CN102140459B - 一种小干扰核酸和药物组合物及其制药应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种小干扰核酸，该小干扰核酸的序列为：正义链：5’-GGAAACUACUGUUGUUAGAdTdT-3’；反义链：5’-UCUAACAACAGUAGUUUCCdTdT-3’；所述小干扰核酸具有E1-E8之一所示方式的修饰。本发明还提供了一种用于预防和/或治疗乙型肝炎的药物组合物，该药物组合物含有本发明提供的小干扰核酸作为活性成分。本发明还提供了所述小干扰核酸在制备用于预防和/或治疗乙型肝炎的药物中的应用。本发明中通过特异性的修饰，从而在仅引入少量修饰的情况下，即可达到增加小干扰核酸的血清稳定性的目的，从而降低了修饰后的小干扰核酸分子的潜在的细胞毒性以及对生物学活性的影响。

Description

一种小干扰核酸和药物组合物及其制药应用

技术领域

本发明涉及一种用于抑制乙型肝炎病毒基因表达的小干扰核酸和含有该小干扰核酸作为活性成分的药物组合物以及所述小干扰核酸在制备用于预防和/或治疗乙型肝炎的药物中的应用。

背景技术

乙型病毒性肝炎简称乙型肝炎，是一种由乙型肝炎病毒(hepatitis Bvirus，HBV)引起的传染病。据世界卫生组织(WHO)统计，全球乙肝病毒携带者超过了20亿人，其中3.6亿乙肝慢性患者的病情正在恶化，每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌。中国是世界范围内感染HBV人数最多的国家，乙型肝炎病毒(HBV)感染率高达57.63％。全国现有慢性乙肝病人2000万，每年乙肝新发病人数约50万，每年有23.7万人死于乙型肝炎相关的疾病，其中有15.6万人死于肝癌。据中国肝炎防治基金会2006年报道，我国每年用于治疗慢性肝炎、肝硬化、肝癌的直接医疗耗费约300亿元人民币，HBV造成的直接经济损失约为3600亿元/年。每人年均医疗花费高达28864.89元人民币，是我国2005年人均GDP的2.12倍。由此可见，乙型肝炎不仅严重危害我国人民的健康，而且还为国家带来严重的社会经济负担。

治疗乙肝的方法主要包括抗病毒复制、提高机体免疫功能、保护肝细胞、促进肝细胞再生以及中医药治疗、基础治疗及心理治疗等综合治疗。全球公认的防治乙型肝炎的药物主要可分为干扰素、核苷类似物2大类。干扰素作为乙肝治疗药物已使用了较长时间，其治疗终末应答率只有30％，即使和其他抗病毒药物联合使用或增加剂量后，其治疗终末应答率也只有50％，且停药、减量或减少注射次数后易复发，不良反应明显增加。另外，长期使用会诱发干扰素抗体，失去药效。核苷类似物起效快，但终末应答率也不高，且核苷类似物只抑制肝细胞质内的病毒，对肝细胞核内的CCC-DNA没有作用，需要长期维持用药。长期用药面临的最主要问题是病毒变异而引发的耐药性，以及停药后也易出现病毒反弹、复发率高。更为严重的是少数病人停药后出现肝功能急剧恶化，甚至死亡。从基因水平抑制HBV的生成和复制来降低病毒代谢和对肝细胞的侵染无疑将是乙肝最为理想的治疗手段。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)分子在mRNA水平关闭同源基因的表达或使该基因表达沉默的现象。但由于小干扰核酸(siRNA)的稳定性较差，在体内容易被核酸酶降解，因此人们对合成的siRNA进行化学修饰，以增加siRNA的血清稳定性，从而有效地抑制目的基因的表达。

目前，由于人们对小干扰核酸在血清中的降解过程和机制缺乏足够的了解，虽然通过修饰在一定程度上提高了小干扰核酸的稳定性，但由于引入了过量的修饰，导致修饰后的小干扰核酸的产生了潜在的细胞毒性，且修饰后的小干扰核酸的生物学活性也受到很大的影响。

因此，开发出一种血清稳定的、具有良好生物活性的且细胞毒性较低的抑制乙型肝炎病毒基因表达的小干扰核酸成为迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明解决的技术问题是克服现有的用于抑制乙型肝炎病毒基因表达的小干扰核酸存在的细胞毒性高且生物活性差的缺点，提供一种具有血清稳定、良好生物活性的且较低的细胞毒性特性的、用于抑制乙型肝炎病毒基因表达的小干扰核酸。

乙型肝炎病毒(HBV)属嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae)，基因组长约3.2kb，为部分双链环状DNA；乙型肝炎病毒基因组含有4个开放读码框(ORF，S基因区、C基因区、P基因区和X基因区)。

S基因区包括S基因、前S1基因和前S2基因，它们分别编码S蛋白、M蛋白和L蛋白；其中，S蛋白和M蛋白与乙型肝炎病毒的嗜肝性、基因免疫及转录激活密切相关。

C基因区包括前C基因和C基因，它们分别编码核壳蛋白HBeAg和BcAg，该核壳HBeAg和HBcAg是组成乙型肝炎病毒核心部分的重要组成部分，是病毒复制的主体。

P基因区包括P基因，编码P蛋白，P蛋白含816个氨基酸，具有4个功能结构域，包括具有反转录酶活性的DNA聚合酶、RNA酶H等，参与HBV复制的全过程。

X基因区包括X基因，是HBV病毒基因组中最小的开放性读码框，编码长度为154个氨基酸的蛋白，该蛋白能够直接或间接地对病毒自身的复制与增殖产生影响，并且能够对宿主细胞中被感染的细胞的调亡和癌变过程产生影响。

所述X、P、S、C基因的保守区在HBV基因组(Genbank登记号为U95551)相对位置分别为1376-1840bp、2309-3182bp和1-1625bp、157-837bp、1816bp-2454bp。

本发明提供了一种小干扰核酸，其中，该小干扰核酸的序列为：

正义链：5’-GGAAACUACUGUUGUUAGAdTdT-3’

反义链：5’-UCUAACAACAGUAGUUUCCdTdT-3’；

并且所述小干扰核酸具有E1-E8之一所示方式的修饰：

E1)正义链中5`-3`方向第1位鸟嘌呤核苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修饰，第6和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修饰，第7、12、13、15和16尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修饰；反义链中5`-3`方向第4、5、7、8和13腺嘌呤核苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修饰；

E2)正义链中5`-3`方向第1位鸟嘌呤核苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修饰，第6和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修饰，第7、12、13、15和16尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修饰；反义链中5`-3`方向第1、3、12、15、16和17位尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氟修饰，第2和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氟修饰；

