JP2001522586A

JP2001522586A - 慢性閉塞性気道疾患に対する診断法および治療法

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Publication number: JP2001522586A
Application number: JP2000519607A
Authority: JP
Inventors: ダフ，ゴードン・ダブリュー; ジョバイン，マルコ; バーネス，ピーター・ジェイ; リム，サイモン
Original assignee: インターロイキン・ジェネティクス・インコーポレーテッド
Priority date: 1997-11-07
Filing date: 1998-11-09
Publication date: 2001-11-20
Also published as: IL135957A0; TR200001263T2; WO1999024615A3; CA2308570A1; PL340624A1; ES2297900T3; AU1386399A; HUP0301197A2; NO20002176L; BR9813950A; EP1029079A2; ATE383438T1; AU760856B2; WO1999024615A2; NO20002176D0; EP1029079B1

Abstract

(57)【要約】被験者が慢性閉塞性気道疾患を発生する罹患性と共に、疾患の相対的重症度を予測する、多型を検出するための方法およびキットが記載される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】１．発明の背景喘息は、気道の炎症および反応性亢進から生じる可逆的な気流閉塞のための、
咳、胸苦しさ、息切れ、および喘鳴をすることにより特徴付けられる慢性肺疾患
である。敏感な個人において、アレルゲンの吸入は気道裏打ち（ｌｉｎｉｎｇ）
の炎症を生じ、そして喘息の突発を促進する可能性がある。喘息はまた、気道感
染など、他の炎症性刺激の結果起こる可能性もある。特定の食物に敏感になった
個人は、これらの物質の摂取後、ひどいそして命を脅かす可能性がある反応を起
こす可能性がある。喘息は、かつて「単純な」過敏反応と考えられていたが、現
在、おそらく広い範囲の原因および寄与する要因を持ち、その中心的特性として
気道炎症がある、複雑な状態であることが知られている。肺の研究者は、多くの
相互作用する側面があるという意味で、喘息をアテローム性動脈硬化症に例えて
いる。寄与する要因の多くは、現在、喘息過程で起こる化学反応；細胞−細胞伝
達の性質、１つの細胞または１つの種類の細胞から別のものに情報が送られる方
法；および反応性または他の上皮細胞の役割を含め、徹底的な研究下にある。ア
レルギーは、喘息症状の発生および重症度の両方に寄与する。アレルギー（即時
過敏症としても知られる）は、通常寛容されそして一般的に無害であると見なさ
れる物質に対する異常な敏感さとして、そして誘発事象が用量非依存性であるた
め、物質に対する用量依存性特異体質反応とは対照的であるとして定義される。
すべての免疫反応は、異物に対する曝露の結果として起こるが、アレルギー性反
応は免疫感作または天然感染により与えられる防御的または亢進された「免疫性
」とは異なる。喘息の子供の約４分の１のみが、気道が成人の大きさに達したと
き、該異常を脱する；残りにとって、該異常は一生の苦難である。米国肺協会（
ＡｍｅｒｉｃａｎＬｕｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）により公表された研究
報告によれば、該異常は、女性の８５パーセントおよび男性の７２パーセントで
持続する（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｌｌｅｒｇｙａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌ
ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＶｏｌ．９６：５１１／９６）。

【０００２】１９９３年に記録されている喘息による死亡は米国のみで４，９６４件であっ
た。子供の喘息死亡の発生は、１９８０年から１９９３年に倍になった。１５お
よび２４歳の間の年齢の人の間で、死亡数は、１９８０年の１００万人当たり２
．５件から１９９３年の１００万人当たり５．２件に上昇した。１９９３年には
、喘息は３４２件の死亡、および年齢２５歳以下の人のおよそ１９８，０００の
入院の原因となった。

【０００３】喘息のための死亡の２１パーセントをアフリカ系アメリカ人が占める。アフリ
カ系アメリカ人の子供は、白人系の子供より、喘息で死ぬ可能性が４倍高い。１
５および２４歳の間のアフリカ系アメリカ人男性は、死亡の最大の危険性を有す
る。

【０００４】家族歴が陽性であることは、喘息に関連付けられる最も強い危険因子の１つで
ある。陽性の同定はしかし、困難である可能性がある。喘息は、先天的異常、感
染性異常、および嚢胞性線維症などの他の異常と共存する可能性がある。病歴が
変則的であるかまたはすぐれた医学的管理に対する反応が劣っている場合、さら
なる指標が考慮される。本疾患の管理に経験が少ない医師は、根底にある原因が
喘息であると気づかずに、これらの症状を感染として治療する可能性がある。

【０００５】子供における喘息の同定は、臨床的手がかりに関する両親の観察に非常に頼っ
ている。正しい同定には、小児喘息の特異性を認識する喘息およびアレルギー専
門家が必要である。胸苦しさなどのより微妙な喘息徴候は、特に子供により、見
逃される可能性がある。再発するまたは定期的な咳発作は、小さい子供における
喘息の唯一よく見られる観察可能な症状である可能性がある。しかし、気管支拡
張療法に対する好ましい臨床反応の立証は、喘息の存在を確認するのを補助する
可能性がある。

【０００６】一般的に、喘息に対し罹患性である人の早期の同定に関する、非常な必要性が
ある。ＣＯＡＤは治療しなければ慢性および進行性疾患であるため、早期同定に
より、最も速い段階での適切な治療の執行が容易になり、それにより、有望な結
果の可能性が増加するであろう。

【０００７】２．発明の概要１つの側面において、本発明は、被験者が慢性閉塞性気道疾患を発生する罹患
性を決定するための、または該被験者における慢性閉塞性気道疾患の迅速性およ
び／または究極的な進行に対し予測するためのアッセイを特徴とする。１つの態
様において、該方法は、被験者から得た核酸試料の遺伝子型を決定し、ＩＬ−１
炎症誘発性ハプロタイプの少なくとも１つの対立遺伝子を決定する段階を含む。

【０００８】例えば、ＩＬ−１炎症誘発性ハプロタイプの対立遺伝子は：１）核酸試料およ
び被験者におけるＩＬ−１ハプロタイプの対立遺伝子に対しハイブリダイズする
ことが可能である単数または複数のプローブの間のハイブリダイゼーション反応
を行うこと；２）ＩＬ−１ハプロタイプの少なくとも１つの対立遺伝子の少なく
とも一部の配列を決定すること；または３）ＩＬ−１ハプロタイプの少なくとも
１つの対立遺伝子またはそれらの構成要素の電気泳動移動度を測定することによ
り、検出することが可能である。別の好ましい態様において、検出段階を行う前
に、ＩＬ−１ハプロタイプの構成要素を増幅段階にさらす。好ましい増幅段階は
：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅
（ＳＤＡ）、クローニング、および上記の変形（例えば、ＲＴ−ＰＣＲおよび対
立遺伝子特異的増幅）からなる群より選択される。特に好ましい態様において、
試料を、ＩＬ−１ハプロタイプの対立遺伝子のセンスまたはアンチセンスに対し
５’および３’にハイブリダイズする一組のプライマーとハイブリダイズさせ、
そしてＰＣＲ増幅にさらす。

【０００９】別の側面において、本発明は、上述のアッセイを行うためのキットを特徴とす
る。該キットは、ＤＮＡ試料収集手段および被験者のＩＬ−１ハプロタイプの少
なくとも１つの対立遺伝子を決定するための手段を含んでもよい。該キットはま
た、コントロール試料または標準も含んでもよい。

【００１０】本明細書に記載されるアッセイおよびキットを用いて得られた情報は（単独で
、または慢性閉塞性気道疾患に寄与する、別の遺伝的欠陥または環境的要因に関
する情報と共に）、被験者が慢性閉塞性気道疾患を発生する可能性が高いかどう
かを予測するのに有用である。さらに、該情報は単独で、または慢性閉塞性気道
疾患に寄与する、別の遺伝的欠陥に関する情報（慢性閉塞性気道疾患の遺伝的プ
ロフィール）と共に、該個人の遺伝的プロフィールに対し治療をあつらえること
を可能にする。例えば、本情報は医師が：１）慢性閉塞性気道疾患を生じるカス
ケードの分子的基礎に注意を向けた薬剤をより効果的に処方し；そして２）特定
の患者に対する特定の薬剤の適切な投薬量をよりよく決定するのを可能にするこ
とができる。最大の臨床利益を示すと期待される患者集団を標的とすることがで
きれば：１）期待に反する市場結果の市場化された薬剤の再配置；２）患者サブ
グループ特異的である、安全性または効能制限の結果として臨床的開発が中断さ
れている、薬剤候補の救出；および３）薬剤候補の加速したそしてより安価な開
発およびより最適な薬剤標識を可能にすることができる。

