CN1478149A - 生理活性物质的筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供与具有各种生理活性的DGE有同样的基因调控活性的生理活性物质、或生理活性物质的候补物质的筛选方法，对维持生物体的恒常性有效的，例如，以缓和或预防应激为目的的基因调控剂、以及基因的调控方法。

Description

生理活性物质的筛选方法

技术领域

本发明涉及生理活性物质的筛选方法、基因调控剂及基因调控方法。

背景技术

生物由于生活环境的变化等外部因素，病毒、细菌感染等内部因素而受到各种应激。应激本身是妨碍生物的正常生活的重要原因，不能平稳地避免这些应激，和相反地产生过剩反应时，会引起更严重的障碍，例如疾病。

处于应激负荷状态或由此而向疾病发展的状态时，生物体内的各种机能、因素复合地相关，但其中实质上是存在基因的表达状态的变化。因此，通过基因水平的调控，平稳地避免应激应该是可能的。但是，受应激的状态、以及避免该应激的过程中的基因表达的调控的详细情况尚不清楚，上述的通过基因水平的调控避免应激的方法尚未建立。

一方面，已知由琼脂糖所得的L-甘油基-1，5-环氧-1αβ，6-二羟基-顺-己-3-烯-2酮(以下称为DGE)，具有各种生理活性，是维持生物体内平衡有用的化合物(国际公开第99/64424号公告)。但是该化合物的基因水平上的作用机制尚不清楚。

本发明的目的是提供筛选具有与DGE同样的基因表达调控活性的生理活性物质或生理活性物质的侯补物质的方法、对维持生物体内平衡有效的，例如缓和或预防应激为目的的基因调控剂、以及基因调控的方法。

发明内容

本发明的第1发明是生理活性物质的筛选方法，该方法包含以下步骤：

(1)以①被检物质，以及②下述(i)中所述的化合物和/或下述(ii)中所述的化合物为负荷，分别施加给生物体的步骤：

(i)选自以下式(I)表示的化合物、该化合物的衍生物及它们的盐类中的至少1种化合物。

(式中，X和Y为H或CH₂OH，但X为CH₂OH时，Y为H，X为H时，Y为CH₂OH)

(ii)选自以下式(II)表示的3，6-脱水半乳糖、它的醛体、水合物及它们的2-O-甲基化物及2-O-硫酸化物的至少1种化合物；和/或选自还原末端有该化合物的可溶性糖化合物的至少1种化合物。

(2)测定(1)的生物体中基因的表达量，比较施加负荷①时和施加负荷②时的该值的步骤，以及

(3)选择被检物质的步骤，该被检物质使至少1种基因所表示的表达量变化与施加负荷②时实质上相同。

本发明的第2发明是生理活性物质的筛选方法，该方法包括以下步骤：

(1)将被检物质负荷施加于生物体的步骤。

(2)测定(1)的生物体中基因的表达量和不施加相应的负荷时，该生物体中基因的表达量，并比较两者的该值的步骤，以及

(3)选择被检物质的步骤，该被检物质使选自下述A群、C群、E群及F群中的至少一种基因的表达量减少，和/或使选自下述B群、D群及G群中的至少一种基因的表达量增加：

A群：

骨形态发生蛋白-6[BMP-6(基因库登记号：NM_001718)]基因、

趋化因子受体-1[CCR-1(基因库登记号：NM_001295)]基因、

肝细胞增殖因子[HGF(基因登记号：X16323)]基因、

细胞间粘附分子-1[ICAM-1(基因库登记号：NM_000201)]基因、

白介素-1β[IL-1β(基因库登记号：X02532)]基因、

白介素-16[IL-16(基因库登记号：M90391)]基因、

白血病抑制因子[LIF(基因库登记号：NM_002309)]基因、

骨桥蛋白[osteopontin(基因库登记号：NM_000582)]基因、

肿瘤坏死因子-α[TNF-α(基因库登记号：X02910)]基因、

神经纤维网-1[Neuropilin-1(基因库登记号：NM_003873)]基因、

信号传导物和转录激活物6[STAT6(基因库登记号：AF067575)]基因、以及

含有智人(Homo Sapiens)cDNA：FLJ22298倒位刺激基因(fis)，

克隆HRC04637(基因库登记号：AK025951)的基因

B群：

血红素加氧酶[HO-1(基因库登记号：NM_002133)]基因、

硫氧还蛋白还原酶-1(基因库登记号：AF106697)基因、

推定的翻译起始因子[SUI1(基因库登记号：AF083441)]基因、以及

智人的(Homo Sapiens)推测的蛋白[HSPC014(基因库登记号：NM_015932)]基因、

C群：

N-myc下游调节性基因1[NDRG1(基因库登记号：NM_006096)]基因、

腺苷脱氨酶、RNA特异性[ADAR(基因库登记号：NM_015841)]基因、

剪接因子3b、亚基2[SF3B2(基因库登记号：NM_006842)]基因、

白介素增强子结合因子3[ILF3(基因库登记号：NM_004516)]基因、

缬氨酰基-tRN合成酶2[VARS2(基因库登记号：NM_006295)]基因、以及

含有序列表的序列号：12中所述的碱其序列的基因、

D群：

真核生物翻译延伸因子1α1[EEF1A1(基因库登记号：NM_001402)]基因、

核糖体蛋白L17[RPL17(基因库登记号：NM_000985)]基因、

核糖体蛋白L24[RPL24(基因库登记号：NM_000986)]基因、

富含精氨酸/丝氨酸的剪接因子2[SFRS2(基因库登记号：NM_003016)]基因、

翻译调控的肿瘤蛋白1[TPT1(基因库登记号：NM_003295)]基因、

还原型辅酶Q(ubiquinol)-细胞色素C还原酶结合蛋白[UQCRB(基因库登记号：NM_

006294)]基因、

核糖体蛋白S15a[RPS15A(基因库登记号：NM_001019)]、以及

核糖体蛋白L27[RPL27(基因库登记号：NM_000988)]基因、

E群：

白介素-2受体α[IL2RA(基因库登记号：X01057)]基因、

白介素-6[IL6(基因库登记号：X04430)]基因、

CD166(基因库登记号：Y10183)基因、

干扰素调节因子-1[IRF1(基因登记号：X14454)]基因、

白介素-15受体α[IL15RA(基因登记号：U31628)]基因、

核因子Kappa-bp105亚基[NFKB1(基因登记号：M58603)]基因、

天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1(カスパ-ゼ-1)[CASP1(基因登记号：M87507)]基因、

白介素-1β[IL1B(基因库登记号：M15330)]基因、

肿瘤坏死因子-α[TNF-α(基因库登记号：X02910)]基因、

Gr01癌基因[GR01(基因库登记号：X54489)]基因、

白介素-1α[IL1A(基因库登记号：M28983)]基因、

抑制素βA[1NHBA(基因库登记号：J03634)]基因、

白介素-7受体[IL7R(基因库登记号：M29696)]基因、

前B细胞集落增强因子[PBEF(基因库登记号：U02020)]基因、

肝和激活作用调节性趋化因子[LARC(基因库登记号：U64197)]基因、以及

白介素-8[IL8(基因库登记号：M26383)]基因、

F群：

集落刺激因子-1受体[CSF1R(基因库登记号：X03663)]基因、

趋化因子(C-X-C基元)受体-4[CXCR4(基因库登记号：AF147604)]基因、以及

エンドグリン[ENG(基因库登记号：NM_000118)]基因、

G群：

血红素加氧酶-1[HM0X1(基因库登记号：Z82244)]基因。

本发明的第3发明是筛选生理活性物质的方法，该方法包括下述步骤：

(1)分别对生物施加应激负荷、以及对生物体施加被检物质和应激负荷的步骤。

(2)分别测定(1)的生物体以及未施加任何负荷的正常生物体中基因的表达量的步骤，以及

(3)用由(2)所得的基因表达量就(1)的生物体和正常生物体作比较、选择被检物质的步骤，该被检物质表现出选自下述(a)～(g)所述的基因表达模式中的至少一种基因的表达模式：

(a)选自上述A群的至少一种基因的表达量，在对生物体施加应激负荷时，比正常生物体增加，对被生物体施加被检物质和应激负荷时减少；

(b)选自上述B群的至少一种基因的表达量，在对生物体施加应激负荷时，比正常生物体增加，对被生物体施加被检物质和应激负荷时进一步增加；

(c)选自上述C群的至少一种基因的表达量，在对生物体施加应激负荷时，比正常生物体减少，对被生物体施加被检物质和应激负荷时进一步减少；

(d)选自上述D群的至少一种基因的表达量，在对生物体施加应激负荷时，比正常生物体减少，对被生物体施加被检物质和应激负荷时增加；

(e)选自上述E群的至少一种基因的表达量，在对生物体施加应激负荷时，比正常生物体增加，对被生物体施加被检物质和应激负荷时减少；

(f)选自上述F群的至少一种基因的表达量，在对生物体施加应激负荷时，与正常生物体相同，对被生物体施加被检物质和应激负荷时减少；

(g)选自上述G群的至少一种基因的表达量，在对生物体施加应激负荷时，与正常生物体相同，对被生物体施加被检物质和应激负荷时增加。

本发明的第3发明中，施加于生物体的应激负荷是用佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯处理时，基因的表达模式如上述(a)～(d)的例子所示；施加于生物体的负荷是用脂多糖处理时，基因的表达模式如上述(e)～(g)的例子所示。

本发明的第1～3发明中，作为生物体，可以用生物个体或培养细胞来举例说明。对于基因的表达量，可根据由该基因转录的mRNA量所测定的基因表达量来举例说明，该测定尤其以通过使用DNA点阵的杂交法进行为合适。此外，本发明还包括由本发明的第1～3发明所得的物质。

本发明的第4发明涉及本发明的第1～3发明的筛选方法中所使用的DNA点阵，该DNA点阵的特征是至少2个选自上述A～G群所述的基因或其片段在载体上预先规定的位置上固定化。

本发明的第5发明涉及基因调控剂，该调控剂的特征是包含具有下述作用的化合物：使选自上述A群、C群、E群及F群中的至少一种基因的表达量减少，和/或使选自上述B群、D群及G群中的至少一种基因的表达量增加。

本发明的第6发明涉及基因调控剂，该调控剂的特征是包含具有下述作用的化合物：在受到应激负荷的生物体中，使选自上述所示的A群、C群、E群及F群中的至少1种基因的表达量减少，和/或使选自上述所示的B群、D群及G群中的至少1种基因的表达量增加。

本发明的第7发明涉及基因调控剂，该调控剂的特征是包含具有下述作用的化合物：在受到应激负荷的生物体中，使由于应激而增加表达量的选自上述A群及E群中的至少1种基因的表达量减少。

本发明的第8发明涉及基因调控剂，该调控剂的特征是包含具有以下作用的化合物：在受到应激负荷的生物体中，使由于应激而增加表达量的选自上述B群及G群中的至少1种基因的表达量增加。

本发明的第9发明涉及基因调控剂，该调控剂的特征是包含具有下述作用的化合物：在受到应激负荷的生物体中，使由于应激减少表达量的选自上述C群及F群中的至少1种基因的表达量减少。

本发明的第10发明涉及基因调控剂，该调控剂的特征是包含具有下述作用的化合物：在受到应激负荷的生物体中，使由于应激而减少表达量的选自上述D群中的至少1种基因的表达量增加。

本发明的第5～10发明中例示的基因调控剂是指，其包含的各种化合物是根据本发明第1～3中任何一个发明的筛选方法所得的物质的基因调控剂。此外，本发明的第5～10发明的基因调控剂是以缓和或预防应激为目的的基因调控剂的例子。

