ES2297900T3 - Diagnosis y terapia para la enfermedad obstructiva cronica de las vias respiratorias. - Google Patents
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Abstract
Un método para determinar el riesgo aumentado de un sujeto de susceptibilidad a desarrollar asma en el sujeto, cuyo método comprende las etapas de : a) proporcionar una muestra de ácido nucleico obtenida de sangre o saliva, o una muestra procedente de piel o de pelo del sujeto; y b) detectar en dicha muestra al menos el alelo 2 de IL-1B (-511) que contiene una T en la base -511 de la IL-1B o el alelo 2 de IL-1B (+3954) que contiene una T en la base +3954 de la IL-1B, en donde la detección de dicho alelo indica que el paciente tiene un riesgo aumentado de susceptibilidad a desarrollar asma.
Description
Diagnosis y terapia para la enfermedad
obstructiva crónica de las vías respiratorias.
El asma es una enfermedad pulmonar crónica
caracterizada por accesos de tos, rigidez del pecho, respiración
difícil, y jadeo que se deben a una obstrucción reversible de la
corriente de aire que resulta de inflamación e hipersensibilidad de
las vías respiratorias. En individuos sensibilizados, la inhalación
de alergenos puede producir inflamación de la túnica de las vías
respiratorias, y precipitar un desencadenamiento de asma. También
puede ocurrir asma como resultado de otros estímulos inflamatorios,
tales como infecciones del tracto respiratorio. Los individuos que
han quedado sensibilizados a alimentos específicos pueden tener
reacciones graves y acaso amenazadoras de la vida después de la
ingestión de esas sustancias. El asma, que en algunos tiempos se
consideró como una reacción de hipersensibilidad "simple", es
conocida actualmente como un estado complejo con un probable
espectro de causas y factores que contribuyen a ello, con
inflamación de las vías respiratorias como su atributo central.
Los investigadores de enfermedades pulmonares relacionan esto con
la arteriosclerosis, en el sentido de que existen muchos aspectos
interactivos. Muchos de los factores que contribuyen a esta
enfermedad están sometidos actualmente a un estudio intenso, que
incluye el de las reacciones químicas que tienen lugar en el
proceso asmático; la naturaleza de la comunicación
célula-célula, el modo en que la información es
trasmitida desde una célula o tipo de célula a otra; y el papel,
reactivo u otras causas, del epitelio. Las alergias contribuyen
tanto a la incidencia como a la gravedad de los síntomas asmáticos.
La alergia (conocida también como hipersensibilidad inmediata) se
define como una sensibilidad anormal a una sustancia que es
tolerada normalmente y que se considera, en general, inocua, y para
la que el episodio desencadenante es independiente de la dosis, en
oposición a una reacción idiosincrática para una sustancia, que
depende de la dosis. Si bien la totalidad de las respuestas
inmunes ocurren como resultado de exposición a sustancias extrañas,
las reacciones alérgicas son distintas de "inmunidad",
protectora o intensificada, comunicada por inmunizaciones o
infecciones naturales. Solo aproximadamente una cuarta parte de los
niños con asma se curan cuando sus vías respiratorias alcanzan el
tamaño adulto; para el resto, el estado de la enfermedad es un
sufrimiento para toda su vida. Este estado persiste, según un
informe de investigación publicado por la American Lung
Association, en el 85 por ciento de las mujeres y en el 72 por
ciento de los hombres. (Journal of Allergy and Clinical Immunology,
Vol. 96:5 11/96).
Ha habido 4.964 muertes debidas al asma
registradas en 1993 solamente en los Estados Unidos. La incidencia
de la mortalidad por asma en los niños se duplicó desde 1980 a 1993.
En personas con edades entre 15 y 24 años, el número de muertes se
elevó desde 2,5 casos por millón en 1980 hasta 5,2 casos por millón
en 1993. En 1993, el asma fue responsable de 342 muertes y,
aproximadamente, 198.000 hospitalizaciones de personas de menos de
25 años de edad.
Los afro-americanos representan
el 21 por ciento de las muertes debidas a asma. Los niños
afro-americanos son cuatro veces más propensos a
muerte por asma que los niños caucásicos. Los
afro-americanos, hombres, de edades comprendidas
entre 15 y 24 años tienen el más alto riesgo de mortalidad.
Una historia familiar positiva tiende a ser uno
de los mayores factores de riesgo asociados con asma, si bien la
identificación positiva puede ser difícil. El asma puede coexistir
con otros estados anormales tales como anomalías congénitas,
estados infecciosos y fibrosis quística. Indicadores adicionales son
tomados en consideración cuando la historia es atípica o la
respuesta a un buen tratamiento médico es mala. Los médicos con
menos experiencia en el tratamiento de esta enfermedad pueden tratar
estos síntomas como si fuera una infección, sin apreciar que la
causa subyacente es el asma.
La identificación del asma en niños se basa
considerablemente en las observaciones por los padres de indicios
clínicos. La identificación correcta requiere un especialista en
asma y alergia que reconozca la unicidad del asma de la niñez.
Signos más sutiles de asma, tales como rigidez del pecho, pueden
ser pasados por alto, en particular por los niños. Accesos de tos,
recurrentes o constantes, pueden ser los únicos síntomas comunes
observables de asma en niños pequeños. A pesar de todo, la
demostración de una respuesta clínica favorable al tratamiento
terapéutico con broncodilatadores puede ayudar a confirmar la
presencia de asma.
Existe una inmensa necesidad de identificación
precoz de aquellos quienes son, en general, susceptibles al asma.
Debido a que la COAD es una enfermedad crónica y progresiva cuando
está sin tratar, la identificación precoz podría facilitar la
administración de un tratamiento apropiado en las primeras fases de
la afección, aumentando con ello la probabilidad de un resultado
positivo.
En un aspecto, la presente invención caracteriza
ensayos para determinar la susceptibilidad de un sujeto a
desarrollar asma. En una realización, el método comprende la etapa
de establecer el genotipo de una muestra de ácido nucleico obtenida
de la sangre, la saliva, la piel o el pelo de un sujeto, para
determinar por lo menos un alelo de un haplotipo proinflamatorio de
la IL-1, detectando en la muestra al menos el alelo
2 de la IL-1B (-511) que contiene una T en la base
-511 de la IL-1B, o el alelo 2 de la
IL-1B (+3954) que contiene una T en la base + 3954
de la IL-1B, en donde la detección de dicho alelo
indica que el paciente tiene un riesgo aumentado de susceptibilidad
a desarrollar asma.
