CN101045946A - Hiv基因检测芯片,其制备方法和应用其检测hiv核酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明适用于HIV核酸检测领域，提供了一种HIV基因检测芯片，其制备方法和应用其检测HIV核酸的方法。其中在芯片的固相载体上固定有HIV特异性基因片段和阳性及阴性对照，所述HIV特异性基因片段包括SEQ IDNO：1－6的序列，阳性对照为SEQ ID NO：7，阴性对照为SEQ ID NO：8。本芯片很好地解决了HIV核酸检测过程中灵敏度与特异性之间的制约关系，提高了产品的质量和实用性。

Description

HIV基因检测芯片，其制备方法和应用其检测HIV核酸的方法

技术领域

本发明涉及一种人类免疫缺陷病毒(HIV)基因检测芯片，其制备方法和应用其检测HIV核酸的方法。

背景技术

获得性免疫缺陷综合症(AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起的一种全身性疾病，在短短的20年间已给全球造成十分严重的危害，几乎波及全球所有国家和地区。HIV的实验室诊断包括病原学诊断和免疫学检测，目前最常用的检测方法(包括初筛和确诊)为抗体检测法。该方法具有特异性强、灵敏度高等优点，但由于检测的是人体内产生的针对HIV的特异性抗体，因此，必须要等到HIV病毒在体内繁殖一段时间，刺激机体产生一定滴度的抗体后，才能检测出。而在体内抗体产生之前的这段时期，尽管病人体内已经感染了HIV，但检测结果仍然为阴性，这段时期称之为窗口期，一般在6-12周内。因此，用抗体法确诊HIV感染的也一般在感染后的6-12周以后。除抗体法以外，其他如HIV抗原检测和病原学检测中的病毒培养也都有14-21天和11天的窗口期。如果病人在窗口期献血，用目前常用的抗体法筛检，将检测不出HIV病毒，该血样视为合格，但输给别人后，将会造成艾滋病病毒的传播。因此，艾滋病病毒感染的早期诊断不仅对疾病的早期发现有重要意义，而且对控制其流行，提高用血安全性也具有极为重要的意义。

目前HIV的早期诊断趋势是HIV的核酸检测。通过检测来自受试者的样本中是否存在HIV核酸来判断受试者体内是否感染HIV。这种方法只要体内存在HIV病毒就可以检测，理论上不存在窗口期。目前，用于HIV核酸检测的试剂和方法主要有罗氏(Roche)公司的Amplicor(Saag Set al.HIV viral loadmarkers in clinical practice.Nature Medicine 1996；2：625-629.)、拜尔(Bayer)公司的bDNA、Organnon Teknika NucliSens等，这些方法的特点是用一条HIV保守基因片段作为参照探针，病人体内的核酸片段经扩增后与之杂交(BayerbDNA方法只扩增杂交信号)，这样如果为了提高检测的灵敏度，就需要加大探针的上样量，而大的上样量则会增加检测的非特异信号，降低检测特异性。

由于HIV是RNA病毒，因此HIV核酸检测中存在的另一个困难是检测时需要将RNA先逆转录成互补DNA再进行后续检测步骤。欲检测标本中的RNA时，目前的检测步骤是，先用逆转录引物将RNA逆转录成cDNA，然后用多条引物分几次扩增，标记后再与靶DNA杂交。不仅操作烦琐，还增加了成本和交叉污染的机会。因此，这种方法很难在基层临床检测中得到推广和应用。在该领域迫切需要能够在一个试管中一次性完成逆转录、扩增和标记的方法。

发明内容

本发明提供的实施例要解决的技术问题是提供一种HIV检测基因芯片，旨在解决目前HIV核酸检测中的灵敏度与特异性之间的制约关系。

本发明实施例是这样实现的，一种HIV基因检测芯片，其中在固相载体上固定有HIV特异性基因片段和阳性及阴性对照，该HIV特异性基因片段包括SEQ ID NO：1-6的序列，阳性对照为SEQ ID NO：7，阴性对照为SEQ IDNO：8。

