CN101979553A - 一种干扰HBV基因的siRNA分子及其抗病毒应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种干扰HBV基因的siRNA分子及其抗病毒应用。该siRNA分子正义链为SEQ ID NO：3，反义链为SEQ ID NO：4，其中，反义链可特异性地与HBV聚合酶基因的mRNA结合，降解mRNA，从而干扰转录后翻译过程，达到抗乙型肝炎病毒的目的。

Description

一种干扰HBV基因的siRNA分子及其抗病毒应用

技术领域

本发明涉及一种干扰HBV基因的siRNA分子及其抗病毒应用。

背景技术

肝炎，即肝脏炎症，有多种致病因素-如病毒、细菌、寄生虫、化学毒物、药物和毒物、酒精等，侵害肝脏，使得肝脏的细胞受到破坏，肝脏的功能受到损害，它可以引起身体的一系列不适症状，以及肝功能指标的异常。肝炎多数情况下指是由甲型、乙型、丙型、丁型、戊型等肝炎病毒引起的病毒性肝炎。

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染导致的乙型肝炎，是一种严重威胁全球人类健康的的传染性疾病，也是最严重类型的病毒性肝炎，它可造成慢性肝病，患者死于肝硬化和肝癌的风险极高。

HBV属嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)，全基因组长约3.2kb，为部分双链环状DNA。其基因组共有四个开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，编码蛋白包括表面抗原(S基因)，核心抗原(C基因)，聚合酶蛋白(P基因)和X蛋白(C基因)。

据世界卫生组织报道，全世界估计有20亿人感染HBV，其中有3.5亿以上的人为慢性乙肝感染者，估计每年有60万人死于急性或慢性乙型肝炎。HBV可造成急性病患，症状可持续数周，包括皮肤和眼睛发黄(黄疸)，尿色深，极度疲劳，恶心，呕吐和腹痛。患者可能需要数月乃至一年才能痊愈。乙型肝炎病毒也会造成慢性肝脏感染，以后可能发展成肝硬化或肝癌。

乙型肝炎病毒通过与受感染者的血液或其他体液(比如，精液和阴道分泌物)接触而在人与人之间传播，传播途径与人类免疫缺陷病毒(艾滋病毒)相同。乙型肝炎病毒的传染性比艾滋病毒强50-100倍，乙型肝炎病毒在体外可存活至少7天以上。在此期间，如果病毒进入未感染者的身体，它依然可造成感染。病毒潜伏期平均达90天，但也可能为大约30至180天不等。乙型肝炎病毒在感染后30至60天即可发现，持续时间差别很大。

目前主要是通过婴儿接种乙型肝炎疫苗来预防乙型肝炎的发生，但尽管如此，人群HBV流行率仍然很高。目前主要治疗慢性乙型肝炎的方法仅局限于抑制患者体内病毒基因的表达和复制。如口服核苷类抗病毒药-拉米夫定，主要功能是抑制HBV的复制，但是停药后复发率高，长期应用则可导致病毒变异，在用药6个月后发生由病毒聚合酶基因发生变异引起的耐药性，使得临床抗病毒治疗面临极大的挑战。

近几年来，随着RNA干扰(RNAi)技术的迅猛发展，为疾病尤其是癌症开辟了全新的治疗途径，为科研工作者提供了一个全新的基因治疗方法。该技术通过用小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)干扰特定靶基因的表达，来达到治疗疾病的目的，是基因治疗的重要组成部分。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)引发的转录后基因沉默机制。其作用机制是：核糖核酸酶III家族的Dicer酶，与dsRNA结合，将其剪切成21-23nt及3’端突出的siRNA，随后siRNA与RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)结合，解旋成单链，活化的RISC受已成单链的siRNA引导，序列特异性地结合到靶信使RNA(mRNA)上并将其切断，引发靶mRNA的特异性分解，从而阻断相应基因表达。RNAi已作为一种简单有效的基因敲除的技术，广泛地应用于功能基因组学研究以及抗病毒、抗肿瘤治疗的研究中。