E3)正义链中的鸟嘌呤核苷酸和腺嘌呤核苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修饰；反义链中5`-3`方向第4、5、7、8和13腺嘌呤核苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修饰；

E4)正义链中的鸟嘌呤核苷酸和腺嘌呤核苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修饰；反义链中5`-3`方向第1、3、12、15、16和17位尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氟修饰，第2和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氟修饰；

E5)正义链中5`-3`方向第6和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氟修饰，第7、12、13、15和16尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氟修饰；反义链中5`-3`方向第1、3、12、15、16和17位尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氟修饰，第2和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氟修饰；

E6)正义链中5’-3’方向的第1、11和14位的鸟嘌呤核苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修饰，第7、13和16位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修饰，第8和17位的腺嘌呤核苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修饰；反义链中5’-3’方向的第2位的胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修饰，第6和18位的胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氟修饰，第12位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氟修饰；

E7)正义链中5’-3’方向的第1位的鸟嘌呤核苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修饰，第7、10、13、15和16位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修饰；反义链中5’-3’方向的第2位的胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修饰，第6、18和19位的胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氟修饰，第3、15和16位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氟修饰；

E8)正义链中5’-3’方向的第1位的鸟嘌呤核苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修饰，第7、10、13、15和16位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修饰；反义链中5’-3’方向的第2位的胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修饰，第6和19位的胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氟修饰，第3、15、16和17位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氟修饰。

本发明还提供了一种用于预防和/或治疗乙型肝炎的药物组合物，其中，该药物组合物含有本发明提供的小干扰核酸作为活性成分。

此外，本发明还提供了本发明所述的小干扰核酸在制备用于预防和/或治疗乙型肝炎的药物中的应用。

本发明提供的小干扰核酸通过特异性的修饰，从而在仅引入少量修饰的情况下，即可达到增加修饰后的小干扰核酸的血清稳定性的目的，从而降低了修饰后的小干扰核酸分子的潜在的细胞毒性，以及修饰对小干扰核酸的生物学活性的影响，从而提供了一种能够有效抑制乙型肝炎病毒基因表达的小干扰核酸。

附图说明

图1显示了本发明实施例中的小干扰核酸与对比例中的参比小干扰核酸的血清稳定性的检测结果。

图2显示了本发明实施例中的小干扰核酸与对比例中的参比小干扰核酸对乙型肝炎病毒mRNA表达抑制活性的检测结果。

图3显示了本发明实施例中的小干扰核酸与对比例中的参比小干扰核酸对乙型肝炎病毒的HBV的S抗原和E抗原表达的抑制率。

图4显示了本发明实施例中的小干扰核酸与对比例中的参比小干扰核酸对小鼠血清中ALT(丙氨酸氨基转移酶)、AST(谷草转氨酶)、LT(血清总蛋白)和LDH(乳酸脱氢酶)的血液生化指标的影响。

图5显示了本发明实施例中的小干扰核酸与对比例中的参比小干扰核酸对HBV转基因小鼠血清中HBsAg含量的影响。

图6显示了本发明实施例中的小干扰核酸与对比例中的参比小干扰核酸对HBV转基因小鼠肝组织中乙型肝炎病毒的mRNA含量的抑制。

具体实施方式

本发明提供了一种小干扰核酸，其中，该小干扰核酸的序列为：

正义链：5’-GGAAACUACUGUUGUUAGAdTdT-3’

反义链：5’-UCUAACAACAGUAGUUUCCdTdT-3’；

并且所述小干扰核酸具有E1-E8之一所示方式的修饰：

E1)正义链中5`-3`方向第1位鸟嘌呤核苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修饰，第6和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修饰，第7、12、13、15和16尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修饰；反义链中5`-3`方向第4、5、7、8和13腺嘌呤核苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修饰；

E2)正义链中5`-3`方向第1位鸟嘌呤核苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修饰，第6和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修饰，第7、12、13、15和16尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修饰；反义链中5`-3`方向第1、3、12、15、16和17位尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氟修饰，第2和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氟修饰；

E3)正义链中的鸟嘌呤核苷酸和腺嘌呤核苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修饰；反义链中5`-3`方向第4、5、7、8和13腺嘌呤核苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修饰；

E4)正义链中的鸟嘌呤核苷酸和腺嘌呤核苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修饰；反义链中5`-3`方向第1、3、12、15、16和17位尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氟修饰，第2和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氟修饰；

E5)正义链中5`-3`方向第6和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氟修饰，第7、12、13、15和16尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氟修饰；反义链中5`-3`方向第1、3、12、15、16和17位尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氟修饰，第2和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氟修饰；

E6)正义链中5’-3’方向的第1、11和14位的鸟嘌呤核苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修饰，第7、13和16位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修饰，第8和17位的腺嘌呤核苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修饰；反义链中5’-3’方向的第2位的胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修饰，第6和18位的胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氟修饰，第12位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氟修饰；

E7)正义链中5’-3’方向的第1位的鸟嘌呤核苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修饰，第7、10、13、15和16位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修饰；反义链中5’-3’方向的第2位的胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修饰，第6、18和19位的胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氟修饰，第3、15和16位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氟修饰；

E8)正义链中5’-3’方向的第1位的鸟嘌呤核苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修饰，第7、10、13、15和16位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修饰；反义链中5’-3’方向的第2位的胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修饰，第6和19位的胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氟修饰，第3、15、16和17位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氟修饰。

本发明的发明人对用于抑制乙型肝炎病毒基因表达的小干扰核酸及其修饰方式进行了细致的研究，发现，具有上述E1-E8之一所示核苷酸序列的小干扰核酸不但血清稳定性好，并且由于引入修饰的量很少，因而降低了修饰后的小干扰核酸分子的潜在的细胞毒性，并且小干扰核酸的生物活性所受到的影响也非常小。本发明提供的小干扰核酸的干扰靶位点序列具有SEQID NO：2所示的核苷酸序列，该核苷酸序列是指与如SEQ ID NO：1所示乙型肝炎病毒基因组(Genbank登记号为U95551)的2334-2352位相对应的乙型肝炎病毒的mRNA序列。

所述氧甲基修饰是指在核苷酸的戊糖2’-OH的氢被甲基所取代(如式I所示)。2’-OH是RNA与DNA的主要区别，RNA水解时，在RNA酶催化下，2’-OH首先进攻磷酸基，在断开磷酸酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用下形成水解产物。在核苷酸的戊糖2’-OH位置引入氧甲基，能够使小干扰核酸具有更强的抵抗核酸酶水解的能力。