本发明实施例的要解决的另一技术问题在于提供一种上述HIV基因检测芯片的制备方法，其步骤包括：

(1)在一个试管中加入含有随机六核苷酸引物的反应体系，该反应体系还含有引物组SEQ ID NO.14+12、SEQ ID NO.20+10、SEQ ID NO.20+11、SEQID NO.21+13、SEQ ID NO.18+12、SEQ ID NO.15+12、SEQ ID NO.20+9、SEQID NO.16+9、SEQ ID NO.17+10、SEQ ID NO.19+11中的一种或几种，对HIVRNA样品一次完成逆转录反应和PCR扩增；

(2)从以上得到的片段中挑取阳性片段克隆，测序证实后保存；

(3)将上述克隆的阳性片段引物组合在不同病人血液中经RT-PCR证实后，选出具有SEQ ID NO：1-6的序列的引物组合探针，保存。

(4)将所述保存的探针扩增产物纯化后与经扩增、纯化步骤的所述阳性对照和阴性对照分别放置到微型板中，然后将浓度调整为所述不同浓度梯度后点膜；

(5)将点膜后滤膜进行交联固定，制成HIV基因检测芯片。

本发明实施例的要解决的另一技术问题在于提供一种应用上述HIV基因检测芯片检测HIV核酸的方法，包括以下步骤：

(A)从样本中分离RNA；

(B)将得到的RNA转移到一个试管中，加入含有SEQ ID NO：9-21序列的反应体系，一次完成逆转录、扩增和地高辛标记；

(C)将标记好的探针与所述HIV基因检测芯片杂交，根据杂交结果判断样本中是否存在HIV。

与目前所采用的检测试剂和方法相比，本发明实施例提供的检测芯片由于采用了序列表中包括SEQ ID NO：1-6序列的特异性基因片段，SEQ IDNO：7的阳性对照，SEQ ID NO：8的阴性对照，很好地解决了灵敏度与特异性之间的制约关系，提高了产品的质量和实用性。而且，应用本发明实施例提供的HIV基因检测芯片也更好地解决了HIV核酸半定量方面的问题，而HIV体内核酸半定量的测定对病人预后、药物疗效的评估，具有重要意义。

另外，采用本发明提供的HIV核酸检测方法时，由于可以一次加入含有序列表中SEQ ID NO：9-21序列的反应体系，就可以在试管中一次完成逆转录、扩增和地高辛标记，操作简单，减少了成本和交叉污染的机会，有利于在基层临床检测中得到推广和应用。

附图说明

图1显示本发明实施例提供的HIV基因检测芯片的结构图；

图2显示应用图1中芯片检测经过确认的HIV阳性样本的结果。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明的HIV基因检测芯片是在固相载体上固定有不同浓度梯度的HIV特异性基因片段以及阳性和阴性对照。所述的固相载体可以是尼龙膜，也可以是其他合适的材料。所述的HIV特异性基因片段是HIV gag基因片段，包括具有SEQ ID NO：1-6的序列的核酸片段。由于采用了多个片段组合，降低了由于HIV核酸变异带来的检出率下降的可能性，提高了检测的灵敏性和特异性。杂交结果显示，该芯片的检测灵敏度可达到＜50copy。

阳性对照是具有SEQ ID NO：7的序列的核酸片段。阴性对照是具有SEQID NO：8的序列的核酸片段。阴性对照采用的是一段植物基因，与HIV片段同源性很低。阴性对照应该与HIV基因片段无非特异性杂交反应，如阴性对照出现杂交阳性信号，说明芯片受到HIV核酸片段的污染或RT-PCR反应体系受到其它核酸片段的污染。阳性对照采用小鼠GAPDH基因片段，与HIV基因片段同样没有非特异性杂交反应，并且该片段的质粒克隆扩增效率很高，在RT-PCR地高辛标记反应体系中加入微量的该克隆质粒即可产生高效的扩增。如果芯片杂交后没有该片段的杂交阳性信号，说明RT-PCR标记反应体系出现问题，如少加了某种RT-PCR反应成分或反应体系有逆转录酶或TaqDNA聚合酶的抑制剂。通过设置阴性对照和阳性对照，有效排除了假阳性和假阴性反应。

