CN105936940A - 检测耳聋基因的核酸序列及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了检测耳聋基因的核酸序列及其应用，属于基因测序和生物检验领域。一组检测耳聋基因的特异性引物，具有序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.170所示的核苷酸序列。本发明的优点是：本发明设计了一套全新的同时检测4个耳聋基因的全外显子共计9497bp的特异性多重PCR引物及使用该引物进行检测的方法。与现有技术相比，上述技术方案应用高通量测序技术进行耳聋基因检测，可以快速准确的检测所有位于4个耳聋基因上的突变位点，包括一直热点突变和新发突变。具有高通量、低成本、检出率高等特点。

Description

检测耳聋基因的核酸序列及其应用
技术领域
本发明涉及检测耳聋基因的核酸序列及其应用，属于基因测序和生物检验领域。具体为检测4个耳聋基因的全外显子的检测方法，以及所述方法中使用的特异性引物，特别是涉及以多重PCR技术结合高通量测序技术进行检测的方法。
背景技术
耳聋是一种最常见的感觉系统疾病，在新生儿中的发病率约为1/1000，其中约60％的耳聋患者是由于遗传因素造成的。按表型特点不同分为综合征性耳聋(SHI)和非综合征性耳聋(NSHI)。根据遗传方式不同将遗传性耳聋分为常染色体显性遗传(AD)、常染色体隐性遗传(AR)、X连锁遗传、Y连锁遗传及线粒体遗传五类，其中以常染色体隐性遗传性耳聋最多见，约占75％-80％。大规模耳聋分子流行病学研究表明，我国人群中最常见的致病基因包括GJB2、GJB3、SLC26A4(PDS)、线粒体DNA(12S rRNA)。
GJB2基因定位在13q12区域，与DFNB1的表型相关，以轻度至极重度的语前感音神经性听力损失为多见，亦可表现进行性听力损害。GJB2基因全长4804bp，编码区678bp，含2个外显子，编码缝隙连接蛋白connexin26(Cx26)。如果缝隙连接复合物中的Cx26蛋白缺乏，就会妨碍去极化相进入细胞的钾离子在复极相回流，使Corti器局部钾离子中毒并造成耳聋。对GJB2基因型与表型的相关性研究，比较一致的认识是GJB2基因的缺乏造成先天性听力损失，而缺失、框移、剪接和不稳定转录等涉及功能缺失的突变可能与综合征或成年后耳聋有关，并且决定于突变位点的重要性及替换氨基酸的性质。GJB2基因突变范围几乎涉及该基因所有编码区域，突变形式包括剪切、无义突变、错义突变、插入及缺失导致移码突变等。
GJB3定位于人类染色体1p33-35，编码有270个氨基酸的连接蛋白31，全长3617bP。GJB3基因编码的蛋白Cx31是间隙连接蛋白家族中的重要成员，分布在身体多个组织器官上，但以皮肤和内耳最多，其突变可导致可变性红斑皮肤角化病(EKV)、听力损伤和周围神经病变，是后天高频感音神经性耳聲患者的常见突变基因。
SLC26A4基因又称PDS基因，位于人类染色体7q31，含有21个外显子，编码含有780个氨基酸的蛋白质Pendrin。SLC26A4基因与DFNB4表型相关，呈进行性或波动性症状，一般可以发展至极重度听力损失，累及所有频率。
线粒体DNA突变易导致药物性耳聋，药物中毒性耳聋指的是使用某些药物治病或人体接触某些化学制剂所引起的耳聋。对耳功能有毒性作用，引起耳聋的药物，统称为耳毒性药物。多年来，由于大量化学药物和抗生素的广泛应用，己发现近百种耳毒性药物。mtDNA突变A1555G和C1494T，使得人体线粒体中的12S rRNA的结构与细菌的16S rRNA的结构更为相似，使得氨基糖苷类抗生素在与细菌结合的同时，与人体12S rRNA也形成了较为紧密的结合。已知AmAn发挥抗菌作用是靠其特异地与细菌核糖体结合，抑制蛋白合成或导致mRNA错译。A1555G突变产生的G-C碱基对有利于与AmAn结合。其结果破坏了线粒体蛋白的合成及减少了ATP的产量，使细胞内外离子浓度失衡，导致了耳蜗毛细胞的死亡。
