JP4119490B2 - ＴＮＦ−αプロモーターが関与する疾患の遺伝子診断 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は遺伝子診断に関するものであり、詳しくは腫瘍壊死因子−α（以下ＴＮＦ−αと言う）が関与する疾患の遺伝子診断に関する。
背景技術
ＴＮＦ−αは、Ｔ細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞等の細胞から、細菌、ウイルス、各種マイトージェン、その他の起炎物質による誘導によって産生されるタンパク質であって、以下のような生物活性を有する。
１）腫瘍に出血性壊死を誘導する因子（in vivo）
２）がん細胞にアポトーシスを誘導（in vitro）
３）プロスタグランジンやコラゲナーゼの産生
４）接着分子（ＩＣＡＭ−１，ＥＬＡＭ−１）の発現
５）ＨＬＡクラスＩＩの発現
６）炎症性サイトカイン（ＩＬ−１，ＩＬ−６）の産生
７）ケモカイン（ＩＬ−８，ＲＡＮＴＥＳ）の産生
８）骨、軟骨吸収の亢進
ＴＮＦ−αは各種炎症性疾患の病態形成のサイトカインカスケードの最上流に位置する重要な物質であると考えられる。
従来よりＴＮＦ−α産生量の個人差が指摘されている。またＴＮＦ−αは血管障害に関与する重要なサイトカインである。川崎病急性期の血清中ＴＮＦ−αは異常な高値を示し、同時期の末梢血単核球ではＴＮＦ−α産生が亢進しているといわれている。これらのことより、全身の血管障害を主病変とする川崎病の発症において、ＴＮＦ−αが重要な役割を果たしていると考えられる（Ｍ．Ｓakaguchi，Ｈ．Ｋato，Ａ．Ｎishiyori，Ｋ．ＳagawaおよびＫ．Ｉtoh．Ｐroduction of tumor necrosis factor-alpha by Ｖβ２-or Ｖβ８-ＣＤ４+Ｔ cells in Ｋawasaki disease．Ｉｎ“Ｋawasaki disease”(Ｈ．Ｋato，Ｅd．），pp．206-213，Ｅlsevier，Ａmsterdam（1995））。そこで、川崎病の発症および重症度には遺伝的要因に基づくＴＮＦ−α高産生性が関与していることが予想される。
同様にリウマチにおいてもＴＮＦ−αの産生が亢進している（Ｍ．Ｓebbag，Ｓ．Ｌ．Ｐarry，Ｆ．Ｍ．ＢrennanおよびＭ．Ｆeldmann．Ｃytokine stimulation of Ｔ lymphocytes regulates their capacity to induce monocyte production of tumor necrosis factor-alpha，but not interleukin−10：possible relevance to pathophysiology of rheumatoid arthritis．Ｅur．Ｊ．Ｉmmunol．27: 624-632（1997））。
一方ＳＬＥ腎症ではＴＮＦ産生能が低いとされる（Ｃ．Ｏ．Ｊacob，Ｚ．Ｆronek，Ｇ．Ｄ．Ｌewis，Ｍ．Ｋoo，Ｊ．Ａ．ＨansenおよびＨ．Ｏ．ＭcＤevitt．Ｈeritable major histocompatibility complex class II-associated differences in production of tumor necrosis factor a: Ｒelevance to genetic predisposition to systemic lupus erythmatosus．Proc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ．87：1233−1237（1990））。
発明の開示
このようにある種の病気の発生や重症度には、個人の持つＴＮＦ−α産生能が関係していることが予想される。
従って遺伝的要因に基づく個体のＴＮＦ−α産生能を予め客観的に測定できれば、ＴＮＦ−αが関与する疾患の事前診断（病気になり易さ、病気になった場合の重症度、治療に対する反応性等）や予後の判定を行うことができる。
このような目的の達成のため発明者等は鋭意検討を行った。その結果ＴＮＦ−α遺伝子の５’フランキング（プロモーター）領域にヌクレオチド変化の遺伝子多型が存在すること、該ヌクレオチド変化によってＴＮＦ−αの産生能が顕著に変化することを見出したことに基づいて本発明を完成させた。
すなわち本願発明は、ＴＮＦ−α遺伝子の５’フランキング領域内のヌクレオチド変化であって、
１）−８５７位（配列番号９の３７３位）のシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への変化、
２）−８６３位（配列番号９の３６７位）のシトシン（Ｃ）からアデニン（Ａ）への変化、
３）−１０３１位（配列番号９の１９９位）のチミン（Ｔ）からシトシン（Ｃ）への変化、
および
４）それらの相補鎖における対応する各々の変化
から選択される１または２以上の変化の有無を検出することよりなる、ＴＮＦ−αが関与する疾患判定の為の遺伝子多型のスクリーニング方法を要旨とするものである。
本明細書において「ＴＮＦ−αが関与する疾患」とはＴＮＦ−αの産生量の多少によって疾患の発生や重症度、治療に対する反応性が左右される疾患を意味する。このような疾患には例えば、若年性関節リウマチ、慢性関節リウマチ、ＳＬＥ腎症や川崎病、さらにはまたインシュリン依存性およびインシュリン非依存性糖尿病、レプチン関連疾患、例えば肥満症等（ＤＩＡＢＥＴＥＳ、第４６巻１４６８−１４７２頁（１９９７））が挙げられる。ＴＮＦ−αが関与する疾患にはＨＬＡ４または９に関連する疾患、例えば慢性関節リウマチ、尋常性天疱瘡、糖尿病、原田病、Ｃｒｏｈｎ病等も含まれる。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＴＮＦ−α産生量の個体差を示す。
