KR20220025985A

KR20220025985A - 만성 감각신경성 이명 진단용 snp 마커 및 이를 이용한 진단 방법

Info

Publication number: KR20220025985A
Application number: KR1020200106269A
Authority: KR
Inventors: 박시내; 이민호; 이건희
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단; 동국대학교 산학협력단
Priority date: 2020-08-24
Filing date: 2020-08-24
Publication date: 2022-03-04
Also published as: KR102481211B1

Abstract

본 발명은 이명 진단용 SNP 마커 및 이를 이용한 진단 방법에 관한 것으로서, 본 발명자들은 전장 유전체 연관 분석(Genome-wide association study; GWAS)을 이용하여 이명 환자들의 유전체 DNA의 단백질 코딩 부위를 분석한 결과, 단일염기다형성(SNP) 부위인 chr22:38485200 위치의 SNP 및 dbSNP 데이터베이스 rs1924089, rs1039239, rs11064191 및 rs9682978이 만성 감각신경성 이명 환자와 밀접하게 연관되어 있는 것을 규명하였는 바, 상기와 같은 SNP 마커는 이명의 진단 또는 발병 예측을 위한 유전자 진단 시약을 개발하는데 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

만성 감각신경성 이명 진단용 SNP 마커 및 이를 이용한 진단 방법 {SNP marker for chronic sensorineural tinnitus diagnosis and diagnosis method using the same}

본 발명은 이명 진단용 SNP 마커 및 이를 이용한 이명 진단 방법 등에 관한 것이다.

일반적으로 이명이란 외부의 자극이 없는데도 소리를 느끼는 것(the sensation of sound without external stimulation)으로 청각계의 이상 중 가장 흔하게 접하는 증상 중의 하나이다. 이명은 불면증, 집중력 상실, 우울증을 유발하여 일상 생활을 방해하고, 정상인의 95%이상에서 일생에 한번 이상 이명을 경험하며 전체인구의 17%가 이명으로 불편함을 겪고 이 중 5%정도가 병원을 찾을 정도로 심한 이명을 느낀다.

이명은 객관적 이명과 주관적 이명으로 구분되며, 관찰자에 의해 소리가 확인 가능한 객관적 이명은 혈관, 근육, 관절 등에 의해 발생되는 소리가 들리는 것으로 원인을 비교적 명확하게 규명할 수 있다. 주관적 이명 또는 감각신경성 이명은 가장 흔한 형태의 이명이지만, 아직 그 발병 원인이 명확하게 알려져 있지 않다. 말초 청각계에서부터 중추신경계까지 발생할 수 있는 어떠한 변화도 이명의 원인이 될 수 있으며, 단일 원인보다는 복합적인 원인에 의해 이명이 발생하는 것으로 생각되고 있다. 이러한 이명 발생 원인의 복잡성과 불명확성은 이명 양상의 다양성을 유발하고, 특히 치료에 대한 반응이 다양하게 되는 원인이 된다.

지금까지 감각신경성 이명의 치료는 주관적인 이명의 증상과 청력검사 결과만 고려되었으며, 환자의 유전학적 특성과 같은 환자 개개인의 차이는 반영되지 못하였던 것이 사실이다. 정밀의료(Precise medicine)은 이러한 이명 치료의 한계를 극복할 수 있는 방법으로, 유전학적, 생물학적, 정신사회적 특성을 고려하여 환자 개개인에게 가장 적합한 치료법을 제시하는 방법이다. 따라서 이명의 유전학적 원인을 규명하는 것은 정밀의료의 측면에서 필수적인 요소가 된다.

한편, 유전체연구 기술 발달에 힘입어 한 사람에 존재하는 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism; SNP)과 질병발생과의 관련성을 동시에 살펴보는 전장 유전체 연관 분석(Genome-wide association study; GWAS) 방법이 대세를 이루게 되었다. 전장 유전체 연관 분석은 약 50만-200만 개 SNP의 유전자형을 탐색하여 질병과의 연관성을 통계적으로 분석하는 방법을 일컫는다. 현재까지 이 방법으로 다양한 유전변이들이 전 세계적으로 발굴되었으며, GWAS를 이용한 질환에 대한 감수성 유전자들을 동정하고자 하는 시도가 이루어지고 있다.