目前临床上对遗传性耳聋致病基因诊断的主要方法包括限制性长度多态性分析(RFLP)、斑点杂交(ASO)、基因扫描、变性高效液相色谱分析(DHPLC)、直接测序、基因芯片方法等。但这些技术或耗时费力，或成本较高，或难以同时检测多个基因的不同突变位点，或只能用于检测已知突变对于新发突变或者低频突变无法覆盖。使用上述方法进行检测的主要用于检测GJB2基因位点：35delG、235del C、299del AT、176del16；GJB3基因位点：538C＞T；SLC26A4基因位点：2168A＞G、IVS7-2A＞G；以及12S rRNA位点：1494C＞T、1555A＞G。以上位点检测面窄，如GJB2基因的突变涉及所有外显子区域，因此需要一种覆盖度全的检测方法，涉及4个基因的全外显子区域。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一组同时检测GJB2基因、GJB3基因、12SrRNA基因和SLC26A4基因的全外显子的耳聋基因检测引物。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种同时检测GJB2基因、GJB3基因、12SrRNA基因和SLC26A4基因的全外显子的耳聋检测试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一组检测耳聋基因的特异性引物，具有序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.170所示的核苷酸序列。参见表1所示。
本发明根据选择目的基因GJB2/GJB3/SLC26A4/12S rRNA的外显子的DNA序列设计特异性引物。引物与引物之间不形成二聚体，引物自身不形成发夹结构，引物与模板之间不发生错配，且引物设计区域不存在突变位点。同时，在引物设计时，每对引物之间的退火温度差异小于2摄氏度，扩增产物长度在100-250bp之间。
所述耳聋基因检测引物，能够同时检测GJB2基因、GJB3基因、12S rRNA基因和SLC26A4基因的全外显子。
表1耳聋基因扩增引物
本发明采用多重PCR反应。根据引物设计方案，将表1中引物序列分组为8个引物池(引物pool)，参见表2所示，每个引物池中的引物为10-16对。
表2耳聋基因扩增引物池(引物pool)
其中引物池ID NO：1至引物池ID NO：4使用rTaq酶进行扩增；引物池ID NO：5至引物池ID NO：8使用LA Taq酶进行扩增。
为了区别不同样本，所有引物均在5’端带有样本标签序列，不同样本使用不同的标签序列。样本标签序列为6～12个碱基的核苷酸序列，优选8个碱基，如表3中的16个标签序列。
所述标签只是为了区别每个样品，以便用于同时检测多个样品，本领域技术人员可以根据需要以及通常的引物设计原则选择使用不同的标签，而实现本发明的目的。因此，在一些实施方案中可以使用任何可以达到上述目的，且不会与检测目的物相互作用的标签序列。
表3样本标签序列表
序号 标签序列名称 标签序列
1 PI-1 CTGCGACT
2 PI-2 TGTAGATA
3 PI-3 TGATATCT
4 PI-4 CGATGCTA
5 PI-5 AGACTAGA
6 PI-6 TGTCTGTG
7 PI-7 CATACTGA
8 PI-8 TGCTCGCA
9 PI-9 ATGAGTAG
10 PI-10 CTCACTAT
11 PI-11 GTACTACT
12 PI-12 TAGACTAG
13 PI-13 TATGCTAC
14 PI-14 ACTCGCTG
15 PI-15 ATCACGCA
16 PI-16 GCATGTGA
一种检测耳聋基因的试剂盒，包含序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.170所示的引物序列。
所述引物序列的5’端带有一个样本标签序列
所述样本标签序列为6～12个碱基的核苷酸序列，优选表3中的一个或多个核苷酸序列。
所述检测耳聋基因的试剂盒，还包括rTaq酶(5U/ul)、10×PCR反应缓冲液、d NTP混合液(2.5mM)、LA Taq酶、2×GC反应缓冲液和灭菌蒸馏水。
本发明还提供了一种检测耳聋基因的方法，使用序列表SEQ ID No.1至SEQ IDNo.170所示的核苷酸序列同时检测样本的GJB2基因、GJB3基因、12S rRNA基因和SLC26A4基因的全外显子序列并对测序结果进行信息分析。