本发明的第11发明涉及基因的调控方法，该方法的特征是，从上述(i)所述的化合物、上述(ii)所述的化合物、以及对至少1种基因具有和这些化合物实质上相同的基因表达调控活性的化合物中，选择至少1种化合物，通过将此化合物或含有该化合物的组合物施予生物体，使选自上述A群、C群、E群及F群中的至少1种基因的表达量减少，和/或使选自上述B群、D群和G群中的至少一种基因的表达量增加。

本发明的第12发明涉及基因的调控方法，该方法的特征是从上述(i)所述的化合物，上述(ii)所述的化合物、以及对至少1种基因具有和这些化合物实质上相同的基因表达调控活性的化合物中，选择至少1种化合物，通过将此化合物或含有该化合物的组合物施予受到应激负荷的生物体，使选自上述A群、C群、E群及F群的至少1种基因的表达量减少，和/或使选自上述B群、D群和G群的至少一种基因的表达量增加。

本发明的第11和12发明中，上述(i)所述的化合物，或上述(ii)所述的化合物，和对至少1种基因有实质上相同的基因表达调控活性的化合物是由本发明的第1～3发明中任何一种筛选方法所得物质的例示。

实施发明的最佳方式

本发明的生理活性物质的筛选方法的一个实施方案中，使用含有上述式(I)表示的结构的化合物。该化合物的例子有L-甘油基-1，5-环氧-1αβ，6-二羟基-顺-己-3烯-2酮(DGE)。

该化合物可以由选自还原末端上有3，6-脱水半乳糖的化合物，例如琼脂二糖、k-角叉菜那二糖(カラビオ一ス)及还原末端有3，6-脱水半乳糖的化合物中的至少1种化合物，在中性至碱性条件下处理(维持)而得到。也可以将相应的化合物在pH7(未满)进行酸水解和/或酶解，然后将所得的酸分解物和/或酶分解物在中性至碱性的条件下处理(维持)而得到。

另外，上述的酶解举例来说有：还原末端有3，6-脱水半乳糖的化合物，如琼脂糖，用α-琼脂糖酶的分解。对进行酶解的条件无特定的限制，按照有关所使用的酶的公知条件即可。

还原末端有3，6-脱水半乳糖的化合物，例如选自琼脂二糖、k-角叉菜二糖以及还原末端有3，6-脱水半乳糖中的至少1种化合物，在用pH超过7的碱处理时，对于溶解或悬浮该化合物的碱的种类无特别的限制，可以使用氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氨水等无机碱，Tris(三羟甲基氨基甲烷)、乙胺、三乙胺等有机碱，碱的浓度也没有特别的限定，但可以优选在0.001～5，更优选在0.001～1当量的浓度下使用。此外，处理温度也无特别的限制，优选设定在0～200℃，更优选设定在20～130℃。另外，处理时间也没有特别的限定，设定为数秒至数日都可以。碱的种类和浓度、处理时的温度及时间可根据作为原料的上述化合物的种类和以式(I)表示的目的化合物的生成量适当选择。一般，pH只要超过7就可以，但选择高浓度的碱和高温，而不是低浓度和低温，可使式(I)表示的化合物的生成迅速进行。

例如，将琼脂二糖或k-角叉菜二糖配制成pH11.5的水溶液，在37℃下保持5分钟，即生成式(I)表示的化合物。

所生成的含有式(I)的表示的化合物的碱溶液可以按照要求，中和后使用，或也可以作为pH低于7的酸性溶液使用。

作为本发明的式(I)表示的化合物的精制方法，可以采用化学的方法，物理的方法等公知的精制方法，例如可以将凝胶过滤法、通过分子量差示膜的差示法、溶剂提取法、使用离子交换树脂等的各种色谱法等的精制方法，组合起来进行精制。

例如，由琼脂二糖的中性到碱性条件下的处理物精制为式(I)表示的X为CH₂OH、Y为H的化合物；由k-角叉菜二糖的中性到碱性条件下的处理物，精制为式(I)表示的X为H、Y为CH₂OH的化合物。

此外，作为式(I)表示的化合物的衍生物，对于在生物体内，能表示与相应的化合物实质上相同的基因表达的模式无特别的限定，例如，可以使用由式(I)表示的化合物与含SH基的化合物(例如半胱氨酸、谷胱甘肽或其公知的衍生物)反应所得的化合物。另外，由式(I)表示的化合物与含有SH基的化合物反应所得的化合物的制造方法有国际公开第99/64424号公告中所述的公知方法。

作为式(I)表示的化合物或其衍生物的盐，使用可药用的盐为合适，该盐可以采用公知的方法进行转换。

此外，式(I)表示的化合物DGE是琼脂寡糖被摄入生物体内时生成的化合物，所以可以预测将琼脂寡糖施予生物体时，会产生与DGE同样的生物反应[Jpn.J.Phycol.(Sorui)48：13-19，March 10，2000]。由此，人们认为对生物体给药时，不使用本发明中以式(I)表示的化合物，而是由相应的化合物来生成，也可以使用选自上式(II)表示的3，6-脱水半乳糖、它的醛体、水合物及它们的2-O-甲基化物及2-O-硫酸化物中的至少1种化合物，和/或选自还原末端有该化合物的可溶性糖化合物中的至少1种化合物，(另外，关于3，6-脱水半乳糖的醛体、水合物、2-0-甲基化物以及2-O-硫酸化物，由国际公开第00/41579号公告中所述的化合物作为例子说明)。作为相应的化合物例子，无特别的限定，例如有琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖等琼脂寡糖的例子。[1]本发明的生理活性物质的筛选方法

以上述式(I)表示的化合物之一的DGE具有缓和生物体受到的损伤、促进维持生物体内平衡的作用。已知在上述受到应激的生物体中，DGE对于观察到表达量有变化的基因的该表达量具有调控活性，亦即有基因表达调控活性(或作用)，该活性参与生物体内的各种基因的表达调控。而且也已知DGE具有各种生理活性，例如，诱发细胞程序死亡(アポト一シス)的活性、抗癌的活性、活性氧产生的抑制活性、过氧化脂质自由基产生的抑制活性、一氧化氮产生的抑制活性等抗氧化活性、抗病原微生物活性、抗变异原活性、α-葡萄糖苷酶抑制活性、免疫调节作用、前列腺素合成抑制作用、抗炎症作用、抗变应性作用、细胞因子产生调节作用、抗风湿作用、抗糖尿病作用、滑膜细胞增殖抑制活性、热激蛋白质产生的诱导作用等。因此，可以认为这些生理活性是由于DGE的基因调控作用，通过表达量的调节而使其表达的。

本发明的生理物质的筛选方法，以基于上述各种生理活性已知的DGE的基因调控作用的基因的表达量变化为指标，对至少表现出同样的基因表达量的变化的DGE以外的物质，提供了一种筛选方法。亦即，提供在生物体内，至少表现出与DGE同样的基因表达模式的物质的筛选方法。

由于根据本发明所得的物质表现出与DGE有同样的基因表达调控活性，所以推测其是具有与DGE同样的生理活性的物质。因此，使用该化合物，例如该生理活性的表达对于其有效解决的疾病和/或症状(例如癌、炎症、变态反应、糖尿病等上述需要DGE的生理活性的疾病)的治疗或预防来说，有可能提供有效的医药、食品、饮料等。

此外，也有可能获得具有与DGE的生理活性不同的未知生理活性的物质，由此观点，由本发明的生理活性物质的筛选方法也可以获得生理活性物质的候补物质的筛选方法。

本发明的生理活性物质的筛选方法，具体是通过下述步骤可以得到具有与DGE同样的基因表达调控活性的物质：

(1)以①被检物质，及②上述(i)中所述的化合物和/或上述

(ii)中所述的化合物作为负荷，分别施加于生物体的步骤、

(2)测定(1)的生物体中基因的表达量、比较在施加负荷①时与施加负荷②时的该测定值，以及

(3)选择具有与DGE同样基因表达调控活性的被检物质的步骤，该被检物质使至少一种基因表现出与施加负荷②时实质上相同的表达量变化。

另外，“实质上相同的表达量的变化”是指不一定是在表达量程度上的相等，而是指至少是表达量的变化模式相同的意思。

亦即，①测定施加了被检物质负荷，即投予或摄取了被检物质(以下同)的生物体样品中的基因表达量、另一方面，测定施加了②的化合物负荷，例如上述式(I)表示的化合物，如DGE，的生物体样品中的基因表达量、然后比较每种基因表达量和/或其变化，判定被检物质和DGE各自的基因表达调控作用是否类似。基因表达调控作用类似的物质具有与DGE同样的生理活性的可能性大，可以期望能用于与DGE同样的使用目的中。

上述的具有DGE的基因表达调控作用并没有特别的限定，例如，可以通过比较施加了DGE负荷的生物体与未施加该负荷时的该生物体(对照)之间的基因表达状态(表达模式)来确认。这时，两者间的表达量有差异的基因可认为是由DGE调控的对象基因。另外，DGE所具有的基因表达调控作用也可以如下述的实施例1所述，通过对生物体施加应激负荷来确认。

另外，本说明书中，对生物体无特别的限定，使用生物个体(人除外)或培养的细胞为合适。例如，使用生物个体时，可以从该个体取出适合的样品，例如组织的一部分和体液等，研究其基因表达的状态。

此外，对本发明筛选方法中使用的被检物质无任何限定，天然来源的物质、人工合成的物质、将天然来源的物质经人工改变的物质等都可以使用。这些物质可以单独的物质、也可以是包含多种物质的物质，任何一种都可使用，例如，也可以适当地将分离操作和本发明的筛选方法组合起来，将有用的物质精制或分离。

此外，通过使用本发明的筛选方法，例如，可以由与上述(i)所述的化合物或上述(ii)所述的化合物有实质上相同的生理活性的组合物，例如来源于植物、动物、担子菌或微生物等天然来源的组合物，特定其活性成分。例如将构成这种组合物的化合物作为被检物质，通过实施本发明的生理活性物质的筛选方法，可以特定其活性成分。

还有，由上述本发明的筛选方法所得的物质，即与上述(i)所述的化合物或上述(ii)所述的化合物有实质上相同的基因调控活性的物质也包括在本发明的范围内。将被检物质提供给本发明的筛选方法中，然后通过判定其是否具有该方法中规定的基因调控活性，即可获得相应的物质。此外，作为相应的物质，举例说明有植物、担子菌类来源的物质及其衍生物，这里使用的植物举例说明有各种生理活性已知的药用植物和海藻类等。

还有，对于上述来源的物质无特别的限定，包括含有作为组成成分的糖的物质，例如多糖类、它的分解物或它们的衍生物，特别是分子量为100-2000左右的物质为合适。进一步可以由这些物质，通过本发明的筛选方法，选择对照物质(例如DGE)以外的具有基因调控活性的物质。作为上述含有组成成分糖的物质，特别合适的是分子内含有3，6-脱水半乳糖的物质。另外，分解物、衍生物，只要在生物体内表现出与其出发物质实质上相同的基因表达模式的物质即可，无特别的限定。

基因表达状态的比较可用公知的方法进行，例如，测定相应的基因产物(多肽)量和由相应的基因转录的mRNA量。由上述的目的来看，测定mRNA的方法有效，较为合适。

例如，多肽量的测定，使用对该多肽或其片段特异结合的抗体进行为好。作为该抗体，多克隆抗体、单克隆抗体的任何一种都可以，还有，用公知技术修饰的抗体和抗体的衍生物，例如Fab片段、单链抗体等也可以使用。这些抗体及衍生物等可以按照公知的方法制备(例如参照1992年，John wiely & Sons，Ine.发行，John E·Coligan编，Current Protocols in Immunology)。此外，作为多肽量的测定方法有，例如公知的酶免疫测定法、萤光免疫测定法、发光免疫测定法等。还有，为了在上述的多肽量的测定方法中便于检测出上述的抗体，也可以进行各种标记。

