RU2451022C2 - Катионные олигонуклеотиды, автоматизированные способы их получения и их применение - Google Patents
Катионные олигонуклеотиды, автоматизированные способы их получения и их применение Download PDFInfo
- Publication number
- RU2451022C2 RU2451022C2 RU2008128853/04A RU2008128853A RU2451022C2 RU 2451022 C2 RU2451022 C2 RU 2451022C2 RU 2008128853/04 A RU2008128853/04 A RU 2008128853/04A RU 2008128853 A RU2008128853 A RU 2008128853A RU 2451022 C2 RU2451022 C2 RU 2451022C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- oligonucleotide
- synthesis
- molecules
- sequence
- index
- Prior art date
Links
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 96
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 52
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 title description 26
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 title 1
- PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N spermine Chemical group NCCCNCCCCNCCCN PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 81
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims abstract description 15
- KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N putrescine Chemical compound NCCCCN KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 239000005700 Putrescine Substances 0.000 claims abstract description 7
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 claims abstract description 7
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 claims abstract description 4
- 125000006833 (C1-C5) alkylene group Chemical group 0.000 claims abstract 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 34
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 31
- 229940063675 spermine Drugs 0.000 claims description 27
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 21
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 claims description 17
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 13
- RWRDLPDLKQPQOW-UHFFFAOYSA-N Pyrrolidine Chemical compound C1CCNC1 RWRDLPDLKQPQOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 claims description 9
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 9
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 8
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 8
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 7
- 150000002009 diols Chemical class 0.000 claims description 7
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 claims description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 7
- YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N Morpholine Chemical group C1COCCN1 YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 4
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 4
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 4
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 claims description 4
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 claims description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 2
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 claims description 2
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 claims description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 2
- SKWCZPYWFRTSDD-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(azaniumyl)propanoate;chloride Chemical compound Cl.NCC(N)C(O)=O SKWCZPYWFRTSDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 abstract description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 abstract 1
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 39
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 27
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- -1 i.e. Proteins 0.000 description 17
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 11
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 9
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 8
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 description 8
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 8
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- QAEDZJGFFMLHHQ-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic anhydride Chemical compound FC(F)(F)C(=O)OC(=O)C(F)(F)F QAEDZJGFFMLHHQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N Cyclohexane Chemical compound C1CCCCC1 XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 238000003818 flash chromatography Methods 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 5
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101100297345 Caenorhabditis elegans pgl-2 gene Proteins 0.000 description 5
- 101100297347 Caenorhabditis elegans pgl-3 gene Proteins 0.000 description 5
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 5
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 5
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 5
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KXDAEFPNCMNJSK-UHFFFAOYSA-N Benzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC=C1 KXDAEFPNCMNJSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 4
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 3
- PECYZEOJVXMISF-UHFFFAOYSA-N 3-aminoalanine Chemical compound [NH3+]CC(N)C([O-])=O PECYZEOJVXMISF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BRARRAHGNDUELT-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxypicolinic acid Chemical compound OC(=O)C1=NC=CC=C1O BRARRAHGNDUELT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000002103 4,4'-dimethoxytriphenylmethyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)(C1=C([H])C([H])=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H])C1=C([H])C([H])=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H] 0.000 description 3
- SXIFAEWFOJETOA-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxy-butyl Chemical group [CH2]CCCO SXIFAEWFOJETOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- 125000004044 trifluoroacetyl group Chemical group FC(C(=O)*)(F)F 0.000 description 3
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 3
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 2
- JBWYRBLDOOOJEU-UHFFFAOYSA-N 1-[chloro-(4-methoxyphenyl)-phenylmethyl]-4-methoxybenzene Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(Cl)(C=1C=CC(OC)=CC=1)C1=CC=CC=C1 JBWYRBLDOOOJEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KMEMIMRPZGDOMG-UHFFFAOYSA-N 2-cyanoethoxyphosphonamidous acid Chemical compound NP(O)OCCC#N KMEMIMRPZGDOMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 2
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 2
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N Pentane Chemical compound CCCCC OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910004298 SiO 2 Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 2
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 2
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 2
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 2
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N guanidine group Chemical group NC(=N)N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000000155 melt Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- XKJCHHZQLQNZHY-UHFFFAOYSA-N phthalimide Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NC(=O)C2=C1 XKJCHHZQLQNZHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 125000001981 tert-butyldimethylsilyl group Chemical group [H]C([H])([H])[Si]([H])(C([H])([H])[H])[*]C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- PGAPATLGJSQQBU-UHFFFAOYSA-M thallium(i) bromide Chemical compound [Tl]Br PGAPATLGJSQQBU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 125000006527 (C1-C5) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOSXTWDYAWERDB-UHFFFAOYSA-N 1-[chloro(diphenyl)methyl]-2,3-dimethoxybenzene Chemical compound COC1=CC=CC(C(Cl)(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)=C1OC LOSXTWDYAWERDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N Hydrogen bromide Chemical compound Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N Sodium Chemical compound [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M Trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- MGPYJVWEJNTXLC-UHFFFAOYSA-N [6-[6-[2-cyanoethoxy-[di(propan-2-yl)amino]phosphanyl]oxyhexylcarbamoyl]-6'-(2,2-dimethylpropanoyloxy)-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-3'-yl] 2,2-dimethylpropanoate Chemical compound C12=CC=C(OC(=O)C(C)(C)C)C=C2OC2=CC(OC(=O)C(C)(C)C)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)NCCCCCCOP(N(C(C)C)C(C)C)OCCC#N)C=C21 MGPYJVWEJNTXLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 150000001414 amino alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- XMQFTWRPUQYINF-UHFFFAOYSA-N bensulfuron-methyl Chemical compound COC(=O)C1=CC=CC=C1CS(=O)(=O)NC(=O)NC1=NC(OC)=CC(OC)=N1 XMQFTWRPUQYINF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 239000005388 borosilicate glass Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- CLNQLMBYYQGUIL-UHFFFAOYSA-N chloro-[(4-cyano-2-methylbutan-2-yl)-propan-2-ylamino]oxyphosphinous acid Chemical compound OP(Cl)ON(C(C)C)C(C)(C)CCC#N CLNQLMBYYQGUIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 229940125782 compound 2 Drugs 0.000 description 1
- 229940126214 compound 3 Drugs 0.000 description 1
- 229940125898 compound 5 Drugs 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013058 crude material Substances 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- DEZRYPDIMOWBDS-UHFFFAOYSA-N dcm dichloromethane Chemical compound ClCCl.ClCCl DEZRYPDIMOWBDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000215 hyperchromic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 150000002892 organic cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 1
- NFHFRUOZVGFOOS-UHFFFAOYSA-N palladium;triphenylphosphane Chemical compound [Pd].C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1.C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1.C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1.C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 NFHFRUOZVGFOOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011837 pasties Nutrition 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N phenylmethyl ester of formic acid Natural products O=COCC1=CC=CC=C1 UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005731 phosphitylation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- SXADIBFZNXBEGI-UHFFFAOYSA-N phosphoramidous acid Chemical group NP(O)O SXADIBFZNXBEGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 231100000683 possible toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 239000012312 sodium hydride Substances 0.000 description 1
- 229910000104 sodium hydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- INGJYKISFRSCQV-UHFFFAOYSA-N tert-butyl-(4-iodobutoxy)-dimethylsilane Chemical compound CC(C)(C)[Si](C)(C)OCCCCI INGJYKISFRSCQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic System
- C07F9/02—Phosphorus compounds
- C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
- C07F9/22—Amides of acids of phosphorus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
- A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
- A61K48/0041—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being polymeric
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Abstract
Настоящее изобретение относится к олигонуклеотид-олигокатионным молекулам AiBjH, применяемым в молекулярной биологии, диагностике и терапевтических вариантах использования. Олигонуклеотид-олигокатионные молекулы AiBjH могут быть синтезированы посредством автоматизированной фосфорамидитной химии и имеют олигонуклеотидные фрагменты Ai и олигокатионные фрагменты Bj. Фрагмент Ai представляет собой i-мерный олигонуклеотидный остаток, с индексом i = от 5 до 50, в котором нуклеотид А представляет собой олигомер с природными или неприродными нуклеиновыми основаниями и/или пентафуранозильными группами и/или нативными сложными фосфодиэфирными связями, а также их химические модификации или замещения. Фрагмент Bj представляет собой j-мерный органический олигокатионный фрагмент с индексом j = от 1 до 50, в котором В выбран из группы, включающей -HPO3-R1-(X-R2 n)n1-X-R3-O-, где R1, R2 n и R3, идентичные или различные, представляют собой С1-С5 алкилен, Х представляет собой NH или NC(NH2)2, индекс n1 = от 2 до 20; -HPO3-R4-CH(R5X1)-R6-O-, где R4 представляет собой С1-С5 алкилен, R5 и R6, идентичные или различные, представляют собой С1-С5 алкилен и X1 представляет собой путресциновый, спермидиновый или сперминовый остаток. 5 н. и 13 з.п. ф-лы, 16 ил., 5 пр.
Description
Изобретение относится к катионным олигонуклеотидам, то есть олигонуклеотид-олигокатионным молекулам, также называемым катионными олигонуклеотидами в описании (независимо от их общего заряда), которые могут быть синтезированы постадийно на олигонуклеотидном синтезаторе. Изобретение также относится к их применению в молекулярной биологии, в диагностике и терапевтических вариантах использования.
Олигонуклеотиды находят чрезвычайно широкое применение в молекулярной биологии и диагностике и могут составлять очень избирательный класс лекарственных средств для лечения обширного круга заболеваний.
Олигонуклеотиды представляют собой полианионы, которые проявляют свою специфическую активность сообразно гибридизации с комплементарной последовательностью, созданной другой полианионной нуклеиновой кислотой.
В качестве потенциальных лекарственных средств (кандидатов лекарственных средств) они должны также быть способны проходить через анионную клеточную мембрану.
Из простых электростатических соображений можно заключить, что для энергии гибридизации и клеточного связывания могло бы быть благоприятным добавление катионных групп к олигонуклеотидной структуре.