図２は、ＴＮＦ−α遺伝子のプロモーター領域の多型を示す。
図３は、ＴＮＦ−α産生量とＴＮＦ−α遺伝子のプロモーター領域の多型との関係を示す。
図４は、プロモーター活性の解析方法を示す。
図５は、ＴＮＦ−α遺伝子の染色体における位置を示す。
図６は、ＴＮＦ−αプロモーター領域のＡＳＯハイブリダイゼーション解析の電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
図７は、ＴＮＦ−α遺伝子のプロモーター領域の塩基配列である。
発明の実施の形態
遺伝子を取り出す試料としてはあらゆる生検試料を使用することができるが、典型的には白血球であり、肝組織バイオプシーも使用できる。
得られた試料をプロテイナーゼＫ−ＳＤＳによりタンパク質分解・変性後、フェノール／クロロホルム抽出によりゲノムＤＮＡ（＋ＲＮＡ）が得られる。所望により、ＲＮＡはＲＮアーゼにより除去することができる。
次いで、得られたゲノムＤＮＡを、以下に記載のプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅させる。
センスプライマー（１〜２０番目の塩基に相当）
アンチセンスプライマー（１０２４〜１０４２番の相補鎖に相当）
次いで、以下に記載する核酸変異検出手法によりヌクレオチド変化の有無を確認する。
１）ＲＦＬＰ法（制限断片長多型）
２）ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析）
３）ＡＳＯハイブリダイゼーション法（allele specific oligonucleotide hybridization）
ＰＣＲ産物をナイロンフィルターなどの支持体にドットブロットし、検索する変異部位に対応した塩基配列をもつ、１８mer程度の合成オリゴヌクレオチドプローブ（シグナルを得るにはラジオアイソトープあるいはビオチン標識が必要）とのハイブリダイゼーション後、そのプローブのＴm値に準じたポスト洗浄により、１塩基ミスマッチの検出（ミスマッチがあればハイブリッドが外れる）が可能となる。これは、ＰＣＲを用いた特定の塩基置換の検出法としては最も典型的な方法である。
４）シークエンス法
得られた領域の全塩基配列を決定し、ヌクレオチド変化の有無を直接調べる。
５）サザンブロッティング法
ＤＮＡを制限酵素処理し、電気泳動で展開し、プローブとハイブリダイゼーションをする一般的方法である。ゲノミックサザン法、ＰＣＲサザン法のいずれも使用できる。後者は、上記（３）と原理は同じであるが、移動度の情報が得られる点で、精度上の利点を有している。
６）ＡＲＭＳ（amplification refracting mutation system）
ＰＣＲでは、鋳型ＤＮＡにプライマーがアニールした後、ＤＮＡポリメラーゼにより５’から３’に相補鎖ＤＮＡが合成される。プライマーの３’末塩基にミスマッチがあると、ＰＣＲの効率が低下する、即ち電気泳動的に観察不可能になる。ＡＲＭＳは本原理を利用するものであり、プライマーの３’末塩基が検出したい変異塩基に相補的なものを用いてＰＣＲを行い、増幅産物の有無を検出できる。
７）ＤＧＧＥ（denaturing gradient gel electrophoresis、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法）
ＰＣＲ産物中のミスマッチを待つヘテロデュプレックスが、ホモデュプレックスよりもその解離が容易であることを利用した方法である。解離が進むにつれ、ゲル電気泳動の移動度が落ちるので、展開するポリアクリルアミドゲルに尿素およびホルムアミドの密度勾配をつけることによりそれがさらに強調され、ミスマッチを含む２本鎖ＤＮＡの存在、即ち変異の存在が検出される。
８）ＲＮase切断法
ＲＮaseＡ（ＲＮＡ分解酵素）は２本鎖のＲＮＡもしくはＲＮＡ／ＤＮＡコンプレックスを分解せず、１本鎖のＲＮＡのみを分解する特性を有する。従って、例えば３２Ｐにより標識したＲＮＡプローブを１本鎖変性したサンプルＤＮＡとハイブリダイズさせ、ＲＮaseＡ処理後、電気泳動により展開すれば、変異型とハイブリダイズしたＲＮＡプローブはミスマッチ部位で切断されるので、２本のバンドとして検出できる。
９）化学切断（chemical cleavage）法
２本鎖ＤＮＡのミスマッチ部位の「Ｃ」に対してはヒドロキシルアミン、「Ｔ」に対してはオスミウムテトラオキシドで別個に修飾した後、ピペリジン処理をすると糖が切断される。標識プローブを用いて２本鎖を形成させ、本処理後、電気泳動し、プローブのサイズが短くなれば変異が検出されたことになる。
１０）リガーゼ法
２つのオリゴヌクレオチドをＤＮＡリガーゼで連結するとき、結合位置に鋳型ＤＮＡとの間にミスマッチがあると、結合できないことが原理である。
i）ＬＭＧＤ（ligase−mediated gene detection）法
一方のオリゴＤＮＡは例えば３２Ｐ標識、他方はビオチン標識し、ライゲーション後、ストレプトアビジン吸着による回収を行なう。これらが連結する（即ち、ミスマッチしない）ならば、３２Ｐの放射線量が高値を示すので、検出することができる。
ii）ＬＣＲ（ligase chain reaction）
上記のライゲーション反応を、耐熱性のリガーゼを用いて繰り返し行なうことで、ＰＣＲと同様にＤＮＡ鎖に対してもオリゴＤＮＡがアニールするので、高感度に変異の検出が可能となる。
実施例
実施例１
ＴＮＦ−α産生能の比較：
日本人の健常人９名より分離したＰＢＭＣ（末梢血単核球）１×１０6を培地（ＲＰＭＩ１６４０＋５％ＦＣＳ）１mlに浮遊し、ＣonＡ（コンカナバリン（Ｃoncanavaline）Ａ:１０μg／ml）により刺激し、３７℃で２０時間培養後、上清中の産生されたＴＮＦ−α濃度をＥＬＩＳＡ法にて測定した。結果を図１に示す。