Por ejemplo, puede detectarse un alelo de un
haplotipo proinflamatorio de IL-1:1) llevando a cabo
una reacción de hibridación entre la muestra de ácido nucleico y
una sonda o sondas capaces de hibridarse con un alelo de un
haplotipo de IL-1 del sujeto; 2) secuenciando por lo
menos un parte de al menos un alelo de un haplotipo de
IL-1; o 3) determinando la movilidad electroforética
de al menos un alelo de un haplotipo de IL-1 o uno
de sus componentes. En otra realización preferida, un componente de
un haplotipo de IL-1 es sometido a una etapa de
amplificación antes de llevar a cabo la etapa de detección. Las
etapas de amplificación preferidas están seleccionadas entre el
grupo que consiste en: la reacción en cadena de la polimerasa (PCR),
la reacción en cadena de la ligasa (LCR), amplificación de
desplazamiento de la cadena (SDA), clonación, y variaciones de las
anteriores (por ejemplo, RT-PCR y amplificación
específica de alelos). En una realización particularmente preferida
la muestra es hibridada con un conjunto de cebadores, que hibridan
los extremos 5' y 3' con una secuencia, sentido o antisentido, del
alelo del haplotipo de IL-1, y sometida a una
amplificación de PCR.
También se describen kits para llevar a cabo los
ensayos anteriormente descritos. El kit puede incluir medios de
recogida de muestras de DNA y medios para determinar por lo menos un
alelo de un haplotipo de IL-1 del sujeto. El kit
puede comprender también muestras testigo o patrones.
La información obtenida utilizando los ensayos y
los kits descritos en esta memoria (sola o en asociación con
información sobre otros defectos genéticos o factores
medioambientales, que contribuyan a enfermedad obstructiva crónica
de las vías respiratorias), es útil para predecir si un sujeto es
propenso a desarrollar enfermedad obstructiva crónica de las vías
respiratorias. Además, la información, sola o en asociación con
información relativa a otros defectos genéticos que contribuyan a
la enfermedad obstructiva crónica de las vías respiratorias (el
perfil genético de la enfermedad obstructiva crónica de las vías
respiratorias), permite adaptar el tratamiento terapéutico al
perfil genético del individuo. Por ejemplo, esta información puede
permitir a un doctor: 1) recetar más eficazmente un fármaco que se
dirija a la base molecular de la cascada que da por resultado la
enfermedad obstructiva crónica de las vías respiratorias; y 2)
determinar de mejor modo la dosis apropiada de un fármaco
particular para el paciente particular. La facultad para poblaciones
diana de pacientes, que se espera ponga de manifiesto el máximo
beneficio clínico, puede permitir: 1) la reposición de fármacos
comercializados con resultados comerciales decepcionantes; 2) el
rescate de candidatos a fármacos cuyo desarrollo clínico haya sido
interrumpido como resultado de limitaciones en cuanto a seguridad o
eficacia, específicas de subgrupos de pacientes; y 3) el desarrollo
acelerado y menos costoso de candidatos a fármacos y una
calificación más óptima de los fármacos.
Otras características y ventajas de la
invención, serán evidentes de la descripción que sigue y de las
reivindicaciones que se detallan.
La Figura 1 muestra la secuencia de DNA del gen
de IL-1A humano (GenBank, No. de catálogo
X03833).
La Figura 2 muestra la secuencia de DNA del gen
de IL-1B humano (GenBank, No. de Catálogo
X04500).
La Figura 3 muestra la secuencia de DNA del gen
de IL-1-RN humano (GenBank, No. de
Catálogo X64532).
Por conveniencia. se proporciona a continuación
el significado de ciertos términos y frases que se emplean en la
memoria descriptiva, los ejemplos y las reivindicaciones que se
acompañan.
El término "alelo" se refiere a formas
alternativas de un gen en un marcador particular. Cuando un sujeto
posee dos alelos idénticos se dice que el sujeto es homozigótico.
Cuando un sujeto posee dos alelos diferentes, se dice que el sujeto
es heterozigótico.
"Enfermedad pulmonar obstructiva crónica" o
"enfermedad obstructiva crónica de las vías respiratorias"
(COAD) son expresiones que se usan para describir un complejo de
condiciones que tienen en común la limitación de la corriente de
aire o la obstrucción de la corriente de aire. La COAD incluye asma,
enfisema, bronquitis crónica y bronquiolitis crónica. Los sitios de
obstrucción de las vías respiratorias en las COADs varían desde las
vías respiratorias superiores hasta los bronquiolos más periféricos.
La causa exacta de la mayor parte de las enfermedades de las vías
respiratorias no es bien conocida. La definición de enfermedades de
las vías respiratorias se añade a la confusión. La bronquitis
crónica está definida clínicamente por la presencia crónica de tos
y por la producción de esputos. El enfisema, por otra parte, está
definido anatómicamente sobre la base de la ruptura de tejido
pulmonar y el alargamiento de los sacos alveolares. Las COADs
manifiestan, todas, estrechamiento de las vías respiratorias como
un parámetro de la enfermedad y comparten también inflamación como
un componente del proceso de la enfermedad.
"Establecimiento del genotipo" se refiere
al análisis del DNA genómico de un individuo (o del ácido nucleico
que le corresponde) para identificar una enfermedad particular que
ocasiona o que contribuye a mutación o polimorfismo, o bien
directamente o basándose en la detección de una mutación o un
polimorfismo (un marcador) que está en desequilibrio de ligamiento
con el gen que causa o que contribuye a la enfermedad.
El término "haplotipo" se refiere a un
conjunto de alelos que son heredados juntos como un grupo (están en
desequilibrio de ligamento). Tal como se usa en esta memoria, se
define haplotipo como incluyendo aquellos haplotipos presentes en
niveles estadísticamente significativos (p_{corr} \leq 0,05).
Tal como se usa en esta memoria, la frase "un haplotipo de
IL-1" se refiere a un haplotipo en los locus de
la IL-1, incluyendo alelos de los genes de
IL-1 A, IL-1B e
IL-1RN, y marcadores en desequilibrio con ellos.
"Haplotipo de IL-1 proinflamatorio" se refiere
a un haplotipo que está asociado con un exceso de liberación y/o
actividad proinflamatoria (por ejemplo, regulación al alza de
IL-1\alpha y/o IL-1\beta
funcional, y/o regulación a la baja de un antagonista funcional del
receptor de IL-1).
"Desequilibrio de ligamiento" se refiere a
coherencia de dos alelos en frecuencias mayores de las que podrían
esperarse de las frecuencias de ocurrencia separadas de cada uno de
los alelos de una población testigo dada. La frecuencia de
ocurrencia esperada de dos alelos que son heredados
independientemente, es la frecuencia del primer alelo multiplicada
por la frecuencia del segundo alelo. Los alelos que se presentan
conjuntamente en las frecuencias esperadas se dice que están en
"equilibrio de ligamiento".