В плане указанной задачи были исследованы многие синтетические подходы для введения аммониевых или гуанидиновых остатков в олигонуклеотиды: замещение в фосфатном каркасе, модификация рибозы или нуклеинового основания и концевое конъюгирование поликатиона. Однако специфичность гибридизации, активность взаимодействующего с нуклеиновой кислотой фермента, а также токсичность метаболитов во всех отношениях касается блокового подхода, где поликатион присоединяется к во всем остальном природному олигонуклеотиду, в качестве наилучшего решения. К сожалению, постадийный автоматизированный синтез конъюгатов олигонуклеотидов с катионными пептидами все еще не является общепринятой практикой. С другой стороны, химические основы конъюгации предварительно сформированных крупных молекулярных блоков остаются непростыми, в особенности в водной среде, где «супер»-цвиттерионы создают трудноразрешимые проблемы в отношении растворимости, очистки и охарактеризовывания. Более того, применение в молекулярной биологии и диагностике нуждается в быстром и однозначном синтезе любой данной последовательности оснований, связанной с органическим катионом любой длины.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что проводимый в режиме реального времени при компьютерном управлении синтез олигонуклеотид-олигокатионных молекул был возможен при установке пробирок, содержащих должным образом активированные и защищенные олигокатионные производные, в олигонуклеотидный синтезатор, с добавлением к ним четырех природных оснований.
Таким образом, цель изобретения состоит в получении новых катионных олигонуклеотидов.
Еще одна цель изобретения состоит в разработке автоматизированного синтеза указанных катионных олигонуклеотидов с высоким выходом.
В дальнейшей цели изобретение относится к применению указанных катионных олигонуклеотидов, в особенности в молекулярной биологии, диагностике и терапевтических методах.
Изобретение тем самым относится к смешанным олигонуклеотид-олигокатионным молекулам, которые могут быть синтезированы посредством автоматизированной фосфорамидитной химии, то есть с помощью сложных полифосфодиэфиров.
Более конкретно, катионные олигонуклеотиды AiBjH согласно изобретению имеют олигонуклеотидные фрагменты Ai и олигокатионные фрагменты Bj, где
Ai представляет собой i-мерный олигонуклеотидный остаток, с индексом i = от 5 до 50, с природными или неприродными нуклеиновыми основаниями и/или пентафуранозильными группами и/или нативными сложными фосфодиэфирными связями;
Bj представляет собой j-мерный органический олигокатионный фрагмент, с индексом j = от 1 до 50, где В выбран из группы, включающей
-HPO3-R1-(X-R2)n1-X-R3-O-, где R1, R2 и R3, идентичные или различные, представляют собой низший алкилен, Х представляет собой NH или NC(NH2)2, и индекс n1 = от 2 до 20,
-HPO3-R4-СН(R5Х1)-R6-O-, где R4 представляет собой низший алкилен, R5 и R6, идентичные или различные, представляют собой низший алкилен, и Х1 представляет собой путресциновый, спермидиновый или сперминовый остаток,
-HPO3-R7-(аа)n2-R8-O-, где R7 представляет собой низший алкилен и R8 представляет собой низший алкилен, серин, природный аминоспирт, полученный восстановлением природной аминокислоты, (аа)n2 представляет собой пептид, содержащий природные аминокислоты с катионными боковыми цепями, такие как аргинин, лизин, орнитин, гистидин, диаминопропионовая кислота, и индекс n2 = от 2 до 20.
«Низший алкил» или «низший алкилен», как используется в описании и пунктах формулы изобретения, преимущественно обозначает необязательно замещенный линейный или разветвленный С1-С5-алкильный или -алкиленовый радикал, соответственно.
А, например, выбран из группы, включающей дезоксирибо-, рибо-, замкнутые (LNA) нуклеотиды, а также их химические модификации или замещения, такие как фосфоротиоат (также называемый тиофосфатом), 2'-фтор-, 2'-О-алкильная или маркерная группа, такая как флуоресцентный агент.
Смешанные олигонуклеотид-олигокатионные молекулы согласно изобретению имеют 3'A5'-B-последовательность.
Другие молекулы согласно изобретению имеют В-3'A5-последовательность.
Еще другие молекулы согласно изобретению имеют В-3'A5'-B- или 3'A5'-B-3'A5'-последовательность.
Такая последовательность иллюстрируется примерами олигонуклеотид-сперминовой молекулы, имеющей следующую структуру:
в которой А и индексы i и j такие, как определено выше.
Молекулы с А, представляющим собой фосфоротиоатный нуклеотид, в особенности предпочтительны с точки зрения их биологического применения, поскольку фосфоротиоатные олигонуклеотиды не гидролизуются в биологических жидкостях.
Вышеописанные катионные олигонуклеотиды формируют прочные и стабильные комплексы с комплементарными им последовательностями в контексте одноцепочечного замещения и даже в контексте плазмидной одноцепочечной инвазии, как иллюстрируется примерами.
Благодаря концевой конъюгации селективность последовательности остается такой же высокой, как для природных нуклеотидов.
Соответственно указанному, катионные олигонуклеотиды согласно изобретению представляют огромный интерес для молекулярной биологии, в качестве реагентов для исследований и в области диагностического применения, например, в ПЦР, ПЦР в реальном времени, генотипировании, in situ гибридизации и ДНК-чипах.
Такие применения также охватываются изобретением и включают использование таких олигонуклеотид-олигокатионных молекул, какие определены выше.
В отличие от анионных олигонуклеотидов катионные олигонуклеотиды согласно изобретению, как показано в примерах, спонтанно проникают в цитоплазму и ядро живых клеток.
Принимая во внимание их усиленную гибридизацию и свойства проникновения в клетку, они также полезны для терапевтических методов, таких как методы, использующие деградацию матричной РНК, направляемую антисмысловыми и короткими некодирующими РНК (siРНК), пропуск экзона во время созревания матричной РНК, образование тройной спирали хроматином, хроматиновую одноцепочечную инвазию (генная коррекция)...
Изобретение тем самым относится также к фармацевтическим композициям, содержащим эффективное количество олигонуклеотид-олигокатионных молекул, таких как описанные выше, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.
Изобретение также относится к способу лечения, включающему применение эффективного количества олигонуклеотид-олигокатионных молекул, таких как описанные выше, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.
Вышеописанные смешанные олигонуклеотид-олигокатионные молекулы преимущественно синтезируются постадийно в олигонуклеотидном синтезаторе, по фосфорамидитному пути, согласно способу, включающему
- размещение пробирок, содержащих активированные и защищенные олигокатионы В в олигонуклеотидном синтезаторе, с добавлением в пробирки олигонуклеотидов А, таких как описанные выше, или наоборот,
- остановку синтеза, когда достигается желаемая длина,
- отщепление олигомеров от твердого носителя,
- удаление защитных групп.
Изобретение имеет непосредственное отношение к синтезе для конструирования олигокатионного повторяющегося блока В. Для указанной цели могут быть использованы следующие фосфорамидитные реагенты
P(OR9)(N(R10)2)-O-R1-(X-R2)n1-X-R3-O-Prot, где R1, R2, R3 и индекс n1 такие, как определено выше, Х представляет собой подходящим образом защищенный NH или NC(NH2)2, R9 представляет собой -CH2CH2CN или низший алкил, R10 представляет собой низший алкил, или -N(R10)2 представляет собой пирролидиновую, пиперидиновую или морфолиновую группу, и Prot представляет собой защитную группу, используемую в олигонуклеотидном синтезе, такую как DMT, MMT;
P(OR9)(N(R10)2)-O-R4-СН(R5Х1)-R6-O-Prot, где R4, R5 и R6 представляют собой низший алкилен, Х1 представляет собой подходящим образом защищенный путресцин, спермидин или спермин, R9 и R10 такие, как описанные выше;
P(OR9)(N(R10)2)-O-R7-(аа)n2-R8-O-Prot, где R7, R8, R9, R10, n2 и Prot такие, как описанные выше, (аа)n2 представляет собой пептид, содержащий природные аминокислоты с подходящим образом защищенными катионными боковыми цепями, такие как аргинин, лизин, орнитин, гистидин, диаминопропионовая кислота, и индекс n2 = от 2 до 20.
«Подходящим образом защищенный NH или NC(NH2)2» означает, что на амино- или гуанидиновом остатке, соответственно, присутствуют защитные группы, чтобы сделать указанные функциональные группы инертными в условиях химических реакций, которым подвергается реагент.
Такими защитными группами являются, например, фталимидная (РНТН), трифторацетатная, аллилоксикарбонильная (Alloc), бензилоксикарбонильная (CBZ), хлорбензилоксикарбонильная, трет-бутилоксикарбонильная (Вос), флуоренилметоксикарбонильная (Fmoc) и изоникотинилоксильная (i-Noc) группы.
Согласно варианту осуществления изобретения постадийный синтез олигонуклеотидной последовательности продолжается постадийным синтезом олигокатионного компонента для получения соединений, имеющих последовательность (3'A5'-B).
Согласно еще одному варианту осуществления изобретения выполняется обратный порядок стадий, с постадийным синтезом олигокатионного компонента, который продолжается постадийным синтезом олигонуклеотидной последовательности для получения соединений с последовательностью (В-3'A5').
Согласно еще одному дальнейшему варианту осуществления изобретения синтезируются смешанные последовательности.
В частности, олигонуклеотидные последовательности, кэпированные на обоих концах (В-3'A5'-В), могут быть устойчивыми к экзонуклеазам в биологических жидкостях, и последовательности с катионным прерыванием (3'A5'-В-3'A5') позволяют позиционировать смежные («вицинальные») последовательности нуклеиновых кислот.
Применением природных аминов, таких как спермин, или пептидов, таких как олигоаргинины, исключается потенциальная токсичность метаболитов. Спермин на самом деле присутствует в миллимолярной концентрации в клетках, и его концевое алкилирование безвредно. Более того, базовые пептидные последовательности наличествуют во многих ядерных белках.
Активированные и защищенные олигокатионы В преимущественно получают путем защиты аминогрупп полиамина, с последующим α,ω-бисгидроксиалкилированием, ведущим к диолам, совместимым с олигонуклеотидным синтезом.
Классический химический подход DMT и фосфорамидитного наращивания цепи предпочтительно применяется вместе с использованием чувствительных к основаниям защитных групп ТFA.
Химически защищенные диолы являются новыми продуктами и входят в объем изобретения.
