CN1740315A - 一种转基因小鼠肝病动物模型、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种转基因小鼠肝病动物模型，该转基因小鼠动物模型的基因组整合有DNA片段LLTK，所述DNA片段LLTK由小鼠白蛋白基因启动子ALB/pro与增强子ALB/en，以及受其调控的下游基因单纯疱疹病毒胸苷嘧啶激酶(HSV－TK)cDNA构成。本发明还公开了该转基因小鼠动物模型的制备方法以及应用，通过尾静脉注射GCV诱导肝脏产生临床生化指标与病理形态学与人类毒素诱导的肝炎有关疾病。该动物模型损伤易控制，机制较明了，症型较明确，模型稳定可重复。可用于筛选治疗肝病(肝炎)的药物，评价治疗肝病(肝炎)的方法。

Description

一种转基因小鼠肝病动物模型、其制备方法及应用

技术领域

本发明属于医疗评价、检测技术领域，具体地说，本发明是关于一种转基因小鼠肝病动物模型、其制备方法及应用。

背景技术

肝脏疾病是人类最常见的疾病之一，严重威胁着人类健康。动物模型可容许复制某些不能直接在人类身上进行观察与研究的疾病，作为医学研究的重要手段。肝病动物模型的建立，为探讨肝病的发病机制、病理生理过程、病理形态改变及药物防治开拓了广阔的前景。但要选择性的杀死动物体的某些特定类型的细胞，从而模仿某种疾病，现在的方法很有限。例如，通过外科手术或激光，不能在分子水平上指定细胞，而能够自动指向特定细胞的物质也很少。现在常用于建立肝病模型的手段有：通过外科手术胆总管结扎等机械刺激；免疫损伤(白蛋白尾静脉注射、异种动物血清腹腔注射)；酒精或营养不良；病原体感染；化学物质中毒所致的损伤；较为常用的化学物质有D-氨基半乳糖(Gal-NH₂)、刀豆素A、N-乙基亚硝胺(DEN)、硫代乙酰胺、四氯化碳(CCl₄)。1979年，Galanos等采用半乳糖胺诱导小鼠中毒性肝损伤，肝损伤机制主要是干扰核酸及蛋白质的合成，造成内毒素血症，产生氧自由基及脂质过氧化导致膜机能障碍，损伤线粒体致氧化磷酸化受损等(GalanosC.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1979 Nov；76(11)：5939-43)。1992年Tiegs等发展的刀豆素A静脉注射小鼠诱导肝脏损伤(Tiegs G.et al.J.Clin.Invest.1992 Jul；90(1)：196-203)。这类模型类似于人类的病毒性肝炎，被广泛用在药物筛选的研究，然而，症状往往是暴发性的。使用N-乙基亚硝胺(DEN)、硫代乙酰胺不易掌握剂量。CCl₄是最早最广泛使用的诱发实验性肝纤维化的肝毒素，被用于多种实验动物，通过胃管灌食法、皮下注射或者吸入给药产生慢性或急性肝中毒(Allis JW.et al.Fundamental and Applied Toxicology.15：558-570，1990；Pritchard DJ et al.Journal of Applied Toxicology.7：229-236，1987；Ray SD et al.Fundamental and Applied Toxicology.15：429-440，1990)。然而，由于CCl₄毒性较大，动物成活率不高、模型的稳定性，可重复性较低。