式I

所述氟修饰指在核苷酸的戊糖2’-OH被氟所取代(如式II所示)。2’-F使RNA酶不易识别到小干扰核酸，从而增加了小干扰核酸的稳定性。

式II

优选情况下，所述小干扰核酸具有E2、E4-E8之一所示方式的修饰。

选择性地，所述E1-E8所示的核苷酸序列的正义链和反义链的-3’末端dTdT之间的磷酸二酯键的硫代磷酸修饰。所述硫代磷酸修饰是用一个硫原子取代磷酸二酯键的非桥氧原子，即P-S键替代P-O键(如式III所示)。连接RNA磷酸骨架的磷酸二酯键是核酸酶作用的化学键，而磷原子是核酸酶攻击的中心，对该原子的修饰能够影响酶的降解作用，从而提高小干扰核酸抗核酸酶的能力，增加其稳定性。

式III

在本发明中，仅对正义链和反义链的-3’末端dTdT之间的磷酸二酯键的硫代磷酸修饰，能够使E1-E8所示的核苷酸序列的稳定性更好，并且与不引入硫代磷酸修饰相比，基本上不会影响小干扰核酸的活性。

根据本发明，所述小干扰核酸的制备方法没有特别的限制，例如，所述小干扰核酸可以通过化学合成得到，或者通过质粒和/或病毒载体的表达而得到。

所述小干扰核酸序列的合成可以采用化学合成的方法，根据小干扰核酸的核苷酸序列以及E1-E8之一所示的修饰方式，使用经过修饰核苷酸替代相应位置中的核苷酸，从而得到本发明提供的小干扰核酸。

优选情况下，使得到的小干扰核酸具有E2、E4-E8之一所示的修饰方式。

选择性地，所述小干扰核酸的制备方法还包括：正义链和反义链的-3’末端dTdT之间的磷酸二酯键的硫代磷酸修饰。

选择性地，也可以委托专门从事核酸合成的生物技术公司根据上述E1-E8之一所示修饰方式来合成本发明的小干扰核酸，如委托上海GenePharma公司进行合成。

一般来说，用于合成小干扰核酸的方法包括以下四个过程：(1)寡聚核糖核苷酸的合成；(2)脱保护；(3)纯化分离；(4)脱盐。

例如，具体步骤如下：

(1)寡聚核糖核苷酸的合成：在自动DNA/RNA合成仪(例如，AppliedBiosystems EXPEDITE8909)上设定合成1毫摩尔的RNA，同时设定每个循环的偶联时间为10-15分钟，起始物为固相连接的5’-O-对二甲氧基-胸苷支持物，第一个循环在固相支持物上连接一个碱基，然后在第n次(19≥n≥2)循环中，在第n-1次循环所连接的碱基上连接一个碱基，重复此循环直至完成全部核酸序列的合成。

(2)脱保护

将连接有小干扰核酸的固相支持物加入到试管中，并在此试管中加入1毫升的乙醇/乙胺(体积比为1∶3)，然后密封，置于55-70℃温箱中，孵育2-30小时，取出连接有小干扰核酸的固相支持物并用双蒸水淋洗2次(每次1毫升)，收集洗脱液，并在室温下干燥30分钟。然后，加入1毫升四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液(1M)，室温放置4-12小时，再加入2毫升乙醇，收集沉淀即得到小干扰核酸的粗产物。

(3)纯化分离

将得到的小干扰核酸的粗产物溶解于2毫升浓度为1摩尔/毫升的乙酸铵水溶液中，然后通过C18高压液相色谱进行分离，得到纯化的小干扰核酸产物。

(4)脱盐

用浓度为75重量％的乙醇水溶液洗涤纯化的小干扰核酸产物2-4次(每次2毫升)，除去盐份，并室温下干燥。然后将正义链和反义链的寡聚核糖核酸混合溶解在1-2毫升的缓冲液中(10mM Tris，pH＝7.5-8.0，50mM NaCl)，将此溶液加热至95℃，然后缓缓将此溶液冷却至室温，并维持室温16-22小时，得到含有小干扰核酸的溶液。

本发明还提供了一种用于预防和/或治疗乙型肝炎的药物组合物，其中，该药物组合物含有本发明提供的小干扰核酸作为活性成分。

根据本发明，所述药物组合物可以为注射液。

本发明中，所述注射液含有药学上可接受的载体和本发明提供的小干扰核酸，所述小干扰核酸与药学上可接受的载体的含量可以在很大范围内变动，优选情况下，相对于100重量份的小干扰核酸，所述药学上可接受的载体的含量为100-10000000重量份。

本发明中，对所述药学上可接受的载体没有特别的限制，可以是pH值为4.0-9.0的磷酸缓冲液、pH值为7.5-8.5的三羟甲基胺基甲烷盐酸盐缓冲液、生理盐水或pH为5.5-8.5的磷酸盐缓冲液，优选情况下，所述药学上可接受的载体为pH值为4.0-9.0的磷酸缓冲液。

根据本发明，所述注射液还可以含有保护剂和/或渗透压调节剂；以所述注射液为基准，所述保护剂的含量为0.01-30重量％，所述保护剂选自肌醇、山梨醇和蔗糖中的一种或几种；所述渗透压调节剂的含量使所述注射液的渗透压为200-700毫渗摩尔/千克，所述渗透压调节剂为氯化钠和/或氯化钾。

当注射本发明所述药用组合物时，注射用量可以为本领域常用的剂量，所述剂量可以根据各种参数、尤其根据待治疗患者的年龄、体重和病症的严重程度来确定。

本发明还提供了所述的小干扰核酸在制备用于预防和/或治疗乙型肝炎的药物中的应用。

下面结合实施例进一步说明本发明，除非特别说明，本发明所用到的试剂、培养基均为市售商品。

实施例1

委托上海吉玛制药技术有限公司(GenePharma)合成具有E1-E8之一所示修饰的小干扰核酸。

表1

实施例2

分别对实施例1中的小干扰核酸(E1-E8)进行如下检测：

一、血清稳定性检测

将10μL浓度为20μM的小干扰核酸加入到含有10μL胎牛血清和80μL1×PBS的溶液(pH7.4)中，在37℃条件下将反应体系孵育一定的时间后取样，分别为0、2、4、6、8、10、12、24和48小时；每次取10μL样本并进行液氮速冻，以立即中止血清核酸酶对小干扰核酸的作用，然后将样本保存于-80℃条件下备用。