Изобретение, в частности, относится к промежуточным продуктам, выбранным из группы, включающей
P(OR9)(N(R10)2)-O-R1-(X-R2)n1-XR3-O-Prot, где R1, R2, R3 и индекс n1 такие, как определено выше, Х представляет собой подходящим образом защищенный NH или NC(NH2)2, R9 представляет собой -CH2CH2CN, или низший алкил, R10 представляет собой низший алкил, или -N(R10)2 представляет собой пирролидиновую, пиперидиновую или морфолиновую группу, и Prot представляет собой защитную группу, используемую в олигонуклеотидном синтезе, такую как DMT, MMT;
P(OR9)(N(R10)2)-O-R4-СН(R5Х1)-R6-O-Prot, где R4, R5, R6 представляют собой низший алкилен, Х1 представляет собой подходящим образом защищенный путресцин, спермидин или спермин, R9 и R10 такие, как описанные выше;
P(OR9)(N(R10)2)-O-R7-(аа)n2-R8-O-Prot, где R7, R8, R9, R10, n2 и Prot такие, как описанные выше, (аа)n2 представляет собой пептид, содержащий природные аминокислоты с подходящим образом защищенными катионными боковыми цепями, такие как аргинин, лизин, орнитин, гистидин, диаминопропионовая кислота, и индекс n2 = от 2 до 20.
Другие характеристики и преимущества изобретения приведены ниже. В частности, синтез декамерных олигонуклеотидных последовательностей (А10) со спермином (S), в последующем обозначаемых А10Sn, будет приведен в качестве иллюстративного примера, без ограничения изобретения. В примерах он будет описан фиг.1-14, которые представляют, соответственно:
фиг.1 - анализ ВЭЖХ катионных олигонуклеотидов N10Sn (n=1-2) на колонке с обращенной фазой,
фиг.2 - анализ ВЭЖХ очищенных олигонуклеотидов N10Sn (n=1-6) на анионообменной колонке,
фиг.3 - анализ электрофоретической подвижности N10Sn (n=1-6) при электрофорезе в полиакриламидном геле,
фиг.4 - спонтанное замещение N10 фрагментами N10·С10 при различных температурах,
фиг.5 - одноцепочечное замещение между N10 и N10Sn, как проявляющееся при электрофорезе в полиамидном геле,
фиг.6 - температуры плавления дуплексов N10Sn·С10 (где С представляет собой нуклеотид, комплементарный N),
фиг.7 - сравнительные результаты температур плавления дуплексов, образованных олигонуклеотидами N10Sn (n=0-6) с 5'GTGGCATCGC3' и 5'GTGGCGTCGC3',
фиг.8 - анализ методом масс-спектрометрии с ионизацией распылением в электрическом поле (электроспрей, ES-МС) очищенных N10Sn (n=1-6) олигонуклеотидов,
фиг.9 - ВЭЖХ обнаруживает фосфоротиоатные олигонуклеотиды N12S11F (9А) и N12S2F (9В),
фиг.10 - масс-спектры MALDI-TOF МС N12S2F (10А) и N12S11F (10В),
фиг.11 - ВЭЖХ обнаруживает N14S4F (11А) и N20S5F (11В), соответственно,
фиг.12 - масс-спектры MALDI-TOF МС N14S4F (12А) и N20S5F (12В),
фиг.13 - одноцепочечная инвазия плазмид pGL2 и pGL3 олигонуклеотидами N14SnF (13А) и N20SnF (13В).
фиг.14А и 14В - проникновение катионного олигонуклеотида F-S18N19 в клетки HeLa.
Пример 1: Синтез фосфорамидитного сперминового синтона
Фосфорамидит 1 на основе спермина был синтезирован из спермина, как показано на следующей схеме 1:
(Mes = 2,4,6-триметилфенил; TBDMS = трет-бутилдиметилсилил; TFA = CF3CO-; DMT = 4,4'-диметокситритил)
Тетракис(мезитилсульфонил)спермин 2, приготовленный из спермина, подвергали бисалкилированию с образованием полупродукта 3. После полного снятия защитных групп с полупродукта 3 в кислотных условиях сырой тетрагидробромид бис(С4-ОН)спермина 4 полностью защищали действием трифторуксусного ангидрида в пиридине, затем две концевых сложноэфирных группы в полупродукте 5 гидролизовали в нейтральных условиях с образованием диола 6. Монотритилирование полупродукта 5 выполняли в статистическом режиме с использованием одного мольного эквивалента реагента DMTCl (диметокситритилхлорид) с образованием полупродукта 7 с выходом 43%. Непрореагировавший диол 6 и бистритилированное соединение 8 извлекали и приводили к новому равновесному состоянию в мягких кислотных условиях (трифторуксусная кислота в дихлорметане) с образованием полупродукта 7. Фосфитилированием полупродукта 7 получали желаемый фосфорамидит 1.
N1,N4,N9,N12-тетракис(мезитилсульфонил)спермин (2): Указанное соединение было приготовлено согласно работе: Bergeron et al., J. Med. Chem., 2001, том 44, стр. 232-244.
N1,N12-бис[4-(трет-бутилдиметилсилилокси)бутил]-N1,N4,N9,N12-тетракис(мезитилсульфонил)спермин (3): К раствору соединения 2 (9,31 г, 10,0 ммоль) в диметилформамиде (ДМФА) (20 мл) при перемешивании в атмосфере азота при температуре 0ºС порциями добавляли гидрид натрия (60%-ный, 1,0 г, 25 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 30 мин одной порцией добавляли трет-бутил(4-иодбутокси)диметилсилан (7,86 г, 25 ммоль). Смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре и затем разбавляли водой (100 мл) и экстрагировали дихлорметаном (100 мл). Органическую фазу отделяли, и водную фазу трижды экстрагировали дихлорметаном (50 мл). Объединенные органические фазы промывали раствором NaHCO3 (1 М) и затем высушивали над MgSO4. После упаривания пастообразный остаток очищали с помощью флэш-хроматографии с использованием смеси AcOEt:циклогексан 1:4 в качестве элюента. Фракции, содержащие продукт 3, упаривали с образованием вязкого масла, которое далее промывали холодным пентаном для удаления высокоподвижной (на хроматограмме) примеси, и затем высушивали в вакууме с образованием 9,97 г (76%) продукта 3 в виде масла: ТСХ (AcOEt/циклогексан 1:4): Rf=0,28. IR (KRS-5): 2937, 1604, 1471, 1320, 1151, 1101, 838, 777, 657, 578 см-1. 1H-ЯМР (300 МГц, CDCl3): δ=-0,01 (с, 12H), 0,85 (с, 18H), 1,20-1,45 (м, 12H), 1,62 (м, 4H), 2,28 (с, 6H), 2,29 (с, 6H), 2,53 (с, 12H), 2,54 (с, 12H), 2,90-3,10 (м, 16H), 3,42 (т, J=6,1 Гц, 4H), 6,91 (с, 4H), 6,92 (с, 4H). 13C-ЯМР (75 МГц, CDCl3): δ=4,7, 18,9, 21,6, 23,4, 23,5, 24,1, 24,9, 25,7, 26,6, 30,4, 43,5, 43,6, 45,6, 45,7, 62,9, 132,59, 132,64, 133,8, 140,7, 143,0, 143,1. МС-ESI (MeOH): m/z=1325,85 [M+Na]+, 1303,83 [M+H]+. C66H110N4O10S4Si2 (Mw=1304,03) рассчитано C 60,79, H 8,50, N 4,30, S 9,84; найдено C 60,74, H 8,55, N 4,21, S 9,63.
Тетрагидробромид N1,N12-бис(4-гидроксибутил)спермина (4): К раствору соединения 3 (9,87 г, 7,57 ммоль) и фенола (29,0 г, 0,31 моль, 40 эквивалентов) в CH2Cl2 (80 мл) по каплям добавляли раствор бромоводорода в уксусной кислоте (33%-ный по весу раствор, 80 мл, 1,4 моль). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. При охлаждении в ледяной бане добавляли при перемешивании холодную воду (100 мл). Органический слой отделяли и трижды экстрагировали водой (20 мл). Объединенные водные слои пять раз промывали CH2Cl2 (30 мл) и упаривали досуха. Полученный сырой твердый остаток суспендировали в эфире, растирали шпателем, и надосадочный слой эфира сливали. Указанные операции повторяли (пять раз), пока не получали суспензию твердого вещества. После упаривания и высушивания в вакууме получали соединение 4 в виде твердого вещества (5,32 г). Полученный сырой материал использовали без дальнейшей очистки: 1Н-ЯМР (300 МГц, D2O): δ=1,75-2,10 (м, 12Н), 2,27 (м, 4Н), 3,15-3,35 (м, 16Н), 3,76 (т, J=12,2 Гц, 4Н). 13С-ЯМР (75 МГц, D2O): δ=22,9, 23,2, 23,4, 29,0, 45,0, 45,2, 47,7, 48,3, 61,5. МС-ESI (МеОН): m/z=347,39 [M+H]+.
N1,N12-бис(4-(трифторацетокси)бутил)-N1,N4,N9,N12-тетракис(трифторацетил)спермин (5) (из соединения 4 с ТFA2O/NEt3): К суспензии соединения 4 (5,3 г, 7,6 ммоль) в CH2Cl2 (50 мл) одной порцией добавляли триэтиламин (11,5 г, 114 ммоль, 15 эквивалентов). Смесь охлаждали в ледяной бане и при перемешивании в атмосфере азота добавляли по каплям трифторуксусный ангидрид (19,1 г, 90,9 ммоль, 12 эквивалентов). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3,5 ч. После охлаждения в ледяной бане полученный раствор трижды промывали холодной водой (20 мл), высушивали над MgSO4 и затем упарили с образованием маслообразного остатка (11,7 г), который в качестве побочного продукта указанной реакции содержит (TFA)2C=CH-NEt2 (ссылка: Schreber, S. L., Tetrahedron Lett., 1980, том 21, стр. 1027). Полученный продукт удаляли двумя последовательными операциями флэш-хроматографии (элюент в градиенте от 1:1 до 60:40 AcOEt:циклогексан, и затем 5-10% Et2O/CH2Cl2) с образованием продукта 5 (5,59 г, 81%) в виде масла: ТСХ (AcOEt/циклогексан 1:1): Rf=0,25. IR (KRS-5): 2955, 1789, 1690, 1467, 1352, 1197, 1147, 759, 731, 692 см-1. 1H-ЯМР (300 МГц, CDCl3): δ=1,52-2,06 (м, 16H), 3,33-3,49 (м, 16H), 3,38 (м, 4H). 13C-ЯМР (75 МГц, CDCl3): Полученный спектр усложнен наличием вращательной изомерии четырех амидных групп. Описаны только резонансные сигналы высокой интенсивности, как следует ниже: δ=23,3, 23,9, 24,1, 24,8, 25,3, 25,6, 26,0, 26,55, 26,61, 44,4, 44,8, 45,7, 46,1, 46,4, 47,3, 48,0, 56,6, 67,3, 67,5, 116,6 (кв, J=288 Гц), 156,9, 157,4, 157,8, 158,6.
