CN1526818A - 一种阻断乙肝病毒表达的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种阻断乙肝病毒表达的方法。目的是能够通过该方法使乙肝病毒的表达阻断。本发明提供的阻断乙肝病毒表达的方法是使用RNAi技术阻断乙肝病毒HBV在人肝细胞中的表达。具体提供了四组siDNA序列，并提供了包含上述四种siDNA的质粒siDNA－1，－2，－3和－4－pBS/U6－GFP及其构建方法。本发明将RNAi技术用于阻断乙肝病毒的表达，将在乙型肝炎的治疗中起到重要作用。

Description

一种阻断乙肝病毒表达的方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域中一种阻断乙肝病毒表达的方法。
背景技术
乙型肝炎由乙肝病毒(HBV)感染引起，是病毒感染性疾病中最普遍的一种，是一种世界性分布的疾病。在东南亚和非洲部分地区感染率高达20％，估计世界范围内有2-3亿的HBV携带者。慢性HBV在成人中有1-10％的发病率，儿童中更高，在HBeAg阳性的母亲所生的婴儿中感染率为100％。
HBV是一种直径为42nm小型嗜肝DNA病毒(hepatotropic DNA virus)，由外面的包被和核心组成。表面抗原是HBV包被的主要成分，并作为诊断HBV感染的主要指标。HBV病毒的核心由核心抗原(HBcAg)、DNA聚合酶/反转录酶和病毒基因组组成。HBV基因组大小为3,200bp，其部分基因及其编码产物如表1所示。
                             表1、HBV基因组部分基因及其编码产物
        基因                           功能
  Pre-Surface1 编码表面抗原HBsAg，诊断主要指标
  Pre-Surface2
  Surface
  Pre-Core 编码e抗原(HBeAg)血清指标
  Core 编码核心抗原(HBcAg)，核结构蛋白
  P-基因 编码DNA聚合酶/反转录酶，病毒复制
  X-基因 编码x抗原(HBxAg)，功能未定
乙肝病毒(HBV)的感染是导致慢性肝炎、肝硬化并转化为肝癌的主要原因。对HBV感染的研究已经比较深入，这包括针对HBV急性和慢性感染的研究。目前在某些病人中对HBV感染的治疗方法主要是用干扰素-α和-β，或与合成的抗病毒药物或其它药物合用，也可用基因疗法。但是不同病人(包括急性和慢性乙肝病人)来源的HBV的基因组有较大程度的突变，这种基因差异给乙肝病毒的治疗带来了很大的困难。
最近几年新兴的、特别是在哺乳动物抗病毒研究中应用的RNA干扰(RNAi)技术能高效阻断某个特定基因的表达，其研究成果，如对阻断HIV表达方面的研究(Lee，N，S.，Dohjima，T.，Bauer，G.，Li，H.，Li，M.J.，Ehsani，A.，Dalvaterra，P.and Rossi，J.(2002)Nature Biotechnology，19，500-505)，和另一类导致肝硬化的HCV的研究(Kapadia，S.B.，Brideau-Andersen，A.and Chisari，F.V.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，100，2014-2018)等已经在RNAi领域引起了巨大反响。
RNAi最初是在植物、线虫(Caenorhabditis elegans)和果蝇(Drosophila)中发现的一种抗病毒的机制，即转录后的基因沉默机制(PTGS)。它是由双链RNA(dsRNA)诱导出的现象。在这个过程中，1)dsRNA被一种类似于RNaseIII的酶(被称作Dicer)切成21-23nt(nucleotide)的双链RNA即siRNA(Cullen，B.R.(2002)Nat.Immunol.3，597-599；Hannon，G.J.(2002)Nature 418，244-251；Tuschl，T.(2001)Chembiochem 2，239-245；Sharp，P.A.(2001)Genes Dev.15，485-490；Moss，E.G.(2001)Curr.Biol.11，R772-R775)；2)这些siRNA小分子与一种蛋白质复合物，也被称为RNA-诱导的沉默复合物(RNA induced silencing complex，RISC)特异性结合；3)RISC直接结合于与此siRNA核酸序列同源的mRNA部位上(例如HBV转录后形成的mRNA上)；4)目的mRNA在与21-23nt同源部分的中间被切断，从而降解而失去功能(Cullen，B.R.(2002)Nat.Immunol.3，597-599；Hannon，G.J.(2002)Nature 418，244-251；Tuschl，T.(2001)Chembiochem 2，239-245；Sharp，P.A.(2001)Genes Dev.15，485-490；Moss，E.G.(2001)Curr.Biol.11，R772-R775)。RNAi作用的最大特点是它非常专一的抑制与其序列同源的基因序列，而对其它无关序列毫无影响。近年来，RNAi技术正在广泛地应用于特别是由于病毒引起的疾病，被称为“一种全新的、激动人心的新技术”(Song，E.，Lee，S.K.，Wang，J.，Ince，N.，Ouyang，N，Min，J.，Chen，J.，Shankar，P.，and Lieberman，J.(2003)Nature Medicine；10.1038/nm828)。