本发明提供了一种用RNAi技术来抗HBV的方法。应用RNA干扰技术，用靶向至HBV基因的siRNA作为靶向药物，在基因的转录后进行干扰，从而有效抑制HBV的蛋白表达和病毒复制，具有特异性强、高效、副作用小、可持续用药的优势，且能弥补目前治疗乙型肝炎药物的不足，在不久的将来可能成为一种新的治疗乙型肝炎的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过siRNA全位点分子库技术筛选出的高效靶向HBV基因的双链siRNA分子，其下述正义链和反义链组成：

正义链：5’-GAUUGACGAUAAGGGAGANN-3’(SEQ ID NO：3)

反义链：5’-UCUCCCUUAUCGUCAAUCNN-3’(SEQ ID NO：4)

其中，N是A、T、C、G或U碱基的任何一种。

换言之，该双链siRNA分子的主干序列为：

正义链：5’-GAUUGACGAUAAGGGAGA-3’(SEQ ID NO：5)

反义链：5’-UCUCCCUUAUCGUCAAUC-3’(SEQ ID NO：6)

在一个优选的实施方式中，上述序列中3’端的“NN”是两个脱氧胸腺嘧啶dTdT。

本发明的另一目的在于提供上述siRNA分子在制备抗HBV药物中的应用。

体外实验证明，本发明的siRNA分子的反义链可特异性地与HBV聚合酶基因的mRNA结合，降解mRNA，从而干扰转录后翻译过程，抑制HBV蛋白质翻译和病毒复制，达到抗HBV的治疗目的。

附图说明

图1是抽提的HBV基因组琼脂糖凝胶电泳检测图。M为1kb plus DNA Ladder(标准参照)。

图2A HBV聚合酶片段1琼脂糖凝胶电泳检测图，制备得到的DNA片段大小为1625bp。图2B是HBV聚合酶片段2琼脂糖凝胶电泳检测图，制备得到的DNA片段大小为874bp。M为1kb plus DNA Ladder(标准参照)。

图3是siRNA分子库构建流程示意图。

图4是U6-siRNA转录模板-H1表达框结构示意图。

图5是PCR制备的U6-siRNA转录模板-H1表达框纯化后琼脂糖凝胶电泳检测图。图中，M为1kb plus DNA Ladder(标准参照)；1为HBV-22；2为HBV-676；3为HBV-877；4为HBV-638；5为HBV-1003；6为HBV-748；7为HBV-182；8为HBV-261；9为阴性对照。

图6是表达框转染细胞后实时定量PCR检测HBV聚合酶基因mRNA表达量柱形图，纵坐标表示HBV聚合酶基因mRNA表达水平；横坐标表示处理实验组，“Negative Control”为阴性对照组。

图7是化学合成的siRNA转染细胞后实时定量PCR检测HBV聚合酶基因mRNA表达量柱形图，纵坐标表示HBV聚合酶基因mRNA表达水平；横坐标表示处理实验组，“NegativeControl”为阴性对照组。

具体实施方式

本发明中诸如“siRNA”、“siRNA序列”或“siRNA分子”等术语可以互换，其表示的意思和范围相同。

其中，siRNA序列可以是单链结构，也可以是双链结构。

本发明的siRNA分子来源于针对HBV聚合酶基因的功能保守区而制备的siRNA分子库，本发明所用siRNA全位点分子库技术是百奥迈科生物技术有限公司的专利技术(中国发明专利号为：ZL 200710024217.6，专利名称：PCR高通量构建siRNA全位点分子库制备方法)，其优点在于所制备得到的siRNA随机分布于HBV聚合酶基因区段，长度可控性分布于18-25bp，可以提高有效靶位点的命中率。

siRNA的制备可采用多种方法，比如：化学合成法、体外转录、酶切长链dsRNA、载体表达siRNA、PCR合成siRNA表达元件等，这些方法的出现为研究者提供了可选择的空间，可以更好地获得基因沉默效率。