对mRNA量的测定方法无特殊的限定，可以使用公知的方法，例如RT-PCR法、Northern杂交法、点印迹杂交法、使用DNA点阵的杂交法、DNA微珠法篝。由于使用DNA点阵的方法用微量的试样即可以研究很多基因的表达状态，所以对于上述的目的，该方法特别合适。

本说明书中的所谓“DNA点阵”是指基因或来源于基因的DNA片段固定在载体上预先规定的领域(位置)的元件，例如包括为DNA芯片的元件。此外，基因或来源于基因的DNA片段高密度固定在载体上的元件称为DNA微点阵。

DNA点阵的载体只要是可以用于杂交的材料，则无特殊的限定，通常使用载玻片、硅芯片、硝酸纤维素膜和尼龙膜等。载体的表面可以是能通过共价或非共价结合、将单链DNA或双链DNA固定化的任何一种表面，载体表面上有亲水性或疏水性的官能基团的载体都可以适用，无特别的限定，例如有羟基、氨基、硫醇基、醛基、羧基、酰基的表面可以适用。这些官能基可以是载体本身的特性而存在的，也可通过表面处理而导入。作为这样的表面处理物，例如有将玻璃用氨烷基硅烷等市售的有机硅烷偶合剂处理的表面、聚赖氨酸和聚乙烯亚胺等聚阳离子处理的表面。此外，一部分经过这种处理的载玻片在市场上有售。

对于在载体上固定化的基因或其DNA片段无特别的限定，例如基因组DNA文库、cDNA文库、通过以它们为模板的公知的核酸扩增法，例如，PCR(polymerase chain reaction)法、LCR(ligase chainreaction)法、SDA(strand displacement amplification)法和ICAN(isothermal and chimeric primer-initiated amplificationof nucleic acids)法(国际公开第00/56877号公告所述)等扩增的DNA，对扩增这此核酸的反应条件无特别的限定。另外，也可以使用通过RNA反转录所得的DNA，该RNA是通过以RNA为模板的转录扩增系统(TAS；Transcription-based amplification system)法、自主复制(3SR；self-sustaind sequence replication)法、NASBA(nucleic acid sequence-based amplification)法、TMA(transcription-mediated amplification)法、或者Qβ复制酶法扩增的RNA。

在载体上固定化的操作可以用市售的DNA点阵制作装置，例如Affymetrix公司生产的DNA芯片制作装置进行。通过使用该装置，可以制作出基因高密度地排列并固定化的DNA点阵(DNA微点阵)。

本发明中所使用的DNA点阵可以是将任意基因或来源于该基因的DNA片段固定的DNA点阵，优选固定了编码与生物体恒常性功能有关的蛋白的基因、或来源于该基因的DNA片段的点阵。此外，将各种基因的片段固定化的DNA微点阵已在市场上销售(IntelliGene HumanCytokine CHIP等，宝酒造公司生产)，这种点阵也可以使用。还有，在该DNA点阵上固定化的基因或来自于该基因的DNA片段的选择，可按以下方法进行，按下述实施例3中所述的DNA微珠法、减法、差示显示法等，对生物体施加应激负荷，例如施加对生物体维持恒常性产生障碍的药剂，如施加佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯和脂多糖等负荷，选择施加负荷与未施加负荷的生物体之间的表达量发生变化的基因。

通过使用这样的DNA点阵，可以同时测定核酸样品中含有的多种核酸的量。而且还具有用少量的核酸样品也能进行测定的优点。例如，对样品中的mRNA进行标记、或以mRNA为模板制备标记的cDNA、使其与DNA点阵进行杂交，由此可以同时检测样品中转录的多个mRNA，并进一步测定其表达量。

施加DGE负荷和未施加DGE负荷的生物体中基因表达的差异，例如两种情况下的基因表达模式，可以通过如以下所述的比较进行研究。

亦即，使来源于施加DGE负荷的生物体的样品(DGE负荷样品)中的核酸以及来源于未施加DGE负荷的生物体的样品(对照样品)中的核酸分别与DNA点阵杂交，通过比较所得的结果，可以检测出表达量不同的基因。例如，用任意的方法标记上述样品的核酸，针对与该核酸杂交的点阵，根据使用的标记，进行合适的信号检测，比较点阵上各基因的DGE负荷样品及对照样品中的表达量。优选将DGE负荷样品和对照样品中的每种核酸预先用不同的方法标记好，采用能够检测多种标记，例如2种荧光标记的多波长检测荧光分析仪，由同一DNA点阵上的竞争杂交可以对DGE负荷样品中的基因表达量与对照样品中的基因表达量之差进行比较。亦即，将两者当量混合，与DNA点阵进行杂交，两者的基因表达量之差可以按信号的颜色及强度的差异进行检测。结果，根据所得的信号强度，两者间的差别有优势的某种基因，可特定为DGE的表达调控对象基因。

更具体地说，可以按照以下的步骤对DGE负荷样品和对照样品间的基因表达量的差别进行研究。

由来源于需要相互比较的生物的样品，例如由经过不同的处理的细胞制备成mRNA、对样品中的mRNA、该mRNA来源的cDNA或该cDNA转录或扩增的核酸进行标记。标记所用的标记物可以使用放射性同位素、荧光物质、化学发光物质、有发光团的物质等。例如，荧光物质有Cy2、FluorX、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、异硫氰酸荧光素(FITC)、德克萨斯红、若丹明等。此外，从同时检测的观点出发，最好用2种以上的荧光物质、较合适是用2种荧光物质对DGE负荷样品、对照样品分别用不同的荧光物质进行标记。另外，除了用化学方法标记样品中的mRNA、该mRNA由来的cDNA或该cDNA转录或扩增的核酸以外，也可以用下述方法，例如在由mRNA合成cDNA时、或在由cDNA转录、扩增反应时与标记核苷酸共存进行标记。

然后，使上述的标记核酸与固定了对应于适当的基因的核酸或其片段的DNA点阵进行杂交。杂交可用公知的方法进行，杂交条件可以适当地选择适合于所用的DNA点阵和标记cDNA的条件。例如，可按分子克隆，实验室指南(Molecular Cloning，A laboratory manual)第2版，第9.52-9.55页(1989)中所述的条件进行。

比较由上述杂交所得的来源于标记的信号，可以检测出样品信号强度存在有意义的差别的基因。具体地说，对于用上述方法标记的核酸样品进行杂交的点阵，使用专用测定器，例如色谱扫描仪或图像分析仪等，对放射能、荧光、发光等信号强度进行检测，根据该信号强度的差别，可以检测出其表达量有意义地变化的基因。标记的检测法，可以根据所用的标记物质的种类选择适合的方法。

用相互区别的标记物质对各种样品来源的核酸(mRNA、来源于该mRNA的cDNA或由该cDNA转录或扩增的核酸)进行标记，由此可以通过一次杂交，对两种样品中的基因表达量的差别进行比较。例如，上述用Cy3和Cy5作为标记物质的情况下，通过在532nm和635nm的波长下分别对Cy3和Cy5进行扫描，可以在1片DNA点阵上测定两种样品中的基因表达量。

这样，可以用微量的样品对不同样品之间的多种基因表达量进行比较。

另外，为了测定DGE负荷样品和对照样品的基因表达差别，必须对两者的mRNA量及使用的荧光物质间的强度差别进行修正，该修正可以用表达变化较少的标准基因(持家基因为合适)按公知的方法进行。

此外，本说明书中，判定基因表达量的差为占优势的情况是，例如，DGE负荷样品中基因表达量相对于对照样品中基因表达量的比，亦即，相对表达比率(DGE负荷样品中基因表达量/对照样品中基因表达量)为1.7以上或0.6以下。这里，相对表达比率为1.7以上时，判定为表达量增加的基因；0.6以下时判定为表达量减少的基因。

此外，DGE负荷样品和对照样品间的基因表达量的差，也可以按公知的DNA微珠点阵法进行。根据该方法，对表达量、和无论已知或未知的表达的基因都可进行分析。

按照上述的方法，对给予或摄取DGE的生物体和未给药的对照之间的基因表达状态进行比较，可以确定DGE能调控其表达的基因。以上那样确认的、作为DGE能对其产生基因表达调控作用的基因，例如可举出下述表1～3中所示的A～G群中所述的基因。

生物由于生活环境的变化等外部因素，病毒、细菌感染等内在的因素，受到各种各样的应激。作为应激，举例说明有，例如高温、低温环境、饥饿状态、暴露于化学物质中等。这里，作为化学物质，例如有佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(TPA)、脂多糖(LPS)、植物血球凝集素(PHA)、辛酸(オカダ酸)等。尤其是TPA和LPS，对生物体给药可引起炎症，利用这种作用，可用来制作人工的炎症模型。

受到这种应激的结果是，在生物体内，各种基因的表达发生变化。其中也存在应激的结果是表达诱导或增强，而对生物体产生不利影响的基因群(例如，A群及E群的基因)。也有为了除去应激的不利影响而使表达诱导或增强、或与未受应激的情况下的表达相同的基因群(例如B群及G群的基因)。受到应激，A群及E群基因产生高表达的状态，如果该表达处于持续不降低的状态，一般认为与各种疾病的发病有关。因此，受到应激时，使A群及E群的基因的表达处于难以增加的状态与各种疾病的预防有关。此外，受到应激时，使增加的A群及E群的基因的表达迅速地降低，这也与各种疾病的预防、治疗、防止恶化有关。一方面，B群及G群的基因属于为了避免应激状态而增加表达的基因群，受到应激时，这样的基因群的表达变得更高，这样可能迅速地避免应激的状态，一般认为与各种疾病的预防、治疗、防止恶化有关。

还有，如果说，应激的结果，为了除去应激的不利影响，而存在使表达减少或与未受应激的情况下的表达相同的基因群(例如C群及F群的基因)，那么也存在应激的结果，使表达减少而对生物体产生不利影响的基因群(例如D群的基因)。一般认为C群的基因是为了避免应激的状态而减少表达的基因群，受到应激时，这样的基因群的表达量进一步抑制，这样有可能迅速地避免应激的状态，与应激引起的各种疾病的预防、治疗、防止恶化有关。一方面，一般认为，受到应激，D群的基因产生表达降低的状态，如果其表达持续处于不增加的状态，则与各种疾病的发病有关。因此，受到应激时，D群的基因的表达增加与各种疾病的预防有关。另外，受到应激时，使减少的D群基因的表达迅速地增加也与各种疾病的预防、治疗、防止恶化有关。

根据本发明已查清，DGE抑制其表达(使其减少)的A群、C群、E群及F群的基因、以及DGE促进其表达(使其增加)的B群、D群及G群的基因在表1～3中表示。表1基因名称                                                基因库

                                                    登记号A群骨形态发生蛋白-6(BMP-6)                                 NM_001718趋化因子受体-1(CCR-1)                                   NM_001295肝细胞增殖因子(HGF)                                     X16323细胞间粘附分子-1(ICAM-1)                                NM_000201白介素-1β(IL-1β)                                      X02532白介素-16(IL-16)                                        M90391白血病抑制因子(LIF)                                     NM_002309骨桥蛋白(osteopontin)                                   NM_000582肿瘤坏死因子-α(TNF-α)                                 X02910神经纤维网-1(Neuropilin-1)                              NM_003873信号传导物和转录激活物6(STAT6)                          AF067575含有智人cDNA：FLJ22298倒位刺激基因，克隆HRC04637的基因  AK025951B群血红素加氧酶-1(H0-1)                                    NM_002133硫氧还蛋白还原酶-1                                      AF106697推定的翻译起始因子(SUI1)                                AF083441智人的推测的蛋白(HSPC014)                               NM_015932表2基因名称                                          基因库

