CN1273611C - 使用突变dna聚合酶的高温逆转录 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用热稳定DNA聚合酶的改进逆转录方法，特别是在镁离子缓冲液中。这些方法在合并逆转录/扩增反应中特别有用。

Description

使用突变DNA聚合酶的高温逆转录
发明背景
发明领域
本发明涉及分子生物学领域，特别是逆转录和核糖核酸(RNA)序列扩增的方法。
现有技术状况
术语“逆转录酶”是指一类鉴定为RNA依赖性DNA聚合酶的聚合酶。所有已知的逆转录酶由RNA模板合成DNA均需引物。长期以来，逆转录酶主要用于将mRNA转录成cDNA，后者再被克隆到载体中供进一步操作。
术语“DNA聚合酶”是指一类鉴定为DNA依赖性DNA聚合酶的聚合酶。DNA聚合酶强烈地排斥识别RNA模板，这与其体内功能是一致的。但是，有几个实验室已经发现，某些DNA聚合酶能够在体外转录RNA(Karkas，1973，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 70：3834-3838；Gulati et al.，1974，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 71：1035-1039；和Wittig和Wittig，1978，Nuc.Acid Res.5：1165-1178)。Gulati等发现大肠杆菌Pol I可用于使用寡聚(dT)10引物转录Qβ病毒RNA。Wittig和Wittig已经证实大肠杆菌Pol I能被用于已使用寡聚(dA)酶促延长的tRNA的逆转录。但是，Gulati等证实，需要的酶量和cDNA产物分子较小的事实表明大肠杆菌Pol I的逆转录酶活性几乎不具实用价值。
水生栖热菌(T.aquaticus，Taq)DNA聚合酶是热稳定性DNA聚合酶，已有报导称使用镁离子作为二价金属离子时其合成cDNA效率很低(Jones and Foulkes，1989，Nuc.Acids.Res.176：8387-8388)。Tse和Forget(1990，Gene 88：293-296)以及Shaffer等(1990，Anal.Biochem.190：292-296)已经介绍了使用Taq DNA聚合酶和镁离子扩增RNA的方法。但是，该方法效果差且不敏感。
RNA和DNA核酸序列扩增的描述可参见美国专利4,683,195；4,683,202和4,965,188，所述专利本文引为参考。优选的方法是聚合酶链反应(PCR)，该方法一般使用Taq DNA聚合酶等热稳定DNA聚合酶进行，这些酶能够经受每个循环中变性扩增产物的温度。在本领域中，PCR现已广为人知，在科学文献中有大量的描述。可参见诸如《PCR应用》1999(Innis et al.，Academic Press，San Diego)，《PCR策略》1995(Innis et al.，Eds.，Academic Press，SanDiego)；《PCR方法》1990(Innis et al.，Eds.，Academic Press，San Diego)；和《PCR技术》1989(Erlich，ed.，Stochton Press，New York)；所述文献均引为参考。PE Biosystems(Foster City，CA)等销售商供应PCR试剂并出版PCR方法。扩增方法的综述见Abramson和Myers，1993，“现代生物技术评析”4：41-47，该文献在此引为参考。
由于使用镁离子缓冲液中的Taq DNA聚合酶的逆转录效率低至不具实用价值，进行由RNA模板起始的PCR扩增时，先使用美拉尼鼠白白血病病毒逆转录酶(MoMuLV RT)或AMV-RT等非热稳定病毒逆转录酶等首先逆转录靶RNA，然后使用热稳定DNA聚合酶扩增所得的cDNA。
一项重要进展是，发现不在镁(Mg2+)缓冲液而在锰(Mn2+)缓冲液中进行反应时，热稳定DNA聚合酶可以用来有效地逆转录RNA模板，使用DNA模板进行引物延伸更为优选。使用热稳定DNA聚合酶的有效锰离子激活逆转录公开于美国专利5,310,652；5,322,770；5,407,800；5,641,058和5,693,517，所述专利均引为参考。由于由DNA模板的cDNA合成和由DNA模板的DNA合成均可在锰离子缓冲液中进行，使用锰离子缓冲液可以实现单一酶偶联逆转录/扩增反应(也可参见Myers and Sigua，1995，《PCR策略》，同前文，第5章)。
发明概述
本发明提供使用热稳定DNA聚合酶逆转录RNA序列的方法。本发明还提供逆转录和扩增RNA序列的方法，优选在一个偶联的单管反应中使用单一热稳定DNA聚合酶。相对于以前所述的高温逆转录方法，本发明的方法提供了较高的逆转录(“RT”)效率。
在一个优选实施方案中，本发明提供了在镁离子(Mg+2)缓冲液中逆转录RNA的方法，以及使用单一热稳定DNA聚合酶在镁离子缓冲液中逆转录和扩增RNA序列的方法，优选是一个偶联的单管反应。相对于以前所述的依赖锰离子(Mn+2)激活热稳定DNA聚合酶的方法，使用镁离子缓冲液的该方法的保真性较高。
本发明的方法使用一种突变热活性DNA聚合酶，优选热稳定DNA聚合酶，其在关键氨基酸位置含有点突变，以前已经报导所述关键氨基酸位置影响DNA聚合酶对荧光素或花菁族染料标记的双脱氧核苷酸(ddNTP)的结合能力。本发明源于以下惊人发现，即这些突变DNA聚合酶也具有显著提高的进行逆转录反应的能力，特别是在镁离子缓冲液中的反应。
用于本发明方法的突变DNA聚合酶公开于欧洲专利申请0902,035、共同未决的美国专利申请09/146,631和PCT国际专利公开WO 98/40496，所述专利申请均引为参考。根据其中的记载，这些突变的DNA聚合酶具有更强的结合核苷酸的能力，所述核苷酸包括荧光素和花菁族染料标记的脱氧核苷酸(dNTP)和双脱氧核苷酸(ddNTP)等碱基类似物。为方便起见，这些突变DNA聚合酶在本文中称为“荧光素家族染料结合”DNA聚合酶或“FDI”DNA聚合酶。FDI DNA聚合酶的主要用途是用于使用荧光素或花菁族染料标记的染料终止物(染料标记的ddNTP)的DNA测序反应中。由于野生型DNA聚合酶排斥识别核苷酸类似物，甚至排斥标记的核苷酸类似物，染料终止物测序反应一般使用过量染料终止物。通过降低对标记染料终止物的排斥识别，FDI DNA聚合酶使得用显著较低的染料终止物浓度进行测序反应成为可能。
在本发明方法中使用的DNA聚合酶中发生突变的关键氨基酸位置，与影响DNA聚合酶对荧光素和花菁族染料标记的双脱氧核苷酸的结合能力的关键氨基酸相同，该位置在欧洲专利申请0 902 035和共同未决的美国专利申请09/146,631中通过定位于天然酶中存在的一个保守基序中而得以鉴定。在多种DNA聚合酶中存在的序列基序的实例见本文表1。序列基序和关键氨基酸下文以基本相同的方式鉴定。
最一般地说，使用标准的氨基酸单字母缩写时，该天然形式DNA聚合酶的关键基序包括以下氨基酸序列
              LXXXXXXXXXE(SEQ ID NO：1)
