CN1141398C - 一种多基因扩增芯片及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种多基因扩增芯片及其制备方法，是检测生物样本中多种基因表达水平的灵敏的方法，包括步骤：(1)逆转录信使核糖核酸(mRNA)成互补脱氧核糖核酸(cDNA)；(2)用通用引物对cDNA进行全长扩增，并标记生物素；(3)和膜结合的基因片段选择性杂交获得肉眼可分辨的结果，结合扫描仪和密度分析软件可进一步获得定量的结果；本发明可用于诊断或研究人甚至动植物的多基因疾病，如肿瘤、心血管病及相关的遗传病。

Description

一种多基因扩增芯片及其制备方法

本发明涉及一种多基因扩增芯片(chip)，能检测生物样本中多基因表达水平的灵敏的分子生物学技术，用于医学相关领域：如诊断或研究人类甚至动植物的多基因疾病，如肿瘤、心血管病及相关的遗传病。

目前研究基因表达变化的主要手段为Northern杂交，定量RT-PCR(逆转录聚合酶链反应)和cDNA(互补脱氧核糖核酸)微阵列(cDNAmicroarray)技术。Northern杂交的基本原理为：先用琼脂糖凝胶电泳分离变性的RNA，然后把分级分离的RNA转移至硝酸纤维素膜或尼龙膜上，最后用放射性或非放射性标记的探针对固定在膜上的RNA进行杂交，用尼龙膜可以耐受2轮以上的洗膜操作，进行连续杂交，检测多基因的表达，但操作过程复杂，多次杂交后背景显著增高，另外.杂交检测的灵敏度也较低。

定量PCR技术是近几年才发展起来的技术，可分为无参照定量PCR，共扩增内参定量PCR和竞争定量PCR三种。各种定量方法均有各自的优缺点，无内参照定量PCR一般用于影响因素较小的系统：竞争定量PCR定量最精确，但对模板的质量要求较高：共扩增定量PCR用指数增长循环内靶基因和内参基因(看家基因)的产量比值来估计靶基因的表达水平，能有效消除部分RNA降解的影响，应用最为广泛，但由于要多对引物同时扩增，所以设计时消除引物之间的相互影响又变得尤为重要。建立同时检测多种基因表达的定量PCR技术常需作引物的筛选，技术要求复杂，引物的增多可明显增加非特异性扩增，降低定量的准确性。

比较杂交技术和定量PCR技术可以发现，杂交技术的缺点是灵敏度低，多探针杂交操作复杂，而内参定量PCR技术的最大缺点为引物间的干扰，cDNA微阵列技术始于90年代中期，可分为同位素标记和荧光标记两种。此技术先用一定长度的基因或寡核苷酸点在膜或玻片上，然后用标记的cDNA和其杂交，仪器分析杂交结果获得基因的表达水平。此技术是以后的发展方向之一，但由于同位素会引起人体伤害和环境公害，而荧光标记需要昂贵的检测仪器，所以推广困难。

多基因扩增膜芯片技术用一组同源引物对cDNA全长及亚全长进行扩增，避免了内参定量PCR的缺点，同时由于对cDNA进行了扩增，所以检则灵敏度大为提高。另外，预先把靶基因和内参基因点在膜上而用全长及亚全长cDNA作探针，简化了操作，提高了灵敏度，从理论上讲在一张膜上同时定量的基因数是无限的。

经检索提供的对比文献及参考文献目录附后。

本发明的目的：

一种多基因扩增芯片来定量检测生物样品中多基因表达水平，建立一种简单、低成本、高灵敏度的分子生物学技术，用于人的肿瘤，心血管疾病等多基因疾病的诊断和辅助检查，也可用于遗传病的产前诊断等领域，在其它哺乳动物疾病的研究方面也有一定价值。

为了实现本发明的目的采取的方法：

本发明涉及一种多基因扩增芯片，它是能将大量特定序列DNA片段的微阵列，固化在纤维素膜或尼龙膜上，它的制备方法可以用提取RNA、逆转录、杂交成为微阵列片段，具体分为①多基因膜的制备，②提取RNA，逆转录，③PCR扩增全长或亚全长cDNA并标记生物素，④和膜结合的基因片段选择性杂交，⑤扫描和检测这样的技术流程是本发明特有的。

本发明的优点，方法操作简单，成本低廉，灵敏度高。

成本低廉：用生物素标记探针产生的显色条带或斑点较大，肉眼可辩，不用昂贵的荧光检测器，成本可成百倍地下降。

灵敏度高：生物素标记全长及亚全长cDNA，标记量大，灵敏度高，不用常规的同位素，无放射性，对人安全，无环境污染。

定量检测：用看家基因作内参照，以检测的靶基因和内参基因的比值来确定靶基因的表达水平。

方法简单：取少量组织或一滴血样，就可通过检测DNA，了解疾病及健康状况。

本发明的多基因扩增芯片有扩展和升级的能力，即基因点阵的数量可根据使用的目的而增加，膜上国定的探针的基因功能明确，可直接用于临床测试。

本发明的应用范围：

可定量检则多基因的表达水平，本方法应用于相关的医学领域，如：肿瘤的多基因诊断，病情监测和预后判断；心血管疾病的诊断，病情监测，其他多基因疾病的诊断；动植物疾病状态的多基因检测；在科研领域可用作新基因的鉴定，寻找基因的新功能及相关的研究，甚至用于法医破案。