Los ejemplos de marcadores polimórficos en
desequilibrio de ligamiento incluyen: el alelo 2 de
IL-1B (-511), el alelo 4 de IL-1A
(222/223), el alelo 1 de IL-1 A (gz5/gz6), el alelo
1 de IL-1 A (-889), el alelo 2 de
IL-1B (+6912), el alelo 1 de IL-1B
(+3954), la región intergénica de
IL-1B/IL-1RN (gaat.p33330) e (Y31),
el alelo 2 de IL-1RN (+2018), el alelo 2 de
IL-1RN (VNTR) y tres polimorfismos que están en
desequilibrio de ligamiento con el alelo 2 de
IL-1RN (VNTR), (Véase Clay et al., (1996)
Hum Genet 97:723-726).
El término "polimorfismo" se refiere a la
coexistencia de más de una forma de un gen o parte del mismo (por
ejemplo, una variante alélica). Se hace referencia a una parte de un
gen del cual existen al menos dos formas diferentes, es decir, dos
secuencias diferentes de nucleótidos, como una "región polimórfica
de un gen". Una región polimórfica puede estar constituida por
un solo nucleótido, cuya identidad difiere en alelos diferentes.
Una región polimórfica puede estar constituida también por varios
nucleótidos..
Basándose en los descubrimientos, que se
describen con detalle en los ejemplos que siguen, de que el alelo 2
de la IL-1B (+3954) y el alelo 2 de la
IL-1B (-511) están asociados significativamente con
el asma, la presente invención proporciona métodos para determinar
si un sujeto padece o es probable que desarrolle asma y/o para
predecir la extensión o progresión de asma en un sujeto.
En una realización, el método comprende
establecer el genotipo de una muestra de ácido nucleico obtenida de
sangre, saliva, piel o pelo del sujeto, para detectar, por lo menos,
un alelo de haplotipos proinflamatorios de IL-1,
el alelo 2 de la IL-1B (-511) o el alelo 2 de la
IL-1B (+3954). Por ejemplo, un alelo de un haplotipo
proinflamatorio de IL-1 puede ser detectado, por
ejemplo, determinando el grado de transcripción o mRNA y/o el nivel
de proteína de un gen o proteína de IL-1, por
ejemplo, mediante análisis de transferencia Northern, transcripción
inversa-reacción en cadena de la polimerasa
(RT-PCR), hibridación in situ,
inmunoprecipitación, hibridación de transferencia Western o
inmunohistoquímica. Según un método, se obtienen células de un
sujeto, se determina el nivel de proteína o mRNA de la
IL-1 y se compara con el nivel de proteína o mRNA de
la IL-1 de un sujeto sano.
En realizaciones preferidas, el método se
caracteriza por comprender el establecimiento del genotipo de una
muestra de ácido nucleico obtenida de sangre, saliva, piel o pelo
del sujeto, determinando al menos un alelo de haplotipos
proinflamatorios de la IL-1, el alelo 2 de la
IL-1B (-511) ó el alelo 2 de la
IL-1B (+3954). En una realización que sirve de
ejemplo, se proporciona una composición de ácidos nucleicos que
comprende una sonda de ácido nucleico que incluye una región de la
secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridación con una
secuencia, sentido o antisentido, del al menos un alelo de un
haplotipo proinflamatorio de la IL-1, el alelo 2 de
la IL-1B (-511) ó el alelo 2 de la
IL-1B (+3954). Por ejemplo, el ácido nucleico puede
hacerse accesible para la hibridación, poner en contacto la sonda
con el ácido nucleico de la muestra, y detectarse la hibridación de
la sonda con el ácido nucleico de la muestra. Tal técnica puede ser
usada para detectar alteraciones de variantes alélicas a nivel
genómico o a nivel del mRNA, así como determinar los niveles de
transcritos de mRNA.
Un método de detección preferido es el de la
hibridación específica del alelo usando sondas que solapan una
región de al menos un alelo de haplotipos proinflamatorios de la
IL-1, el alelo 2 de la IL-1B (-511)
ó el alelo 2 de la IL-1B (+3954) y que posee
aproximadamente 5, 10, 20, 25 ó 30 nucleótidos en torno a la
mutación o región polimórfica. Varias sondas capaces de hibridarse
específicamente con otras variantes alélicas implicadas en la
enfermedad obstructiva crónica de las vías respiratorias, pueden
fijarse a un soporte de fase sólida, por ejemplo un "chip"
(que puede albergar hasta aproximadamente 250.000 oligonucleótidos).
Los oligonucleótidos pueden unirse a un soporte sólido mediante
diversos procedimientos, con inclusión de litografía. El análisis
de detección de mutaciones usando estos chips que comprenden
oligonucleótidos, denominados también "colecciones de sondas de
DNA", ha sido descrito, por ejemplo, por Cronin et al.
(1996) en Human Mutation 7:244. Un chip puede comprender la
totalidad de las variantes alélicas de al menos una región
polimórfica de un gen. El soporte que constituye la fase sólida se
pone en contacto luego con el ácido nucleico a ensayar y se detecta
la hibridación con las sondas específicas. Por consiguiente, puede
identificarse la identidad de numerosas variantes alélicas de uno o
más genes, con un sencillo experimento de hibridación.
Estas técnicas pueden comprender también la
etapa de amplificar el ácido nucleico antes del análisis. Los
expertos en la técnica conocen procedimientos de amplificación que
incluyen, aun cuando no está limitado a ellos, clonación, reacción
en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la
polimerasa de alelos específicos (ASA), reacción en cadena de la
ligasa (LCR), reacción en cadena de la polimerasa nidificada,
replicación de secuencias autosostenida (Guatelli, J.C. et
al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
87:1874-1878), sistema de amplificación de la
transcripción (Kwoh, D.Y. et al., 1989, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 86:1173-1177) y Q-Beta
Replicase (Lizardi, P.M. et al., 1988, Bio/Technology
6:1197).
Los cebadores particularmente preferidos para
usar en una reacción PCR incluyen los siguientes:
- 5'-CTC AGC AAC ACT CCT AT-3'
- (SEQ ID NO.5)
- 5'-TCC TGG TCT GCA GCT AA-3'
- (SEQ ID NO. 6)
- 5'-CTA TCT GAG GAA CAA ACT AGT AGC-3'
- 8SEQ ID NO. 7)
- 5'-TAG GAC ATT GCA CCT AGG GTT TGT-3'
- (SEQ ID NO. 8)
- 5'-AAG CTT GTT CTA CCA CCT GAA CTA GGC-3'
- (SEQ ID NO. 9) y
- 5'-TTA CAT ATG AGC CTT CCA TG3-'
- (SEQ ID NO. 10)
Los productos de amplificación pueden ser
analizados de diversos modos, que incluyen análisis dimensional,
digestión con enzimas de restricción seguida de análisis
dimensional, detección de cebadores específicos de oligonucleótidos
señalados como diana en los productos de reacción, hibridación de
oligonucleótidos específica de alelos (ASO), detección de
exonucleasa de 5' específica de alelos, secuenciación, hibridación,
y semejantes.