其中，2位的X是S或A，3、4、6、7、8、9和10位的X是任何氨基酸，5位的X是L或I。
在一个更具体的实施方案中，天然形式DNA聚合酶的关键基序包括以下氨基酸序列
             LSXELXIPYEE(SEQ ID NO：2)
其中，3位的X是Q或G，6位的X是S或A。含有该基序的DNA聚合酶的实例是栖热菌属DNA聚合酶。
在一个优选实施方案中，天然形式DNA聚合酶的关键基序包括以下氨基酸序列
              LSQELAIPYEE(SEQ ID NO：3)
含有该基序的DNA聚合酶的实例是栖热菌属水生栖热菌、嗜热栖热菌、ZO5和T.caldophilus的DNA聚合酶。
在另一个优选实施方案中，天然形式DNA聚合酶的关键基序包括以下氨基酸序列
              LSXELSIPYEE(SEQ ID NO：4)
其中，3位的X是Q或G。含有该基序的DNA聚合酶的实例是栖热菌属黄栖热菌、sps17和丝状栖热菌的DNA聚合酶。
在另一个更具体的实施方案中，天然形式DNA聚合酶中的关键基序包括以下氨基酸序列
             LSVRLGXPVKE(SEQ ID NO：5)
其中，7位的X是V或I。含有该基序的DNA聚合酶的实例是栖热袍菌属海栖热袍菌和那不勒斯栖热袍菌的DNA聚合酶。
在另一个更具体的实施方案中，天然形式DNA聚合酶的关键基序包括以下氨基酸序列
              LKSRIGLSVSE(SEQ ID NO：6)
含有该基序的DNA聚合酶实例是非洲栖热腔菌的DNA聚合酶。
在另一个更具体的实施方案中，天然形式DNA聚合酶的关键基序包括以下氨基酸序列
              LAQNLNIXRKE(SEQ ID NO：7)
其中，8位的X是S或T。含有该基序的DNA聚合酶实例是芽孢杆菌属热坚芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌的DNA聚合酶。
在所有上述鉴定的关键基序中，关键氨基酸是4位氨基酸。
如实施例中证实，对除E(实施例中使用的天然DNA聚合酶中存在)、A、G或P以外的任何关键氨基酸的突变提供了较高的RT效率。因此，本发明的方法使用热活性突变DNA聚合酶，优选热稳定DNA聚合酶，其特征在于天然形式DNA聚合酶包括选自SEQ ID NO：i-7的序列基序，该基序中4位氨基酸突变成除E、A、G或P外的任何氨基酸。优选，关键氨基酸突变成除E、A、G、P或Q外的任何氨基酸，更优选突变成除E、A、G、P、Q或D外的任何氨基酸。
本发明一方面涉及逆转录RNA的方法，该方法包括使用本文所述的突变热活性或热稳定DNA聚合酶进行逆转录。优选，该方法包括：
(a)提供含有与RNA足够互补的引物和本文所述突变热活性或热稳定DNA聚合酶的反应混合物，该引物与RNA杂交并起始与靶RNA互补的cDNA分子的合成；和
(b)在合适的条件下处理反应混合物以提供单链cDNA。
在一个优选实施方案中，反应步骤(a)在合适的缓冲液中进行，其中缓冲液含有Mg+2。
本发明另一方面涉及扩增RNA的方法，该方法包括使用本文所述的突变热活性或热稳定DNA聚合酶进行单一酶合并逆转录/扩增反应。优选，该方法包括：
(a)提供在合适的缓冲液中含有第一和第二引物以及本文所述突变热活性或热稳定DNA聚合酶的反应混合物，其中第一引物与靶RNA足够互补，从而与其杂交并起始与靶RNA互补的cDNA分子的合成，第二引物与靶RNA足够同源，从而与cDNA杂交并起始延伸产物的合成，缓冲液中含有Mg+2；
(b)在合适的条件下处理反应混合物以提供单链cDNA；
(c)在合适的条件下处理步骤(b)的反应混合物以扩增步骤(b)的cDNA。
在优选实施方案中，逆转录和扩增是使用本文所述的突变热活性或热稳定DNA聚合酶在含有Mg+2的缓冲液中进行的单一酶单管偶联逆转录/PCR扩增反应。
发明详述
为了方便理解本发明，以下定义一些术语。
术语“热活性DNA聚合酶”在本文中是指具有较高的最适反应温度的DNA聚合酶。在本发明中，热活性DNA聚合酶催化最适合在60到90℃之间的温度进行的引物延伸。
术语“热稳定DNA聚合酶”是指对热稳定的DNA聚合酶，即它在实现双链核酸变性所必需的时间内处于较高温度不会不可逆地变性(失活)。核酸变性所需的加热条件在本领域中是众所周知的。在本文中，热稳定聚合酶适合在如4,965,188(本文引为参考)所述的聚合酶链反应(PCR)扩增方法的循环反应温度下使用。
“高温逆转录反应”在本文中是指在至少40℃下进行的逆转录反应，优选反应温度为40℃到80℃，更优选50℃到70℃。
术语“基因”是指含有生成可回收的生物活性多肽或前体所必需的控制和编码序列的DNA序列。
术语“天然的”是指由天然来源分离的基因或基因产物。该术语也指通过分子生物学技术制备的重组形式天然蛋白，其氨基酸序列与天然形式相同。
术语“突变体”是指其核酸序列已经发生改变的基因或其氨基酸序列已经发生改变的基因产物，产生的基因产物具有与天然或野生型基因或基因产物不同的功能特性。
在本文中，氨基酸序列中的“点突变”是指单个氨基酸取代或单个氨基酸缺失。点突变优选通过编码DNA中合适的密码子改变引入氨基酸序列。
序列中各个氨基酸在本文中表示为AN，其中A是序列中的氨基酸，N是在序列中的位置。氨基酸序列中取代型点突变在本文中表示为A1NA2，其中A1是未突变蛋白序列中的氨基酸，A2是突变蛋白序列中的氨基酸，N是氨基酸序列中的位置。使用单字母或三字母代码代表氨基酸(参见Lehninger，BioChemistry 2nd ed.，1975，WorthPbulishers，Inc.New York，NY：p73-75，本文引为参考)。例如G46D突变代表46位甘氨酸到天冬氨酸的改变。氨基酸位置根据蛋白的全长序列编号，含有突变的区域来自该全长序列。DNA序列中核苷酸和点突变的表示与此类似。
术语“核酸”和“寡核苷酸”是指待检测的引物、探针和寡聚体，是聚脱氧核糖核苷酸(含2-脱氧-D-核糖)、聚核糖核苷酸(含D-核糖)和作为嘌呤或嘧啶碱基或修饰嘌呤或嘧啶碱基的N糖苷的任何其它类型多核苷酸的总称。术语“核酸”和“寡核苷酸”的长度没有确定的区别，这些术语可以互换使用。这些术语仅指分子的一级结构。因此，这些术语包括双链和单链DNA以及双链和单链RNA。
寡核苷酸可通过任何合适的方法制备，包括例如合适序列的克隆和限制和直接化学合成，化学合成方法包括磷酸三酯法(Narang etal.，1979，Meth.Enzymol.68：90-99)、磷酸二酯法(Brown et al.，1979，Meth.Enzymol.68：109-151)、二乙基磷酰胺(diethylphosphoramidite)法(Beaucage et al.，1981，Tetrahedron Lett.22：1859-1862)和固相载体法(美国专利4,458,066)，上述文献均引为参考。使用氰乙基磷酰胺化学法的自动合成是优选的。试剂和仪器可向例如PE Biosystems(AppliedBiosystems，Foster City，CA)和Pharmacia(Piscataway，NJ)洽购。