이명은 높은 유병률에도 불구하고 이명과 관련된 유전 연구는 아직 미비한 실정이다. 그러나 GWAS를 이용하여 탐색된 SNP를 이용하면 이명 환자들의 유전적 특성을 예측할 수 있으므로 가장 적합한 치료 방법을 제시하는데 도움이 될 수 있을 것으로 기대된다.

이에 본 발명자들은 이명과 관련된 유전자형을 확인하기 위해 동일한 표본 크기를 이용하여 변이(variant)를 검출하는 데에 있어, GWAS 분석을 수행한 결과, 유의한 SNP들을 확인하여 이명의 진단 또는 발병 예측을 위한 유전자 진단 시약 개발 등에 활용하고자 하였다.

한국등록특허공보 제10-1296885호

본 발명자들은 GWAS 분석을 통해 이명 환자들의 유전체 DNA의 단백질 코딩 부위를 분석하여 이명 환자와 밀접하게 연관되어 있는 SNP들을 확인하였는 바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은 chr22:38485200 위치의 단일염기다형성(SNP), dbSNP 데이터베이스 rs1924089, rs1039239, rs11064191 및 rs9682978로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단일염기다형성(SNP)의 검출 제제를 포함하는, 이명 진단 또는 발병 예측용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는, 이명 진단 또는 발병 예측용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 SNP를 이용하여 이명의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법 및 이명의 발병 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 chr22:38485200 위치의 단일염기다형성(SNP), dbSNP 데이터베이스 rs1924089, rs1039239, rs11064191 및 rs9682978로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단일염기다형성(SNP)의 검출 제제를 포함하는, 이명 진단 또는 발병 예측용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 이명 진단 또는 발병 예측용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 피검체로부터 수득한 시료 중의 단일염기다형성(SNP) 부위의 염기서열에 chr22:38485200 위치의 단일염기다형성(SNP), dbSNP 데이터베이스 rs1924089, rs1039239, rs11064191 및 rs9682978로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 SNP가 존재하는 경우, 피검체가 이명을 가진 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 이명의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 피검체로부터 수득한 시료 중의 단일염기다형성(SNP) 부위의 염기서열에 chr22:38485200 위치의 단일염기다형성(SNP), dbSNP 데이터베이스 rs1924089, rs1039239, rs11064191 및 rs9682978로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 SNP가 존재하는 경우, 피검체가 이명에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 이명의 발병 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 이명은 만성 감각신경성 이명일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 검출 제제는 chr22:38485200 위치의 SNP, rs1924089, rs1039239, rs11064191 및 rs9682978로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 SNP를 검출할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 키트는 RT-PCR 키트 또는 마이크로어레이 칩 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 chr22:38485200 위치의 단일염기다형성(SNP), dbSNP 데이터베이스 rs1924089, rs1039239, rs11064191 및 rs9682978로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단일염기다형성(SNP)의 검출 제제를 포함하는 조성물의 이명 진단 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 chr22:38485200 위치의 단일염기다형성(SNP), dbSNP 데이터베이스 rs1924089, rs1039239, rs11064191 및 rs9682978로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단일염기다형성(SNP)의 검출 제제를 포함하는 조성물의 이명 발병 예측 용도를 제공한다.