配置20重量％的聚丙烯酰胺凝胶，将3μL的上样缓冲液(20mM EDTA，36重量％甘油，0.06重量％溴酚蓝)与小干扰核酸的降解样本进行混合，然后上样，在80mA的恒流条件下电泳60分钟。电泳结束后，用1×Sybr Gold染料(Invitrogen，Cat.11494)进行15分钟的染色后照相，结果如图1所示。

二、修饰siRNA的细胞毒性检测

将在DMEM培养基(10重量％FBS，2mM L-谷氨酰胺，100个单位/毫升的青霉素和100μg/ml的链霉素)中培养的人胚胎肾细胞(HEK293)接种到24孔板中(1×10⁵细胞/孔)；待细胞生长24小时后，细胞的融合度为50％左右时，将培养基换为Opti-MEM培养基(Gibco公司)；然后分别将实施例1得到的小干扰核酸通过Lipofectamine 2000(Invitrogen公司，美国)进行细胞转染，小干扰核酸的终浓度为10、20、40、80、160nM，每种修饰每个梯度的小干扰核酸平行转染三个复孔，无小干扰核酸的三个转染复孔作为对照；4小时后再将转染介质换成1ml DMEM培养基(10重量％FBS，2mML-谷氨酰胺，100个单位/毫升的青霉素和100μg/ml的链霉素)；24小时后吸去培养液，用PBS洗涤一次，每孔加1ml PBS和10μl MTT(噻唑蓝)染液，在37℃ 5％ CO₂的二氧化碳培养箱中培养4小时；每孔加0.1mlDMSO(二甲基亚砜)，在振荡器上振荡30min，让还原产物充分溶解；酶联免疫检测仪测定570nm处各孔A值，并按照以下公式计算细胞生长抑制率，结果如表3所示。

细胞存活率(％)＝实验组平均A值/对照组平均A值×100％。

三、对乙型肝炎病毒基因表达的抑制活性检测

(1)HepG2.2.15细胞的培养

用含有10％胎牛血清、2mM L-谷胺酰胺、380ug/ml G418的DMEM完全培养基，在24孔细胞培养板上以1×10⁵个细胞/孔的密度接种HepG2.2.15细胞(源自北京大学人民医院)，在温度为37℃及CO2含量为5％的培养箱中进行培养，每72小时传代、更换新鲜培养基。在转染前24小时，用0.25％的胰酶消化细胞，计数，然后以1×10⁵个细胞/ml的浓度接种到24孔板，每孔1000μl。

(2)转染

使用Invitrogen公司的Lipofectamine^TM2000脂质体对实施例1得到的不同化学修饰组合(E1-E8)的小干扰核酸和一个无关序列siRNA作为阴性对照NC分别进行转染，以不添加小干扰核酸的组作为空白对照。

具体操作步骤如下：将小干扰核酸溶解于无RNA酶的无菌水中，配制成浓度为20μmol/L的小干扰核酸溶液。吸出每孔细胞中的上清，加入0.5ml的OptiMEM I低血清培养基(Invitrogen公司，31985-062)。分别将3μl小干扰核酸溶液(20μmol/L)稀释于50μl Opti-MEM I低血清培养基(Invitrogen公司，31985-062)中，将1.0μl Lipofectamine^TM 2000脂质体稀释于50μlOpti-MEM I低血清培养基(Invitrogen公司，31985-062)中，然后将上述两种溶液在室温下孵育5分钟后混合，混合溶液于室温静置20分钟后，把100μl该混合溶液加到接种有细胞的所述24孔板中。小干扰核酸的最终浓度是100nM。细胞37℃培养4小时，再加入1ml含10％胎牛血清、2mM L-谷胺酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的MEM完全培养基，然后在37℃下再培养48小时。

(3)对乙型肝炎病毒mRNA表达的抑制作用

通过Real Time-PCR分别检测(2)中转染了小干扰核酸的HEPG2.2.15细胞中乙型肝炎病毒基因mRNA的表达量，以未转染小干扰核酸的HEPG2.2.15细胞作为对照，结果如图2所示。

具体步骤为：用1ml Trizol(GIBCOL公司)裂解转染小干扰核酸的持续表达乙型肝炎病毒的HepG2.2.15细胞，并提取总RNA，提取总RNA的具体步骤为：将转染后的细胞在温度为37℃及CO₂含量为5％的培养箱中培养48小时，然后离心收集细胞，并用预冷的2ml PBS洗一遍；所述PBS的组成为：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄4.3mmol/L，KH₂PO₄1.4mmol/L；每孔加入1ml Trizol，室温放置5分钟，细胞发生裂解；将裂解物转移到1.5ml EP管中；加入200μl氯仿，用手剧烈震荡15秒，室温放置3分钟；14000rpm 4℃离心15分钟；取液相上清约500μl放于一新的EP管中，加入500μl异丙醇，室温放置10分钟；12000rpm，4℃离心10分钟，除去上清，用1ml浓度为75重量％的乙醇将沉淀物洗一次；7600rpm，4℃离心5分钟；除去上清，室温干燥RNA沉淀10分钟；加入20μl ddH₂O溶解RNA。

将2单位的DNase I(RNase-free)(TakaRa公司)加入至上述溶解有RNA的DEPC水中，并在37℃条件下静置30分钟，以除去总RNA中残留的DNA。经过DNase I处理后，采用Invitrogen公司的PureLink Micro-to-Midi Total RNAPurification Kit对总RNA进行提纯，提纯的具体步骤为：在总RNA中加入20μl的浓度为70重量％的乙醇，振荡混合均匀，将混合物转移至纯化柱上，室温12000rpm离心15秒，弃去过滤液，加入700μl清洗缓冲液I(TakaRa公司)，室温12000rpm离心15秒，弃去过滤液，加入500μl清洗缓冲液II(TakaRa公司)，室温12000rpm离心15秒，弃去过滤液，再加入500μl清洗缓冲液II(TakaRa公司)，室温12000rpm离心15秒，弃过滤液，室温12000rpm离心1分钟，将纯化柱转移至RNA收集管上，加入30μl DEPC水，室温放置1分钟，室温13000rpm离心2分钟，将RNA样品置于-80℃保存。

对提纯后得到的总RNA进行逆转录反应，在逆转录反应中，所用的逆转录酶为Promega公司的M-MLV逆转录酶，逆转录反应的具体步骤为：将1ug提纯后的总RNA与1ul(0.5ug)的Oligo dT在试管中进行混合，用DEPC水将总体积补足至16.25μl，将试管进行加热，加热的条件包括加热温度为70℃，加热时间为5分钟；然后将试管迅速冷却至0℃，并加入缓冲液(5×MLVbuffer 5μl，10mM Dntp 1.25μl，RNasin 0.5μl，M-MLV 1μl)，在42℃条件下孵育1小时，得到cDNA。