【００１１】本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および請求項により明白と
なるであろう。

【００１２】３．発明の詳細な説明３．１定義便宜のため、本明細書、実施例、および付随する請求の範囲に使用される特定
の用語および句の意味を以下に提供する。

【００１３】「対立遺伝子（Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）」という用語は、特定のマーカーでの
遺伝子の代替型を指す。被験者が２つの同一の対立遺伝子を有する場合、該被験
者はホモ接合体であると言われる。被験者が２つの異なる対立遺伝子を有する場
合、該被験者はヘテロ接合体であると言われる。

【００１４】「慢性閉塞性肺疾患」または「慢性閉塞性気道疾患」（ＣＯＡＤ）は、共通の
気流制限または気流閉塞を有する異常の複合体を記述するのに用いられる用語で
ある。ＣＯＡＤには、喘息、気腫、慢性気管支炎および慢性細気管支炎が含まれ
る。ＣＯＡＤにおける気道閉塞の部位は、上部気道から最も末梢の細気管支まで
多様である。気道疾患のほとんどの正確な原因はよく理解されていない。気道疾
患の定義が混乱を増している。慢性気管支炎は、臨床的に咳および痰産生の慢性
的存在により定義されている。一方、気腫は、解剖学的に、肺組織の破壊および
肺胞嚢の増大に基づき定義されている。ＣＯＡＤはすべて疾患パラメーターとし
て気道狭窄を有し、そしてＣＯＡＤはまた、疾患過程の構成要素として炎症を共
有する。

【００１５】「遺伝子型決定」は、特定の疾患を生じるまたは特定の疾患に寄与する突然変
異または多型（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）を直接、または疾患を引き起こすま
たは疾患に寄与する遺伝子と連鎖不均衡にある突然変異または多型（マーカー）
の検出に基づき、同定するための、個人のゲノムＤＮＡ（またはそれに対応する
核酸）の解析を指す。

【００１６】「ハプロタイプ」という用語は、群として共に遺伝する（連鎖不均衡にある）
一組の対立遺伝子を指す。本明細書において、ハプロタイプは、統計学的に有意
なレベル（Ｐ_corr≦０．０５）で出現するハプロタイプを含むと定義される。本
明細書において、「ＩＬ−１ハプロタイプ」という句は、ＩＬ−１Ａ、ＩＬ−１
ＢおよびＩＬ−１ＲＮ遺伝子の対立遺伝子およびそれらと不均衡にあるマーカー
を含むＩＬ−１遺伝子座におけるハプロタイプを指す。「炎症誘発性ＩＬ−１ハ
プロタイプ」は、炎症誘発性放出および／または活性過剰（例えば、機能的なＩ
Ｌ−１αおよび／またはＩＬ−１βの上方制御および／または機能的なＩＬ−１
受容体アンタゴニストの下方制御）と関連付けられるハプロタイプを指す。

【００１７】「連鎖不均衡」は、既定のコントロール集団における各対立遺伝子出現の独立
した頻度から期待されるであろうより、高い頻度で２つの対立遺伝子が共遺伝す
ることを指す。独立して遺伝する２つの対立遺伝子の期待される出現頻度は、第
一の対立遺伝子の頻度に第二の対立遺伝子の頻度を乗じたものである。期待され
る頻度で共出現する対立遺伝子は、「連鎖均衡」にあると言われる。

【００１８】連鎖不均衡にある多型性マーカーの例には：ＩＬ−１Ｂ対立遺伝子２（−５１
１）、ＩＬ−１Ａ対立遺伝子４（２２２／２２３）、ＩＬ−１Ａ対立遺伝子１（
ｇｚ５／ｇｚ６）、ＩＬ−１Ａ対立遺伝子１（−８８９）、ＩＬ−１Ｂ対立遺伝
子２（＋６９１２）、ＩＬ−１Ｂ対立遺伝子１（＋３９５４）、ＩＬ−１Ｂ／Ｉ
Ｌ−１ＲＮ遺伝子間領域（ｇａａｔ．ｐ３３３３０）および（Ｙ３１）、ＩＬ−
１ＲＮ対立遺伝子２（＋２０１８）、ＩＬ−１ＲＮ対立遺伝子２（ＶＮＴＲ）お
よびＩＬ−１ＲＮ対立遺伝子２（ＶＮＴＲ）と連鎖不均衡にある３つの多型が含
まれる（Ｃｌａｙら，（１９９６）ＨｕｍＧｅｎｅｔ９７：７２３−７２６
を参照されたい）。

【００１９】「多型性」という用語は、遺伝子またはその部分（例えば対立遺伝子変異体）
の１つ以上の型の共存を指す。少なくとも２つの異なる型、すなわち２つの異な
るヌクレオチド配列がある遺伝子部分は、「遺伝子の多型領域」と呼ばれる。多
型領域は、異なる対立遺伝子でその同一性が異なる、単一のヌクレオチドであっ
てもよい。多型領域はまた、長さ数ヌクレオチドであってもよい。

【００２０】３．２予測医学３．２．１予後アッセイおよびキット以下の実施例に詳細に記載される、ＩＬ−１Ｂ対立遺伝子２（＋３９５４）お
よびＩＬ−１Ｂ対立遺伝子２（−５１１）が喘息と有意に関連付けられるという
発見に基づき、本発明は、被験者が慢性閉塞性気道疾患を有するまたは発生する
可能性があるかどうかを決定するための、および／または被験者におけるこうし
た疾患の度合いまたは進行を予測するための方法およびキットを提供する。

【００２１】１つの態様において、該方法は、被験者から得た核酸試料の遺伝子型を決定し
、ＩＬ−１炎症誘発性ハプロタイプの少なくとも１つの対立遺伝子を検出するこ
とを含む。例えば、ＩＬ−１炎症誘発性ハプロタイプの対立遺伝子は、例えば、
ＩＬ−１遺伝子またはタンパク質の転写速度またはｍＲＮＡおよび／またはタン
パク質レベルを、例えばノーザンブロット解析、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（
ＲＴ−ＰＣＲ）、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション、免疫沈降、ウェスタ
ンブロットハイブリダイゼーション、または免疫組織化学により、測定すること
によって、検出することが可能である。１つの方法にしたがい、細胞を被験者か
ら得、そしてＩＬ−１タンパク質またはｍＲＮＡレベルを測定し、そして健康な
被験者におけるＩＬ−１タンパク質またはｍＲＮＡのレベルと比較する。

【００２２】別の態様において、該方法は、ＩＬ−１タンパク質の少なくとも１つの活性を
測定することを含む。例えば、被験者のＩＬ−１αまたはβタンパク質の受容体
との親和性定数を測定してもよい。得られた結果をその後、慢性閉塞性気道疾患
を有することが知られる被験者に行った同じ解析からの結果と比較してもよい。

【００２３】好ましい態様において、該方法は、被験者から得られた核酸試料の遺伝子型を
決定し、ＩＬ−１炎症誘発性ハプロタイプの少なくとも１つの対立遺伝子を決定
することとして特徴付けられる。典型的な態様において、ＩＬ−１炎症誘発性ハ
プロタイプの少なくとも１つの対立遺伝子のセンスまたはアンチセンス配列に対
しハイブリダイズすることが可能であるヌクレオチド配列の領域を含む核酸プロ
ーブを含む核酸組成物が提供される。例えば、核酸を、ハイブリダイゼーション
可能なようにしてもよく、プローブを試料の核酸に接触させてもよく、そしてプ
ローブの試料核酸へのハイブリダイゼーションを検出してもよい。こうした技術
を用い、ゲノムまたはｍＲＮＡレベルのどちらかで、改変または対立遺伝子変異
体（ｖａｒｉａｎｔ）を検出すると共にｍＲＮＡ転写レベルを測定してもよい。