所述方法包括以下步骤：
步骤1，用标签引物对目的样品进行多重PCR扩增，标签引物是序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.170所示的引物序列，在5’端连接表3所示的标签序列组成，得到多重PCR扩增产物；
步骤2，混合步骤1得到的多重PCR扩增产物，得到混合产物；
步骤3，对混合产物依次进行末端修复和接头连接，得到带接头的产物；
步骤4，采用通用引物对接头连接的产物进行扩增，得到扩增子文库；
步骤5，对得到的扩增子文库进行高通量测序，得到样品测序结果；
步骤6，对样品的测序结果进行信息分析，得到样品的检测结果。
进一步地，在步骤1后，以及步骤2之前，还包括对多个扩增产物进行电泳检测的步骤；
进一步地，步骤3在末端修复之后还包括对多个扩增产物进行纯化的步骤，优选采用磁珠对末端修复产物进行纯化；
进一步地，步骤3接头连接后还包括对多个扩增产物进行纯化的步骤，优选采用磁珠对接头连接产物进行纯化；
进一步地，步骤4所述通用引物由LIFE technology公司提供；
进一步地，在步骤4之后，以及步骤5之前，还包括对扩增子文库的纯化，优选采用磁珠对接头连接产物进行纯化；
进一步地，纯化反应后，还包括对扩增子文库进行定量的步骤，优选采用QUBIT2.0荧光计对扩增产物进行定量；
进一步地，定量之后，需要对样本进行油包水的PCR反应；
进一步地，在步骤5之后，以及步骤6之前，还包括对测序结果的转化。
本方法所提到的多重PCR是指：一个混合多种成分在单个孔内的扩增反应体系；来源于对样本提取的基因组DNA作为模板。
得特别说明的是，本方法可以同时检测GJB2基因、GJB3基因、12S rRNA基因和SLC26A4基因的全外显子。通过使用本方法进行检测，可以检测已知突变位点和新发突变位点。
本发明的优点是：本发明设计了一套全新的同时检测4个耳聋基因的全外显子共计9497bp的特异性多重PCR引物及使用该引物进行检测的方法。与现有技术相比，上述技术方案应用高通量测序技术进行耳聋基因检测，可以快速准确的检测所有位于4个耳聋基因上的突变位点，包括一直热点突变和新发突变。具有高通量、低成本、检出率高等特点。
下面结合具体实施方式对本发明做进一步说明，并非对本发明的限制。凡依照本发明公开内容所进行的本领域等同替换，均属于本发明保护范围。
具体实施方式
在本发明的实施例中，采用本发明的特异性引物及高通量测序方法，对从血液从提取的DNA样本进行检测，获得样本的耳聋基因检测结果。
以下实施例的试剂及来源如下：
DNA提取试剂：购自天根生化科技(北京)有限公司。
PCR反应试剂：合成16组样品标签序列不同的扩增引物；每一组扩增引物包括序列表SEQ ID No.1-SEQ ID No.170的核苷酸序列，每条引物的5’端连接表3中的一个样品标签序列，同组扩增引物的标签序列相同；每一组扩增引物均按表2分成8个引物池，引物池IDNo.1-引物池ID No.8；由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成；
PCR反应试剂：购自宝生物工程(大连)有限公司。
纯化试剂：无水乙醇购自上海西巴斯生物技术开发有限公司；
Nuclease-Free Water购自英潍捷基(上海)贸易有限公司；
Agencourt AMPure XP-核酸纯化试剂盒购自贝克曼库尔特公司；
文库制备试剂：购自英潍捷基(上海)贸易有限公司；
测序试剂：One Touch试剂购自英潍捷基(上海)贸易有限公司；
测序试剂购自英潍捷基(上海)贸易有限公司。
临床标本：遵循知情同意的原则，由连云港市妇幼保健院收集13个家系，43例耳聋患者的临床资料及血液样本，对所有患者进行详细的病史调查、全身检查及听力学检查，并抽取5mml静脉血用于基因组DNA的提取。
实施例1：提取全血标本中的DNA
1)从-20℃冰箱中取出样品，置于室温下溶解，同时打开水浴锅设为56℃。
2)在1.5ml离心管中加入20ul蛋白酶K，加入200ul充分溶解的全血(使用前颠倒混匀)，振荡混匀，短时离心以去除管内壁的液滴。
3)加入200ul缓冲液GB，振荡混匀，短时离心以去除管内壁的液滴将离心管放入56℃中水浴10min，并不时轻摇样品。