                                              登记号C群N-myc下游调节性基因1(NDRG1)                       NM_006096腺苷脱氨酶，RNA特异性(ADAR)                       NM_015841剪接因子3b，亚基2(SF3B2)                          NM_006842白介素增强子结合因子3(ILF3)                       NM_004516缬氨酰基-tRNA合成酶2(VARS2)                       NM_006295含有序列表的序列号：12中所述的碱基序列的基因      无D群真核生物翻译延伸因子1α1(EEF1A1)                  NM_001402核糖体蛋白L17(RPL17)                              NM_000985核糖体蛋白L24(RPL24)                              NM_000986富含精氨酸/丝氨酸的剪接因子2(SFRS2)               NM_003016翻译调控的肿瘤蛋白1(TPT1)                         NM_003295还原型辅酶Q-细胞色素c还原酶结合蛋白(UQCRB)        NM_006294核糖体蛋白S15a(RPS15A)                            NM_001019核糖体蛋白L27(RPL27)                              NM_000988表3基因名称                                          基因库

                                              登记号E群白介素-2受体α(IL2RA)                             X01057白介素6(IL6)                                      X04430CD166                                             Y10183干扰素调节因子-1(IRF1)                            X14454白介素-1 5体α(IL15RA)                            U31628核因子kappa-b p105亚基(NFKB1)                     M58603天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1(CASP1)             M87507白介素-1β(IL1B)                                  M15330肿瘤坏列因子-α(TNF-α)                           X02910Gro1癌基因(GR01)                                  X54489白介素-1α(IL1A)                                  M28983抑制素βA(INHBA)                                  J03634白介素-7受体(IL7R)                                M29696前B细胞集落增强因子(PBEF)                         U02020肝和激活作用调节性趋化因子(LARC)                  U64197白介素-8(IL8)                                     M26383F群集落刺激因子-1受体(CSF1R)                         X03663趋化因子(C-X-C基元)受体-4(CXCR4)                  AF147204エンドグリン(ENG)                                 NM_000118G群血红素加氧酶-1(HM0X1)                             Z82244

对被检物质，与上述DGE同样地进行基因表达调控作用的研究，并通过与DGE的比较，可选择出与DGE有同样的基因表达调控活性的物质。另外，在施加被检物质负荷的场合与施加DGE负荷的场合的基因表达量的变化比较中，亦即在表达模式的比较中，可以对至少1种基因进行比较，但从发现更有用的物质的观点出发，优选对多种基因的表达模式进行比较。在这方面对本发明无特别的限定，例如优选对2种以上的基因、较优选对4种以上的基因、更优选对7种以上的基因的表达模式进行比较，选择所需要的具有基因表达调控活性的物质。

作为合适的方案，可以从上述的表1～3所示的A群～G群中选择至少1种基因进行比较，较优选的是从A群、C群、E群及F群中选择至少1种基因，以及从B群、D群及G群中选择至少1种基因(共计2种以上的基因)、更优选从A群～G群的每个群选择至少1种基因(共计7种以上的基因)、并对其表达模式进行比较。

此外，在以上的见解的基础上，根据本发明，提供如以下所述的本发明的生理活性物质筛选方法的其他方案。亦即，根据本发明，提供包含下述步骤的生理活性物质的筛选方法：

(1)将被检物质负荷施加于生物体的步骤、

(2)测定(1)的生物体中基因的表达量和未施加相应负荷的生物体中基因的表达量，比较两者的该测定值的步骤，以及

(3)选择被检物质的步骤，该被检物质可使选自表1～3中的A群、C群、E群及F群中的至少1种基因的表达量减少，和/或使选自B群、D群及G群中的至少1种基因的表达量增加。根据该方法，可以简便地得到与DGE有同样基因表达调控活性的物质。

此外，更详细而言，提供了如以下所述的本发明的生理活性物质的筛选方法的其他方案。亦即，根据本发明，提供包含下述步骤的生理活性物质的筛选方法：

(1)分别对生物体施加应激负荷、以及对生物体施加被检物质和应激负荷的步骤、

(2)分别测定(1)的生物体以及未施加任何负荷的正常生物体中的基因表达量的步骤，以及

(3)用由(2)所得的基因表达量就(1)的生物体和正常生物体作比较、选择被检物质的步骤，该被检物质表现出选自下述(a)～(g)所述的基因表达模式中的至少一种基因的表达模式：

(a)选自上述A群的至少1种基因的表达量，在对生物体施加应激负荷时，比正常生物体增加、在对生物体施加被检物质和应激负荷时减少。

(b)选自上述B群的至少1种基因的表达量，在对生物体施加应激负荷时，比正常生物体增加、在对生物体施加被检物质和应激负荷时进一步增加。

(c)选自上述C群的至少1种基因的表达量，在对生物体施加应激负荷时，比正常生物体减少、在对生物体施加被检物质和应激负荷时进一步减少。

(d)选自上述D群的至少1种基因的表达量，在对生物体施加应激负荷时，比正常生物体减少、在对生物体施加被检物质和应激负荷时增加。

(e)选自上述E群的至少1种基因的表达量，在对生物体施加应激负荷时，比正常生物体增加、在对生物体施加被检物质和应激负荷时减少。

(f)选自上述F群的至少1种基因的表达量，在对生物体施加应激负荷时，与正常生物体相同、在对生物体施加被检物质和应激负荷时减少。

(g)选自上述G群的基因的表达量，在对生物体施加应激负荷时，与正常生物体相同、在对生物体施加被检物质和应激负荷时增加。根据该方法，可以简便地得到与DGE有同样的基因调控活性的物质。

另外，上述的2种其他方案中，可以用与上述的DGE同样的方法，对被检物质的基因表达调控作用进行研究。此外，对生物体施加应激负荷，可按上述那样，将各种应激负荷施加于生物体，但优选用化学物质进行为合适，尤其是TPA(波佛醇肉豆蔻酸乙酸酯)处理或LPS(脂多糖)处理更为合适。这里所说的处理是指投予或使其摄取。

已知TPA是致癌的促癌剂，并已知它的作用除了直接变异作用外，还通过诱导生物体的炎症而致癌。亦即，TPA引起NO、前列腺素E2等炎症介体与巨噬细胞等炎症细胞的分离。

LPS是细胞因子诱导因子、对生物体产生发热、致死效果、血压降低等各种影响，但该作用不是LPS本身的直接作用，而是通过LPS，以巨噬细胞为中心的宿主细胞产生的炎症性细胞因子等所引起的作用。

上述A～D群是用TPA作为应激时，确认为基因有变化的基因群，而上述的E～G群是用LPS时确认为基因有变化的基因群。由于DGE抑制由TPA和LPS诱发的炎症，亦即，在上述步骤中的用TPA处理作为应激时，如果选择表现出上述基因表达模式(a)～(d)的化合物，对于诱发机制和TPA诱发的炎症相同的炎症来说，可期望得到对其治疗或预防有效的化合物，另外，用LPS处理作为应激时，选择表现出上述基因的表达模式(e)～(g)的化合物，对于诱发机制和LPS诱发的炎症相同的炎症来说，可期望得到对其治疗或预防有效的化合物。

另外，基因调控作用稍有不同的物质也可能具有DGE所具有的生理活性中的几种生理活性。这样的物质也可以作为DGE的替代物，根据其目的而使用。

还有，作为另一种方案，还提供适用于本发明的生理活性物质的筛选方法的试剂盒。该试剂盒至少要含有用来检测选自表1～3中所示的A群～G群的至少1种基因所表达的mRNA或其片段的引物和/或探针、或对应于该基因编码的多肽或其片段的抗体或其片段。[2]本发明的DNA点阵

本发明还提供用于上述生理活性物质筛选方法中的DNA点阵，该DNA点阵是将选自上述A～G群基因中的至少2种基因或其片段在载体上预先规定的位置固定化的DNA点阵。本发明的DNA点阵是上述受到DGE表达调控的基因或该基因来源的DNA片段在载体上预先规定的位置固定化的点阵。亦即，在载体上预先决定与各个基因对应的DNA或其片段的位置，使用这样的点阵时，由检测的信号的位置，可以直接知道该信号来自哪个基因的DNA或其片段。该点阵可用于上述[1]的生理活性物质的筛选、以及对DGE的投予或摄取有效的疾病从基因方面对病态的分解。

上述DNA点阵上固定的基因或其DNA片段，只要是受到施加于生物体的应激和DGE的表达调控的基因或其DNA片段、或者是含有这些基因或其DNA片段的物质，则无特别的限定，例如可以用下述的实施例3中所述的DNA微珠法，选择固定化的基因或其DNA片段。此外，也可以含有受到施加于生物体的应激和DGE表达调控的基因以外的基因，例如，作为阴性对照的基因等。另外，该点阵可以按照公知的方法制造，例如，可以使用上述[1]中所述的DNA点阵制作装置来制造。

本发明的DNA点阵中，基因或其DNA片段采用单链或双链固定都可以。还有，多聚核苷酸、寡核苷酸的任何一种都可以使用，而且，对其制法无特别的限定，化学法合成的、天然物质、酶法合成的，或其组合都可以。另外，基因或其DNA片段的链长无特别的限定，但最好长度为约20个碱基～约1kb(キロ塩基)，而且，比该链的长度短或长的基因或DNA片段，只要它与任意的被检样品中的核酸杂交时进行特异杂交，都可以使用。

点阵的载体、DNA固定化的密度也无特别的限定，根据目的和固定化的基因数适当选择即可。例如，作为DNA点阵的载体，可以用上述的材料，只要是可用于杂交的材料则无特别的限定，通常使用载玻片、硅芯片、硝酸纤维素和尼龙膜等。此外，制作大量的基因固定化的点阵和适用于微量样品的点阵时，可采用基因在载体上高密度地固定的微点阵。作为该微点阵，核酸、特别是DNA，以100个点/cm2以上的密度固定化为合适。另外，对其形状也无特别的限定，可适当选择平板状、圆盘状、带状等。〔3〕本发明的基因调控剂、基因调控方法

本发明还涉及生物体中的基因表达的调控方法，对该方法无特别的限定，对于受到应激的生物体中表达量发生变化的基因，提供对相应的基因的表达进行调控(调节)、保持生物体内平衡的方法、以及该方法所用的基因调控剂。

例如，一般认为，对受到上述的应激的生物体的影响，可能通过对该生物体中的基因的表达进行适当的调控而消除。为此，使用能对该基因，例如表1～3中所举出的基因，进行调控的化合物、或将该化合物作为有效成分而包含在内的组合物，亦即，根据本发明提供的基因调控剂是有效的。因此，该基因调控剂特别适用于应激的缓和或预防。

上述的基因调控剂中可以作为有效成分包含在内的化合物，例如可使用DGE、DGE衍生物和/或它们的盐类；还可以使用具有与DGE同样的基因表达调控活性的化合物、其衍生物和/或它们的盐类。另外，该化合物的衍生物可以与上述式(I)表示的化合物的衍生物同样地制造。作为具有与DGE同样的基因表达调控活性的化合物，可以使用上述〔1〕中所述的通过筛选所得的物质。

相应的基因调控剂可以按照公知的药物制造方法制备。例如，将上述有效成分与公知的药用液状或固体状载体混合，进一步按照要求，加入公知的溶剂、分散剂、乳化剂、稳定剂、润滑剂等，即可制成液剂、悬浊剂、乳剂等液体制剂、或片剂、颗粒剂、散剂、粉末剂等固形制剂。

上述的载体可根据本发明的基因调控剂的给药方式及剂型而选择。作为口服剂时，例如适宜采用淀粉、乳糖、甘露醇、羧甲基纤维素等。一方面，用作非口服剂时，例如，适宜采用注射用蒸馏水、生理盐水、大豆油、丙二醇等。