术语“引物”在本文中是指天然或合成的寡核苷酸，当置于起始引物延伸的条件下时，它能作为合成的起始点。引物优选是单链寡脱氧核糖核苷酸。引物的合适长度取决于引物的预定用途，但一般是15到35个核苷酸。短引物分子与模板形成足够稳定的杂合体通常需要较低的温度。引物无需反应模板的确切序列，但必需足够互补，从而与引物延伸模板杂交。
“一对引物”在本文中是指为扩增所需靶序列选定的在聚合酶链反应等扩增反应中有功能的第一和第二引物。例如，为用于扩增靶RNA的偶联逆转录/扩增反应，一对引物包括第一和第二引物，其中第一引物与靶RNA足够互补，从而与其杂交并起始与该靶RNA互补的cDNA分子合成，所述第二引物与所述靶RNA足够同源，从而与cDNA杂交并起始延伸产物的合成。扩增核酸序列的引物对的设计在本领域是众所周知的。
必要时，引物可以通过掺入分光光度法、光化学法、免疫化学法或化学法可以检测的标记进行标记。例如，有用的标记包括32P、荧光染料、电子致密试剂、酶(ELISA试验中常用)、生物素或可用其获得抗血清或单克隆抗体的半抗原和蛋白。
在本文中，术语“cDNA”是指使用核糖核酸链(RNA)作为模板合成的DNA分子拷贝。RNA可以是mRNA、tRNA、rRNA或病毒RNA等其它形式RNA。cDNA可以是单链、双链或可以是与互补RNA分子氢键结合成RNA/cDNA杂合体。
术语“逆转录反应混合物”是指含有用来逆转录靶RNA的各种试剂的含水溶液。这些试剂包括酶、含水缓冲液、盐、寡核苷酸引物、靶核酸和核苷三磷酸。在不同情况下，混合物可以是完整或不完整的逆转录反应混合物。
术语“扩增反应混合物”是指含有用来扩增靶核酸的各种试剂的含水溶液。这些试剂包括酶、含水缓冲液、盐、扩增引物、靶核酸和核苷三磷酸。在不同情况下，该混合物可以是完整或不完整的反应混合物。在本发明优选实施方案中，扩增反应是聚合酶链反应(PCR)，扩增反应混合物是PCR混合物。在本文中，扩增反应混合物包括在偶联逆转录/扩增反应中用于扩增RNA的反应混合物。
术语“缓冲液”在本文中是指含有缓冲剂或缓冲剂混合物的溶液，可选地含有二价阳离子和单价阳离子。
分子生物学和核酸化学的常规技术均属现有技术，在文献中有详细的介绍。参见例如Sambrook et al.，1989《分子克隆-实验指南》，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait，ed.，1984)；《核酸杂交》(B.D.Hames和S.J.Higgins.Eds.，1984)；《分子生物学基本方法》(Elsevier，NY)；《现代分子生物学方法》(John Wiley和Sons，NY)及《酶学方法》系列(Academic Press，Inc.)，上引文献全部引为参考。本文上文和下文提及的所有专利、专利申请和出版物均引为参考。
本发明方法中使用的突变DNA聚合酶在欧洲专利申请0902,035、共同未决的美国申请09/146,631和PCT国际专利公开WO98/40496(均引为参考)鉴定的关键氨基酸位置含有点突变。欧洲专利申请0 902,035和共同未决的美国申请09/146,631鉴定了天然DNA聚合酶序列中发现的保守关键序列内的关键氨基酸位置。PCT国际公开WO 98/40496通过与Taq DNA聚合酶的氨基酸序列同源性鉴定了Taq DNA聚合酶和其它DNA聚合酶中关键氨基酸的位置(E681)。两种方法均鉴定了相同的关键氨基酸位置。为了叙述的准确性，本文中关键氨基酸采用其在保守关键序列基序中的位置表述。
表1基本上是按照欧洲专利申请0 902,035、共同未决的美国申请09/146,631的表1复制而来，它提供了多种代表性DNA聚合酶中发现的关键基序(关键氨基酸以黑体表示)和全长酶序列中关键氨基酸的位置。提供了多个位置数，其中相同物种的DNA聚合酶在文献中报导的氨基酸序列略有不同。
表1
  生物体 SEQ ID NO： 关键基序   位置
  栖热菌水生栖热菌黄栖热菌嗜热栖热菌Z05sps17caldophilus丝状栖热菌栖热袍菌海栖热袍菌那不勒斯栖热袍菌栖热腔菌非洲栖热腔菌芽孢杆菌热坚芽孢杆菌嗜热脂肪芽孢杆菌 8910111213141516171819 LSQELAIPYEELSGELSIPYEELSQELAIPYEELSQELAIPYEELSQELSIPYEELSQELAIPYEELSQELSIPYEELSVRLGVPVKELSVRLGIPVKELSKRIGLSVSELAQNLNISRKELAQNLNITRKE 681679683683679683679744744743725,724724,727,802
具有热活性DNA聚合酶的多种物种可参见欧洲专利申请0902,035、共同未决的美国申请09/146,631和PCT国际专利公开WO98/40496，该酶含有关键基序。用于本发明的优选DNA聚合酶来自一种栖热菌。
用于本发明方法的突变DNA聚合酶是热活性突变DNA聚合酶，优选热稳定DNA聚合酶，其特征在于天然形式DNA聚合酶包括选自SEQID NO：1-7的序列基序，该基序中4位氨基酸突变成除E、A、G或P外的任何氨基酸。优选，关键氨基酸突变成除E、A、G、P或Q外的任何氨基酸，更优选突变成除E、A、G、P、Q或D外的任何氨基酸。
突变DNA聚合酶可以来自于任何具有热活性DNA聚合酶的物种，该酶含有聚合酶结构域中的关键基序。关键基序确定该酶的聚合酶结构域内的具体功能区域，确定该基序内对其功能至关重要的氨基酸。这些实例介绍了广泛使用的热稳定DNA聚合酶嗜热栖热菌DNA聚合酶中该位点的每一种可能的突变对镁离子激活的逆转录效率的影响。在基本上所有具有保守的关键基序的DNA聚合酶中，该位点的氨基酸改变影响荧光素或花菁族染料标记的双脱氧核苷酸(ddNTP)的掺入效率，预期该位点的氨基酸改变将会影响几乎所有具有保守关键基序的DNA聚合酶的镁离子激活的逆转录效率。
DNA聚合酶的结构相关性和保守功能域的存在是众所周知的(参见例如Ito 和  Braithwaite，1991，Nucl.Acids  Res.19(15)：4045-4047；Blanco et al.，1991，Gene 100：27-38；Gutman和Minton，1993，Nucl.Acids.Res.21(18)：4406-4407；和Delarue et al.，1990，Protein Engineering 3(6)：461-467；均引为参考)。一般，预期保守功能域中关键氨基酸的突变引入其它DNA聚合酶具有类似效果(参见例如，Xu et al.，1997，J.Mol.Biol.268：284-302；美国专利5,466,591；5,795,762；5,939,292和5,614,365，均引为参考)。
其它含有关键基序的热活性或热稳定DNA聚合酶及其中关键氨基酸的位置可以通过直接考察氨基酸序列方便地确定。此外，关键基序和氨基酸可以利用与其它已知含有关键基序的DNA聚合酶如表1所列的栖热菌的DNA聚合酶的序列同源性确定。氨基酸和核酸序列比较程序可以方便地获得。例如，包括“GAP”、“BESTFIT”和“PILEUP”的广泛使用的序列比较程序可获自Genetics Computer Group(Madison，Wisconsin)。一般，使用缺省参数进行序列比较促进与表1中所列的DNA聚合酶之一的关键氨基酸同源的DNA聚合酶序列中关键氨基酸的确定。