转基因动物技术是近二十年来发展起来的生命科学领域中的一个全新技术，在医药学领域中，既可作为“生物反应器”应用，也可作为疾病动物模型用于疾病发生机制及化疗药物筛选研究。转基因动物的基本方法和原理都是建立在基因片段交换重组(质粒重组)，基因特异性表达及染色体体外基因转移的基础上。但当用基因工程的方法引起特定组织表达蛋白毒素时，动物会在生命的早期死亡，用这些方法不能在实验上加以控制。如90年代中期，发展的肝脏疾病小鼠模型：alb-uPA转基因小鼠。Sangren等通过将尿激酶血纤维蛋白溶酶原激活因子uPA基因插入到白蛋白启动子下游，以介导其在肝脏中特异的表达来产生肝脏毒性(Sangren EP.et al.Cell，1991，66：245～256)。一般情况，大部分uPA分泌到血液，因而被认为是血栓溶解剂因子。在该模型，一些uPA仍保留在肝脏引起严重的炎症。与uPA小鼠移植模型相似的另一模型是富马酰乙酰乙酸盐水解酶(FAH)基因敲除小鼠(Grompe M.et al.Genes.Dev.，1993，7(12A)：2298～2307)。该模型由Grompe等发展作为人类遗传性酪氨酸血症I型(HT1)的动物模型。该模型小鼠缺乏FAH，酪氨酸分解代谢的最后一步受到阻碍，导致富马酰乙酰乙酸盐(FAA)和前体(MAA)底物的聚集，FAA与MAA对肝脏有毒性。这两个模型均为肝脏遗传性疾病小鼠。然而，alb-uPA转基因小鼠和FAH^-转基因小鼠的饲养与繁殖有一定的局限性，因为只有在外加条件(药物)的作用下，小鼠才不会死亡，也不发生肝脏功能衰竭。其肝脏功能的正常需要靠药物维持。

Heyman等最早在1989年提出TK敲除(TK obliteration)的概念(Heyman，R.A.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2698-2702，1989)，即在转基因小鼠体内通过细胞类型特异性启动子敲除特定细胞。单纯疱疹病毒胸苷嘧啶激酶(HSV-TK)不同于哺乳动物的核苷激酶，HSV-TK有效地磷酸化核苷以及核苷类似物如更昔洛韦(GCV)，阻碍DNA合成，从而导致细胞的死亡。其作用机理是：HSV-TK基因编码胸苷激酶，该酶可将核苷类似物(NA)无毒性抗病毒药物GCV代谢为二磷酸化合物，后者在细胞内酶的作用下产生三磷酸GCV；三磷酸GCV有毒性，它可以明显抑制细胞DNA聚合酶，从而抑制蛋白质的合成，杀伤细胞。单独HSV-TK或者GCV对机体基本无影响。这一系统允许研究者通过GCV控制细胞敲除的时间与阶段，是理解特定细胞类型的生理功能的有效手段。如在细胞特异性启动子控制下敲除生长激素分泌细胞，T细胞和B细胞，白介2，4表达细胞，树突状细胞，纤维原细胞(Borrelli，E.et al.Nature(London)339：538-541，1989；Dzierzak，E.et al.Int.Immunol.5：975-984，1993；Kamogawa，Y.et al.Cell 75：985-995，1993；Minasi，L.E.et al.J.Exp.Med.177：1451-1459，1993；Salomon，B.et al.J.Immunol.152：537-548，1994；Bin Tian et al.American Journal of Pathology，Vol.163，No.2，August2003)。

发明内容

本发明的目的就在于提供一种损伤可诱导与调控的转基因小鼠肝病动物模型。

本发明的另一个目的在于提供一种损伤可诱导与调控的转基因小鼠肝病动物模型的制备方法。

本发明的又一个目的在于提供一种损伤可诱导与调控的转基因小鼠肝病动物模型的应用。

由于小鼠生长周期短，易于饲养管理，容易获得已经定性的近交交配鼠和遗传突变体，作为实验动物较为经济实惠，是基因组结构、个体发育过程、组织细胞结构等与人类相近的模式生物体系。

白蛋白基因启动子ALB/pro在进化过程中的高度保守性，及其高度的肝脏细胞特异性调控机制使ALB/pro成为适于肝脏细胞特异表达调控研究的启动子。

我们用白蛋白基因增强子ALB/en和ALB/pro调控单纯疱疹病毒胸苷嘧啶激酶(HSV-TK)在成体肝脏特异表达，利用小鼠制造肝损伤实验动物模型。该种模型如果仅有HSV-TK的表达而没有人为给与GCV，对机体基本没有影响，故易于饲养繁殖。