본 발명자들은 전장 유전체 연관 분석(Genome-wide association study; GWAS)을 이용하여 이명 환자들의 유전체 DNA의 단백질 코딩 부위를 분석한 결과, 단일염기다형성(SNP) 부위인 chr22:38485200 위치의 SNP 및 dbSNP 데이터베이스 rs1924089, rs1039239, rs11064191 및 rs9682978이 만성 감각신경성 이명 환자와 밀접하게 연관되어 있는 것을 규명하였는 바, 상기와 같은 SNP 마커는 이명의 진단 또는 발병 예측을 위한 유전자 진단 시약을 개발하는데 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 단일염기다형성(SNP) 선별 과정에서 데이터 처리 및 데이터 품질 관리 과정을 도식화한 도면으로, DQC는 dish 품질 관리 (dish quality control), APT는 분석 파워 툴(analysis power tools), QC는 품질 관리(quality control), SNP는 단일염기다형성(single nucleotide polymorphisms), MDS는 다차원 척도법(multidimensional scale)을 각각 의미한다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 PLINK를 이용한 GWAS 분석에 대한 전체적인 개략도를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따른 SNP에 대한 연관성 분석 결과를 나타낸 도면이다.

본 발명은 chr22:38485200 위치의 단일염기다형성(SNP), dbSNP 데이터베이스 rs1924089, rs1039239, rs11064191 및 rs9682978로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단일염기다형성(SNP)의 검출 제제를 포함하는, 이명 진단 또는 발병 예측용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, "다형성(polymorphism)"이란 유전적으로 결정된 집단 내에서 2 이상의 대체적 서열 또는 대립형질(또는 대립유전자)의 발생을 의미하며, "단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)"은 하나의 염기의 다형성을 의미한다. 구체적으로 유전체에서 단일염기(A, T, C 또는 G)가 종의 멤버들 간 또는 한 개체(individual)의 쌍 염색체 간에 발생하는 DNA 서열의 다양성을 의미한다. 예를 들어, 서로 다른 개체의 세 개의 DNA 단편들(예를 들어 AAGT[A/A]AG, AAGT[A/G]AG, AAGT[G/G]AG)처럼 단일염기에서 차이를 포함하는 경우, 두 개의 대립유전자(A 또는 G)라고 부르며, 일반적으로 거의 모든 SNP는 두 개의 대립 유전자를 가진다. 또한 SNP가 특정 질환과 유전적으로 밀접하게 연관되어 있는 경우에는, SNP는 확인된 정상인(normal) 또는 야생형(wild-type, WT) 개체 또는 대립유전자와 비교하여 특정 위치의 하나의 염기에 변이가 발생한 것을 의미하기도 한다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 chr22:38485200 위치의 SNP, dbSNP 데이터베이스 rs1924089, rs1039239, rs11064191 및 rs9682978로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 SNP를 진단 마커로 검출한다.

본 발명에 있어서, chr22:38485200 위치의 SNP는 인간의 22번 염색체 상의 38485200번째 염기가 G에서 T로 치환된 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, SNP rs1924089는 인간의 13번 염색체 상의 49318097번째 염기가 A에서 G 또는 T로 치환된 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, SNP rs1039239는 인간의 4번 염색체 상의 186667811번째 염기가 A에서 C, G, 또는 T로 치환된 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, SNP rs11064191은 인간의 12번 염색체 상의 6545413번째 염기가 G에서 C로 치환된 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, SNP rs9682978은 인간의 3번 염색체 상의 43733184번째 염기가 A에서 G 또는 T로 치환된 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 이명은 만성 감각신경성 이명일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, "이명"은 외부에서 음자극이 없는데도 소리를 느끼는 것으로 각종 질환 또는 내이의 청각 세포의 손상으로부터 기인된다. 현재 이명의 85%는 청각 세포의 손상으로부터 기인되는 것으로 알려져 있으며, 청각 세포 손상에 의한 이명은 강한 소음, 노화, 약물 부작용, 알레르기, 외이도 및 중이염증으로부터 기인된다.