4)将离心管从水浴锅中取出，稍冷，加入200ul无水乙醇，振荡混匀，短时离心后于室温静置3分钟。
5)将上述混合液转入吸附柱CR2中，应谨慎操作以避免污染提取柱管口，12000rpm离心30sec，弃废液液，将吸附柱CR2放回收集管中。
6)向吸附柱中加入500ul缓冲液GD(使用前先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中。
7)向洗脱柱中加入600ul漂洗液PW(使用前先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中。
8)向洗脱柱中加入600ul漂洗液PW，12000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中。
9)12000rpm离心2min，将吸附柱放在新的1.5ml离心管上晾干3min至乙醇充分挥发。
10)加入50ul洗脱缓冲液TB，室温溶解5min，12000rpm离心2min。
11)在离心管上贴好相应的条形码，取lμl样品，用于DNA定量分析。
12)保存核酸标本至-20摄氏度冰箱。
实施例2：多重PCR扩增
使用实施例1得到的DNA为模板，进行多重PCR扩增。
其中所述的多重PCR反应体系为25ul体系，具体反应体系及反应程序如表4和表5所示。其中“多重PCR引物”为引物池，见表1和表2。
表4：引物池ID No：1-引物池ID No：4的反应体系
序号 试剂 体积(ul)
1 模板DNA 2
2 rTaq聚合酶 0.2
3 10X PCR缓冲液 2.5
4 dNTP混合液(2.5mM) 2
5 多重PCR引物(100uM) 4
6 灭菌蒸馏水 14.3
Total 25
表5：引物池ID No：5-引物池ID No：8的反应体系
序号 试剂 体积(ul)
1 模板DNA 2
2 LA Taq聚合酶 0.2
3 2X GC缓冲液 12.5
4 dNTP混合液(2.5mM) 4
5 多重PCR引物(100uM) 4
6 灭菌蒸馏水 2.3
Total 25
表6：PCR反应程序
结果：每个样本得到8个多重PCR产物。
实施例3：文库制备
将实施例2得到的PCR产物进行混合后使用Agencourt AMPure XP-核酸纯化试剂盒进行纯化。纯化后的产物进行文库制备，文库制备步骤如下：
1、末端修复
表7：末端修复反应体系
将反应体系震荡混匀并离心后，室温孵育20min。孵育结束后使用AgencourtAMPure XP-核酸纯化试剂盒进行纯化，最后溶解在27ul无核酶水中。
2、接头连接
表8：接头连接反应体系
将接头连接反应混合震荡混匀并离心后，置于PCR仪上，25摄氏度孵育15min，72摄氏度孵育5min。孵育结束后，使用Agencourt AMPure XP-核酸纯化试剂盒进行纯化，最后溶解在30ul无核酶水中。
3、PCR反应
表9：PCR反应体系：
将接头连接反应MIX震荡混匀并离心后，置于PCR仪上，进行PCR扩增，具体反应程序如下：
表10：PCR反应程序
PCR反应在ABI公司的VERITI PCR仪上进行。PCR反应结束后，使用AgencourtAMPure XP-核酸纯化试剂盒进行纯化，最后溶解在25ul无核酶水中，使用QUBIT荧光计对纯化后的产物进行定量，得到扩增文库。
实施例4：高通量测序反应
将实施例3得到的制备好的扩增文库，经过one Touch试剂(英潍捷基(上海)贸易有限公司)进行油包水反应，而后将油包水反应产物上样至测序反应芯片上，最后使用LIFETECHNOLOGY公司测序仪PGM进行测序。具体操作步骤如下：
1、将实施例3制备好的文库稀释成100pM；
2、按照LIFE TECHNOLOGY公司One Touch 2仪器操作说明，安装好OT2仪器相关耗材；
3、按照表11配制OT2扩增反应液
表11
4、将制备好的OT2扩增反应液及油相反应液按照操作说明加入至适配器中，启动OT2仪器开始进行油包水反应；
5、油包水反应完成后，使用OT2ES系统对油包水扩增反应完成的产物进行回收富集；