本发明的关键在于利用HSV-TK的GCV药物敏感性与小鼠白蛋白基因启动子与增强子的肝脏特异性调控，产生转基因小鼠，通过GCV的注射产生肝脏损伤，并通过GCV给药的时间与剂量实现肝脏损伤的可调控。

该转基因小鼠的制备方法包括下列步骤：

一、小鼠白蛋白基因启动子ALB/pro的克隆；

二、小鼠白蛋白基因增强子ALB/en的克隆；

三、PCR扩增得到HSV-TK cDNA；

四、以HSV-TK cDNA为目的基因，ALB/pro与ALB/en为调控元件，构建肝脏特异性杀伤载体pLLTK；

五、限制性内切酶酶切线性化pLLTK，回收并纯化约4130bp的片段；

六、显微注射小鼠雄原核，得到阳性转基因小鼠。

本方法产生的小鼠肝病模型损伤易控制，机制较明了，症型较明确，模型稳定可重复。由于在肝脏特异性调控元件的控制下目的基因组织特异性表达，损伤特异性强，与一般的毒素蛋白表达的转基因动物模型相比，易于饲养繁殖。可用于筛选治疗肝炎的药物，评价治疗肝炎的方法。

附图说明

图1为质粒pLLTK的构建流程图。

图2为pLLTK的酶切鉴定电泳图谱，其中M：1kb marker；1：AgeI+XhoI：1.9kb+6.5kb；2：KpnI：2.1kb+6.3kb。

图3为F0和F1代转基因小鼠的PCR检测结果，其中1：阳性对照；2：阴性对照；3：空白对照；4：阳性转基因小鼠F0代；M：marker 100bp；5～13：F1代转基因小鼠后代。

图4为F2代转基因小鼠的PCR检测结果，其中1～10：F2代转基因小鼠；11：阳性转基因小鼠F1代；12：空白对照；13：阴性对照：14：阳性对照；M：marker 100bp。

图5为F3代转基因小鼠的PCR检测结果，其中1～11：F3代转基因小鼠；12：空白对照；13：阴性对照；14：阳性对照；15：阳性转基因小鼠F2代；M：marker 100bp。

图6为转基因小鼠的HSV-TK表达的琼脂糖凝胶电泳图，其中M：marker100bp；1：空白对照；2：阴性对照；3：阳性对照；4：心；5：肝；6：脾脏；7：肾脏；8：脑；9：胰腺；10：肠；11：血；12：皮肤；13：睾丸。

图7为免疫组化分析HSV-TK蛋白表达情况示意图，其中A为TK小鼠肝脏；C为TK小鼠肾脏；B为非转基因小鼠肝脏；D为非转基因小鼠肝脏肾脏。

图8为GCV处理前后生化值的变化示意图。

图9为肝脏组织HE染色的结果示意图，A、C为GCV处理后TK小鼠肝脏；B为未处理TK转基因小鼠肝脏；D为GCV处理后ALB转基因小鼠肝脏。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步的说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

实施例1  小鼠白蛋白启动子ALB/pro的克隆

尾静脉采取昆明白小鼠外周血200μl，按照常规酚氯仿法提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，通过巢式PCR扩增昆明白小鼠白蛋白基因启动子ALB/pro，具体如下：