ＣonＡ刺激によるＰＢＭＣのＴＮＦ−α産生量は日本人健常人９名で著しい差があることを見出した。
実施例２
ＴＮＦ−α遺伝子プロモーター領域における多型の解析：
実施例１と同様に分離したＰＢＭＣによりゲノムＤＮＡを分離し、ＰＣＲ法にてＴＮＦ−α遺伝子プロモーター領域（約１．３Ｋbp）を増幅したあと、さらにＴＡクローニング法にて増幅し全塩基配列の決定を行ない、多型の有無を解析した。結果を図２及び図７に示す。図７は、独自に構築したコンセンサス配列（配列番号９）に対してケース２Ｘおよび２Ｙをアライメントさせた図である。
上記９名の配列比較により、ＴＮＦ−α遺伝子プロモーター領域に現在までに報告されていない多型が３カ所存在することを見出した。
実施例３
多型プロモーターの活性：
これらのＴＮＦ−α遺伝子プロモーター領域の−８５７、−８６３、および−１０３１位における多型は、ＴＮＦ−α高産生者に高頻度にみられた。
そこで、−８５７、−８６３、−１０３１位のいずれかに多型を認めるものといずれにも認めないものでＴＮＦ−α産生能を比較した。その結果、前者において有意にＴＮＦ−α産生能が高いことが統計的に認められた（p値＝０．０５:Ｍann ＷhitneyのＵ検定）（図３）。
次にこれら多型のうちの−８５７位に多型をもつものと−８６３および−１０３１位に多型をもつものと２種類について、そのプロモーター活性をレポーター遺伝子を用いて次のように測定し、比較した。
ＴＮＦ−α遺伝子プロモーター領域を、レポーターベクター（ＰＧＬ−３:ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含む）に挿入し、対照ベクター（pＲＬ−ＴＫ:レニラルシフェラーゼ遺伝子を含む）とともにヒトＴ細胞白血病株Ｊurkatにエレクトロポレーションにて同時トランスフェクションし、１８時間培養した。その後Ｆicoll比重遠心法にて生細胞のみ分離し、細胞溶解したあと２種類のルシフェラーゼ活性をルミノメーターで測定した（図４）。プロモーター活性は、対照ベクターのルシフェラーゼ活性に対する比より決定した。
結果を表１に示す。−８５７位に多型を有するＴＮＦ−α遺伝子プロモーター（pＧＬ−ＴＮＦp２Ｘ）、および−８６３と−１０３１位に多型を有するプロモーター（pＧＬ−ＴＮＦp２Ｙ）は保存配列より約２倍強いプロモーター活性を有する。
実施例４
ＡＳＯハイブリダイゼーション法によるＴＮＦ−α遺伝子プロモーター領域多型の解析：
−８５７、−８６３および−１０３１位の多型について、ＡＳＯハイブリダイゼーション法により解析した。実施例２と同様にゲノムＤＮＡより、ＰＣＲ法にてＴＮＦ−α遺伝子プロモーター領域を増幅したのち、ナイロンフィルターにドットスポットし、ＵＶクロスリンカーで固定した。ＡＳＯプローブの塩基配列を以下に示す。
（−８５７位のＣに特異的に反応する。配列番号３。以下、Ｈ−８５７Ｃと呼ぶ。）
（−８５７位のＴに特異的に反応する。配列番号４。以下、Ｈ−８５７Ｔと呼ぶ。）
（−８６３位のＣに特異的に反応する。配列番号５。以下、Ｈ−８６３Ｃと呼ぶ。）
（−８６３位のＡに特異的に反応する。配列番号６。以下、Ｈ−８６３Ａと呼ぶ。）
（−１０３１位のＴに特異的に反応する。配列番号７。以下、Ｈ−１０３１Ｔと呼ぶ。）
（−１０３１位のＣに特異的に反応する。配列番号８。以下、Ｈ−１０３１Ｃと呼ぶ。）
これらをγ32−Ｐ−ＡＴＰで末端標識して用いた。ハイブリダイゼーションは、ＴＭＡＣ（テトラメチルアンモニウムクロライド）存在下で行った。結果を図６および表２に示す。図２に示した塩基配列の結果と完全に一致する結果が得られた。
実施例５
健常人のＴＮＦ−α遺伝子５’フランキング領域多型
日本人の健常人５７５人について、−２３８、−３０８、−８５７、−８６３、および−１０３１位の多型について、実施例４と同様にしてＡＳＯハイブリダイゼーション法により解析した。結果を表３に示す。
健常人ではアレルＡ（−１０３１位がＴ、−８６３位がＣ、−８５７位がＣ、−３０８位がＧ、−２３８位がＧであるアレル）を有する人が多いことがわかる。
実施例６
若年性関節リウマチとＴＮＦ−α遺伝子５’フランキング領域多型との関係
１１２人の若年性関節リウマチ（ＪＲＡ）患者（全身性および非全身性）における−８５７位および−１０３１位の多型を、健常人の場合と比較した（表４）。
表４中、−８５７／Ｔ＋とは−８５７位がＴに変化しているもの、−８５７／Ｔ−とは同位がＴに変化していないもの（すなわちＣであるもの）−を示す。同様に−１０３１／Ｃ＋とは−１０３１位がＣに変化しているもの、−１０３１／Ｃ−とは同位がＣに変化していないもの（すなわちＴであるもの）を示す。
全身性リウマチ患者では、健常人と比較して−８５７／Ｔ＋と−８５７Ｔ−との比、および−１０３１／Ｃ＋と−１０３１／Ｃ−との比が有意に異なることがわかる。このことは、−８５７位または−１０３１位におけるヌクレオチドの変化を調べることによって若年性全身性関節リウマチが診断できることを示唆するものである。
実施例７
慢性関節リウマチとＴＮＦ−α遺伝子５’フランキング領域多型との関係
慢性関節リウマチ（ＲＡ）患者（３８７人）および健常者（５７５人）について、ＴＮＦ−β遺伝子の−１０３１位、−８６３位、−８５７位、−３０８位および−２３８位における多型を分析した。結果を表５に示す。
上表に示すように、−１０３１でのＴからＣへの変化（以下「−１０３１Ｃ」と言う）、−８６３位でのＣからＡへの変化（以下「−８６３Ａ」と言う）、−８５７位でのＣからＴへの変化（以下、「−８５７Ｔ」と言う）、−３０８位でのＧからＡへの変化（以下、「−３０８Ａ」と言う）、および−２３８位でのＧからＡへの変化（以下、「−２３８Ａ」と呼ぶ）の割合は、ＲＡ患者においては、それぞれ１８．０％、１６．４％、２７．３％、０．４％、１．４％であった。一方健常者においては、それぞれ１６．０％、１４．０％、１７．７％、１．７％、２．０％であった。−８５７Ｔおよび−３０８Ａの割合は、ＲＡ患者と健常者との間で統計的に有意差があり、ＲＡ患者では健常者に比べて、−８５７位がＴに変化している割合が大きく、−３０８位がＧからＡに変化している割合が低い。このことはＴＮＦ−α遺伝子の−８５７位および−３０８位における多型はＲＡ感受性に関与していることを示すものである。