【００２４】好ましい検出法は、ＩＬ−１炎症誘発性ハプロタイプの少なくとも１つの対立
遺伝子の領域と一致し、そして突然変異または多型領域の周りに約５、１０、２
０、２５、または３０ヌクレオチドを有するプローブを用いた対立遺伝子特異的
ハイブリダイゼーションである。本発明の好ましい態様において、慢性閉塞性気
道疾患に関与する他の対立遺伝子変異体に特異的にハイブリダイズすることが可
能ないくつかのプローブを固体相支持体、例えば「チップ」（最大約２５０，０
００のオリゴヌクレオチドを保持することが可能である）に付着させる。オリゴ
ヌクレオチドは、石版印刷（ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ）を含む、多様な方法によ
り固体支持体に結合させてもよい。オリゴヌクレオチドを含むこれらのチップを
用いた突然変異検出解析はまた、「ＤＮＡプローブアレイ」とも呼ばれ、例えば
Ｃｒｏｎｉｎら（１９９６）ＨｕｍａｎＭｕｔａｔｉｏｎ７：２４４に記載
される。１つの態様において、チップは、遺伝子の少なくとも１つの多型領域の
すべての対立遺伝子変異体を含む。固体支持体をその後、試験核酸と接触させ、
そして特定のプローブに対するハイブリダイゼーションを検出する。したがって
、１つまたはそれ以上の遺伝子の非常に多くの対立遺伝子変異体の同一性を、単
純なハイブリダイゼーション実験で同定することが可能である。

【００２５】これらの技術はまた、解析前に核酸を増幅する段階を含んでもよい。増幅技術
は当業者に知られ、そして限定されるわけではないが、クローニング、ポリメラ
ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、特定の対立遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応（ＡＳＡ）
、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、入れ子式（ｎｅｓｔｅｄ）ポリメラーゼ連鎖反
応、自己維持配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ，Ｊ．Ｃ．ら，１９９０，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：１８７４−１８７８
）、転写増幅系（Ｋｗｏｈ，Ｄ．Ｙ．ら，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：１１７３−１１７７）、およびＱ
−ベータレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ，Ｐ．Ｍ．ら，１９８８，Ｂｉｏ
／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：１１９７）を含む。

【００２６】ＰＣＲ反応に使用するのに特に好ましいプライマーには：

【００２７】

【化１】

【００２８】が含まれる。

【００２９】増幅産物は、大きさ解析、制限消化後の大きさ解析、反応産物中の特定のタグ
化オリゴヌクレオチドプライマーの検出、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド
（ＡＳＯ）ハイブリダイゼーション、対立遺伝子特異的５’エキソヌクレアーゼ
検出、配列決定、ハイブリダイゼーション、およびそれらに匹敵するものを含む
、多様な方法でアッセイしてもよい。

【００３０】ＰＣＲに基づく検出手段は、同時に多数のマーカーの多重増幅を含んでもよい
。例えば、大きさが重なり合わずそして同時に解析することが可能であるＰＣＲ
産物を生成するＰＣＲプライマーを選択することが、当業に周知である。あるい
は、区別して標識され、そしてしたがって、各々を区別して検出することが可能
であるプライマーで、異なるマーカーを増幅することが可能である。もちろん、
ハイブリダイゼーションに基づく検出手段は、試料中の多数のＰＣＲ産物の区別
的検出を可能にする。多数のマーカーの多重解析を可能にする他の技術が当業に
知られる。

【００３１】単なる例示的態様において、該方法は、（ｉ）患者から細胞試料を収集し、（
ｉｉ）試料細胞から核酸（例えばゲノム、ｍＲＮＡまたは両方）を単離し、（ｉ
ｉｉ）ＩＬ−１炎症誘発性ハプロタイプの少なくとも１つの対立遺伝子に対し５
’および３’に特異的にハイブリダイズする１つまたはそれ以上のプライマーと
該核酸試料を、対立遺伝子のハイブリダイゼーションおよび増幅が起こる条件下
で接触させ、そして（ｉｖ）増幅産物を検出する段階を含む。これらの検出計画
は、非常に少ない数で存在する核酸分子の検出に特に有用である。

【００３２】本アッセイの好ましい態様において、ＩＬ−１炎症誘発性ハプロタイプの対立
遺伝子は、制限酵素切断パターンの改変により同定される。例えば、試料および
コントロールＤＮＡを単離し、増幅し（所望による）、１つまたはそれ以上の制
限エンドヌクレアーゼで消化し、そして断片長の大きさをゲル電気泳動により測
定する。

【００３３】さらに別の態様において、当業に知られる多様な配列決定反応のいずれを用い
、対立遺伝子の配列を直接決定してもよい。典型的な配列決定反応には、Ｍａｘ
ｉｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ
（１９７７）７４：５６０）またはＳａｎｇｅｒ（Ｓａｎｇｅｒら（１９７７）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７４：５４６３）により開発さ
れた技術に基づくものが含まれる。本アッセイを行う場合、質量分析による配列
決定（例えばＰＣＴ公開ＷＯ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎら（１９９６）Ａ
ｄｖＣｈｒｏｍａｔｏｇｒ３６：１２７−１６２；およびＧｒｉｆｆｉｎら
（１９９３）ＡｐｐｌＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３８：１４７
−１５９を参照されたい）を含む、多様な自動化配列決定法（Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ（１９９５）１９：４４８）のいずれを利用してもよいこともまた、
意図される。当業者には、特定の態様に関し、配列決定反応において、核酸塩基
の１つ、２つまたは３つのみの出現が決定される必要があることが明白であろう
。例えば、１つのみの核酸が検出される、Ａ−トラックまたはそれに匹敵するも
のを実行してもよい。

【００３４】さらなる態様において、切断剤（例えばヌクレアーゼ、ヒドロキシルアミンま
たは四酸化オスミウムおよびピペリジンでのもの）からの防御を用い、ＲＮＡ／
ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡまたはＤＮＡ／ＤＮＡ異種二重鎖におけるミスマッ
チ塩基を検出してもよい（Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０：
１２４２）。一般的に「ミスマッチ切断」の当業技術は、野生型対立遺伝子を含
む（標識）ＲＮＡまたはＤＮＡを試料とハイブリダイズすることにより形成され
る異種二重鎖を提供することにより、開始する。コントロールおよび試料鎖の間
の塩基対ミスマッチのために存在するであろうものなどの、二重鎖の一本鎖領域
を切断する剤で、二重鎖を処理する。例えば、ミスマッチ領域を酵素的に消化す
るため、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖をＲＮａｓｅで処理してもよく、そしてＤＮＡ／
ＤＮＡハイブリッドをＳ１ヌクレアーゼで処理してもよい。他の態様において、
ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を、ミスマッチ領域を消化するため
、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムおよびピペリジンで処理してもよ
い。ミスマッチ領域の消化後、生じた成分をその後、変性ポリアクリルアミドゲ
ル上で大きさにより分離し、突然変異部位を決定する。例えば、Ｃｏｔｔｏｎら
（１９８８）Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８５：４３９
７；Ｓａｌｅｅｂａら（１９９２）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．２１７
：２８６−２９５を参照されたい。好ましい態様において、コントロールＤＮＡ
またはＲＮＡを検出のため標識してもよい。

【００３５】さらに別の態様において、ミスマッチ切断反応は、二重鎖ＤＮＡにおけるミス
マッチ塩基対を認識する１つまたはそれ以上のタンパク質（いわゆる「ＤＮＡミ
スマッチ修復」酵素）を使用する。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｍｕｔＹ
酵素はＧ／ＡミスマッチのＡを切断し、そしてＨｅＬａ細胞由来のチミジンＤＮ
ＡグリコシラーゼはＧ／ＴミスマッチのＴを切断する（Ｈｓｕら（１９９４）Ｃ
ａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ１５：１６５７−１６６２）。典型的な態様にし
たがい、炎症誘発性ハプロタイプの対立遺伝子に基づくプローブを、試験細胞由
来のｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ産物にハイブリダイズさせる。二重鎖をＤＮＡミ
スマッチ修復酵素で処理し、そしてあるとすれば切断産物を電気泳動プロトコル
またはそれに匹敵するもので検出してもよい。例えば米国特許第５，４５９，０
３９号を参照されたい。