1、引物：

prol kpn I：5′-cttaggtacctccatgccaaggcccaca-3′

pro2 Age I：5′-cgtataccggtagtggggttgataggaaagg-3′

2、反应体系：

模版：                    1.0μl

10×buffer                2.5μl

dNTP(25mM)                2.5μl

pro3(10mM)                1.0μl

pro4(10mM)                1.0μl

TagE(5U/μl)              0.25μl

ddH₂O                   16.75μl

                          25.0μl

3、循环参数条件：

94℃  5分钟；

95℃  30秒-1分钟，50℃-55℃  30秒-1分钟，72℃  30秒-1分钟，共28-35不个循坏；

72℃  10分钟。

通过以上扩增得到SEQ ID No.1所示的昆明白小鼠白蛋白基因启动子ALB/pro，全长335bp，位于转录起始点下游310bp到上游25bp。

实施例2  鼠白蛋白基因增强子ALB/en的克隆

以昆明白小鼠基因组DNA为模板，通过PCR扩增克隆小鼠白蛋白基因增强子ALB/en，具体如下：

1、引物：

en1：5′-acgag tctaga gtggagctta cttctttgatttga-3′

en2kpnI：5′-aaacggtaccatgccatgtaaatcaact-3′

2、反应体系：

DNA(20-100ng)：      1.0μl

10×buffer           2.5μl

dNTP(25mM)           2.5μl

en1(10mM)            1.0μl

en2(10mM)            1.0μl

TagE(5U/μl)         0.25μl

ddH₂O              16.25μl

                     25.0μl

3、循环参数条件：

94℃  5分钟；

95℃  30秒-1分钟，50℃-55℃  30秒-2分钟，72℃  30秒-2分钟，共28-35个循坏；

72℃  10分钟。

通过以上扩增得到SEQ ID No.2所示的昆明白小鼠白蛋白基因增强子ALB/en，全长约2059bp，位于转录起始点上游-9192bp到-11250bp。

实施例3  PCR扩增得到单纯疱疹病毒胸苷嘧啶激酶(HSV-TK)cDNA

以质粒pTK-neo(novagen公司)为模板，通过PCR扩增HSV-TK cDNA，具体如下：

1、引物：

tk1 ageI 5‘-gtataccggtggcaccatggcttcgtaccccggc-3’

tk2 5‘-ccg cgt cga cgg aaa agc gcc tcc cct ac-3’

2、反应体系：

DNA(20-100ng)：         1.0μl

10×buffer              2.5μl

dNTP(25mM)              2.5μl

tk1(10mM)               1.0μl

tk2(10mM)           1.0μl

TagE(5U/μl)        0.25μl

ddH₂O             16.25μl

                    25.0μl

3、循环参数条件：

94℃  5分钟；

95℃  30秒-1分钟，45℃-55℃  1分钟-2分钟，72℃  1分钟-2分钟，共28-35个循坏；

72℃  10分钟。

通过以上扩增得到HSV-TK cDNA(TK)，其序列如SEQ ID No.3所示。

实施例4  肝脏特异性杀伤载体的构建

如图1所示，以HSV-TK cDNA为目的基因，以ALB/pro与ALB/en为调控元件，以pCDNA3.1(+)/Zeo质粒(Invitrogen公司)为框架，通过DNA两端的酶切位点进行平、粘端连接，构建目标载体-肝脏特异性杀伤载体pLLTK，具体如下：

1、框架载体的线性化

用限制性内切酶NruI与NheI酶切真核表达载体pCDNA3.1(+)/Zeo得到末端为平、粘端的线性片段。

2、连接片段的酶切

a)用KpnI与AgeI酶切ALB/pro得到两末端为粘端的线性片段；

b)用KpnI酶切ALB/en得到两末端分别为平端与粘端的线性片段；

c)用AgeI酶切TK得到两末端分别为平端与粘端的线性片段。

3、连接

	体积
		10×bufferpCDNA3.1(+)/ZeoALB/en	1μl2μl2μl

        Alb/pro                               2μl

        TK                                    2μl

        T₄ DNA ligase(3 weiss u/μl)