在本发明的一个具体实施方案中，HIV基因检测芯片为膜芯片，基因点样直径为0.15-0.2mm的斑点，膜芯片的大小为4cm×3.5cm，六个HIV基因片段以六个浓度梯度点样，点样数为36个，另加阳性对照样6个，阴性对照样6个。上述六个浓度梯度为，第1梯度浓度为0.5μg/μl，第2梯度浓度为0.1μg/μl，第3梯度浓度为0.05μg/μl，第4梯度浓度为0.01μg/μl，第5梯度浓度为0.005μg/μl，第6梯度浓度为0.001μg/μl。当然，根据需要可以将上述不同浓度梯度个数及浓度值进行调整。

本发明实施例提供的上述HIV基因检测芯片的制备方法，其步骤包括：

(1)在一个试管中加入含有随机六核苷酸引物的反应体系，所述反应体系还含有引物组SEQ ID NO.14+12、SEQ ID NO.20+10、SEQ ID NO.20+11、SEQ ID NO.21+13、SEQ ID NO.18+12、SEQ ID NO.15+12、SEQ ID NO.20+9、SEQ ID NO.16+9、SEQ ID NO.17+10、SEQ ID NO.19+11中的一种或几种，对HIV RNA样品一次完成逆转录反应和PCR扩增；

(2)从以上得到的片段中挑取阳性片段克隆，测序证实后保存；

(3)将上述克隆的阳性片段引物组合在不同病人血液中经RT-PCR证实后，选出特异性高，灵敏度高的引物组合探针，即具有SEQ ID NO：1-6的序列的引物组合探针，保存。

(4)将所述保存的探针扩增产物纯化后与经扩增、纯化步骤的所述阳性对照和阴性对照分别放置到微型板中，然后将浓度调整为所述不同浓度梯度后点膜；

(5)将点膜后滤膜进行交联固定，制成HIV基因检测芯片。

采用上述方法制备所述芯片，由于在一个试管中一次完成逆转录反应和PCR扩增，操作简单，成本低。

本发明应用上述HIV基因检测芯片检测HIV核酸的方法，包括以下步骤：

(A)从样本中分离RNA；

(B)将得到的RNA转移到一个试管中，加入含有SEQ ID NO：9-21序列的反应体系，一次完成逆转录、扩增和地高辛标记；

(C)将标记好的探针与所述HIV基因检测芯片杂交，根据杂交结果判断样本中是否存在HIV。

其中所述样本可以是血液、血清、血浆、淋巴液、精液、尿液、唾液和脑脊液。从样本中分离RNA的方法是本领域技术人员熟知的。

在本发明的HIV核酸检测方法中，逆转录步骤中所使用的引物是具有SEQID NO：9-13的序列的引物以及随机六核苷酸引物。核酸扩增采用MultiplexPCR方法，其中使用的引物是具有SEQ ID NO：9-21的序列的引物。在实施本发明的方法时，一次加入上述所有引物和其他反应产物，反应就可以在一个试管中一次完成。

在本发明的方法中，完成杂交后，可以通过显色反应判断反应结果。显色步骤后，可以通过肉眼观察芯片上的杂交斑点，来判断反应结果，或者通过扫描仪扫描，从而进行定量测定。

实施例

实施例1：HIV基因检测芯片的制备

从HIV感染者体内获取HIV特异核酸片段，验证后克隆、保存，用作HIV基因检测芯片的探针，此方法可细分为：

(1)在一个试管中加入含有随机六核苷酸引物的反应体系，该反应体系还含有引物组SEQ ID NO.14+12、SEQ ID NO.20+10、SEQ ID NO.20+11、SEQID NO.21+13、SEQ ID NO.18+12、SEQ ID NO.15+12、SEQ ID NO.20+9、SEQID NO.16+9、SEQ ID NO.17+10、SEQ ID NO.19+11中的一种或几种，对HIVRNA样品一次完成逆转录反应和PCR扩增；

其中，上述SEQ ID NO：14-21序列是针对HIV特异片段的寡核苷酸正向引物；上述SEQ ID NO：9-13序列是针对HIV特异片段的寡核苷酸反向引物；随机六核苷酸引物是指能够与上述样品的HIV RNA接触，引发DNA的合成的长度为六个核苷酸的引物，随机六核苷酸引物的加入可以大大增强RT-PCR的效果。