【００３６】他の態様において、電気泳動移動度の改変を用いＩＬ−１β対立遺伝子２（−
５１１）が同定されるであろう。例えば、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）を用
い、突然変異体および野生型核酸の間の電気泳動移動度の相違を検出してもよい
（Ｏｒｉｔａら（１９８９）ＰｒｏｃＮａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳ
Ａ８６：２７６６、またＣｏｔｔｏｎ（１９９３）ＭｕｔａｔＲｅｓ２８
５：１２５−１４４；およびＨａｙａｓｈｉ（１９９２）ＧｅｎｅｔＡｎａｌ
ＴｅｃｈＡｐｐｌ９：７３−７９も参照されたい）。試料およびコントロ
ールＩＬ−１β対立遺伝子（−５１１）の一本鎖ＤＮＡ断片を変成し、そして再
結合させる。一本鎖核酸の二次構造は、配列にしたがい多様であり、生じた電気
泳動移動度の改変により単一の塩基変化であっても検出が可能になる。ＤＮＡ断
片を標識プローブで標識しまたは検出してもよい。アッセイ感度は、（ＤＮＡよ
りも）二次構造が配列変化に対し、より感度が高いＲＮＡを用いることにより亢
進される可能性がある。好ましい態様において、本方法は、異種二重鎖解析を利
用し、電気泳動移動度の変化に基づき、異種二重鎖を分離する（Ｋｅｅｎら（１
９９１）ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ７：５）。

【００３７】さらに別の態様において、変成剤の勾配を含むポリアクリルアミドゲルにおけ
る対立遺伝子の動きを、変成勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を用い、アッセイす
る（Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ３１３：４９５）。ＤＧＧＥを解
析法として用いる場合、ＤＮＡは、例えばＰＣＲにより高融解ＧＣリッチＤＮＡ
のおよそ４０ｂｐのＧＣ留め具（ｃｌａｍｐ）を添加することにより、完全に変
成しないことを確実にするように、修飾されるであろう。さらなる態様において
、コントロールおよび試料ＤＮＡの移動度の相違を同定するため、変成剤勾配の
代わりに温度勾配を用いる（ＲｏｓｅｎｂａｕｍおよびＲｅｉｓｓｎｅｒ（１９
８７）ＢｉｏｐｈｙｓＣｈｅｍ２６５：１２７５３）。

【００３８】対立遺伝子を検出するための他の方法の例には、限定されるわけではないが、
選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的
プライマー伸長が含まれる。例えば、（例えば対立遺伝子変異体における）既知
の突然変異またはヌクレオチド相違が中央に置かれるオリゴヌクレオチドプライ
マーを調製し、そしてその後、完全な一致が見られる場合のみ、ハイブリダイゼ
ーションが許される条件下で、標的ＤＮＡとハイブリダイズさせてもよい（Ｓａ
ｉｋｉら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ３２４：１６３；Ｓａｉｋｉら（１９８９
）Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ８６：６２３０）。こ
うした対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション技術を用い
、オリゴヌクレオチドがＰＣＲ増幅標的ＤＮＡにハイブリダイズする場合、反応
当たり１つの突然変異または多型領域を、あるいはオリゴヌクレオチドがハイブ
リダイズ膜に付着し、そして標識標的ＤＮＡとハイブリダイズする場合、いくつ
かの異なる突然変異または多型領域を試験してもよい。

【００３９】あるいは、選択的ＰＣＲ増幅に頼る対立遺伝子特異的増幅技術を、本発明と共
に用いてもよい。特異的増幅のプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチド
は、目的の突然変異または多型領域を、（増幅が区別的ハイブリダイゼーション
次第であるように）該分子の中央に（Ｇｉｂｂｓら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ
ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１７：２４３７−２４４８）、または適切な条件下で
、ミスマッチがポリメラーゼ伸長を妨げまたは減少させる可能性がある、１つの
プライマーの最端の３’端に（Ｐｒｏｓｓｎｅｒ（１９９３）Ｔｉｂｔｅｃｈ
１１：２３８）、有してもよい。さらに、突然変異領域に新規制限部位を導入し
、切断に基づく検出を生成することが望ましい可能性がある（Ｇａｓｐａｒｉｎ
ｉら（１９９２）Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＰｒｏｂｅｓ６：１）。特定の態様に
おいて、増幅はまた、増幅にＴａｑリガーゼを用いて行ってもよいことが予想さ
れる（Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
ＵＳＡ８８：１８９）。こうした場合、連結は、５’配列の３’端に完全な
一致がある場合のみ起こり、増幅の有無を探すことにより、特定の部位での既知
の突然変異の存在を検出することが可能になる。

【００４０】別の態様において、対立遺伝子変異体の同定は、例えば米国特許第４，９９８
，６１７号およびＬａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｕら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１：１０
７７−１０８０（１９８８）に記載されるような、オリゴヌクレオチド連結アッ
セイ（ＯＬＡ）を用い行われる。ＯＬＡプロトコルは、標的の一本鎖の隣接配列
にハイブリダイズすることが可能であるように設計されている２つのオリゴヌク
レオチドを使用する。オリゴヌクレオチドの１つは、分離マーカーに連結、例え
ばビオチン化されており、そしてもう一方は、検出可能であるように標識されて
いる。正確な相補配列が標的分子中に見られる場合、オリゴヌクレオチドは、そ
の末端が隣接するようにハイブリダイズし、そして連結基質を生成するであろう
。その後、連結により、アビジンまたは別のビオチンリガンドを用い、標識オリ
ゴヌクレオチドを回収することが可能になる。Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ａ．ら
は、ＰＣＲおよびＯＬＡの特性を組み合わせた核酸検出アッセイを記載してきて
いる（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ａ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８７：８９２３−８９２７（１９９０））。本
方法において、ＰＣＲを用い、標的ＤＮＡの指数増幅を達成し、該増幅をその後
、ＯＬＡを用い検出する。

【００４１】本ＯＬＡ法に基づくいくつかの技術が開発されてきており、そしてＩＬ−１炎
症誘発性ハプロタイプの対立遺伝子を検出するのに用いてもよい。例えば、米国
特許第５，５９３，８２６号は、３’−アミノ基を有するオリゴヌクレオチドお
よび５’−リン酸化オリゴヌクレオチドを用いて、ホスホロアミデート（ｐｈｏ
ｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）連結を有する結合体を形成するＯＬＡを開示する。
Ｔｏｂｅら（（１９９６）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ２４：３７２
８）に記載される別のＯＬＡの変形において、ＰＣＲと組み合わせたＯＬＡによ
り、単一のマイクロタイターウェル中の２つの対立遺伝子の型決定が可能になる
。特有のハプテン、すなわちジゴキシゲニンおよびフルオレセインで、対立遺伝
子特異的プライマーの各々に印をつけることにより、異なる酵素リポーター、ア
ルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されている、ハ
プテン特異的抗体を用いることにより、各ＯＬＡ反応を検出してもよい。本系は
、２つの異なる色の産生を導く、高効率形式を用いた２つの対立遺伝子の検出を
可能にする。

【００４２】単一ヌクレオチド多型性の解析を容易にする、いくつかの方法が開発されてき
ている。１つの態様において、単一塩基多型性は、例えばＭｕｎｄｙ，Ｃ．Ｒ
．（米国特許第４，６５６，１２７号）に開示されるような、特殊化エキソヌク
レアーゼ耐性ヌクレオチドを用いることにより、検出してもよい。該方法にした
がい、多型部位に対しすぐ３’の対立遺伝子配列に相補的なプライマーを、特定
の動物またはヒトから得られた標的分子にハイブリダイズさせる。標的分子上の
多型部位が、存在する特定のエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド誘導体に相補
的なヌクレオチドを含むならば、その誘導体がハイブリダイズしたプライマーの
末端上に取り込まれるであろう。こうした取り込みにより、プライマーがエキソ
ヌクレアーゼに耐性となり、そしてそれにより、その検出が可能になる。該試料
のエキソヌクレアーゼ耐性誘導体の同一性が知られるため、プライマーがエキソ
ヌクレアーゼに耐性になったという発見は、標的分子の多型部位に存在するヌク
レオチドが、反応に用いられたヌクレオチド誘導体のものに相補的であったこと
を明らかにする。本方法は、大量の無関係な配列データの決定を必要としないと
いう利点を有する。

【００４３】本発明の別の態様において、多型部位のヌクレオチドの同一性を決定するのに
、溶液に基づく方法を用いる。Ｃｏｈｅｎ，Ｄ．ら（フランス特許第２，６５
０，８４０号；ＰＣＴ出願第ＷＯ９１／０２０８７号）。米国特許第４，６５６
，１２７号のＭｕｎｄｙ法におけるように、多型部位に対しすぐ３’の対立遺伝
子配列に相補的であるプライマーを使用する。該方法は、多型部位のヌクレオチ
ドに相補的であれば、プライマーの末端上に取り込まれるであろう標識ジデオキ
シヌクレオチド誘導体を用い、その部位のヌクレオチドの同一性を決定する。