本发明的基因调控剂中的上述有效成分的含量不能根据基因调控剂的给药方式，给药方法等的变化一概而定，但只要是按照能获得本发明所要求的效果的量，而将上述有效成分给药，则对该量无特别的限定。

本发明的基因调控剂根据剂型通过适当的给药途径，可以口服或非口服给药。非口服给药时，例如作为注射剂，可以通过静脉内、肌肉内、皮下、皮内等给药。对该给药量也无特别的限定，例如，根据剂型、给药方法、使用目的、给药对象患者的年龄、体重、症状等，在可获得本发明所要求的效果范围内适当决定。

本发明的基因调控剂具体可用以下例子说明。

(1)含有某种化合物而制成的基因调控剂，该化合物具有使选自表1～3中所述的A群、C群、E群及F群的至少1种基因的表达量减少，和/或使选自B群、D群及G群的至少1种基因的表达量增加的作用；

(2)含有某种化合物而制成的基因调控剂，在受到应激负荷的生物体中，该化合物具有使选自表1～3中所述的A群、C群、E群及F群的至少1种基因的表达量减少，和/或使选自B群、D群及G群的至少1种基因的表达量增加的作用；

(3)含有某种化合物而制成的基因调控剂，在受到应激负荷的生物体中，该化合物具有使因应激而增加表达量的选自表1～3所述的A群及E群的至少1种基因的表达量减少的作用；

(4)含有某种化合物而制成的基因调控剂，在受到应激负荷的生物体中，该化合物具有使因应激而增加表达量的选自表1～3所述的B群及G群的至少1种基因的表达量增加的作用；

(5)含有某种化合物而制成的基因调控剂，在受到应激负荷的生物体中，该化合物具有使因应激而减少表达量的选自表1～3所述的C群及F群的至少1种基因的表达量减少的作用；

(6)含有某种化合物而制成的基因调控剂，在受到应激负荷的生物体中，该化合物具有使因应激而减少表达量的选自表1～3所述的D群的至少1种基因的表达量增加的作用；

进一步根据本发明，提供以下的基因调控方法：

将选自上述(i)所述的化合物、(ii)所述的化合物，以及对至少1种基因具有与这些化合物实质上相同的基因表达调控活性的化合物中的至少1种化合物、或含有该化合物的组合物，施予生物体，由此使选自表1～3中所述的A群、C群、E群及F群中的至少1种基因的表达量减少，和/或使选自B群、D群及G群中的至少1种基因的表达量增加的基因调控方法、以及

将选自上述(i)所述的化合物、(ii)所述的化合物，以及对至少1种基因具有与这些化合物实质上相同的基因表达调控活性的化合物中的至少1种化合物、或含有该化合物的组合物，施予受到应激负荷的生物体，由此使选自表1～3中所述的A群、C群、E群及F群的至少1种基因的表达量减少，和/或使选自B群、D群及G群的至少1种基因的表达量增加的基因调控方法。

这里所说的生物体是指哺乳动物，尤其是指人。此外，作为对至少1种基因实质上有相同的基因表达调控活性的化合物，可以适当地使用上述〔1〕中所述的通过筛选方法所得的物质。

根据这样的基因调控方法，可以合适地对表1～3所示的基因的表达进行调控，有可能缓和和/或避免生物体受到的应激。

另外，作为有效成分给药的化合物或含有该化合物的组合物的给药方法、给药量等，可以与上述基因调控剂相同。

根据本发明的基因的调控方法，在抑制因应激而对生物体产生不利影响的基因群的表达的同时，增强与避免应激状态有关的基因群的表达，可以对各种疾病进行预防、治疗、阻止恶化。

以下，举出实施例对本发明进一步具体地说明，但本发明不限定于这些实施例。

实施例1

(1)RNA的制备

将HL-60细胞(ATCC CCL-240)悬浮于含有10％牛胎儿血清(JRHバイオサイエンシズ公司生产)、1.3％含有二甲亚砜的RPMI1640培养基(バイオウイタカ-公司生产，12-702F)中，5％碳酸气存在下、37℃下培养1周、分化诱导成嗜中性细胞。

将上述所得的细胞离心分离回收，按10⁶个细胞/ml的浓度悬浮于含10％牛胎儿血清的RPMI1640培养基中，每个10cm的培养皿中加入10ml。设定各个培养皿中加入100μl的4mM DGE水溶液，4小时后回收总RNA的组、添加10μl的100μg/ml佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(TPA、ギブコ社制、13139-019)二甲亚砜溶液，4小时后回收总RNA的组、添加100μl的4mMDGE水溶液，培养6小时后再添加10μl的100μg/ml TPA二甲亚砜溶液，4小时后回收总RNA的组。此外，设定添加100μl的水、4小时后回收总RNA的组，作为阴性对照。另外，用Rneasy Mini试剂盒(キアゲン公司生产，74104)，按照试剂盒的说明书制备。

(2)cDNA的合成

将上述所得的各总RNA 25μg和100pg的λpolyA+RNA-A(宝酒造公司生产，TX802)，用RNA荧光标记核心试剂盒(宝酒造公司生产，TX807)和1mM F luoroLink Cy3-dUTP或Cy5-dUTP(Amersham·Pharmacia公司生产，PA53022(Cy3)、PA55022(Cy5))、按试剂盒的说明书进行荧光标记的cDNA合成反应和精制。将荧光标记的DNA溶液按表4的组合混合，用氯仿·异戊醇(24∶1)进行抽提、加入2μl的5×CompetitorI(Human)(宝酒造公司生产，TX808)、用乙醇沉淀、回收DNA。所得的DNA溶于10μl的杂交溶液(经过0.22μm的过滤器过滤的6×SSC、

0.2％SDS、5×Denhard溶液、0.1mg/ml变性鲑鱼精子DNA溶液)中，备作杂交之用。

表4

组合1	阴性对照(Cy3标记)和DGE添加部分(Cy5标记)
		组合2	阴性对照(Cy3标记)和TPA添加部分(Cy5标记)
组合3	阴性对照(Cy3标记)和DGE及TPA添加部分(Cy5标记)
		组合4	TPA添加部分(Cy3标记)和DGE及TPA添加部分(Cy5标记)

(3)杂交

在盖玻片(22×22mm)上滴下10μl的预杂交溶液(经过0.22μm的过滤器过滤的6×SSC、0.2％SDS、5×Denhard溶液、1mg/ml变性鲑鱼精子DNA溶液)，将人细胞因子芯片(ver.1.0)(宝酒造公司生产，X104)的DNA点阵DNA面向下地复盖在盖玻片上，而且不使气泡进入。将芯片翻过来，使DNA面向上、用胶纸(コクヨ社制，タ-100)将盖玻片周边滴下的溶液封闭，在室温下放置2小时进行预杂交。将芯片移至2×SSC中并将胶纸和盖玻片取下，在2×SSC中、然后在0.2×SSC中洗净后，通过离心除去水份使其干燥。

使上述的溶于杂交液的荧光标记DNA溶液在95℃下加热2分钟使其变性后，离心、并将上清液滴下至盖玻片(22×22mm)上，将经过上述处理的芯片的DNA点阵面向下地复盖在盖玻片上、而且不使气泡进入。将芯片翻过来，使DNA面向上、用胶纸将盖玻片周边滴下的溶液封闭。将此芯片放入湿箱后，置于65℃的恒温槽内保温16小时。将芯片移至2×SSC中并将胶纸和盖玻片取下，在55℃的2×SSC、0.2％SDS中洗2次，每次30分钟、然后在65℃的2×SSC、0.2％SDS中洗5分钟、在室温的0.05×SSC中洗5分钟后，通过离心除去水份使其干燥。

(4)分析

用Affymetrix418点阵扫描仪(宝酒造公司生产，GM205)读取上述芯片的各个点的荧光信号。以该图象数据为基础，用ImaGene(宝酒造公司生产，，BD001)对各个点的荧光信号进行定量。结果，可以确认，TPA添加组中，有几个基因的表达有变化、与此对应，可以确认，DEG+TPA添加组中，该变化进一步上下变动。亦即，可以确定，对于某几个基因，DGE对因TPA引起的基因变化有修饰作用。该结果归纳在表5中表示。表5归纳了因TPA而产生变化的基因中，通过DGE修饰其变化的基因，A-1群是通过DGE抑制其表达的基因、B-1群是通过DGE促进其表达的基因。

表5

基因名称                                     基因库

                                             登记号

A-1群

骨形态发生蛋白-6(BMP-6)                      NM_001718

趋化因子受体-1(CCR-1)                        NM_001295

肝细胞增殖因子(EGF)                          X16323

细胞间粘附分子-1(ICAM-1)                     NM_000201

白介素-1β(IL-1β)                           X02532

白介素-16(IL-16)                             M90391

白血病抑制因子(LIF)                          NM_002309

骨桥蛋白(osteopontin                         NM_000582

肿瘤坏死因子(TNF-α)                         X02910

神经纤维网-1(Neuropilin-1)                   NM_003873

B-1群

血红素加氧酶-1(H0-1)                         NM_002133

硫氧还蛋白还原酶-1                           AF106697

实施例2

(1)PBMC的分离及保存

从健康人供体采血400ml。采集的血液用PBS(-)稀释2倍、在Ficoll-paque(Pharmacia公司生产)上分层后在500×g下离心20分钟。用移液器回收中间层的外周血单核细胞(PBMC)、用RPMI1640培养基(バイオウイタカ-公司生产)洗净。采集的PBMC悬浮于90％FCS(JRHバイオサイエンシズ公司生产)/10％二甲亚砜的保存液中，保存在液氮中。实验时，将保存的PBMC在37℃的水浴中迅速融解、用含10μg/ml DNase(DNA酶，カルビオケム公司生产)的RPMI1640培养基洗净后，用锥虫蓝染色法算出活细胞数供各实验之用。

(2)塑料粘着性单细胞的分离

将PBMC按照1×10⁷个细胞/ml的浓度悬浮于含有5％的人AB血清、0.1mM非必须氨基酸、1mM丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺(以上バイオウイタカ-公司生产)、10mMHEPES(ナカライテスク公司生产)、1％链霉素-青霉素(ギブコBRL公司生产)的RPMI1640培养基(以下简称为5HRPMI培养基)中、然后在每个100mm的培养皿(旭テクノグラス公司生产)上涂布15ml、在37℃下、5％的CO₂的湿式保温箱内保温1.5小时。然后吸去非粘着性的细胞，用RPMI1640将各池洗净、加入10ml的5HRPMI培养基，即得到塑料粘着性的单细胞。

(3)RNA的制备

设定实施例2-(2)所得的各培养皿中加入10μl的1μg/ml脂多糖(LPS，Sigma公司生产，L-2012)水溶液，4小时后回收总RNA的组、添加10μl的20mM DGE水溶液培养4小时后再加10μl的1μg/ml LPS水溶液，4小时后回收总RNA的组。此外，设定作为阴性对照、添加10μl的水，4小时后回收总RNA的组。另外，RNA用Rneasy Mini试剂盒(キアグン公司生产，74104)，按试剂盒的操作说明书制备。

(4)cDNA的合成

cDNA的合成按实施例1-(2)所述的方法进行。但是，荧光标记的DNA溶液的组合按照表6进行。

表6

组合1	阴性对照(Cy3标记)和LPS添加组(Cy5标记)
		组合2	阴性对照(Cy3标记)和DGE及LPS添加组(Cy5标记)

