
해동된 기관을 칭량하고, 외식된 폐의 절반을 FastPrep°-24 균질화기(MP Biomedicals)를 사용하여 용해 완충액에서 균질화했다. 100μL의 루시페린 완충액을 Lumat LB 9507 광도계(Berthold Technologies)에 의해 75μL의 원심분리된 용해물에 자동으로 첨가했다. 루시퍼라제 활성은 RLU/s로 측정하였고, RLU/기관으로 전환시켰다.
결과
이 실시예는 지질 기반 복합체의 동결 방지제로서 본원에서 정의된 첨가제의 적합성을 입증했다. 제1 단계에서, 나노 입자를 형성시키고, 첨가제의 존재 또는 부재하에 1회 동결-해동 주기로 도전했다. 크기를 동결 전 및 해동 후에 측정했다. 1,2-프로판디올이 물질 그룹의 대표로서 선택되었다. 실험은 상이한 복합체 농도(0.2 및 0.5mg/mL)뿐만 아니라 상이한 첨가제 농도(5% 및 10% (w/v))에서 수행하였다. 크기 차이는 표 18b에 요약된다.
[표 18a]
ZetaSizer Nano ZS(Malvern)로 측정된 새로 제조된 복합체의 표준 크기
Figure pct00026
[표 18b]
동결 전 대 해동 후 5% 또는 10% 1,2-프로판디올을 함유하는 상이한 폴리플렉스 제형의 크기 편차 (%).
Figure pct00027
표 18b에 나타낸 바와 같이, 1,2-프로판디올은 또한 지질 기반 복합체에 대해 1회 동결-해동 도전 동안 입자 크기를 안정화시킨다. 따라서, 폐 전달 후 형질 감염의 효율은 다음 단계에서 시험되었다. 이 목적을 위해, 반딧불이 루시퍼라제를 인코딩하는 10㎍ mRNA의 용량을 마이크로스프레이 주사를 통해 기관으로 BALB/c 마우스에 적용했다. 전달 효율 및 이에 따른 담체의 기능성에 대한 척도로서 생성된 단백질의 검출 결과는 도 5 및 표 19에 제시된다.
도 5는 1,2-프로판디올로 동결 후 지질 기반 나노 입자 또는 미세입자 입자의 생체내 형질 감염 효율을 도시한다.
반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA를 함유하는 복합체를 1,2-프로판디올의 존재 또는 부재하에 제조하였고, 4℃에서 저장 또는 1회 동결-해동 주기 후 마이크로스프레이를 통해 마우스에 기관내 적용했다. 처리 24시간 후, 마우스를 마취시키고, 루시퍼라제 활성 측정을 위해 폐를 외식시켰다. n = 3.
도 5의 표 데이터(외식된 폐에서의 생물 발광 포함)
FLuc mRNA 용량/동물 첨가제 견해 생물 발광
(외식된 폐) 		루시퍼라제 활성
(균질물)
유형 농도
[% w/v] 		총 플럭스 (photos/초) STDEV RLU/기관 STDEV
10　μg 신선한 복합체 0 신선함 8106000 1824000 2263125 98203
1,2-프로판디올 5 신선함 18522000 15191171 976173 256302
1,2-프로판디올 5 동결됨 21634667 21475152 6637646 4472781
도 5 및 표 19에서 알 수 있는 바와 같이, 1,2-프로판디올의 존재하에 동결된 복합체는 생체내 적용 후 완전한 기능성을 유지했다. 따라서, 첨가제는 형질 감염 효율에 부정적인 영향을 미치지 않는다.
토론 및 결론
이 실시예에 제시된 데이터는 1,2-프로판디올이 중합체 기반 복합체뿐만 아니라 지질 기반 복합체의 동결을 허용하여 그들이 응집되는 것을 방지하고 생체내에서 활성을 보존한다는 것을 보여준다.