【００４４】遺伝的小片解析（ＧｅｎｅｔｉｃＢｉｔＡｎａｌｙｓｉｓ）またはＧＢＡ ^TM として知られる代替法は、Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．ら（ＰＣＴ出願第９２／１５
７１２号）に記載されている。Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．らの方法は、標識ターミネ
ーターおよび多型部位に対し３’の配列に相補的であるプライマーの混合物を用
いる。取り込まれる標識ターミネーターは、したがって、評価される標的分子の
多型部分に存在するヌクレオチドにより決定され、そして該ヌクレオチドに相補
的である。Ｃｏｈｅｎら（フランス特許第２，６５０，８４０号；ＰＣＴ出願第
ＷＯ９１／０２０８７号）の方法と対照的に、Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．らの方法は
、好ましくは異種相アッセイであり、ここでプライマーまたは標的分子は固体相
に固定されている。

【００４５】近年、ＤＮＡ中の多型部位をアッセイするためのいくつかのプライマー誘導ヌ
クレオチド取り込み法が記載されてきている（Ｋｏｍｈｅｒ，Ｊ．Ｓ．ら，
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７：７７７９−７７８４（１９８９）
；Ｓｏｋｏｌｏｖ，Ｂ．Ｐ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１８：
３６７１（１９９０）；Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．−Ｃ．ら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ
８：６８４−６９２（１９９０）；Ｋｕｐｐｕｓｗａｍｙ，Ｍ．Ｎ．ら，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８８：１１
４３−１１４７（１９９１）；Ｐｒｅｚａｎｔ，Ｔ．Ｒ．ら，Ｈｕｍ．Ｍ
ｕｔａｔ．１：１５９−１６４（１９９２）；Ｕｇｏｚｚｏｌｉ，Ｌ．ら，
ＧＡＴＡ９：１０７−１１２（１９９２）；Ｎｙｒｅｎ，Ｐ．ら，Ａｎ
ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０８：１７１−１７５（１９９３））。これらの
方法は、これらがすべて、多型部位での塩基の間を識別するため、標識デオキシ
ヌクレオチドの取り込みに頼っている点で、ＧＢＡ^TMとは異なる。こうした形式
において、シグナルは取り込まれたデオキシヌクレオチドの数に比例するため、
同一ヌクレオチドが連続して出現する多型は、連続する長さに比例しているシグ
ナルを生じる可能性がある（Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．−Ｃ．ら，Ａｍｅｒ．
Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５２：４６−５９（１９９３））。

【００４６】タンパク質翻訳の未成熟な終結を生じる突然変異に関しては、タンパク質一部
切除（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）試験（ＰＴＴ）が効果的な診断アプローチを提供
する（Ｒｏｅｓｔら，（１９９３）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２：１
７１９−２１；ｖａｎｄｅｒＬｕｉｊｔら，（１９９４）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ
２０：１−４）。ＰＴＴでは、まず入手可能な組織からＲＮＡを単離し、そし
て逆転写し、そして目的の部分をＰＣＲにより増幅する。逆転写ＰＣＲの産物を
その後、入れ子式ＰＣＲ増幅のテンプレートとして、ＲＮＡポリメラーゼプロモ
ーターおよび真核翻訳を開始するための配列を含むプライマーと共に用いる。目
的の領域の増幅後、プライマーに取り込まれている特有のモチーフにより、ＰＣ
Ｒ産物の連続ｉｎｖｉｔｒｏ転写および翻訳が可能になる。翻訳産物のドデシ
ル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に際し、一部切除ポリペプ
チドの出現は、翻訳の未成熟な終結を引き起こす突然変異の存在を知らせる。本
技術の変形において、目的の標的領域が単一エクソンから由来する場合、（ＲＮ
Ａではなく）ＤＮＡをＰＣＲテンプレートとして用いる。

【００４７】本明細書に記載される診断法に使用する核酸試料を得るのに、いかなる細胞種
または組織を利用してもよい。好ましい態様において、ＤＮＡ試料は、体液、例
えば、既知の技術（例えば静脈穿刺）により得られた血液または唾液から得られ
る。あるいは、乾燥試料（例えば毛髪または皮膚）に対し核酸試験を行ってもよ
い。ＲＮＡまたはタンパク質を用いる場合、利用してもよい細胞または組織は、
ＩＬ−１遺伝子を発現しなければならない。

【００４８】診断法はまた、核酸増幅が不要であるように、生検または切除により得られた
患者組織の（固定および／または凍結）組織切片に対し直接ｉｎｓｉｔｕで行
ってもよい。こうしたｉｎｓｉｔｕ法には、核酸試薬をプローブおよび／また
はプライマーとして用いてもよい（例えば、Ｎｕｏｖｏ，Ｇ．Ｊ．，１９９
２，ＰＣＲｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ニューヨーク州レーブンプレスを
参照されたい）。

【００４９】１つの核酸配列の検出に主に重点を置く方法に加え、こうした検出計画におけ
るプロフィールもまた、評価してもよい。例えば、ディファレンシャルディスプ
レイ、ノーザン解析および／またはＲＴ−ＰＣＲを利用することにより、フィン
ガープリントプロフィールを生成してもよい。

【００５０】本発明の別の態様は、慢性閉塞性気道疾患を発生する、および／またはより迅
速にまたは重症に進行させる傾向を検出するためのキットに向けられる。本キッ
トは、ＩＬ−１炎症誘発性ハプロタイプの少なくとも１つの対立遺伝子に対し５
’および３’にハイブリダイズする５’および３’オリゴヌクレオチドを含む、
１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドを含んでもよい。ＰＣＲ増幅オリゴヌ
クレオチドは、続く解析に便利な大きさのＰＣＲ産物を産生するため、２５およ
び２５００塩基対の間で、好ましくは約１００および約５００塩基の間で、離れ
てハイブリダイズするべきである。

【００５１】キットに使用するオリゴヌクレオチドは、多様な天然および／または合成組成
物、例えば合成オリゴヌクレオチド、制限断片、ｃＤＮＡ、合成ペプチド核酸（
ＰＮＡ）、およびそれらに匹敵するもののいずれであってもよい。該アッセイキ
ットおよび方法はまた、アッセイにおける同定を容易にするため、標識オリゴヌ
クレオチドを使用してもよい。使用してもよい標識の例には、放射標識、酵素、
蛍光化合物、ストレプトアビジン、アビジン、ビオチン、磁気部分、金属結合部
分、抗原または抗体部分、およびそれらに匹敵するものが含まれる。

【００５２】該キットはまた、所望により、ＤＮＡサンプリング手段を含んでもよい。ＤＮ
Ａサンプリング手段は当業者に周知であり、そして限定されるわけではないが、
支持体、例えばフィルターペーパー、ＡｍｐｌｉＣａｒｄ^TM（シェフィールド大
学（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｈｅｆｆｉｅｌｄ），Ｓｈｅｆｆｉｅｌ
ｄ，ＥｎｇｌａｎｄＳ１０２ＪＦ；Ｔａｌｏｗ，ＪＷら，Ｊ．ｏｆ
Ｉｎｃｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１０３：３８７−３８９（１９９４））
およびそれらに匹敵するもの；ＤＮＡ精製試薬、例えばＮｕｃｌｅｏｎ^TMキット
、溶解緩衝液、プロテイナーゼ溶液およびそれらに匹敵するもの；ＰＣＲ試薬、
例えば１０Ｘ反応緩衝液、熱安定性ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、およびそれらに匹
敵するもの；並びに対立遺伝子検出手段、例えばＨｉｎｆＩ制限酵素、対立遺伝
子特異的オリゴヌクレオチド、乾燥血液からの入れ子式ＰＣＲのための縮重オリ
ゴヌクレオチドプライマーを含んでもよい。