获得了新的DNA聚合酶序列后，可以发现含有在SEQ ID NO：1中未明确描述的关键基序变体，但通过与已知酶的序列同源性可鉴别的序列。作为假定的例子，以下酶由于其与几种栖热菌酶的关键基序的高同源性(本例中是11个氨基酸中的10个)将被认为具有该关键基序，该酶在DNA聚合酶结构域具有作为SEQ ID NO：3变体的基序，其区别仅在于5位氨基酸不是L或I。这种酶就本发明目的而言被视为等同物。
关键氨基酸参照天然酶确定。但是，这并不意味着突变酶其它各处的氨基酸序列与天然酶相同。本发明方法中使用的突变DNA聚合酶可以含有其它突变，这些突变对于具体的应用可能更有利。例如，消除了5’到3’外切核酸酶活性或3’到5’外切核酸酶活性的突变及其应用是众所周知的。在SEQ ID NO：1-7中确定的关键基序3位上的另一个突变(例如Tth DNA聚合酶的Q682K、E683K突变)可以提供额外的好处，特别是在Mn+2激活的反应中，如允许Mn+2浓度进一步降低，或进一步扩展可以使用的盐浓度范围。
本发明方法中使用的DNA聚合酶优选以重组表达载体表达，在该载体中编码序列已经过修饰，表达特定的目标突变蛋白序列。在表达质粒的编码序列中引入点突变的方法在本领域是众所周知的，在本文引用的专利和科学文献中也有介绍。详细的方法介绍参见例如Sambrook et al.，《分子克隆：实验指南》Cold Spring Harbor，1989，第二版，15.51章“寡核苷酸介导的诱变”和Ausebel et al.，《现代分子生物学方法》(最新版)，二者均引为参考。欧洲专利申请0902,035、共同未决的美国申请09/146,631和PCT国际专利公开WO98/40496教导了合适表达载体的构建和所得突变DNA聚合酶的表达和纯化。按照引用文献的指导，使用众所周知的技术，本领域技术人员将能够制备任何数量的表达载体，其中含有适于在多种宿主系统中表达本发明方法中使用的突变DNA聚合酶的突变基因。
用于本发明的高温逆转录方法时，只需要DNA聚合酶是热活性即可。由于由RNA模板制备cDNA不涉及高温重复变性循环，该方法中使用的酶没有必要是热稳定的和热活性的。在实施例中的单一酶合并逆转录/聚合酶链反应扩增(RT/PCR)方法中，使用热稳定DNA聚合酶是优选的，因为DNA聚合酶要经受RT和PCR两种条件，其中包括重复变性循环。
根据本发明逆转录时，在含有RNA模板、引物和热活性或热稳定突变DNA聚合酶的混合物中进行反应。反应混合物通常含有所有四种脱氧核苷三磷酸(dNTP)和含有二价阳离子和一价阳离子的缓冲液。DNA聚合酶的催化活性需要二价阳离子。使用DNA模板进行延伸反应时，优选的二价阳离子是镁离子，但锰离子或钴离子等其它阳离子也可激活DNA聚合酶。
与使用热活性或热稳定DNA聚合酶和DNA模板的延伸反应不同，使用RNA模板的延伸反应即逆转录基本上必需使用锰离子来获得实用的效率。例如使用氯化锰或醋酸锰与Tth DNA聚合酶进行RNA扩增比使用氯化镁和标准PCR条件相比，敏感性至少增加106倍。
尽管使用Mn+2增加逆转录效率，但也降低保真性，产生较多的错误合成核苷酸。使用Mn+2也降低DNA扩增的保真性。因此，使用Mn+2的单酶单管RNA扩增反应的结果是降低RNA和DNA反应阶段的保真性。因此，如需要高保真RNA扩增，优选分两步进行反应，首先使用EDTA等螯合剂从逆转录混合物中有效去除锰离子，然后加入合适的含镁离子的DNA扩增混合物完成反应，优选的螯合剂是EGTA。
无论使用何种二价阳离子，在本发明方法中使用突变DNA聚合酶对逆转录反应都是有利的。在锰离子反应中，与使用天然酶相比，使用突变DNA聚合酶可以进行高温逆转录，以更高的效率扩增RNA。此外，使用突变DNA聚合酶可以在较低的锰离子浓度下进行反应，因此，减少了锰离子对保真性的负面影响。
尤其出乎意料的是，突变DNA聚合酶能使用镁离子以显著增加的效率进行逆转录。使用该酶的优选二价阳离子镁离子，提供了显著较高的保真性。因此，在镁离子反应中，使用突变DNA聚合酶可以以实用的效率进行高温、高保真RNA逆转录和扩增。
二价阳离子以盐形式提供，如氯化镁、醋酸镁、硫酸镁、氯化锰、醋酸锰或硫酸锰。通常，使用二价锰离子的反应中，在Tris-HCl缓冲液中可以使用的阳离子浓度是0.5到7mM MnCl2，优选0.5到2mM，在N-二甘氨酸/醋酸钾缓冲液或三甘氨酸(tricine)/醋酸钾缓冲液中可以使用的阳离子浓度是0.5到20mM醋酸锰，优选0.5到5mM。一般，使用二价镁离子的反应中，在Tris-HCl缓冲液中可以使用的阳离子浓度是0.5到10mM MgCl2，在N-二甘氨酸/醋酸钾缓冲液或三甘氨酸(tricine)/醋酸钾缓冲液中可以使用的阳离子浓度是0.5到20mM醋酸锰，优选0.5到5mM。这些浓度提供进行常规反应优化的有用起始条件。在特定反应中，最佳二价离子浓度不仅取决于所用的酶，也取决于其它反应成分，如dNTP浓度和引物序列和浓度。本领域技术人员可以理解，对于任何特定反应，一般反应条件，特别是二价阳离子浓度，可以使用常规实验方法实现优化。
以前，尽管混合二价阳离子缓冲液(如二价镁离子和二价锰离子)能够激活RNA模板指导的DNA合成，但由于较低的敏感性和效率，它并不是优选的。预期混合二价阳离子缓冲液可以用于本发明的方法中，在某些应用中还可能是优选的。使用混合阳离子可能在高效率但低保真性的Mn+2激活反应和高保真Mg+2激活反应中实现平衡。
在Mn+2缓冲液中使用热稳定DNA聚合酶的高温逆转录方法和合并逆转录/扩增方法在本领域是众所周知的。参见，例如美国专利5,310,652；5,322,770；5,407,800；5,561,058；5,641,864和5,693,517，均引为参考。本发明的方法是前述方法的改进，其中改进包括使用突变DNA聚合酶，已如上述。在优选实施方案中，反应在含有Mg+2作为激活DNA聚合酶的二价阳离子的缓冲液中进行。
本发明方法的一个优点是使用突变DNA聚合酶似乎提供了较快的RT延伸速度，因此RT反应所需的时间较少。优选，为了使逆转录反应中产生的cDNA量最大，反应进行约30分钟。取决于具体应用，特别是在锰反应中，RT时间短至1分钟或更短可以提供可接受的结果。
本发明方法的其它优点是使用突变DNA聚合酶可以在较低的酶浓度提供较高的RT效率，并且提供较宽的可使用盐浓度范围。预期，最适反应条件取决于诸如使用的具体酶，可以以常规方式凭经验确定。
实施本发明方法所需考虑的其它方面，如靶RNA的选择，样品制备，引物设计和除DNA聚合酶和二价阳离子以外用来激活DNA聚合酶的其它反应条件，在本领域是众所周知的，可参见例如上引专利。同样，如果逆转录偶联扩增反应，除DNA聚合酶和二价阳离子以外用来激活DNA聚合酶的所有扩增方面在本领域也是众所周知的，可参见例如上引专利。最后，RNA的逆转录和扩增的应用在本领域是众所周知的，可参见例如上引专利。本领域技术人员可以将本发明方法应用于需要RNA逆转录或还需要扩增的任何应用中。
提供以下实施例仅为说明，并非以任何方式限制本发明。
实施例1
突变DNA聚合酶实例