본 발명에 있어서, "감각신경성 이명"은 주관적 이명이라고도 하며 주로 노인성 난청, 소음성 난청, 돌발성 난청, 만성 중이염에 동반된 감각신경성 난청에 의하거나, 아스피린이나 혹은 귀에 해로운 약을 지속적으로 복용한 경우에 발생하기도 하며, 내이 혈관의 순환장애, 메니에르병 등의 경우처럼 달팽이관의 질환으로 발생하거나, 머리의 외상에 의한 뇌의 기능 변화, 뇌종양, 청신경 종양 등 청각신경 경로의 질환에 의해 발생하며, 또한 이런 원인들이 전혀 없이 원인 미상으로 발생하는 경우도 흔히 있으며 특히 정신적으로나 육체적으로 심한 스트레스에 의해 촉발되기도 한다. 특히 최근에는 기계 산업의 발달에 의한 직업적 소음성 난청뿐만 아니라 군대생활 중 사격이나 젊은이들이 큰 소리로 음악을 들어 내이에 손상을 받아 발생하는 경우 등 소음에 의한 이명이 매우 증가하는 추세이다.

본 발명에 있어서, “검출”은 목적하는 물질의 존재(발현) 여부를 측정 및 확인하는 것, 또는 목적하는 물질의 존재 수준(발현 수준)의 변화를 측정 및 확인하는 것을 모두 포함하는 의미이다. 같은 맥락에서, 본 발명에서 상기 SNP의 발현수준을 측정하는 것은 발현 여부를 측정하는 것(즉, 발현 유무를 측정하는 것), 또는 상기 SNP의 질적, 양적 변화 수준을 측정하는 것을 의미한다. 상기 측정은 정성적인 방법(분석)과 정량적인 방법을 모두 포함하여 제한 없이 수행될 수 있다. SNP 존재 여부 측정에 있어서 정성적 방법과 정량적 방법의 종류는 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 명세서에서 기술한 실험법들이 이에 포함된다. 각 방법 별로 구체적 SNP 수준 비교 방식은 당업계에 잘 알려져 있다.

본 발명에 있어서, 상기 검출 제제는 chr22:38485200 위치의 SNP, rs1924089, rs1039239, rs11064191 및 rs9682978로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 SNP를 검출할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, "프라이머(primer)"는 DNA 합성의 개시점(starting point)으로 작용하는 짧은 단일가닥 올리고뉴클레오티드(single strand oligonucleotide)이다. 프라이머는 적합한 완충액(buffer)와 온도 조건에서 주형(template)인 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하고, DNA 중합효소가 프라이머에 주형 DNA에 상보적인 염기를 갖는 뉴클레오사이드 트리포스페이트를 추가하여 연결함으로써 DNA가 합성된다. 프라이머는 일반적으로 15 내지 30개의 염기서열로 이루어져 있으며, 염기 구성과 길이에 따라 주형 가닥에 결합하는 온도(melting temperature, Tm)가 달라진다. 프라이머의 서열은 주형의 일부 염기 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서 상기 SNP 부위의 cDNA 또는 genomic DNA의 염기서열을 참조하여 본 발명에 따른 검출 제제인 프라이머쌍을 용이하게 디자인할 수 있다. SNP를 검출하기 위한 프라이머는 각 유전자 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, DNA 합성을 통해 mRNA 또는 cDNA의 특정 구간을 증폭하여 mRNA의 양을 측정하려는 목적에 맞는 길이와 상보성을 갖는 것이면 충분하다. 상기 증폭 반응을 위한 프라이머는 증폭하고자 하는 mRNA의 특정 구간의 양쪽 끝부분의 주형(또는 센스, sense)과 반대편(안티센스, antisense)에 각각 상보적으로 결합하는 한 세트(쌍)으로 구성된다.

본 발명에 있어서, "프로브(probe)"는 특정 유전자의 mRNA나 cDNA(complementary DNA), DNA 등에 특이적으로 결합할 수 있는 짧게는 수개 내지 길게는 수백 개의 염기(base pair) 길이의 RNA 또는 DNA 등 폴리뉴클레오티드의 단편을 의미하며, 표지(labeling)되어 있어서 결합하는 대상 mRNA나 cDNA의 존재 유무, 발현양 등을 확인할 수 있다. 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 기술에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 프로브는 대립형질(또는 대립유전자, allele)을 검출하기 위한 진단 방법 등에 사용될 수 있다. 상기 진단 방법에는 서던 블롯 등과 같은 핵산의 혼성화에 근거한 검출 방법들이 포함되며, DNA 칩을 이용한 방법에서 DNA 칩의 기판에 미리 결합된 형태로 제공될 수도 있다. 본 발명에서 상기 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 프로브는 공개된 한국인 유전자 칩 디자인을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서, 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한 프라이머 또는 프로브는 검출하고자 하는 표적이 되는 폴리뉴클레오티드와의 혼성화를 방해하지 않는 범위에서 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 다양하게 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 그리고 형광 또는 효소를 이용한 표지물질(labeling material)의 결합 등이 있다.