将得到的cDNA作为PCR反应的模板，进行Real-time PCR反应。Real-time PCR反应体系为：ddH₂O 17.5μl，10mM Dntp 0.5μl，10×Taq buffer2.5μl，Taq 0.5μl，F primer 0.5μl，R primer 0.5μl，Syber Green I 1μl，cDNA 2μl；PCR反应的条件为：94℃2分钟，94℃15秒，60℃30秒，共40个循环。同时设立GAPDH作为内参基因，根据下式计算小干扰核酸抑制活性，结果如图2所示。

Realtime PCR引物对如下表所示：

小干扰核酸的抑制活性＝[1-(小干扰核酸转染后的乙型肝炎病毒基因的拷贝数/小干扰核酸转染后的GAPDH拷贝数)/(对照孔乙型肝炎病毒基因的拷贝数/对照孔GAPDH拷贝数)]×100％。

GAPDH：3-磷酸甘油醛脱氢酶基因。3-磷酸甘油醛脱氢酶基因是细胞中的看家基因，在细胞中稳定表达，不受其他外加因素的影响，因此作为荧光定量PCR反应的内参照。

四、对乙型肝炎病毒s抗原、e抗原表达的抑制活性

(1)HepG2.2.15细胞的培养

用含有10％胎牛血清、2mM L-谷胺酰胺、380ug/ml G418的MEM完全培养基，在24孔细胞培养板上以1×10⁵个细胞/孔的密度接种HepG2.2.15细胞(源自北京大学人民医院)，在温度为37℃及CO2含量为5％的培养箱中进行培养，每72小时传代、更换新鲜培养基。在转染前24小时，用0.25重量％的胰酶消化细胞，计数，然后以1×10⁵个细胞/ml的浓度接种到24孔板，每孔1ml。

(2)转染

使用Invitrogen公司的Lipofectamine^TM2000脂质体对实施例1得到的小干扰核酸E1-E8和一个无关序列siRNA作为阴性对照NC分别进行转染，以不添加小干扰核酸的组作为空白对照。

具体操作步骤如下：将小干扰核酸溶解于无RNA酶的无菌水中，配制成浓度为20μmol/L的小干扰核酸溶液。吸出每孔细胞中的上清，加入0.5ml的OptiMEM I低血清培养基(Invitrogen公司，31985-062)。分别将3μl小干扰核酸溶液(20μmol/L)稀释于50μl Opti-MEM I低血清培养基(Invitrogen公司，31985-062)中，将1.0μl Lipofectamine^TM 2000脂质体稀释于50μlOpti-MEM I低血清培养基(Invitrogen公司，31985-062)中，然后将上述两种溶液在室温下孵育5分钟后混合，混合溶液于室温静置20分钟后，把100μl该混合溶液加到接种有细胞的所述24孔板中，轻轻摇匀。小干扰核酸的最终浓度是100nM。细胞37℃培养4小时，再加入1ml含10％胎牛血清、2mML-谷胺酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的MEM完全培养基，然后再培养48小时。

(3)检测培养上清液s抗原(HBsAg)的含量

为了确定小干扰核酸对HBV蛋白表达的影响，使用ELISA试剂盒对收集的细胞上清的HBsAg的含量进行检测。该试剂盒购自上海科华生物，操作按说明书进行，结果以P/N值(P/N值＝样品的光吸收值/对照的光吸收值)表示，并按下列公式计算小干扰核酸对两者的抑制率。

光吸收值为检测样本在450nm处的吸光值减去样品在630nm处的吸光值所得的差值。

抑制率(％)＝(空白对照孔P/N值-实验孔P/N值)/(空白对照孔P/N值-2.1)×100％，结果如图3所示。

(4)检测培养上清液e抗原(HBeAg)的含量

为了确定小干扰核酸对HBV蛋白表达的影响，使用ELISA试剂盒对收集的细胞上清HBeAg的含量进行检测。该试剂盒购自上海科华生物，操作按说明书进行，结果以P/N值(P/N值＝样品的光吸收值/对照的光吸收值)表示，并按下列公式计算小干扰核酸对两者的抑制率。

光吸收值为检测样本在450nm处的吸光值减去样品在630nm处的吸光值所得的差值。

抑制率(％)＝(空白对照孔P/N值-实验孔P/N值)/(空白对照孔P/N值-2.1)×100％，结果如图3所示。

五、乙型肝炎病毒转基因小鼠实验

实验动物：C57BL/6j-TgN(AlblHBV)44Bri乙型肝炎病毒基因小鼠，雄性，7-8周龄，20-25g，购自北京大学医学部实验动物科学部；动物合格证号：SCXK(京)2006-0008；饲养条件按照SFP级动物标准执行。

眼眶内眦采血，离心分离血清，筛选出血清HBsAg强阳性，HBV DNA阳性的转基因小鼠。选择各项指标相近的小鼠随机分组，每组6只。重复3次。

分别取20mg(约1.5uM)的实施例1得到的小干扰核酸E1-E8和一个无关序列siRNA作为阴性对照NC，并溶解于1.5ml无RNA酶的无菌生理盐水中，配制成浓度为1mmol/L的小干扰核酸的溶液，并与脂质体以1∶1的体积比混合。用脂质体包裹后的小干扰核酸加入到4.2ml无RNA酶的无菌生理盐水(小干扰核酸的浓度为2.5mg/ml)中，得到注射液。同时配制等比例的混合组分样品的注射液。

分别使用注射液通过常规的尾静脉注射对小鼠进行注射，注射的体积为20ml的注射液/kg体重，空白对照组注射相同体积的生理盐水，1次/天，连续3天。

主要观察指标：小鼠最后一次注射后3天，从眼眶内眦取血，常规离心得到血清，-20℃备检，并处死小鼠，在冰盒上剖腹取肝组织，匀浆备检。

(1)血清蛋白检测

小鼠最后一次注射后第3天，从眼眶内眦取血，常规离心得到血清，利用丙氨酸氨基转移酶/谷草转氨酶试剂盒(ALT/AST，IFCC推荐法，北京中生北控生物科技股份有限公司产品)，应用日立7170A全自动生化分析仪检测生化指标。具体操作严格按照试剂盒说明书。结果如图4所示。