【００５３】３．２．２．薬理ゲノム学（Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）敗血症を予測する特定のＩＬ−１多型性を知ることは、単独で、または慢性閉
塞性気道疾患に寄与する他の遺伝的欠陥に関する情報（慢性閉塞性気道疾患の遺
伝的プロフィール）と共に、個人の遺伝的プロフィールに対し、特定の疾患に関
する治療をあつらえること、「薬理ゲノム学」の目的を可能にする。例えば、Ｉ
Ｌ−１Ｂ対立遺伝子２（−５１１）および／またはＩＬ−１Ｂ対立遺伝子２（＋
３９５４）を有する被験者は、慢性閉塞性気道疾患を発生する、または慢性閉塞
性気道疾患に、より迅速にまたは重症に進行する傾向がある。したがって、個人
のＩＬ−１炎症誘発性プロフィールを、慢性閉塞性気道疾患の集団プロフィール
に比較することにより、特定の患者または患者集団（すなわち同一の遺伝的改変
を有する患者群）に対し安全でそして有効であると期待される薬剤の選択または
設計が可能になる。

【００５４】ＩＬ−１Ｂまたは疾患遺伝的プロフィールに基づき、最大の臨床利益を示すと
期待される集団を標的とすることができれば：１）期待に反する市場結果の市場
化された薬剤の再配置；２）患者サブグループ特異的である、安全性または効能
制限の結果として臨床的開発が中断されている、喘息薬剤候補の救出；および３
）喘息薬剤候補の加速したそしてより安価な開発およびより最適な薬剤標識（例
えば、本明細書に記載されるマーカーの使用は、有効量を最適化するのに有用で
あるため）を可能にすることができる。

【００５５】被験者の細胞はまた、治療薬の投与前および後に得て、ＩＬ−１以外の遺伝子
の発現レベルを検出し、該治療薬が、有害である可能性がある遺伝子の発現を増
加させまたは減少させないことを確認してもよい。これは、例えば転写プロフィ
ール決定の方法を用いることにより、行ってもよい。したがって、ｉｎｖｉｖ
ｏで治療薬に曝露された細胞由来のｍＲＮＡおよび該治療薬に曝露されなかった
同一種の細胞由来のｍＲＮＡを逆転写し、そして多くの遺伝子由来のＤＮＡを含
むチップにハイブリダイズさせ、それにより該治療薬で処理されたおよび処理さ
れていない細胞における遺伝子発現を比較してもよい。

【００５６】本発明はさらに、以下の実施例により例示されるが、これは、いかなる点でも
限定するものとして解釈されてはならない。本出願の至るところで引用された、
すべての引用参考文献の内容（参考文献、発行された特許、公開特許出願を含む
）は、本明細書に特に援用される。本発明の実施は、別に示されない限り、当業
の範囲内である、慣用技術を使用するであろう。こうした技術は、文献に完全に
説明されている。例えば、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＡＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版，Ｓａｍｂｒｏｏｋ監修，Ｆｒｉｔｓ
ｈａｎｄＭａｎｉａｔｉｓ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ：１９８９）；ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ，第１
巻および第２巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ監修，１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎ
ｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ監修，１９８
４）；Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，１９５号；ＮｕｃｌｅｉｃＡ
ｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．
Ｈｉｇｇｉｎｓ監修，１９８４）；ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＡｎｄＴ
ｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ
監修，１９８４）を参照されたい。

【００５７】

【実施例】

実施例１：ＩＬ−１Ｂ（＋３９５４）の検出ＩＬ−１Ｂ塩基＋３９５４での単一塩基変動（Ｃ／Ｔ）多型のスクリーニング
を、ゲノムテンプレートのＰＣＲ増幅により行った。陽性コントロールとして、
１つのミスマッチをプライマーに挿入し、ＴａｑＩ部位を完成させた。多型Ｔａ
ｑＩ部位は天然である。ゲノム配列（Ｃｌａｒｋら，１９８６；ＧＥＮＢＡＮＫ
Ｘ０４５００）に基づき、以下のプライマー：５’ ＣＴＣＡＧＧＴＧＴＣＣＴＣＧＡＡＧＡＡＡＴＣＡＡＡ
３’（配列番号１）５’ ＧＣＴＴＴＴＴＴＧＣＴＧＴＧＡＧＴＣＣＣＧ３’（配列
番号２）をＡＢＩＤＮＡ合成装置で産生した。

【００５８】ＰＣＲ反応条件は以下の通りであった：［９５℃（２分）］１サイクル［９５℃（１分）、６７．５℃（１分）、７４℃（１分）］３８サイクル；およ
び［７２℃（８分）］１サイクル制限酵素消化を６０℃で８時間行った。大きさ決定は８％ＰＡＧＥによった
。ＰＣＲ産物のＴａｑＩでの消化により、１２ｂｐの部分（該部分がないことは
不完全な消化を示す）並びに８５および９７ｂｐの２つのさらなる部分（対立遺
伝子１）、または１８２ｂｐの単一のもの（対立遺伝子２）のいずれかを生じる
。

【００５９】実施例２：ＩＬ−１Ｂ（−５１１）の検出ＩＬ−１Ｂ遺伝子の位−５１１での単一塩基多型（Ｃ／Ｔ）を、ゲノムテンプ
レートのＰＣＲ増幅に続き、ＲＦＬＰ（制限断片長多型）解析によりスクリーニ
ングした。遺伝子変動は、最もよくある対立遺伝子において、ＡｖａＩ制限部
位を完全にし、そしてより稀な対立遺伝子ではＢｓｕ３６Ｉを完全にする。
したがって、これらの酵素でＰＣＲ産物を消化することにより、ＩＬ−１Ｂ（−
５１１）遺伝子座の効率的な解析が提供される。

【００６０】ゲノム配列（Ｃｌａｒｋら，１９８６；ＧｅｎｂａｎｋＸ０４５００）に基
づき、以下のプライマー：５’ ＴＧＧＣＡＴＴＧＡＴＣＴＧＧＴＴＣＡＴＣ−３’（配列番
号３）；５’ ＧＴＴＴＡＧＧＡＡＴＣＴＴＣＣＣＡＣＴＴ−３’（配列番
号４）をＡＢＩ合成装置で産生した。

【００６１】ＰＣＲ条件は以下の通りであった：［９５℃（１分）］１サイクル［９５℃（１分）、５３℃（１分）、７２℃（１分）］３５サイクル［７２℃（５分）］１サイクル各ＰＣＲ反応物を２つの２５μｌアリコットに分けた；特異的１０Ｘ制限緩衝
液３μｌに加え、１つに３単位のＡｖａＩを添加し、もう一方に３．７単位の
Ｂｓｕ３６Ｉを添加した。消化は３７℃で一晩であり、大きさ決定は９％
ＰＡＧＥによった。ＡｖａＩ消化は、対立遺伝子１で１９０＋１１４ｂｐ部分
を生じた一方、対立遺伝子２は切断しなかった（３０４ｂｐ）。Ｂｓｕ３６
Ｉ消化は、対立遺伝子２で１９０＋１１４ｂｐ断片を生じた一方、対立遺伝子１
は切断しなかった（３０４ｂｐ）。得られた制限パターンは２つのアリコットで
逆転するか（ホモ接合体を同定する）または同一（ヘテロ接合体を同定する）で
あった。本プロトコルは、ＩＬ−１Ｂ（−５１１）遺伝子座の効率的な解析を提
供した。

【００６２】実施例３：ＩＬ−１ＲＮ（ＶＮＴＲ）の検出ＩＬ−１ＲＮ遺伝子のイントロン２内に多様な数の直列反復が存在することは
、該遺伝子のクローニング中、最初に報告された（Ｓｔｅｉｎｋａｓｓｅｒｅｒ
，Ａ．ら，（１９９１）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ１９：５０９
５）。本ＶＮＴＲは、Ｔａｒｌｏｗら（（１９９３）ＨｕｍＧｅｎｅｔ．９
１：４０３−４０４）により、多様な数（２ないし６）の８６ｂｐリピートと特
徴付けられた。ゲノム配列（ＧｅｎｂａｎｋＸ６４５３２）に基づき、以下の
プライマー：５’−ＣＴＣＡＧＣＡＡＣＡＣＴＣＣＴＡＴ−３’（＋２８７９／＋
２８９５）（配列番号５）５’−ＴＣＣＴＧＧＴＣＴＧＣＡＧＣＴＡＡ−３’（＋３２７４／＋
３２９０）（配列番号６）をＡＢＩ合成装置で産生した。

【００６３】ＰＣＲ反応条件は以下の通りであった：サイクリングを、［９６℃、１分］Ｘ１；［６０℃、１分；７０℃、２分］
Ｘ３５；［７０℃、５分］Ｘ１；４℃で行う。２％アガロースで、９０Ｖで
３０分電気泳動する。