N1,N12-бис(4-гидроксибутил)-N1,N4,N9,N12-тетракис(трифторацетил)спермин (6): К раствору соединения 5 (5,39 г, 5,84 ммоль) в МеОН (50 мл) одной порцией добавляли NaHCO3 (0,1 г, твердый), и полученную суспензию перемешивали в течение 2 часов при комнатной температуре. После упаривания маслообразный остаток растворяли в CH2Cl2 (с образованием суспензии некоторого количества волокнистого NaHCO3) и очищали с помощью флэш-хроматографии, вымывая смесью 5-10% MeOH/CH2Cl2 с образованием 3,61 г (85%) продукта 6 в виде масла: ТСХ (5% MeOH/CH2Cl2): Rf=0,14. (10% MeOH/CH2Cl2): Rf=0,45. 1Н-ЯМР (300 МГц, CDCl3): δ=1,51-2,02 (м, 18Н), 3,33-3,51 (м, 16Н), 3,68 (м, 4Н). МС-ESI (МеОН): m/z=753,33 [M+Na]+. С26Н38F12N4O6·H2O (Mw=748,60) рассчитано С 41,72, Н 5,39, N 7,48, F 30,45; найдено C 41,97, H 5,26, N 7,37, F 30,14.
Получение продукта 6 из соединения 4 (TFA2O/пиридин, затем NaHCO3): К суспензии соединения 4 (15,3 г, 22,8 ммоль) в CH2Cl2 (100 мл) и пиридине (44 мл, 0,54 моль) при охлаждении в ледяной бане и перемешивании в атмосфере азота добавляли по каплям трифторуксусный ангидрид (46 мл, 0,33 моль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. Избыток трифторуксусного ангидрида разлагали добавлением холодной воды (100 мл) при охлаждении в ледяной бане, затем полученный раствор экстрагировали дихлорметаном CH2Cl2 (четыре раза, 100 мл + 50 мл + 25 мл ×2). Объединенные экстракты промывали холодной водой (50 мл ×3), высушивали над MgSO4 и затем упаривали с образованием сырого продукта 5 (19,4 г, 92%) в виде масла. Полученное масло растворяли в МеОН (100 мл). Добавляли NaHCO3 (твердый, 0,1 г), и суспензию перемешивали в течение ночи. После упаривания растворителя остаток очищали флэш-хроматографией с использованием смеси 5-7% МеОН:CH2Cl2 в качестве элюента с образованием 10,1 г (61%) продукта 6 в виде масла.
N1-[4-(диметокситритилокси)бутил]-N12-(4-гидроксибутил)-N1,N4,N9,N12-тетракис(трифторацетил)спермин (7): К раствору соединения 6 (1,46 г, 2,00 ммоль) в пиридине (3 мл) добавляли DMTCl (757 мг, 2,23 ммоль), используя 1 мл пиридина для полноты смывания. Реакционную смесь перемешивали в течение 4 часов при комнатной температуре в атмосфере азота, и затем пиридин удаляли повторным переупариванием с толуолом. Остаток очищали двумя последовательными операциями флэш-хроматографии (элюент 2-5% МеОН/CH2Cl2 и затем 10-15% ацетон/CH2Cl2) с образованием продукта 7 (879 мг, 43%) в виде пены, и бис-DMT-защищенного производного 8 (648 мг, 24%). Также возвращали исходный диол 6 (350 мг, 24%). Данные для 7: ТСХ (ацетон/СН2Cl2 1:9): Rf=0,20. 1Н-ЯМР (300 МГц, CDCl3): δ=1,51-2,03 (м, 17Н), 3,11 (м, 2Н), 3,32-3,51 (м, 16Н), 3,71 (м, 2Н), 3,81 (с, 6Н), 6,84 (м, 4Н), 7,19-7,46 (м, 9Н). МС-ESI (МеОН): m/z=1055,52 [M+Na]+. C47H56F12N4O8 (Mw=1032,95) рассчитано С 54,65, Н 5,46, N 5,42, F 22,07; найдено C 54,46, H 5,58, N 5,37, F 21,63.
Соединение (7) из диола (6) и бис-DMT-защищенного производного (8): К раствору соединения 6 (1,4 г, 1,9 ммоль) и соединения 8 (2,5 г, 1,9 ммоль) в CH2Cl2 добавляли трифторуксусную кислоту (50 мкл, 0,6 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Раствор трижды промывали 1 М раствором Na2CO3, высушивали над MgSO4 и упаривали. Остаток отделяли флэш-хроматографией (диаметр колонки: 50 мм, высота SiO2: 15 см) с использованием последовательно элюентов 5% AcOEt/CH2Cl2 (750 мл), 33% AcOEt/CH2Cl2 (500 мл), 7% МеОН/CH2Cl2 (500 мл) и 10% МеОН/CH2Cl2 (500 мл) с образованием продукта 8 (1,1 г), продукта 7 (1,2 г) и продукта 6 (1,3 г).
Фосфорамидит на основе спермина (1): К раствору соединения 7 (844 мг, 817 мкмоль) и триэтиламина (230 мкл, 1,65 ммоль, 2 эквивалента) в CH2Cl2 (4 мл) добавляли 2-цианоэтил-(N,N-диизопропиламино)хлорфосфит (205 мкл, 0,92 ммоль, 1,1 эквивалента), и смесь перемешивали в атмосфере азота при комнатной температуре в течение 40 минут. Реакционную смесь пропускали через колонку с SiO2 (диаметр: 20 мм, высота: 15 см), насыщенным NEt3 (1% NEt3 в CH2Cl2:циклогексан 1:2, 400 мл) с использованием смеси 1% NEt3 в CH2Cl2:циклогексан 1:2 (125 мл) и затем 1% NEt3 в CH2Cl2:циклогексан 1:1 (100 мл) с образованием продукта 1 (735 мг, 73%) в виде масла: 1Н-ЯМР (200 МГц, CDCl3): δ=1,13-1,35 (м, 12Н), 1,51-2,06 (м, 16Н), 2,66 (т, J=6,4 Гц, 2Н), 3,11 (м, 2Н), 3,32-3,98 (м, 20Н), 3,81 (с, 6Н), 6,84 (м, 4Н), 7,15-7,51 (м, 9Н). 31Р-ЯМР (81 МГц, CDCl3): 148,06, 148,13, 148,19, 148,3 (расщепление вследствие вращательной изомерии амидных групп).
Пример 2: Синтез, очистка и охарактеризовывание декамерных олигонуклеотидов, имеющих формулу
Названные олигонуклеотиды будут далее обозначаться N10Sn (N10 = олигонуклеотидный фрагмент; S = сперминовый остаток, и индекс n=1-6).
Автоматизированный синтез: Серию декамерных олигонуклеотидов с идентичными последовательностями N10 = 3'CACCGTAGCG5', соединенными с нарастающим числом сперминовых остатков S, синтезировали с использованием стандартного химического подхода твердофазным цианоэтилфосфорамидитным методом в синтезаторе Expedite DNA, согласно следующей схеме:
с нуклеозидом в качестве последнего N-фрагмента согласно классическому олигонуклеотидному синтезу.
Реагенты, использованные для автоматизированного синтеза ДНК, были приобретены в фирме Glen Research (Eurogentec).
В ходе автоматизированного синтеза использовали стандартный 1-микромольный цикл сочетания, за исключением сочетания сперминового фосфорамидита 1, которое было проведено с пролонгированным временем сочетания (15 минут) и с использованием слегка более концентрированного раствора фосфорамидита (90 мг амидита в 1 мл ацетонитрила).
Тритильные фракции собирали, разбавляли и анализировали в спектрофотометре для определения выходов постадийного сочетания.
Выходы сочетания четырех природных нуклеотидов превышали 97%, тогда как выходы сочетания сперминового фосфорамидита составляли между 90 и 96% в вышеназванных условиях сочетания.
Во всех случаях применяли вариант DMT-ON (ON = олигонуклеотид) (олигонуклеотид с диметокситритильной защитой), сохраняя 5'-концевую DMT-группу неотщепленной на олигомерах для целей очистки и идентификации.
Обработка после синтеза: После автоматизированного синтеза проводили отщепление от твердого носителя и полное снятие защитных групп с олигомеров с использованием стандартных условий (обработка концентрированным водным аммиаком в течение 90 минут при комнатной температуре для отщепления и затем в течение ночи при температуре 55ºС для снятия защитных групп).
Очистка: Первые два анионных олигонуклеотида N10S1 и N10S2 были первоначально очищены в DMT-защищенном состоянии по стандартной ВЭЖХ-методике на колонке с обращенно-фазным носителем Nucleosil C-18 (фирма Macherey-Nagel, размер 10×250 мм) с линейным градиентом ацетонитрила (5-35% в течение 20 минут) в 20 мМ растворе ацетата аммония (рН 7). С очищенных олигонуклеотидов затем удаляли тритильную защиту обработкой смесью АсОН/Н2О=4/1 (500 мл) при комнатной температуре в течение 20 минут. После разбавления водой (5 мл) образовавшийся DMT-OH удаляли путем экстрагирования эфиром (3×2 мл), и водную фазу концентрировали для получения олигомеров.
Данные ВЭЖХ олигонуклеотидов N10S1 и N10S2 приведены на фиг.1; колонка с обращенно-фазным носителем Nucleosil C-18 (фирма Macherey-Nagel, 4,6×250 мм) с линейным градиентом ацетонитрила (5-35% в течение 20 минут) в 20 мМ растворе ацетата аммония (рН 7): а) N10S1, сырой, DMT-защищенный олигонуклеотид (DMT-ОN); b) N10S1, очищенный; с) N10S2, сырой, DMT-защищенный олигонуклеотид (DMT-ОN); d) N10S2, очищенный. *Бензамид; **Укороченные последовательности.
Нейтральный олигомер N10S3 и катионные олигомеры N10S4, N10S5 и N10S6 (с защитной DMT-группой или без таковой) были очищены с использованием колонок Poly-Pak IITM (Glen Research/Eurogentec) согласно инструкции, приведенной изготовителем, за исключением конечного элюирования олигонуклеотида, которое проводили смесью ацетонитрил/концентрированный водный аммиак/вода (20:4:80). Фракции, содержащие олигонуклеотиды, могли быть выявлены с помощью ТСХ. После сбора фракций растворители были удалены путем лиофилизации. Полученные таким образом олигомеры в общем были загрязнены бензамидом. Его удаляли путем экстрагирования эфиром (три раза) после растворения в разбавленном растворе водного аммиака (50 мМ). Очищенные олигонуклеотиды были растворены в разбавленном растворе водного аммиака (50 мМ), и их концентрацию определяли с использованием следующего коэффициента экстинкции (260 нм, моль-1дм3см-1):
ε=(15,4NА+11,5NG+7,4NC+8,7NT)×0,9×103.