(5)杂交

杂交按照实施例1-(3)所述的方法进行，但芯片采用人细胞因子芯片(ver.1.0)(宝酒造公司生产，X104)。

(6)分析

用Affymetrix 428 Array Scanner(宝酒造公司生产)读取上述芯片上各个点的荧光信号。用ImaGene(宝酒造公司生产，BD001)对该图象数据的各个点的荧光信号进行定量。结果，可以确认，有几个基因在添加LPS的组的表达增加，与此相对，也可以确认，由于添加了DGE而抑制了该表达的增加。此外，有几个基因虽然在添加LPS的组未看到表达的变化，但可以确认在添加DGE+LPS的组表达的增加和下降。其结果归纳如表7所示。表7总结的内容是因LPS使其表达增加的基因中，通过DGE抑制该增加的基因(E群)、虽然LPS使其表达无变化，但在DGE+LPS的组其表达下降的基因(F群)和增加的基因(G群)。表7基因名称                                         基因库

                                             登记号E群白介素-2受体α(IL2RA)                            X01057白介素6(IL6)                                     X04430CD166                                            Y10183干扰素调节因子-1(IRF1)                           X14454白介素-15受体α(IL15RA)                          U31628核因子kappa-b p105亚基(NFKB1)                    M58603天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1(CASP1)            M87507白介素-1β(IL1B)                                 M15330肿瘤坏列因子-α(TNF-α)                          X02910Gro1癌基因(GR01)                                 X54489白介素-1α(IL1A)                                 M28983抑制素βA(INHBA)                                 J03634白介素-7受体(IL7R)                               M29696前B细胞集落增强因子(PBEF)                        U02020肝和激活作用调节性趋化因子(LARC)                 U64197白介素-8(IL8)                                    M26383F群集落刺激因子-1受体(CSF1R)                        X03663趋化因子(C-X-C基元)受体-4(CXCR4)                 AF147204エンドグリン(ENG)                                NM_000118G群血红素加氧酶-1(HM0X1)                            Z82244

实施例3 DNA微珠的制作和基因的选择

按照Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第97卷，第1665-1670页(2000年)(以下称为文献1)所述的方法，如以下所示的方法制作DNA微珠。

(1)cDNA的合成

将人前骨髓性白血病细胞HL-60细胞(ATCC CCL-240)悬浮于含有10％牛胎儿血清(JRHバイオサイエンシズ公司生产)、1.3％二甲亚砜的RPMI1640培养基中(バイオウイタカ一公司生产)，在5％碳酸气存在下，37℃下培养1周，使上述细胞分化诱导成嗜中性细胞。将所得的细胞离心回收，按照1×10⁶个细胞/ml的浓度悬浮于含有10％牛胎儿血清的RPMI1640培养基中，然后将此悬浮液加入2个10cm的培养皿内，每个10ml。1个培养皿内加入100μl的水(A)，另一个培养皿内加入10μl的100μg/ml佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(TPA，ギブコ公司生产)二甲亚砜溶液(B)，分别培养4小时。用Trizol试剂(ギフゴ公司生产)分别由每个培养皿回收的(A)、(B)的细胞制备总RNA，然后用オリゴテツクス^TM-dT30(宝酒造公司生产)由总RNA精制mRNA。以2.5μg的该mRNA为模板，用cDNA合成试剂盒(ストラタジ一ン公司生产)合成cDNA。此时，反转录所用的引物采用序列表的序列号：1中所示的碱基序列的5’生物素标记引物。

用苯酚·氯仿处理上述所得的cDNA，用Cellulose CL4B(Amersham·Pharmacia公司生产)凝胶过滤精制后、乙醇沉淀。沉淀后回收的cDNA溶于200μl的DphII缓冲液(New England Biolabs公司生产)中，用限制酶DpnII(New England Biolabs公司生产)消化，用链霉抗生物素蛋白磁珠(タイナ一ル公司生产)由消化物回收cDNA的3’端部分后，加入20μl的10×NEB#2缓冲液(New EnglandBiolabs公司生产)，使总体积调至200μl，用限制酶BsmBI(NewEngland Biolabs)进行消化。反应液用苯酚·氯仿处理和乙醇沉淀后，将沉淀溶于10.5μl的无菌水中，作为3’端的cDNA溶液用于以下的实验中。

(2)3’端cDNA和带有抗标记物的微珠的杂交

来源于由实施例3-(1)合成的(A)和(B)的3’端cDNA溶液1μl分别插入200ng文献1所述的标记载体pLCV2中，制备成6个14万-18万个克隆的质粒库。每份100μl的反应液分别使用100pmol的序列表的序列号：2中所述的碱基序列的5’生物素标记引物、和序列表的序列号：3中所述的碱基序列的5’FAM标记引物，每份反应液以125ng上述各质粒库的质粒为模板进行PCR反应，每个质粒库进行48份PCR反应，PCR反应按以下条件进行。

94℃-保持3分钟

94℃-30秒、67℃-3分钟为1个循环，共8个循环

94℃-30秒、64℃-3分钟为1个循环，共22个循环

67℃-保持3分钟

反应结束后，分别将每个库的PCR反应液收集为1份，用苯酚·氯仿处理和乙醇沉淀后，所得的沉淀溶于1200μl无菌水中。溶解的沉淀中加入180μl 10×NEB#4缓冲液(New England Biolabs公司生产)，将总量调至1800μl，然后用限制酶PacI(New England Biolabs公司生产)进行消化。从反应液中除去吸附在超交联SA树脂(ウルトラリンクSAレジン，ピアス公司制)上的级分，所得的cDNA溶液用苯酚·氯仿处理和乙醇沉淀后，沉淀溶于1200μl无菌水中，在此溶解的沉淀中加入180μl 10×NEB#2缓冲液(New England Biolabs公司生产)，使总量调整至1800μl(用T4DNA聚合酶(宝酒造公司生产)处理，此时另加入作为底物的dGTP，使标记部分单链化。

将带有单链标记的cDNA的各个库按每个库用300μg与文献1所述的14400万个带抗标记物的微珠混合，在400μl的杂交缓冲液(10mM磷酸缓冲液(pH7.2)、0.5MNaCl、0.01％Tween20、1.2％硫酸葡聚糖)中，72℃下振荡3天进行杂交。通过离心分离收集微珠悬浮于500μl的10mMTris-HCl(pH7.9)、10mM MgCl₂、50mMNaCl、1mM二硫苏糖醇、0.01％Tween20中，64～70℃下振荡洗涤30分钟。收集反复洗涤数次后的6个库的cDNA微珠，用MoFloサイトメ-タ-(サイトメ-シヨン公司生产)测定微珠的FAM的荧光强度(激发波长：488nm、检测波长：530nm)、从荧光强度大的微珠中选出1％的微珠。通过以上的操作得到的约600万个经杂交与cDNA结合的微珠。

(3)DNA微珠悬浮液的制备

将实施例3-(2)所得的、通过杂交与cDNA结合的微珠约200万个，悬浮于100μl的10mM Tris-HCl(pH7.9)、10mM MgCl₂、50mM NaCl、1.4mM二硫苏糖醇、0.01％Tween 20、各0.1mM的dATP、dGTP、dTTP、5-甲基dCTP、1mMATP中，加入20U的T4DNA聚合酶和400U的T4DNA连接酶、12℃下反应2小时，用链霉蛋白酶处理停止反应，通过离心分离收集反应液中的微珠，悬浮于100μl的DpnII缓冲液(NewEngland Biolabs公司生产)中，用DpnII(New England Biolabs公司生产)消化。通过离心分离收集微珠，悬浮于100μl的10mMTris-HCl(pH7.5)、5mM MgCl₂、0.033mM dGTP、7.5mM二硫苏糖醇、0.01％Tween20中，加入10U的DNA聚合酶I大片段(宝酒造公司生产)，25℃下反应15分钟。通过离心分离收集微珠，悬浮于100μl的连接缓冲液(宝酒造公司生产)中之后，加入0.1nmol预先用序列表的序列号：4、序列号5中所示的碱基序列的DNA经退火制成的接头，用T4DNA连接酶(宝酒造公司生产)进行连接反应。离心收集微珠、悬浮于脱微珠溶液(150mM NaOH、0.01％Tween20)中，室温下反应10分钟。反应液离心分离除去上清后，用10mMTris-HCl(pH8.0)、1mMEDTA、0.01％Tween20洗净、悬浮于1ml的10mMTris-HCl(pH8.0)、1mMEDTA、0.01％Tween20中，得到来源于样品1和样品2的DNA微珠悬浮液。

(4)探针的制备

将1μl实施例3-(1)制备的(A)和(B)来源的3’端cDNA分别插入200ng文献1所述的探针载体pLCV中，制备含有800万-1000万个克隆的质粒。在每10μg该质粒中加入通用缓冲液H(宝酒造公司生产)20μl，将总量调至200μl后，用限制酶Sau3A I(宝酒造公司生产)消化。以1.2μg(A)来源的经Sau3AI消化过的质粒1.2μg为模板，用2nmol序列表的序列号：6所示的碱基序列的5′FAM标记引物、或用2.4μg(B)来源的经Sau3AI消化过的质粒2.4μg为模板，用4nmol序列表的序列号：7中所示的碱基序列的5’Cy5标记引物，分别进行线性PCR。线性PCR按以下条件进行。

95℃-保持5分钟

95℃-30秒、64℃-30秒、72℃-30秒为一个循环，共25个循环。

72℃-保持10分钟

用キアクイツクPCR纯化试剂盒(キアゲン公司生产)由每种线性PCR后的反应液精制扩增的DNA、用乙醇沉淀后，溶于21μl无菌水中，得到来源于样品1的FAM荧光标记探针和来源于样品2的CY5荧光标记探针。

(5)和DNA微珠的杂交

将实施例3-(3)制备的来源于样品1的DNA微珠和来源于样品2的DNA微珠各约36万个混合，在该微珠中加入(4)制备的来源于样品1的FAM荧光标记探针和来源于样品2的Cy5荧光标记探针各5μg，在50μg的缓冲液(4×SSC、25％甲酰胺、0.1％SDS)中，65℃下振荡杂交过夜。离心分离收集微珠、用1×SSC，0.1％SDS在65℃下洗涤30分钟，用0.1SSC，0.1％SDS在65℃下洗涤30分钟，离心分离收集DNA微珠，并将其悬浮于10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mMEDTA、0.01％Tween20中，即得到杂交过的DNA微珠。

(6)分类

将实施例3-(5)所得的杂交过的DNA微珠，提供给用MoFloサイトメ-タ-(サイトメ-シヨン公司生产)进行分类之用。对于DNA微珠，测定其FAM的荧光强度(激发波长：488mm、检测波长：530mm)和Cy5的荧光强度(激发波长：647nm、检测波长670nm)，分选出了3692个(微珠悬浮液A)FAM的荧光强的DNA微珠、3349个(微珠悬浮液B)Cy5的荧光强度强的DNA微珠。

(7)PCR以及DNA碱基的确定

以实施例3-(6)中选出的微珠悬浮液A和B为模板，用序列表的序列号：8和序列号：9分别所示的碱基序列为引物，进行PCR。每100μl反应液中，加入200个微珠模板和40pmol引物，微珠悬浮液A、B各自分别进行5份反应。PCR按以下条件进行。

95℃-保持5分钟

95℃-30秒、64℃-30秒、72℃-30秒为1个循环，共25个循环

72℃-保持10分钟

将悬浮液A、B的PCR反应液各自合并为1份，每种取1μl与克隆载体pT7Blue(ノバジエン公司制)混合，进行连接、克隆。由微珠悬浮液A来源的960个克隆和微珠悬浮液B来源的960个克隆共1920个克隆提取质粒，分析插入的DNA片段的碱基序列。从所得的碱基序列中，选择满足以下所示条件之一的序列。