実施例８
慢性リウマチ患者の臨床的特徴とＴＮＦ−α遺伝子５’フランキング領域の多型との関係
慢性リウマチ（ＲＡ）患者において、−１０３１Ｃ、−８６３Ａ、−８５７Ｔの有無と、その患者の臨床的特徴（関節点数（Ｌansbury評価法），腫膿関節数、疼痛関節数、顕微鏡下血尿）との関係を調べた。結果を表６に示す。
ＲＡ患者であって、ＨＬＡ ＤＲＢ１＊４０５陰性の患者においては、−１０３１Ｃ、または−８６３Ａが陽性である場合には、Ｍicrohematuriaを有している場合が有意に多いことが認められる。このことはＴＮＦ−α遺伝子の−１０３１位および−８６３位における多型はＲＡの腎臓合併症に関与していることを示唆するものである。
実施例９
インシュリン依存性糖尿病とＴＮＦ−α遺伝子５’フランキング領域多型との関係
インシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）患者（１４０人）および健常者（５７５人）について、ＴＮＦ−α遺伝子の−８５７位、−８６３位および−１０３１位置における多型を分析した。結果を表７に示す。
上表に示すように、ＩＤＤＭ患者における−１０３１Ｃ、−８６３Ａ、−８５７Ｔの割合は、それぞれ２５．４％、２５．０％、２８．９％であり、一方健常者においては１６．０％、１４．０％、１７．７％であった。両者のこれらの値の差異は統計的に有意であり、ＴＮＦ−α遺伝子の−１０３１位、−８６３位、−８５７位における多型はインシュリン依存性糖尿病感受性に関与していることを示す。
実施例１０
インシュリン非依存性糖尿病とＴＮＦ−α遺伝子５’フランキング領域多型との関係（１）
肥満しているインシュリン非依存性糖尿病患者（ＮＩＤＤＭ＋）（５９人）および健常者（ＮＩＤＤＭ−）（９６人）について、ＴＮＦ−α遺伝子の−８５７位における多型を分析した。結果を表８に示す。
上表に示すように、−８５７Ｔの割合はＤＭ患者では２８．０％であるのに対し、健常者では１４．０％であり、これらの値は統計的に有意差があった。
このことは肥満している人では、ＴＮＦ−α遺伝子の−８５７位における多型が糖尿病に関与していることを示すものである。
実施例１１
インシュリン非依存性糖尿病とＴＮＦ−α遺伝子５’フランキング領域多型との関係（２）
肥満していない、インシュリン非依存性糖尿病患者（ＮＩＤＤＭ＋）（１５４人）および健常者（ＮＩＤＤＭ−）（１９５人）について、ＴＮＦ−α遺伝子の−１０３１位および−８６３位における多型を調べた。結果を表９に示す。
上表に示すように、−１０３１Ｃおよび−８６３Ａの割合は、ＮＩＤＤＭ患者では、それぞれ１２．０％、１０．７％であるのに対し、健常者では、それぞれ１８．５％、１７．４％であった。これらの値の差異は統計的に有意である。
このことは肥満していない人では、ＴＮＦ−α遺伝子の−１０３１位、−８６３位における多型が糖尿病に関与していることを示す。
実施例１２
ＨＬＡのＤＲＢ１アレルとＴＮＦ−αの遺伝子５’フランキング領域多型との関係
ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）のＤＲＢ１には多数の多型が存在することが知られている。そこでＨＬＡのＤＲＢ１アレルと本願発明に係るＴＮＦ−α遺伝子５’フランキング領域における多型との関係を調べた。
表１０において０９０１＋とはＤＰＢ１ ０９０１アレルを言い、０９０１−とはＤＰＢ１ ０９０１アレルでないものを言う。同様に０４０５＋とはＤＰＢ１ ０４０５アレルを指し、０４０５−とはＤＰＢ１ ０４０５アレルでないものを言う。
またアレルＢ＋とはアレルＢを言い、アレルＢ−とはアレルＢではないもの（すなわちアレルＡ、Ｃ、ＤまたはＥ）を言う。同様にアレルＤ＋とはアレルＤを指し、アレルＤ−とはアレルＤでないもの（すなわちアレルＡ、Ｂ、ＣまたはＥ）を言う。アレルＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥについては実施例５を参照。
表から明らかなように、ＨＬＡのＤＲＢ１ ０９０１−とアレルＢ−、およびＨＬＡのＤＲＢ１ ０４０５−とアレルＤ−には強い相関性が認められる。図５に示すように、ＴＮＦ−αの５’フランキング領域は、染色体上ＨＬＡクラスＩとクラスIIとの間に位置しているので、ＨＬＡとＴＮＦ−αプロモーターは連鎖している可能性がある。
一方、従来からＨＬＡと疾患感受性との関係が指摘されている（「医科免疫学」改訂第４版、１０７頁、菊地浩吉編、南江堂）。例えばＨＬＡのＤＲＢ１ ４０５を有する人は、慢性関節リウマチ、尋常性天疱瘡、糖尿病、原田病、Ｃｒｏｈｎ病等に対する感受性が強いとされる。従って、ＴＮＦ−α遺伝子５’フランキング領域の多型を調べることによってこれらの病気の事前診断を行うことのできる可能性が示唆される。
以上のように、本発明のＴＮＦ−αが関与する疾患遺伝子多型のスクリーニング方法により、或る個体のＴＮＦ−α遺伝子５’フランキング領域内の特定の位置でのヌクレオチド変化を測定すれば、その個体のＴＮＦ−α産生能、ひいてはＴＮＦ−αが関与する疾患の事前診断や予後の判定を行うことができる。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
配列番号：２
配列の長さ：１９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
配列番号：３
配列の長さ：１８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