由“天然”嗜热栖热菌(Tth)DNA聚合酶构建一系列共19个突变DNA聚合酶，代表关键氨基酸中的所有可能突变。如欧洲专利申请0 902 035和共同未决的美国申请09/146,631中所述，Tth DNA聚合酶氨基酸序列含有SEQ ID NO：3代表的关键序列基序(它是SEQ IDNO：2的具体实施方案，而后者是普通基序SEQ ID NO：1的较窄的实施方案)。关键氨基酸位于683位(E683)。
Tth DNA聚合酶序列和含有Tth DNA聚合酶基因的质粒在本领域是已知的(例见美国专利5,618,711和5,789,224，均引为参考)。在本实施例中使用的具体质粒编码也含有G46E点突变的Tth DNA聚合酶，该突变消除了酶的5’到3’外切核酸酶活性，如美国专利5,466,591所述，该专利引为参考。此外，专利含有静默核苷酸取代，引入了含有密码子678、679和680的第一个核苷酸的ClaI识别和切割位点，没有改变编码氨基酸序列。据信在5’到3’外切核酸酶结构域存在其它突变对DNA聚合酶在Mg+2缓冲液中逆转录RNA的能力没有可见的影响；具有G46E突变的DNA聚合酶在本文中被认为是天然DNA聚合酶。
在表达蛋白中的点突变通过使用标准技术突变编码DNA序列引入。基本上，含有密码子683的编码序列短片段用含有所需序列的合成片段置换。长度为65个核苷酸的短片段通过限制酶CalI和HindIII消化质粒切割。合成编码氨基酸序列同切割片段相同但在密码子683中含有所需突变的合成双链DNA插入物。合成的片段连接至消化的质粒中，产生含有编码具有所需点突变的全长Tth DNA聚合酶的突变密码子的质粒。
实施例2
逆转录/扩增效率
比较实施例1的20种DNA聚合酶(1种天然酶和19种突变酶)催化逆转录/扩增反应的能力。一般，用各种DNA聚合酶进行偶联单酶逆转录/扩增反应。每个反应中使用相同的起始靶拷贝数，在反应中监测扩增产物的合成。确定每种DNA聚合酶产生任意但确定量的扩增产物所需的循环数，它反映了反应效率。由于在逆转录/扩增反应中，起始逆转录步骤一般是关键的限速步骤，总体反应效率的提高也表明了起始逆转录步骤反应效率的提高。
在反应中扩增核酸的增加使用文献中所述的方法(Higuchi etal.，Bio/Technology 10：413-417，1992；Higuchi et al.，1993，Bio/Technology 11：1026-1030；Higuchi和Watson《PCR应用》，上文，16章；美国专利5,994,056；和欧洲专利公开487,218和512,334，均引为参考)监测。这些方法在本文中称为动态PCR，它们取决于溴化乙锭(EtBr)和其它DNA结合染料结合于双链DNA时增加的荧光，以便测定反应中双链DNA的量的变化。由靶序列合成导致的双链DNA的增加引起结合于双链DNA的染料量的增加和相应的荧光的可见增加。
在反应中用溴化乙锭进行扩增。或者，在反应中使用SYBRGreenI(Molecular Probes，Eugene，OR)进行扩增。两种染料在插入或结合于双链DNA后荧光增加。反应在合并的热循环仪和荧光测定系统中进行，荧光测定系统可以监测扩增反应过程中反应混合物的荧光。很清楚，除了下文所述仪器外，还可以使用任何合适的仪器。
RNA靶和扩增引物
靶RNA使用编码人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因的表达质粒合成。GAPDH RNA的一个区用以下引物扩增，引物以5’到3’方向显示：
P1(SEQ ID NO：20)5’-CGAGATCCCTCCAAAATCAA
P2(SEQ ID NO：21)5’-CATGAGTCCTTCCACGATACCAA
起始靶浓度以标准方式测定。比较本文所述反应时，相对拷贝数较绝对拷贝数更重要。为了确保每一反应中的拷贝数相同，使用同一起始RNA储存液稀释物等分试样。
本领域技术人员会意识到选择靶很方便。其它RNA靶和相应扩增引物可以以基本相同的方法使用。反应条件的常规优化是可以预期的。
扩增
每一RT-PGR扩增在100μl的总反应体积中进行。最终试剂浓度如下：
10单位DNA聚合酶
106拷贝GAPDH RNA
50mM三甘氨酸，pH8.15
50mM醋酸钾
2mM醋酸镁
200μM dATP，dGTP，dCTP
400μm dUTP
200nm各种引物
8％甘油
1％DMSO
1μg/ml溴化乙锭
2单位UNG*
*由Roche Molecular Systems生产，Applied Biosystems，Foster City，CA销售。
或者，可以用SYBR Green I代替溴化乙锭用来监测扩增产物。使用SYBR Green I的扩增在DMSO稀释的0.2×SYBR Green I(商品形式为10,000×)中进行。
使用溴化乙锭的反应优选使用ABI PRISM7700序列测定系统(Applied Biosystems，Foster City，CA)进行，该系统可以选择适当的检测波长。使用SYBR Green I的反应优选使用GeneAmp5700序列测定系统(Applied Biosystems，Foster City，CA)在相同的热循环条件下进行。GeneAmp5700序列测定系统是为使用SYBRGreen I而设计，其激发和测定波长预先针对这种染料设定。
下文所述实验使用常规仪器进行，该仪器基本上由GeneAmpPCR系统9600热循环仪(PE Biosystem，Foster City，CA)组成，但增加了类似于GeneAmp5700序列测定系统中使用的、但设计使用溴化乙锭的荧光检测系统。使用该常规仪器获得的结果预期与使用优选的仪器之一获得的结果相当。
使用如下所示的具体温度循环进行扩增反应。
热循环时间和温度
反应前温育：                50℃  2分钟
逆转录：                    60℃  30分钟
                            95℃  1分钟
55个循环           变性                95℃  15秒
                   退火                55℃  30秒
                   延伸                72℃  15秒
最后延伸和保持：                       72℃
检测
反应过程中每一循环的扩增产物积累通过测定反应荧光的增加确定。在每一扩增循环中，每一反应以接近染料最大激发极限的波长的光激发，染料发射在接近其最大发射极限处测定。
荧光测定通过除以在反应中循环间荧光测定值相对恒定的循环早期获得的起始荧光测定值来标准化。选定进行起始荧光测定的循环数对比较的所有反应是相同的，所以所有测定值代表了相对相同反应循环的增加值。
进行到荧光超过任意荧光水平(AFL)的扩增循环数由观察的荧光值计算。选择接近基线荧光水平但高于测定荧光的随机波动范围的AFL，以便确定在扩增早期产物呈几何级数增加时的反应动力学。在扩增的几何增长期间，达到特定阈值所需的循环数仅取决于起始拷贝数和反应效率。如每一反应使用相同的起始靶拷贝数，达到阈值的循环数就是反应效率的度量。在较后的循环中，扩增产物的积累和试剂的消耗最终会导致反应平台。