【００６４】ＰＣＲ産物サイズは、リピート数の直接の指標である；最もよくある対立遺伝
子（対立遺伝子１）は４１２ｂｐ産物を生じる。隣接領域が６６ｂｐ伸長するた
め、残った３４４が４つの８６ｂｐ反復を暗示する。同様に、２４０ｂｐ産物は
２つの反復を示し（対立遺伝子２）、３２６は３つの反復であり（対立遺伝子３
）、４９８は５つであり（対立遺伝子４）、５８４は６つである（対立遺伝子６
）。４つの最もよくある対立遺伝子に関する北部英国系白人集団の頻度は、０．
７３４、０．２４１、０．０２１および０．０４である。

【００６５】実施例４：ＩＬ−１ＲＮ（＋２０１８）の検出エクソン２内の本単一塩基変動（＋２０１６でのＣ／Ｔ）は、Ｃｌａｙら（（
１９９６）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ９７：７２３−７２６）に記載された。これ
らのＰＣＲプライマー（ゲノム配列に対しミスマッチしている）は、２つの対立
遺伝子上に２つの酵素切断部位を持つよう設計した。これらの２つの対立遺伝子
は、ＩＬ−１ＲＮ（ＶＮＴＲ）の２つの最もよくある対立遺伝子と１００％連鎖
不均衡にある。ゲノム配列（ＧｅｎｂａｎｋＸ０４５３２）に基づき、以下の
プライマー：５’−ＣＴＡＴＣＴＧＡＧＧＡＡＣＡＡＡＣＴＡＧＴＡＧＣ−３
’（＋１９９０／＋２０１５）（配列番号７）５’−ＴＡＧＧＡＣＡＴＴＧＣＡＣＣＴＡＧＧＧＴＴＴＧＴ−３
’（＋２１３３／＋２１５６）（配列番号８）をＡＢＩ合成装置で産生した。

【００６６】サイクリングを、［９６℃、１分］Ｘ１；［９４℃、１分；５７℃、１分；
７０℃、２分］Ｘ３５；［７０℃、５分］Ｘ１；４℃で行う。各ＰＣＲ反応
を２μｌの特異的１０Ｘ制限緩衝液中に分ける。インキュベーションは３７℃で
一晩である。電気泳動はＰＡＧＥ９％による。

【００６７】２つの酵素は、それぞれ２つの異なる対立遺伝子を切断する。ＡｌｕＩは、
対立遺伝子１に関し、１２６＋２８ｂｐ断片を生じるであろう一方、対立遺伝子
２は消化しない（１５４ｂｐ）。ＭｓｐＩは、対立遺伝子２で、１２５＋２９
ｂｐ断片を生じるであろう一方、対立遺伝子１は切断しない（１５４ｂｐ）。し
たがって、２つの反応（ＰＡＧＥで並べて分離される）は、ホモ接合体の個人で
消化の逆転パターン、そしてヘテロ接合体で同一パターンを与えるであろう。北
部英国系白人集団の対立遺伝子頻度は、０．７４および０．２６である。同様の
遺伝的プールにおける０．０５有意レベルでの９０％能力（ｐｏｗｅｒ）には、
頻度の１．５倍増加を検出するのに２５１例を調べなければならず、または頻度
の０．１の絶対増加には４２０例を調べなければならない。

【００６８】実施例５：ＩＬ−１Ａ（−８８９）の検出ＩＬ−１Ａプロモーターにおける該Ｃ／Ｔ単一変動はＭｃＤｏｗｅｌｌら（Ａ
ｒｔｈｒｉｔｉｓａｎｄＲｈｅｕｍａｔｉｓｍ３８：２２１−２２８（１
９９５））に記載された。ＰＣＲプライマーの１つは、対立遺伝子１（−８８９
がシトシン）を増幅する際、ＮｃｏＩ部位を生成するよう、塩基変化を有する
。ゲノム配列（ＧｅｎｂａｎｋＸ０３８３３）に基づき、以下のプライマー：
５’−ＡＡＧＣＴＴＧＴＴＣＴＡＣＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＡＧ
ＧＣ−３’（−９６７／−９４５）（配列番号９）５’−ＴＴＡＣＡＴＡＴＧＡＧＣＣＴＴＣＣＡＴＧ−３’（−８８
８／−８６９）（配列番号１０）をＡＢＩ合成装置で産生した。

【００６９】最終１ｍＭでＭｇＣｌ₂を、そして０．８μＭでＰＣＲプライマーを用いる。

【００７０】サイクリングを、［９６℃、１分］Ｘ１；［９４℃、１分；５０℃、１分；
７２℃、２分］Ｘ４５；［７２℃、５分］Ｘ１；４℃で行う。

【００７１】各ＰＣＲ反応に、１μｌの特異的１０Ｘ制限緩衝液に加え、６単位のＮｃｏ
Ｉを添加する。インキュベーションは３７℃で一晩である。電気泳動はＰＡＧＥ
６％による。

【００７２】ＮｃｏＩは、対立遺伝子１に関し、８３＋１６を生じるであろう一方、対立
遺伝子２は切断しない（９９ｂｐ）。ヘテロ接合体は３つのバンドを有するであ
ろう。北部英国系白人集団の対立遺伝子頻度は、０．７１および０．２９である
。同様の遺伝的プールにおける０．０５有意レベルでの９０％能力には、頻度の
１．５倍増加を検出するのに２１４例を調べなければならず、または頻度の０．
１の絶対増加には４４６例を調べなければならない。

【００７３】実施例６：被験者における喘息の存在と、ＩＬ−１Ｂ対立遺伝子２（＋３９５４）およびＩＬ−１Ｂ対立遺伝子２（−５１１）の関連以下の研究を行い、喘息およびＩＬ−１Ｂ遺伝子の相当する領域に見られる対
立遺伝子との間に関連があるかどうか評価した。１０６人の喘息患者を研究に勧
誘した。２５１人の北部英国系白人の非喘息被験者を、コントロールとして勧誘
した。喘息患者はすべて、喘息の定義としてのＡＴＳ規準（ＡｍｅｒＲｅｖ
ＲｅｓｐｉｒＤｉｓ１９８５，１３２：１８０−１８２）を満たし、そして
相当する場合、４ｍｇ／ｍｌ未満のＰＣ２０メタコリンを有した。喘息患者は、
臨床的に軽症または重症の喘息を有すると分類された。重症の喘息は、８００ｍ
ｇ／日以上の吸入ステロイドを必要とする患者と定義された。ベータ−２アゴニ
ストのみを受けている喘息患者は軽症の喘息を有すると分類された。喘息患者の
総数のうち、５０がベータ２アゴニストのみを受けている軽症喘息患者（ＦＥＶ
１９２．５±１．５％ｐｒｅｄ）で、そして平均年齢２６．５±０．９であり
、そして５６が１日当たり少なくとも８００ｍｇの吸入ステロイド処方計画を
受けている重症喘息患者（ＦＥＶ１５８．４±３．４％ｐｒｅｄ）で、平均年
齢は４７．２±２．３であった。インフォームドコンセントを得た後、各患者か
ら静脈血１０ｍｌを抜き取り、そしてＥＤＴＡ含有試験管に収集した。総ゲノム
ＤＮＡを抽出し、１０６人の患者から抽出したＤＮＡで対立遺伝子頻度を評価し
た。ＩＬ−１Ｂ（＋３９５４）に関し、１０５人の患者の遺伝子型を決定するこ
とが可能であった。ＩＬ−１Ｂ（−５１１）に関しては、１０４人の患者の遺伝
子型を決定した。各ＤＮＡに関し、ＩＬ−１Ｂ遺伝子の相当する領域に渡る単一
ＰＣＲ産物を産生し、そして実施例１に記載されるように解析した。カイ平方試
験を用いてデータを解析し、稀な対立遺伝子の運搬を比較した（コーホート間の
対立遺伝子２の少なくとも１つのコピーを運搬する遺伝子型）。ＩＬ−１Ｂ（＋
３９５４）に関する結果を以下の表１に示し、そしてＩＬ−１Ｂ（−５１１）に
関する結果を以下の表２に示している。