Данные ВЭЖХ очищенных олигонуклеотидов приведены на фиг.2: анионообменная колонка (Dionex PA-100, 9×250 мм) с линейным градиентом раствора NaCl (с концентрациями от 100 мМ до 350 мМ в течение 10 минут)/NaOH, 25 мМ (рН 12,4): а) N10S1, b) N10S2, с) N10S3, d) N10S4, е) N10S5, f) N10S6.
Благодаря применению конъюгационного химического подхода каждый полиамин поступает с фосфатной группой, тем самым внося в систему дополнительные катионные заряды. Семь олигонуклеотидов, (N10Sn)3n-9 n=0...6, с общими зарядами -9, -6, -3, 0, +3, +6, +9, будучи полностью ионизированными, тем самым являются доступными в количествах, варьирующих от 80 до 250 наномоль.
Электрофоретическая подвижность
Их миграцию в электрическом поле при величине рН 7 изучали методом электрофореза в полиакриламидном геле с проявлением по пятну серебряного зеркала. Соединения (0,5 нмоль) в 10 мкл буферного носителя (10 мМ буфер HEPES с рН 7,4, 150 мМ NaCl, глицерин) были помещены в неденатурирующий полиакриламидный гель (15% в ТАЕ-буфере, рН 7). Электрофорез проводили при 5 В/см в течение 17 часов при температуре 4ºС. Серебряное прокрашивание выполняли согласно работе Rabilloud et al., Electrophoresis, 1987, том 9, стр. 288-291. Результаты приведены на фиг.3. Олигонуклеотид N10 (дорожка 1) без спермина быстро двигался к аноду и проявлял только слабое серебряное прокрашивание в условиях, где выявлялись олигонуклеотиды, содержащие полиамины.
Спонтанное замещение N
10
фрагментами N
10
·С
10
Олигонуклеотид С10 (где С представляет собой нуклеотид, комплементарный N) (50 пмоль или 500 пмоль) добавляли к раствору флуоресцентного дуплекса N10·C10* (50 пмоль в 10 мМ буфере HEPES, рН 7,4, 150 мМ NaCl). Смеси инкубировали в течение 4 часов при температуре 37ºС, 20ºС или 10ºС и помещали в неденатурирующий полиакриламидный гель (15% в ТАЕ-буфере, рН 7). Электрофорез проводили при температуре 4ºС в течение 17 часов при 5 В/см. С10*-флуоресценцию детектировали сканированием геля с использованием прибора Typhoon 8600 Imager. Как показано результатами, приведенными на фиг.4, спонтанное замещение N10 фрагментами N10·С10 не является значительным при температуре 10ºС.
Одноцепочечное замещение между N
10
и N
10
S
n
Способность к одноцепочечному замещению N10Sn в отношении природного дуплекса N10·C10 тестировали в условиях физиологического раствора.
Сперминовые конъюгаты N10Sn (50 или 500 пмоль) добавляли к раствору флуоресцентного дуплекса N10·C10* (50 пмоль в 10 мМ буфере HEPES, рН 7,4, 150 мМ NaCl). Смеси инкубировали в течение 4 часов при температуре 10ºС, и помещали в неденатурирующий полиакриламидный гель (15% в ТАЕ-буфере, рН 7). Электрофорез проводили при температуре 4ºС в течение 17 часов при 5 В/см. Флуоресценцию детектировали сканированием геля с использованием прибора Typhoon 8600 Imager.
Конъюгация спермина оказывала сильное влияние на реакцию одноцепочечного замещения, как показано на фиг.5. Полоса, соответствующая N10·C10*, становилась слабее по мере увеличения числа сперминовых остатков в конкурирующем N10Sn, в пользу менее подвижного менее анионного комплекса N10Sn·C10*. Указанный эффект был в особенности выраженным для N10S3, то есть для конъюгатов, которые уже не несли формального отрицательного заряда. Действительно, спермин скрепляет дуплексные структуры ДНК путем формирования межцепочечной сети из NH2 +-бидентатных водородных связей в малой бороздке спирали ДНК, тем самым способствуя связыванию N10Sn по сравнению с N10. К тому же еще и дополнительно благоприятствующий кинетический фактор может действовать, когда одноцепочечное замещение происходит в предварительно сформированном электростатическом комплексе (N10Sn)3n-9/(N10·C10)18-, который может иметь место для n>3.
Температуры плавления дуплексов N
10
S
n
·C
10
Стабильности двухцепочечных нуклеиновых кислот сравнивали измерением их температуры плавления, то есть температуры, при которой комплементарные цепочки кооперативно расходятся. Для этого фиксировали при длине волны 260 нм оптическую плотность (ОD) растворов N10Sn·C10 относительно температуры Т.
Температуры плавления Tпл измеряли в 10 мМ буфере HEPES, рН 7,4 (черная линия, ромбики) и в 10 мМ буфере HEPES, рН 7,4 + 150 мМ NaCl (серая линия, кружки). Профили плавления всех дуплексов (3,75 нмоль в 1 мл буфера) наблюдали с использованием спектрофотометра CARY 4000, оснащенного блоком температурного контроля, при постепенном нагревании образцов (1ºС/мин), в то же время записывая их поглощение при длине волны 260 нм. Плавление дуплексов проявлялось в гиперхромном сдвиге, и Tпл представляет собой температуру, при которой кривая первой производной dOD/dT=f(T) достигает своего максимума. Результаты приведены на фиг.5.
Природный дуплекс плавится при Tпл=30ºС в 10 мМ буфере HEPES с рН 7,4 (фиг.5). Конъюгация с нарастающим количеством сперминовых остатков ведет к заметному повышению значения Tпл. N10S6·C10 плавится при Tпл=75,2ºС, почти на 45ºС выше, чем природный дуплекс. Кривая Tпл=f(n) обнаруживает сигмоидальную форму с перегибом для нейтрального олигонуклеотида N10S3.
Температуры плавления были также записаны в условиях физиологического раствора. Кривая Tпл=f(n) проявляется более спрямленной и, что примечательно, пересекает предыдущую кривую в точке для N10S3. Таким образом, для n<3 как олигонуклеотиды N10Sn, так и олигонуклеотиды С10 являются анионными и отталкиваются друг от друга в дуплексе; повышение концентрации соли в растворе экранирует силы отталкивания, тем самым повышая значение Tпл. Для n>3 N10Sn становится катионным и притягивает С10; здесь обусловленное солью электростатическое экранирование снижает стабильность.
Для нейтрального N10S3 стабильность дуплекса не зависит от концентрации соли.
Сравнение температур плавления дуплексов, сформированных N
10
S
n
(n=0-6) с
5'
GTGGCATCGC
3'
и с
5'
GTGGCGTCGC
3'
Было испытано различение ошибочного спаривания («мисматча») одиночной пары оснований олигонуклеотид-сперминовых конъюгатов. Внутри контекста последовательности С10 = 5'GTGGCATCGC3' литературные данные рекомендуют центрально локализованную конверсию «A-в-G» как наиболее строгий критерий.
Температуры плавления Tпл измеряли в 10 мМ буфере HEPES с рН 7,4 + 150 мМ NaCl. Профили плавления всех дуплексов (3,75 нмоль в 1 мл буфера) наблюдали с использованием спектрофотометра CARY 4000, оснащенного блоком температурного контроля, при постепенном нагревании образцов (1ºС/мин), в то же время записывая их поглощение при длине волны 260 нм. Tпл представляет собой температуру, при которой кривая первой производной dOD/dT=f(T) достигает своего максимума. Результаты приведены на фиг.7 (ромбики соответствуют 5'GTGGCATCGC3', и треугольники соответствуют 5'GTGGCGTCGC3').
Температура перехода природного дуплекса N10·C10 в 150 мМ NaCl падала от 50,6ºС до 42,9ºС, то есть DTпл=7,7ºС, когда присутствовал мисматч. В принципе возрастание стабильности благодаря неспецифическим электростатическим силам при концевой конъюгации не должно ухудшать специфичность пары оснований, которая выражается как ΔΔG. Это и наблюдается в действительности, так как комплементарный и мисматчевый целевые олигонуклеотиды проявляли квазипараллельные кривые Tпл=f(n) со средним значением ΔTпл=7,9ºС.
Анализ ES-МС очищенных олигонуклеотидов N
10
S
n
Олигонуклеотиды растворяли в 50%-ном (по объему) водном ацетонитриле, содержащем 1% триэтиламина при конечной концентрации 5×10-5 М. Аликвоты объемом 100 мл вводили в ионный источник масс-спектрометра Mariner 5155 фирмы Applied Biosystems при скорости течения 5 мл/мин. Результаты приведены на фиг.8 (на вставках: спектры деконволюции): а) N10S1, b) N10S2, с) N10S3, d) N10S4, е) N10S5, f) N10S6. Ионизация нейтральных и катионных олигомеров N10S3-6 становилась более трудной, и было необходимым накопление нескольких спектров для получения приемлемого отношения «сигнал-шум».
Пример 3: Синтез, очистка и охарактеризование 12-мерных тиофосфатных олигонуклеотидов, имеющих формулу
Названные олигонуклеотиды будут далее обозначаться N12SnF (N = 12-мерный тиофосфат-олигонуклеотидный фрагмент; S = сперминовый остаток, и индекс n = от 2 до 11; F = флуоресцеин, конъюгированный с тимином).
Автоматизированный синтез: 12-мерные тиофосфат-олигонуклеотиды с последовательностью N12 = 3'GCGACTCATGAA5', соединенной с числом сперминовых остатков S от двух до 11, синтезировали с использованием твердофазного цианоэтилфосфорамидитного химического подхода в синтезаторе Expedite DNA. Фосфорамидиты UltraMILD CE и носители UltraMILD (Glen Research/Eurogentec) использовали, чтобы избежать расщепления олигомера во время обработки после синтеза. Стандартный сульфурирующий реагент (Glen Research/Eurogentec) использовали для создания фосфоротиоатных связок в 12-мерной олигонуклеотидной структуре. Флуоресцеин-dT-фосфорамидит (Glen Research/Eurogentec) применяли для маркировки 5'-конца. Сочетание сперминовых фосфорамидитов выполняли с использованием методики сочетания, описанной в примере 2.