所有反应的AFL选定为1.12。由于PCR扩增由单独的循环组成并且每一循环进行荧光测定，在每一循环中测定的荧光一般由低于AFL增加到高于AFL。为了提高测定的准确度，达到AFL阈值的“精确”循环数(本文称为CT值)通过循环间荧光测定值的内插计算。
结果
使用天然Tth DNA聚合酶(E683)和每种突变DNA聚合酶(以683位的氨基酸表示)获得的CT值示于下表。每一CT值代表两个反应中获得的平均值。为了方便比较，也提供了CT值差，即(天然CT值)-(突变CT值)。使用突变DNA聚合酶增加了效率，导致达到预期所需的循环数较少，即CT值较低。因此，CT值的正差代表效率的增加。
                    反应效率
  aa@683单字母代码   aa@683三字母代码   平均CT   (天然CT值)-(突变CT值)
  E   Glu   37.7   0.0
  A   Ala   38.7   -1.1
  C   Cys   33.2   4.5
  D   Asp   36.6   1.1
  F   Phe   28.2   9.5
  G   Gly   42.3   -4.7
  H   His   32.0   5.7
  I   Ile   33.4   4.3
  K   Lys   27.6   10.1
  L   Leu   27.8   9.9
  M   Met   30.3   7.4
  N   Asn   31.5   6.2
  P   Pro   38.8   -1.1
  Q   Gln   37.4   0.3
  R   Arg   27.2   10.5
  S   Ser   32.0   5.7
  T   Thr   31.5   6.2
  V   Val   31.4   6.3
  W   Trp   29.2   8.5
  Y   Tyr   26.1   11.6
结果表明683位氨基酸突变成除Ala，Gly或Pro以外的任何氨基酸导致DNA聚合酶的效率增加。其中，除Asp和Gln突变体外，其余突变体导致CT值改善至少4个循环。
实施例3
逆转录效率
比较实施例1所述的选定DNA聚合酶催化逆转录反应的能力。使用Mg+2或Mn+2对每一种DNA聚合酶进行逆转录反应。由每一反应得到的cDNA然后使用天然酶和Mg+2在所示条件下进行扩增。该方法可以测定酶对逆转录/扩增反应中逆转录的特异性影响。
除了天然酶外，使用683位氨基酸为F、K、L、R和Y的突变DNA聚合酶进行反应。实施例2中证实这些突变均显著增加合并逆转录/扩增反应的效率。
逆转录
在100μl的总反应体积中进行每一种逆转录反应。最终试剂浓度如下：
5单位DNA聚合酶
106拷贝GAPDH RNA
50mM三甘氨酸，pH8.15
50mM醋酸钾
2mM醋酸镁或醋酸锰
200μM dATP，dGTP，dCTP，dUTP
200nm各种引物
8％甘油
1％DMSO
0.2×SYBRGreen I
1单位UNG*
*由Roche Molecular Systems生产，Applied Biosystems，Foster City，CA销售。
使用如下所示的具体温度循环进行扩增反应。
逆转录时间和温度
反应前温育：                50℃  2分钟
逆转录：                    60℃  30分钟
保持：                      4℃
扩增
逆转录后，向10μl反应产物加入10μl 2mM EGTA螯合金属离子，从而从下列扩增反应中有效去除金属离子。将混合物加入含有天然酶和Mg+2的PCR扩增混合物。因此，残余突变DNA聚合酶被稀释，预期任何效应均可忽略不计。用以下最终试剂浓度在100μl反应中进行PCR扩增：
5单位天然DNA聚合酶
50mM三甘氨酸，pH8.15
50mM醋酸钾
2mM醋酸镁或醋酸锰
200μM dATP，dGTP，dCTP，dUTP
200nm各种引物
8％甘油
1％DMSO
0.2×SYBRGreen I
使用如下所示的具体温度循环进行扩增反应。
扩增热循环时间和温度
                                              95℃  1分钟
55个循环                  变性                95℃  15秒
                          退火                55℃  30秒
                          延伸                72℃  15秒
最终延伸和保持                                72℃
结果
使用天然Tth DNA聚合酶(E683)和每种突变DNA聚合酶(以683位的氨基酸表示)进行逆转录和天然Tth DNA聚合酶进行所有扩增获得的CT值示于下表。每一CT值代表两个反应中获得的平均值。为了方便比较，也提供了CT值差，即(天然CT值)-(突变CT值)。使用突变DNA聚合酶增加了效率，导致达到预期所需的循环数较少，即CT值较低。因此，CT值的正差代表效率的增加。
             反应效率
           Mg+2激活的RT
  aa@683   平均CT   (天然CT)-(突变CT)
  E   33.8   0.0
  F   26.9   6.9
  K   29.0   4.8
  L   26.0   7.8
  R   25.9   7.9
  Y   24.5   9.3
            反应效率
           Mn+2激活的RT
  aa@683   平均CT   (天然CT)-(突变CT)
  E   24.6   0.0
  F   21.1   3.5
  K   20.2   4.4
  L   20.6   4.0
  R   20.7   3.9
  Y   20.3   4.3
这些突变DNA聚合酶的每一种均显著增加了逆转录/扩增反应的效率。因为每一反应的DNA扩增部分均使用天然酶进行，这些结果表明这些突变DNA聚合酶的每一种增加了反应中逆转录部分的效率。使用任一种阳离子这些突变DNA聚合酶均显著提高了效率。
使用Mg+2的改善特别明显，表明使用天然DNA聚合酶使得Mg+2激活的反应成为现实。与以前报导的一致，使用天然酶的RNA扩增必需使用Mn+2获得实用的反应效率，这由使用Mg+2时CT几乎延迟10个循环(33.8-24.6)可知。相形之下，使用E683Y突变体时，Mg+2激活的反应的效率与使用天然酶和Mn+2时相同。
实施例4
保真性
选定突变DNA聚合酶和突变酶的保真性以几种方式进行了比较。在Mg+2中进行的偶联逆转录/扩增反应的保真性与在Mn+2缓冲液中进行的反应的保真性进行了比较。此外，比较了用于DNA扩增的酶的保真性。