(2)血清HBsAg检测

小鼠最后一次注射后3天，摘眼球取血，常规离心分离得到血清，使用ELISA试剂盒对血清中HBsAg的含量进行检测。该试剂盒购自法国生物梅里埃有限公司，操作按说明书进行。结果以P/N值(P/N值＝样品的光吸收值/对照光吸收值)表示，并按下列公式计算siRNA对两者的抑制率。

光吸收值为检测样本在450nm处的吸光值减去样品在630nm处的吸光值所得的差值。

抑制率(％)＝(空白对照孔P/N值-实验孔P/N值)/(空白对照孔P/N值-2.1)×100％，结果如图5所示。

(3)肝组织HBV-mRNA的检测

小鼠最后一次注射后3天，摘眼球放血处死后，取出肝脏，切取成约100mg的组织块，放入匀浆器充分研磨，然后按照Trizol(GIBCOL公司)的说明，使用Trizol抽提肝组织总RNA，提取的总RNA经DNase酶消化去除DNA后，逆转录为cDNA，接着用荧光定量PCR法检测小干扰核酸对乙型肝炎病毒mRNA表达的抑制作用。

具体步骤为：

①Trizol(GIBCOL公司)提取总RNA。脱臼处死小鼠，在冰盒上剖腹取肝组织，切取约100mg的肝脏组织块，加入1ml Trizol试剂，用玻璃-Teflon或电动匀浆器匀浆；匀浆后室温放置30min，以保证核蛋白复合体完全分离。；将裂解物转移到新的无RNase的1.5ml EP管中，加入200μL氯仿/1mL Trizol试剂，用手剧烈震荡15s，室温放置3min，12000g 4℃离心10min；取上清放于一新的EP管中，加入1/2体积的异丙醇，室温放置10min；2000g，4℃离心10min；吸去上清，用等体积冰冷75重量％的乙醇洗一次，10000g，4℃离心5min，吸去上清；无RNase环境室温干燥RNA沉淀10min，加入20μlDEPC水溶解RNA。

②RNA的纯化。将2单位的DNase I(RNase-free)(TakaRa公司)加入至总RNA中，并在37℃条件下静置30min，以除去总RNA中残留的DNA；在总RNA中加入等体积的浓度为70重量％的乙醇，振荡混合均匀；将混合物转移至纯化柱上，室温12000g离心15s，弃过滤液；加入700μL清洗缓冲液I，室温12000g离心15s，弃过滤液；加入500μL清洗缓冲液II，室温12000g离心15s，弃过滤液；再加入500μL清洗缓冲液II，室温12000g离心15s，弃过滤液；室温12000g离心1min，将纯化柱转移至RNA收集管上；加入30μl DEPC水，室温放置1min；室温13000g离心2min，丢弃纯化柱，将RNA样品至于-80℃保存。

③RNA逆转录。将1μg(2μL)提纯后的总RNA在EP管中70℃加热5min；微型离心机瞬时离心后将EP管迅速放到冰上；依次加入25mM的MgCl₂ 4μL，10×逆转录buffer 2μL，10mM的dNTP Mixture 2μL，RNase抑制剂0.5μL，逆转录酶15U(1μg)，Oligo引物0.5μg，用无RNase水定容至20μL；在42℃条件下孵育15min，95℃加热5min，5℃孵育5min，得到cDNA。

将得到的cDNA作为PCR反应的模板，进行Real-time PCR反应。PCR试剂盒购自北京美莱博医学科技有限公司。Real-time PCR反应体系为：ddH₂O 17.5μl，10mM Dntp 0.5μl，10×Taq buffer 2.5μl，Taq 0.5μl，F primer0.5μl，R primer 0.5μl，Syber Green I 1μl，cDNA 2μl；PCR反应的条件为：94℃2分钟，94℃15秒，60℃30秒，共40个循环。同时设立GAPDH作为内参，根据下式计算小干扰核酸抑制活性，结果如图6所示。

Realtime PCR引物对如下表所示：

小干扰核酸的抑制活性＝[1-(给药组乙肝病毒基因的拷贝数/给药组GAPDH的拷贝数)/(空白对照组乙肝病毒基因的拷贝数/空白对照组GAPDH的拷贝数)]×100％。

此外，对上述表1中小干扰核酸(E1-E8)正义链和反义链-3’末端dTdT之间的磷酸二酯键进行硫代磷酸修饰，对修饰物进行了上述(一)至(五)的检测，发现仅对正义链和反义链的-3’末端dTdT之间的磷酸二酯键进行硫代磷酸修饰，核苷酸序列的稳定性更好，并且其他检测的结果也与图2-6以及表3的结果基本上一致，说明3’末端dTdT之间的硫代磷酸修饰在提高核酸稳定性的同时，保持了小干扰核酸的活性，并且在细胞核体内检测无毒性。

对比例1

委托上海吉玛制药技术有限公司(GenePharma)合成下表2所示的小干扰核酸。

表2

对比例2

通过与实施例2相同的方法检测对比例1得到具有CE1或CE2所示修饰的小干扰核酸分别进行检测，不同在于分别使用具有CE1或CE2所示修饰的小干扰核酸替代本发明的小干扰核酸(E1-E8)，结果分别如表3、以及图1-6所示。

表3

从表3可以看出，与经过随机小干扰核酸(CE2)相比，本发明提供的小干扰核酸的细胞毒性显著降低，基本上与未经过小干扰核酸的细胞毒性水平相当，由此可见，本发明在仅引入少量修饰的情况下，即可达到增加修饰后的小干扰核酸的血清稳定性的目的，从而降低了修饰后的小干扰核酸分子的潜在的细胞毒性。

此外，图1显示了本发明实施例中的小干扰核酸与对比例中的参比小干扰核酸的血清稳定性的检测结果。从图1可以看出，与无化学修饰的样品(CE1)相比，本发明提供的小干扰核酸的稳定性明显提高，并且具有比随机小干扰核酸(CE2)更好的稳定性，在血清中能维持稳定长达72小时。

图2显示了本发明实施例中的小干扰核酸与对比例中的参比小干扰核酸对乙型肝炎病毒mRNA表达抑制活性的检测结果。从图2可以看出，本发明提供的小干扰核酸在具有很好血清稳定性的同时，也保留了90％以上的抑制活性，而随机小干扰核酸(CE2)仅能够保留60％以下的抑制活性，因此，可以看出，本发明提供的小干扰核酸的修饰方式能够有效地保持小干扰核酸的抑制活性。