        (TakaRo公司)                          1μl

           总共                               10μl

                       16℃连接过夜

4、克隆构建按照分子克隆试验指南(J.萨姆布鲁克)进行，得到载体pLLTK。

5、酶切鉴定

对载体pLLTK进行限制性内切酶消化，反应如下：

(1)选择AgeI(10u/μl，buffer L，promega)，XhoI(10u/μl，buffer H，TakaRo)，

        DNA                                   2.0μl

        10×buffer                            5.0μl

        100×BSA                              0.5μl

        AgeI(10U/μl)                         1.0μl

        ddH ₂ O                               41.5μl

                                              50μl

                           37℃2小时

                               ↓

                2倍无水乙醇沉淀，自然风干DNA

                               ↓

        DNA+ddH₂O                           39.0μl

        10×buffer                            5.0μl

        10×BSA                               5.0μl

        XhoI(10U/μl)                         1.0μl

                                              50μl

                          37℃2小时

(2)选择KpnI(10u/μl，buffer 4，NEB)

        DNA                                   2.0μl

        10×buffer                            2.0μl

        10×BSA                               2.0μl

        KpnI(10U/μl)                         0.5μl

        ddH ₂ O                               13.5μl

                                              20.0μl

                         37℃2小时

(3)将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，其电泳图谱如图2所示，所获片段长度与预期结果一致。

实施例5  产生转基因小鼠家系

将实施例4得到的质粒用无内毒素质粒大量纯化试剂盒进行质粒纯化(按照QIAGEN公司、Protocol for EndoFree Plasmid Maxi Kit进行)；用限制性内切酶Hand III酶切线性化，琼脂糖凝胶电泳回收约4130bp的DNA片段LLTK，然后进行纯化(按照QIAGEN公司、QIAquick Gel Extraction Kit Protocol进行)；最后用Schleicher&Schuell公司的S&S ELUTIP Minicolumns纯化(按照Basic Protocol for DNA for DNA Purification from 50bp-50Kb进行，Schleicher&Schuell公司)；将DNA溶于10mMTris，0.1mMEDTA，PH7.4，按照4ng/μl进行小鼠雄原核显微注射；步骤按照常规转基因小鼠制备步骤。

1、PCR初步分析证明原代及后代小鼠转基因的整合；

转基因小鼠经传3代后，检测其后代阳性率，PCR检测引物设计如下：

stk1：5’-gtataccggtatgcccacgctactgcgg-3’

SH552：5‘-gatggcggtcgaagatgagg-3’

产物长度：390bp

检测结果如图3-5所示：

由图3可见，F0与F1代转基因小鼠的PCR检测结果为：

6、8、10、11、13：F1代阳性转基因小鼠后代；5、7、9、12：F1代阴性转基因小鼠后代，阳性率为5/9＝56％；

由图4可见，F2代转基因小鼠的PCR检测结果为：

1、2、3、5、7：F2代阳性转基因小鼠；4、6、8、9、10：F2代阴性转基因小鼠，阳性率为5/10＝50％。

由图5可见，F3代转基因小鼠的PCR检测结果为：

1、4、5、7、8：F2代阳性转基因小鼠；2、3、6、9、10、11：F2代阴性转基因小鼠，阳性率为5/11＝45％。

上述结果表明，经传3代后，后代的阳性率为45％～56％，说明转基因已稳定整合在转基因小鼠的基因组中，并通过生殖系在世代间稳定遗传。

实施例6  HSV-TK的组织特异性表达

分别以心、肝、脾脏、肾脏、脑、胰腺、肠、血、皮肤和睾丸为对象，以260bpβ-actin为内对照，通过RT-PCR分析HSV-TK的组织特异性表达，其结果如图6所示：

其中引物如下：

β-actin引物：

actin1：5‘-ctacaatgagctgcgtgtggc-3’

actin2：5‘-caggtccagacgcaggatggc-3’