结合附图对本发明进一步具体详细说明：

所谓多基因扩增芯片：即将大量特定序列的DNA基因片段有序地固化在硝酸纤维素膜或尼龙膜上，从而构成储存大量生命信息的DNA扩增芯片。

用PCR对cDNA进行全长或亚全长扩增的原理见附图2，首先用逆转录引物和PCR引物29(序列见图4)对mRNA进行逆转录，本方法的逆转录引物5′端有一段和动植物基因均不同源的序列(通过核酸数据库比较)，便于设计引物进行PCR扩增，PCR引物29的3′端有3个G，当逆转录酶逆转录mRNA到末端时会非特异地加上数个C，由于C和G结合能力较强，CG和C配对时形成3个氢键，而A和T配对时形成2个氢键，完成配对后可继续延伸，也加上一段便于PCR引物设计的和动植物基因均不同源的序列(通过核酸数据库比较)通过PCR引物1和引物2(序列见图4)可扩增全长cDNA，但是，cDNA全长扩增的效率不高，加之mRNA容易降解，要得到高效的标记探针，本发明还用了cDNA亚全长扩增技术(原理亦见图2)，引物3-28专为扩增cNDA亚全长设计，引物的5′端和PCR引物29的5′相同，便于用同一条引物扩增，3′端为随机引物，可以和cDNA随机结合。引物3-28和引物2配套可高效扩增cDNA的5′端序列，综上，综合利用cDNA全长扩增和亚全长扩增技术，完整的mRNA或部分降解的mRNA均可用于高效扩增，掺入生物素标记的dATP便可得到高效的探针。见附图2cNDA全长和亚全长扩增原理图。

多基因扩增膜芯片技术的定量原理见图3，内参基因(看家基因)是细胞内稳定表达的基因，在疾病和生理状态下表达水平均基本不改变，而要检测的基因(靶基因)在疾病状态下表达水平改变，通过提取细胞内的RNA并经RT-PCR扩增(本发明中应用了cDNA全长及亚全长扩增技术)，靶基因/内参基因的比值不会改变，通过杂交获得相对光密度比值即可代表靶基因/内参基因比值，此比值也可代表靶基因的表达水平。图3显示一种内参基因可定量2种靶基因，其时可定量：靶基因数在多基因扩增膜芯片技术中可以扩展。附图3为多基因扩增芯片技术的定量原理图。

方法可细分为五部分：

1、多基因扩增芯片的多基因膜的制备；2、RNA提取；3、逆转录PCR制备cDNA全长及亚全长探针；4、杂交；5、显色；6、扫描和检测，这样的流程是本发明特有的(见图1)

1、多基因膜的制备：1]点膜基因片段的获得

①.PCR(聚合酶链反应)获得基因的特异性片段

例：获取MRP(多药耐药相关蛋白基因)的特异性片段；

引物序列：5′-ATG GAC ACA AGG GTG ATG C-3′

          3′-TCC  GCA TCT  CTG TCT  CTG G-5′

扩增片段长度为337bP。标准扩增条件获得扩增产物。

②.PCR产物的纯化

A：需要的材料：

试剂盒：Wizard PCR Preps DNA纯化系统(货号#A7170，Promega公司)

3ml一次性注射器

无菌蒸馏水或T E缓冲液。

异丙醇，80％。

乙醇，95％。

B：试验步骤：

1)PCR反应完成后，转移水相到一个清洗的微离心管中。

2)直接取纯化缓冲液100μl到一个1.5ml微离心管中，加30-300ml的PCR反应物，简短地旋转至混合。

3)加1ml树脂并简短地旋转3次，时间超过1分钟。

4)每管PCR准备一个Wizard微(层析)柱，并准备一个3ml一次性的注射器。

5)吸附树脂/DNA混合物到注射筒，慢慢地插入注射器活塞，用注射器活塞轻轻地推这种悬浮液到微柱上。

6)吸2ml 80％的异丙醇到注射器中洗层析柱。

7)移去注射器，将微柱转移到一个1.5ml的微离心管中，12000×g离心微柱20秒，使树脂干燥。

8)转移微柱到一个新的离心管，加50μl的水或TE缓冲液等1分钟(DNA保留在微柱上，作用可长达30分钟)，在12000×g离心微柱20秒，使结合的DNA片段洗脱。

9)移去并丢弃这个微柱，纯化为DNA可在4℃至-20℃下储存在微离心管中。

③用pGEM-T容易载体克隆PCR片段

A：需要的材料

pGEM-T容易载体系统(货号A3600，Promega公司)