Claims (20)

  1. (i) 액체 상에 현탁된 치료적 활성제의 나노 입자 또는 미세입자 제형, 및
    (ii) 1개 또는 2개의 하이드록시 그룹으로 치환된 C3-C5 알칸으로부터 선택된 적어도 하나의 동결 방지 첨가제(cryoprotective additive)를 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 치료적 활성제가 핵산인, 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 치료적 활성제가 mRNA인, 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 나노 입자 또는 미세입자 제형이 1 내지 4000nm, 더욱 바람직하게는 2 내지 2500nm, 가장 바람직하게는 5 내지 1000nm 범위의 평균 입자 직경을 나타내는, 조성물.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 치료적 활성제가 핵산이고, 나노 입자 또는 미세입자 제형의 입자가 핵산 및 양이온성 부형제를 포함하는, 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 입자 제형의 입자가 핵산을, 핵산과 양이온성 부형제로서 양이온성 올리고머 또는 양이온성 중합체에 의해 형성된 복합체 형태로 포함하는, 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 입자 제형의 입자가 핵산을, 핵산과 양이온성 부형제로서 양이온성 지질 또는 양이온성 리피도이드(lipidoid)에 의해 형성된 복합체 형태로 포함하는, 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 동결 방지 첨가제가 적어도 2차 하이드록시 그룹을 포함하는, 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 동결 방지 첨가제가 1,2-프로판디올, 2-프로판올, 1,2-부탄디올, 및 1,3-부탄디올로부터 선택되는, 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 동결 방지 첨가제가 1,2-프로판디올인, 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 동결 방지 첨가제가, 액체 상의 용적을 기준으로 하여, 0.5 내지 50% w/v의 농도로 함유되는, 조성물.
  12. (i) 치료적 활성제의 나노 입자 또는 미세입자 제형, 및
    (ii) 1개 또는 2개의 하이드록시 그룹으로 치환된 C3-C5 알칸으로부터 선택된 적어도 하나의 동결 방지 첨가제를 포함하는 고체 조성물로서,
    제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따르는 조성물을 동결시킴으로써 수득될 수 있는 고체 조성물.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따르는 조성물의 제조 방법으로서, 상기 방법이
    a) 액체 상에 현탁된 치료적 활성제의 나노 입자 또는 미세입자 제형을 제공하는 단계, 및
    b) 1개 또는 2개의 하이드록시 그룹으로 치환된 C3-C5 알칸으로부터 선택된 적어도 하나의 동결 방지 첨가제를 액체 상에 첨가하는 단계로서, 동결 방지 첨가제의 액체 상에의 첨가가 액체 상에 현탁된 입자 제형을 제공하기 전, 제공하는 동안 또는 제공한 후에 달성될 수 있는, 단계를 포함하는, 제조 방법.
  14. 제12항에 따르는 고체 조성물의 제조 방법으로서, 상기 방법이
    a) 액체 상에 현탁된 치료적 활성제의 나노 입자 또는 미세입자 제형을 제공하는 단계, 및
    b) 1개 또는 2개의 하이드록시 그룹으로 치환된 C3-C5 알칸으로부터 선택된 적어도 하나의 동결 방지 첨가제를 액체 상에 첨가하는 단계로서, 동결 방지 첨가제의 액체 상에의 첨가가 액체 상에 현탁된 입자 제형을 제공하기 전, 제공하는 동안 또는 제공한 후에 달성될 수 있는, 단계를 포함하는 공정에 의해 상기 제1 측면에 따르는 조성물을 제공하는 제1 단계 및
    제1 단계에서 수득된 조성물을 동결시키는 제2 단계를 포함하는, 제조 방법.
  15. 치료적 활성제의 나노 입자 또는 미세입자 제형의 보존 방법으로서, 상기 방법이 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따르는 현탁액 조성물을 제공하는 단계 및 상기 조성물을 동결시키는 단계를 포함하는, 보존 방법.
  16. 치료적 활성제의 나노 입자 또는 미세입자 제형을 포함하는 조성물을 위한 동결 방지 첨가제로서의 1개 또는 2개의 하이드록시 그룹으로 치환된 C3-C5 알칸으로부터 선택된 화합물의 용도.
  17. 액체에 현탁된 미립자 조성물(particulate composition)로부터 에어로졸을 형성하거나, 이러한 조성물을 분무(nebulising)하기 위한 장치(device)로서, 이러한 장치가 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따르는 조성물을 포함하는, 장치.
  18. 제17항에 있어서, 장치가 계량된 용량 흡입기, 분무기 및 비강 분무 장치로부터 선택된 흡입기인, 장치.
  19. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 기도에 또는 기도를 통해 투여되는, 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 조성물이 폐 투여를 통해 또는 비강 투여를 통해 투여되는, 조성물.
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