6、将回收富集好的油包水PCR反应产物中加5ul Control Ion Sphere Particles(质控离子球颗粒，ISP)，然后再加100ul Annealing Buffer(退火缓冲液)，用吸头吹打混匀，15500g离心2min(注意离心管方向)。小心去除上清至剩余3ul，往管里面加3ulSequencing Primer(测序引物)，用移液器吹打混匀，使ISPs悬浮。将离心管放在PCR仪上运行以下程序：95℃，2min；37℃，2min；15℃，∞。从PCR仪上取出样品，往里面加入1ul PGM200Sequencing Polymerase(测序反应聚合酶)，使总体积为7ul，吹打混匀后室温孵育5min。
7、准备好PGM测序仪初始化试剂，将PGM测序仪进行初始化，初始化试剂如表12：
表12
8、孵育好的油包水反应产物上样至PGM测序仪配套314芯片上，上样完成后直接置于初始化完成的测序仪上开始测序反应。
实施例5：信息分析检测耳聋基因突变
将本发明检测方法用于43例临床标本检测，得到4个基因所有SNP结果，经过过滤得到每个样本的基因突变结果，检测结果与sanger测序结果进行比对，比对结果如下：
表13
综上所述，使用本发明所述引物及检测方法，可以准确快速的检测非综合征型耳聋基因多态性，且准确性与sanger测序法进行比较，一致性达到100％。因此，本发明可用于耳聋基因检测，在临床上具有较大的应用及推广价值。
实施例6：检测耳聋基因的试剂盒
一、试剂组成
1、rTaq酶，5U/ul
2、10X PCR反应缓冲液，市售
3、dNTP混合液，2.5mM
4、LA Taq酶，5U/ul
5、2×GC反应缓冲液，市售
6、灭菌蒸馏水
7、引物混合液(100uM)：引物混合液分为引物池1，引物池2，引物池3，引物池4，引物池5，引物池6，引物池7，引物池8。引物的序列和引物池分组情况见表1和表2。
二、耳聋基因检测试剂盒的使用方法：
1、使用市场通用DNA提取试剂盒提取出待测样本DNA，方法同实施例1；
2、使用本试剂盒对提取好的DNA进行PCR扩增，方法同实施例2；
3、而后使用LIFE TECHNOLOGY公司通用建库及测序试剂进行二代测序，方法同实施例3和4；
4、测序结果使用计算机进行自动分析，根据分析结果判定是否存在突变，方法同实施例5。
实施例7：检测耳聋基因的试剂盒
一、试剂组成
1、rTaq酶，5U/ul
2、10X PCR反应缓冲液，市售
3、dNTP混合液，2.5mM
4、LA Taq酶，5U/ul
5、2×GC反应缓冲液，市售
6、灭菌蒸馏水
7、引物混合液(100uM)：16组引物混合液，每组引物混合液分为引物池1，引物池2，引物池3，引物池4，引物池5，引物池6，引物池7，引物池8。引物的序列和引物池分组情况见表1和表2。每条引物的5’端连接表3中的一个样品标签序列，同组扩增引物的样品标签序列相同。
二、耳聋基因检测试剂盒的使用方法：
1、使用市场通用DNA提取试剂盒提取出待测样本DNA，方法同实施例1；
2、使用本试剂盒对提取好的DNA进行PCR扩增，方法同实施例2；
3、而后使用LIFE TECHNOLOGY公司通用建库及测序试剂进行二代测序，方法同实施例3和4；
4、测序结果使用计算机进行自动分析，根据分析结果判定是否存在突变，方法同实施例5。

Claims (10)

1.一组检测耳聋基因的特异性引物，其特征在于：具有序列表SEQ ID No.1至SEQ IDNo.170所示的核苷酸序列。
2.一种检测耳聋基因的试剂盒，其特征在于：包含序列表SEQ ID No.1至SEQ IDNo.170所示的引物序列。
3.根据权利要求2所述的一种检测耳聋基因的试剂盒，其特征在于：所述引物序列的5’端带有一个样本标签序列。
4.根据权利要求3所述的一种检测耳聋基因的试剂盒，其特征在于：所述样本标签序列为6～12个碱基的核苷酸序列。
5.根据权利要求3或4所述的一种检测耳聋基因的试剂盒，其特征在于所述样本标签序列选自下述核苷酸序列中的一个或多个：
(1)CTGCGACT；
(2)TGTAGATA；
(3)TGATATCT；
(4)CGATGCTA；
(5)AGACTAGA；
(6)TGTCTGTG；
(7)CATACTGA；
(8)TGCTCGCA；
(9)ATGAGTAG；
(10)CTCACTAT；
(11)GTACTACT；
(12)TAGACTAG；
(13)TATGCTAC；