RNAi在动物体中同样存在(Cullen，B.R.(2002)Nat.Immunol.3，597-599；Yu，J.Y.，DeRuiter，S.L.and Turner，D.L.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99，6047-6052；Brummelkamp，T.R.，Bernards，R.and Agami，R.(2002)Science 296，550-553；Sui，G.，Soohoo，C.，Affarel，B.，Gay，F.，Y.andForrester，W.C.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99，5515-5520)，例如它可以阻断HCV(hepatitis C virus)，HIV-1(human immunodeficiency virus-1)，FHV(flock house virus)，Rous sarcoma virus，dengue virus和poliovirus等病毒的表达(Kapadia，S.B.，Brideau-Andersen，A.and Chisari，F.V.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，100，2014-2018)，但这些病毒多是RNA病毒，而HBV是双链DNA病毒。
发明内容
本发明的目的是提供一种阻断乙肝病毒表达的方法。
本发明提供的阻断乙肝病毒表达的方法是使用RNAi技术阻断乙肝病毒HBV在人肝细胞中的表达。
本发明提供了四组siDNA序列：
1)siDNA-1
SEQ ID № I(正义链1a)：5’GGCTGCTATGCCTCATCTTCTA 3’
SEQ ID № II(反义链1b)：5’AGCTTAGAAGATGAGGCATAGCAGCC 3’
SEQ ID № III(正义链2a)：5’AGCTTAGAAGATGAGGCATAGCAGCCCTTTTTG 3’
SEQ ID № IV(反义链2b)：5’AATTCAAAAAGGGCTGCTATGCCTCATCTTCTA 3’
2)siDNA-2
SEQ ID № V(正义链1a)：5’GGCCTATGGGAGTGGGCCTCAA 3’
SEQ ID № VI(反义链1b)：5’AGCTTTGAGGCCCACTCCCATAGGCC 3’
SEQ ID № VII  (正义链2a)：5’AGCTTTGAGGCCCACTCCCATAGGCCCTTTTTG 3’
SEQ ID № VIII(反义链2b)：5’AATTCAAAAAGGGCCTATGGGAGTGGGCCTCAA 3’
3)siDNA-3
SEQ ID № IX(正义链1a)：5’GGAAGCCTCCAAGCTGTGCCTA 3’
SEQ ID № X(反义链1b)：5’AGCTTAGGCACAGCTTGGAGGCTTCC 3’
SEQ ID № XI(正义链2a)：5’AGCTTAGGCACAGCTTGGAGGCTTCCCTTTTTG 3’
SEQ ID № XII(反义链2b)：5’AATTCAAAAAGGGAAGCCTCCAAGCTGTGCCTA 3’
4)siDNA-4
SEQ ID № XIII(正义链1a)：5’GGAAGAAGAACTCCCTCGCCTA 3’
SEQ ID № XIV(反义链1b)：5’AGCTTAGGCGAGGGAGTTCTTCTTCC 3’
SEQ ID № XV(正义链2a)：5’AGCTTAGGCGAGGGAGTTCTTCTTCCCTTTTTG 3’
SEQ ID № XVI(反义链2b)：5’AATTCAAAAAGGGAAGAAGAACTCCCTCGCCTA 3’
包含上述四组DNA的质粒及细胞系均属于本发明的保护范围。具体的质粒为siDNA-1，-2，-3和-4-pBS/U6-GFP。
质粒siDNA-1，-2，-3和-4-pBS/U6-GFP的通用结构如图2所示。
质粒siDNA-1，-2，-3和-4-pBS/U6-GFP的构建方法为：分别将siDNA-1、siDNA-2、siDNA-3、siDNA-4的正义链1a/反义链1b和正义链2a/反义链2b之间由设计在序列中的HindIII酶切位点连接，连接后的片断分别插入到pBS/U6质粒中的ApaI和EcoRI的酶切位点之间。GFP(绿色荧光蛋白，green fluorescence protein)片断插入到siDNA的3’末端的SmaI位点上。
本发明提供了四种siDNA核苷酸序列，并在质粒pBS/U6的基础上，将质粒改造为可表达GFP的质粒，与共转染相比，可以作为更好的siDNA转染标记。
本发明筛选的含有siDNA的稳定细胞系将对用RNAi技术治疗HBV感染的下一步研究提供不可缺少的实验材料，也属于本发明的保护范围。并将在乙肝病毒的治疗中起到重要作用。