Тритильные фракции собирали, разбавляли и анализировали в спектрофотометре для определения выходов постадийного сочетания.
Во всех случаях применяли вариант DMT-ON, сохраняя 5'-концевую DMT-группу неотщепленной на олигомерах для целей очистки и идентификации.
Обработка после синтеза: После автоматизированного синтеза отщепление от твердого носителя и полное снятие защитных групп с олигомеров проводили обработкой концентрированным водным аммиаком в течение ночи при комнатной температуре.
Очистка: DMT-ON-соединения N12S2F и N12S11F очищали с использованием колонок Poly-Pak IITM (Glen Research/Eurogentec) согласно инструкции, приведенной изготовителем.
Очищенные олигонуклеотиды N12SnF (n=2, 11) анализировали на анионообменной колонке (SAX1000-8) в водных щелочных условиях (100 мМ аммиак, рН 11) с использованием градиента раствора NaCl (0,75-2,5 М в течение 20 минут). Пики ВЭЖХ показаны на фиг.9 (А: N12S11F, В: N12S2F).
Анализ MALDI-TOF МС очищенных олигонуклеотидов
Олигонуклеотиды растворяли в 500 мкл деминерализованной воды. Образец и НРА-матрицу (гидроксипиколиновая кислота) смешивали вместе на пластинке. После кристаллизации образец анализировали на приборе BRUKER Ultraflex МС. Результаты приведены на фиг.10А: N12S2F, рассчитано 5460, найдено 5459 (верхний), и на фиг.10В: N12S11F, рассчитано 9135, найдено 9125 (нижний).
Пример 4: Одноцепочечная инвазия плазмидной ДНК с 14-мерными и 20-мерными флуоресцентными олигонуклеотидами
Соединения, показанные выше, далее будут обозначаться как N14SnF (N = олигонуклеотидный фрагмент; S = сперминовый остаток с n=2-4; F = флуоресцеиновый остаток), и как N20SnF (N = олигонуклеотидный фрагмент; S = сперминовый остаток с n=3-5; F = флуоресцеиновый остаток).
Указанные флуоресцентные олигонуклеотиды были синтезированы согласно методике, описанной в примере 2. 5'-флуоресцеин-фосфорамидит (Glen Research/Eurogentec) использовали для маркировки 5'-конца. Аналитические пики ВЭЖХ и MALDI-TOF МС для наиболее замещенных соединений N14S4F и N20S5F показаны на фиг.11 и 12 как доказательства чистоты и структуры (N14S4F, рассчитано 6470, найдено 6478; N20S5F, рассчитано 8813, найдено 8815), соответственно.
Олигонуклеотидные последовательности N14SnF и N20SnF были выбраны в пределах последовательности гена люциферазы контрольной плазмиды pGL3 (Promega). Для оценки специфичности последовательности в одноцепочечной инвазии применяли контрольную плазмиду pGL2 (Promega). Последовательность GL2-люциферазы является на 95% идентичной таковой для GL3, и последовательности, целевые для N14SnF и N20SnF, содержат соответственно один или два мисматча.
Способность N14SnF и N20SnF к одноцепочечной инвазии в плазмиду pGL3, но не в pGL2, испытывали в условиях физиологического раствора и температуры.
Флуоресцентные конъюгаты N14SnF и N20SnF (8,65 пмоль) добавляли к раствору плазмиды (1,5 мкг, 0,43 пмоль в 10 мМ буфере HEPES с рН 7,4, 150 мМ NaCl). Смеси инкубировали в течение 24 часов при температуре 37ºС и помещали в агарозный гель (1,3% в ТАЕ-буфере с рН 7,4). Электрофорез проводили при комнатной температуре в течение 45 минут после выявления зеленого свечения флуоресцеина путем сканирования геля с использованием прибора Typhoon 8600 Imager. Картина красной флуоресценции геля была снята на УФ-трансиллюминаторе с последующей инкубацией в течение 15 минут в растворе этидиумбромида. Результаты приведены на фиг.13.
Красная и зеленая флуоресценции являются доказательством двухцепочечного связывания плазмидной ДНК и флуоресцентного олигонуклеотида соответственно. Их солокализация с pGL3, но не с pGL2, является тем самым доказательством одноцепочечной инвазии. Соединения N14S3F и N20SnF показали нечеткую полосу зеленой флуоресценции, связанную с плазмидой, когда инкубировались с pGL3, но не с pGL2.
Пример 5: Проникновение катионных олигонуклеотидов в клетки
Клетки HeLa, выращенные в 10%-ной (по объему) минимальной питательной среде (МЕМ), содержащей фетальную телячью сыворотку, были помещены в 4-луночные разделенные на камеры чашки из боросиликатного стекла Lab-Tek при 50-60×103 клеток/лунку за один день до эксперимента. Полную среду для культивирования замещали 0,5 мл МЕМ-средой без сыворотки. 5'-катионный конъюгированный с флуоресцеином олигонуклеотидный F-S18N19 (где N19 представляет собой TCGAAGTACTCAGCGTAAG) состав приготовили в стерильном фосфатно-солевом буфере (PBS). Его добавляли к клеткам до конечной концентрации 2 мкМ. Через четыре часа среду замещали 1 мл свежей среды, содержащей сыворотку. Первую картинку снимали на флуоресцентном микроскопе Zeiss axiovert 25, оснащенном голубым интерференционным фильтром (FITС) (фиг.14А, слева). Все клетки стали флуоресцировать с некоторыми флуоресценциями, расположенными во внутриклеточных вакуолях и, наиболее важно, также распространенными по цитоплазме и ядру. Через 24 часа среду замещали 1 мл МЕМ-среды, не содержащей фенолового красного. Добавляли пропидиум иодид (1 мМ в воде) до конечной концентрации 10 мкМ. Через десять минут снимали вторую картинку, показывающую большинство здоровых клеток, не включающих пропидиум, которые по-прежнему флуоресцировали (фиг.14В, справа). Контрольные клетки, которые были инкубированы в сходных условиях с олигонуклеотидом F-N19, не показали флуоресценции.
Таким образом, изобретение представляет универсальный автоматизированный синтез катионных олигонуклеотидов, которые формируют прочные и стабильные комплексы с комплементарной им последовательностью даже в контексте одноцепочечной инвазии. Благодаря концевой конъюгации селективность последовательности остается высокой, как для природных олигонуклеотидов. Более того, благодаря их катионному характеру, доставка внутрь клетки не требует формирования комплекса с молекулами катионных носителей. В совокупности указанные характеристики делают олигонуклеотид-олигокатионные конъюгаты привлекательной альтернативой олигонуклеотидам для молекулярной биологии, диагностики, а также для терапевтического применения.
Claims (18)
1. Олигонуклеотид-олигокатионные молекулы AiBjH, которые могут быть синтезированы посредством автоматизированной фосфорамидитной химии, имеющие олигонуклеотидные фрагменты Ai и олигокатионные фрагменты Bj, где
Ai представляет собой i-мерный олигонуклеотидный остаток с индексом i = от 5 до 50, с природными и неприродными нуклеиновыми основаниями и/или пентафуранозильными группами и/или нативными сложными фосфодиэфирными связями, а также их химические модификации или замещения,
Bj представляет собой j-мерный органический олигокатионный фрагмент с индексом j = от 1 до 50, где В выбран из группы, включающей
-HPO3-R1-(X-R2)n1-X-R3-O-, где R1, R2 и R3, идентичные или различные, представляют собой C1-C5 алкилен, Х представляет собой NH или NC(NH2)2, и индекс n1 = от 2 до 20,
-НРО3-R4-CH(R5X1)-R6-O-, где R4 представляет собой C1-C5 алкилен, R5 и R6, идентичные или различные, представляют собой C1-C5 алкилен, и X1 представляет собой путресциновый, спермидиновый или сперминовый остаток.
Ai представляет собой i-мерный олигонуклеотидный остаток с индексом i = от 5 до 50, с природными и неприродными нуклеиновыми основаниями и/или пентафуранозильными группами и/или нативными сложными фосфодиэфирными связями, а также их химические модификации или замещения,
Bj представляет собой j-мерный органический олигокатионный фрагмент с индексом j = от 1 до 50, где В выбран из группы, включающей
-HPO3-R1-(X-R2)n1-X-R3-O-, где R1, R2 и R3, идентичные или различные, представляют собой C1-C5 алкилен, Х представляет собой NH или NC(NH2)2, и индекс n1 = от 2 до 20,
-НРО3-R4-CH(R5X1)-R6-O-, где R4 представляет собой C1-C5 алкилен, R5 и R6, идентичные или различные, представляют собой C1-C5 алкилен, и X1 представляет собой путресциновый, спермидиновый или сперминовый остаток.
2. Молекулы по п.1, в которых олигонуклеотид выбран из группы, включающей дезоксирибо-, рибо-, замкнутые (LNA) нуклеотиды, а также их химические модификации или замещения.
3. Молекулы по п.2, в которых модификации или замещения представляют собой фосфоротиоат, 2'-фтор-, 2'-O-алкил.
4. Молекулы по любому из пп.1-3, включающие маркерную группу, которая представляет собой флуоресцентный агент.
5. Молекулы по любому из пп.1-3, в которых аминокислоты представляют собой аргинин, лизин, орнитин, гистидин, диаминопропионовую кислоту.
6. Молекулы по любому из пп.1-3, имеющие 3'А5'-В-последовательность.
7. Молекулы по любому из пп.1-3, имеющие В-3'А5'-последовательность.
8. Молекулы по любому из пп.1-3, имеющие В-3'А5'-В или 3'А5'-B-3'A5'-последовательности, а также их комбинации.
9. Способ получения олигонуклеотид-олигокатионных молекул по любому из пп.1-8 путем использования постадийного синтеза на олигонуклеотидном синтезаторе по фосфорамидитному пути, включающий
размещение пробирок, содержащих активированные и защищенные олигокатионы В, в олигонуклеотидном синтезаторе с добавлением к пробиркам олигонуклеотидов А или наоборот,
- остановку синтеза, когда достигается желаемая длина,
- отщепление олигомеров от твердого носителя и
- удаление защитных групп.
размещение пробирок, содержащих активированные и защищенные олигокатионы В, в олигонуклеотидном синтезаторе с добавлением к пробиркам олигонуклеотидов А или наоборот,
- остановку синтеза, когда достигается желаемая длина,
- отщепление олигомеров от твердого носителя и
- удаление защитных групп.