所采用的方法为：在一个200微升的PCR管中，混合以下成分。

10×缓冲液	5微升
		25mM MgCl2	10微升
10mM 4dNTP mix(final 0.2mM)	5微升
		Rnase inhibitor(40U/ul)	1微升
AMV Rtase XL(5U/ul)	1微升
		AMV-optimized Taq(5U/ul)	1微升
引物组*	2微升
		模板RNA	10微升
6mer随机引物(100uM)	4微升
		去离子水	11微升

^*引物组：为SEQ ID NO.14+12，SEQ ID NO.20+10，SEQ ID NO.20+11，SEQID NO.21+13，SEQ ID NO.18+12，SEQ ID NO.15+12，SEQ ID NO.20+9，SEQ IDNO.16+9，SEQ ID NO.17+10，SEQ ID NO.19+11组合中的一种或几种。

按以下方法进行扩增，典型的变性、退火和聚合条件如下：

94℃	2分钟	循环次数2次
			50℃	30秒
72℃	2分钟

94℃	30秒	循环次数35次
			62℃	30秒
72℃	1.5分钟
			72℃	10分钟

(2)从以上得到的片段中挑取阳性片段克隆，测序证实后保存；所用方法为：

[1].感受态细胞的制备：

挑取JM109受体菌单菌落(2～3mm)于有2YT培养基的200ml锥形瓶中。

37℃振荡(250rp)培养2.5小时(活细胞数不超过10⁸个/ml)超净工作台上，倒入经消毒的50ml离心管中，盖严。

在冰浴中放置10分钟，使菌落冷却至0℃。

4℃，4000rp离心10分钟收集菌体。

弃上清夜，倒置在卫生纸上1分钟。

加10ml预冷的0.1mol/L CaCL₂，悬浮菌体。

冰浴25分钟。

离心(4℃ 4,000rpm 10分钟)

加入1.5ml预冷的0.1mol/L CaCL₂小心悬浮。

4℃冰箱保存过夜。

[2].连接

在微型离心管中制备下列连接反应液，总量为10μl。

PMD 18-T Vector                    1μl

Control Insert DNA                 1μl

dH₂O                              3μl

Solution I                         5μl

16℃反应过夜。

[3].转化

用微量移液器吸取已培养的感受态细胞100μl，加入小PCR管中，用微量移液器尖端混合均匀。

冰浴30分钟。

42℃静置90秒。

冰浴2～3分钟。

加入800μl 37℃预热的2YT培养基中

置于摇床37℃(200rpm)45分钟。

各取100～200μl涂板，将培养皿置于室温至液体被吸收。

倒置培养皿，37℃培养过夜。挑取阳性克隆，测序证实后，-20℃保存。

(3)将上述克隆的阳性片段引物组合在不同病人血液中经RT-PCR证实后，选出特异性高，灵敏度高的引物组合探针，即具有SEQ ID NO：1-6的序列的引物组合探针，保存。

(4)将所述保存的探针引物扩增产物纯化后与经扩增、纯化步骤的所述阳性对照和阴性对照分别放置到微型板中，然后将浓度调整为6个浓度梯度后点膜；

具体步骤为：

[1].将保存的探针引物进行PCR扩增。

所用方法为：

	×1
		10×PCR缓冲液	5μl
10mM 4dNTP mix(final 0.2mM)	1μl
		Taq酶(1U/ul)	1μl
去离子水	33μl
		模板DNA	1μl
MgCl2	4μl
		引物	各1μl

PCR循环如下：

94℃	3分钟
			94℃	30秒	循环次数35次
42℃	30秒
		72℃	30秒
72℃	7分钟

[2]将上述PCR产物纯化

1.取40μl PCR产物，加200μl体积的GENECLEAN Turbo盐溶液(BIO 101，GENECLEAN TURBO FOR PCR KIT，Cat No：1103-200)，混匀。

2.将上述溶液转移至Turbo Cartridge，10,000rpm离心5秒。

3.加54ml无水乙醇到Wash Solution中，混匀后，取500μl到TurboCartridge。

4.离心5秒中，去下层洗液

5.重复洗涤一次

6.将空的Turbo Cartridge管离心4分钟，10,000rpm。

7.将Turbo Cartridge管移到一新管中，去掉Turbo Cartridge的盖子。

8.加30μl洗脱液室温放置5分钟。

9.离心30秒，10,000转/分，收集回收液(含PCR产物)