条件1：插入序列的长度为40个碱基以上的序列。

条件2：插入序列的长度为30个碱基以上的序列，40个碱基以下、无polyA序列的序列。

多个质粒出现同一序列时，任意选择1个质粒，得到740个用于DNA点阵的模板质粒。

实施例4用DNA点阵的表达分析

(1)DNA点阵的制作

以实施例3中所得的740个克隆的质粒为模板，用含有序列表的序列号：10和11中所述的序列的一对引物进行PCR反应。随后，将该扩增反应产物用乙醇溶液精制后按0.3μg/μl的浓度溶于1×溶液T(SolutionT，宝酒造社制)中，将此溶液作为制作点阵的溶液。用Affymetrix 417点阵仪(Affymetrix公司生产)，将此溶液点在氨基化的载玻片MAS涂层载玻片(松浪硝子公司生产)上。点过样后的载玻片在37℃、湿度90％下保持1小时后，用能量为60mJ/cm²的UV进行交联。再用0.2％SDS洗涤1次，然后用蒸馏水洗涤2次后，在由2.75g琥珀酸酐和162.5ml的N-甲基-2-吡咯烷酮、15ml的1M硼酸缓冲液(pH8.0)配成的封闭溶液中浸20分钟，封闭游离的氨基。随后，用蒸馏水洗2次后，在沸水中热变性2分钟、用冰冷的100％乙醇迅速冷却、然后在1,000rpm左右下低速离心分离、使载玻片干燥，用于以下的实验中。

(2)细胞的制备

将HL-60细胞(ATCC CCL-240)悬浮于含有10％牛胎儿血清(JRHバイオサイエンシズ公司生产)、1.3％二甲亚砜的RPMI1640培养基(バイオウイタカ一公司生产，12-702F)中，在5％碳酸气存在下，37℃下培养1周，分化诱导成嗜中性细胞。离心分离回收所得的细胞，按106个细胞/ml的浓度悬浮于含有10％牛胎儿血清的RPMI1640培养基中，并在每个10cm的培养皿中加入10ml。设定各培养皿中添加100μl的4mM DGE水溶液，4小时后回收RNA的组、添加10μl的100μg/ml的佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(TPA，ギブコ公司生产，13139-019)的二甲基亚砜溶液，4小时后回收RNA的组、添加100μl的4mMDGE水溶液，培养6小时后再加入10μl的100μg/ml TPA二甲亚砜溶液，4小时后回收RNA的组。另外，设定作为阴性对照，添加100μl的水，4小时后回收RNA的组。

(3)检测用的标记cDNA的制备和杂交

实施例4-(2)中制备的HL-60细胞，用Trizol Reagent(GIBCOBRL公司生产)和Oligotex-dT30<Super>(宝酒造公司生产)，按照各自的试剂盒的方法说明制备PolyA(+)RNA。然后用RNA FluorescenceLabeling Core Kit(M-MLV Version)(宝酒造公司生产)。按照试剂盒的方法说明，以1.0μg的每种PolyA(+)RNA为模板，按表8所示的样品RNA的组合，制备以Cy3和Cy5标记的cDNA、并混合。

表8

样品号	Cy3	Cy5
			1	未处理	DGE处理
2	未处理	TPA处理
			3	TPA处理	DGE处理+TPA处理
4	未处理	DGE处理+TPA处理

接着，按照IntelliGene(宝酒造公司制)的操作说明书，使实施例4-(1)中制备的DNA微点阵和上述的Cy3标记的cDNA和Cy5标记的cDNA的混合物(4种)进行杂交，并进行洗净、干燥的操作。然后用Affymetrix 428 Array Scanner(Affymetrix公司生产)得到Cy3(激发波长：532nm，检测波长570nm)和Cy5(激发波长：635nm，检测波长：660nm)的荧光图像。其后，用图像定量分析软件ImaGene4.1(Biodiscovery公司生产)定量算出各点的点领域的信号强度平均值和点的周边领域(以下称为背景领域)的信号强度的平均值和标准偏差。

(4)各克隆的分组

由表达比率通过统计分析对各克隆进行分组，必须删除可靠性低的数据和未表现出有意义变化的克隆的数据。因此，按照以下的次序对提供分组的克隆进行交叉。亦即，由实施例4-(3)中所得的背景领域的信号强度平均值和标准偏差，按照以下的公式求出信号强度的阈值。

信号强度的阈值＝背景领域的信号强度平均值+2×(背景领域的信号强度的标准偏差)

根据各点领域的信号强度的平均值是否比上述的阈值大，判断该点信号在各系统中的有意义性。然后，将全部4个样品Cy3和Cy5两系统中无有效信号的点的克隆除外。再算出Cy5的信号强度对Cy3信号强度的比率(以下称为表达比率)，对全部样品中该比率大于1/2而且小于2的克隆，作为未表现出变化的克隆在以后的分析中除去。以上交叉的结果，从740个克隆中选出227个克隆。

然后，对于上述选出的227个克隆，通过TPA和DGE的处理，其表达发生变化的克隆，亦即样品3或4的表达比率值为0.55以下或1.8以上的克隆，根据DGE处理的变化的关系，可以分为以下4个组。

A-3群经TPA处理表达增加，再经DGE处理，其表达降低的克隆。

B-3群经TPA处理表达增加，再经DGE处理，其表达增加的克隆。

C-3群经TPA处理表达降低，再经DGE处理，其表达降低的克隆。

D-3群经TPA处理表达降低，再经DGE处理，其表达增加的克隆。

针对这些克隆的相同性进行检索。根据这些结果，对于分成4组的克隆，所得到的相同性的碱基序列名及其基因库的登记号在表9和表10中表示。另外，在表9和表10中，对于看到有相同性的克隆用其在基因库登记的碱基序列名表示、对于未看到有相同性的克隆其序列表的序列号表示。表9认为有同源性的碱基序列                                  基因库

                                                    登记号A-3群智人信号传导蛋白和转录激活物6(STAT6)基因，              AF067575外显子15至23和完全的cds基因智人cDNA：PLJ22298倒位刺激基因，克隆HRC04637            AK025951B-3群智人SUI1固源mRNA，完全的cds基因                         AF083441智人的推测的蛋白(HSPC014)，mRNA                         NM_015932C-3群智人cDNA：FLJ22730倒位刺激基因，克隆HSI15793，          AK026383高度类似于AF004162同型早期人类镍特异性的诱导蛋白(Cap43)mRNA智人腺苷脱氨酶，RNA特异性(ADAR)，转录物变异的           NM_015841ADAR-c，mRNA智人剪接因子3b，亚基2，145kD(SF3B2)，mRNA               NM_006842结合双链RNA的细胞核蛋白ILF3所结合的智人的部分           AJ271747mRNA，可变转录物人转移缬氨酰基-tRNA合成酶nRNA，cds的3′端               M98326序列表的序列号：12中所述的碱基序列                      无表10认为有同源性的碱基序列                                   基因库

                                                     登记号D-3群智人cDNA：FLJ22997倒位刺激基因，克隆KAT11962，           AK026650高度类似于延伸因子1-α的HSEF1AC人mRNA(克隆CEF4)智人核糖体蛋白L17(RPL17)mRNA                             NM_00985智人核糖体蛋白L24(RPL24)mRNA                             NM_00986智人染色体17，克隆hRPK318_A_15，完全序列                 X75755翻译调控的肿瘤蛋白(TCTP)的智人TPT1基因，外显子           AJ4007171-6智人还原型辅酶Q-细胞色素C还原酶结合蛋白(UQCRB)           NM_006294mRNA智人核糖体蛋白S15a(RPS15A)mRNA                           NM_001019智人核糖体蛋白L27(RPL27)mRNA                             NM_000988

由这些结果推测，分别分类为A-3群、B-3群、C-3群、D-3群的克隆是表11所示的基因的部分序列。另外，表11中的基因库登记号中，基因的全碱基序列尚未清楚的，用表9及10所述的碱基序列的基因库登记号表示。表11基因名称                                                   基因库

                                                       登记号A-3群信号传导蛋白和转录激活物6(STAT6)                           AF067575含智人cDNA：FLJ22298倒位刺激基因，克隆HRC04637的基因       AK025951B-3群推定的翻译起始因子(SUI1)                                   AF083441智人的推测的蛋白(HSPC014)                                  NM_015932C-3群N-myc下游调节性基因1(NDRG1)                                NM_006096腺苷脱氢酶，RNA特异性(ADAR)                                NM_015841剪接因子3b，亚基2(SF3B2)                                   NM_006842白介素增强子结合因子3(ILF3)                                NM_004516缬氨酰基-tRNA合成酶2(VARS2)                                NM_006295含有序列表的序列号：12中所述的碱基的基因                   无D-3群真核生物翻译延伸因子1α1(EEF1A1)                           NM_001402核糖体蛋白L17(RPL17)                                       NM_000985核糖体蛋白L24(RPL24)                                       NM_000986富含精氨酸/丝氨酸的剪接因子2(SFRS2)                        NM_003016翻译调控的肿瘤蛋白1(TPT1)                                  NM_003295还原型辅酶Q-细胞色素c还原酶结合蛋白(UPCRB)                 NM_006294核糖体蛋白S15a(RPS15A)                                     NM_001019核糖体蛋白L27(RPL27)                                       NM_000988

序列表说明

序列号：1的序列是有关总mRNA反转录用引物的序列。

序列号：2的序列是扩增标记载体pLCV2的一部分的PCR所用的引物序列。

序列号：3的序列是扩增标记载体pLCV2的一部分的PCR所用的引物序列。

序列号：4的序列是寡核苷酸接头的序列。

序列号：5的序列是寡核苷酸接头的序列。

序列号：6的序列是扩增探针载体pLCV的一部分的线性PCR所用的引物序列。

序列号：7的序列是扩增探针载体pLCV的一部分的线性PCR所用的引物序列。

序列号：8的序列是有关DNA微珠上的cDNA的PCR所用的引物序列。

序列号：9的序列是有关DNA微珠上的cDNA的PCR所用的引物序列。

序列号：10的序列是扩增pT7Blue载体的一部分的PCR所用的引物序列。

序列号：11的序列是扩增pT7Blue载体的一部分的PCR所用的引物序列。

工业上应用的可能性

本发明提供筛选具有与DGE同样的基因表达调控活性的生理活性物质、或生理活性物质的候补物质的方法、对维持生物体的恒常性有效的，例如缓和或预防应激为目的的基因调控剂、以及基因调控的方法。根据本发明，例如，对于DGE的各种生理活性的表达起有效作用的疾病或症状来说，可以期望有治疗或预防效果。

                            序列表<110>宝生物工程株式会社<120>生理活性物质的筛选方法<130>01-065-PCT<150>JP 2000-303644<151>2000-10-03<150>JP 2001-283393<151>2001-09-18<160>12<210>1<211>43<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于总mRNA反转录的引物<400>1gacatgctgc attgagacga ttctttttt tttttttttt ttv             43<210>2<211>25<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>扩增标记载体pLCV2的一部分所用的PCR引物<400>2cgccagggtt ttcccagtca cgacg                                25<210>3<211>24<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>扩增标记载体pLCV2的一部分所用的PCR引物<400>3gcttccggct cgtatgttgt gtgg                                 24<210>4<211>14<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>设计的寡核苷酸接头组成<400>4gactggcagc tcgt                                            14<210>5<211>17<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>设计的寡核苷酸接头组成<400>5atcacgagct gccagtc                                         17<210>6<211>18<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>扩增探针载体pLCV的一部分所用的线性PCR引物<400>6tgtaaaacga cggccagt                                        18<210>7<211>18<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>扩增探针载体pLCV的一部分所用的线性PCR引物<400>7tgtaaaacga cggccagt                                        18<210>8<211>19<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于插入DNA微珠的cDNA的PCR引物<400>8gcccgcattg agacgattc                                       19<210>9<211>18<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于插入DNA微珠的cDNA的PCR引物<400>9gattggcagc tcgtgatc                                        18<210>10<211>20<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>扩增pT7Blue载体的一部分所用的PCR引物<400>10agggttttcc cagtcacgac                                              20<210>11<211>20<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>扩增pT7Blue载体的一部分所用的PCR引物<400>11atgcttccgg ctcgtatgtt                                              20<210>12<211>73<212>DNA<213>同型早期人类<400>12tttttttttt ttttgtcatg ttggagttat gaggggaatg gggagttgtt tgtttccatt  60tgtaaactcg atc                                                     73