配列番号：４
配列の長さ：１８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
配列番号：５
配列の長さ：１８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
配列番号：６
配列の長さ：１８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
配列番号：７
配列の長さ：１８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
配列番号：８
配列の長さ：１８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
配列番号：９
配列の長さ：１３５７
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｇenomic ＤＮＡ
起源
生物名：ヒト
配列
本発明は遺伝子診断に関するものであり、詳しくは腫瘍壊死因子−α（以下ＴＮＦ−αと言う）が関与する疾患の遺伝子診断に関する。
背景技術
ＴＮＦ−αは、Ｔ細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞等の細胞から、細菌、ウイルス、各種マイトージェン、その他の起炎物質による誘導によって産生されるタンパク質であって、以下のような生物活性を有する。
１）腫瘍に出血性壊死を誘導する因子（in vivo）
２）がん細胞にアポトーシスを誘導（in vitro）
３）プロスタグランジンやコラゲナーゼの産生
４）接着分子（ＩＣＡＭ−１，ＥＬＡＭ−１）の発現
５）ＨＬＡクラスＩＩの発現
６）炎症性サイトカイン（ＩＬ−１，ＩＬ−６）の産生
７）ケモカイン（ＩＬ−８，ＲＡＮＴＥＳ）の産生
８）骨、軟骨吸収の亢進
ＴＮＦ−αは各種炎症性疾患の病態形成のサイトカインカスケードの最上流に位置する重要な物質であると考えられる。
従来よりＴＮＦ−α産生量の個人差が指摘されている。またＴＮＦ−αは血管障害に関与する重要なサイトカインである。川崎病急性期の血清中ＴＮＦ−αは異常な高値を示し、同時期の末梢血単核球ではＴＮＦ−α産生が亢進しているといわれている。これらのことより、全身の血管障害を主病変とする川崎病の発症において、ＴＮＦ−αが重要な役割を果たしていると考えられる（Ｍ．Ｓakaguchi，Ｈ．Ｋato，Ａ．Ｎishiyori，Ｋ．ＳagawaおよびＫ．Ｉtoh．Ｐroduction of tumor necrosis factor-alpha by Ｖβ２-or Ｖβ８-ＣＤ４+Ｔ cells in Ｋawasaki disease．Ｉｎ“Ｋawasaki disease”(Ｈ．Ｋato，Ｅd．），pp．206-213，Ｅlsevier，Ａmsterdam（1995））。そこで、川崎病の発症および重症度には遺伝的要因に基づくＴＮＦ−α高産生性が関与していることが予想される。
同様にリウマチにおいてもＴＮＦ−αの産生が亢進している（Ｍ．Ｓebbag，Ｓ．Ｌ．Ｐarry，Ｆ．Ｍ．ＢrennanおよびＭ．Ｆeldmann．Ｃytokine stimulation of Ｔ lymphocytes regulates their capacity to induce monocyte production of tumor necrosis factor-alpha，but not interleukin−10：possible relevance to pathophysiology of rheumatoid arthritis．Ｅur．Ｊ．Ｉmmunol．27: 624-632（1997））。
一方ＳＬＥ腎症ではＴＮＦ産生能が低いとされる（Ｃ．Ｏ．Ｊacob，Ｚ．Ｆronek，Ｇ．Ｄ．Ｌewis，Ｍ．Ｋoo，Ｊ．Ａ．ＨansenおよびＨ．Ｏ．ＭcＤevitt．Ｈeritable major histocompatibility complex class II-associated differences in production of tumor necrosis factor a: Ｒelevance to genetic predisposition to systemic lupus erythmatosus．Proc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ．87：1233−1237（1990））。
発明の開示
このようにある種の病気の発生や重症度には、個人の持つＴＮＦ−α産生能が関係していることが予想される。
従って遺伝的要因に基づく個体のＴＮＦ−α産生能を予め客観的に測定できれば、ＴＮＦ−αが関与する疾患の事前診断（病気になり易さ、病気になった場合の重症度、治療に対する反応性等）や予後の判定を行うことができる。
このような目的の達成のため発明者等は鋭意検討を行った。その結果ＴＮＦ−α遺伝子の５’フランキング（プロモーター）領域にヌクレオチド変化の遺伝子多型が存在すること、該ヌクレオチド変化によってＴＮＦ−αの産生能が顕著に変化することを見出したことに基づいて本発明を完成させた。
すなわち本願発明は、ＴＮＦ−α遺伝子の５’フランキング領域内のヌクレオチド変化であって、
１）−８５７位（配列番号９の３７３位）のシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への変化、
２）−８６３位（配列番号９の３６７位）のシトシン（Ｃ）からアデニン（Ａ）への変化、
３）−１０３１位（配列番号９の１９９位）のチミン（Ｔ）からシトシン（Ｃ）への変化、
および
４）それらの相補鎖における対応する各々の変化
から選択される１または２以上の変化の有無を検出することよりなる、ＴＮＦ−αが関与する疾患判定の為の遺伝子多型のスクリーニング方法を要旨とするものである。