10. Способ по п.9, в котором фосфорамидитные реагенты выбраны из группы, включающей
P(OR9)(N(R10)2)-O-R1-(X-R2)n1-X-R3-O-Prot, где R1, R2, R3 и индекс n1 такие, как определено выше, Х представляет собой подходящим образом защищенный NH или NC(NH2)2, R9 представляет собой -CH2CH2CN или C1-C5 алкил, R10 представляет собой C1-С5 алкил, или -N(R10)2 представляет собой пирролидиновую, пиперидиновую или морфолиновую группу, и Prot представляет собой защитную группу, используемую в олигонуклеотидном синтезе, такую как DMT, ММТ;
P(OR9)(N(R10)2)-O-R4-CH(R5X1)-R6-O-Prot, где R4, R5, R6 представляют собой C1-C5 алкилен, X1 представляет собой подходящим образом защищенный путресцин, спермидин или спермин, R9 и R10 такие, как описанные выше.
P(OR9)(N(R10)2)-O-R1-(X-R2)n1-X-R3-O-Prot, где R1, R2, R3 и индекс n1 такие, как определено выше, Х представляет собой подходящим образом защищенный NH или NC(NH2)2, R9 представляет собой -CH2CH2CN или C1-C5 алкил, R10 представляет собой C1-С5 алкил, или -N(R10)2 представляет собой пирролидиновую, пиперидиновую или морфолиновую группу, и Prot представляет собой защитную группу, используемую в олигонуклеотидном синтезе, такую как DMT, ММТ;
P(OR9)(N(R10)2)-O-R4-CH(R5X1)-R6-O-Prot, где R4, R5, R6 представляют собой C1-C5 алкилен, X1 представляет собой подходящим образом защищенный путресцин, спермидин или спермин, R9 и R10 такие, как описанные выше.
11. Способ по п.9 или 10, в котором постадийный синтез олигонуклеотидной последовательности продолжается постадийным синтезом олигокатионного фрагмента для получения соединений, имеющих последовательность (3'A5'-B).
12. Способ по п.9 или 10, в котором постадийный синтез олигокатионного фрагмента продолжается постадийным синтезом олигонуклеотидной последовательности для получения соединений, имеющих последовательность (В-3'А5').
13. Способ по п.9 или 10, включающий синтез смешанных последовательностей.
14. Способ по п.13, включающий синтез олигонуклеотидных последовательностей, кэппированных на обоих концах (В-3'А5'-В), или катионпрерываемых последовательностей олигонуклеотидных последовательностей [3'А5'-В-3'А5').
15. Способ по п.9 или 10, в котором активированные и защищенные олигокатионы В получают защитой аминогрупп полиамина с последующим α,ω-бисгидроксиалкилированием, ведущим к диолам, совместимым с олигонуклеотидным синтезом.
16. В качестве промежуточных соединений, фосфорамидитные реагенты формулы
P(OR9)(N(R10)2)-O-R1-(X-R2)n1-X-R3-O-Prot, где R1, R2, R3 и индекс n1 такие, как определено выше, Х представляет собой подходящим образом защищенный NH или NC(NH2)2, R9 представляет собой -CH2CH2CN или низший алкил, R10 представляет собой низший алкил, или -N(R10)2 представляет собой пирролидиновую, пиперидиновую или морфолиновую группу, и Prot представляет собой защитную группу, используемую в олигонуклеотидном синтезе, такую как DMT, ММТ;
P(OR9)(N(R10)2)-O-R4-CH(R5X1)-R6-O-Prot, где R4, R5, R6 представляют собой C1-C5 алкилен, X1 представляет собой подходящим образом защищенный путресцин, спермидин или спермин, R9 и R10 такие, как описанные выше.
P(OR9)(N(R10)2)-O-R1-(X-R2)n1-X-R3-O-Prot, где R1, R2, R3 и индекс n1 такие, как определено выше, Х представляет собой подходящим образом защищенный NH или NC(NH2)2, R9 представляет собой -CH2CH2CN или низший алкил, R10 представляет собой низший алкил, или -N(R10)2 представляет собой пирролидиновую, пиперидиновую или морфолиновую группу, и Prot представляет собой защитную группу, используемую в олигонуклеотидном синтезе, такую как DMT, ММТ;
P(OR9)(N(R10)2)-O-R4-CH(R5X1)-R6-O-Prot, где R4, R5, R6 представляют собой C1-C5 алкилен, X1 представляет собой подходящим образом защищенный путресцин, спермидин или спермин, R9 и R10 такие, как описанные выше.
17. Применение олигонуклеотид-олигокатионных молекул по любому из пп.1-8 в способе для использования в биологии и диагностике, таком как ПЦР, ПЦР в реальном времени, генотипирование, in situ гибридизация и изготовление ДНК-чипов.
18. Фармацевтические композиции, содержащие эффективное количество олигонуклеотид-олигокатионных молекул по любому из пп.1-8, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US75034605P | 2005-12-15 | 2005-12-15 | |
| US60/750,346 | 2005-12-15 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2008128853A RU2008128853A (ru) | 2010-01-20 |
| RU2451022C2 true RU2451022C2 (ru) | 2012-05-20 |
Family
ID=38163300
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2008128853/04A RU2451022C2 (ru) | 2005-12-15 | 2006-12-14 | Катионные олигонуклеотиды, автоматизированные способы их получения и их применение |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US9090648B2 (ru) |
| EP (1) | EP1973927B1 (ru) |
| JP (1) | JP5346585B2 (ru) |
| KR (1) | KR101388320B1 (ru) |
| CN (1) | CN101370817B (ru) |
| AU (1) | AU2006325054B2 (ru) |
| BR (1) | BRPI0619932A2 (ru) |
| CA (1) | CA2633065C (ru) |
| ES (1) | ES2435420T3 (ru) |
| HK (1) | HK1127360A1 (ru) |
| IL (1) | IL192158A0 (ru) |
| NZ (1) | NZ569138A (ru) |
| RU (1) | RU2451022C2 (ru) |
| WO (1) | WO2007069092A2 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2553349C1 (ru) * | 2014-05-07 | 2015-06-10 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") | Олигодезоксирибонуклеотидный ингибитор днк-метилтрансферазы 1 человека |
Families Citing this family (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1973927B1 (en) | 2005-12-15 | 2013-08-14 | Centre National de la Recherche Scientifique - CNRS | Cationic oligonucleotides, automated methods for preparing same and their uses |
| EP2075342A1 (en) | 2007-12-27 | 2009-07-01 | PolyPlus Transfection | Method for hybridizing nucleic acids |
| FR2926818B1 (fr) * | 2008-01-30 | 2012-04-06 | Centre Nat Rech Scient | siRNA CATIONIQUES, SYNTHESE ET UTILISATION POUR L'ARN INTERFERENCE |
| US20120302737A1 (en) | 2009-09-16 | 2012-11-29 | Genentech, Inc. | Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof |
| CN102140461B (zh) * | 2010-01-29 | 2012-12-05 | 苏州瑞博生物技术有限公司 | 小干扰核酸和药物组合物及其制药应用 |
| CN102140458B (zh) * | 2010-01-29 | 2013-05-22 | 苏州瑞博生物技术有限公司 | 小干扰核酸和药物组合物及其制药应用 |
| CN102140459B (zh) * | 2010-01-29 | 2013-04-03 | 苏州瑞博生物技术有限公司 | 一种小干扰核酸和药物组合物及其制药应用 |
| EP3214174B1 (en) | 2010-03-04 | 2019-10-16 | InteRNA Technologies B.V. | A mirna molecule defined by its source and its diagnostic and therapeutic uses in diseases or conditions associated with emt |
| TW201138821A (en) | 2010-03-26 | 2011-11-16 | Roche Glycart Ag | Bispecific antibodies |
| NZ704322A (en) | 2010-07-06 | 2016-07-29 | Interna Technologies Bv | Mirna and its diagnostic and therapeutic uses in diseases or conditions associated with melanoma, or in diseases or conditions associated with activated braf pathway |
| WO2012085064A1 (en) | 2010-12-23 | 2012-06-28 | Roche Diagnostics Gmbh | Detection of a posttranslationally modified polypeptide by a bi-valent binding agent |
| WO2012085113A1 (en) | 2010-12-23 | 2012-06-28 | Roche Diagnostics Gmbh | Binding agent |
| SG191153A1 (en) | 2010-12-23 | 2013-07-31 | Hoffmann La Roche | Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery |
| EP2474617A1 (en) | 2011-01-11 | 2012-07-11 | InteRNA Technologies BV | Mir for treating neo-angiogenesis |
| US9029528B2 (en) | 2011-05-17 | 2015-05-12 | Ajinomoto Co., Inc. | Solution-based method of making oligonucleotides via phosphoramidite coupling |
| EP3369818B1 (en) | 2011-12-22 | 2021-06-09 | InteRNA Technologies B.V. | Mirna for treating head and neck cancer |
| JP6486686B2 (ja) | 2012-02-10 | 2019-03-20 | ジェネンテック， インコーポレイテッド | 単鎖抗体及び他のヘテロ多量体 |
| WO2014001325A1 (en) | 2012-06-27 | 2014-01-03 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for making antibody fc-region conjugates comprising at least one binding entity that specifically binds to a target and uses thereof |
| RU2639287C2 (ru) | 2012-06-27 | 2017-12-20 | Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг | Способ отбора и получения высокоселективных и мультиспецифичных нацеливающих групп с заданными свойствами, включающих по меньшей мере две различные связывающие группировки, и их применения |
| EP2917348A1 (en) | 2012-11-06 | 2015-09-16 | InteRNA Technologies B.V. | Combination for use in treating diseases or conditions associated with melanoma, or treating diseases or conditions associated with activated b-raf pathway |
| JP6609246B2 (ja) | 2013-06-28 | 2019-11-20 | エスリス ゲーエムベーハー | 細胞内へのｒｎａ導入用組成物 |
| US9410172B2 (en) | 2013-09-16 | 2016-08-09 | General Electric Company | Isothermal amplification using oligocation-conjugated primer sequences |
| WO2015128030A1 (en) | 2014-02-26 | 2015-09-03 | Ethris Gmbh | Compositions for gastrointestinal administration of rna |