无核酸酶的水

SOC培养基

B：试验步骤

1)pGEM-T容易载体，简短地离心，并插入对照管，在管底收集内含物。

2)如下所述进行连接反应

                      标准    阳性    背景

                      反应    对照    对照

连接酶10×缓冲液      1μl    1μl    1μl

pGEM-T容易载体(50ng)  1μl    1μl    1μl

PCR产物               Xμl     -        -

插入的DNA对照          -      2μl      -

T4 DNA连接酶          1μl    1μl     1μl(3 Weiss单位/ml)

无核酸酶的水到

最终体积           10μl    10μl    10μl

PCR产物：pGEM-T容易载体的摩尔比率需要最佳为1∶1。

3)在4℃连接过夜，若缩短连接时间(最少为3小时)，菌落较少。

④.转化JM109感受态细胞：

A：需要的材料：

溶液I

10mmol/L DOPS(3-N-吗啉代丙磺酸PH7.0)

10mmol/L Rbcl

溶液II

0.1mol/L MOPS(PH6.5)

50mmol/L Cacl₂

10mmol/L Rbcl

B：操作步骤：

1)从5ml单菌落过夜培养物中，取出0.5ml加至含有100ml LB培养基的500ml三角瓶中，37℃强烈振荡，直至培养浓度为5×10⁷个细胞/ml，每次转化实验需2ml细胞悬浮液，有1×10⁸个细胞。

2)取2ml(1×10⁸个细胞)于4℃，4000g离心10分钟，弃上清液，收集细胞。

3)将细胞沉淀轻轻悬浮在1ml溶液I中，再离心回收细胞。

4)弃上清液，细胞沉淀物悬浮于1ml溶液II中，冰上放置15分钟。

5)4℃，4000g离心10分钟，尽可能地去尽上清液，再将细胞沉淀物悬浮于0.2ml溶液II中，即可马上用于转化试验。

6)加入3μl二甲亚砜(DMSO，光谱纯)1-200ng(溶于10μl TE)，冰上放置30分钟。

7)43-44℃热休克30秒，加入5ml LB培养基，37℃振荡培养1小时。

8)将培养物离心回收细胞后，悬浮在1ml LB培养基中，分别取100μl，200μl细胞悬浮液，铺于含适量具有IPEG和X-Gal的平板上20分钟后，倒置琼脂板，37℃培养12-24小时。

9)挑取白色菌落，进一步培养，测序。

⑤测序：可送测序服务公司，保存序列正确的克隆菌株。

2]点膜基因片段的制备：

①、细菌培养②、质粒DNA小量制备③、质粒定量④、质粒酶切⑤基因片段回收⑥片段定量

①细菌的培养：

1)、从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到10ml LB培养基中，37℃培养过夜。

LB培养基配制：

细菌培养用胰化蛋白物10g

细菌培养用酵母提取物5g

NaCl10g

加去离子水800ml

搅拌，使溶质完全溶解，用5mol/LNaOH调节PH值至7.4，加去离子水至总体积为1升，高压蒸汽灭菌20分钟。

2)、培养物4℃，12000g离心30秒，吸去培养液，使细菌沉淀，尽可能干燥。

3)将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的溶液I中，剧烈振荡

②质粒DNA小量制备

1)溶液I的配制

溶液I

50mmol/L葡萄糖

25mmol/L Tris·Cl(pH8.0)

10mmol/L EDTA(pH8.0)

2)加200μl新配制的溶液II，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物，应确保离心管的整个内表面均与溶液II接触，不要振荡，将离心管放置于冰上。

溶液II

0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L贮存液现用现稀释)

1％SDS

3)加150μl用冰预冷的溶液III，盖紧管口，将管倒置后温和地振荡10秒钟，使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3-5分钟。

溶液III 5mol/L乙酸钾60ml

冰乙酸11.5ml

水    28.5ml

4)用微量离心机于4℃以12000g离心5分钟，将上清转移到另一离心管中。

5)用2倍体积的乙醇于室温沉淀双链DNA。振荡混合，于室温放置2分钟。

6)用微量离心机于4℃，以12000g离心5分钟。

7)小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出，再将附于管壁的液滴除尽。

8)用1ml 70％乙醇于4℃洗涤双链DNA沉淀，按步骤7)所述方法去掉上清，在空气中使核酸沉淀干燥10分钟。

9)用50μl含无DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml)的TE重新溶解核酸，振荡，贮存于-20℃。

③质粒的定量：

A：仪器：带氩灯的分光光度计，使用前预热稳定10分钟

B：操作步骤：

1)吸取5μl DNA样品，加水至1ml混合后，转入分光光度计的石英比色杯中。

2)分光光度计先用1ml水校正零点。

3)在260nm和280nm分别读出光密度，DNA样品的浓度为OD260×核酸稀释倍数×50/1000，浓度单位为μg/μl。

④质粒酶切

双蒸水            16.3μl

酶切10×缓冲液H    2μl

牛血清蛋白        10μg/μl   0.2μl

质粒              1μg/μl    1μl

混匀

EcoRI             10μg    0.5μl

总体积            20μl

37℃酶切1-4小时。

⑤基因片段回收

1)EB电泳

2)切下相应的电泳条带

3)12000g/min离心10分钟

4)酚∶氯仿(24∶1)抽提

5)用2倍体积无水乙醇沉淀，弃去上清液

6)70％乙醇洗沉淀一次

7)50μl TE缓冲液溶解片段

⑥片段定量(同质粒定量)