本明細書において「ＴＮＦ−αが関与する疾患」とはＴＮＦ−αの産生量の多少によって疾患の発生や重症度、治療に対する反応性が左右される疾患を意味する。このような疾患には例えば、若年性関節リウマチ、慢性関節リウマチ、ＳＬＥ腎症や川崎病、さらにはまたインシュリン依存性およびインシュリン非依存性糖尿病、レプチン関連疾患、例えば肥満症等（ＤＩＡＢＥＴＥＳ、第４６巻１４６８−１４７２頁（１９９７））が挙げられる。ＴＮＦ−αが関与する疾患にはＨＬＡ４または９に関連する疾患、例えば慢性関節リウマチ、尋常性天疱瘡、糖尿病、原田病、Ｃｒｏｈｎ病等も含まれる。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＴＮＦ−α産生量の個体差を示す。
図２は、ＴＮＦ−α遺伝子のプロモーター領域の多型を示す。
図３は、ＴＮＦ−α産生量とＴＮＦ−α遺伝子のプロモーター領域の多型との関係を示す。
図４は、プロモーター活性の解析方法を示す。
図５は、ＴＮＦ−α遺伝子の染色体における位置を示す。
図６は、ＴＮＦ−αプロモーター領域のＡＳＯハイブリダイゼーション解析の電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
図７は、ＴＮＦ−α遺伝子のプロモーター領域の塩基配列である。
発明の実施の形態
遺伝子を取り出す試料としてはあらゆる生検試料を使用することができるが、典型的には白血球であり、肝組織バイオプシーも使用できる。
得られた試料をプロテイナーゼＫ−ＳＤＳによりタンパク質分解・変性後、フェノール／クロロホルム抽出によりゲノムＤＮＡ（＋ＲＮＡ）が得られる。所望により、ＲＮＡはＲＮアーゼにより除去することができる。
次いで、得られたゲノムＤＮＡを、以下に記載のプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅させる。
センスプライマー（１〜２０番目の塩基に相当）
１）ＲＦＬＰ法（制限断片長多型）
２）ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析）
３）ＡＳＯハイブリダイゼーション法（allele specific oligonucleotide hybridization）
ＰＣＲ産物をナイロンフィルターなどの支持体にドットブロットし、検索する変異部位に対応した塩基配列をもつ、１８mer程度の合成オリゴヌクレオチドプローブ（シグナルを得るにはラジオアイソトープあるいはビオチン標識が必要）とのハイブリダイゼーション後、そのプローブのＴm値に準じたポスト洗浄により、１塩基ミスマッチの検出（ミスマッチがあればハイブリッドが外れる）が可能となる。これは、ＰＣＲを用いた特定の塩基置換の検出法としては最も典型的な方法である。
４）シークエンス法
得られた領域の全塩基配列を決定し、ヌクレオチド変化の有無を直接調べる。
５）サザンブロッティング法
ＤＮＡを制限酵素処理し、電気泳動で展開し、プローブとハイブリダイゼーションをする一般的方法である。ゲノミックサザン法、ＰＣＲサザン法のいずれも使用できる。後者は、上記（３）と原理は同じであるが、移動度の情報が得られる点で、精度上の利点を有している。
６）ＡＲＭＳ（amplification refracting mutation system）
ＰＣＲでは、鋳型ＤＮＡにプライマーがアニールした後、ＤＮＡポリメラーゼにより５’から３’に相補鎖ＤＮＡが合成される。プライマーの３’末塩基にミスマッチがあると、ＰＣＲの効率が低下する、即ち電気泳動的に観察不可能になる。ＡＲＭＳは本原理を利用するものであり、プライマーの３’末塩基が検出したい変異塩基に相補的なものを用いてＰＣＲを行い、増幅産物の有無を検出できる。
７）ＤＧＧＥ（denaturing gradient gel electrophoresis、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法）
ＰＣＲ産物中のミスマッチを待つヘテロデュプレックスが、ホモデュプレックスよりもその解離が容易であることを利用した方法である。解離が進むにつれ、ゲル電気泳動の移動度が落ちるので、展開するポリアクリルアミドゲルに尿素およびホルムアミドの密度勾配をつけることによりそれがさらに強調され、ミスマッチを含む２本鎖ＤＮＡの存在、即ち変異の存在が検出される。
８）ＲＮase切断法
ＲＮaseＡ（ＲＮＡ分解酵素）は２本鎖のＲＮＡもしくはＲＮＡ／ＤＮＡコンプレックスを分解せず、１本鎖のＲＮＡのみを分解する特性を有する。従って、例えば３２Ｐにより標識したＲＮＡプローブを１本鎖変性したサンプルＤＮＡとハイブリダイズさせ、ＲＮaseＡ処理後、電気泳動により展開すれば、変異型とハイブリダイズしたＲＮＡプローブはミスマッチ部位で切断されるので、２本のバンドとして検出できる。
９）化学切断（chemical cleavage）法
２本鎖ＤＮＡのミスマッチ部位の「Ｃ」に対してはヒドロキシルアミン、「Ｔ」に対してはオスミウムテトラオキシドで別個に修飾した後、ピペリジン処理をすると糖が切断される。標識プローブを用いて２本鎖を形成させ、本処理後、電気泳動し、プローブのサイズが短くなれば変異が検出されたことになる。
１０）リガーゼ法
２つのオリゴヌクレオチドをＤＮＡリガーゼで連結するとき、結合位置に鋳型ＤＮＡとの間にミスマッチがあると、結合できないことが原理である。
i）ＬＭＧＤ（ligase−mediated gene detection）法
一方のオリゴＤＮＡは例えば３２Ｐ標識、他方はビオチン標識し、ライゲーション後、ストレプトアビジン吸着による回収を行なう。これらが連結する（即ち、ミスマッチしない）ならば、３２Ｐの放射線量が高値を示すので、検出することができる。