10.-20℃保存备用。

[3]点膜：

将经扩增、纯化步骤的阳性对照和阴性对照与上述纯化后的PCR产物转移到384孔微型板中，将浓度调整为0.5μg/μl，加入20×SSC，终浓度为6×SSC，然后调整为6个浓度梯度，即第1梯度浓度为0.5μg/μl，第2梯度浓度为0.1μg/μl，第3梯度浓度为0.05μg/μl，第4梯度浓度为0.01μg/μl，第5梯度浓度为0.005μg/μl，第6梯度浓度为0.001μg/μl。最后用384.5a点膜仪(V&P Scientifics Corp.)点膜。

(5)将点膜后滤膜进行交联固定，制成HIV基因检测芯片。

将点膜后的滤膜在80℃真空环境下，烘烤30分钟，然后在紫外交联仪内65毫焦/cm²进行交联固定。

HIV基因检测芯片为多斑点的膜芯片，点样直径为0.15-0.2mm的斑点，膜芯片的大小如下：4cm长×3.5cm宽，HIV基因点样为36个，六个片段以上述六个浓度梯度点样，阳性对照点样6个，阴性对照点样6个。基因点样为6个，其中5个检测基因，1个内参照基因。

实施例2：HIV核酸检测方法

(A)从样本中分离HIV RNA，方法为：

准备：

用1ml SKVR(Solution I)结合溶液溶解Carrier RNA后，转入SolutionI瓶。

将溶解了Carrier RNA的Solution I溶液分装成小份，4℃冰箱可保存6个月。如有沉淀，用之前37℃加热，同一试剂加热勿超过5次。

加等体积的无水乙醇到SKVR洗涤液A中。

在SKVR洗涤液B中加无水乙醇至乙醇终浓度为35％。

操作：

取一1.5ml的离心管，加入300μl SKVR结合溶液后，再加入200μl血浆，用微量移液器轻轻抽吸4次后，室温放置10分钟。

取200μl DEPC处理的水放在一小离心管中，65℃水浴，预热备用。

向管中加250μl无水乙醇，上下颠倒试管3分钟。

将提纯树脂溶液(Solution II)摇匀至无肉眼可见的沉淀为止。加50微升提纯树脂溶液后，将全部液体上柱，12,000转/分，离心1分钟。

将柱子取出，移到一个2ml的新管中，小心打开盖子，加入600μlSKVR洗液A(Solution III)，12,000转/分，离心1分钟。

第二次将柱子取出，移到一个2ml的新管中，小心打开盖子，加入600μlSKVR洗液B(Solution IV)，12,000rpm，离心1分钟。

第三次将柱子取出，移到一个2ml的管中，小心打开盖子，加入500μl75％的乙醇，12,000rpm，离心1分钟。

最后将柱子转移到一个1.5ml的收集管中，小心打开盖子，加50μl预热的DEPC处理的水，65℃水浴5分钟，然后12,000rpm，离心2分钟保存离心后的液体(在1.5ml的收集管中)，备用。

(B)将得到的病毒RNA转移到一个试管中一次完成逆转录、扩增和地高辛标记，方法为：

	标记
		10×缓冲液	5μl
25mM MgCl2	10μl
		33.3mM d(AGC)TP mix	4μl
2mM dTTP	2μl
		0.1mMDig-dUTP	8μl
Rnase inhibitor(40U/ul)	1μl
		AMV Rnase XL(5U/ul)	1μl

AMV-optimizedTaq(5U/ul)	1μl
		1×混合引物*	4μl
模板RNA(L)	10μl
		6mer随机引物(100uM)	4μl

^*混合引物：为所有引物(SEQ ID NO.9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21)各取1μl充分混匀后的混合引物。

按以下方法进行扩增，典型的变性、退火和聚合条件如下：

94℃	2分钟	循环次数2次
			50℃	30秒
72℃	2分钟
			94℃	30秒	循环次数35次
62℃	30秒
		72℃	1.5分钟
72℃	10分钟