3]点膜

A：需要的材料：过滤加样器，0.45μm尼龙膜

6×SSC

变性液：1.5mol/L Nacl/0.5mol/L NaOH(室温)

中和液：1mol/L Nacl/0.5mol Tris.cl pH7.0(室温)

B：步骤

1)裁一张与多样过滤加样器一样大小的尼龙膜，将膜置于6×SSC的表面让其自然浸泡，放置10分钟。

2)裁一张与多样过滤加样器一样大小的滤纸，用6×SSC浸湿。

3)将滤纸置于多样抽滤加样器上，将膜放置于其上，将多样抽滤加样器安装好，确保不漏气。

4)在DNA中加入6×SSC，体积为200-400μl，在100℃变性10分钟，然后置于冰中。

5)连接吸液装置，每孔中加入500μl 6×SSC。

6)将DNA样品离心，小心勿让吸头触及膜，让样品过滤。

7)拆开加样装置，将膜置于一张浸过变性液的滤纸上，放置10分钟。

8)将膜转至一张浸过中和液的滤纸上，放置5分钟。

9)将膜置于一张滤纸上，晾干。

10)短波紫外线照射10分钟。

2、RNA提取：

RNA提取有许多商品化的试剂盒可以使用，如LTI公司的TRIZOLReagent(货号：15596-026)，PROMEGA公司的SV总RNA分离系统(货号：Z3100)。另外，提取mRNA的试剂盒也可列为选择范围。下面介绍本发明使用的方法。

用盐酸胍和有机溶剂提取RNA操作步骤

1)肿瘤组织手术切除术后30分钟内液氮保存，在组织碎片加10倍体积盐酸胍匀浆缓冲液I.

盐酸胍匀浆缓冲液I

8mol/L盐酸胍(分子量＝95.6D)

0.1mol/L乙酸钠(pH5.2)

5mmol/L二硫苏糖醇(DTT)

0.5％十二烷基肌氨酸钠

2)用组织匀浆机在室温下匀浆1分钟。

3)于室温以5000g离心10分钟。

4)将上清液移至另一个离心管中，加0.1体积3mol/L乙酸钠(pH5.2)，混匀，加0.5体积冰预冷的乙醇，充分混匀，于0℃放置至少2小时。

5)于0℃以5000g离心10分钟回收核酸，弃去上清液，于室温晾干核酸沉淀。

6)用少量盐酸胍匀浆缓冲液II溶解沉淀，每克组织或细胞的提取物加10-15ml缓冲液。

盐酸胍匀浆缓冲液II

8mol/L盐酸胍(分子量＝95.6D)

0.1mol/L乙酸钠(pH7.0)

1mmol/L二硫苏糖醇(DTT)

20mmol/L EDTA(pH8.0)

7)加0.5体积用冰预冷的乙醇，立即混匀，于-20℃放置至少2小时。

8)以5000g离心10分钟回收核酸，弃去上清液，于室温晾干核酸沉淀。

9)将步骤7)-8)重复2次(即用乙醇沉淀3次)。

10)用0.02mol/L EDTA(pH8.0)溶解沉淀，每克细胞或组织的提取物加5ml EDTA溶液。

11)加等体积氯仿∶异戊醇(4∶1)，混匀。

12)于室温以5000g离心10分钟，将上层水相移至另一个管内。用有机溶剂再抽提1次。

13)将上层水相移至另一个离心管内，加3倍体积4mol/L乙酸钠(pH7.0)，-20℃放置至少1小时。

14)于0℃以5000g离心20分钟沉淀RNA。

15)弃去上清液，于4℃下用3mol/L乙酸钠(pH7.0)洗沉淀1次于0℃以5000g离心20分钟。

16)尽量将上清液去除干净，用尽可能少的0.2％SDS、0.0.5mol/L EDTA(pH8.0)溶解沉淀，每克细胞或组织的提取物加1ml。

17)加2倍体积用冰预冷的乙醇，于0℃放置至少2小时，于4℃以5000g离心10分钟，以回收RNA。

18)用70％乙醇洗涤沉淀，离心片刻，在空气中晾干核酸沉淀。

19)用少量水重溶RNA，加3倍体积乙醇，-70℃贮存备用。

3、逆转录和PCR

A.逆转录

设置一合成cDNA第一链的反应：

10×扩增缓冲液         2μl

4种dNTP混合，每种浓度为10mmol/L 2μl

胎盘RNA酶抑制剂  20单位

总RNA             6μl

逆转录引物        5μm   2μl

50mmol/L MgCl₂   1μl

加水至            20μl

SuperScript II逆转录酶(货号：18064-022，LTI公司)200单位，于37℃反应30分钟

10×扩增缓冲液

500mmol/L KCL

100mmol/L Tris·Cl(pH8.3室温)