ii）ＬＣＲ（ligase chain reaction）
上記のライゲーション反応を、耐熱性のリガーゼを用いて繰り返し行なうことで、ＰＣＲと同様にＤＮＡ鎖に対してもオリゴＤＮＡがアニールするので、高感度に変異の検出が可能となる。
実施例
実施例１
ＴＮＦ−α産生能の比較：
日本人の健常人９名より分離したＰＢＭＣ（末梢血単核球）１×１０6を培地（ＲＰＭＩ１６４０＋５％ＦＣＳ）１mlに浮遊し、ＣonＡ（コンカナバリン（Ｃoncanavaline）Ａ:１０μg／ml）により刺激し、３７℃で２０時間培養後、上清中の産生されたＴＮＦ−α濃度をＥＬＩＳＡ法にて測定した。結果を図１に示す。
ＣonＡ刺激によるＰＢＭＣのＴＮＦ−α産生量は日本人健常人９名で著しい差があることを見出した。
実施例２
ＴＮＦ−α遺伝子プロモーター領域における多型の解析：
実施例１と同様に分離したＰＢＭＣによりゲノムＤＮＡを分離し、ＰＣＲ法にてＴＮＦ−α遺伝子プロモーター領域（約１．３Ｋbp）を増幅したあと、さらにＴＡクローニング法にて増幅し全塩基配列の決定を行ない、多型の有無を解析した。結果を図２及び図７に示す。図７は、独自に構築したコンセンサス配列（配列番号９）に対してケース２Ｘおよび２Ｙをアライメントさせた図である。
上記９名の配列比較により、ＴＮＦ−α遺伝子プロモーター領域に現在までに報告されていない多型が３カ所存在することを見出した。
実施例３
多型プロモーターの活性：
これらのＴＮＦ−α遺伝子プロモーター領域の−８５７、−８６３、および−１０３１位における多型は、ＴＮＦ−α高産生者に高頻度にみられた。
そこで、−８５７、−８６３、−１０３１位のいずれかに多型を認めるものといずれにも認めないものでＴＮＦ−α産生能を比較した。その結果、前者において有意にＴＮＦ−α産生能が高いことが統計的に認められた（p値＝０．０５:Ｍann ＷhitneyのＵ検定）（図３）。
次にこれら多型のうちの−８５７位に多型をもつものと−８６３および−１０３１位に多型をもつものと２種類について、そのプロモーター活性をレポーター遺伝子を用いて次のように測定し、比較した。
ＴＮＦ−α遺伝子プロモーター領域を、レポーターベクター（ＰＧＬ−３:ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含む）に挿入し、対照ベクター（pＲＬ−ＴＫ:レニラルシフェラーゼ遺伝子を含む）とともにヒトＴ細胞白血病株Ｊurkatにエレクトロポレーションにて同時トランスフェクションし、１８時間培養した。その後Ｆicoll比重遠心法にて生細胞のみ分離し、細胞溶解したあと２種類のルシフェラーゼ活性をルミノメーターで測定した（図４）。プロモーター活性は、対照ベクターのルシフェラーゼ活性に対する比より決定した。
結果を表１に示す。−８５７位に多型を有するＴＮＦ−α遺伝子プロモーター（pＧＬ−ＴＮＦp２Ｘ）、および−８６３と−１０３１位に多型を有するプロモーター（pＧＬ−ＴＮＦp２Ｙ）は保存配列より約２倍強いプロモーター活性を有する。
ＡＳＯハイブリダイゼーション法によるＴＮＦ−α遺伝子プロモーター領域多型の解析：
−８５７、−８６３および−１０３１位の多型について、ＡＳＯハイブリダイゼーション法により解析した。実施例２と同様にゲノムＤＮＡより、ＰＣＲ法にてＴＮＦ−α遺伝子プロモーター領域を増幅したのち、ナイロンフィルターにドットスポットし、ＵＶクロスリンカーで固定した。ＡＳＯプローブの塩基配列を以下に示す。
これらをγ32−Ｐ−ＡＴＰで末端標識して用いた。ハイブリダイゼーションは、ＴＭＡＣ（テトラメチルアンモニウムクロライド）存在下で行った。結果を図６および表２に示す。図２に示した塩基配列の結果と完全に一致する結果が得られた。
健常人のＴＮＦ−α遺伝子５’フランキング領域多型
日本人の健常人５７５人について、−２３８、−３０８、−８５７、−８６３、および−１０３１位の多型について、実施例４と同様にしてＡＳＯハイブリダイゼーション法により解析した。結果を表３に示す。
実施例６
若年性関節リウマチとＴＮＦ−α遺伝子５’フランキング領域多型との関係
１１２人の若年性関節リウマチ（ＪＲＡ）患者（全身性および非全身性）における−８５７位および−１０３１位の多型を、健常人の場合と比較した（表４）。
全身性リウマチ患者では、健常人と比較して−８５７／Ｔ＋と−８５７Ｔ−との比、および−１０３１／Ｃ＋と−１０３１／Ｃ−との比が有意に異なることがわかる。このことは、−８５７位または−１０３１位におけるヌクレオチドの変化を調べることによって若年性全身性関節リウマチが診断できることを示唆するものである。
実施例７
慢性関節リウマチとＴＮＦ−α遺伝子５’フランキング領域多型との関係
慢性関節リウマチ（ＲＡ）患者（３８７人）および健常者（５７５人）について、ＴＮＦ−β遺伝子の−１０３１位、−８６３位、−８５７位、−３０８位および−２３８位における多型を分析した。結果を表５に示す。
実施例８
慢性リウマチ患者の臨床的特徴とＴＮＦ−α遺伝子５’フランキング領域の多型との関係
慢性リウマチ（ＲＡ）患者において、−１０３１Ｃ、−８６３Ａ、−８５７Ｔの有無と、その患者の臨床的特徴（関節点数（Ｌansbury評価法），腫膿関節数、疼痛関節数、顕微鏡下血尿）との関係を調べた。結果を表６に示す。
実施例９
インシュリン依存性糖尿病とＴＮＦ−α遺伝子５’フランキング領域多型との関係
インシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）患者（１４０人）および健常者（５７５人）について、ＴＮＦ−α遺伝子の−８５７位、−８６３位および−１０３１位置における多型を分析した。結果を表７に示す。
実施例１０
インシュリン非依存性糖尿病とＴＮＦ−α遺伝子５’フランキング領域多型との関係（１）
肥満しているインシュリン非依存性糖尿病患者（ＮＩＤＤＭ＋）（５９人）および健常者（ＮＩＤＤＭ−）（９６人）について、ＴＮＦ−α遺伝子の−８５７位における多型を分析した。結果を表８に示す。