tk引物同上。

由图6可知，390bp HSV-TK目的条带仅在肝脏与睾丸出现表达。

实施例7  免疫组化

免疫组化步骤，按照常规步骤。

一抗：HSV-TK兔多克隆抗体；

二抗：生物素标记的羊抗兔；

三抗：亲和素偶联过氧化物酶。

其结果如图7所示，可见HSV-TK蛋白在肝脏表达，而在肾脏没有表达。

实施例8

1、血液的生化指标检查

尾静脉注射GCV，诱导转基因小鼠的损伤。对照小鼠为乳腺表达ALB的转基因小鼠。尾静脉采血，连续三周每周测定血液的生化值，其结果如图8所示，由图可知，在GCV第一次注射后21天，与注射前相比，谷丙转氨酶ALT、谷草转氨酶AST、总胆红素TBIL的检测值在转基因小鼠组显著性增加(P＜0.05)，而对照小鼠没有显著性差异。肝酐CREA的检测值均无显著性差异(图未列)。血液的生化检查结果表明肝脏功能的损伤，肾脏功能的正常。

2、病理形态学检查

处死小鼠后，取肝脏组织进行病理形态学分析，方法按照常规HE染色步骤，结果如图9所示，结果表明GCV处理TK转基因小鼠后，肝脏组织出现肝小叶灶性坏死，个别凋亡小体，淋巴细胞浸润等病理表现(A、C)，而未处理TK转基因小鼠肝脏(B)，ALB转基因小鼠肝脏在GCV处理后基本没有出现组织病理形态学的改变(D)。

综上所述，本发明的转基因小鼠肝病动物模型损伤易控制，机制较明了，症型较明确，模型稳定可重复，且由于在肝脏特异性调控元件的控制下目的基因组织特异性表达，损伤特异性强，与一般的毒素蛋白表达的转基因动物模型相比，易于饲养繁殖，因此可用于筛选治疗肝炎的药物，评价治疗肝炎的方法。

                         序列表

<110>上海交通大学附属儿童医院

<120>一种转基因小鼠肝病动物模型、其制备方法及应用

<130>041317C

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>335

<212>DNA

<213>rat

<220>

<221>promoter

<222>(25)..(308)

<223>

<400>1

ggtacctcca tgccaaggcc cacactgaaa tgctcaaatg ggagacaaag agattaagct    60

cttatgtaaa atttgctgtt ttacataact ttaatgaatg gacaaagtct tgtgcatggg    120

ggtgggggtg gggttagagg ggaacagctc cagatggcaa acatacgcaa gggatttagt    180

caaacaactt tttggcaaag atggtatgat tttgtaatgg taggaaccaa tgaaatgcga    240

ggtaagtatg gttaatgatc tacagttatt ggttaaagaa gtatattaga gcgagtcttt    300

ctgcacacag atcacctttc ctatcaaccc cacta                               335

<210>2

<211>2059

<212>DNA

<213>rat

<220>

<221>enhancer

<222>(1)..(2059)