Los medios de detección basados en PCR pueden
incluir amplificación multiplexada de una pluralidad de marcadores,
simultáneamente, Por ejemplo, es bien sabido en la técnica
seleccionar cebadores de la PCR para generar productos de PCR que
no se solapan en cuanto a dimensiones y pueden ser analizados
simultáneamente.
Alternativamente, es posible amplificar
diferentes marcadores con cebadores que estén marcados de modo
diferente y por tanto puede ser detectado diferentemente cada uno
de ellos. Como es natural, los medios de detección basados en la
hibridación permiten la detección diferencial en una muestra de
múltiples productos de PCR. Otros procedimientos de análisis son
conocidos en la técnica que permiten análisis multiplexados de una
pluralidad de marcadores.
En una realización simplemente ilustrativa, el
método incluye las etapas de (i) recoger una muestra de células
procedente de un paciente, (ii) aislar de las células de la muestra
ácido nucleico (por ejemplo, genómico, mRNA o ambos), (iii) poner
en contacto la muestra de ácido nucleico con uno o más cebadores que
hibridan específicamente los extremos 5' y 3' con al menos un alelo
de haplotipos proinflamatorios de IL-1, el alelo 2
de la IL-1B (-511) ó el alelo 2 de la
IL-1B (+3954), en condiciones tales que tiene lugar
la hibridación y amplificación del alelo, y (iv) detectar el
producto de la amplificación. Estos esquemas de detección son
especialmente útiles para la detección de moléculas de ácidos
nucleicos si tales moléculas se encuentran presentes en cantidades
muy bajas.
En una realización preferida del ensayo, el
alelo del haplotipo proinflamatorio de IL-1, el
alelo 2 de la IL-1B (-511) ó el alelo 2 de la
IL-1B (+3954), es identificado por alteraciones en
los esquemas de escisión por enzimas de restricción. Por ejemplo,
se aísla DNA de la muestra y el testigo, se amplifica
(opcionalmente), se somete a digestión con una o más endonucleasas
de restricción, y se determinan los tamaños de los fragmentos
obtenidos mediante electroforesis en gel.
Todavía en otra realización, puede usarse
cualquiera de una variedad de reacciones de secuenciación conocidas
en la técnica para secuenciar directamente el alelo. Las reacciones
de secuenciación que pueden servir de ejemplo incluyen las basadas
en las técnicas desarrolladas por Maxim y Gilbert (Proc. Natl.
Acad. Sci. USA (1977) 74:560), ó Sanger (Sanger et al.,
(1977) Proc. Nat. Acad. Sci. 74:5463). También se contempla
que pueda utilizarse cualquiera de una diversidad de procedimientos
de secuenciación automatizados cuando se llevan a cabo los ensayos
(Biotechniques (1995) 19:448), que incluyen secuenciación
mediante espectrometría de masas (véanse, por ejemplo, la
publicación PCT del documento WO 94/16101; Cohen et al.
(1996) Adv. Chromatogr. 36:127-162; y
Griffin et al., (1993) Appl. Biochem. Biotechnol.
38:147-159). Resultará evidente para los expertos
en la técnica que, para ciertas realizaciones, solamente es
necesario determinar en la reacción de secuenciación la existencia
de una o dos de las bases de los ácidos nucleicos. Por ejemplo,
puede llevarse a cabo una pista A (A.track) o semejante, por
ejemplo, cuando solamente se detecta un ácido nucleico.
En otra realización, puede usarse protección de
agentes de escisión (tales como una nucleasa, hidroxilamina o
tetróxido de osmio y con piperidina), para detectar bases
desigualadas en RNA/RNA o heterodúplexes de RNA/DNA o DNA/DNA
(Myers et al., (1985) Science 230:1242). En general el
procedimiento de la técnica de "escisión con desigualación"
comienza por proporcionar heterodúplexes formados hibridando con la
muestra RNA o DNA (marcados) que contienen el alelo de tipo
salvaje. Los dúplexes de doble cadena se tratan con un agente que
escinde regiones del dúplex de una sola cadena, tales como las que
pueden existir debido a desigualamiento de pares de bases
existente entre las cadenas del testigo y de la muestra. Por
ejemplo, los dúplexes de RNA/DNA pueden ser tratados con RNasa y
los híbridos de DNA/DNA tratarse con nucleasa S1 para digerir
enzimáticamente las regiones desigualadas. En otras realizaciones,
los sistemas dúplex o bien de DNA/DNA ó de RNA/DNA pueden ser
tratados con hidroxilamina o tetróxido de osmio y con piperidina con
objeto de digerir las regiones desigualadas. Después de digestión
de las regiones desigualadas, el material que resulta se separa por
tamaños sobre geles de poliacrilamida con agentes desnaturalizantes
para determinar el sitio de la mutación. Véanse, por ejemplo, las
publicaciones de Cotton et al., (1988) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 85:4397 y de Saleeba et al., (1992) Methods
Enzimol. 217:286-295. En una realización preferida,
el DNA o RNA testigo puede ser marcado para su detección.
Todavía en otra realización, la reacción de
escisión desigual emplea una o más proteínas que reconocen pares
de bases desigualados en DNA de doble cadena (denominadas, por
tanto, enzimas de "restauración de desigualdades de DNA"). Por
ejemplo, la enzima mutY de E. coli escinde desigualdades de A
en G/A y la timidina DNA glicosilasa procedente de células HeLa
escinde las desigualdades T en G/T (Hsu et al., (1994)
Carcinogenesis 15:1657-1662). Según una
realización que sirve de ejemplo, una sonda basada en un alelo de un
haplotipo proinflamatorio es hibridada con un cDNA u otro producto
de DNA procedente de una célula o células de ensayo. El dúplex se
trata con una enzima de restauración de desigualdades de DNA, y los
productos de escisión, si hay alguno, pueden ser detectados a
partir de protocolos de electroforesis o semejantes. Véase, por
ejemplo, la patente de EE.UU. No. 5.459.039.
En otras realizaciones, se pueden usar
alteraciones de la movilidad electroforética para identificar el
alelo 2 de IL-1\beta (-511). Por ejemplo, puede
emplearse polimorfismo de conformación de una sola cadena (SSCP)
para detectar diferencias de movilidad electroforética entre ácidos
nucleicos mutantes y de tipo salvaje (Orita et al. (1989) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 86:2766, véanse también las publicaciones
de Cotton (1993) Mutat. Res. 285:125-144, y
de Hayashi (1992) Genet. Anal. Tech. Appl.
