CN108949960A - 人cyp2c19基因多态性检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人CYP2C19基因多态性检测试剂盒，包括CYP2C19反应缓冲液，所述CYP2C19反应缓冲液中包括CYP2C19*2引物及CYP2C19*2探针，CYP2C19*3引物及CYP2C19*3探针，CYP2C19*17引物及CYP2C19*17探针，内控引物及探针，dNTPs，rTth酶及UNG酶。本发明的优点在于采用Taqman探针法，建立了在两管反应检测3个多态性位点基因型的多重荧光定量PCR方法，本发明CYP2C19基因多态性检测试剂盒采用ARMS引物特异性扩增目的片段，采用普通Taqman探针以降低成本，同时引入内标体系和UNG酶防污染系统，更加准确、稳定的对样本进行分型检测。

Description

人CYP2C19基因多态性检测试剂盒
技术领域
本发明涉及体外诊断技术领域，尤其是涉及一种人CYP2C19基因多态性检测试剂盒。
背景技术
CYP2C19是CYP450家族中重要的药物代谢酶之一，许多内源性底物以及临床上大约2%的药物都由其催化代谢。研究发现，CYP2C19可影响到氯吡格雷、奥美拉唑、地西泮、苯妥英钠等许多重要临床应用药物的代谢，而其基因多态性是引起个体间和种族间对同一药物表现出不同代谢能力的原因之一。2010年美国FDA要求氯吡格雷药物标签上注明CYP2C19与疗效的关系，并建议使用前检测CYP2C19基因型。
氯吡格雷又称波立维，是一种血小板聚集抑制剂，适用于有过近期发作的中风、心肌梗死和确诊外周动脉疾病的患者，可有效减少动脉粥样硬化性事件的发生(如心肌梗死、中风和血管性死亡)。氯吡格雷与阿司匹林的联合治疗现已成为急性冠脉综合症和经皮冠状动脉介入治疗(PCI，俗称血管支架植入)术后的标准治疗方案。
美国FDA在2010年3月要求氯吡格雷的产品说明书上加上黑格标签，警告弱代谢者服用氯吡格雷疗效不佳，建议医师可以通过检测CYP2C19的基因型来了解患者波立维的代谢能力，对于波立维弱代谢者可给患者选用其它抗凝血药物。
目前，CYP2C19基因多态性检测的分子生物学方法有多种，主要包括高分辨率溶解曲线、基因芯片技术和DNA测序技术，其中DNA一代测序技术作为该检测的金标准，程序繁杂，耗时长，严重制约了其在临床中的应用。高分辨率溶解曲线和基因芯片对仪器和操作人员要求较高，临床不易推广。因此需要一种操作简便快速，特异性好且灵敏的检测手段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简便、灵敏度高、特异性强的人CYP2C19基因多态性检测试剂盒。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
本发明所述的人CYP2C19基因多态性检测试剂盒，包括CYP2C19反应缓冲液，所述CYP2C19反应缓冲液中包括CYP2C19*2引物及CYP2C19*2探针，CYP2C19*3引物及CYP2C19*3探针，CYP2C19*17引物及CYP2C19*17探针，内控引物及探针，dNTPs，rTth酶及UNG酶。
所述CYP2C19*2（G681A）引物为：
F1：5’TTTCCAGAAACGTTTCGATTAT 3’，
F2：5’AAACTTGGCCTTACCTGGACC 3’，
R1：5’TTGGTAAACTTGGCCTTACCTGGTTT 3’，
所述CYP2C19*2探针为：
5’AGGGGGTGCTTACAATCCTGATGTTTTCA 3’。
所述CYP2C19*3（G836A）引物为：
F3：5’CCACTATCATTGATTATTTCCCA 3’，
F4：5’TATCACCACTATCATTGATTATTTACCG 3’，
R2：5’CAATAAAGTCCCGAGGGTTGTT 3’，
所述CYP2C19*3探针为：
5’CCTTGCTTTTATGGAAAGTGATATTTTGGAG 3’。
所述CYP2C19*17（C806T）引物为：
F5：5’CAAATTTGTGTCTTCTGTTCTCAAAGC3’，
F6 ：5’CAAATTTGTGTCTTCTGTTCTCAAAGT3’，
R3：5’AGACCCTGGGAGAACAGGACA3’，
所述CYP2C19*17探针为： 5’AATCCCAGTTCTGCCAGCTATGAGCTG3’。