图3显示了本发明实施例中的小干扰核酸与对比例中的参比小干扰核酸对乙型肝炎病毒的HBV的S抗原和E抗原表达的抑制率。从图3可以看出，本发明提供的小干扰核酸对两种抗原的抑制效果基本上能够与未小干扰核酸(CE1)处于同一水平，而随机小干扰核酸(CE2)对这两种抗原的抑制效果则比(CE1)低的多，从此方面也能够看出，本发明提供的小干扰核酸的修饰方式能够有效地保持小干扰核酸的抑制活性。

图4显示了本发明实施例中的小干扰核酸与对比例中的参比小干扰核酸的对小鼠血清中ALT、AST、LT和LDH的血液生化指标的影响。从图4可以看出，与5％葡萄糖注射组相比，注射样品后，血清生化指标均处于正常范围，且无显著差异。表明经过化学稳定性修饰后的样品通过静脉给药后，不会对动物的肝脏和心脏等主要脏器造成损伤，样品是安全的。

图5显示了本发明实施例中的小干扰核酸与对比例中的参比小干扰核酸对HBV转基因小鼠血清中HBsAg含量的影响。从图5可以看出，与参比小干扰核酸(CE1和CE2)相比，本发明提供的小干扰核酸能够有效抑制血清中HBsAg的生成，抑制效率均超过了35％以上，特别是E3-E8更是达到了90％以上，这说明本发明的小干扰核酸的稳定性更好，能够更有效地在血清中保持其抑制活性。

图6显示了本发明实施例中的小干扰核酸与对比例中的参比小干扰核酸对HBV转基因小鼠肝组织中乙型肝炎病毒的mRNA含量的抑制。从图6可以看出，与参比小干扰核酸(CE1和CE2)相比，本发明提供的小干扰核酸能够有效抑制转基因小鼠肝脏中HBV基因的表达，这说明本发明的小干扰核酸在体内的稳定性更好，从而使其能够更有效地在体内保持其抑制活性。

综上所述，一方面与未经过小干扰核酸(CE1)相比，本发明提供的小干扰核酸的稳定性显著提高；另一方面与经过随机小干扰核酸(CE2)相比，本发明提供的小干扰核酸在提高了稳定性的同时，还显著地降低了细胞毒性，并且还能够维持与未小干扰核酸基本相同的活性，由此可见，本发明在仅引入少量修饰的情况下，即可达到增加修饰后的小干扰核酸的血清稳定性的目的，从而降低了修饰后的小干扰核酸分子的潜在的细胞毒性，以及修饰对小干扰核酸的生物学活性的影响。

SEQUENCE LISTING

<110>苏州瑞博生物技术有限公司

<120>小干扰核酸和药物组合物及其制药应用

<130>I12719SRB

<160>2

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>3182

<212>DNA

<213>乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)