(C)将标记好的探针与膜上的探针杂交，洗涤后肉眼观察结果，扫描仪进行病毒半定量检测。具体方法为：

试剂配制：

a)经变性并被打断的鲑鱼精DNA

b)把鲑鱼精DNA(Sigma，III型，钠盐)溶解于水配制成10mg/ml浓度(必要时于室温磁力搅拌2～4小时助溶)

c)把溶液中NaCl的浓度调至0.1mol/L，并用酚和酚：氯仿各抽提一次，回收水相。

d)使DNA溶液快速通过17号皮下注射针头12次，以剪切DNA。

e)加入2倍体积用冰预冷的乙醇沉淀DNA。

f)离心回收DNA并重溶于水，配制成10mg/ml的浓度。

g)测定溶液的OD₂₆₀值并计算出DNA浓度。

h)煮沸10分钟，分装成小份保存于-20℃。

i)临用前置沸水浴中加热5分钟然后迅速在冰浴中骤冷。预杂交液中应含有100μg/ml经变性并被打断的鲑精DNA。

Denhardt试剂

Denhardt试剂(Denhardt，1996)通常配置成50×贮存液，过滤后保存于-20℃。可将该贮存液10倍稀释于预杂交液(常为含有0.5％SDS和100μl/ml经变性并被打断的鲑精DNA的6×SSC或6×SSPE)中。50×Denhardt液中含5g聚蔗糖(Ficoll，400型，Pharmacia)、5g聚乙烯吡咯烷酮和5g牛血清白蛋白(组分V；Sigma)，加水至终体积为500ml。

预杂交和杂交：

杂交液的配制

杂交液：6×SSC

5×Denhardr试剂

0.5％SDS

100μg/ml经变性并断裂成片段的鲑精DNA

50％甲酰胺

操作：

1、预杂交：

1)每一张杂交膜用杂交液2ml。

2)将杂交膜装入杂交袋中，加入2ml杂交液。尽可能将袋内空气挤压出来，加热封口，将其浸入42℃的水浴中温育1小时。

3)100℃加热5分钟使探针变性，迅速在冰水浴中骤冷。

4)将杂交袋剪开一角，加入探针，尽可能将袋内所有空气挤压出去，加热封口。

5)将杂交袋浸入42℃的水浴，杂交过夜。

6)取出杂交膜并将其置入一个盛有2×SSC和0.1％SDS的托盘内，于室温洗涤4次，每次5分钟。

7)将杂交膜转移至一个盛有0.2×SSC，0.1％SDS的平底塑料盒中，洗涤2次，每次30分钟。

8)将滤膜置于一叠纸巾上，以除去大部分液体。

2、显色：

1)将HIV膜放入封闭液中封闭30分钟

2)加入2ml抗地高辛抗体稀释液(稀释度为1∶3000)

3)用10m洗涤液洗涤2次，每次15分钟

4)加入2ml检测缓冲液5分钟

5)加入1ml NBT/BCIP底物溶液，平铺于膜上用塑料纸盖好，避光(勿晃动)，反应时间至阳性参照有清晰的斑点出现为止。

6)用水冲洗终止反应。

3、检测结果

申请人采用本发明的HIV核酸检测方法检测了经过确认的HIV患者标本，具体情况如下。共检测了20例HIV感染者和5例阴性血清，均与原先的结果相符。阳性标本来源于深圳市疾病预防控制中心艾滋病确认实验室。所有阳性标本均经该实验室用WB方法确认。病人血清中的病毒载量在50copy/ml到50000copy/ml范围内(经该室用Roche公司的HIV-1 MONITOR^TM TEST试剂盒测定)。阴性标本来源于深圳市疾病预防控制中心艾滋病确认实验室，经该室用硒标法确认为阴性。

图1显示本发明实施例提供的HIV基因检测芯片的结构图。其中阴性对照为辣椒色素基因，与HIV基因无同源性，因此，在所有检测中，均不应出现杂交信号。HIV基因探针为保守的HIV基因，在与HIV感染者阳性病人血清杂交后，出现杂交信号，而正常人的血清不应出现杂交信号。阳性对照为GAPDH基因，只要操作和检测试剂无误，应出现杂交信号。图中1-6为不同的上样浓度。

图2显示应用图1中芯片检测经过确认的HIV阳性样本的结果。由该结果可以看见，本发明的HIV基因检测芯片和应用其检测HIV核酸的方法可以准确地检出样本中的HIV核酸。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