所述内控引物为：
F7：5’gaaggctcatggcaagaaag3’，
R4：5’ctcactcagtgtggcaaagg3’，
所述内控探针为：5’cttgaggttgtccaggtgagccag3’。
其中，所述CYP2C19*2探针的荧光报告基团为FAM，所述CYP2C19*3探针的荧光报告基团为VIC，所述CYP2C19*17探针的荧光报告基团为ROX，所述内控探针的荧光报告基团为CY5。
本发明试剂盒还包括包含Mn2+的增强剂，包含全血和质粒的阳性质控品和包含质粒和EB水的引线质控品。
本发明试剂盒的检测方法为：
1、样本制备，包括分离纯化样品中的基因组DNA；
2、用人CYP2C19基因检测引物探针及PCR试剂配置的PCR反应液（W）、PCR反应液（M）和PCR反应液(E)构建PCR反应体系，分别构建PCR反应液（W）和PCR反应液（M）两种反应体系，每个反应体系均用DNA作为模板，进行荧光定量PCR，同时设置阴性质控和阳性质控；
3、检测结果分析：
阳性质控反应体系所以荧光通道均需检测到荧光信号，即FAM、HEX、ROX、CY5均有信号，且CT值小于35；阴性质控反应体系中CY5通道需检测到荧光信号，且CT值小于35，其他通道CT值均应大于35。
待测样本检测结果判读：
FAM通道结果： CtW-CtM＞2.5为CYP2C19*2 GG型，CtM-CtW＞2.5为CYP2C19*2 AA型，|CtW-CtM|≤2.5为CYP2C19*2 AA型；
HEX通道结果： CtW-CtM＞2.5为CYP2C19*3 GG型，CtM-CtW＞2.5为CYP2C19*3 AA型，|CtW-CtM|≤2.5为CYP2C19*3 AA型；
ROX通道结果：CtW-CtM＞2.5为CYP2C19*17 CC型，CtM-CtW＞2.5为CYP2C19*17 TT型，|CtW-CtM|≤2.5为CYP2C19*17 TT型。
本发明的优点在于采用Taqman探针法，建立了在两管反应检测3个多态性位点基因型的多重荧光定量PCR方法，本发明CYP2C19基因多态性检测试剂盒采用ARMS引物特异性扩增目的片段，采用普通Taqman探针以降低成本，同时引入内标体系和UNG酶防污染系统，更加准确、稳定的对样本进行分型检测。
具体来说，本发明试剂盒具有以下优点：1、一次检测可以准确检测单个样本3个位点的基因型，费用较低；2、操作简单，2管PCR即可对单个样本的3个位点进行准确分型。3、可以准确检测0.1ng/ul基因组浓度的DNA的基因型；4、针对CYP2C19的3个位点分别设计对应的ARMS引物和Taqman探针，可以特异性扩增识别对应的多态性；5、使用荧光定量PCR技术进行检测，检测过程引入UNG酶防污染体系，且全程闭管，因此可以大大降低污染风险，保证检测的准确型；6、快速检测，整个检测过程在50分钟内完成，判读方法简单可行；7、PCR试剂实现4℃保存，避免传统-20℃保存的苛刻条件。
附图说明
图1~图3是本发明实施例对CYP2C19基因CYP2C19*2位点的三种基因型的扩增检测图。
图4~图6是本发明实施例对CYP2C19基因CYP2C19*3位点的三种基因型的扩增检测图。
图7~图9是本发明实施例对CYP2C19基因CYP2C19*17位点的三种基因型的扩增检测图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能赋予实施，但所举实施例并不能作为对本发明的限定。
实施例1：试剂盒的组成
本发明试剂盒的组成如下表1：
PCR反应液(W)中的特异性引物和探针为：F1/R1，F3/R2，F5/R3，F7/R4。
PCR反应液(M) 中的特异性引物和探针为：F2/R1，F4/R2，F6/R3，F7/R4。
实施例2 样本基因组DNA的提取
本实施例中收集人全血/外周血样本，从中提取基因组DNA。
从EDTA抗凝血浆中提取基因组DNA，用其作为PCR检测的模板。采用郑州安图生物工程股份有限公司的前处理试剂和核酸提取纯化试剂（磁珠法），按照说明进行操作，具体详述如下：
1. 样本前处理：
冻融全血用红细胞裂解液进行前处理：
① 取200ul临床冻融或发生溶血全血样本，加入600ul红细胞裂解液，轻轻颠倒混匀10次，红细胞裂解后，溶液应该是清亮透明的；12000rpm/min离心3min，弃上清；