(14)ACTCGCTG；
(15)ATCACGCA；
(16)GCATGTGA。
6.根据权利要求5至7中任一项所述的一种检测耳聋基因的试剂盒，其特征在于：所述检测耳聋基因的试剂盒，还包括rTaq酶(5U/ul)、10×PCR反应缓冲液、d NTP混合液(2.5mM)、LA Taq酶、2×GC反应缓冲液和灭菌蒸馏水。
7.一种检测耳聋基因的方法，其特征在于：使用序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.170所示的核苷酸序列同时检测样本的GJB2基因、GJB3基因、12S rRNA基因和SLC26A4基因的全外显子序列并对测序结果进行信息分析。
8.根据权利要求7所述的一种检测耳聋基因的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤1，用标签引物对目的样品进行多重PCR扩增，标签引物是序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.170所示的引物序列，在5’端连接权利要求5的标签序列组成，得到多重PCR扩增产物；
步骤2，混合步骤1得到的多重PCR扩增产物，得到混合产物；
步骤3，对混合产物依次进行末端修复和接头连接，得到带接头的产物；
步骤4，采用通用引物对接头连接的产物进行扩增，得到扩增子文库；
步骤5，对得到的扩增子文库进行高通量测序，得到样品测序结果；
步骤6，对样品的测序结果进行信息分析，得到样品的检测结果。
9.根据权利要求8所述的一种用于检测耳聋基因检测的方法，其特征在于：所述步骤1后、步骤2之前，还包括对多重PCR扩增产物进行电泳检测的步骤；
步骤3在末端修复之后还包括对多个扩增产物进行纯化的步骤，优选采用磁珠对末端修复产物进行纯化；
步骤4所述通用引物由LIFE technology公司提供；
步骤4之后，以及步骤5之前，还包括对扩增子文库的纯化，优选采用磁珠对接头连接产物进行纯化；
所述纯化反应后，还包括对扩增子文库进行定量的步骤，优选采用QUBIT2.0荧光计对扩增产物进行定量；
定量之后，需要对样本进行油包水的PCR反应；
步骤5之后，以及步骤6之前，还包括对测序结果的转化。
10.权利要求1所述的特异性引物用于制备检测耳聋的诊断试剂的用途。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106399504A (zh) * 2016-09-20 2017-02-15 苏州贝康医疗器械有限公司 基于靶向新一代测序的耳聋基因检测集合、试剂盒及检测方法
CN106755496A (zh) * 2017-01-23 2017-05-31 广州奇辉生物科技有限公司 基于高通量测序技术检测遗传性耳聋基因的多重pcr特异性引物、试剂盒及方法
CN108949951A (zh) * 2018-05-18 2018-12-07 中国人民解放军陆军军医大学第附属医院 一种同时无创检测gjb2和slc26a4基因突变的方法和试剂盒
CN111378736A (zh) * 2018-12-28 2020-07-07 迈基诺（重庆）基因科技有限责任公司 耳聋相关基因捕获试剂盒及其应用
CN114790455A (zh) * 2021-01-25 2022-07-26 深圳华大基因股份有限公司 用于扩增gjb2基因和slc26a4基因的引物组、试剂盒和方法
CN116445608A (zh) * 2023-04-24 2023-07-18 上海浦东解码生命科学研究院 检测耳聋相关基因突变的组合物、试剂盒、及用途
CN114790455B (zh) * 2021-01-25 2024-05-31 深圳华大基因股份有限公司 用于扩增gjb2基因和slc26a4基因的引物组、试剂盒和方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104131008A (zh) * 2014-07-24 2014-11-05 深圳华大基因医学有限公司 Dna标签、pcr引物及其应用
CN104232760A (zh) * 2014-08-26 2014-12-24 深圳华大基因医学有限公司 确定混合测序数据中读段的样本源的方法及装置