                        序列表

<110>深圳市疾病预防控制中心

<120>HIV基因检测芯片，其制备方法和应用其检测HIV核酸的方法

<160>21

<170>Patentln version 3.1

<210>1

<211>152

<212>DNA

<213>人类免疫缺损病毒

<400>1

gctaactagg gaacccactg cttaagcctc aataaagctt gccttgagtg cttcaagtag

60

tgtgtgcccg tctgttgtgt gactctggta actagagatc cctcagaccc ttttagtcag

120

tgtggaaaat ctctagcagt ggcgcccgaa ca

152

<210>2

<211>130

<212>DNA

<213>人类免疫缺损病毒

<400>2

taagcctcaa taaagcttgc cttgagtgct tcaagtagtg tgtgcccgtc tgttgtgtga

60

ctctggtaac tagagatccc tcagaccctt ttagtcagtg tggaaaatct ctagcagtgg

120

cgcccgaaca

130

<210>3

<211>114

<212>DNA

<213>人类免疫缺损病毒

<400>3

ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg taactagaga

60

tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca gtggcgcccg aaca

114

<210>4

<211>188

<212>DNA

<213>人类免疫缺损病毒

<400>4

ataatccacc tatcccagta ggagaaattt ataaaagatg gataatcctg ggattaaata

60

aaatagtaag aatgtatagc cctaccagca ttctggacat aagacaagga ccaaaggaac

120

cctttagaga ctatgtagac cggttctata aaactctaag agccgagcaa gcttcacagg

180

aggtaaaa

188

<210>5

<211>296

<212>DNA

<213>人类免疫缺损病毒

<400>5

agtgggggga catcaagcag ccatgcaaat gttaaaagag accatcaatg aggaagctgc

60

agaatgggat agagtgcatc cagtgcatgc agggcctatt gcaccaggcc agatgagaga

120

accaagggga agtgacatag caggaactac tagtaccctt caggaacaaa taggatggat

180

gacaaataat ccacctatcc cagtaggaga aatttataaa agatggataa tcctgggatt

240

aaataaaata gtaagaatgt atagccctac cagcattctg gacataagac aaggac

296

<210>6

<211>676

<212>DNA

<213>人类免疫缺损病毒

<400>6

agtgggggga catcaagcag ccatgcaaat gttaaaagag accatcaatg aggaagctgc

60

agaatgggat agagtgcatc cagtgcatgc agggcctatt gcaccaggcc agatgagaga

120

accaagggga agtgacatag caggaactac tagtaccctt caggaacaaa taggatggat

180

gacaaataat ccacctatcc cagtaggaga aatttataaa agatggataa tcctgggatt

240

aaataaaata gtaagaatgt atagccctac cagcattctg gacataagac aaggaccaaa

300

ggaacccttt agagactatg tagaccggtt ctataaaact ctaagagccg agcaagcttc

360

acaggaggta aaaaattgga tgacagaaac cttgttggtc caaaatgcga acccagattg

420

taagactatt ttaaaagcat tgggaccagc ggctacacta gaagaaatga tgacagcatg

480

tcagggagta ggaggacccg gccataaggc aagagttttg gctgaagcaa tgagccaagt

540

aacaaattca gctaccataa tgatgcagag aggcaatttt aggaaccaaa gaaagattgt

600

taagtgtttc aattgtggca aagaagggca cacagccaga aattgcaggg cccctaggaa

660

aaagggctgt tggaaa

676

<210>7

<211>240

<212>DNA

<213>小鼠(小鼠(mouse))

<220>

<221>misc_feature

<222>(112)..(112)