附图说明
图1用于克隆siDNA的pBS/U6质粒图谱
图2质粒siDNA-1，-2，-3和-4-pBS/U6-GFP的通用结构图谱
图3为经过FACS(Fluorescence-Activated Cell Sorting)对含有荧光-siDNA的HepG2.2.15细胞分离后的可见光和荧光显微镜观察图
图4为经过不同siDNA转染的细胞所产生的HBV表面抗原的相对浓度与时间的关系曲线
图5为不同细胞所产生的HBV表面抗原的相对浓度直方图
具体实施方式
材料
细胞及质粒
1、质粒的构建是以E.coli DH5α为宿主进行的；
2、HBV阳性细胞系为HepG2.2.15；
3、用于克隆siDNA的质粒为pBS/U6，其图谱见附图1；
4、GFP(绿色荧光蛋白，green fluorescence protein)cassette是从InvitrogenLife Technology的pCR3.1-Uni中克隆出来，它包括GFP的功能区(753bp)及其两侧的从PCMV到“BGH polyadenylation”之间的1739bp，同时在GFP序列前添加了NLS(nucleic-location-site)序列区。
实施例1、siDNA(small interfering DNA)的设计
从GenBankTM得到不同来源的HBV的DNA序列共计19套，其GenBankTM序号见表2：
表2、用于设计siDNA的HBV序列(GenBankTM序号)
    Sequence NO.     GenBank NO.
    Sequence 1     AB076679
    Sequence 2     AB076678
    Sequence 3     AY090461
    Sequence 4     AY090460
    Sequence 5     AY090459
    Sequence 6     AY090458
    Sequence 7     AY090457
    Sequence 8     AY090456
    Sequence 9     AY090455
    Sequence 10     AY090454
    Sequence 11     AY090453
    Sequence 12     AY090452
    Sequence 13     E10905
    Sequence 14     NC_003977
    Sequence 15     AB074756
    Sequence 16     AB074755
    Sequence 17     AB064316
    Sequence 18     AB064315
    Sequence 19     AB064314
对上述19套HBV的DNA序列进行同源性分析，以其共有的保守区(长度大于19nt)设计siDNA。共设计了4套siDNA，设计原则为：
1、天然U6启动子，包含3个G，转录从此起始，这三个G在RNAi构建中被改造，作为siRNA的一部分。在pBS/U6载体中，在U6启动子后，紧跟着一个ApaI(GGGCCC)位点。用ApaI对pBS/U6载体酶切消化，用Klenow或T4-DNA聚合酶切成平端，还留下一个G，因此为了将2个G放回去，第一个oligo(oligo 1a)应该以“GG”开始，第二个oligo(即互补的oligo 1b)应该以“CC”结束。
2、在第二对oligo中，oligo 2a应该有“CCC”，“CCC”后应该是“TTTTT”(用于Pol III转录终止)和一个EcoR I酶切位点(用于将oligo亚克隆到载体中)。在oligo 2b中，需要有“GGG”和EcoR I酶切位点。
3、在两对oligo之间，用HindIII来连接，因此所有四个oligo都需要有HindIII识别序列。
4、确定所设计的oligo中没有EcoR I位点和Hind III位点，如果有，选择其它酶切位点来进行亚克隆。下面是用来构建各个RNAi载体的oligo的格式：
Oligo 1a  5’GG….A 3’
Oligo 1b  3’CC….TTCGA 5’
Oligo 2a  5’AGCTT….CCC TTTTT G 3’
Oligo 2b  3’A….GGG AAAAA CTTAA 5’
其中Oligo 1a，1b反向互补，Oligo 2a，2b反向互补；1a和2b的基因组DNA(与需阻断的基因组内同源的序列)相同，2a和1b的基因组DNA的序列相同。这样最终得到的siDNA，是一个完全的反向重复，转录出来的这个RNA将折叠成发卡结构，可以很好地作为siRNA起作用。用于设计siDNA的HBV保守序列如表3所示：
             表3、用于设计siDNA的HBV保守序列
            用于设计siDNA的HBV序列保守区 nt 序列所在的蛋白编码区*
1 (404)TTC CTC TTC ATC CTG CTG CTA TGC CTC ATC TTC TT* 35  P-1 and HBsAg
2 (640)CCT ATG GGA GTG GGC CTC AG 20  P-1 and HBsAg