9:73-79). Fragmentos de DNA de una sola cadena de
alelos de IL-1\beta (-511), muestra y testigo, son
desnaturalizados y se les deja renaturalizar. La estructura
secundaria de ácidos nucleicos de una sola cadena varía según la
secuencia, permitiendo la alteración resultante de la movilidad
electroforética la detección de incluso un único cambio de base. Los
fragmentos de DNA pueden ser marcados o detectados con sondas
marcadas. La sensibilidad del ensayo puede ser intensificada usando
RNA (en lugar de DNA), en el que la estructura secundaria es más
sensible a un cambio de secuencia. En una realización preferida, el
método utiliza análisis de heterodúplexes para separar moléculas de
heterodúplexes de doble cadena sobre la base de cambios de la
movilidad electroforética (Keen et al., (1991) Trends Genet
7:5)
Todavía, en otra realización, el movimiento de
alelos en geles de poliacrilamida que contienen un gradiente de
agente desnaturalizante, se analiza usando electroforesis en gel con
gradiente de agente desnaturalizante (DGGE) Myers et al
(1985) Nature 313:495), Cuando se usa DGGE como el método de
análisis, el DNA puede modificarse para asegurar que no se
desnaturaliza completamente, por ejemplo, añadiendo una "grapa"
de GC de aproximadamente 40 bp de DNA rico en GC de alto punto de
fusión, por PCR. En otra realización se usa un gradiente de
temperaturas en lugar de un gradiente de un agente desnaturalizante
para identificar diferencias de la movilidad de DNA testigo y de
muestra (Rosenbaum y Reissner (1987), Biophys. Chem. 265:12753).
Los ejemplos de otras técnicas para detectar
alelos incluyen, aun cuando no está limitado a ellas, hibridación
selectiva de oligonucleótidos, amplificación selectiva, o extensión
selectiva de cebadores. Por ejemplo, pueden prepararse cebadores de
oligonucleótidos en los que la mutación conocida o diferencia de
nucleótidos que se conoce (por ejemplo, en variantes alélicas) se
coloca centralmente y luego se hibrida con un DNA diana en
condiciones que permiten obtener hibridación, solamente si se
encuentra una igualación perfecta (Saiki et al., (1986)
Nature 324:163); Saiki et al., (1989) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 86:6230). Tales técnicas de hibridación de
oligonucleótidos específicas de alelos pueden utilizarse para
ensayar una mutación o una región polimórfica por reacción cuando
se hibridan oligonucleótidos con DNA diana amplificado por PCR, o
varias mutaciones o regiones polimórficas diferentes cuando los
oligonucleótidos está fijados a la membrana de hibridación e
hibridados con DNA diana marcado.
Alternativamente, puede usarse tecnología de
amplificación específica de alelos que depende de amplificación
selectiva por PCR, en conjunción con la presente invención. Los
oligonucleótidos usados como cebadores para una amplificación
específica pueden ser portadores de la mutación o región polimórfica
de interés en el centro de la molécula (por lo que la amplificación
depende de hibridación diferencial) (Gibbs et al., (1989)
Nucleic Acids Res. 17:2437-2448) o en el
extremo 3' final de un cebador donde, en condiciones apropiadas,
pueden evitarse desigualdades o reducir la extensión de la
polimerasa (Prossner (1993) Tibtech 11:238. Además, puede
ser deseable introducir un nuevo sitio de restricción en la región
de la mutación para crear detección basada en escisión (Gasparini
et al., (1992) Mol. Cell Probes 6:1). Se anticipa que
en ciertas realizaciones, puede llevarse a cabo también
amplificación usando para la amplificación Taq ligasa (Barany
(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189). En tales casos,
la ligación tendrá lugar solamente si hay una igualdad perfecta en
el extremo 3' de la secuencia de 5', haciendo posible detectar la
presencia de una mutación conocida en un sitio específico
investigando la presencia o ausencia de amplificación.
En otra realización, la identificación de la
variante alélica se lleva a cabo usando un ensayo de ligamiento de
oligonucleótidos (OLA), según se describe, por ejemplo, en la
patente de EE.UU. No. 4.998.617 y en la publicación de Landegren,
U. et al., Science 241:1077-1080 (1988). El
protocolo de OLA utiliza dos oligonucleótidos que están diseñados
para que sean capaces de hibridación con secuencias contiguas de una
sola cadena de una diana. Uno de los oligonucleótidos se enlaza a
una marcador de separación, por ejemplo, biotinilado, y el otro es
marcado de modo detectable. Si se encuentra la secuencia
complementaria precisa en una molécula diana, los oligonucleótidos
pueden hibridarse de tal modo que sus términos están contiguos, y
crean un sustrato de ligamiento. El ligamiento permite entonces que
el oligonucleótido marcado sea recuperado usando avidina u otro
ligando de biotina. Nickerson D.A. et al., han descrito un
ensayo de detección de ácidos nucleicos que combina atributos de
PCR y OLA (Nickerson, D.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
(U.S.A.) 87:8923-8927 (1990). En este método, se
usa PCR para conseguir la amplificación exponencial de DNA diana,
que se detecta luego usando OLA.
Varias técnicas basadas en este método OLA han
sido desarrolladas y pueden ser utilizadas para detectar alelos de
un haplotipo proinflamatorio de IL-1. Por ejemplo,
la patente de EE.UU. No. 5.593.826 describe una técnica OLA que usa
un oligonucleótido que tiene un grupo amino en 3' y un
oligonucleótido fosforilado en 5', para formar un conjugado que
posee un ligamiento fosforoamidato. En otra variación de OLA
descrita por Tobe et al.(1996) en Nucleic Acids Res.
24:3728), OLA combinada con PCR permite la tipificación de dos
alelos en un solo pocillo de microtitulación. Marcando cada uno de
los cebadores específico de un alelo con un única hapteno, por
ejemplo, digoxigenina y fluoresceína, cada reacción OLA puede ser
detectada usando anticuerpos específicos del hapteno que están
marcados con diferentes informadores enzimáticos, fosfatasa alcalina
o peroxidasa de rábano picante. Este sistema permite la detección
de los dos alelos usando un formato de alto rendimiento que conduce
a la producción de dos colores diferentes.
Varios métodos han sido desarrollados para
facilitar el análisis de polimorfismos de un solo nucleótido. En
una realización, el polimorfismo de una sola base puede ser
detectado usando un nucleótido especializado resistente a la
exonucleasa, según ha sido descrito, por ejemplo, por Mundy, C.R.
(patente de EE.UU. No. 4.656.127). Según el método, se permite que
un cebador complementario de la secuencia alélica inmediatamente 3'
respecto al sitio polimórfico, se hibride con una molécula diana
obtenida de un animal o un ser humano particular. Si el sitio
polimórfico situado sobre la molécula diana contiene un nucleótido
que es complementario del derivado de nucleótido particular
resistente a la exonucleasa, presente, el derivado será incorporado
sobre el extremo del cebador hibridado. Tal incorporación hace al
cebador resistente a la exonucleasa permitiendo con ello su
detección. Dado que se conoce la identidad del derivado de la
muestra resistente a la exonucleasa, el descubrimiento de que el
cebador se ha hecho resistente a exonucleasas revela que el
nucleótido presente en el sitio polimórfico de la molécula diana
era complementario del del derivado del nucleótido usado en la
reacción. Este método tiene la ventaja de que no requiere la
determinación de cantidades grandes de datos de secuencia
extraños.