15mmol/L MgCl₂

0.1％明胶

逆转录引物：CGGGAAGGGCTTTACCTCTTC ATG-d(T)30 N-M-3′

(M＝A，G，C，或T；N＝A，G或C)

B.扩增反应(PCR)

制备cDNA全长及亚全长探针，标记的探针长度长，探针为全长cDNA及亚全长cDNA的扩增产物，长度可达3.5Kb，即3.5千碱基

1)按以下次序，将各成分在0.5ml灭菌离心管内混合：

灭菌水             30μl

10×扩增缓冲液     10μl

dTTP：1.25mmol/L    4μl

dGTP：1.25mmol/L    4μl

dCTP：1.25mmol/L    4μl

dATP：1.25mmol/L    4μl

生物素(Biotin)-14-dATP 1-4μl(dATP含10-30％为宜)

把生物标记技术用于基因芯片的制备，标记用生物素，对工作人员安全，又无环境污染，传统生物标记用同位素或荧光，对工作人员有害又污染环境；不必用昂贵的荧光检测仪，成本可以成百倍地下降。

用29种引物(序列见图4)(每种引物)50-100pmol(均溶于水)

模板DNA(可至2μg，取决于靶序列含量)

加水至终体积100μl

10×扩增缓冲液：

500mmol/L KC

100mmol/L Tris·Cl(pH8.3，室温)

15mmol/L MgCl₂

0.1％明胶

2)于94℃加热反应混合液5分钟，以使DNA完全变性。

3)将0.5μl Taq DNA聚合酶加入仍处于94℃的反应混合液中。

4)用100μl轻矿物油覆盖于反应混合液之上，这样可防止样品在反复加热-冷却过程中蒸发。

5)按以下方法进行扩增，典型的变性、退火和聚合条件如下：

  循环           变性         退火        聚合

首轮循环       94℃5分钟    50℃2分钟   72℃3分钟

后续30循环     94℃1分钟    50℃2分钟   72℃3分钟

末轮循环       94℃1分钟    50℃2分钟   72℃10分钟

4.杂交

1)配制预杂交液；每平方厘米尼龙膜约需预杂交液0.2ml。

预杂交液

6×SSC

5×Denhardt试剂

0.5％SDS

100μg/ml经变性并断裂成片段的鲑精DNA

 2)将含有靶DNA的尼龙膜漂浮于一盘6×SSC的液面上，待其由下至上完全湿润，将滤膜浸入液体内泡2分钟。

3)将湿润滤膜装入可加热封接的袋中，按每平方厘米尼龙膜0.2ml的量加入预杂交液。

尽可能将袋内空气压挤出来，用加热封接机封住袋子开口的一边，将其浸入68℃的水浴中温育1-2小时。

4)100℃加热5分钟使探针变性，迅速在冰水浴中骤冷。

5)完全倒出预杂交液并迅速更换杂交液，随后加入探针，尽可能将袋内所有空气压挤出去，用加热封接机重封袋口，尽可能减少封在袋内的气泡，重新封口。

杂交液

6×SSC

0.5％SDS

100μg/ml经变性并断裂成片段的鲑精DNA

6)将杂交袋浸入68℃的水浴，杂交过夜。

7)戴上手套，取出滤膜并随即将其置入一个盛有数百毫升2×SSC和0.5％，SDS的托盘内，于室温浸泡。

8)5分钟后，将滤膜转移至另一个盛有数百毫升2×SSC和0.1％SDS托盘中，于室温温育15分钟，间或温和地摇动。

9)将滤膜转移至一个盛有数百毫升新配的0.1×SSC和0.5％SDS的平底塑料盒中，于37℃温育30分钟至1小时，间或温和地摇动。

10)将溶液换为新配的0.1×SSC和0.5％SDS，并将塑料盒转移到一调至68℃的水浴中温育同样长的一段时间。

11)用0.1×SSC于室温短暂漂洗滤膜，将滤膜置于一叠纸巾上，以除去大部分液体。

5.显色

杂交袋中加2ml 1μg/ml链亲和素-碱性磷酸酶交联物，室温10分钟。用洗膜缓冲液

(成分：50mmol/L Tris.cl(pH7.4)

200mmol/L Nacl 6％Tween-20 0.01％ thimerosal)，洗芯片3次，每次5分钟，

加入2ml硝基蓝四氮唑/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐底物工作液，室温下避光显色30分钟。

水洗终止反应，干燥保存。

6、扫描及检测

①用扫描仪获得数字图像，(见图5)

②软件分析杂交条带或斑点的相对光密度值

③计算机计算检测靶基因和内参照基因光密度比值，比值即为该基因的表达水平。

多基因扩增芯片的规格：

A、基因点样为条带的膜芯片

基因点样为4.0mm(长)×0.5mm(宽)，膜芯片的大小如下：

a.7.2cm(长)×1.9cm(宽)

基因点样为6个，其中5个检测基因，1个内参照基因

b.7.2cm(长)×3.8cm(宽)