본 발명에 있어서, 상기 프라이머 또는 프로브는 본 발명의 chr22:38485200 위치의 SNP, dbSNP 데이터베이스 rs1924089, rs1039239, rs11064191 및 rs9682978로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 SNP를 검출할 수 있는 것이라면 특정 서열로 한정되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트 또는 마이크로어레이 칩 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 키트는 이명의 진단용 마커인 SNP 마커를 증폭을 통해 확인하거나, SNP 마커의 발현 수준을 mRNA의 발현 수준을 확인함으로써 이명의 발병을 예측 또는 조기 진단할 수 있다.

상기 RT-PCR 키트는 상기 SNP 부위를 포함하는 핵산을 증폭할 수 있는 각각의 프라이머 쌍을 포함할 수 있으며, 그 외 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.

상기 마이크로어레이 칩 키트는 상기 SNP 부위를 포함하는 핵산이 고정화되어 있는 기판을 갖는 마이크로어레이를 포함할 수 있다. 상기 마이크로어레이는 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어질 수 있다. 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질, 예를 들면, Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.

또한, 본 발명은 피검체로부터 수득한 시료 중의 단일염기다형성(SNP) 부위의 염기서열에 chr22:38485200 위치의 SNP, dbSNP 데이터베이스 rs1924089, rs1039239, rs11064191 및 rs9682978로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 SNP가 존재하는 경우, 피검체가 이명을 가진 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 이명의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 피검체로부터 수득한 시료 중의 단일염기다형성(SNP) 부위의 염기서열에 chr22:38485200 위치의 SNP, dbSNP 데이터베이스 rs1924089, rs1039239, rs11064191 및 rs9682978로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 SNP가 존재하는 경우, 피검체가 이명에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 이명의 발병 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 방법은 시퀀싱(sequencing), 엑솜 시퀀싱(exome sequencing), 마이크로어레이에 의한 혼성화(microarray hybridization), 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization), PCR 연장 분석 및 Taqman 기법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 chr22:38485200 위치의 SNP, dbSNP 데이터베이스 rs1924089, rs1039239, rs11064191 및 rs9682978로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단일염기다형성(SNP)의 검출 제제를 포함하는 조성물의 이명 진단 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 chr22:38485200 위치의 SNP, dbSNP 데이터베이스 rs1924089, rs1039239, rs11064191 및 rs9682978로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단일염기다형성(SNP)의 검출 제제를 포함하는 조성물의 이명 발병 예측 용도를 제공한다.

본 발명에 있어서, "개체" 또는 “대상체”는 발병 예측 또는 진단을 하기 위한 피험자를 의미한다.

본 발명에 있어서, “시료”는 발병 예측 또는 진단하고자 하는 대상체로부터 채취된 것이라면 제한없이 사용할 수 있으며, 예를 들어 생검 등으로 얻어진 세포나 조직, 혈액, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액, 각종 분비물, 소변, 대변 등일 수 있다. 바람직하게는 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 비액, 객담, 복수, 질 분비물 및 소변으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 혈액, 혈장, 혈청, 신장 조직 또는 신장 사구체 조직일 수 있다. 상기 시료는 검출 또는 진단에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 균질화(homogenization), 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)를 모두 포함하는 개념이다. 본 발명에 있어서, 상기 진단은 조기 진단 또는 발병 예측을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서는 GWAS 분석을 통해 이명 환자에서 유전체의 연관성을 확인한 결과, chr22:38485200 위치의 SNP가 이명과 가장 유의한 연관성을 가지는 것으로 확인되었으며(P<10^-8), 상기 마커 외에 dbSNP 데이터베이스 rs1924089, rs1039239, rs11064191 및 rs9682978의 4가지 SNP 마커도 이명과 유의한 연관성을 나타내는 것을 확인하였다(실시예 2 참조).