En otra realización de la invención, se usa un
método basado en una solución para determinar la identidad del
nucleótido de un sitio polimórfico Cohen, D et al., (patente
francesa 2.650.840, solicitud de PCT No. WO91/02087). Como en el
método de Mundy de la patente de EE.UU. No. 4.656.127, se emplea un
cebador que es complementario de las secuencias alélicas
inmediatamente 3' con respecto a un sitio polimórfico. El método
determina la identidad del nucleótido de ese sitio usando derivados
de didesoxinucleótidos marcados, que, si son complementarios del
nucleótido del sitio polimórfico se incorporarán en el término del
cebador.
Un método alternativo, conocido como Genetic Bit
Analysys o GBA^{TM} ha sido descrito por Goelet et al.,
(solicitud de PCT No. 92/15712). El método de Goelet, P. et
al., utiliza mezclas de terminadores marcados y un cebador que
es complementario de la secuencia 3' respecto a un sitio
polimórfico. El terminador marcado que ha sido incorporado es
determinado de este modo por el nucleótido presente en el sitio
polimórfico de la molécula diana que está siendo evaluada y
complementario del mismo A diferencia del método de Cohen et
al., (patente francesa 2.650.840; solicitud de PCT No.
WO91/02087), el método de Goelet, P. et al., es,
preferiblemente, un ensayo en fase heterogénea, en el que el
cebador o la molécula diana está inmovilizado(a) en una fase
sólida.
Recientemente, han sido descritos diversos
procedimientos operatorios de incorporación de nucleótidos guiada
por cebadores para analizar sitios polimórficos existentes en DNA
(Komher, J.S. et al., Nucl. Acids Res.
17:7779-7784 (1989); Sokolov, B.P., Nucl. Acids
Res. 18:3671 (1990); Syvanen, A. C., et al., Genomics
8:684-692 (1990); Kuppuswamy, M.N. et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:1143-1147 (1991);
Prezant, T.R. et al., Hum. Mutat. 1:159-164
(1992); Ugozzoli, L. et al., GATA 9:107-112
(1992); Nyren, P. et al., Anal. Biochem.
208:171-175 (1993)). Estos métodos se diferencian
del GBA^{TM} en que se basan en la incorporación de
desoxinucleótidos marcados para discriminar entre bases situadas en
un sitio polimórfico. En un formato tal, dado que la señal es
proporcional al número de desoxinucleótidos incorporados,
polimorfismos que se presentan en series del mismo nucleótido
pueden dar por resultado señales que son proporcionales a la
longitud de la serie (Syvanen, A. -C., et al., Amer. J.
Hum. Genet. 52:46-59 (1993)).
Para mutaciones que producen una terminación
prematura de la traducción de proteínas, el ensayo de truncamiento
de proteínas (PTT) ofrece un enfoque eficiente de diagnóstico
(Roest, et al., (1993) Hum. Mol. Genet.
2:1719-21; van der Luijt, et al., (994)
Genomics 20:1-4). Para el ensayo PTT, se
aísla inicialmente RNA del tejido de que se dispone y se somete a
transcripción inversa, y el segmento de interés es amplificado
mediante PCR. Los productos de PCR de transcripción inversa se
utilizan después como molde para amplificación de PCR nidificada,
con un cebador que contiene un promotor de RNA polimerasa y una
secuencia de iniciación de la traducción eucariótica. Después de
amplificar la región de interés, los restos únicos incorporados en
el cebador permiten la transcripción secuencial in vitro y la
traducción de los productos de la PCR. Por electroforesis en gel de
poliacrilamida- dodecil sulfato sódico de los productos de la
traducción, la aparición de polipéptidos truncados señala la
presencia de una mutación que causa la terminación prematura de la
traducción. En una variación de esta técnica, se usa DNA (en
oposición a RNA) como molde de la PCR cuando la región diana de
interés deriva de un exón único.
\newpage
Cualquier tipo de célula o tejido puede
utilizarse para obtener muestras de ácidos nucleicos para usar en
los ensayos de diagnósticos que se describen en esta memoria. En una
realización preferida, la muestra de DNA se obtiene de un fluido
corporal, por ejemplo, sangre, obtenida mediante técnicas conocidas
(por ejemplo, venipuntura), o saliva.
Alternativamente, los ensayos de ácidos
nucleicos pueden ser llevados a cabo sobre muestras secas (por
ejemplo, pelo o piel). Cuando se usa RNA o una proteína, las
células o tejidos que pueden utilizarse deben expresar un gen de
IL-1.
También pueden llevarse a cabo procedimientos
operatorios de diagnóstico in situ, directamente sobre
secciones de tejido (fijado y/o congelado) de tejido del paciente
obtenido de biopsias o resecciones, de modo que no es necesaria la
purificación del ácido nucleico. Reactivos de ácidos nucleicos
pueden ser usados como sondas y/o cebadores para tales
procedimientos operatorios in situ (véase, por ejemplo, la
publicación de Nuovo, G.J., 1992, PCR in situ
hybridization: protocols and applications, Raven Press, NY).
Además de los métodos enfocados principalmente
sobre la detección de la secuencia de un ácido nucleico, también
pueden apreciarse los perfiles en tales esquemas de detección.
Pueden generarse perfiles de "huellas dactilares", por
ejemplo, utilizando un procedimiento operatorio diferencial de
exposición, análisis de transferencia Northern y/o
RT-PCR.
También se describen kits para detectar una
predisposición para desarrollar asma. Estos kits pueden contener
uno o más oligonucleótidos, incluyendo oligonucleótidos de 5' y 3'
que hibridan los extremos 5' y 3' con al menos un alelo de un
haplotipo proinflamatorio de IL-1. Los
ologonucleótidos de amplificación por PCR deben hibridarse entre 25
y 2500 pares de base aparte, de preferencia entre aproximadamente
100 y aproximadamente 500 bases aparte, con objeto de dar lugar a
un producto de PCR de tamaño conveniente para los análisis
subsiguientes.
Para usar en un kit, los oligonucleótidos pueden
ser cualquiera de una diversidad de composiciones naturales y/o
sintéticas tales como oligonucleótidos sintéticos, fragmentos de
restricción, cDNAs, ácidos nucleicos peptídicos sintéticos (PNAs),
y semejantes. El kit y el método de ensayo puede emplear también
oligonucleótidos marcados para permitir facilidad de identificación
en los ensayos. Los ejemplos de marcadores que pueden emplearse
incluyen radio-marcadores, enzimas, compuestos
fluorescentes, estreptavidina, avidina, biotina, restos magnéticos,
restos que se unen a metales, restos de antígenos o anticuerpos, y
semejantes.