<223>

<400>2

gaaattaccc atcttcctaa gcttctgctt ctctcagttt tctgcttgct cattccactt     60

ttccagctga ccctgccccc taccaacatt gctccacaag cacaaattca tccagagaaa    120

ataaattcta agttttatag ttgtttggat cgcataggta gctaaagagg tggcaaccca    180

cacatcctta ggcatgagct tgattttttt tgatttagaa ccttcccctc tctgttccta    240

gactacacta cacattctgc aagcatagca cagagcaatg ttctacttta attactttca    300

ttttcttgta tcctcacagc ctagaaaata acctgcgtta cagcatccac tcagtatccc    360

ttgagcatga ggtgacacta cttaacatag ggacgagatg gtactttgtg tctcctgctc    420

tgtcagcagg gcactgtact tgctgatacc agggaatgtt tgttcttaaa taccatcatt    480

ccggacgtgt ttgccttggc cagttttcca tgtacatgca gaaagaagtt tggactgatc    540

aatacagtcc tctgccttta aagcaatagg aaaaggccaa cttgtctacg tttagtatgt    600

ggctgtagaa agggtataga tataaaaatt aaaactaatg aaatggcagt cttacacatt    660

tttggcagct tatttaaagt cttggtgtta agtacgctgg agctgtcaca gctaccaatc    720

aggcatgtct gggaatgagt acacggggac cataagttac tgacattcgt ttcccattcc    780

atttgaatac acacttttgt catggtattg cttgctgaaa ttgttttgca aaaaaaaccc    840

cttcaaattc atatatatta ttttaataaa tgaattttaa tttatctcaa tgttataaaa    900

aagtcaattt taataattag gtacttatat acccaataat atctaacaat catttttaaa    960

catttgttta ttgagcttat tatggatgaa tctatctcta tatactctat atactctaaa   1020

aaagaagaaa gaccatagac aatcatctat ttgatatgtg taaagtttac atgtgagtag   1080

acatcagatg ctccatttct cactgtaata ccatttatag ttacttgcaa aactaactgg   1140

aattctagga cttaaatatt ttaagtttta gctgggtgac tggttggaaa attttaggta   1200

agtactgaaa ccaagagatt ataaaacaat aaattctaaa gttttagaag tgatcataat   1260

caaatattac cctctaatga aaatattcca aagttgagct acagaaattt caacataaga   1320

taattttagc tgtaacaatg taatttgttg tctatttctt ttgagataca gttttttctg   1380

tctagctttg gctgtcctgg accttgctct gtagaccagg ttggtcttga actcagagat   1440

ctgcttgcct ctgccttgca agtgctagga ttaaaagcat gtgccaccac tgcctggcta   1500

caatctatgt tttataagag attataaagc tctggctttg tgacattaat ctttcagata   1560

ataagtcttt tggattgtgt ctggagaaca tacagactgt gagcagatgt tcagaggtat   1620

atttgcttag gggtgaattc aatctgcagc aataattatg agcagaatta ctgacacttc   1680

cattttatac attctacttg ctgatctatg aaacatagat aagcatgcag gcattcatca   1740

tagttttctt tatctggaaa aacattaaat atgaaagaag cactttatta atacagttta   1800

gatgtgtttt gccatctttt aatttcttaa gaaatactaa gctgatgcag agtgaagagt   1860

gtgtgaaaag cagtggtgca gcttggcttg aactcgttct ccagcttggg atccttaacc   1920

ccatgtatcc tctcctacct ttgaggacac cttctcatgc cgtaagactg tcacacgcca   1980

cacgggaagc acacaatcgc agcatttcaa ggaggaagga ccccagggat aattttatcc   2040

cagttgattt acatggcat                                                2059

<210>3

<211>1795

<212>DNA

<213>rat

<220>

<221>gene

<222>(1)..(1795)