基因点样为12个，其中11个检测基因，1个内参照基因或者含5个2次重复点样的检测基因，1个2次重复点样的内参照基因

c.12.4cm(长)×3.8cm(宽)

基因点样为24个，其中23个检测基因，1个内参照基因，或者含11个2次重复点样的检测基因，1个2次重复点样的内参照基因

B.基因点样为斑点：膜芯片

基因点样为直径3mm的斑点，膜芯片的大小如下：

a.8cm(长)×1.8cm(宽)

b.8cm(长)×3.6cm(宽)

c.8cm(长)×7.2cm(宽)显色的条带或斑点较大，肉眼可辨。实施例：

一种用于肿瘤化疗耐受检则的多基因扩增芯片

本实施例分六部分

1.肿瘤化疗耐受检测多基因扩增芯片多基因膜的制备

2.RNA提取

3.逆转录PCR

4.杂交

5.显色

6.扫描和检测

1.肿瘤化疗耐受检测多基因扩增芯片多基因膜的制备

1].点膜基因片段的获得

PCR获得耐药相关基因的特异性片段引物设计见表1基因名称   PCR扩增引物                       产物大小(bp)   基因库接受号GST-π       5′CAG GAG GGC TCA CTCAAA-3′           350       X06547

     3′-GAT CAG CAG CAA GTC CAG CAG-5′MDR      5′-GTA CCC ATC ATT GCA ATA GC-3′      167       NM-00927

      3′-CTG AGT CCT CGT CTT CAA AC-5′MRP      5′ATG  GAC TAC ACA AGG GTG ATG C-3′   337       L05628

      3′TCC  GCA TCT G TCT CTG G-5′LRP      5′-GAG CAGTTC ACA GTG TT G TCC-3′     342       X79882

      3′-AAA GCC AAA GAC AGC AGT GCG-5′bCl-2    5′-GGA CAA CAT CGC CCT GTG-3′         137       M14745

      3′-AGG ACC GAC AGA GAC TTC TGA-5′β-actin   5′CGA  GAA GAT GAC CCA GAT CA-3′     234       M10277

      3′-AGG GGC CGG ACT CGT CAT AC-5′表1：获得探针：PCR引物设计注：上表中：GST-π(谷光甘肽S转移酶π基因)，MDR₁(多药耐药基因)

        MRP(多药耐药相关蛋白基因)LRP(肺耐药相关蛋白基因)

        bcl-2(凋亡调控相关基因)β-actin(β-肌动蛋白基因)

①PCR扩增

每50μl体系含10倍PCR缓冲液5μl，25mmol/L MgCl₂，3μl引物30Pmol/L，二甲亚砜(DMSO)0.5μl，Taq DNA聚合酶2单位，100ng胎盘总RNA对应的模板，94℃变性1分钟，55℃退火1分钟(β-actin和LRP基因退火温度为56℃)，72℃延伸2分钟，共30个循环，最后72℃延伸10分钟。

②PCR产物纯化

③用PGEM-T容易载体克隆PCR片段

④转化JM109感受态细胞

⑤测序

2]点膜基因片段的制备

①细菌培养

②质粒DNA小量制备

③质粒酶切

④基因片段回收

⑤基因片段定量。

2.提取RNA：用一例乳腺癌手术切除样本。

3.逆转录和PCR

A：逆转录

B.PCR，标记用生物素(Biotin)，Biotin＝dATP的比例为1∶4所用29种引物，引物序列见图4 。

4.杂交：以上方法前面已有详述

3]点膜程序，加入基因的量如下：

定量基因片段，20×SSC稀释基因到500ng/ml，在不同的孔中分别加入GST-π(550μl)，MDR1(230μl)，MRP(500μl)，LRP(520μl)，bcl-2(200μl)和β-actin(400μl)，最后每孔加入20×SSC补到800μl。多基因扩增芯片的规格为7.2×cm(长)×1.9cm(宽)。

5.显色

杂交袋中加2ml 1μg/ml链亲和素-碱性磷酸酶交联物，室温10分钟。用洗膜缓冲液

(成分50mmol/L Triscl(pH7.4)

200mmol/L Nacl 6％ Tween-20 0.01％ thimerosal)，洗芯片3次，每次5分钟，

加入2ml硝基蓝四氮唑/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐底物工作液，室温下避光显色30分钟。

水洗终止反应，干燥保存。

6、扫描和检测

1)扫描仪获得数字图像(见图5)