② 加入600ul 0.2mg/ml 蛋白酶K，常温20-25℃孵育5min后，12000rpm/min离心3min，弃上清，取沉淀；
③ 加入600ul 裂解液涡旋充分重悬沉淀，备用。
非冻融全血用淋巴细胞分离液处理：
① 取200ulEDTA抗凝血缓慢加入含有600ul淋巴细胞分离液EP管中（不可晃动，直接离心）3000rpm/min，离心5min，此时离心管中由上至下细胞分四层（第一层：为血浆层；第二层：为环状乳白色淋巴细胞层；第三层：为透明分离
液层；第四层：为红细胞层）；
② 取前三层上清液备用。
2、样本提取：
①将10μL蛋白酶K、20μL磁珠混悬液（吸前振荡混匀磁珠）、1.3mL裂解液、600μL血清/血浆样本或处理后其他样本类型样本液依次加入5mL离心管，混匀，于37℃培养箱中孵育2min；
②将孵育后的上述混合液转移至2mL离心管中，放置在磁力架上，磁吸2min，弃上清；
③去除磁力架，添加2mL洗液A，混匀，放置在磁力架上，磁吸2min，弃上清；
④去除磁力架，添加2mL洗液B，混匀，放置在磁力架上，磁吸2min，弃上清（尽量减少残留）；
⑤ 加100-300μL （按照后续实验要求添加）洗脱液，振荡混匀，于80℃干式恒温器中解离5min；
⑥ 放置在磁力架上，磁吸2min后，取上清液用于后续实验。
实施例3 样本基因组DNA的检测
采用实施例1所列举的引物、探针组合来扩增实施例2提取的基因组DNA样品。具体检测步骤如下：
1、构建反应体系
计算所需要的样本数，按照下表中的量等比例增加试剂量，阴、阳质控只做一份。
2、上机检测
直接上荧光定量PCR仪进行检测，扩增程序设置为50℃ 2min，95℃ 2min，
（95℃ 10s，60℃ 22s，45 Cycle）；每个循环后收集FAM、HEX、ROX、CY5荧光。
3、检测结果分析
依照检测结果绘制出的CYP2C19基因CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17三个位点三种基因型的扩增检测图如图1~9所示，其中图1~图3是本发明实施例对CYP2C19基因CYP2C19*2位点的三种基因型的扩增检测图（其中：图1为野生型，图2为突变型，图3为杂合型）。图4~图6是本发明实施例对CYP2C19基因CYP2C19*3位点的三种基因型的扩增检测图（其中图4为野生型，图5为突变型，图6为杂合型）。图7~图9是本发明实施例对CYP2C19基因CYP2C19*17位点的三种基因型的扩增检测图（其中图7为野生型，图8为突变型，图9为杂合型）。
从以上图中可以看出：野生型样本，野生型引物扩增效果较好，突变型引物扩增效果较差，突变型样本，突变型引物扩增效果较好，野生型引物扩增效果差，杂合型样本，野生型引物及突变型引物扩增效果相当。
序列表
<110> 郑州安图生物工程股份有限公司
<120> 人CYP2C19基因多态性检测试剂盒
<141> 2018-08-13
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
tttccagaaa cgtttcgatt at 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
aaacttggcc ttacctggac c 21
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
ttggtaaact tggccttacc tggttt 26
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
ccactatcat tgattatttc cca 23
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
tatcaccact atcattgatt atttaccg 28
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
caataaagtc ccgagggttg tt 22
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
caaatttgtg tcttctgttc tcaaagc 27
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