<223>

<400>3

gccaccatgg cttcgtaccc cggccatcag cacgcgtctg cgttcgacca ggctgcgcgt     60

tctcgcggcc atagcaaccg acgtacggcg ttgcgccctc gccggcagca agaagccacg    120

gaagtccgcc cggagcagaa aatgcccacg ctactgcggg tttatataga cggtccccac    180

gggatgggga aaaccaccac cacgcaactg ctggtggccc tgggttcgcg cgacgatatc    240

gtctacgtac ccgagccgat gacttactgg cgggtgctgg gggcttccga gacaatcgcg    300

aacatctaca ccacacaaca ccgccttgac cagggtgaga tatcggccgg ggacgcggcg    360

gtggtaatga caagcgccca gataacaatg ggcatgcctt ataccgtgac cgacgccgtt    420

ctggctcctc atatcggggg ggaggctggg agctcacatg ccccgccccc ggccctcacc    480

ctcatcttcg accgccatcc catcgccgcc ctcctgtgct acccggccgc gcgatacctt    540

atgggcagca tgacccccca ggccgtgctg gcgttcgtgg ccctcatccc gccgaccttg    600

cccggcacaa acatcgtgtt gggggccctt ccggaggaca gacacatcga ccgcctggcc    660

aaacgccagc gccccggcga gcggcttgac ctggctatgc tgaccgcgat tcgccgcgtt    720

tacgggctgc ttgccaatac ggtgcggtat ctgcagggcg gcgggtcgtg gcgggaggat    780

tggggacagc tttcggggac ggccgtgccg ccccagggtg ccgagcccca gagcaacgcg    840

ggcccacgac cccatatcgg ggacacgtta tttaccctgt ttcgggcccc cgagttgctg    900

gcccccaacg gcgacctgta caacgtgttt gcctgggcct tggacgtctt ggccaaacgc    960

ctccgtccca tgcacgtctt tatcctggat tacgaccaat cgcccgccgg ctgccgggac   1020

gccctgctgc aacttacctc cgggatgatc cagacccacg tcaccacccc aggctccata   1080

ccgacgatct gcgacctggc gcgcacgttt gcacgggaga tgggggaggc taactgaaac   1140

acggaaggag acaataccgg aaggaacccg cgctatgtcg gcaataaaaa gacagaataa   1200

aacgcacggg tgttgggtcg tttgttcata aacgcggggt tcggtcccag ggctggcact   1260

ctgtcgatac cccaccgaga ccccattggg gccaatacgc ccgcgtttct tccttttccc   1320

caccccaacc cccaagttcg ggtgaaggcc cagggctcgc agccaacgtc ggggcggcaa   1380

gcccgccata gccacgggcc ccgtgggtta gggacggggt cccccatggg gaatggttta   1440

tggttcgtgg gggttattct tttgggcgtt gcgtggggtc aggtccacga ctggactgag   1500

cagacagacc catggttttt ggatggcctg ggcatggacc gcatgtactg gcgcgacacg   1560

aacaccgggc gtctgtggct gccaaacacc cccgaccccc aaaaaccacc gcgcggattt   1620

ctggcgccgc cggacgaact aaacctgact acggcatctc tgccccttct tcgctggtac   1680

gaggagcgct tttgttttgt attggtcacc acggccgagt ttccgcggga ccccggccag   1740

atcaagctta tcgataccgt cgaggaattc taccgggtag gggaggcgct tttcc        1795

Claims (8)

1、一种转基因小鼠肝病动物模型，其特征在于，所述转基因小鼠动物模型的基因组整合有DNA片段LLTK，所述DNA片段LLTK由小鼠白蛋白基因启动子ALB/pro与增强子ALB/en，以及受其调控的下游基因单纯疱疹病毒胸苷嘧啶激酶cDNA构成。

2、如权利要求1所述的转基因小鼠肝病动物模型，其特征在于，所述小鼠白蛋白基因启动子ALB/pro具有SEQ ID No.1所示的序列。

3、如权利要求1所述的转基因小鼠肝病动物模型，其特征在于，所述小鼠白蛋白基因增强子ALB/en具有SEQ ID No.2所示的序列。

4、如权利要求1所述的转基因小鼠肝病动物模型，其特征在于，所述单纯疱疹病毒胸苷嘧啶激酶cDNA的序列如SEQ ID No.3所示。

5、如权利要求1所述的转基因小鼠肝病动物模型，其特征在于，所述DNA片段LLTK的长度约为4130bp。

6、一种转基因小鼠肝病动物模型的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

A、小鼠白蛋白基因启动子ALB/pro的克隆；

B、小鼠白蛋白基因增强子ALB/en的克隆；

C、PCR扩增得到单纯疱疹病毒胸苷嘧啶激酶cDNA；

D、以单纯疱疹病毒胸苷嘧啶激酶cDNA为目的基因，ALB/pro与ALB/en为调控元件，构建肝脏特异性杀伤载体pLLTK；

E、限制性内切酶酶切线性化pLLTK，回收并纯化约4130bp的片段LLTK；

F、显微注射小鼠雄原核，得到阳性转基因小鼠。

7、权利要求1的转基因小鼠肝病动物模型用于筛选治疗肝病的药物的用途。

8、一种DNA片段LLTK，其特征在于，所述DNA片段LLTK由小鼠白蛋白基因启动子ALB/pro与增强子ALB/en，以及受其调控的下游基因单纯疱疹病毒胸苷嘧啶激酶cDNA构成。

Images