El kit puede incluir también, opcionalmente,
medios de toma de muestras de DNA. Son bien conocidos de los
expertos en la técnica medios para la toma de muestras de DNA y
pueden incluir, aun cuando no está limitado a ellos, substratos,
tales como papeles de filtro, el AmpliCard^{TM} (Universidad de
Sheffield, Sheffield, Inglaterra S 10 2JF; Tarlow, JW, et
al., J. of Invest. Dermatol. 103:387-389
(1994)) y semejantes; reactivos de purificación de DNA tales como
los kits Nucleon^{TM}, soluciones tampón de lisis, soluciones de
proteinasas y semejantes; reactivos de PCR tales como tampones de
reacción 10X, polimerasa termoestable, dNTPs, y semejantes; y
medios de detección de alelos tales como la enzima de restricción
HinfI, oligonucleótidos específicos de alelos, cebadores
degenerados de oligonucleótidos para PCR nidificada procedente de
sangre desecada.
El conocimiento de los polimorfismos
particulares de la IL-1, que son predictores de
sepsis, solos o asociados con información sobre otros defectos
genéticos que contribuyen a una enfermedad obstructiva crónica de
las vías respiratorias, (el perfil genético de la enfermedad
obstructiva crónica de las vías respiratorias), permite una
personalización del tratamiento terapéutico para una enfermedad
particular, ajustado al perfil genético del individuo, lo que
constituye el objetivo de la "farmacogenómica". Por ejemplo,
sujetos que tienen el alelo 2 de la IL-1B (-511)
y/o el alelo 2 de la IL-1B (+3954) están
predispuestos a desarrollar una enfermedad obstructiva crónica de
las vías respiratorias o a progresar más rápida o más gravemente en
una enfermedad obstructiva crónica de las vías respiratorias. Por
tanto, la comparación del perfil proinflamatorio de la
IL-1 de un individuo con respecto al perfil de una
población para una enfermedad obstructiva crónica de las vías
respiratorias, permite la selección o el diseño de fármacos que se
espera que sean seguros y eficaces para un paciente particular o
para una población de pacientes (es decir, un grupo de pacientes que
poseen la misma alteración genética).
La aptitud para elegir como diana poblaciones
que se espera pongan de manifiesto el máximo beneficio clínico
basado en la IL-1B o en el perfil genético de la
enfermedad, puede permitir: 1) la reposición de fármacos
comercializados para el tratamiento del asma con resultados
comerciales decepcionantes; 2) el rescate de candidatos a fármacos
para el tratamiento del asma cuyo desarrollo clínico haya sido
interrumpido como resultado de limitaciones referentes a seguridad
o eficacia, que son específicas de subgrupos de pacientes; y 3) un
desarrollo acelerado y menos costoso de candidatos a fármacos para
el tratamiento del asma, y prescipciones óptimas de los fármacos
(por ejemplo, dado que el uso de marcadores que se describe en esta
memoria es útil para optimizar la dosis eficaz).
También pueden obtenerse células de un sujeto
antes y después de administrar un tratamiento terapéutico para
detectar el nivel de expresión de genes distintos de
IL-1, para verificar que el tratamiento terapéutico
no aumenta ni disminuye la expresión de genes que pudieran ser
perjudiciales. Esto puede realizarse, por ejemplo, usando el método
de establecimiento del perfil de la transcripción. Así pues, un
mRNA procedente de células expuestas in vivo a un
tratamiento terapéutico y un mRNA procedente del mismo tipo de
células que no hubieran estado expuestas al tratamiento
terapéutico, podrían exponerse a transcripción inversa e hibridarse
a un chip que contenga DNA procedente de numerosos genes,
comparando con ello la expresión de genes en células tratadas y sin
tratar con la terapia.
La presente invención se ilustra además mediante
los ejemplos siguientes que no deben interpretarse, en modo alguno,
como limitaciones. La práctica de la presente invención empleará, a
menos que se indique de otro modo, procedimientos convencionales,
que están dentro de la capacidad de la técnica. Tales procedimientos
están explicados completamente en la bibliografía. Véanse, por
ejemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2ª Ed., compilado
por Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory
Press: 1989); DNA Cloning, Volúmenes I y II (D. N. Glover,
compilador, 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. G.compilador,
1984); Mullis et al, patente de EE.UU. No. 4.683.195;
Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames y S. J. Higgins,
compiladores, 1984); Transcription and Translation (B. D. Hames y
S.J. Higgins, compiladores, 1984).
La exploración del polimorfismo de variación de
una sola base (C/T) en la base +3954 de la IL-1B,
se llevó a cabo mediante amplificación por PCR de moldes genómicos.
Una desigualdad fue insertada en un cebador para completar un
sitio TaqI como testigo positivo. El sitio polimórfico
TaqI es nativo. Los cebadores que siguen fueron producidos
en un sintetizador de DNA ABI basándose en las secuencias genómicas
(Clark et al., 1986; GENBANK X04500)
- 5' CTC AGG TGT CCT CGA AGA AAT CAA A 3'
- (SEQ ID No: 1)
- 5' GCT TTT TTG CTG TGA GTC CCG 3'
- (SEQ ID No:2)
Las condiciones de reacción de la PCR fueron las
siguientes:
[95 C (2 minutos)] 1 ciclo;
[95 C (1 minuto), 67,5 C (1 minuto), 74 C (1
minuto)] 38 ciclos; y
[72 C (8 minutos)] 1 ciclo.
La digestión con una enzima de restricción se
llevó a cabo a 60ºC durante 8 horas. La determinación de tamaños
se llevó a cabo mediante PAGE al 8%. La digestión del producto de
PCR con TaqI proporciona un segmento de 12 bp (cuya ausencia
indica digestión incompleta) y o bien otros dos segmentos de 85 y 97
bp (alelo 1), o uno solamente de 182 bp (alelo 2).
\vskip1.000000\baselineskip
El polimorfismo de una sola base (C/T) en la
posición -511 del gen de IL-1B fue explorado
mediante amplificación por PCR de moldes genómicos, seguido de
análisis RFLP (Polimorfismo de Longitud de Fragmentos de
Restricción). La variación génica completa un sitio de restricción
Ava I en el alelo más frecuente, y un sitio Bsu 36 I
en el alelo de menor frecuencia. Por tanto, la digestión del
producto de la PCR con estas enzimas proporciona un análisis eficaz
del locus de IL-1B (-511).