<400>1

aattccacaa cctttcacca aactctgcaa gatcccagag tgagaggcct gtatttccct   60

gctggtggct ccagttcagg agcagtaaac cctgttccga ctactgcctc tcccttatcg  120

tcaatcttct cgaggattgg ggaccctgcg ctgaacatgg agaacatcac atcaggattc  180

ctaggacccc ttctcgtgtt acaggcgggg tttttcttgt tgacaagaat cctcacaata  240

ccgcagagtc tagactcgtg gtggacttct ctcaattttc tagggggaac taccgtgtgt  300

cttggccaaa attcgcagtc cccaacctcc aatcactcac caacctcctg tcctccaact  360

tgtcctggtt atcgctggat gtgtctgcgg cgttttatca tcttcctctt catcctgctg  420

ctatgcctca tcttcttgtt ggttcttctg gactatcaag gtatgttgcc cgtttgtcct  480

ctaattccag gatcctcaac caccagcacg ggaccatgcc gaacctgcat gactactgct  540

caaggaacct ctatgtatcc ctcctgttgc tgtaccaaac cttcggacgg aaattgcacc  600

tgtattccca tcccatcatc ctgggctttc ggaaaattcc tatgggagtg ggcctcagcc  660

cgtttctcct ggctcagttt actagtgcca tttgttcagt ggttcgtagg gctttccccc  720

actgtttggc tttcagttat atggatgatg tggtattggg ggccaagtct gtacagcatc  780

ttgagtccct ttttaccgct gttaccaatt ttcttttgtc tttgggtata catttaaacc  840

ctaacaaaac aaagagatgg ggttactctc tgaattttat gggttatgtc attggaagtt  900

atgggtcctt gccacaagaa cacatcatac aaaaaatcaa agaatgtttt agaaaacttc  960

ctattaacag gcctattgat tggaaagtat gtcaacgaat tgtgggtctt ttgggttttg    1020

ctgccccatt tacacaatgt ggttatcctg cgttaatgcc cttgtatgca tgtattcaat    1080

ctaagcaggc tttcactttc tcgccaactt acaaggcctt tctgtgtaaa caatacctga    1140

acctttaccc cgttgcccgg caacggccag gtctgtgcca agtgtttgct gacgcaaccc    1200

ccactggctg gggcttggtc atgggccatc agcgcgtgcg tggaaccttt tcggctcctc    1260

tgccgatcca tactgcggaa ctcctagccg cttgttttgc tcgcagcagg tctggagcaa    1320

acattatcgg gactgataac tctgttgtcc tctcccgcaa atatacatcg tatccatggc    1380

tgctaggctg tgctgccaac tggatcctgc gcgggacgtc ctttgtttac gtcccgtcgg    1440

cgctgaatcc tgcggacgac ccttctcggg gtcgcttggg actctctcgt ccccttctcc    1500

gtctgccgtt ccgaccgacc acggggcgca cctctcttta cgcggactcc ccgtctgtgc    1560

cttctcatct gccggaccgt gtgcacttcg cttcacctct gcacgtcgca tggagaccac    1620

cgtgaacgcc caccgaatgt tgcccaaggt cttacataag aggactcttg gactctctgc    1680

aatgtcaacg accgaccttg aggcatactt caaagactgt ttgtttaaag actgggagga    1740

gttgggggag gagattagat taaaggtctt tgtactagga ggctgtaggc ataaattggt    1800

ctgcgcacca gcaccatgca actttttcac ctctgcctaa tcatctcttg ttcatgtcct    1860

actgttcaag cctccaagct gtgccttggg tggctttggg gcatggacat cgacccttat    1920

aaagaatttg gagctactgt ggagttactc tcgtttttgc cttctgactt ctttccttca    1980

gtacgagatc ttctagatac cgcctcagct ctgtatcggg aagccttaga gtctcctgag    2040

cattgttcac ctcaccatac tgcactcagg caagcaattc tttgctgggg ggaactaatg    2100

actctagcta cctgggtggg tgttaatttg gaagatccag catctagaga cctagtagtc    2160

agttatgtca acactaatat gggcctaaag ttcaggcaac tcttgtggtt tcacatttct    2220

tgtctcactt ttggaagaga aaccgttata gagtatttgg tgtctttcgg agtgtggatt    2280

cgcactcctc cagcttatag accaccaaat gcccctatcc tatcaacact tccggaaact    2340

actgttgtta gacgacgagg caggtcccct agaagaagaa ctccctcgcc tcgcagacga    2400

aggtctcaat cgccgcgtcg cagaagatct caatctcggg aacctcaatg ttagtattcc    2460

ttggactcat aaggtgggga actttactgg tctttattct tctactgtac ctgtctttaa  2520

tcctcattgg aaaacaccat cttttcctaa tatacattta caccaagaca ttatcaaaaa  2580

atgtgaacag tttgtaggcc cacttacagt taatgagaaa agaagattgc aattgattat  2640

gcctgctagg ttttatccaa aggttaccaa atatttacca ttggataagg gtattaaacc  2700

ttattatcca gaacatctag ttaatcatta cttccaaact agacactatt tacacactct  2760

atggaaggcg ggtatattat ataagagaga aacaacacat agcgcctcat tttgtgggtc  2820

accatattct tgggaacaag atctacagca tggggcagaa tctttccacc agcaatcctc  2880

tgggattctt tcccgaccac cagttggatc cagccttcag agcaaacaca gcaaatccag  2940

attgggactt caatcccaac aaggacacct ggccagacgc caacaaggta ggagctggag  3000

cattcgggct gggtttcacc ccaccgcacg gaggcctttt ggggtggagc cctcaggctc  3060

agggcatact acaaactttg ccagcaaatc cgcctcctgc ctccaccaat cgccagacag  3120

gaaggcagcc taccccgctg tctccacctt tgagaaacac tcatcctcag gccatgcagt  3180

gg                                                                 3182

<210>2

<211>19

<212>RNA

<213>乙型肝炎病毒mRNA(Hepatitis B virus)

<400>2

ggaaactact gttgttaga                                                 19

Claims (8)

1.一种小干扰核酸，其特征在于，该小干扰核酸的序列为：

正义链：5’-GGAAACUACUGUUGUUAGAdTdT-3’

反义链：5’-UCUAACAACAGUAGUUUCCdTdT-3’；

并且所述小干扰核酸具有E1-E8之一所示方式的修饰：

E1）正义链中5`-3`方向第1位鸟嘌呤核苷酸的戊糖的2’-OH被氧甲基取代，第6和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH被氧甲基取代，第7、12、13、15和16尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH被氧甲基取代；反义链中5`-3`方向第4、5、7、8和13腺嘌呤核苷酸的戊糖的2’-OH被氧甲基取代；

E2）正义链中5`-3`方向第1位鸟嘌呤核苷酸的戊糖的2’-OH被氧甲基取代，第6和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH被氧甲基取代，第7、12、13、15和16尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH被氧甲基取代；反义链中5`-3`方向第1、3、12、15、16和17位尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH被氟取代，第2和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH被氟取代；

E3）正义链中的鸟嘌呤核苷酸和腺嘌呤核苷酸的戊糖的2’-OH被氧甲基取代；反义链中5`-3`方向第4、5、7、8和13腺嘌呤核苷酸的戊糖的2’-OH被氧甲基取代；

E4）正义链中的鸟嘌呤核苷酸和腺嘌呤核苷酸的戊糖的2’-OH被氧甲基取代；反义链中5`-3`方向第1、3、12、15、16和17位尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH被氟取代，第2和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH被氟取代；

E5）正义链中5`-3`方向第6和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH被氟取代，第7、12、13、15和16尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH被氟取代；反义链中5`-3`方向第1、3、12、15、16和17位尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH被氟取代，第2和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH被氟取代；

E6）正义链中5’-3’方向的第1、11和14位的鸟嘌呤核苷酸的戊糖的2’-OH被氧甲基取代，第7、13和16位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH被氧甲基取代，第8和17位的腺嘌呤核苷酸的戊糖的2’-OH被氧甲基取代；反义链中5’-3’方向的第2位的胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH被氧甲基取代，第6和18位的胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH被氟取代，第12位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH被氟取代；

E7）正义链中5’-3’方向的第1位的鸟嘌呤核苷酸的戊糖的2’-OH被氧甲基取代，第7、10、13、15和16位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH被氧甲基取代；反义链中5’-3’方向的第2位的胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH被氧甲基取代，第6、18和19位的胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH被氟取代，第3、15和16位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH被氟取代；

E8）正义链中5’-3’方向的第1位的鸟嘌呤核苷酸的戊糖的2’-OH被氧甲基取代，第7、10、13、15和16位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH被氧甲基取代；反义链中5’-3’方向的第2位的胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH被氧甲基取代，第6和19位的胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH被氟取代，第3、15、16和17位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH被氟取代。

2.根据权利要求1所述的小干扰核酸，其中，该小干扰核酸具有E2、E4-E8之一所示方式的修饰。

3.根据权利要求1所述的小干扰核酸，其中，该小干扰核酸的正义链和反义链的-3’末端dTdT之间的磷酸二酯键中的非桥氧原子被硫原子取代。

4.一种用于预防和/或治疗乙型肝炎的药物组合物，其特征在于，该药物组合物含有权利要求1-3中的任意一项所述的小干扰核酸作为活性成分。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其中，所述药物组合物为注射液，所述注射液还含有药学上可接受的载体，相对于100重量份的小干扰核酸，所述药学上可接受的载体的含量为100-10000000重量份。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其中，所述药学上可接受的载体为pH值为4.0-9.0的磷酸缓冲液、pH值为7.5-8.5的三羟甲基胺基甲烷盐酸盐缓冲液、生理盐水或pH为5.5-8.5的磷酸盐缓冲液。

7.根据权利要求5所述的药物组合物，其中，所述注射液还含有保护剂和/或渗透压调节剂；以所述注射液的总重量为基准，所述保护剂的含量为0.01-30重量％，所述保护剂选自肌醇、山梨醇和蔗糖中的一种或几种；所述渗透压调节剂的含量使所述注射液的渗透压为200-700毫渗摩尔/千克，所述渗透压调节剂为氯化钠和/或氯化钾。

8.权利要求1-3中的任意一项所述的小干扰核酸在制备用于预防和/或治疗乙型肝炎的药物中的应用。

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