このことは肥満している人では、ＴＮＦ−α遺伝子の−８５７位における多型が糖尿病に関与していることを示すものである。
実施例１１
インシュリン非依存性糖尿病とＴＮＦ−α遺伝子５’フランキング領域多型との関係（２）
肥満していない、インシュリン非依存性糖尿病患者（ＮＩＤＤＭ＋）（１５４人）および健常者（ＮＩＤＤＭ−）（１９５人）について、ＴＮＦ−α遺伝子の−１０３１位および−８６３位における多型を調べた。結果を表９に示す。
このことは肥満していない人では、ＴＮＦ−α遺伝子の−１０３１位、−８６３位における多型が糖尿病に関与していることを示す。
実施例１２
ＨＬＡのＤＲＢ１アレルとＴＮＦ−αの遺伝子５’フランキング領域多型との関係
ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）のＤＲＢ１には多数の多型が存在することが知られている。そこでＨＬＡのＤＲＢ１アレルと本願発明に係るＴＮＦ−α遺伝子５’フランキング領域における多型との関係を調べた。
またアレルＢ＋とはアレルＢを言い、アレルＢ−とはアレルＢではないもの（すなわちアレルＡ、Ｃ、ＤまたはＥ）を言う。同様にアレルＤ＋とはアレルＤを指し、アレルＤ−とはアレルＤでないもの（すなわちアレルＡ、Ｂ、ＣまたはＥ）を言う。アレルＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥについては実施例５を参照。
表から明らかなように、ＨＬＡのＤＲＢ１ ０９０１−とアレルＢ−、およびＨＬＡのＤＲＢ１ ０４０５−とアレルＤ−には強い相関性が認められる。図５に示すように、ＴＮＦ−αの５’フランキング領域は、染色体上ＨＬＡクラスＩとクラスIIとの間に位置しているので、ＨＬＡとＴＮＦ−αプロモーターは連鎖している可能性がある。
一方、従来からＨＬＡと疾患感受性との関係が指摘されている（「医科免疫学」改訂第４版、１０７頁、菊地浩吉編、南江堂）。例えばＨＬＡのＤＲＢ１ ４０５を有する人は、慢性関節リウマチ、尋常性天疱瘡、糖尿病、原田病、Ｃｒｏｈｎ病等に対する感受性が強いとされる。従って、ＴＮＦ−α遺伝子５’フランキング領域の多型を調べることによってこれらの病気の事前診断を行うことのできる可能性が示唆される。
以上のように、本発明のＴＮＦ−αが関与する疾患遺伝子多型のスクリーニング方法により、或る個体のＴＮＦ−α遺伝子５’フランキング領域内の特定の位置でのヌクレオチド変化を測定すれば、その個体のＴＮＦ−α産生能、ひいてはＴＮＦ−αが関与する疾患の事前診断や予後の判定を行うことができる。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
配列の長さ：１９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
配列の長さ：１８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
配列の長さ：１８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
配列の長さ：１８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
配列の長さ：１８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
配列の長さ：１８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
配列の長さ：１８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
配列の長さ：１３５７
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｇenomic ＤＮＡ
起源
生物名：ヒト
配列
Claims (4)
- ヒトＴＮＦ−α遺伝子の５’フランキング領域内のヌクレオチド変化であって、−８５７位のシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への変化の有無を検出し、変化があった場合は慢性関節リウマチ、またはインシュリン非依存性糖尿病の感受性であると判断する、遺伝子多型のスクリーニング方法。
- ヒトＴＮＦ−α遺伝子の５’フランキング領域内のヌクレオチド変化であって、−８６３位のシトシン（Ｃ）からアデニン（Ａ）への変化、および−１０３１位のチミン（Ｔ）からシトシン（Ｃ）への変化の有無を検出し、変化があった場合はＨＬＡ ＤＲＢ１＊０４０５陰性の慢性関節リウマチの腎臓合併症の感受性であると判断する、遺伝子多型のスクリーニング方法。
- ヒトＴＮＦ−α遺伝子の５’フランキング領域内のヌクレオチド変化であって、−８５７位のシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への変化、および−１０３１位のチミン（Ｔ）からシトシン（Ｃ）への変化の有無を検出し、変化があった場合は若年性全身性関節リウマチの感受性であると判断する、遺伝子多型のスクリーニング方法。
- ヒトＴＮＦ−α遺伝子の５’フランキング領域内のヌクレオチド変化であって、−８５７位のシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への変化、−８６３位のシトシン（Ｃ）からアデニン（Ａ）への変化、および−１０３１位のチミン（Ｔ）からシトシン（Ｃ）への変化の有無を検出し、変化があった場合はインシュリン依存性糖尿病の感受性であると判断する、遺伝子多型のスクリーニング方法。
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