本发明的siRNA分子可以作为抗HBV药物的有效成分。

作为该siRNA分子的另一种表达形式，可将其制备成DNA表达框形式，比如：U6启动子-siRNA转录模板-H1启动子。

简言之，在下文中将“U6启动子-siRNA转录模板-H1启动子”简写为“U6-siRNA转录模板-H1”或“U6-siRNA-H1”，它们表示的意思和范围相同。

出于应用目的，可将siRNA分子、表达siRNA分子的DNA表达框、或者包含siRNA分子表达框的质粒作为药物直接给药于受药者身上特定部位，比如病灶组织。

本发明的药物的剂型可以为多种形式，只要适合于相应疾病的给药、并且恰当地保持siRNA分子的活性。比如，对于注射用给药系统，剂型可以是冻干粉。

任选地，上述药物剂型中可以包含任何药学可接受的辅助剂，只要其适合于相应的给药体系、并且恰当地保持siRNA分子的活性。

为了实现本发明的设计思想并验证筛选得到的siRNA的抗HBV效果，设计了如下实验方案：

(1)构建HBV聚合酶基因的siRNA分子库，该分子库中包含靶向至HBV聚合酶基因的siRNA效应分子，长度分布于18-25bp。

(2)制备具有相应效应的siRNA表达框，其结构为U6启动子-siRNA转录模板-H1启动子，使其更易于体外筛选。

(3)运用实时定量PCR技术，检测上述siRNA表达框在细胞中转录出的效应siRNA分子对HBV聚合酶基因的抑制作用。

(4)化学合成上述方法筛选得到的最优靶点siRNA，在体外细胞实验中进一步运用实时定量PCR技术检测HBV聚合酶基因的mRNA表达水平。

下述实施例仅用于阐明本发明，并非是对本发明进行限制。

实施例1

siRNA全位点分子库的制备

1.主要仪器、试剂和材料

1.1仪器：PCR仪(ABI公司)；电转仪(Bio-Rad公司)；离心机(Eppendorf公司)，长波长紫外灯等。

1.2材料和试剂：HepG22.2.15细胞(百奥迈科公司保存)；1kb plus DNA Ladder(invitrogen公司)；DNase I(Roche公司)；MnCl₂(BBI公司)；磷酸接头(Sigma-aldrich公司)；ATP(BBI公司)；BSA(NEB公司)；BmsbI(NEB公司)；T4DNA连接酶(NEB公司)；Tag DNA聚合酶(百奥迈科公司)；琼脂糖(BBI公司)；dNTP(上海生工)；酚氯仿抽提试剂(上海生工)；低分子量DNA Ladder(NEB公司)；EcoP15I(NEB公司)；T4DNA聚合酶(NEB公司)；FokI酶(NEB公司)；SfiI酶(NEB公司)；感受态细胞(invitrogen公司)；pU6H1-GFP表达载体(NT Oimcs公司)。凝胶抽提试剂盒：QIAEX II Gel ExtrationKit(QIAGEN公司)；质粒抽提试剂盒(百奥迈科公司)。其他生化试剂均购于Sigma-aldrich公司。

2.siRNA全位点分子库的构建

2.1HBV聚合酶基因的获得：从细胞HepG22.2.15的基因组DNA(如图1所示)中PCR扩增HBV聚合酶片段。HepG22.2.15细胞含2个拷贝的HBV基因组，能稳定分泌HBsAg、HBeAg、HBcAg及Dane颗粒，并可检测到细胞内HBV的DNA和RNA等中间复制体(Sells eta1.Proc Natl Acad Sci，1987；84：1005-1009)，其含有HBV的血清亚型为ayw(GenBankAccession number：U95551)，根据GenBank报道的核酸序列设计PCR扩增引物，分成两个片段为HBV聚合酶片段1和HBV聚合酶片段2，长度分别为：1625bp(如图2A所示)和874bp(如图2B所示)。引物序列如下：