【００７４】

【表１】

【００７５】

【表２】

【００７６】表１および２により明らかなように、ＩＬ−１Ｂ対立遺伝子２（＋３９５４）
およびＩＬ−１Ｂ対立遺伝子２（−５１１）の存在は、臨床的喘息に有意に関連
している。さらに、ＩＬ−１Ｂ（−５１１）遺伝子座の対立遺伝子２の少なくと
も１つのコピーの存在は、より重症な疾患と関連付けられることが発見された。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ヒトＩＬ−１Ａ遺伝子のＤＮＡ配列を示す（ＧｅｎＢａ
ｎｋ寄託番号第Ｘ０３８３３号）。

【図２】図２は、ヒトＩＬ−１Ｂ遺伝子のＤＮＡ配列を示す（ＧｅｎＢａ
ｎｋ寄託番号第Ｘ０４５００号）。

【図３】図３は、ヒトＩＬ−１ＲＮ遺伝子のＤＮＡ配列を示す（ＧｅｎＢ
ａｎｋ寄託番号第Ｘ６４５３２号）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ジョバイン，マルコイギリス国エス10・３ビー２サウス・ヨークシャー，シェフィールド，アッシュゲイト・ロード 18 (72)発明者バーネス，ピーター・ジェイイギリス国エスダブリュー３・６エルワイロンドン，ドーブハウス・ストリート，インペリアル・カレッジ・スクール・オブ・メディシン・アット・ザ・ナショナル・ハート・アンド・ラング・インスティチュート・デパートメント・オブ・ソーラシック・メディシン内 (72)発明者リム，サイモンイギリス国エスダブリュー３・６エルワイロンドン，ドーブハウス・ストリート，インペリアル・カレッジ・スクール・オブ・メディシン・アット・ザ・ナショナル・ハート・アンド・ラング・インスティチュート・デパートメント・オブ・ソーラシック・メディシン内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】被験者が慢性閉塞性気道疾患を発生する罹患性を決定する
ための、または該被験者における慢性閉塞性気道疾患の迅速性または究極的な進
行を予測するための方法であって：ａ）該被験者から核酸試料を得て；そしてｂ）前記試料におけるＩＬ−１炎症誘発性（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）
ハプロタイプの少なくとも１つの対立遺伝子を検出するここでＩＬ−１炎症誘発性ハプロタイプの少なくとも１つの対立遺伝子の検出は
、該患者の慢性閉塞性気道疾患を発生する罹患性が増加していることを示す段階を含む、前記方法。
【請求項２】少なくとも１つの対立遺伝子がＩＬ−１Ｂ対立遺伝子２（
−５１１）である、請求項１の方法。
【請求項３】検出段階が：５’ ＣＴＣＡＧＧＴＧＴＣＣＴＣＧＡＡＧＡＡＡＴＣＡＡＡ
３’（配列番号１）；５’ ＧＣＴＴＴＴＴＴＧＣＴＧＴＧＡＧＴＣＣＣＧ３’（配列
番号２）からなる群より選択される少なくとも１つのプライマーを用いた増幅を含む、請
求項２の方法。
【請求項４】少なくとも１つの対立遺伝子がＩＬ−１Ｂ対立遺伝子２（
＋３９５４）である、請求項１の方法。
【請求項５】検出段階が：５’ ＴＧＧＣＡＴＴＧＡＴＣＴＧＧＴＴＣＡＴＣ−３’（配列番
号３）；５’ ＧＴＴＴＡＧＧＡＡＴＣＴＴＣＣＣＡＣＴＴ−３’（配列番
号４）からなる群より選択される少なくとも１つのプライマーを用いた増幅を含む、請
求項４の方法。
【請求項６】慢性閉塞性気道疾患が：喘息、気腫、慢性気管支炎および
慢性細気管支炎からなる群より選択される、請求項１の方法。
【請求項７】検出段階が：５’−ＣＴＣＡＧＣＡＡＣＡＣＴＣＣＴＡＴ−３’（配列番号５）５’−ＴＣＣＴＧＧＴＣＴＧＣＡＧＣＴＡＡ−３’（配列番号６）５’−ＣＴＡＴＣＴＧＡＧＧＡＡＣＡＡＡＣＴＡＧＴＡＧＣ−３
’（配列番号７）５’−ＴＡＧＧＡＣＡＴＴＧＣＡＣＣＴＡＧＧＧＴＴＴＧＴ−３
’（配列番号８）５’−ＡＡＧＣＴＴＧＴＴＣＴＡＣＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＡＧ
ＧＣ−３’（配列番号９）５’−ＴＴＡＣＡＴＡＴＧＡＧＣＣＴＴＣＣＡＴＧ−３’（配列番
号１０）からなる群より選択される少なくとも１つのプライマーを用いた増幅を含む、請
求項１の方法。
【請求項８】被験者が慢性閉塞性気道疾患を発生する罹患性を決定する
ためのキットであって：（ａ）ＤＮＡ試料収集手段；（ｂ）該ＤＮＡ試料中のＩＬ−１炎症誘発性ハプロタイプの少なくとも１つの対
立遺伝子を検出するための手段を含む、前記キット。
【請求項９】検出手段がＩＬ−１炎症誘発性ハプロタイプの対立遺伝子
に対し５’または３’にハイブリダイズする第一のプライマーを含む、請求項８
のキット。
【請求項１０】プライマーが：５’ ＣＴＣＡＧＧＴＧＴＣＣＴＣＧＡＡＧＡＡＡＴＣＡＡＡ
３’（配列番号１）５’ ＧＣＴＴＴＴＴＴＧＣＴＧＴＧＡＧＴＣＣＣＧ３’（配列
番号２）５’ ＴＧＧＣＡＴＴＧＡＴＣＴＧＧＴＴＣＡＴＣ−３’（配列番
号３）５’ ＧＴＴＴＡＧＧＡＡＴＣＴＴＣＣＣＡＣＴＴ−３’（配列番
号４）５’−ＣＴＣＡＧＣＡＡＣＡＣＴＣＣＴＡＴ−３’（配列番号５）５’−ＴＣＣＴＧＧＴＣＴＧＣＡＧＣＴＡＡ−３’（配列番号６）５’−ＣＴＡＴＣＴＧＡＧＧＡＡＣＡＡＡＣＴＡＧＴＡＧＣ−３
’（配列番号７）５’−ＴＡＧＧＡＣＡＴＴＧＣＡＣＣＴＡＧＧＧＴＴＴＧＴ−３
’（配列番号８）５’−ＡＡＧＣＴＴＧＴＴＣＴＡＣＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＡＧ
ＧＣ−３’（配列番号９）５’−ＴＴＡＣＡＴＡＴＧＡＧＣＣＴＴＣＣＡＴＧ−３’（配列番
号１０）からなる群より選択される、請求項９のキット。
【請求項１１】ＩＬ−１炎症誘発性ハプロタイプの対立遺伝子が：ＩＬ
−１Ｂ対立遺伝子２（−５１１）、ＩＬ−１Ａ対立遺伝子４（２２２／２２３）
、ＩＬ−１Ａ対立遺伝子１（ｇｚ５／ｇｚ６）、ＩＬ−１Ａ対立遺伝子１（−８
８９）、ＩＬ−１Ｂ対立遺伝子２（＋６９１２）、ＩＬ−１Ｂ対立遺伝子１（＋
３９５４）、ＩＬ−１Ｂ／ＩＬ−１ＲＮ遺伝子間領域（ｇａａｔ．ｐ３３３３０
）および（Ｙ３１）、ＩＬ−１ＲＮ対立遺伝子２（＋２０１８）、ＩＬ−１ＲＮ
対立遺伝子２（ＶＮＴＲ）からなる群より選択される、請求項８のキット。
【請求項１２】さらに、第一のプライマーがＩＬ−１炎症誘発性ハプロ
タイプの対立遺伝子に対し５’にハイブリダイズする場合、３’にハイブリダイ
ズし、そして第一のプライマーがＩＬ−１炎症誘発性ハプロタイプに対し３’に
ハイブリダイズする場合、５’にハイブリダイズする、第二のプライマーを含む
、請求項１０のキット。
【請求項１３】前記の第一のプライマーおよび前記の第二のプライマー
が約５０および１０００塩基対の間の範囲内にある領域に対しハイブリダイズす
る、請求項１２のキット。
【請求項１４】さらに検出因子オリゴヌクレオチドを含む、請求項１０
のキット。
【請求項１５】検出因子オリゴヌクレオチドが標識を含む、請求項１４
のキット。