3 (1866)TTC AAG CCT CCA AGC TGT GCC TTG G 25  HBeAgCore
4 (2373)GAA GAA GAA CTC CCT CGC CTC GCA GAC G 28  HBeAgCore和P-2
*P：聚合酶1-1626(P-1)and 2310-3215(P-2)；HBsAg：表面抗原(LHBS，MHBS，HBsAg)1-838 and 2851-3215；HBeAgCore：1817-2455；X-protein：1377-1841。数字表示核苷酸在基因组中的位置。
所设计的siDNA为：
1)siDNA-1
SEQ ID № I(正义链1a)：5’GGCTGCTATGCCTCATCTTCTA 3’
SEQ ID № II(反义链1b)：5’AGCTTAGAAGATGAGGCATAGCAGCC 3’
SEQ ID № III(正义链2a)：5’AGCTTAGAAGATGAGGCATAGCAGCCCTTTTTG 3’
SEQ ID № IV(反义链2b)：5’AATTCAAAAAGGGCTGCTATGCCTCATCTTCTA 3’
2)siDNA-2
SEQ ID № V(正义链1a)：5’GGCCTATGGGAGTGGGCCTCAA 3’
SEQ ID № VI(反义链1b)：5’AGCTTTGAGGCCCACTCCCATAGGCC 3’
SEQ ID № VII(正义链2a)：5’AGCTTTGAGGCCCACTCCCATAGGCCCTTTTTG 3’
SEQ ID № VIII(反义链2b)：5’AATTCAAAAAGGGCCTATGGGAGTGGGCCTCAA 3’
3)siDNA-3
SEQ ID № IX(正义链1a)：5’GGAAGCCTCCAAGCTGTGCCTA 3’
SEQ ID № X(反义链1b)：5’AGCTTAGGCACAGCTTGGAGGCTTCC 3’
SEQ ID № XI(正义链2a)：5’AGCTTAGGCACAGCTTGGAGGCTTCCCTTTTTG 3’
SEQ ID № XII(反义链2b)：5’AATTCAAAAAGGGAAGCCTCCAAGCTGTGCCTA 3’
4)siDNA-4
SEQ ID № XIII(正义链1a)：5’GGAAGAAGAACTCCCTCGCCTA 3’
SEQ ID № XIV(反义链1b)：5’AGCTTAGGCGAGGGAGTTCTTCTTCC 3’
SEQ ID № XV(正义链2a)：5’AGCTTAGGCGAGGGAGTTCTTCTTCCC TTTTTG 3’
SEQ ID № XVI(反义链2b)：5’AATTCAAAAAGGGAAGAAGAACTCCCTCGCCTA 3’
实施例2、质粒的构建
分别将siDNA-1、siDNA-2、siDNA-3、siDNA-4的正义链1a/反义链1b和正义链2a/反义链2b之间由设计在序列中的HindIII酶切位点连接，连接后的片断插入到pBS/U6质粒中的ApaI和EcoRI的酶切位点之间。GFP(绿色荧光蛋白，greenfluorescence protein)片断插入到siDNA的3’末端的SmaI位点上，经过DNA序列测定，证明所克隆的siDNA片断已经正确插入，可用于转染人肝细胞系HepG2.2.15(质粒的结构见附图2)。用于质粒克隆的宿主为E.coliDH5α，培养基为添加0.1g/lAmpicillin(青霉素(Sigma))的LB培养基。
实施例3、siDNA-pBS/U6-GFP的转染
1.HBV阳性的人肝细胞系HepG2.2.15用添加10％FBS的DMEM(GIBCO)高糖培养基，在含5％CO2的37℃培养箱中静置培养。
2.siDNA-pBS/U6-GFP质粒转染是用Effectene Transfection Reagent(QIAGEN)试剂盒完成的，具体操作如下：
(1)转染前24小时在含10％血清(FBS)的DMEM培养基的六孔板上接种约0.5-2×105个HBV阳性的人肝细胞系HepG2.2.15细胞，37℃培养至转染前；
(2)转染前观察细胞生长正常，并且密度在40-80％饱和度之间；
(3)在1.5ml离心管中将0.4μg siDNA-pBS/U6-GFP质粒DNA(浓度不低于0.1μg/μl)用pH7-8的TE溶解，加入Buffer EC至终体积100μl，加入3.2μl Enhancer，振荡器振荡1秒钟；
(4)室温(15-25℃)放置2-5分钟，稍加离心，将管壁上的液滴甩下来；
(5)加入10μl Effectene Transfection Reagent，用移液枪上下吹吸5次；
(6)室温放置5-10分钟以形成转染复合体；
(7)在放置5-10分钟期间，将6孔板中阳性的人肝细胞系HepG2.2.15细胞培养上清液吸去，用2ml PBS洗细胞一次，加入1.6ml新鲜培养基；
(8)加入600μl培养基到转染复合体中，用移液枪上下吹吸2次，将转染复合物迅速滴加到六孔板的细胞上，轻轻混合均匀，37℃继续培养；
(9)如果出现细胞毒性，在转染后6-18小时弃去培养基，用PBS冲洗一次，换上新鲜培养基。
实施例4、FACS(Fluorescence-Activated Cell Sorting)分选细胞和荧光观察