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험 방법

1-1. 대상

실험군으로 2016 년 6 월부터 2019 년 9 월까지 서울성모병원 제3 의뢰센터의 이명 클리닉을 방문한 환자가 등록되었으며, 주관적 또는 객관적인 이명을 호소한 사람들 중 전문가에 의해 만성 감각신경성 이명 진단을 받은 환자 만이 실험군으로 등록되었다. 과거에 정신 질환 진단을 받은 18 세 미만, 70 세 이상, 임신 또는 모유 수유중인 환자는 실험군에서 제외되었다. 대조군으로는 한국 바이오뱅크 어레이(Korean Biobank Array) 데이터를 사용하여, 만성 감각신경성 이명 환자 111명 및 대조군 133명의 혈액을 이용하여 유전자형을 분석하였다.

1-2. DNA 추출 및 유전자형 분석

이명 환자의 DNA는 표준 절차를 사용하여 혈액 샘플에서 추출되었으며 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 유전자형 분석이 수행되었다. SNP 마커의 유전자형 분석을 위해 질병관리본부(KCDC)에서 제조한 게놈-와이드 휴먼(Genome-wide Human) SNP 칩을 사용하였다.

1-3. GWAS(Genome-Wide Association Study) 분석

품질 관리(quality control, QC)는 각각 샘플 및 마커 수준에서 수행하였으며, 2,504 명의 피험자와 8470 만 SNP를 포함하는 1000 Genomes Project Phase 3과 Minimac2 및 SHAPEIT 알고리즘을 사용하여 SNP 연관 테스트를 로그 가산 모델을 기반으로 수행하였다.

한국 바이오 뱅크 어레이를 사용하여 실험군의 310건의 케이스와 150건의 건강한 대조군에 대해 샘플 수준에서는 낮은 호출 속도(low call rate) 및 과도한 헤테로 비율(excessive hetero rate)(n=38), 다차원 척도법(Multidimensional scale)(n=4), 성 미스매치(gender mismatch)(n=4)를 통해 샘플을 필터링하여 실험군 275건, 대조군 139건의 샘플에 대해 연관성 테스트를 수행하였다.

대립 유전자 연관 연구는 PLINK 소프트웨어를 사용하여 수행되었다.

한국 바이오 뱅크 어레이의 800,000개 이상의 SNP 마커 중 SNPolisher failed SNP(n=94,533), 마커 호출 속도(marker call rates)<0.05(n=15,963), HWE(Hardy-Weinberg Equilibrium) 테스트 p-값<10^-5(n=595), 마이너 대립 유전자 빈도(MAF)<0.01(n=202,639)인 SNP를 선택하였다. 또한, 유실률(missing rate)>0.05 인 SNP, 유실률>0.01 인 개체는 제외되었다. 이들 필터를 적용한 후, PLINK 1.919를 사용하여 SNP 마커에 대해 결합 테스트를 수행하였다. 연관성 시험의 p-값이 1×10^-8 미만인 SNP를 후보 SNP로 판단하였다. 연관성 연구의 통계적 유의성은 환자와 대조군 피험자 간의 MAF를 비교하기 위해 카이-제곱 테스트(Chi-squared test)를 사용하여 평가되었다.

PLINK를 이용한 GWAS 분석에 대한 전체적인 개략도를 도 2에 나타내었다.