HBV聚合酶片段1上游引物：5’-AATTCCACAACCTTTCACCAA-3’；

HBV聚合酶片段1下游引物：5’-TCACGGTGGTCTCCATGCGA-3’；

HBV聚合酶片段2上游引物：5’-ATGCCCCTATCCTATCAACAC-3’；

HBV聚合酶片段2下游引物：5’-CCACTGCATGGCCTGAGGAT-3’。

1)HBV聚合酶片段1序列：

  1  aattccacaa cctttcacca aactctgcaa gatcccagag tgagaggcct gtatttccct

 61  gctggtggct ccagttcagg agcagtaaac cctgttccga ctactgcctc tcccttatcg

121  tcaatcttct cgaggattgg ggaccctgcg ctgaacatgg agaacatcac atcaggattc

181  ctaggacccc ttctcgtgtt acaggcgggg tttttcttgt tgacaagaat cctcacaata

241  ccgcagagtc tagactcgtg gtggacttct ctcaattttc tagggggaac taccgtgtgt

301  cttggccaaa attcgcagtc cccaacctcc aatcactcac caacctcctg tcctccaact

361  tgtcctggtt atcgctggat gtgtctgcgg cgttttatca tcttcctctt catcctgctg

421  ctatgcctca tcttcttgtt ggttcttctg gactatcaag gtatgttgcc cgtttgtcct

481  ctaattccag gatcctcaac caccagcacg ggaccatgcc gaacctgcat gactactgct

541  caaggaacct ctatgtatcc ctcctgttgc tgtaccaaac cttcggacgg aaattgcacc

601  tgtattccca tcccatcatc ctgggctttc ggaaaattcc tatgggagtg ggcctcagcc

 661  cgtttctcct ggctcagttt actagtgcca tttgttcagt ggttcgtagg gctttccccc

 721  actgtttggc tttcagttat atggatgatg tggtattggg ggccaagtct gtacagcatc

 781  ttgagtccct ttttaccgct gttaccaatt ttcttttgtc tttgggtata catttaaacc

 841  ctaacaaaac aaagagatgg ggttactctc tgaattttat gggttatgtc attggaagtt

 901  atgggtcctt gccacaagaa cacatcatac aaaaaatcaa agaatgtttt agaaaacttc

 961  ctattaacag gcctattgat tggaaagtat gtcaacgaat tgtgggtctt ttgggttttg

1021  ctgccccatt tacacaatgt ggttatcctg cgttaatgcc cttgtatgca tgtattcaat

1081  ctaagcaggc tttcactttc tcgccaactt acaaggcctt tctgtgtaaa caatacctga

1141  acctttaccc cgttgcccgg caacggccag gtctgtgcca agtgtttgct gacgcaaccc

1201  ccactggctg gggcttggtc atgggccatc agcgcgtgcg tggaaccttt tcggctcctc

1261  tgccgatcca tactgcggaa ctcctagccg cttgttttgc tcgcagcagg tctggagcaa

1321  acattatcgg gactgataac tctgttgtcc tctcccgcaa atatacatcg tatccatggc

1381  tgctaggctg tgctgccaac tggatcctgc gcgggacgtc ctttgtttac gtcccgtcgg

1441  cgctgaatcc tgcggacgac ccttctcggg gtcgcttggg actctctcgt ccccttctcc

1501  gtctgccgtt ccgaccgacc acggggcgca cctctcttta cgcggactcc ccgtctgtgc

1561  cttctcatct gccggaccgt gtgcacttcg cttcacctct gcacgtcgca tggagaccac

1621  cgtga(SEQ ID NO：1)

2)HBV聚合酶片段2序列：

2281                                at gcccctatcc tatcaacact tccggaaact

2341  actgttgtta gacgacgagg caggtcccct agaagaagaa ctccctcgcc tcgcagacga

2401  aggtctcaat cgccgcgtcg cagaagatct caatctcggg aacctcaatg ttagtattcc

2461  ttggactcat aaggtgggga actttactgg tctttattct tctactgtac ctgtctttaa

2521  tcctcattgg aaaacaccat cttttcctaa tatacattta caccaagaca ttatcaaaaa

2581  atgtgaacag tttgtaggcc cacttacagt taatgagaaa agaagattgc aattgattat

2641  gcctgctagg ttttatccaa aggttaccaa atatttacca ttggataagg gtattaaacc

2701  ttattatcca gaacatctag ttaatcatta cttccaaact agacactatt tacacactct

2761  atggaaggcg ggtatattat ataagagaga aacaacacat agcgcctcat tttgtgggtc

2821  accatattct tgggaacaag atctacagca tggggcagaa tctttccacc agcaatcctc

2881  tgggattctt tcccgaccac cagttggatc cagccttcag agcaaacaca gcaaatccag

2941  attgggactt caatcccaac aaggacacct ggccagacgc caacaaggta ggagctggag

3001  cattcgggct gggtttcacc ccaccgcacg gaggcctttt ggggtggagc cctcaggctc

3061  agggcatact acaaactttg ccagcaaatc cgcctcctgc ctccaccaat cgccagacag

3121  gaaggcagcc taccccgctg tctccacctt tgagaaacac tcatcctcag gccatgcagt

3181  gg(SEQ ID NO：2)