2)用Kodak ID软件分析

①获得6个条带的相对光密度

                                        结果

1.β-actin   为β-肌动蛋白基因        24498.15

2.GST-π            为谷光甘肽S转移酶π基因  18028.34

3.MDR1       为多药耐药基因           13250.58

4.MRP        为多药耐药相关蛋白基因   8080.56

5.LRP        为肺耐药相关蛋白基因     2052.10

6.bcl-2      为凋亡调控相关基因       826.34

②计算5种基因的表达水平

β-actin＝内参照

GST-π表达水平＝GST-相对光密度/β-actin相对光密度

              ＝18028.34/24498.15-0.74

MDR1表达水平＝MDR1相对光密度/β-actin相对光密度

            ＝1325.58/24498.15＝0.54

MRP表达水平＝MRP相对光密度/β-actin相对光密度

           ＝8080.56/24498.15＝0.33

LRP表达水平＝LRP相对光密度/β-actin相对光密度

           ＝2052.10/24498.15＝0.08

bcl-2表达水平＝bcl-2相对光密度/β-actin相对光密度

             ＝826.34/24498.15＝0.03

对比文献附图说明：

图1、cDNA微阵列点印仪，计算机控制的机器人的臂能在XYZ方向平面移动，在点印头上装备有16个(8个两行)点印针，在一次自动循环点印中，点印头能下降点印针到含有DNA探针96孔板，并升起，然后，点印头水平地在真空桌上移动，成功地使点印针接触到每个玻片，沉淀探针DNA，点印头继续达到洗涤干燥台，在那里用水将点印针清洁两次并干燥，这样，循环重复。点印头下一次用探针浸湿，连续点印直至96孔板内探针用完，有一个机械会自动移去微孔板，并装上一块新板。用这种方法，正好将15000探针点印到微阵列玻片上，并分离了cDNA探针。

图2、靶标的制备和杂交的示意图。

图3、共聚焦激光显微镜扫描和图象分析图。

图4、基因表达比率和平均光密度的比较曲线图。

具体由看家基因(常用于计算机标化因子)的红/绿比率组成，覆盖一个宽的信号密度范围。

图5、由DeArray软件产生的代表微阵列杂交伪彩图形。

绿色是成纤维细胞株为参考靶标，红色是横纹肌肉瘤细胞株，红色代表基因表达水平增高，绿色代表基因表达水平降低，黄色代表基因表达水平没有变化，几个感兴趣的基因用方格标出，A，SM22(R/G0.06比率)；B，ATF3(39)；C，CAPDH(0.8)；D，MYCN(39)。

图6，Northern杂交和cDNA微阵列表达比率的比较。

测定由放射-标记，β-肌动蛋白(β-actin)探针作为用于加样差异的参照，在(β-actin)cDNA微阵列，观察到红/绿比率为1.04，此误差是允许的。

                说明书附图说明

图1多基因膜芯片制备的流程图。

图2cDNA全长和亚全长扩增原理图。说明：mRNA逆转录时，cDNA的3′端形成非特异的C尾，引物29的GGG和非特异的C尾结合，结合后Taq酶可延伸补齐整个cDNA，用逆转录引物和PCR引物的5′端非同源区设计引物使cDNA全长得到扩增。另外，PCR引物3-28的3′端为随机引物序列，可随机地和cDNA多个部位结合，得到短于全长的扩增片段，综合利用全长和亚全长扩增技术可以使标记探针的效率大大提高。

图3多基因扩增膜芯片技术定量原理图。

说明：靶基因和看家基因在细胞中的比率不会因PCR扩增而改变(PCR在指数增长区间内)，用杂交后测得的靶基因和看家基因的相对光密度的比率代表靶基因的表达水平。在多基因扩增芯片技术中，靶基因的数量可以扩展。

图4：PCR(聚合酶链反应)引物序列图

图5：一种用于肿瘤耐受检测：多基因扩增芯片的杂交结果图

                                        结果

1.β-actin    为β-肌动蛋白基因        24498.15

2.GST-π              为谷光甘肽S转移酶π基因  18028.34

3.MDR1        为多药耐药基因           13250.58

4.MRP         为多药耐药相关蛋白基因   8080.56

5.LRP         为肺耐药相关蛋白基因     2052.10

6.bcl-2       为凋亡调控相关基因       826.34参考文献：

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3.定量的PCR：现代生物技术的一种测试.Reischl U，Kochanowski B.摩尔生物技术1995，3：55-71

4.Foord O，Rose EA.Long-distance PCR.PCR Methods Appl.1994，3：S149-161

4.长距离PCR.Foord O，Rose EA，PCR方法的应用.1994，3：S149-161

5.Chengs，Fockler C，BarnesWM，et al，Effective Amplificationof Long Targets from Cloned Inserts and Humangenetic DNA.Pro Natl Acad Sci USA.1994，91：5695-5699.

5.由克隆插入的长靶和人类基因的DNA的有效扩增.Cheng s，Focklerc，Bames WM.等，Rro Nall科学委员会1994，91：5695-5699

6.陈高明，本春海，王尧河等，RT-PCR定量检测GST-π mRNA的表达.中国肿瘤临床.1998，25(12)：858-861.

7.陈高明，李春海，王建军等，多药耐药相关蛋白基因在乳腺癌中的表达及其临床意义.中国肿瘤临床.1999，26(1)：23-25.