실시예 2. 연관성 분석 결과 확인

발견 단계에서, 한국 바이오 뱅크 어레이를 사용하여 확인된 5억개 이상의 SNP 유전자형에 기초한 310건의 케이스와 150건의 건강한 대조군에 대해 연관성 테스트를 수행하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 하나의 SNP가 이명과 유의한 연관성을 나타내는 것으로 확인되었으며, 표 1에 나타낸 바와 같이 chr22:38485200 위치의 SNP가 이명과 유의한 연관성을 가지는 것으로 확인되었다(P<10^-8). 도 3에서 Manhattan 플롯은 유전자형화된(genotyped) SNP의 -log₁₀ P 값을 나타내며, 수평 및 수직 축은 각각 영 분포(null distribution)에서 예상되는 P 값과 관측된 P 값을 나타낸다.

이때, 상기 chr22:38485200 위치의 SNP가 위치한 뇌-특이적 혈관신생 억제제 1-연관 단백질 2-유사 단백질 2(Brain-Specific Angiogenesis Inhibitor 1-Associated Protein 2-Like Protein 2, BAIAP2L2) 유전자와 관련된 질환을 하기 표 2에 나타내었다. 연관 점수(association score)는 https://docs.targetvalidation.org/getting-started/scoring를 기반으로 하여 계산되었으며, 점수가 높을수록 해당 질병과의 연관성이 높을 것으로 예상할 수 있다(https://doi.org/10.1093/nar/gky1133).

특히, 가장 연관성이 높게 확인된 두 가지 질환으로 감각신경성 난청이 관련되어 있었는데, 이것은 난청과 관련된 SNP 변이가 실제로 난청이 유발되지 않더라도 이명의 원인이 될 수 있는 가능성을 시사한다.

또한, P 값이 10^-5 미만으로 정의되었을 때, 하기 표 3에 나타낸 바와 같이 이명과 연관성을 가진 4개의 다른 유전자좌(rs1924089, rs1039239, rs11064191 및 rs9682978)가 확인되었다. 이들 중 3 개의 SNP는 유전자 사이 영역(intergenic region)에 위치하였으며, 나머지 1개의 SNP는 코딩 유전자 SORBS2의 인트론 영역(intronic region)에 위치하였다.

이때, 상기 4개의 SNP가 위치한 유전자들과 각각 관련된 질환을 하기 표 4에 나타내었다. 관련 질환들 중 이명과 관련성이 있는 질환은 포함되어 있지 않았다.

상기 실시예에 따라 만성 감각신경성 이명에서 임상적 유의성이 있다고 판단되는 SNP들이 선별되었는 바, 본 발명의 SNP는 이명의 조기 진단 및 발병 예측에 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

Claims

chr22:38485200 위치의 단일염기다형성(SNP), dbSNP 데이터베이스 rs1924089, rs1039239, rs11064191 및 rs9682978로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단일염기다형성(SNP)의 검출 제제를 포함하는, 이명의 진단 또는 발병 예측용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 이명은 만성 감각신경성 이명인 것을 특징으로 하는, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 검출 제제는 chr22:38485200 위치의 SNP, rs1924089, rs1039239, rs11064191 및 rs9682978로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 SNP를 검출할 수 있는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 조성물.
제1항의 조성물을 포함하는, 이명 진단 또는 발병 예측용 키트.
제4항에 있어서,
상기 이명은 만성 감각신경성 이명인 것을 특징으로 하는, 키트.
제4항에 있어서,
상기 키트는 RT-PCR 키트 또는 마이크로어레이 칩 키트인 것을 특징으로 하는, 키트.
피검체로부터 수득한 시료 중의 단일염기다형성(SNP) 부위의 염기서열에 chr22:38485200 위치의 SNP, dbSNP 데이터베이스 rs1924089, rs1039239, rs11064191 및 rs9682978로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 SNP가 존재하는 경우, 피검체가 이명을 가진 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 이명의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
피검체로부터 수득한 시료 중의 단일염기다형성(SNP) 부위의 염기서열에 chr22:38485200 위치의 SNP, dbSNP 데이터베이스 rs1924089, rs1039239, rs11064191 및 rs9682978로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 SNP가 존재하는 경우, 피검체가 이명에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 이명의 발병 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.