2.2siRNA分子库构建：用百奥迈科生物技术有限公司的专利技术构建siRNA分子库(专利号为：ZL 200710024217.6，专利名称：PCR高通量构建siRNA全位点分子库制备方法)，构建流程如图3所示。

成功构建HBV聚合酶基因的siRNA分子库，随机挑取克隆进行测序，其序列长度可控性分布在18-25bp之间，显示出位点及长度的多样性。

实施例2

siRNA表达框的制备与靶位点筛选

1.主要仪器、试剂和材料

1.1仪器：PCR仪(ABI公司)；实时定量PCR仪(Bio-Rad公司)；凝胶电泳设备(北京六一)；长波长紫外灯；细胞培养箱(Thermo公司)等。

1.2材料和试剂：1kb plus DNA Ladder(invitrogen公司)；Pfu DNA聚合酶(百奥迈科公司)；琼脂糖(BBI公司)；dNTP(上海生工)；琼脂糖凝胶纯化试剂盒(百奥迈科公司)，Lipofectamin^TM2000(invitrogen公司)，DMEM培养基(Gibco公司)，TurboCapturemRNA kit(QIAGEN公司)，SensiMix^TM One-Step Kit(Quantace公司)等。其他生化试剂均购于上海生工。

1.3PCR引物(百奥迈科合成)：

5’U6启动子引物：5’-AAGGTCGGGCAGGAAGAGGGC-3’

3’H1启动子引物：5’-TATTTGCATGTCGCTATGTGTTCT-3’

HBV聚合酶正向引物：5’-TGTGGTTATCCTGCGTTAATG-3’

HBV聚合酶反向引物：5’-GCGTCAGCAAACACTTGG-3’

GAPDH正向引物：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’

GAPDH反向引物：5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’

2.siRNA表达框的制备

2.1PCR扩增制备U6-siRNA转录模板-H1表达框：选取8例HBV聚合酶siRNA阳性克隆质粒为模板，用高保真酶Pfu DNA聚合酶通过PCR的方法扩增制备U6-siRNA转录模板-H1表达框(图3为表达框示意图)。

各PCR反应体系为50μl反应体系：0.5μl模板DNA(10-50ng)，1μl 5’U6启动子引物(10μM)，1μl 3’H1启动子引物(10μM)，1μl dNTP(10mM)，0.5μl Pfu DNA聚合酶，用ddH₂O补足到50μl。反应条件为：95℃1min预变性，95℃15sec变性，58℃30sec退火，72℃30sec延伸，20个循环。1.0％琼脂凝胶电泳检测，PCR产物条带单一，片段大小符合实验要求。

2.2表达框PCR产物纯化：1.0％琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增得到的表达框，并用琼脂糖凝胶纯化试剂盒纯化凝胶产物。纯化后的DNA再次进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，纯化后的U6-siRNA转录模板-H1表达框纯度和浓度符合要求，如图4所示。同时用紫外分光光度计测得制备后的表达框浓度约为200ng/μl。

3.靶位点筛选

3.1细胞培养：肝癌细胞HepG22.2.15在含10％FBS的DMEM培养基中，37℃、5％CO₂培养箱培养。

3.2细胞铺板并转染：将细胞按1×10⁵/孔接种到96孔细胞培养板中，在无抗含10％FBS的DMEM培养基中，37℃、5％CO₂培养箱培养过夜。

转染按照Lipofectamin^TM2000的说明书转染，U6-siRNA转录模板-H1表达框DNA量按0.2μg/孔加入。

3.3实时定量PCR检测HBV聚合酶基因mRNA水平：用mRNA提取纯化试剂盒TurboCapture mRNA kit提取纯化细胞RNA，操作按试剂盒说明书进行，用80μl无RNase水/孔溶解RNA，取4μl RNA为模板进行实时定量PCR反应。