8.Khan J，Saal LH，Bittner ML，et al.Expression Profilingin Cancer Using cDNA Microarrays.Electrophoresis 1999，20：223-229，用互补DNA微陈列技术检测肿瘤中基因表达的全貌.电泳.1999，20：223-229。

Claims (9)

1、一种多基因扩增芯片的制备方法，用提取RNA、逆转录、杂交成为微阵列片段，其特征是具体分为①多基因膜的制备，②提取RNA，逆转录，③PCR扩增全长cDNA并标记生物素，④和膜结合的基因片段选择性杂交。

2、根据权利要求1所述的这种多基因扩增芯片的制备方法，其特征是标记的探针为全长cDNA的扩增产物，全长的长度可达3.5Kb。

3、根据权利要求1所述的这种多基因扩增芯片的制备方法，其中有逆转录步骤，其特征是：所用的逆转录引物为CGGGAAGGGCTTTACCTCTTC ATG-d(T)30N-M-3’，其中M等于A，G，C或T；N等于A，G，或C。

4、根据权利要求1所述的这种多基因扩增芯片的制备方法，其中有PCR步骤，其特征是：扩增全长cDNA及cDNA5’端，所用的整套引物为29种，均溶于水，每条引物为50-100pmol，其序列为：

PCR引物1：AGAAACAGGCGCTGGGCATC

PCR引物2：CGGGAAGGGCTTTACCTCTTC

PCR引物3：AGAAACAGGCGCTGGGCATCTACAACGAGG

PCR引物4：AGAAACAGGCGCTGGGCATCTGGATTGGTC

PCR引物5：AGAAACAGGCGCTGGGCATCCTTTCTACCC

PCR引物6：AGAAACAGGCGCTGGGCATCTTTTGGCTCC

PCR引物7：AGAAACAGGCGCTGGGCATCGGAACCAATC

PCR引物8：AGAAACAGGCGCTGGGCATCAAACTCCGTC

PCR引物9：AGAAACAGGCGCTGGGCATCTCGATACAGG

PCR引物10：AGAAACAGGCGCTGGGCATCTGGTAAAGGG

PCR引物11：AGAAACAGGCGCTGGGCATCTCGGTCATAG

PCR引物12：AGAAACAGGCGCTGGGCATCGGTACATTGG

PCR引物13：AGAAACAGGCGCTGGGCATCTACCTAAGCG

PCR引物14：AGAAACAGGCGCTGGGCATCCTGCTTGATG

PCR引物15：AGAAACAGGCGCTGGGCATCGTTTTCGCAG

PCR引物16：AGAAACAGGCGCTGGGCATCGATCAAGTCC

PCR引物17：AGAAACAGGCGCTGGGCATCGATCCAGTAC

PCR引物18：AGAAACAGGCGCTGGGCATCGATCACGTAC

PCR引物19：AGAAACAGGCGCTGGGCATCGATCTGACAC

PCR引物20：AGAAACAGGCGCTGGGCATCGATCTCAGAC

PCR引物21：AGAAACAGGCGCTGGGCATCGATCATAGCC

PCR引物22：AGAAACAGGCGCTGGGCATCGATCAATCGC

PCR引物23：AGAAACAGGCGCTGGGCATCGATCTAACCG

PCR引物24：AGAAACAGGCGCTGGGCATCGATCGCATTG

PCR引物25：AGAAACAGGCGCTGGGCATCGATCTGACTG

PCR引物26：AGAAACAGGCGCTGGGCATCGATCATGGTC

PCR引物27：AGAAACAGGCGCTGGGCATCGATCATAGCG

PCR引物28：AGAAACAGGCGCTGGGCATCGATCTAAGGC

PCR引物29：AGAAACAGGCGCTGGGCATCGGCCATGGCCGGG

5、根据权利要求1所述的这种多基因扩增芯片的制备方法，其中有PCR步骤，其特征是：标记用生物素。

6、一种多基因扩增芯片，能将大量特定序列DNA片段的微阵列，固化在纤维素膜或尼龙膜上，其特征是：按权利要求1所述的多基因扩增芯片的制备方法制备的。

7、根据权利要求6所述的这种多基因扩增芯片的应用，最终检测的结果，其特征是：基因点样显色为条带或斑点的膜芯片，显色的条带和斑点直径为3mm，肉眼可辨。

8、根据权利要求6所述的这种多基因扩增芯片的应用，检测的结果，其特征是：基因点样为条带的膜芯片，基因点样为4.0mm×0.5mm宽，膜芯片的大小如下：

a.7.2cm长×1.9cm宽，基因点样为6个，其中5个为检测基因，1个为内参照基因；

b.7.2cm长×3.8cm宽，基因点样为12个，其中11个为检测基因，1个为内参照基因或者含5个2次重复点样的检测基因，1个2次重复点样的内参照基因；

c.12.4cm长×3.8cm宽，基因点样为24个，其中23个为检测基因，1个为内参照基因，或者含11个2次重复点样的检测基因，1个2次重复点样的内参照基因。

9、根据权利要求6所述的这种基因扩增芯片的制备方法，检测的结果，其特征是：基因点样为斑点的膜芯片，基因点样为直径3mm的斑点，膜芯片的大小如下：

a.8cm长×1.8cm宽

b.8cm长×3.6cm宽

c.8cm长×7.2cm宽。

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