CN104531862A (zh) * 2014-12-19 2015-04-22 钱学庆 检测人类brca1和brca2基因全外显子序列突变位点的方法和引物
CN104561272A (zh) * 2014-12-11 2015-04-29 南京普东兴生物科技有限公司 一种人类耳聋基因突变筛查的组合引物及其应用
CN105441540A (zh) * 2015-12-04 2016-03-30 长沙迪安医学检验所有限公司 检测非综合症型耳聋基因多态性的试剂盒及其应用
CN205974520U (zh) * 2016-06-30 2017-02-22 上海凡迪生物科技有限公司 一种检测耳聋基因的试剂盒

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104131008A (zh) * 2014-07-24 2014-11-05 深圳华大基因医学有限公司 Dna标签、pcr引物及其应用
CN104232760A (zh) * 2014-08-26 2014-12-24 深圳华大基因医学有限公司 确定混合测序数据中读段的样本源的方法及装置
CN104561272A (zh) * 2014-12-11 2015-04-29 南京普东兴生物科技有限公司 一种人类耳聋基因突变筛查的组合引物及其应用
CN104531862A (zh) * 2014-12-19 2015-04-22 钱学庆 检测人类brca1和brca2基因全外显子序列突变位点的方法和引物
CN105441540A (zh) * 2015-12-04 2016-03-30 长沙迪安医学检验所有限公司 检测非综合症型耳聋基因多态性的试剂盒及其应用
CN205974520U (zh) * 2016-06-30 2017-02-22 上海凡迪生物科技有限公司 一种检测耳聋基因的试剂盒

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106399504A (zh) * 2016-09-20 2017-02-15 苏州贝康医疗器械有限公司 基于靶向新一代测序的耳聋基因检测集合、试剂盒及检测方法
CN106755496A (zh) * 2017-01-23 2017-05-31 广州奇辉生物科技有限公司 基于高通量测序技术检测遗传性耳聋基因的多重pcr特异性引物、试剂盒及方法
CN108949951A (zh) * 2018-05-18 2018-12-07 中国人民解放军陆军军医大学第附属医院 一种同时无创检测gjb2和slc26a4基因突变的方法和试剂盒
CN108949951B (zh) * 2018-05-18 2022-01-28 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院 一种同时无创检测gjb2和slc26a4基因突变的方法和试剂盒
CN111378736A (zh) * 2018-12-28 2020-07-07 迈基诺（重庆）基因科技有限责任公司 耳聋相关基因捕获试剂盒及其应用
CN111378736B (zh) * 2018-12-28 2023-04-25 迈基诺（重庆）基因科技有限责任公司 耳聋相关基因捕获试剂盒及其应用
CN114790455A (zh) * 2021-01-25 2022-07-26 深圳华大基因股份有限公司 用于扩增gjb2基因和slc26a4基因的引物组、试剂盒和方法
CN114790455B (zh) * 2021-01-25 2024-05-31 深圳华大基因股份有限公司 用于扩增gjb2基因和slc26a4基因的引物组、试剂盒和方法
CN116445608A (zh) * 2023-04-24 2023-07-18 上海浦东解码生命科学研究院 检测耳聋相关基因突变的组合物、试剂盒、及用途
CN116445608B (zh) * 2023-04-24 2024-02-02 上海浦东解码生命科学研究院 检测耳聋相关基因突变的组合物、试剂盒、及用途

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