Claims (23)

1.一种生理活性物质的筛选方法，其特征在于该方法包含下述步骤：

(1)将①被检物质、及②下述(i)中所述的化合物和/或下述(ii)中所述的化合物分别对生物体施加负荷的步骤：

(i)选自下述以式(I)表示的化合物、它的衍生物及它们的盐中的至少1种化合物、

(式中，X及Y是H或CH₂OH，但是，X为CH₂OH时，Y为H，X为H时，Y为CH₂OH)

(ii)选自以下式(II)表示的3，6-脱水半乳糖、它的醛体、它的水合物，以及它们的2-O-甲基化物及2-O-硫酸化物中的至少1种化合物、和/或选自在还原末端有该化合物的可溶性糖化合物的至少1种化合物，

(2)测定(1)的生物体中的基因表达量，比较负荷为①时和负荷为②时的该值的步骤，以及

(3)选择被检物质的步骤，该被检物质至少使1种基因表示出与负荷为②时实质上相同的表达量的变化。

2.一种生理活性物质的筛选方法，其特征在于该方法包含下述步骤：

(1)将被检物质对生物体施加负荷的步骤，

(2)测定(1)的生物体中基因的表达量和不施加该负荷时该生物体中基因的表达量，比较两者的值的步骤，以及

(3)选择被检物质的步骤，该被检物质使选自以下所示的A群、C群、E群及F群中的至少1种基因的表达量减少，和/或使选自以下所示的B群、D群及G群中的至少1种基因的表达量增加：

A群：

骨形态发生蛋白-6[BMP-6(基因库登记号：NM_001718)]基因、

趋化因子受体-1[CCR-1(基因库登记号：NM_001295)]基因、

肝细胞增殖因子[HGF(基因登记号：X16323)]基因、

细胞间粘附分子-1[ICAM-1(基因库登记号：NM_000201)]基因、

白介素-1β[IL-1β(基因库登记号：X02532)]基因、

白介素-16[IL-16(基因库登记号：M90391)]基因、

白血病抑制因子[LIF(基因库登记号：NM_002309)]基因、

骨桥蛋白[osteopontin(基因库登记号：NM_000582)]基因、

肿瘤坏死因子-α[TNF-α(基因库登记号：X02910)]基因、

神经纤维网-1[Neuropilin-1(基因库登记号：NM_003873)]基因、

信号传导物和转录激活物6[STAT6(基因库登记号：AF067575)]基因、以及

含有智人(Homo Sapiens)cDNA：FLJ22298倒位刺激基因，克隆HRC04637(基因库登记号：AK025951)的基因

B群：

血红素加氧酶[HO-1(基因库登记号：NM_002133)]基因、

硫氧还蛋白还原酶-1(基因库登记号：AF106697)基因、

推定的翻译起始因子[SUI1(基因库登记号：AF083441)]基因、以及

智人的推测的蛋白[HSPCO14(基因库登记号：NM_015932)]基因、

C群：

N-myc下游调节性基因1[NDRG1(基因库登记号：NM_006096)]基因、

腺苷脱氨酶、RNA特异性[ADAR(基因库登记号：NM_015841)]基因、

剪接因子3b、亚基2[SF3B2(基因库登记号：NM_006842)]基因、

白介素增强子结合因子3[ILF3(基因库登记号：NM_004516)]基因、

缬氨酰基-tRN合成酶2[VARS2(基因库登记号：NM_006295)]基因、以及

含有序列表的序列号：12中所述的碱其序列的基因、

D群：

真核生物翻译延伸因子1α1[EEF1A1(基因库登记号：NM_001402)]基因、

核糖体蛋白L17[RPL17(基因库登记号：NM_000985)]基因、

核糖体蛋白L24[RPL24(基因库登记号：NM_000986)]基因、

富含精氨酸/丝氨酸的剪接因子2[SFRS2(基因库登记号：NM_003016)]基因、

翻译调控的肿瘤蛋白1[TPT1(基因库登记号：NM_003295)]基因、

还原型辅酶Q-细胞色素C还原酶结合蛋白[UQCRB(基因库登记号：NM_006294)]基因、

核糖体蛋白S15a[RPS15A(基因库登记号：NM_001019)]、以及

核糖体蛋白L27[RPL27(基因库登记号：NM_000988)]基因、

E群：

白介素-2受体α[IL2RA(基因库登记号：X01057)]基因、

白介素-6[IL6(基因库登记号：X04430)]基因、

CD166(基因库登记号：Y10183)基因、

干扰素调节因子-1[IRF1(基因库登记号：X14454)]基因、

白介素-15受体α[IL15RA(基因库登记号：U31628)]基因、

细胞核因子Kappa-bp105亚基[NFKB1(基因库登记号：M58603)]基因、

天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1[CASP1(基因库登记号：M87507)]基因、

白介素-1β[IL1B(基因库登记号：M15330)]基因、

肿瘤坏死因子-α[TNF-α(基因库登记号：X02910)]基因、

Grol癌基因[GR01(基因库登记号：X54489)]基因、

白介素-1α[IL1A(基因库登记号：M28983)]基因、

抑制素βA[1NHBA(基因库登记号：J03634)]基因、

白介素-7受体[IL7R(基因库登记号：M29696)]基因、

前B细胞集落增强因子[PBEF(基因库登记号：U02020)]基因、

肝和激活作用调节性趋化因子[LARC(基因库登记号：U64197)]基因、以及

白介素-8[IL8(基因库登记号：M26383)]基因、

F群：

集落刺激因子-1受体[CSF1R(基因库登记号：X03663)]基因、

趋化因子(C-X-C基元)受体-4[CXCR4(基因库登记号：AF147204)]基因、以及

エンドグリン[ENG(基因库登记号：NM_000118)]基因、

G群：

血红素加氧酶-1[HMOX1(基因库登记号：Z82244)]基因。

3.一种生理活性物质的筛选方法，其特征在于该方法包含以下步骤：

(1)分别将应激负荷施加于生物体，以及将被检物质和应激负荷施加于生物体的步骤，

(2)分别测定(1)的生物体以及未施加任何负荷的生物体的基因表

达量的步骤，以及

(3)比较由(2)所得的(1)的生物体和正常生物体的基因表达量，

选择被检物质的步骤，该被检物质表现出选自下述(a)～(g)所述的至少一种基因表达模式：

(a)权利要求2中记载的选自上述A群的至少1种基因的表达量，在对生物体施加应激负荷时，比正常生物体增加、在对生物体施加被检物质和应激负荷时减少，

(b)权利要求2中记载的选自上述B群的至少1种基因的表达量，在对生物体施加应激负荷时，比正常生物体增加、在对生物体施加被检物质和应激负荷时进一步增加，

(c)权利要求2中记载的选自上述C群的至少1种基因的表达量，在对生物体施加应激负荷时，比正常生物体减少、在对生物体施加被检物质和应激负荷时进一步减少，

(d)权利要求2中记载的选自上述D群的至少1种基因的表达量，在对生物体施加应激负荷时，比正常生物体减少、在对生物体施加被检物质和应激负荷时增加，

(e)权利要求2中记载的选自上述E群的至少1种基因的表达量，在对生物体施加应激负荷时，比正常生物体增加、在对生物体施加被检物质和应激负荷时减少，

(f)权利要求2中记载的选自上述F群的至少1种基因的表达量，在对生物体施加应激负荷时，与正常生物体相同、在对生物体施加被检物质和应激负荷时减少，

(g)权利要求2中记载的G群的基因的表达量，在对生物体施加应激负荷时，与正常生物体相同、在对生物体施加被检物质和应激负荷时增加。

4.权利要求3所述的生理活性物质的筛选方法，其中的应激是用佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯处理，基因的表达模式选自(a)～(d)所述的表达模式。

5.权利要求3所述的生理活性物质的筛选方法，其中的应激是用脂多糖处理，基因的表达模式选自(e)～(g)所述的表达模式。

6.权利要求1～5中任何1项所述的生理活性物质的筛选方法，其中的生物体是生物个体或培养细胞。

7.权利要求1～6中任何1项所述的生理活质的筛选方法，其中基因的表达量根据该基因转录的mRNA量来测定。

8.权利要求7所述的生理活性物质的筛选方法，其中的基因表达量通过使用DNA点阵的杂交法来测定。

9.权利要求8所述的生理活性物质的筛选方法中所使用的DNA点阵，其特征在于选自权利要求2所述的A～G群的基因中的至少2个基因或其片段在载体上的预先规定的位置上固定化。

10.一种基因调控剂，其特征在于该调控剂含有可使选自权利要求2中所述的A群、C群、E群及F群中的至少1个基因的表达量减少，和/或使选自B群、D群及G群中的至少1种基因的表达量增加的化合物。

11.一种基因调控剂，其特征在于该调控剂含有在受到应激负荷的生物体中，可使选自权利要求2所述的A群、C群、E群及F群中的至少1种基因的表达量减少，和/或使选自B群、D群及G群中的至少1种基因的表达量增加的化合物。

12.一种基因调控剂，其特征在于该调控剂含有在受到应激负荷的生物体中，可使因应激而增加表达量的选自权利要求2中所述的A群及E群中的至少1种基因的表达量减少的化合物。

13.一种基因调控剂，其特征在于该调控剂含有在受到应激负荷的生物体中，可使因应激而增加表达量的选自权利要求2所述的B群及G群中的至少1种基因的表达量增加的化合物。

14.一种基因调控剂，其特征在于该调控剂含有在受到应激负荷的生物体中，可使因应激而表达量减少的选自权利要求2所述的C群及F群中的至少1种基因的表达量减少的化合物。

15.一种基因调控剂，其特征在于该调控剂含有在受到应激负荷的生物体中，可使因应激而表达量减少的选自权利要求2所述的D群中的至少1种基因的表达量增加的化合物。

16.权利要求10～15中任何一项所述的基因调控剂，其中的化合物是由权利要求1～8中任何一项所述的筛选方法所得的物质。

17.权利要求10～16中任何一项所述的基因调控剂，其中该基因调控剂是以缓和或预防应激为其使用目的。

18.一种基因调控的方法，其特征在于，通过选自权利要求1中所述的(i)所述的化合物、(ii)所述的化合物以及与这些化合物至少对1种基因具有实质上相同的基因调控活性的化合物的至少1种化合物、或含有该化合物的组合物施予生物体，可使选自权利要求2所述的A群、C群、E群及F群中的至少1种基因的表达量减少，和/或使B群、D群及G群中的至少1种基因的表达量增加。

19.一种基因调控的方法，其特征在于，通过选自权利要求1中所述的(i)所述的化合物、(ii)所述的化合物以及与这些化合物至少对1种基因具有实质上相同的基因调控活性的化合物的至少1种化合物、或含有该化合物的组合物施予受应激负荷的生物体，可使选自权利要求2所述的A群、C群、E群及F群中的至少1种基因的表达量减少，和/或使B群、D群及G群中的至少1种基因的表达量增加。

20.权利要求18或19所述的基因的调控方法，其中权利要求1中所述的(i)所述的化合物或(ii)所述的化合物和至少对1种基因具有实质上相同的调控活性的化合物是由权利要求1～8中任何一项所述的筛选方法所得的物质。

21.权利要求1～8中任何一项所述的筛选方法所得的物质。

22.权利21所述的物质，其中该物质是来源于植物的物质、来源于担子菌的物质或它们的衍生物。

23.权利要求21或22所述的物质，其中该物质是多糖类，它的分解物或它们的衍生物。