<223>n＝a，t，g，or c

<400>7

tgatgacatc aagaaggtgg tgaagcaggc atctgagggc ccactgaagg gcatcttggg

60

ctacactgag gaccaggttg tctcctgcga cttcaacagc aactcccact cntccacctt

120

cgatgccggg gctggcattg ctctcaatga caactttgtc aagctcattt cctggtatga

180

caatgaatac ggctacagca acagggtggt ggacctcatg gcctacatgg cctccaagga

240

<210>8

<211>176

<212>DNA

<213>辣椒

<400>8

ggtaggaaga taagcggtag cttgattgtt gatgcaagtg gctatgctag tgattttata

60

gagtatgaca agccaagaaa ccatggttat caagttgctc atgggatttt agcagaagtt

120

gataatcatc catttgattt ggataaaatg atgcttatgg tattggaggg attctc

176

<210>9

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>9

ttttacctcc tgtgaagctt gctcggct

28

<210>10

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>10

gtccttgtct tatgtccaga atgc

24

<210>11

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>11

tttccaacag ccctttttcc tagg

24

<210>12

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>12

tgttcgggcg ccactgctag aga

23

<210>13

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>13

gctatgtcac ttccccttgg ttctctc

27

<210>14

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>14

gctaactagg gaacccactg c

21

<210>15

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>15

ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtg

28

<210>16

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>16

tcagacagga tcagaagaac

20

<210>17

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>17

cagaacatcc aggggcaaat ggtac

25

<210>18

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>18

taagcctcaa taaagcttgc cttgag

26

<210>19

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>19

gtagaagaga aggctttcag c

21

<210>20

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>20

cacagtgggg ggacatcaag cagc

24

<210>21

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>21

ataatccacc tatcccagta ggagaaat

28

Claims (9)

1.一种HIV基因检测芯片，其中在固相载体上固定有HIV特异性基因片段和阳性及阴性对照，所述HIV特异性基因片段包括SEQ ID NO：1-6的序列，阳性对照为SEQ ID NO：7，阴性对照为SEQ ID NO：8。

2.如权利要求1的芯片，所述HIV特异性基因片段以不同的浓度梯度固定在固相载体上。

3.如权利要求2的芯片，所述不同的浓度梯度为6个：第1梯度浓度为0.5μg/μl，第2梯度浓度为0.1μg/μl，第3梯度浓度为0.05μg/μl，第4梯度浓度为0.01μg/μl，第5梯度浓度为0.005μg/μl，第6梯度浓度为0.001μg/μl。

4.一种如权利要求1所述HIV基因检测芯片的制备方法，其步骤包括：

(1)在一个试管中加入含有随机六核苷酸引物的反应体系，所述反应体系还含有引物组SEQ ID NO.14+12、SEQ ID NO.20+10、SEQ ID NO.20+11、SEQ ID NO.21+13、SEQ ID NO.18+12、SEQ ID NO.15+12、SEQ ID NO.20+9、SEQ ID NO.16+9、SEQ ID NO.17+10、SEQ ID NO.19+11中的一种或几种，对HIV RNA样品一次完成逆转录反应和PCR扩增；

(2)从以上得到的片段中挑取阳性片段克隆，测序证实后保存；

(3)将上述克隆的阳性片段引物组合在不同病人血液中经RT-PCR证实后，选出具有SEQ ID NO：1-6的序列的引物组合探针，保存。

(4)将所述保存的探针扩增产物纯化后与经扩增、纯化步骤的所述阳性对照和阴性对照放置到微型板中，然后将浓度调整为所述不同浓度梯度后点膜；

(5)将点膜后滤膜进行交联固定，制成HIV基因检测芯片。

5、一种如权利要求4所述HIV基因检测芯片的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述不同浓度梯度为6个：第1梯度浓度为0.5μg/μl，第2梯度浓度为0.1μg/μl，第3梯度浓度为0.05μg/μl，第4梯度浓度为0.01μg/μl，第5梯度浓度为0.005μg/μl，第6梯度浓度为0.001μg/μl。

6、一种应用如权利要求1HIV基因检测芯片检测HIV核酸的方法，包括以下步骤：

(A)从样本中分离RNA；

(B)将得到的RNA转移到一个试管中，加入含有SEQ ID NO：9-21序列的反应体系，一次完成逆转录、扩增和地高辛标记；

(C)将标记好的探针与所述HIV基因检测芯片杂交，根据杂交结果判断样本中是否存在HIV。

7、如权利要求6的方法，其中所述样本可以是血液、血清、血浆、淋巴液、精液、尿液、唾液或脑脊液。

8、如权利要求6的方法，所述样本中HIV是否存在的判断通过显色反应完成。

9、如权利要求6的方法，所述步骤还包括通过扫描仪扫描进行半定量检测。

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