Los cebadores siguientes fueron producidos en un
sintetizador ABI basándose en la secuencia genómica (Clark et
al., 1986; GENBANK X04500):
- 5' TGG CAT TGA TCT GGT TCA TC-3'
- (SEQ ID No: 3)
- 5' GTT TAG GAA TCT TCC CAC TT-3'
- (SEQ ID No:4)
Las condiciones de la PCR fueron las
siguientes:
[95 C (1 minuto)] 1 ciclo
[95 C (1 minuto)] 53 C (1 minuto), 72 (1
minuto)] 35 ciclos
[72 C (5 minutos)] 1 ciclo.
Cada reacción de PCR se dividió en dos partes
alícuotas de 25 \mul; una se añadió a 3 unidades de Ava
I, la otra a 3,7 unidades de Bsu 36 I, además de a 3 \mul
del tampón de restricción específico de 10X. La digestión se llevó
a cabo a 37ºC durante la noche y el establecimiento de los tamaños
se realizó mediante PAGE al 9%. La digestión con Ava I
produjo segmentos de 190 + 114 bp con el alelo 1, mientras que el
alelo 2 estaba sin cortar (304 bp). La digestión con Bsu 36 I
produjo fragmentos de 190 + 114 bp con el alelo 2, mientras que el
alelo 1 estaba sin cortar (304 bp). El esquema de restricción
obtenido estaba invertido en las dos partes alícuotas
(identificando homozigotos) o era idéntico (identificando
heterozigotos). Este protocolo proporcionó un análisis eficaz del
locus de IL-1B (-511).
\vskip1.000000\baselineskip
El estudio que sigue fue llevado a cabo para
evaluar si existía asociación entre el asma y los alelos
encontrados en las regiones relevantes del gen de
IL-1B. Ciento seis (106) pacientes con asma fueron
incorporados al estudio. Se introdujeron como testigos 251 sujetos
no asmáticos, de raza blanca, caucásicos,
nor-británicos. Todos los pacientes asmáticos
cumplían los criterios de la ATS para la definición de asma
(Amer. Rev. Respir. Dis. 1985, 132:180-182),
y cuando era importante, tenían una metacolina de PC20 menor que 4
mg/ml. Los pacientes asmáticos fueron clasificados desde el punto
de vista clínico como aquejados de asma, o bien leve o bien grave.
El asma grave fue definida como la de aquellos pacientes que
requerían mas de 800 mg/día de esteroides inhalados. Los pacientes
asmáticos con agonista de beta-2 solamente fueron
calificados como aquejados de asma leve. Del número total de
pacientes asmáticos, 50 eran asmáticos leves con agonista de beta 2
solamente (FEVI 92,5 \pm 1,5% pred.) y tenían una edad media de
26,5 \pm 0,9 y 56 eran asmáticos graves con un régimen de al
menos 800 mg por día de esteroides inhalados (FEVI 58,4 \pm 3,4%
pred.) con una edad media de 47,2 \pm 2,3. Después de que fueron
informados y se obtuvo el consentimiento, se extrajo de cada
paciente 10 ml de sangre venosa recogiéndose en tubos que contenían
EDTA. Se extrajo el DNA genómico total y se determinaron las
frecuencias de alelos en el DNA extraído de los 106 pacientes. Para
la IL-1B (+3954) pudo establecerse el genotipo de
105 pacientes. De 104 pacientes se estableció el genotipo para la
IL-1B (-511). Para cada DNA se obtuvo un producto
único de la PCR que abarcaba las regiones relevantes del gen de
IL-1B y se analizó según se ha descrito en el
Ejemplo 1. Los datos procedentes de los resultados obtenidos fueron
analizados usando el ensayo Ji cuadrado para comparar el transporte
del alelo raro (genotipos portadores de al menos una copia del
alelo 2 entre cohortes). Los resultados para IL-1B
(+3954) están presentados en la Tabla 1 que figura a continuación y
los resultados para IL-1B (-511) están presentados
en la Tabla 2 que sigue.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se pone de manifiesto por las Tablas 1 y 2,
la presencia del alelo 2 de la IL-1B (+3954) y del
alelo 2 de la IL-1B (-511) está asociada
significativamente con el asma clínica. Además, se encontró que la
presencia de al menos una copia del alelo 2 en el locus de la
IL-1B (-511) estaba asociada con una enfermedad más
grave.
Claims (7)
1. Un método para determinar el riesgo
aumentado de un sujeto de susceptibilidad a desarrollar asma en el
sujeto, cuyo método comprende las etapas de :
a) proporcionar una muestra de ácido nucleico
obtenida de sangre o saliva, o una muestra procedente de piel o de
pelo del sujeto; y
b) detectar en dicha muestra al menos el alelo 2
de IL-1B (-511) que contiene una T en la base -511
de la IL-1B o el alelo 2 de IL-1B
(+3954) que contiene una T en la base +3954 de la
IL-1B, en donde la detección de dicho alelo indica
que el paciente tiene un riesgo aumentado de susceptibilidad a
desarrollar asma.
2. Un método según la reivindicación 1, en el
que el alelo es el alelo 2 de IL-1B (-511) que
contiene una T en la base -511 de la IL-1B.
3. Un método según la reivindicación 2, en el
que la etapa de detección comprende amplificación usando al menos
un cebador seleccionado entre el grupo que consiste en:
- 5' CTC AGG TGT CCT CGA AGA AAT CAA A3'
- (SEQ ID No: 1),
- 5' GCT TTT TTG CTG TGA GTC CCG 3'
- (SEQ ID No: 2).
4. Un método según la reivindicación 1, en el
que el alelo es el alelo 2 de IL-1B (+3954) que
contiene una T en la base +3954 de la IL-1B.
5. Un método según la reivindicación 4, en el
que la etapa de detección comprende amplificación usando al menos
un cebador seleccionado entre el grupo que consiste en:
- 5' TGG CAT TGA TCT GGT TCA TC-3'
- (SEQ ID No: 3);
- 5' GTT TAG GAA TCT TCC CAC TT-3'
- (SEQ ID No: 4).
6. Un método según la reivindicación 1, en el
que la presencia de dicho alelo 2 de IL-1B (-511) es
indicativa de una propensión aumentada a asma grave.
7. Un método según la reivindicación 1, en el
que la etapa de detección comprende, además, amplificación usando
al menos un cebador seleccionado entre el grupo que consiste en:
- 5'- CTC AGC AAC ACT CC T AT-3'
- (SEQ ID NO. 5)
- 5'-TCC TGG TCT GCA GCT AA-3'
- (SEQ ID NO. 6)
- 5'-CTA TCT GAG GAA CAA ACT AGT AGC-3'
- (SEQ ID NO. 7)
- 5'-TAG GAC ATT GCA CCT AGG GTT TGT-3'
- (SEQ ID NO. 8)
- 5'-AAG CTT GTT CTA CCA CCT GAA CTA GGC-3'
- (SEQ ID NO. 9)
- 5'-TTA CAT ATG AGC CTT CCA TG.-3'
- (SEQ ID NO. 10).
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