转染前后的细胞用LEICA MPS60(Solms，Germany)荧光显微镜观察并采集图像。经转染的细胞在荧光显微镜下可见明显的绿色荧光。经过siDNA-pBS/U6-GFP转染的HepG2.2.15细胞经48h培养后用FACSDiva仪器(Becton Dickinson Bioscience，IOWA，USA)分离带有GFP荧光的细胞(即带有siDNA的细胞)并收集起来，继续培养。结果如图3所示，表明FACS技术可有效地将带有GFP(即带有siDNA)的细胞分选出来。
实施例5、经过不同siDNA转染的细胞所产生的HBV表面抗原的相对浓度与时间的关系
以HBV阳性的人肝细胞系HepG2.2.15和只含pBS/U6-GFP(不含siDNA)质粒的HBV阳性的人肝细胞系HepG2.2.15细胞作为对照细胞。用含有不同siDNA的质粒转染HBV阳性的人肝细胞系HepG2.2.15细胞，经过48h培养后，根据细胞是否含有荧光，用FACS技术将含有荧光的细胞分离并收集起来，继续培养，同时与培养的对照细胞一起，在不同的培养时间，取培养上清液，用“乙肝表面抗原测定试剂盒S-01”(英科新创，厦门，中国)根据厂家提供的ELISA方法测定上清液中的HBV表面抗原HBsAg含量，以测定不同siRNA对HBV表达的抑制程度。
结果如图4所示，表明不同细胞所产生的HBsAg的量，随着培养时间的延长而增高。其中两个对照细胞：HBV阳性的人肝细胞系HepG2.2.15和只含pBS/U6(不含siDNA)质粒的HBV阳性的人肝细胞系HepG2.2.15细胞所产生的sAg增高程度相近，并且作为对照，计算siRNA的抑制率；而经不同siDNA(siDNA-1，-2和-4)--pBS/U6-GFP转染的细胞与对照细胞相比，产生HBsAg的速度明显减慢，产生量也有不同程度的明显下降。这说明了不同siRNA对HBV表面抗原的表达有不同程度的抑制作用。图4中，所标的时间是经FACS分离后细胞培养的时间；HepG2.2.15是未经过任何质粒转染的、HBV阳性的稳定细胞系；pBS/U6是不含有siDNA的、经过pBS/U6-GFP转染的HepG2.2.15细胞；siRNA-1，-2，-4分别代表经过siDNA-1，-2和-4-pBS/U6-GFP质粒转染的HepG2.2.15细胞。
实施例6、不同siRNA对HBV表面抗原表达的抑制效率
用不同siDNA转染的HepG2.2.15细胞、经FACS分离后培养120h，用FACS技术将含有荧光的细胞收集起来，与培养120h的HBV阳性的人肝细胞系HepG2.2.15和培养120h的只含pBS/U6(不含siDNA)质粒的HBV阳性的人肝细胞系HepG2.2.15细胞共同测量HBV表面抗原HBsAg含量，测定方法同实施例5。结果如图5所示，图中，HepG2.2.15是未经过任何质粒转染的、HBV阳性的稳定细胞系；pBS/U6是不含有siDNA的、经过pBS/U6-GFP转染的HepG2.2.15细胞；siRNA-1，-2，-3，-4分别代表经过siDNA-1，-2，-3和-4-pBS/U6-GFP质粒转染的HepG2.2.15细胞。
图5的结果如表4所示，表明，siRNA-1对HBV表面抗原的抑制率可达80％，其次为siRNA-3为60％；siRNA-2和-4也分别对HBsAg的产生有明显的抑制作用，其抑制率分别为21.9％和39％。其中以不含siDNA的、经pBS/U6-GFP转染的细胞作为对照。
                表4、不同siRNA对HBV表面抗原表达的抑制效率。
pBS/U6 siDNA-1 siDNA-2 siDNA-3 siDNA-4
抑制率(％) 0 80±8.8 21.9±1.1 60* 39.0±0.041
*未列入说明书附图4、5。
                        序列表
<160>16
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
ggctgctatg cctcatcttc ta    22
<210>2
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
agcttagaag atgaggcata gcagcc    26
<210>3
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
agcttagaag atgaggcata gcagcccttt ttg    33
<210>4
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4
aattcaaaaa gggctgctat  gcctcatctt  cta    33
<210>5
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>5
ggcctatggg agtgggcctc aa    22
<210>6
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6
agctttgagg cccactccca taggcc    26
<210>7