DNA聚合酶的保真性可以通过测定使用酶产生的扩增产物的融解温度(Tm)谱来比较。DNA聚合酶的保真性反映的是链合成过程中发生错配的数量。使用低保真性酶的扩增将会导致产生的扩增序列群体的较大异质性。为了测定异质性，将扩增产物变性，退火，测定所得双链体的Tm。因为双链体中的链由异源序列群体随机联合形成，双链体一般含有一定双链的错配。扩增产物群体的异质性越大，双链体中的平均错配数越大。这些错配使双链体不稳定，因而测定的Tm值较低。
使用扩增时使用的热循环仪/荧光测定仪可以方便地获得动态PCR反应扩增产物的融解曲线。扩增后，荧光和稳定之间的关系在包含产物退火温度的温度范围内确定。双链和单链分子间的转换通过染料荧光的变化反映。因此，融解温度可以方便地确定。或者，可以使用标准方法进行测定，通常包括监测随温度变化的光密度变化，它是反应中双链DNA量的度量。
天然DNA聚合酶的保真性与含有E683K和E683N突变的两种突变DNA聚合酶的保真性分别进行比较。偶联逆转录/扩增反应基本上如实施例2所述在Mg+2和Mn+2缓冲液中按双份进行，改变如下。对Mn+2反应，在反应中使用2mM醋酸锰。使用25单位DNA聚合酶进行所有反应。
为了测定扩增双链靶序列的杂交稳定性谱(融解曲线)，扩增后反应混合物的荧光在至少60到80℃的温度范围内监测。不出所料，荧光测定产生了S形融解曲线。Tm为S形融解曲线中温度的拐点，这相当于一半靶序列成为单链形式的温度。
结果
Mg+2激活反应和Mn+2激活反应扩增产物的Tm值示于下表。给出的每一测定值均为两次反应的平均值。所有温度为摄氏度。
扩增产物TM值
 DNA聚合酶   Tm，Mg+2   Tm，Mn+2
 天然E683KE683N   808080   787676
使用Mg+2缓冲液，未观察到天然酶和突变DNA聚合酶的保真性有差别。使用所有20种DNA聚合酶进行的类似反应(数据未示出)证实，在Mg+2激活反应中所有突变DNA聚合酶的保真性与天然DNA聚合酶的保真性相同。
使用Mn+2缓冲液获得的结果与使用Mg+2缓冲液获得的结果相比，所有DNA聚合酶的保真性均下降，这可由所得的Tm值较低看出。有意思的是，使用Mn+2缓冲液时，两种突变DNA聚合酶甚至具有更低的保真性，至少在这些反应条件下。
保真性受Mn+2浓度影响。为了比较Mn+2浓度对突变和天然酶保真性的影响，使用E683K突变在Mn+2浓度为0.5到5mM的范围内进行进一步试验。这些结果(数据未示出)表明，不出所料，使用两种酶中任一种，最低的Mn+2浓度均获得最高的保真性。突变酶的保真性较天然酶的保真性受增加的Mn+2浓度影响更甚。但是，出乎意料的是，至少在这些试验中，突变酶也是在最低的Mn+2浓度下最有效。因此，使用突变酶可以在较低的Mn+2浓度下进行反应，从而使Mn+2浓度对保真性的不利影响最小。
此外，Mg+2激活反应和Mn+2激活反应均基本如上所述进行，但使用DNA模板，这使仅在反应的DNA部分观察保真性的影响更为便利。在所有情况下，DNA扩增产物的Tm值与RNA扩增产物的Tm值无法区分。
该结果和前面实施例的结果证实了本发明方法的优势。以前报导了使用Mn+2进行高温逆转录和扩增的方法，其缺点是保真性降低。本发明提供了几种选择。使用Mn+2时，使用突变酶进行RNA的高温逆转录和扩增的效率较使用天然酶时要高，可以在较低的Mn+2浓度下进行反应，从而使Mn+2浓度对保真性的不利影响最小。使用Mg+2时，使用突变酶提供了具有实用效率的RNA高温高保真逆转录和扩增。
                                 序列表
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     Grenzacherstrasse 124
     4070 Basel
     瑞士
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<170>PatentIn version 3.0
<210>1
<211>11
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>序列基序
<220>
<221>变体
<222>(2)..(2)
<223>X是S或A
<220>
<221>变体
<222>(3)..(3)
<223>X是任何氨基酸
<220>
<221>变体
<222>(4)..(4)
<223>X是任何氨基酸
<220>
<221>变体
<222>(5)..(5)
<223>X是L或I
<220>
<221>变体
<222>(6)..(6)
<223>X是任何氨基酸
<220>
<221>变体
<222>(7)..(7)
<223>X是任何氨基酸
<220>
<221>变体
<222>(8)..(8)
<223>X是任何氨基酸
<220>
<221>变体
<222>(9)..(9)
<223>X是任何氨基酸
<220>
<221>变体
<222>(10)..(10)
<223>X是任何氨基酸
<400>1
Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu
1               5                   10
<210>2
<211>11
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>序列基序
<220>
<221>变体
<222>(3)..(3)
<223>X是Q或G
<220>
<221>变体
<222>(6)..(6)
<223>X是S或A
<400>2
Leu Ser Xaa Glu Leu Xaa Ile Pro Tyr Glu Glu
1               5                   10
<210>3
<211>11
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>序列基序
<400>3
Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu
1               5                   10
<210>4
<211>11
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>序列基序
<220>
<221>变体
<222>(3)..(3)
<223>X是Q或G
<400>4
Leu Ser Xaa Glu Leu Ser Ile Pro Tyr Glu Glu
1               5                   10
<210>5
<211>11
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>序列基序
<220>
<221>变体
<222>(7)..(7)
<223>X是V或I
<400>5
Leu Ser Val Arg Leu Gly Xaa Pro Val Lys Glu
1               5                   10
<210>6
<211>11
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>序列基序
<400>6