用基因特异性引物检测样本中HBV聚合酶基因mRNA表达水平，同时扩增看家基因GAPDH作为内参对照。每个反应做3个平行实验。建立如下25μl的反应体系：4μl模板RNA，12.5μl 2×SensiMix One-Step，1μl 5’正向引物(6μM)，1μl 3’反向引物(6μM)，0.5μl 50×SYBR Green I，用无RNase水补足体系至25μl。反应条件：42℃反转录30min，95℃预变性7min，95℃变性20sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，循环45次。

3.4结果分析：用实时定量PCR 2^-ΔΔct法分析实验结果，并作出柱状图，如图5所示，结果显示对应于HBV聚合酶基因多个位点的siRNA均呈现较好的沉默效果，尤其是HBV-877，相对于未转染组其沉默效果达到90％。

尤其需要说明的是，HBV-877正义链序列与HBV聚合酶基因的第109-126(下划线部分tctcccttatcgtcaatc)相对应。

实施例3

化学合成siRNA验证沉默效果

1.主要仪器、试剂和材料

1.1仪器：核酸合成仪(GE公司)、PCR仪(ABI公司)；实时定量PCR仪(Bio-Rad公司)；细胞培养箱(Thermo公司)等。

1.2材料和试剂：Lipofectamin^TM2000(invitrogen公司)，DMEM培养基(Gibco公司)，TurboCapture mRNA kit(QIAGEN公司)，SensiMix^TM One-Step Kit(Quantace公司)等。其他生化试剂均购于上海生工。

1.3PCR引物(百奥迈科合成)：

HBV聚合酶正向引物：5’-TGTGGTTATCCTGCGTTAATG-3’

HBV聚合酶反向引物：5’-GCGTCAGCAAACACTTGG-3’

GAPDH正向引物：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’

GAPDH反向引物：5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’

2.化学合成制备siRNA

利用百奥迈科生物技术有限公司拥有的核酸合成仪(美国GE公司)分别合成siRNA1的正义链(sense strand)和反义链(antisense strand)的RNA。并进行纯化，将正义链和对应的反义链退火成siRNA双链(duplex)，分装1OD/管，最后冷冻干燥，转染前用无RNase水溶解至20μM。

3.沉默效率验证

3.1细胞培养：肝癌细胞HepG22.2.15在含10％FBS的DMEM培养基中，37℃、5％CO₂培养箱培养。

3.2细胞铺板并转染：将细胞按1×10⁵/孔接种到96孔细胞培养板中，在无抗含10％FBS的DMEM培养基中，37℃、5％CO₂培养箱培养过夜。

转染按照Lipofectamin^TM2000的说明书转染，RNA按10nM/孔加入。

3.3实时定量PCR检测HBV聚合酶基因mRNA水平：用mRNA提取纯化试剂盒TurboCapture mRNA kit提取纯化细胞RNA，操作按试剂盒说明书进行，用80μl无RNase水/孔溶解RNA，取4μl RNA为模板进行实时定量PCR反应。

用基因特异性引物检测样本中HBV聚合酶mRNA表达水平，同时扩增看家基因GAPDH作为内参对照。每个反应做3个平行。建立如下25μl反应体系：4μl模板RNA，12.5μl2×SensiMix One-Step，1μl 5’正向引物(6μM)，1μl 3’反向引物(6μM)，0.5μl50×SYBR Green I，用无RNase水补足体系至25μl。反应条件：42℃反转录30min，95℃预变性7min，95℃变性20sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，循环45次。

3.4结果分析：用实时定量PCR 2^-ΔΔct法分析实验结果，并作出柱状图，如图6所示，结果显示靶向至HBV聚合酶基因的HBV-877的沉默效果达到70％。

Claims (4)

1.一种干扰HBV基因的siRNA分子，其特征在于，具有如下序列结构：

正义链：5’-GAUUGACGAUAAGGGAGANN-3’SEQ ID NO：3，

反义链：5’-UCUCCCUUAUCGUCAAUCNN-3’SEQ ID NO：4，

其中，N是A、T、C、G或U碱基的任何一种。

2.如权利要求1所述的干扰HBV基因的siRNA分子，其特征在于，所述N为T。

3.权利要求1～2中任一项所述的siRNA分子在制备抗病毒药物中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的病毒为乙型肝炎病毒。

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