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>7
agctttgagg cccactccca taggcccttt ttg    33
<210>8
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>8
aattcaaaaa gggcctatgg gagtgggcct caa    33
<210>9
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>
<400>9
ggaagcctcc aagctgtgcc ta    22
<210>10
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>10
agcttaggca cagcttggag gcttcc    26
<210>11
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>11
agcttaggca cagcttggag gcttcccttt ttg    33
<210>12
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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aattcaaaaa gggaagcctc caagctgtgc cta    33
<210>13
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<212>DNA
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ggaagaagaa ctccctcgcc ta    22
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<212>DNA
<213>人工序列
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agcttaggcg agggagttct tcttcc    26
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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agcttaggcg agggagttct tcttcccttt ttg    33
<210>16
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>16
aattcaaaaa gggaagaaga actccctcgc cta    33

Claims (11)

1、一种阻断乙肝病毒表达的方法，其特征在于：使用RNAi方法阻断乙肝病毒在人肝细胞中的表达。
2、根据权利要求1所述的阻断乙肝病毒表达的方法，其特征在于：所述RNAi方法中的siDNA为序列表中下述四组核苷酸片断：SEQ ID № I、SEQ ID № II、SEQ IDNo III和SEQ ID № IV。
3、根据权利要求1所述的阻断乙肝病毒表达的方法，其特征在于：所述RNAi方法中的siDNA为序列表中下述四组核苷酸片断：SEQ ID № V、SEQ ID № VI、SEQ ID№ VII和SEQ ID № VIII。
4、根据权利要求1所述的阻断乙肝病毒表达的方法，其特征在于：所述RNAi方法中的siDNA为序列表中下述四组核苷酸片断：SEQ ID № IX、SEQ ID № X、SEQ ID№ XI和SEQ ID № XII。
5、根据权利要求1所述的阻断乙肝病毒表达的方法，其特征在于：所述RNAi方法中的siDNA为序列表中下述四组核苷酸片断；SEQ ID № XIII、SEQ ID № XIV、SEQ ID № XV和SEQ ID No XVI。
6、一种包含权利要求2、3、4或5所述siDNA的质粒。
7、根据权利要求6所述的质粒，其特征在于：所述质粒为siDNA-1-pBS/U6-GFP，siDNA-2-pBS/U6-GFP，siDNA-3-pBS/U6-GFP和siDNA-4-pBS/U6-GFP。
8、一种构建权利要求7所述质粒的方法：将siDNA序列由设计在序列中的HindIII酶切位点连接，连接后的片断插入到pBS/U6质粒中的ApaI和EcoRI的酶切位点之间，得到目的质粒。
9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述质粒中还包括GFP标记；所述GFP片断插入到siDNA的3’末端的SmaI位点上。
10、根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述siDNA选自siDNA-1、siDNA-2、siDNA-3或siDNA-4中的任意一种。
11、一种包含权利要求6、7、8、9所述siDNA的的细胞系。
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