caaatttgtg tcttctgttc tcaaagt 27
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
agaccctggg agaacaggac a 21
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
agggggtgct tacaatcctg atgttttca 29
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
ccttgctttt atggaaagtg atattttgga g 31
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
aatcccagtt ctgccagcta tgagctg 27
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 13
gaaggctcat ggcaagaaag 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 14
ctcactcagt gtggcaaagg 20
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 15
cttgaggttg tccaggtgag ccag 24

Claims (7)

1.一种人CYP2C19基因多态性检测试剂盒，其特征在于：包括CYP2C19反应缓冲液，所述CYP2C19反应缓冲液中包括CYP2C19*2引物及CYP2C19*2探针，CYP2C19*3引物及CYP2C19*3探针，CYP2C19*17引物及CYP2C19*17探针，内控引物及探针，dNTPs，rTth酶及UNG酶。
2.根据权利要求1所述的人CYP2C19基因多态性检测试剂盒，其特征在于：所述CYP2C19*2引物为：
F1：5’TTTCCAGAAACGTTTCGATTAT 3’，
F2：5’AAACTTGGCCTTACCTGGACC 3’，
R1：5’TTGGTAAACTTGGCCTTACCTGGTTT 3’，
所述CYP2C19*2探针为：
5’AGGGGGTGCTTACAATCCTGATGTTTTCA 3’。
3.根据权利要求1所述的人CYP2C19基因多态性检测试剂盒，其特征在于：所述CYP2C19*3引物为：
F3：5’CCACTATCATTGATTATTTCCCA 3’，
F4：5’TATCACCACTATCATTGATTATTTACCG 3’，
R2：5’CAATAAAGTCCCGAGGGTTGTT 3’，
所述CYP2C19*3探针为：
5’CCTTGCTTTTATGGAAAGTGATATTTTGGAG 3’。
4.根据权利要求1所述的人CYP2C19基因多态性检测试剂盒，其特征在于：所述CYP2C19*17引物为：
F5：5’CAAATTTGTGTCTTCTGTTCTCAAAGC3’，
F6 ：5’CAAATTTGTGTCTTCTGTTCTCAAAGT3’，
R3：5’AGACCCTGGGAGAACAGGACA3’，
所述CYP2C19*17探针为： 5’AATCCCAGTTCTGCCAGCTATGAGCTG3’。
5.根据权利要求1所述的人CYP2C19基因多态性检测试剂盒，其特征在于：所述内控引物为：
F7：5’gaaggctcatggcaagaaag3’，
R4：5’ctcactcagtgtggcaaagg3’，
所述内控探针为：5’cttgaggttgtccaggtgagccag3’。
6.根据权利要求1所述的人CYP2C19基因多态性检测试剂盒，其特征在于：所述CYP2C19*2探针的荧光报告基团为FAM，所述CYP2C19*3探针的荧光报告基团为VIC，所述CYP2C19*17探针的荧光报告基团为ROX，所述内控探针的荧光报告基团为CY5。
7.根据权利要求1所述的人CYP2C19基因多态性检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括包含Mn2+的增强剂，包含全血和质粒的阳性质控品和包含质粒和EB水的阴性质控品。
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