| EP3034539A1 (en) | 2014-12-19 | 2016-06-22 | Ethris GmbH | Compositions for introducing nucleic acid into cells |
| DE102017123919A1 (de) | 2017-10-13 | 2019-04-18 | Gna Biosolutions Gmbh | Verfahren und Vorrichtung zur Lyse von Mikroorganismen |
| CA3079524A1 (en) | 2017-11-03 | 2019-05-09 | Interna Technologies B.V. | Mirna molecule, equivalent, antagomir, or source thereof for treating and/or diagnosing a condition and/or a disease associated with neuronal deficiency or for neuronal (re)generation |
| JP2021513508A (ja) | 2018-02-12 | 2021-05-27 | インテアールエヌエー テクノロジーズ ビー．ヴイ．ＩｎｔｅＲＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｂ．Ｖ． | 抗がんマイクロｒｎａ及びその脂質製剤 |
| JP2021522228A (ja) | 2018-04-25 | 2021-08-30 | エスリス ゲーエムベーハーｅｔｈｒｉｓ ＧｍｂＨ | Ｒｎａの送達用の脂質に基づく製剤 |
| KR20200045212A (ko) * | 2018-10-22 | 2020-05-04 | (주)바이오니아 | 옥타민 또는 옥타민 유도체가 결합된 프로브 및 이의 용도 |
| BR112023016903A2 (pt) | 2021-02-26 | 2023-10-10 | Ethris Gmbh | Formulação de suspensão aquosa para formação de aerossol, nebulizador, e, aerossol |
| EP4327829A1 (en) | 2022-08-26 | 2024-02-28 | Ethris GmbH | Stabilization of lipid or lipidoid nanoparticle suspensions |
| WO2024042236A1 (en) | 2022-08-26 | 2024-02-29 | Ethris Gmbh | Stable lipid or lipidoid nanoparticle suspensions |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2175337C2 (ru) * | 1994-11-18 | 2001-10-27 | Супратек Фарма, Инк. | Полинуклеотидные композиции |
| RU2236467C1 (ru) * | 2003-04-14 | 2004-09-20 | Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН | Способ получения днк-чипов |
Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6071890A (en) * | 1994-12-09 | 2000-06-06 | Genzyme Corporation | Organ-specific targeting of cationic amphiphile/DNA complexes for gene therapy |
| CA2298061A1 (en) * | 1997-08-01 | 1999-02-11 | Supratek Pharma, Inc. | Polynucleotide compositions |
| EP1013770A1 (en) * | 1998-12-23 | 2000-06-28 | Université Louis Pasteur de Strasbourg | Non-viral transfection vector |
| US6147200A (en) * | 1999-08-19 | 2000-11-14 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 2'-O-acetamido modified monomers and oligomers |
| DE10207177A1 (de) * | 2002-02-19 | 2003-09-04 | Novosom Ag | Fakultativ kationische Lipide |
| US20040019008A1 (en) * | 2002-05-28 | 2004-01-29 | Lewis David L. | Compositions and processes using siRNA, amphipathic compounds and polycations |
| JP2004137143A (ja) | 2002-08-21 | 2004-05-13 | Fuji Photo Film Co Ltd | 有機変性層状珪酸塩及びその組成物 |
| ES2343318T3 (es) * | 2002-11-26 | 2010-07-28 | University Of Massachusetts | Administracion de arnsis. |
| US7771711B2 (en) | 2003-06-18 | 2010-08-10 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Sphingolipids' polyalkylamines conjugates |
| JP5059411B2 (ja) * | 2003-12-19 | 2012-10-24 | ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド | 短鎖干渉ｒｎａの細胞トランスフェクティング処方物、関連する組成物および作製方法ならびに使用 |
| EP1736501A4 (en) * | 2004-04-16 | 2012-10-31 | Japan Science & Tech Agency | CONJUGATED FUNCTIONAL NUCLEIC ACID-PEG |
| JP2008519053A (ja) | 2004-11-04 | 2008-06-05 | アンディーノ，ラウル | 小さい干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のポリアミン共役体の合成及びそれによって形成された共役体 |
| EP1812016A4 (en) * | 2004-11-17 | 2010-07-14 | Univ Maryland | HIGHLY BRANCHED HK PEPTIDES AS EFFECTIVE CARRIERS OF SMALL INTERFERING RNA |
| EP1973927B1 (en) | 2005-12-15 | 2013-08-14 | Centre National de la Recherche Scientifique - CNRS | Cationic oligonucleotides, automated methods for preparing same and their uses |
| EP1844772A1 (en) * | 2006-04-06 | 2007-10-17 | Polyplus-Transfection SA | Compositions for transfection of oligonucleotides active for gene silencing and their biological and therapeutical applications |
| ES2549728T3 (es) * | 2006-04-20 | 2015-11-02 | Silence Therapeutics Gmbh | Formulaciones de lipoplexo para la administración específica al endotelio vascular |
| FR2926818B1 (fr) * | 2008-01-30 | 2012-04-06 | Centre Nat Rech Scient | siRNA CATIONIQUES, SYNTHESE ET UTILISATION POUR L'ARN INTERFERENCE |
-
2006
- 2006-12-14 EP EP06847298.4A patent/EP1973927B1/en active Active
- 2006-12-14 US US12/086,599 patent/US9090648B2/en active Active
- 2006-12-14 RU RU2008128853/04A patent/RU2451022C2/ru active
- 2006-12-14 AU AU2006325054A patent/AU2006325054B2/en active Active
- 2006-12-14 BR BRPI0619932-1A patent/BRPI0619932A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2006-12-14 CA CA2633065A patent/CA2633065C/en active Active
- 2006-12-14 WO PCT/IB2006/004085 patent/WO2007069092A2/en active Application Filing
- 2006-12-14 ES ES06847298T patent/ES2435420T3/es active Active
- 2006-12-14 KR KR1020087017193A patent/KR101388320B1/ko active IP Right Grant
- 2006-12-14 NZ NZ569138A patent/NZ569138A/en unknown
- 2006-12-14 CN CN2006800510864A patent/CN101370817B/zh active Active
- 2006-12-14 JP JP2008545144A patent/JP5346585B2/ja active Active
-
2008
- 2008-06-15 IL IL192158A patent/IL192158A0/en active IP Right Grant
-
2009
- 2009-07-16 HK HK09106495.8A patent/HK1127360A1/xx unknown
-
2015
- 2015-06-22 US US14/745,871 patent/US9676798B2/en active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2175337C2 (ru) * | 1994-11-18 | 2001-10-27 | Супратек Фарма, Инк. | Полинуклеотидные композиции |
| RU2236467C1 (ru) * | 2003-04-14 | 2004-09-20 | Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН | Способ получения днк-чипов |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| CHEN С-Р ЕТ AL, BIOCONJUGATE CHEMISTRY, 2003, т.14, №3, с.532-538. PITIE M ЕТ AL, JOURNAL OF BIOLOGICAL INORGANIC CHEMISTRY, 1996, т.1, №3, с.239-246. SUND С ЕТ AL, TETRAHEDRON, 1996, т.52, с.12275-12290. CHING-HSUAN TUNG ЕТ AL, NUCLEIC ACIDS RESEARCH, 1993, т.21, №23, с.5489-5494. WALDMANN Н ЕТ AL, CHEMICAL COMMUNICATIONS, 1997, №19, с.1861, 1862. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2553349C1 (ru) * | 2014-05-07 | 2015-06-10 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") | Олигодезоксирибонуклеотидный ингибитор днк-метилтрансферазы 1 человека |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BRPI0619932A2 (pt) | 2011-10-25 |
| CN101370817B (zh) | 2012-08-08 |
| US20160280728A1 (en) | 2016-09-29 |
| AU2006325054A1 (en) | 2007-06-21 |
| RU2008128853A (ru) | 2010-01-20 |
| KR20080087001A (ko) | 2008-09-29 |
| WO2007069092A2 (en) | 2007-06-21 |
| US9676798B2 (en) | 2017-06-13 |
| AU2006325054B2 (en) | 2013-05-02 |
| US9090648B2 (en) | 2015-07-28 |
| JP5346585B2 (ja) | 2013-11-20 |
| KR101388320B1 (ko) | 2014-04-22 |
| CA2633065A1 (en) | 2007-06-21 |
| CA2633065C (en) | 2016-10-18 |
| IL192158A0 (en) | 2009-02-11 |
| HK1127360A1 (en) | 2009-09-25 |
| EP1973927A2 (en) | 2008-10-01 |
| NZ569138A (en) | 2012-06-29 |
| WO2007069092B1 (en) | 2008-06-19 |
| US20090069262A1 (en) | 2009-03-12 |
| EP1973927B1 (en) | 2013-08-14 |
| JP2009519317A (ja) | 2009-05-14 |
| ES2435420T3 (es) | 2013-12-19 |
| WO2007069092A3 (en) | 2008-04-17 |
| CN101370817A (zh) | 2009-02-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2451022C2 (ru) | Катионные олигонуклеотиды, автоматизированные способы их получения и их применение | |
| CA2744987C (en) | Method for the synthesis of phosphorus atom modified nucleic acids | |
| ES2296372T3 (es) | Procedimiento de desproteccion mejorado para la sintesis de compuestos oligomericos. | |
| US6169177B1 (en) | Processes for the synthesis of oligomeric compounds | |
| US20210277047A1 (en) | Synthesis and Biological Activity of Phosphoramidimidate and Phosphoramidate DNA | |
| EP1244682A1 (en) | Process for the preparation of oligomeric compounds | |
| US6825338B2 (en) | Labeled oligonucleotides, methods for making same, and compounds useful therefor | |
| US6399765B1 (en) | Methods for removing dimethoxytrityl groups from oligonucleotides | |
| US20060063147A1 (en) | Omega-amino-PEG-phosphoramidites and conjugates thereof | |
| Sanghvi et al. | Chemical synthesis and purification of phosphorothioate antisense oligonucleotides | |
| EP1308452A2 (en) | Oligonucleotide labeling reactants based on acyclonucleosides and conjugates derived thereof | |
| JP6429264B2 (ja) | ボラノホスフェート化合物、及び核酸オリゴマー | |
| Wiesler et al. | Synthesis and purification of phosphorodithioate DNA | |
| Putta et al. | Synthesis, purification, and characterization of immune-modulatory oligodeoxynucleotides that act as agonists of Toll-like receptor 9 | |
| KR20210151593A (ko) | 신규한 몰포리노 올리고뉴클레오티드 유도체 | |
| US20040054161A1 (en) | Stepwise solid-phase synthesis of peptide-oligonucleotide conjugates and supports therefor | |
| AU2002254493A1 (en) | Labeled oligonucleotides, methods for making same, and compounds useful therefor | |
| WO2013175656A1 (ja) | 新規核酸誘導体、及び当該核酸誘導体とアミン化合物のコンジュゲート | |
| Scozzari et al. | 1 Chemical Synthesis and Purification of Phosphorothioate Antisense Oligonucleotides |