Leu Ser Lys Arg Ile Gly Leu Ser Val Ser Glu
1               5                   10
<210>7
<211>11
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>序列基序
<220>
<221>变体
<222>(8)..(8)
<223>X是S或T
<400>7
Leu Ala Gln Asn Leu Asn Ile Xaa Arg Lys Glu
1               5                   10
<210>8
<211>11
<212>PRT
<213>水生栖热菌
<400>8
Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu
1               5                   10
<210>9
<211>11
<212>PRT
<213>黄栖热菌
<400>9
Leu Ser Gly Glu Leu Ser Ile Pro Tyr Glu Glu
1               5                   10
<210>10
<211>11
<212>PRT
<213>嗜热栖热菌
<400>10
Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu
1               5                   10
<210>11
<211>11
<212>PRT
<213>栖热菌.Z05
<400>11
Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu
1               5                   10
<210>12
<211>11
<212>PRT
<213>栖热菌.sps17
<400>12
Leu Ser Gln Glu Leu Ser Ile Pro Tyr Glu Glu
1               5                   10
<210>13
<211>11
<212>PRT
<213>Thermus caldophilus
<400>13
Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu
1               5                   10
<210>14
<211>11
<212>PRT
<213>丝状栖热菌
<400>14
Leu Ser Gln Glu Leu Ser Ile Pro Tyr Glu Glu
1               5                   10
<210>15
<211>11
<212>PRT
<213>海栖热袍菌
<400>15
Leu Ser Val Arg Leu Gly Val Pro Val Lys Glu
1               5                   10
<210>16
<211>11
<212>PRT
<213>那不勒斯栖热袍菌
<400>16
Leu Ser Val Arg Leu Gly Ile Pro Val Lys Glu
1               5                   10
<210>17
<211>11
<212>PRT
<213>非洲栖热腔菌
<400>17
Leu Ser Lys Arg Ile Gly Leu Ser Val Ser Glu
1               5                   10
<210>18
<211>11
<212>PRT
<213>热坚芽孢杆菌
<400>18
Leu Ala Gln Asn Leu Asn Ile Ser Arg Lys Glu
1               5                   10
<210>19
<211>11
<212>PRT
<213>嗜热脂肪芽孢杆菌
<400>19
Leu Ala Gln Asn Leu Asn Ile Thr Arg Lys G1u
1               5                   10
<210>20
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物
<400>20
cgagatccct ccaaaatcaa                                                 20
<210>21
<211>23
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物
<400>21
catgagtcct tccacgatac caa                                             23

Claims (8)

1.在单一酶的、单管的偶联逆转录/扩增反应中逆转录RNA的方法，包括：
(a)提供含有所述RNA、引物、Mg2+和突变热活性DNA聚合酶的逆转录反应混合物，其中所述突变DNA聚合醇的特征在于
i)该DNA聚合酶的天然形式的DNA聚合酶结构域中包含有SEQ IDN0：1的氨基酸序列；
ii)所述氨基酸序列第2位的氨基酸是S或A，所述氨基酸序列第5位的氨基酸是L或I；和
iii)与天然序列相比，所述氨基酸序列中4位氨基酸突变成除E、A、G或P之外的氨基酸；以及
(b)在足以使所述突变DNA聚合酶起始所述引物的延伸产物合成的温度下处理所述反应混合物，以提供与所述RNA互补的cDNA分子，其中使用一对引物，所述一对引物包括第一和第二引物，其中第一引物与RNA足够互补，从而与其杂交并起始与该RNA互补的cDNA分子合成，所述第二引物与所述RNA足够同源，从而与cDNA杂交并起始延伸产物的合成。
2.权利要求1的方法，其中所述DNA聚合酶的天然形式包含有选自SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的氨基酸序列。
3.权利要求1的方法，其中所述DNA聚合酶的天然形式包含有SEQID NO：2的氨基酸序列。
4.权利要求3的方法，其中所述DNA聚合酶的天然形式包含有选自SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
5.权利要求1、3和4任一项的方法，其中所述DNA聚合酶是一种栖热菌DNA聚合酶的突变形式。
6.权利要求5的方法，其中所述DNA聚合酶是嗜热栖热菌DNA聚合酶或水生栖热菌DNA聚合酶的突变形式。
7.权利要求1-4任一项的方法，其中步骤(b)所述反应混合物的温度为40℃-80℃。
8.权利要求1-4任一项的方法，其中与天然序列相比，所述氨基酸序列的4位氨基酸突变成除E、A、G、P、Q或D以外的氨基酸。
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